CN115315430A - 使用了链段型亚磷酰胺化合物的核酸合成法 - Google Patents
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Abstract
本发明的目的在于提供使用链段型亚磷酰胺化合物合成寡核苷酸的方法。一种制造寡核苷酸的方法，其包含进行一次以上的在活化剂的存在下，使核苷亚磷酰胺键合到核苷酸或核苷的3’或5’的羟基或硫醇基上的偶联工序，在至少一次的偶联工序中，所述核苷亚磷酰胺为(a)具有2个以上核苷部分的核苷亚磷酰胺、或(b)具有1个以上核苷部分和连接分子部分的核苷亚磷酰胺，所述活化剂具有下述式(1)或式(2)所示的结构，式(1)中，X为有机碱；式(2)中，R1和R2各自独立地选自H、直链或支链的C1～7烷基、和可任意被取代的芳香族基团。通过所述方法，上述课题得到了解决。
Description
技术领域
本发明涉及使用链段型亚磷酰胺化合物(segmented amidite)合成寡核苷酸的方法。
背景技术
在DNA寡核苷酸或RNA寡核苷酸等核酸的化学合成中，广泛使用亚磷酰胺法(phosphoramidite method)。在该方法中，具有所期望的序列的寡核苷酸典型地是通过将被适当保护的核苷一个一个地依次加成来合成。但是，反应不会以100％的概率发生，并且所加成的核苷有时也会在合成反应中分解，必然会产生具有相对于所期望的长度(N)短1个以上(n)的长度的寡核苷酸(N-n)mer。合成后，寡核苷酸通过色谱法等进行精制，但由于具有所期望的长度的寡核苷酸的(N)mer和相对于所期望的长度(N)短1个核苷酸的(N-1)mer的色谱移动率接近，因此(N-1)mer的存在会对寡核苷酸的精制效率、精制品的纯度产生较大影响。
在专利文献1和2以及非专利文献1中，作为用于抑制(N-1)mer的寡核苷酸生成的方法，记载了在合成中利用具有2个或3个核苷部分的核苷亚磷酰胺(链段型亚磷酰胺化合物)的方法，但这些方法尚不是足够高效的方法。
另外，在专利文献3中，作为在寡核苷酸的合成中能够比1H-四唑更安全地使用的活化剂，记载了邻磺酰苯甲酰亚胺(saccharin)的衍生物。然而，在专利文献3中对于作为邻磺酰苯甲酰亚胺的衍生物的活化剂的性能并未进行充分研究。另外，在专利文献4中，作为代替1H-四唑的活化剂，记载了包含至少1个吡啶鎓盐和至少1个被取代的咪唑的活化剂、咪唑鎓盐和苯并咪唑鎓盐。然而，在专利文献4中，作为活化剂，并没有记载使用与邻磺酰苯甲酰亚胺形成的盐。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开第02/20543号
专利文献2：日本特表第2017-514479号
专利文献3：美国专利第7,501,505号
专利文献4：美国专利第6,642,373号
非专利文献
非专利文献1：RNA synthesis via dimer and trimer phosphoramidite blockcoupling[Tetrahedron Letters 52(2011)2575-2578]
发明内容
发明所要解决的课题
本发明的目的在于提供一种使用链段型亚磷酰胺化合物合成寡核苷酸的方法。
用于解决课题的手段
本发明者们对使用链段型亚磷酰胺化合物合成寡核苷酸的方法进行了深入研究，其中发现了在该方法中有用的活化剂。并基于该见解进一步继续研究，结果完成了本发明。
即，本发明涉及以下内容。
[1]一种制造寡核苷酸的方法，其包含进行一次以上的在活化剂的存在下、使核苷亚磷酰胺键合到核苷酸或核苷的3’或5’的羟基或硫醇基上的偶联工序，
在至少一次的偶联工序中，所述核苷亚磷酰胺为：
(a)具有2个以上核苷部分的核苷亚磷酰胺、或
(b)具有1个以上核苷部分和连接分子部分的核苷亚磷酰胺，
所述活化剂具有下述化学式1或2所示的结构：
[化学式1]
式中，
X为有机碱，
[化学式2]
式中，
R1和R2各自独立地选自H、直链或支链的C1～7烷基、和可任意被取代的芳香族基团。
[2]根据[1]所述的方法，其中，
X为N-甲基咪唑、吡啶或3-甲基吡啶，
R1为H、CnH2n+1或苄基，
R2为H、CH3或C6H5，
n为1、2或3。
[3]根据[1]或[2]所述的方法，其中，
所述活化剂为5-巯基-1-甲基四唑(1-Me-MCT)、5-巯基-1-苯基四唑(1-Ph-MCT)、邻磺酰苯甲酰亚胺1-甲基咪唑(SMI)、或5-乙硫基-1H-四唑(ETT)。
[4]根据[1]～[3]中任一项所述的方法，其中，
在进行两次以上的偶联工序中的至少最后一次中，核苷亚磷酰胺为：
(a)具有2个以上核苷部分的核苷亚磷酰胺、或
(b)具有1个以上核苷部分和连接分子部分的核苷亚磷酰胺。
[5]根据[1]～[4]中任一项所述的方法，其中，
在进行两次以上的偶联工序中的至少最后一次中，核苷亚磷酰胺为具有3个核苷部分的核苷亚磷酰胺。
[6]根据[1]～[5]中任一项所述的方法，其中，
在进行两次以上的偶联工序中的至少一次中，核苷亚磷酰胺为具有1个核苷部分的核苷亚磷酰胺。
[7]根据[1]～[6]中任一项所述的方法，其中，
在进行两次以上的偶联工序中的仅最后一次中，核苷亚磷酰胺为：
(a)具有3个核苷部分的核苷亚磷酰胺、或
(b)具有1个以上核苷部分和连接分子部分的核苷亚磷酰胺，
在其他次的偶联工序中，核苷亚磷酰胺为具有1个核苷部分的核苷亚磷酰胺。
[8]根据[1]～[7]中任一项所述的方法，其中，
具有2个以上核苷部分的核苷亚磷酰胺为下式(I)所示的核苷亚磷酰胺或其立体异构体，
[化学式3]
式中，
X1各自独立地为-O-或-S-；
X2各自独立地为-O-或-S-；
X3各自独立地为-O-、-S-、-CH2-或-(CH2)2-；
R1为保护基团；
R2各自独立地为-H、-NHR6、卤素、-CN、-CF3、或者被酰基系保护基团、醚系保护基团或硅烷基系保护基团所保护的羟基；
R3各自独立地为-OCH2CH2CN、-SCH2CH2CN、取代或未取代的脂肪族基团、-OR7或-SR7；
R4和R5各自独立地为取代或未取代的脂肪族基团、取代或未取代的芳香族基团、取代或未取代的芳烷基；或
R4和R5与它们所键合的氮一起形成杂环烷基或杂芳香族基团；
R6各自独立地为-H、取代或未取代的脂肪族基团、取代或未取代的芳香族基团、取代或未取代的芳烷基、或保护基团；
R7各自独立地为取代或未取代的脂肪族基团、取代或未取代的芳香族基团、或者取代或未取代的芳烷基；
B1、B2及B3各自独立地为-H、或者被保护或无保护的碱基；及
n为0或正整数。
[9]根据[8]所述的方法，其中，
n为0或1。
[10]根据[8]或[9]所述的方法，其中，
R2为-H。
[11]根据[8]～[10]中任一项所述的方法，其中，
R3为-OCH2CH2CN。
[12]根据[1]～[11]中任一项所述的方法，其中，
具有1个以上核苷部分和连接分子部分的核苷亚磷酰胺为下述式(II)所示的核苷亚磷酰胺或其立体异构体，
[化学式4]
式中，
X1各自独立地为-O-或-S-；
X2各自独立地为-O-或-S-；
X3各自独立地为-O-、-S-、-CH2-或-(CH2)2-；
L为连接分子；
R2各自独立地为-H、-NHR6、卤素、-CN、-CF3、或者被酰基系保护基团、醚系保护基团或硅烷基系保护基团所保护的羟基；
R3各自独立地为-OCH2CH2CN、-SCH2CH2CN、取代或未取代的脂肪族基团、-OR7或-SR7；
R4和R5各自独立地为取代或未取代的脂肪族基团、取代或未取代的芳香族基团、取代或未取代的芳烷基；或
R4和R5与它们所键合的氮一起形成杂环烷基或杂芳香族基团；R6各自独立地为-H、取代或未取代的脂肪族基团、取代或未取代的芳香族基团、取代或未取代的芳烷基、或保护基团；
R7各自独立地为取代或未取代的脂肪族基团、取代或未取代的芳香族基团、或者取代或未取代的芳烷基；
B1和B2各自独立地为-H、或被保护或未保护的碱基；及
n为0或正整数；
[13]一种制造寡核苷酸的方法，其包含进行一次以上的在活化剂的存在下、使核苷亚磷酰胺键合到核苷酸或核苷的3’或5’的羟基或硫醇基上的偶联工序，
在至少一次的偶联工序中，所述核苷亚磷酰胺为：
(a)具有2个或3个核苷部分的核苷亚磷酰胺、或
(b)具有1个以上核苷部分和连接分子部分的核苷亚磷酰胺，
所述活化剂具有下述化学式5或6所示的结构：
[化学式5]
式中，
X为有机碱，
[化学式6]
式中，
R1和R2各自独立地选自H、直链或支链的C1～7烷基、和可任意被取代的芳香族基团。
[14]根据[13]所述的方法，其中，
X为N-甲基咪唑、吡啶或3-甲基吡啶，
R1为H、CnH2n+1或苄基，
R2为H、CH3或C6H5，
n为1、2或3。
[15]一种制造寡核苷酸的方法，其包含进行一次以上的在活化剂的存在下、使核苷亚磷酰胺键合到核苷酸或核苷的3’或5’的羟基或硫醇基上的偶联工序，
在至少一次的偶联工序中，所述核苷亚磷酰胺为：
(a)具有2个以上核苷部分的核苷亚磷酰胺、或
(b)具有1个以上核苷部分和连接分子部分的核苷亚磷酰胺，
所述活化剂的HOMO能量(a.u.)在乙腈中为-0.21407～-0.16858，且
所述活化剂的轨道系数在乙腈中为0.31531～0.59405。
[16]根据[15]所述的方法，其中，
所述活化剂的pKa在水中为3.65～7。
[17]一种制造寡核苷酸的方法，其包含进行一次以上的在活化剂的存在下、使核苷亚磷酰胺键合到核苷酸或核苷的3’或5’的羟基或硫醇基上的偶联工序，
在至少一次的偶联工序中，核苷亚磷酰胺为：
(a)具有2个或3个核苷部分的核苷亚磷酰胺、或
(b)具有1个以上核苷部分和连接分子部分的核苷亚磷酰胺，
所述活化剂的HOMO能量(a.u.)在乙腈中为-0.22024～-0.16858，且
所述活化剂的轨道系数在乙腈中为0.31531～0.59405。
[18]根据[17]所述的方法，其中，
活化剂的pKa在水中为3.65～7。
[19]一种制造寡核苷酸的方法，其包含进行一次以上的在活化剂的存在下、使核苷亚磷酰胺键合到核苷酸或核苷的3’或5’的羟基或硫醇基上的偶联工序，
在至少一次的偶联工序中，所述核苷亚磷酰胺为：
(a)具有2个或3个核苷部分的核苷亚磷酰胺、或
(b)具有1个以上核苷部分和连接分子部分的核苷亚磷酰胺，
所述活化剂的pKa在水中为3.65～7。
[20]一种制造寡核苷酸的方法，其包含进行一次以上的在活化剂的存在下、使核苷亚磷酰胺键合到核苷酸或核苷的3’或5’的羟基或硫醇基上的偶联工序，
在至少一次的偶联工序中，所述核苷亚磷酰胺为：
(b)具有2个以上核苷部分的核苷亚磷酰胺、或
(b)具有1个以上核苷部分和连接分子部分的核苷亚磷酰胺，
所述活化剂的pKa在水中为4.3～7。
发明效果
通过使用本发明的活化剂，可以使用具有2个以上核苷部分的核苷亚磷酰胺即链段型亚磷酰胺化合物、或具有1个以上核苷部分和连接分子部分的核苷亚磷酰胺，以高效率合成寡核苷酸。另外，通过在偶联工序的最后一次中使用具有2个以上核苷部分的核苷亚磷酰胺即链段型亚磷酰胺化合物，能够抑制色谱移动率与所期望的目标寡核苷酸接近、且通过精制难以去除的(N-1)mer的生成。另外，作为活化剂，使用本发明的活化剂也有助于抑制合成过程中链段型亚磷酰胺化合物的分解。
具体实施方式
以下，对本发明详细地进行说明。
在本说明书中只要没有特别定义，则本说明书中使用的全部技术用语和科学用语具有与本领域技术人员通常理解的用语相同的含义。本说明书中所参照的全部专利、申请以及其他出版物、信息通过参照将其整体援引到本说明书中。另外，在本说明书中所参照的出版物与本说明书的记载发生矛盾的情况下，以本说明书的记载优先。
本发明在一个方面涉及一种制造寡核苷酸的方法，其包含进行一次以上的在活化剂的存在下、使核苷亚磷酰胺键合到具有未取代的羟基或未取代的硫醇基的核苷酸或核苷上的偶联工序。
在本发明中，寡核苷酸的制造是使用所谓的亚磷酰胺法来进行的，即在溶液中或固体支撑体上，在合适的活化剂的存在下，通过核苷亚磷酰胺与核苷的缩合反应进行核苷酸的加成。
在本发明中，寡核苷酸是指具有碱基、糖、磷酸通过磷酸二酯键连接而成的结构的化合物，包括天然存在的寡核苷酸、例如2’-脱氧核糖核酸(以下称为“DNA”)及核糖核酸(以下称为“RNA”)、和含有修饰糖部分、修饰磷酸部分、或修饰核碱基(nucleobase)的核酸。对糖部分的修饰包括将核糖环替换为己糖、环戊基或环己基环。或者，可以将天然存在的核酸的D-核糖环替换为L-核糖环，或者也可以将天然存在的核酸的β-端基异构体替换为α-端基异构体。寡核苷酸还可以包含1个以上的非碱基性部分。修饰磷酸部分包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、膦酸甲酯和磷酸甲酯。这样的核酸类似物是本领域技术人员已知的。含有上述2种以上的混合物而成的寡核苷酸例如可以由含有脱氧核糖和核糖核苷的混合物、特别是脱氧核糖核苷和如2’-O-甲基或2’-O-甲氧基乙基核糖核苷那样的2’-O-取代核糖核苷的混合物而成的寡核苷酸制造。含有核苷的混合物而成的寡核苷酸的例子包含核酶。
在本发明中，核苷亚磷酰胺(链段型亚磷酰胺化合物)是指由亚磷酰胺化合物衍生的核苷。亚磷酰胺化合物化例如可以通过使用1H-四唑作为活化剂，使2-氰基乙基-N,N,N’,N’-四异丙基亚磷酰二胺与被适当保护的核苷反应来进行。
在本发明中，核苷是指碱基和糖键合而成的化合物，可以是如腺苷、胸苷、鸟苷、胞苷、尿苷那样的天然存在的核苷、或修饰核苷。碱基可以是如腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶那样的天然存在的碱基或修饰碱基。核苷的糖部分可以是天然存在的脱氧核糖或核糖，可以采取D构型或L构型。
在本发明中，活化剂用于使核苷亚磷酰胺与核苷酸或核苷反应，也称为活性化剂或偶联剂。
在本发明的一个方式中，活化剂具有下述化学式7或8所示的结构：
[化学式7]
式中，
X为有机碱，与邻磺酰苯甲酰亚胺形成盐复合物，优选为N-甲基咪唑、吡啶或3-甲基吡啶，
[化学式8]
式中，
R1和R2各自独立地选自H、直链或支链的C1～7烷基、和可任意被取代的芳香族基团。
优选R1和R2各自独立地为H、甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、苯基、苄基，进一步优选R1为H、CnH2n+1或苄基，R2为H、CH3或C6H5，n为1、2或3。
在本发明的一个方式中，活化剂例如为5-巯基-1-甲基四唑(1-Me-MCT)：
[化学式9]
5-巯基-1-苯基四唑(1-Ph-MCT)：
[化学式10]
5-苄基硫代四唑(BTT)：
[化学式11]
邻磺酰苯甲酰亚胺1-甲基咪唑(SMI)：
[化学式12]
5-乙硫基-1H-四唑(ETT)
[化学式13]
4,5-二氰基咪唑(DCI)：
[化学式14]
或苯并咪唑三氟甲磺酸盐(BIT)：
[化学式15]
优选为1-Me-MCT、1-Ph-MCT、SMI、ETT或BTT，更优选为1-Me-MCT、1-Ph-MCT或SMI。
在本发明的一个方式中，本发明的活化剂的HOMO能量(a.u.)在乙腈中为-0.22024～-0.16858。例如，本发明的活化剂的HOMO能量(a.u.)在乙腈中为-0.21995～-0.16858、-0.21407～-0.16858、-0.19928～-0.16858、-0.18904～-0.16858、或-0.18741～-0.16858，优选为-0.21407～-0.16858(a.u.)，更优选为-0.18904～-0.16858(a.u.)。
在本发明的一个方式中，本发明的活化剂的轨道系数在乙腈中为0.31531～0.59405。例如，本发明的活化剂的轨道系数在乙腈中为0.31531～0.59405、0.39931～0.59405、0.51802～0.59405、或0.53787～0.59405，优选为0.39931～0.59405。
在本发明的一个方式中，活化剂的HOMO能量(a.u.)在乙腈中为-0.22024～-0.16858，并且所述活化剂的轨道系数在乙腈中为0.31531～0.59405。
在本发明的一个方式中，活化剂的HOMO能量(a.u.)在乙腈中为-0.21407～-0.16858，并且所述活化剂的轨道系数在乙腈中为0.31531～0.59405。
HOMO能量和轨道系数可以通过量子化学计算程序来求出，例如可以在Gaussian公司制的量子化学计算程序Gaussian16中，通过采用了Becke-型3-参数密度泛函理论(B3LYP)的最优化计算来求出。
在本发明的一个方式中，本发明的活化剂在25℃的水中的pKa为3.65～7.0，例如为3.86～7.0、4.1～7.0、4.3～7.0、4.5～7.0、5.0～7.0、5.5～7.0、6.0～7.0、或6.5～7.0。
在本发明的一个方式中，在所述制造寡核苷酸的方法中的至少一次的偶联工序中，核苷亚磷酰胺为(a)具有2个以上核苷部分的核苷亚磷酰胺、或(b)具有1个以上核苷部分和连接分子部分的核苷亚磷酰胺。
在本发明的一个方式中，在所述制造寡核苷酸的方法中的至少一次的偶联工序中，核苷亚磷酰胺为(a)具有2个或3个核苷部分的核苷亚磷酰胺、或(b)具有1个以上核苷部分和连接分子部分的核苷亚磷酰胺。
具有2个或3个核苷部分的核苷亚磷酰胺与具有4个以上核苷部分的核苷亚磷酰胺相比，由于分子尺寸小而运动性高、反应速度快，因此推测反应率提高。
在本发明的一个方式中，在所述制造寡核苷酸的方法中所进行的两次以上的偶联工序中的至少最后一次中，核苷亚磷酰胺为(a)具有2个以上核苷部分的核苷亚磷酰胺、或(b)具有1个以上核苷部分和连接分子部分的核苷亚磷酰胺。
在本发明的一个方式中，在所述制造寡核苷酸的方法中所进行的两次以上的偶联工序中的至少最后一次中，核苷亚磷酰胺为具有3个核苷部分的核苷亚磷酰胺。
在本发明的一个方式中，在所述制造寡核苷酸的方法中所进行的两次以上的偶联工序中的至少一次中，核苷亚磷酰胺为具有1个核苷部分的核苷亚磷酰胺。
在本发明的一个方式中，在所述制造寡核苷酸的方法中所进行的两次以上的偶联工序中的仅最后一次中，核苷亚磷酰胺为(a)具有3个核苷部分的核苷亚磷酰胺、或(b)具有1个以上核苷部分和连接分子部分的核苷亚磷酰胺，在其他次的偶联工序中，核苷亚磷酰胺为具有1个核苷部分的核苷亚磷酰胺。
在本发明中，具有2个以上核苷部分的核苷亚磷酰胺例如可以如国际公开第2019/212061号中记载的那样进行制作。
在本发明的一个方式中，具有2个以上核苷部分的核苷亚磷酰胺具有下述式(I)所示的核苷亚磷酰胺或其立体异构体：
[化学式16]
式(I)中，X1各自独立地为-O-或-S-。
式(I)中，X2各自独立地为-O-或-S-。
式(I)中，X3各自独立地为-O-、-S-、-CH2-或-(CH2)2-。
式(I)中，R1为保护基团，优选为对酸不稳定的保护基团、或如叔丁基二甲基硅烷基或三异丙基硅烷基那样的三烷基硅烷基。对酸不稳定的保护基团是指能够通过使该基团与质子酸或路易斯酸接触而除去的保护基团。对酸不稳定的保护基团是本领域技术人员已知的。作为对酸不稳定保护基团的例子，可举出取代或未取代的三苯甲基、取代或未取代的四氢吡喃基、取代或未取代的四氢呋喃基、或9-苯基呫吨基等。三苯甲基通常被如烷氧基那样的供电子基团取代。在更优选的方式中，R1为取代或未取代的三苯甲基、9-苯基呫吨基或四氢吡喃(以下称为“THP”)。需要说明的是，在更优选的方式中，R1为未取代的三苯甲基、单烷氧基三苯甲基、二烷氧基三苯甲基、三烷氧基三苯甲基、THP或9-苯基呫吨基。最优选R1为4,4’-二甲氧基三苯甲基。
式(I)中，R2各自独立地为H、NHR6、卤素、CN、CF3、或者被酰基系保护基团、醚系保护基团或硅烷基系保护基团保护的羟基中的任一种。卤素例如为F、Cl、Br和I。作为酰基系保护基团，例如可举出乙酰基、苯甲酰基、新戊酰基等。作为醚系保护基团，例如可举出苄基、对甲氧基苄基(PMB)、烯丙基等。作为硅烷基系保护基团，例如可举出叔丁基二甲基硅烷基(TBS)、叔丁基二苯基硅烷基(TBDPS)、叔三异丙基硅烷基(TIPS)、三乙基硅烷基(TES)、三甲基硅烷基(TMS)等。优选为-H。
式(I)中，R3各自独立地为-OCH2CH2CN、-SCH2CH2CN、取代或未取代的脂肪族基团、-OR7或-SR7，优选为-OCH2CH2CN。作为取代或未取代的脂肪族基团，并不限定于这些，例如可举出4-氰基丁-2-烯基硫基、4-氰基丁-2-烯基氧基、烯丙基硫基、烯丙氧基、巴豆基硫基或巴豆基氧基等。
式(I)中，R4和R5各自独立地为取代或未取代的脂肪族基团、取代或未取代的芳香族基团、取代或未取代的芳烷基；或R4和R5与它们所键合的氮一起形成杂环烷基或杂芳香族基团。作为取代或未取代的脂肪族基团，并不限定于这些，例如可举出甲基、乙基、异丙基等，优选为异丙基。作为取代或未取代的芳香族基团，并不限定于这些，例如可举出苯基、苄基、萘基、2-芘基甲基，优选为苯基、苄基。作为取代或未取代的芳烷基，并不限定于这些，例如可举出2-氟苯基甲氧基哌啶-4-基等。作为杂环烷基，并不限定于这些，例如可举出吡咯烷基(Pyrrolizino)、吗啉基等，优选为吗啉基。
式(I)中，R6各自独立地为-H、取代或未取代的脂肪族基团、取代或未取代的芳香族基团、取代或未取代的芳烷基、或以酰基为代表的保护基团中的任一个。作为取代或未取代的脂肪族基团，并不限定于这些，例如可举出甲基、乙基、烯丙基、1-戊烯基、2-甲氧基乙基，优选为甲基、烯丙基、2-甲氧基乙基。作为取代或未取代的芳香族基团，并不限定于这些，例如可举出苯基、苄基、萘基、2-芘基甲基，优选为苯基、苄基。作为取代或未取代的芳烷基，并不限定于这些，例如可举出2-氟苯基甲氧基哌啶-4-基等。保护基团例如为叔丁基二甲基硅烷基、三氟乙酰基、叔丁氧基羰基、苄氧基羰基、邻苯二甲酰基、对甲苯磺酰基。
式(I)中，R7为取代或未取代的脂肪族基团、取代或未取代的芳香族基团、或者取代或未取代的芳烷基。作为取代或未取代的脂肪族基团，并不限定于这些，例如可举出THP、4-甲氧基四氢吡喃基等。作为取代或未取代的芳香族基团，并不限定于这些，例如可举出邻氯苯基或对氯苯基等。作为取代或未取代的芳烷基，并不限定于这些，例如可举出2-氟苯基甲氧基哌啶-4-基等。
式(I)中，B1、B2及B3各自独立地为H、或者被保护或无保护的碱基。作为被保护或无保护的碱基，并不限定于这些，例如可举出如腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶那样的天然存在的碱基、或如7-去氮杂鸟嘌呤、7-去氮杂-8-氮杂鸟嘌呤、5-丙炔基胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、7-去氮杂腺嘌呤、7-去氮杂-8-氮杂腺嘌呤、7-去氮杂-6-氧代嘌呤、6-氧代嘌呤、3-去氮杂腺苷、2-氧代-5-甲基嘧啶、2-氧代-4-甲硫基-5-甲基嘧啶、2-硫羰基-4-氧代-5-甲基嘧啶、4-氧代-5-甲基嘧啶、2-氨基嘌呤、5-氟尿嘧啶、2,6-二氨基嘌呤、8-氨基嘌呤、4-三唑并-5-甲基胸腺嘧啶、和4-三唑并-5-甲基尿嘧啶那样的修饰碱基等。
式(I)中，n为0或正整数，优选为0以上且4以下的整数，更优选为0或1。
在本发明的一个方式中，具有1个以上核苷部分和连接分子部分的核苷亚磷酰胺是在核苷的5’位上经由磷原子、例如经由亚磷酸酯、磷酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯而键合有连接分子的核苷亚磷酰胺。
在本发明的一个方式中，具有1个以上核苷部分和连接分子部分的核苷亚磷酰胺并不限定于这些，例如可以由从Glen Research公司获得的、以具有以下所示的连接分子部分的亚磷酰胺为原料来制备：
PC连接分子亚磷酰胺(PC Linker Phosphoramidite，3-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-1-(2-硝基苯基)-丙烷-1-基-[(2-氰基乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺)
[化学式17]
5'-氨基氧基-修饰分子-11-CE亚磷酰胺(5'-Aminooxy-Modifier-11-CEPhosphoramidite，10-[N-二甲氧基三苯甲基-氨基氧乙基)]-三乙二醇-1-[(2-氰基乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺)
[化学式18]
α-生育酚-TEG亚磷酰胺(α-Tocopherol-TEG Phosphoramidite，1-二甲氧基三苯甲基氧基)-3-O-[(9-DL-α-生育酚)-三乙二醇-1-基]-甘油基-2-O-[(2-氰基乙基)-(N,N,-二异丙基)]-亚磷酰胺)
[化学式19]
5'-DBCO-TEG亚磷酰胺(5'-DBCO-TEG Phosphoramidite，10-(6-氧代-6-(二苯并[b,f]氮杂环辛-4-炔-1-基)-己内酰胺-N-乙基)-O-三乙二醇-1-[(2-氰基乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺)
[化学式20]
5'-胆甾醇基-TEG亚磷酰胺(5'-Cholesteryl-TEG Phosphoramidite，10-O-[1-丙基-3-N-咔唑基胆甾醇]-三乙二醇-1-[(2-氰基乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺)
[化学式21]
DNP-TEG亚磷酰胺(DNP-TEG Phosphoramidite，1-二甲氧基三苯甲基氧基)-3-O-[N-(2,4-二硝基苯基)-3-N-氨基丙基-(三乙二醇)]-甘油基-2-O-(2-氰基乙基)-(N,N-二异丙基)-亚磷酰胺)
[化学式22]
胆甾醇基-TEG亚磷酰胺(Cholesteryl-TEG Phosphoramidite，1-二甲氧基三甲苯基氧基-3-O-(N-胆甾醇基-3-氨基丙基)-三乙二醇-甘油基-2-O-(2-氰基乙基)-(N,N,-二异丙酯)-亚磷酰胺)
[化学式23]
5'-氨基-修饰分子TEG CE-亚磷酰胺(5'-Amino-Modifier TEG CE-Phosphoramidite，10-(O-三氟乙酰胺-N-乙基)-三乙二醇-1-[(2-氰基乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺)
[化学式24]
间隔分子亚磷酰胺18(Spacer Phosphoramidite 18，18-O-二甲氧基三苯甲基六乙二醇，1-[(2-氰基乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺)
[化学式25]
间隔分子亚磷酰胺9(Spacer Phosphoramidite 9，9-O-二甲氧基三苯甲基-三乙二醇，1-[(2-氰基乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺)
[化学式26]
PC氨基-修饰分子亚磷酰胺(PC Amino-Modifier Phosphoramidite，[(6-三氟乙酰基酰胺己内酰胺甲基)-1-(2-硝基苯基)-乙基]-2-氰基乙基-(N,N-二异丙基)-亚磷酰胺)
[化学式27]
巯基-修饰分子C6 S-S(Thiol-Modifier C6 S-S，1-O-二甲氧基三苯甲基-己基-二硫基，1’-[(2-氰基乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺)
[化学式28]
5'-羧基-修饰分子C10(5'-Carboxy-Modifier C10，10-羧基-癸基-(2-氰基乙基)-(N,N-二异丙基)-亚磷酰胺基，N-羟基琥珀酰亚胺酯)
[化学式29]
5'-巯基-修饰分子C6(5'-Thiol-Modifier C6，S-三苯甲基-6-巯基己基-1-[(2-氰基乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺)
[化学式30]
二巯基丝氨醇亚磷酰胺(Dithiol Serinol Phosphoramidite，3-二甲氧基三苯甲基氧基-2-(3-((R)-α-硫辛酰胺)丙酰胺)丙基-1-O-(2-氰基乙基)-(N,N-二异丙基)-亚磷酰胺)
[化学式31]
5'-马来酰亚胺-修饰分子亚磷酰胺(5'-Maleimide-Modifier Phosphoramidite，2-(1,7-二甲基-3,5-二氧代-10-氧杂-4-氮杂三环[5.2.1.02，6]癸-8-烯-4-基)-乙基-1-O-[(2-氰基乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺)
[化学式32]
PC生物素亚磷酰胺(PC Biotin Phosphoramidite，1-[2-硝基-5-(6-(N-(4,4’-二甲氧基三苯甲基))-生物素酰胺基己内酰胺甲基)苯基]-乙基-[2-氰基乙基-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺)
[化学式33]
被保护的生物素LC丝氨醇亚磷酰胺(Protected BiotinLC SerinolPhosphoramidite，3-二甲氧基三苯甲基氧基)-2-(3-((4-叔丁基苯甲酰基)-生物素基-3-氨基丙基)-二乙二醇基-丙基酰胺-甲醚基(日文原文：グリカノイル)酰胺)丙基-1-O-(2-氰基乙基)-(N,N-二异丙基)-亚磷酰胺)
[化学式34]
6-荧光素丝氨醇亚磷酰胺(6-Fluorescein Serinol Phosphoramidite，3-二甲氧基三苯甲基氧基-2-(3-(6-羧基-(二-O-新戊酰基-荧光素)丙酰胺)丙基)-1-O-(2-氰基乙基)-(N,N-二异丙基)-亚磷酰胺)
[化学式35]
被保护的生物素丝氨醇亚磷酰胺(Protected Biotin SerinolPhosphoramidite，3-二甲氧基三苯甲基氧基)-2-(3-((4-叔丁基苯甲酰基)-生物素基)丙酰胺)丙基-1-O-(2-氰基乙基)-(N,N-二异丙基)-亚磷酰胺)
[化学式36]
1-乙炔基-d间隔分子CE亚磷酰胺(1-Ethynyl-dSpacer CE Phosphoramidite，5’-O-二甲氧基三苯甲基-1’-乙炔基-2’-脱氧核糖-3’-[(2-氰基乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺)
[化学式37]
偶氮苯亚磷酰胺(Azobenzene Phosphoramidite，3-O-(二甲氧基三苯甲基)-2-N-(4-羧基偶氮苯)-D-苏氨酸-1-基-O-[(2-氰基乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺)
[化学式38]
5'-I-dT-CE亚磷酰胺(5'-I-dT-CE Phosphoramidite，5’-碘-2’-脱氧胞苷，3’-[(2-氰基乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺)
[化学式39]
补骨脂素C6亚磷酰胺(Psoralen C6 Phosphoramidite，6-[4’-(羟甲基)-4,5’,8-三甲基补骨脂素]-己基-1-O-(2-氰基乙基)-(N,N-二异丙基)-亚磷酰胺)
[化学式40]
补骨脂素C2亚磷酰胺(2-[4’-(羟甲基)-4,5’,8-三甲基补骨脂素]-乙基-1-O-(2-氰基乙基)-(N,N-二异丙基)-亚磷酰胺)
[化学式41]
3-氰基乙烯基咔唑亚磷酰胺(CNVK)(5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-1’-(3-氰基乙烯基咔唑-9-基)-2’-脱氧-β-D-呋喃核糖基-3’-[(2-氰基乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺)
[化学式42]
在本发明的一个方式中，具有1个以上核苷部分和连接分子部分的核苷亚磷酰胺为下述式(II)所示的核苷亚磷酰胺或其立体异构体。
[化学式43]
式(II)中，X1各自独立地为-O-或-S-。
式(II)中，X2各自独立地为-O-或-S-。
式(II)中，X3各自独立地为-O-、-S-、-CH2-或-(CH2)2-。
在式(II)中，L为连接分子。作为连接分子，并不限定于这些，例如可举出，
[化学式44]
[化学式45]
[化学式46]
[化学式47]
[化学式48]
式(II)中，R2各自独立地为-H、-NHR6、卤素、-CN、-CF3、或者被酰基系保护基团、醚系保护基团或硅烷基系保护基团所保护的羟基中的任一个。卤素例如为F、Cl、Br和I。作为酰基系保护基团，例如可举出乙酰基、苯甲酰基、新戊酰基等。作为醚系保护基团，例如可举出苄基、对甲氧基苄基(PMB)、烯丙基等。作为硅烷基系保护基团，例如可举出叔丁基二甲基硅烷基(TBS)、叔丁基二苯基硅烷基(TBDPS)、叔三异丙基硅烷基(TIPS)、三乙基硅烷基(TES)、三甲基硅烷基(TMS)等。优选为-H。
式(II)中，R3各自独立地为-OCH2CH2CN、-SCH2CH2CN、取代或未取代的脂肪族基团、-OR7或-SR7，优选为-OCH2CH2CN。作为取代或未取代的脂肪族基团，并不限定于这些，例如可举出4-氰基丁-2-烯硫基、4-氰基丁-2-烯氧基、烯丙基硫基、烯丙基氧基、巴豆基硫基或巴豆基氧基等。
式(II)中，R4和R5各自独立地为取代或未取代的脂肪族基团、取代或未取代的芳香族基团、取代或未取代的芳烷基；或R4和R5与它们所键合的氮一起形成杂环烷基或杂芳香族基团。作为取代或未取代的脂肪族基团，并不限定于这些，例如可举出甲基、乙基、异丙基等，优选为异丙基。作为取代或未取代的芳香族基团，并不限定于这些，例如可举出苯基、苄基、甲苯基、苯胺基等，优选为苯基、苄基。作为杂环烷基，并不限定于这些，例如可举出吡咯嗪基、吗啉基等。
式(II)中，R6各自独立地为-H、取代或未取代的脂肪族基团、取代或未取代的芳香族基团、取代或未取代的芳烷基、或以酰基为代表的保护基团中的任一种。作为取代或未取代的脂肪族基团，并不限定于这些，例如可举出甲基、乙基、烯丙基、1-戊烯基、2-甲氧基乙基，优选为甲基、烯丙基、2-甲氧基乙基。作为取代或未取代的芳香族基团，并不限定于这些，例如可举出苯基、苄基、萘基、2-芘基甲基，优选为苯基、苄基。保护基团例如为叔丁基二甲基硅烷基。
式(II)中，R7为取代或未取代的脂肪族基团、取代或未取代的芳香族基团、或者取代或未取代的芳烷基。作为取代或未取代的脂肪族基团，并不限定于这些，例如可举出THP、4-甲氧基四氢吡喃基等。作为取代或未取代的芳香族基团，并不限定于这些，例如可举出邻氯苯基或对氯苯基等。作为取代或未取代的芳烷基，并不限定于这些，例如可举出2-氟苯基甲氧基哌啶-4-基等。
式(II)中，B1和B2各自独立地为H、或被保护或未保护的碱基。作为被保护或无保护的碱基，并不限定于这些，例如可举出如腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶那样的天然存在的碱基、或如7-去氮杂鸟嘌呤、7-去氮杂-8-氮杂鸟嘌呤、5-丙炔基胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、7-去氮杂腺嘌呤、7-去氮杂-8-氮杂腺嘌呤、7-去氮杂-6-氧代嘌呤、6-氧代嘌呤、3-去氮杂腺苷、2-氧代-5-甲基嘧啶、2-氧代-4-甲硫基-5-甲基嘧啶、2-硫羰基-4-氧代-5-甲基嘧啶、4-氧代-5-甲基嘧啶、2-氨基嘌呤、5-氟尿嘧啶、2,6-二氨基嘌呤、8-氨基嘌呤、4-三唑并-5-甲基胸腺嘧啶、和4-三唑并-5-甲基尿嘧啶那样的修饰碱基等。在优选的方式中，B1和B2中的至少一个为腺嘌呤。
式(II)中，n为0或正整数，优选为0以上且4以下的整数，更优选为0或1。
实施例
参照以下的例子更详细地说明本发明，但这些是为了表示本发明的特定的具体例，本发明并不限定于这些。
例1逐次法与链段法的比较
(1)寡核苷酸的合成
将dT NittoPhase(注册商标)HL dT300(日东电工株式会社制))以相当于1573μmol的量填充于反应柱，使用核酸合成装置AKTA oligopilot plus 100(Cytiva公司，原GEHealthcare Janpan公司制)合成17mer(5’CCG ATT AAG CGA AGC TT3’)的DNA寡核苷酸。然后，将附着有17mer DNA的固相载体以相当于205μmol的量填充于反应柱内，在核酸合成装置AKTA oligopilot plus 100中，使用5-乙硫基-1H-四唑(ETT)作为活化剂，以将dC、dT、dA依次进行缩合的逐次法、将dATC以1.8当量的亚磷酰胺化合物当量、5分钟的缩合时间进行缩合的链段法1、将dATC以3.0当量的亚磷酰胺化合物当量、10分钟的缩合时间进行缩合的链段法2这3个条件进行合成。其他合成试剂使用通常使用的脱保护试剂、封端试剂及氧化溶液。dATC如国际公开第2019/212061号中记载的那样制作。
将结合有DNA寡核苷酸的固相载体浸渍于28％氨水中，从固相载体切出该DNA寡核苷酸。用水将该液体的一部分稀释，制成DNA寡核苷酸试样溶液。剩余的溶液为粗溶液。
(2)寡核苷酸的精制
对于得到的粗溶液，利用精制装置AKTA pure 25(Cytiva公司，原GE HealthcareJapan公司制)进行精制。(精制条件：柱：25cm×10mm CV＝19.6mL GE source 15Q resin、Buffer：用NaOH、NaCl、超纯水进行调整)。
(3)DNA寡核苷酸的分析
对于精制前和精制后的DNA寡核苷酸试样溶液，进行基于高效液相色谱法(HPLC)的测定(测定条件：柱：Waters XBridge OST C18 2.5μm 50×4.6mm、UV检测：260nm、BufferA：HFIP/TEA的水溶液、BufferB：甲醇)。
(4)结果
将精制前的DNA寡核苷酸试样溶液的分析结果示于表1。
表1
| 逐次法 | 链段法1 | 链段法2 | |
| 样品ID | mi09122018-1 | mi09122018-2 | mi09122018-3 |
| 纯度(％) | 73.8 | 72.2 | 75.6 |
| 吸光度(A260) | 439 | 409 | 436 |
| 合计OD | 21925 | 20450 | 21800 |
| FLP(纯度×合计OD) | 16181 | 14765 | 16481 |
| 杂质I(％) | 2.9 | 0.6 | 0.7 |
| 杂质II(％) | 2.8 | 0.4 | 1.8 |
| 杂质III(％) | 1.5 | 7.9 | 2.8 |
在此，杂质I是指在HPLC测定中出现在N-1mer附近的杂质，杂质II是指在HPLC测定中出现在N-2mer附近的杂质，杂质III是指在HPLC测定中出现在N-3mer附近的杂质。
在通过逐次法合成的情况下，杂质I和杂质II的含量分别为2.9％、2.8％，而在通过链段法1进行合成的情况下，杂质I和杂质II的含量分别为0.6％、0.4％，另外在通过链段法2进行合成的情况下，分别为0.7％、1.8％。在利用链段法进行合成的情况下，与通过逐次法进行合成的情况相比，大幅降低了杂质I和杂质II的含量。
精制后的DNA寡核苷酸试样溶液的分析结果如表2所示。
表2
| 逐次法 | 链段法1 | 链段法2 | |
| 纯度(％) | 90.46 | 92.34 | 92.53 |
| 吸光度(A260) | 0.451 | 0.439 | 0.439 |
| 合计OD | 10283 | 11590 | 11590 |
| FLP(纯度×合计OD) | 9302 | 10702 | 10724 |
| 杂质I(％) | 2.47 | 0.41 | 0.42 |
| 杂质II(％) | 0.47 | 0.62 | 1.01 |
| 杂质III(％) | 0.26 | 0.25 | 0.29 |
目标寡核苷酸的纯度在逐次法中为90.46％，而在链段法1中为92.34％，在链段法2中为92.53％，在通过链段法进行合成的情况下，与通过逐次法进行合成的情况相比，以较高的纯度得到了目标寡核苷酸。另外，FLP(全长产物、纯度×合计OD)在逐次法中为9302，而在链段法1中为10702、在链段法2中为10724，在通过链段法进行合成的情况下，与通过逐次法进行合成的情况相比，以更高的产量得到了目标寡核苷酸。
例2反应率的比较
(1)DNA寡核苷酸的合成
将NittoPhase(注册商标)HL Unylinker 350(日东电工株式会社制)以相当于2935μmol的量填充于反应柱，使用核酸合成装置AKTA oligopilot plus100合成17mer(5’CCG ATT AAG CGA AGC TT 3’)的DNA寡核苷酸。然后，将附着有17mer DNA的固相载体以相当于90μmol的量填充到反应柱内，在核酸合成装置AKTA oligopilot plus10中，使用5-巯基-1-甲基四唑(1-Me-MCT)、5-巯基-1-苯基四唑(1-Ph-MCT)、5-苄基硫代四唑(BTT)、邻磺酰苯甲酰亚胺1-甲基咪唑(SMI)、5-乙硫基-1H-四唑(ETT)、4,5-二氰基咪唑(DCI)、5-[3,5-双(三氟甲基)苯基]-1H-四唑(Activator42)、或苯并咪唑三氟甲磺酸盐(BIT)作为活化剂，将dGCC以1.8当量的亚磷酰胺化合物当量数、5分钟的缩合时间进行缩合。使活化剂全部溶解于乙腈，调整为0.25M。关于其他合成试剂，作为脱保护剂，使用3％DCA的甲苯溶液；作为氧化剂，使用吡啶、碘的水溶液；作为封端剂，使用吡啶、N-甲基咪唑、乙酸酐或异丁酸酐的乙腈溶液；作为胺洗反应液，使用TBA的乙腈溶液。dGCC按照国际公开第2019/212061号所记载的那样进行制作。
将结合有DNA寡核苷酸的固相载体浸渍于氨水中，从固相载体上切出该DNA寡核苷酸。
其中，Activator42具有以下的结构：
[化学式49]
(2)RNA寡核苷酸的合成
将NittoPhase(商标登记)HL rU250(Kinovate Life Science公司制)以相当于327μmol的量填充于反应柱，使用核酸合成装置AKTA oligopilot plus100，合成17mer合成(5’CCG AUU AAG CGA AGC UU 3’)的RNA寡核苷酸。然后，将附着有17mer RNA的固相载体以相当于85μmol的量填充到反应柱内，在核酸合成装置AKTA oligopilot plus10中，使用5-巯基-1-甲基四唑(1-Me-MCT)、邻磺酰苯甲酰亚胺1-甲基咪唑(SMI)或5-[3,5-双(三氟甲基)苯基]-1H-四唑(Activator42)作为活化剂，使rAUC以2.0当量的亚磷酰胺化合物当量数、15分钟的缩合时间进行缩合。使活化剂全部溶解于乙腈，调整为0.25M。关于其他合成试剂，作为脱保护剂，使用3％DCA的甲苯溶液；作为氧化剂，使用吡啶、碘的水溶液；作为封端剂，使用吡啶、N-甲基咪唑、乙酸酐或异丁酸酐的乙腈溶液；作为胺洗反应液，使用TBA的乙腈溶液。rAUC按照国际公开第2019/212061号所记载的那样进行制作
将结合有RNA寡核苷酸的固相载体浸入AMA试剂(28～30％氨水：甲胺水溶液＝1：1)中，用过滤器过滤，用DMSO洗涤。然后，在冰浴下缓慢滴加TEA.3HF，通过振荡从固相载体切出该RNA寡核苷酸。
(3)反应率的分析
对于切出后的各寡核苷酸试样溶液，进行基于高效液相色谱法(HPLC)的测定(测定条件：柱：Waters XBridge OST C18 2.5μm 50×4.6mm、UV检测：260nm、BufferA：HFIP/TEA的水溶液、BufferB：甲醇)。
在DNA合成中，在HPLC测定结果中观测到杂质III的峰之后，将在1.1分钟后检测到的峰的面积的总和记为100％，减去杂质III的峰面积(％)，由此算出反应率。在RNA合成中，在HPLC测定结果中观测到杂质III的峰之后，将在1.4分钟后检测到的峰的面积的总和记为100％，减去杂质III的峰面积(％)，由此算出反应率。
(4)结果
将DNA合成中的结果示于表3，将RNA合成中的结果示于表4。
另外，将本实验中使用的活化剂的HOMO能量和轨道系数一并示于表3和表4。HOMO能量、轨道系数利用Gaussian公司制的量子化学计算程序Gaussian16，通过采用了Becke-型3-参数密度泛函理论(B3LYP)的最优化计算求出。具体而言，利用Web base的计算辅助程序WebMO，制作出活化剂对亚磷酰胺化合物进行亲核攻击时的活性种(BIT为中性种，其他为阴离子种)的结构、即活化剂的初始结构，制成计算前的分子的初始结构，基底函数输入6-31G(d)，电荷为阴离子时为-1，为中性种时为0，多重度输入1重项，溶剂输入乙腈，按照结构优化、轨迹计算的顺序执行，由此求出HOMO能量和轨道系数。通过在WebMO中执行Cleanup功能的Mechanics Optimize，适当地进行用于避免分子模型的原子间冲突的初始结构的简易的结构修正。
表3对dGCC亚磷酰胺化合物的反应率
表4对rAuC亚磷酰胺化合物的反应率
由表3和表4可知，显示反应率比Activator42高的活化剂的HOMO能级高、和/或轨道系数大。考虑由于活化剂的HOMO能级高，因此活化剂的HOMO能级与链段型亚磷酰胺化合物的LUMO能级的能量差变小而容易发生反应。另外考虑，由于活化剂的轨道系数大，因此活化剂的氮原子与链段型亚磷酰胺化合物的磷原子中的轨道的重叠变大而容易发生反应。
例3链段型亚磷酰胺化合物的分解的比较
(1)使用dGCC作为链段型亚磷酰胺化合物进行的寡核苷酸的合成
将例2(1)中得到的附着有17mer DNA的固相载体以相当于90μmol的量填充于反应柱，在核酸合成机AKTA oligopilot plus10中，使用0.6M 5-巯基-1-甲基四唑(1-Me-MCT)、0.5M 5-巯基-1-苯基四唑(1-Ph-MCT)、0.25M 5-苄基硫代四唑(BTT)、0.25M邻磺酰苯甲酰亚胺1-甲基咪唑(SMI)、0.6M 5-乙基硫代-1H-四唑(ETT)或0.25M 5-[3,5-双(三氟甲基)苯基]-1H-四唑(Activator42)作为活化剂，将dGCC以1.8当量的亚磷酰胺化合物当量数、10分钟的缩合时间进行缩合。关于其他合成试剂，作为脱保护剂，使用3％DCA的甲苯溶液；作为氧化剂，使用吡啶、碘的水溶液；作为封端剂，使用吡啶、N-甲基咪唑、乙酸酐的乙腈溶液；作为胺洗反应液，使用TBA的乙腈溶液。dGCC按照国际公开第2019/212061号所记载的那样进行制作。
将结合有DNA寡核苷酸的固相载体55℃下浸渍于氨水中12～16小时，从固相载体上切出该DNA寡核苷酸。
(2)DNA寡核苷酸的分析
对于切出后的DNA寡核苷酸试样溶液，进行基于高效液相色谱法(HPLC)的测定(测定条件：柱：Waters XBridge OST C18 2.5μm 50×4.6mm、UV检测：260nm、BufferA：100mMHFIP/7mM TEA的水溶液、pH为8.0，BufferB：甲醇、温度：60℃)。
在HPLC测定结果中观测到杂质III的峰之后，算出将在1.1分钟后检测到的峰的面积总和记为100％时的杂质II的峰面积(％)。
(4)结果
将结果示于表5。另外，将本实验中使用的活化剂在水中的pKa值一并示于表5。
表5杂质II的比例
在使用Activator42进行合成的情况下，杂质II的峰面积为9.089％，观测到链段型亚磷酰胺化合物显著分解。另一方面，在使用其他活化剂的情况下，杂质II的峰面积为1～2％左右，几乎未观测到分解。推测由于连接寡核苷酸和链段型亚磷酰胺化合物的磷酸二酯键部分被酸分解而产生杂质II的可能性高。
序 列 表
<110> 日东电工株式会社
日东电工奥维斯公司
<120> 使用了分段型亚酰胺化合物的核酸合成法
<130> PCT3064ND
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 17
<212> DNA
<213> 合成结构
<400> 1
ccgattaagc gaagctt 17
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 合成结构
<400> 2
ccgattaagc gaagcttatc 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 合成结构
<400> 3
ccgattaagc gaagcttgcc 20
<210> 4
<211> 17
<212> RNA
<213> 合成结构
<400> 4
ccgauuaagc gaagcuu 17
<210> 5
<211> 20
<212> RNA
<213> 合成结构
<400> 5
ccgauuaagc gaagcuuauc 20
Claims (20)
1.一种制造寡核苷酸的方法，其包含进行一次以上的在活化剂的存在下、使核苷亚磷酰胺键合到核苷酸或核苷的3’或5’的羟基或硫醇基上的偶联工序，
在至少一次的偶联工序中，所述核苷亚磷酰胺为：
(c)具有2个以上核苷部分的核苷亚磷酰胺、或
(b)具有1个以上核苷部分和连接分子部分的核苷亚磷酰胺，
所述活化剂具有下述化学式1或2所示的结构：
[化学式1]
式中，
X为有机碱，
[化学式2]
式中，
R1和R2各自独立地选自H、直链或支链的C1～7烷基、和可任意被取代的芳香族基团。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，
X为N-甲基咪唑、吡啶或3-甲基吡啶，
R1为H、CnH2n+1或苄基，
R2为H、CH3或C6H5，
n为1、2或3。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，
所述活化剂为5-巯基-1-甲基四唑(1-Me-MCT)、5-巯基-1-苯基四唑(1-Ph-MCT)、邻磺酰苯甲酰亚胺1-甲基咪唑(SMI)、或5-乙硫基-1H-四唑(ETT)。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，
在进行两次以上的偶联工序中的至少最后一次中，核苷亚磷酰胺为：
(a)具有2个以上核苷部分的核苷亚磷酰胺、或
(b)具有1个以上核苷部分和连接分子部分的核苷亚磷酰胺。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的方法，其中，
在进行两次以上的偶联工序中的至少最后一次中，核苷亚磷酰胺为具有3个核苷部分的核苷亚磷酰胺。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的方法，其中，
在进行两次以上的偶联工序中的至少一次中，核苷亚磷酰胺为具有1个核苷部分的核苷亚磷酰胺。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的方法，其中，
在进行两次以上的偶联工序中的仅最后一次中，核苷亚磷酰胺为：
(b)具有3个核苷部分的核苷亚磷酰胺、或
(b)具有1个以上核苷部分和连接分子部分的核苷亚磷酰胺，
在其他次的偶联工序中，核苷亚磷酰胺为具有1个核苷部分的核苷亚磷酰胺。
8.根据权利要求1～7中任一项所述的方法，其中，
具有2个以上核苷部分的核苷亚磷酰胺为下式(I)所示的核苷亚磷酰胺或其立体异构体，
[化学式3]
式中，
X1各自独立地为-O-或-S-；
X2各自独立地为-O-或-S-；
X3各自独立地为-O-、-S-、-CH2-或-(CH2)2-；
R1为保护基团；
R2各自独立地为-H、-NHR6、卤素、-CN、-CF3、或者被酰基系保护基团、醚系保护基团或硅烷基系保护基团所保护的羟基；
R3各自独立地为-OCH2CH2CN、-SCH2CH2CN、取代或未取代的脂肪族基团、-OR7或-SR7；
R4和R5各自独立地为取代或未取代的脂肪族基团、取代或未取代的芳香族基团、取代或未取代的芳烷基；或
R4和R5与它们所键合的氮一起形成杂环烷基或杂芳香族基团；
R6各自独立地为-H、取代或未取代的脂肪族基团、取代或未取代的芳香族基团、取代或未取代的芳烷基、或保护基团；
R7各自独立地为取代或未取代的脂肪族基团、取代或未取代的芳香族基团、或者取代或未取代的芳烷基；
B1、B2及B3各自独立地为-H、或者被保护或无保护的碱基；及
n为0或正整数。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，
n为0或1。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其中，
R2为-H。
11.根据权利要求8～10中任一项所述的方法，其中，
R3为-OCH2CH2CN。
12.根据权利要求1～11中任一项所述的方法，其中，
具有1个以上核苷部分和连接分子部分的核苷亚磷酰胺为下述式(II)所示的核苷亚磷酰胺或其立体异构体，
[化学式4]
式中，
X1各自独立地为-O-或-S-；
X2各自独立地为-O-或-S-；
X3各自独立地为-O-、-S-、-CH2-或-(CH2)2-；
L为连接分子；
R2各自独立地为-H、-NHR6、卤素、-CN、-CF3、或者被酰基系保护基团、醚系保护基团或硅烷基系保护基团所保护的羟基；
R3各自独立地为-OCH2CH2CN、-SCH2CH2CN、取代或未取代的脂肪族基团、-OR7或-SR7；
R4和R5各自独立地为取代或未取代的脂肪族基团、取代或未取代的芳香族基团、取代或未取代的芳烷基；或
R4和R5与它们所键合的氮一起形成杂环烷基或杂芳香族基团；R6各自独立地为-H、取代或未取代的脂肪族基团、取代或未取代的芳香族基团、取代或未取代的芳烷基、或保护基团；
R7各自独立地为取代或未取代的脂肪族基团、取代或未取代的芳香族基团、或者取代或未取代的芳烷基；
B1和B2各自独立地为-H、或者被保护或未保护的碱基；及
n为0或正整数。
13.一种制造寡核苷酸的方法，其包含进行一次以上的在活化剂的存在下、使核苷亚磷酰胺键合到核苷酸或核苷的3’或5’的羟基或硫醇基上的偶联工序，
在至少一次的偶联工序中，所述核苷亚磷酰胺为：
(a)具有2个或3个核苷部分的核苷亚磷酰胺、或
(b)具有1个以上核苷部分和连接分子部分的核苷亚磷酰胺，
所述活化剂具有下述化学式5或6所示的结构：
[化学式5]
式中，
X为有机碱，
[化学式6]
式中，
R1和R2各自独立地选自H、直链或支链的C1～7烷基、和可任意被取代的芳香族基团。
14.根据权利要求13所述的方法，其中，
X为N-甲基咪唑、吡啶或3-甲基吡啶，
R1为H、CnH2n+1或苄基，
R2为H、CH3或C6H5，
n为1、2或3。
15.一种制造寡核苷酸的方法，其包含进行一次以上的在活化剂的存在下、使核苷亚磷酰胺键合到核苷酸或核苷的3’或5’的羟基或硫醇基上的偶联工序，
在至少一次的偶联工序中，所述核苷亚磷酰胺为：
(a)具有2个以上核苷部分的核苷亚磷酰胺、或
(b)具有1个以上核苷部分和连接分子部分的核苷亚磷酰胺，
所述活化剂的HOMO能量(a.u.)在乙腈中为-0.21407～-0.16858，且
所述活化剂的轨道系数在乙腈中为0.31531～0.59405。
16.根据权利要求15所述的方法，其中，
所述活化剂的pKa在水中为3.65～7。
17.一种制造寡核苷酸的方法，其包含进行一次以上的在活化剂的存在下、使核苷亚磷酰胺键合到核苷酸或核苷的3’或5’的羟基或硫醇基上的偶联工序，
在至少一次的偶联工序中，核苷亚磷酰胺为：
(a)具有2个或3个核苷部分的核苷亚磷酰胺、或
(b)具有1个以上核苷部分和连接分子部分的核苷亚磷酰胺，
所述活化剂的HOMO能量(a.u.)在乙腈中为-0.22024～-0.16858，且
所述活化剂的轨道系数在乙腈中为0.31531～0.59405。
18.根据权利要求17所述的方法，其中，
活化剂的pKa在水中为3.65～7。
19.一种制造寡核苷酸的方法，其包含进行一次以上的在活化剂的存在下、使核苷亚磷酰胺键合到核苷酸或核苷的3’或5’的羟基或硫醇基上的偶联工序，
在至少一次的偶联工序中，所述核苷亚磷酰胺为：
(a)具有2个或3个核苷部分的核苷亚磷酰胺、或
(b)具有1个以上核苷部分和连接分子部分的核苷亚磷酰胺，
所述活化剂的pKa在水中为3.65～7。
20.一种制造寡核苷酸的方法，其包含进行一次以上的在活化剂的存在下、使核苷亚磷酰胺键合到核苷酸或核苷的3’或5’的羟基或硫醇基上的偶联工序，
在至少一次的偶联工序中，所述核苷亚磷酰胺为：
(d)具有2个以上核苷部分的核苷亚磷酰胺、或
(b)具有1个以上核苷部分和连接分子部分的核苷亚磷酰胺，
所述活化剂的pKa在水中为4.3～7。
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