WO2021141072A1 - セグメント型アミダイトを用いた核酸合成法 - Google Patents

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WO2021141072A1
WO2021141072A1 PCT/JP2021/000273 JP2021000273W WO2021141072A1 WO 2021141072 A1 WO2021141072 A1 WO 2021141072A1 JP 2021000273 W JP2021000273 W JP 2021000273W WO 2021141072 A1 WO2021141072 A1 WO 2021141072A1
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nucleoside
phosphoramidite
substituted
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nucleoside phosphoramidite
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PCT/JP2021/000273
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智▲祥▼ 飯田
正史 岩本
康太 阪本
パレデス，エデュアルド
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日東電工株式会社
日東電工アベシア・インコーポレーテッド
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Definitions

  • the present invention relates to a method for synthesizing an oligonucleotide using segmented amidite.
  • oligonucleotides with the desired sequence are typically synthesized by sequentially adding appropriately protected nucleosides one at a time. However, the reaction does not occur with a 100% probability, and the added nucleoside may be decomposed during the synthetic reaction, so that the length is 1 or more (n) shorter than the desired length (N). Oligonucleotide (Nn) mer with the same value can inevitably occur.
  • the oligonucleotide is purified by chromatography or the like, but is an oligonucleotide having a desired length (N) mer and one nucleotide shorter than the desired length (N) (N-1). Since the mer has a close chromatographic mobility, the presence of the (N-1) mer has a great influence on the purification efficiency of the oligonucleotide and the purity of the refined product.
  • Patent Documents 1 and 2 and Non-Patent Document 1 describe nucleoside phosphoramidite (segments) having two or three nucleoside moieties in synthesis as a method for suppressing the production of oligonucleotides of (N-1) mer.
  • Patent Document 3 describes a derivative of saccharin as an activator that can be used more safely than 1H-tetrazole in the synthesis of oligonucleotides. However, in Patent Document 3, the performance of a saccharin derivative as an activator has not been sufficiently studied.
  • Patent Document 4 describes an activator containing at least one pyridinium salt and at least one substituted imidazolium, an imidazolium salt, and a benzoimidazolium salt as activators in place of 1H-tetrazole. However, Patent Document 4 does not describe the use of a salt with saccharin as an activator.
  • An object of the present invention is to provide a method for synthesizing an oligonucleotide using segmented amidite.
  • the present inventors have found a useful activator in the method while working diligently on a method for synthesizing an oligonucleotide using segmented amidite. Then, as a result of further research based on such findings, the present invention was completed.
  • the present invention relates to the following.
  • a method for producing an oligonucleotide In the presence of the activator, the coupling step of binding the nucleoside phosphoramidite to the 3'or 5'hydroxyl or thiol group of the nucleotide or nucleoside is performed one or more times.
  • the nucleoside phosphoramidite is (a) a nucleoside phosphoramidite having two or more nucleoside moieties, or (b) a nucleoside phosphoramidite having one or more nucleoside moieties and a linker moiety.
  • the activator has the following formula: During the ceremony X is an organic base, Or the following formula: During the ceremony R 1 and R 2 are each independently, H, are selected from linear or C 1 ⁇ 7 branched alkyl group, and the group consisting of an aromatic group which may be optionally substituted, The method having a structure represented by.
  • X is N-methylimidazole, pyridine or 3-methylpyridine.
  • R 1 is an H, C n H 2n + 1 or benzyl group.
  • R 2 is H, CH 3 , or C 6 H 5 and n is 1, 2 or 3, The method according to [1].
  • the activator is 5-mercapto-1-methyltetrazole (1-Me-MCT), 5-mercapto-1-phenyltetrazole (1-Ph-MCT), saccharin 1-methylimidazole (SMI), or 5 -The method according to [1] or [2], which is ethylthio-1H-tetrazole (ETT).
  • ETT ethylthio-1H-tetrazole
  • the nucleoside phosphoramidite is (a) a nucleoside phosphoramidite having two or more nucleoside moieties, or (b) a nucleoside phosphoramidite having one or more nucleoside moieties and a linker moiety, [1]-[3].
  • the method described in any one of. [5] In at least the last one of the coupling steps performed two or more times.
  • Nucleoside phosphoramidite is a nucleoside phosphoramidite having three nucleoside moieties, The method according to any one of [1] to [4]. [6] In at least one of the coupling steps performed two or more times.
  • Nucleoside phosphoramidite is a nucleoside phosphoramidite having one nucleoside moiety, The method according to any one of [1] to [5]. [7] In the last one of the coupling steps performed two or more times, The nucleoside phosphoramidite is (a) a nucleoside phosphoramidite having three nucleoside moieties, or (b) a nucleoside phosphoramidite having one or more nucleoside moieties and a linker moiety. In the other coupling process Nucleoside phosphoramidite is a nucleoside phosphoramidite having one nucleoside moiety, The method according to any one of [1] to [6].
  • a nucleoside phosphoramidite having two or more nucleoside moieties is represented by the following formula (I).
  • X 1 is -O- or -S-, respectively;
  • X 2 is -O- or -S-, respectively;
  • X 3 are each independently -O-, -S-, -CH 2- or-(CH 2 ) 2- ;
  • R 1 is a protecting group;
  • R 2 is each independently a hydroxyl group protected with -H, -NHR 6 , halogen, -CN, -CF 3 , or an acyl protecting group, an ether protecting group or a silyl protecting group;
  • R 3 are independently -OCH 2 CH 2 CN, -SCH 2 CH 2 CN, substituted or unsubstituted aliphatic groups, -OR 7 or -SR 7 ;
  • R 4 and R 5 are independently substituted or unsubstituted aliphatic groups, substituted or unsubstituted
  • R 7 are independently substituted or unsubstituted aliphatic groups, substituted or unsubstituted aromatic groups, or substituted or unsubstituted alalkyl groups;
  • B 1 , B 2 and B 3 are independently -H, or protected or unprotected bases; and
  • n is 0 or a positive integer; The method according to any one of [1] to [7], which is a nucleoside phosphoramidite represented by (1) or a stereoisomer thereof.
  • a nucleoside phosphoramidite having one or more nucleoside moieties and a linker moiety is represented by the following formula (II).
  • X 1 is -O- or -S-, respectively;
  • X 2 is -O- or -S-, respectively;
  • X 3 are each independently -O-, -S-, -CH 2- or-(CH 2 ) 2- ;
  • L is a linker;
  • R 2 is each independently a hydroxyl group protected with -H, -NHR 6 , halogen, -CN, -CF 3 , or an acyl protecting group, an ether protecting group or a silyl protecting group;
  • R 3 are independently -OCH 2 CH 2 CN, -SCH 2 CH 2 CN, substituted or unsubstituted aliphatic groups, -OR 7 or -SR 7 ;
  • R 4 and R 5 are independently substituted or unsubstituted aliphatic groups, substituted
  • R 7 are independently substituted or unsubstituted aliphatic groups, substituted or unsubstituted aromatic groups, or substituted or unsubstituted alalkyl groups;
  • B 1 and B 2 are independently -H, or protected or unprotected bases; and
  • n is 0 or a positive integer;
  • a method for producing an oligonucleotide In the presence of the activator, the coupling step of binding the nucleoside phosphoramidite to the 3'or 5'hydroxyl or thiol group of the nucleotide or nucleoside is performed one or more times.
  • the nucleoside phosphoramidite is (a) a nucleoside phosphoramidite having two or three nucleoside moieties, or (b) a nucleoside phosphoramidite having one or more nucleoside and linker moieties.
  • the activator has the following formula:
  • X is an organic base, Or the following formula:
  • R 1 and R 2 are each, independently, H, are selected from linear or C 1 ⁇ 7 branched alkyl group, and the group consisting of an aromatic group which may be optionally substituted, in expressed The method according to the above method.
  • X is N-methylimidazole, pyridine or 3-methylpyridine.
  • R 1 is an H, C n H 2n + 1 or benzyl group.
  • R 2 is H, CH 3 , or C 6 H 5 and n is 1, 2 or 3, The method according to [13].
  • [15] A method for producing an oligonucleotide. In the presence of the activator, the coupling step of binding the nucleoside phosphoramidite to the 3'or 5'hydroxyl or thiol group of the nucleotide or nucleoside is performed one or more times.
  • the nucleoside phosphoramidite is (a) a nucleoside phosphoramidite having two or more nucleoside moieties, or (b) a nucleoside phosphoramidite having one or more nucleoside moieties and a linker moiety.
  • the HOMO energy (au) of the activator is -0.21407 to -0.16858 in acetonitrile and The orbital coefficient of the activator is 0.31531 to 0.59405 in acetonitrile.
  • the method. [16] The method according to [15], wherein the pKa of the activator is 3.65 to 7 in water.
  • nucleoside phosphoramidite is (a) a nucleoside phosphoramidite having two or three nucleoside moieties, or (b) a nucleoside phosphoramidite having one or more nucleoside and linker moieties.
  • the HOMO energy (au) of the activator is -0.22024 to -0.16858 in acetonitrile and The orbital coefficient of the activator is 0.31531 to 0.59405 in acetonitrile.
  • the method. [18] The method according to [17], wherein the activator pKa is 3.65-7 in water. [19] A method for producing an oligonucleotide. In the presence of the activator, the coupling step of binding the nucleoside phosphoramidite to the 3'or 5'hydroxyl or thiol group of the nucleotide or nucleoside is performed one or more times.
  • the nucleoside phosphoramidite is (a) a nucleoside phosphoramidite having two or three nucleoside moieties, or (b) a nucleoside phosphoramidite having one or more nucleoside and linker moieties.
  • Amidite, The activator pKa is 3.65-7 in water.
  • the method. [20] A method for producing an oligonucleotide. In the presence of the activator, the coupling step of binding the nucleoside phosphoramidite to the 3'or 5'hydroxyl or thiol group of the nucleotide or nucleoside is performed one or more times.
  • the nucleoside phosphoramidite is (a) a nucleoside phosphoramidite having two or more nucleoside moieties, or (b) a nucleoside phosphoramidite having one or more nucleoside moieties and a linker moiety.
  • the activator pKa is 4.3-7 in water. The method.
  • nucleoside phosphoramidite having two or more nucleoside moieties that is, a segmented amidite, or a nucleoside phosphoramidite having one or more nucleoside moieties and a linker moiety.
  • Oligonucleotides can be synthesized with.
  • nucleoside phosphoramidite having two or more nucleoside moieties, that is, a segmented amidite in the final one of the coupling steps, the desired oligonucleotide and the chromatographic mobility are close to each other, and by purification.
  • the formation of (N-1) mer which is difficult to remove, can be suppressed.
  • the use of the activator of the present invention as the activator also contributes to the suppression of decomposition of segmented amidite in the synthetic process.
  • the present invention in one aspect, is a method of producing an oligonucleotide, which, in the presence of an activator, couples a nucleoside phosphoramidite to a nucleotide or nucleoside having an unsubstituted hydroxyl group or an unsubstituted thiol group.
  • the present invention relates to the above method, which comprises performing the step one or more times.
  • the production of an oligonucleotide is a so-called phosphorotide in which nucleotides are added by a condensation reaction between a nucleoside phosphoramidite and a nucleoside in the presence of a suitable activator in a solution or on a solid support. It is performed using the amidite method.
  • the oligonucleotide refers to a compound having a structure in which a base, a sugar, and a phosphoric acid are linked by a phosphodiester bond, and a naturally occurring oligonucleotide such as 2'-deoxyribonucleic acid (hereinafter, "DNA”) and Includes ribonucleic acid (“RNA”) and nucleic acids containing modified sugar moieties, modified phosphate moieties, or modified nucleobases. Modifications to the sugar moiety include replacing the ribose ring with a hexose, cyclopentyl, or cyclohexyl ring.
  • the D-ribose ring of a naturally occurring nucleic acid may be replaced with an L-ribose ring, or the ⁇ -anomer of a naturally occurring nucleic acid may be replaced with an ⁇ -anomer.
  • Oligonucleotides may also contain one or more non-basic moieties. Modified phosphate moieties include phosphorothioate, phosphorodithioate, methylphosphonate, and methyl phosphate. Such nucleic acid analogs are known to those of skill in the art.
  • Oligonucleotides comprising the above two or more mixtures include, for example, mixtures of deoxyribo and ribonucleosides, particularly 2'-O such as deoxyribonucleoside and 2'-O-methyl or 2'-O-methoxyethylribonucleoside.
  • Examples of oligonucleotides comprising a mixture of nucleosides include ribozymes.
  • nucleoside phosphoramidite refers to a nucleoside derivatized with amidite.
  • Amiditeization can be carried out, for example, by using 1H-tetrazole as an activator and reacting a properly protected nucleoside with 2-cyanoethyl-N, N, N', N'-tetraisopropylphosphorodiamidite. it can.
  • the nucleoside refers to a compound in which a base and a sugar are bound, and may be a naturally occurring nucleoside such as adenosine, thymidine, guanosine, cytidine, or uridine, or a modified nucleoside.
  • the base may be a naturally occurring base such as adenine, guanine, cytosine, thymine, and uracil, or a modified base.
  • the sugar moiety of the nucleoside may be naturally occurring deoxyribose or ribose, and may be in the D or L configuration.
  • the activator is used for reacting a nucleoside phosphoramidite with a nucleotide or a nucleoside, and is also referred to as an activator or a coupling agent.
  • the activator is defined by the following formula:
  • X is an organic base that forms a salt complex with saccharin, preferably N-methylimidazole, pyridine or 3-methylpyridine.
  • R 1 and R 2 are each independently, H, are selected from linear or C 1 ⁇ 7 branched alkyl group, and the group consisting of an aromatic group which may be optionally substituted, It has a structure represented by.
  • R 1 and R 2 are independently H, methyl group, ethyl group, propyl group, butyl group, pentyl group, hexyl group, phenyl group and benzyl group, and more preferably R 1 is. , H, C n H 2n + 1 or a benzyl group, R 2 is H, CH 3 , or C 6 H 5 , and n is 1, 2 or 3.
  • the activator is, for example, 5-mercapto-1-methyltetrazole (1-Me-MCT): 5-Mercapto-1-phenyltetrazole (1-Ph-MCT): 5-Benzylthiotetrazole (BTT): Saccharin 1-methylimidazole (SMI): 5-Ethylthio-1H-Tetrazole (ETT) 4,5-Dicyanoimidazole (DCI): Or benzimidazole trifluoromethanesulfonate (BIT): It is preferably 1-Me-MCT, 1-Ph-MCT, SMI, ETT, or BTT, and more preferably 1-Me-MCT, 1-Ph-MCT, or SMI.
  • the HOMO energy (au) of the activator of the invention is -0.22024 to -0.16858 in acetonitrile.
  • the HOMO energy (au) of the activator of the present invention is -0.21995 to -0.16858, -0.21407 to -0.16858, -0.19928 to -0.16858 in acetonitrile. , -0.18904 to -0.16858, or -0.18741 to -0.16885, preferably -0.21407 to -0.16858 (a.u.), and more preferably-. It is 0.18904 to ⁇ 0.16858 (au).
  • the orbital coefficients of the activators of the invention are 0.31531 to 0.59405 in acetonitrile.
  • the orbital coefficients of the activators of the present invention are 0.31531 to 0.59405, 0.39931 to 0.59405, 0.51802 to 0.59405, or 0.53787 to 0.59405 in acetonitrile.
  • it is 0.39931 to 0.59405.
  • the HOMO energy (au) of the activator is -0.22024 to -0.16858 in acetonitrile, and the orbital coefficient of the activator is 0. It is 31531 to 0.59405.
  • the HOMO energy (a.u.) of the activator is -0.21407 to -0.16858 in acetonitrile, and the orbital coefficient of the activator is 0. It is 31531 to 0.59405.
  • the HOMO energy and orbital coefficient can be obtained by a quantum chemistry calculation program. For example, in the quantum chemistry calculation program Gaussian16 manufactured by Gaussian, an optimization calculation using the Becke-type 3-parameter density functional theory (B3LYP) is performed. Can be sought.
  • the pKa of the activator of the invention in water at 25 ° C. is 3.65 to 7.0, eg, 3.86 to 7.0, 4.1 to 7.0, 4. It is 3 to 7.0, 4.5 to 7.0, 5.0 to 7.0, 5.5 to 7.0, 6.0 to 7.0, or 6.5 to 7.0.
  • the nucleoside phosphoramidite in at least one coupling step in the method of producing said oligonucleotides, is (a) a nucleoside phosphoramidite having two or more nucleoside moieties, or (b). ) A nucleoside phosphoramidite having one or more nucleoside and linker moieties.
  • the nucleoside phosphoramidite in at least one coupling step in the method of producing said oligonucleotides, is (a) a nucleoside phosphoramidite having two or three nucleoside moieties, or (B) A nucleoside phosphoramidite having one or more nucleoside and linker moieties.
  • a nucleoside phosphoramidite having two or three nucleoside moieties reacts because it has a smaller molecular size, is more motivated and has a faster reaction rate than a nucleoside phosphoramidite having four or more nucleoside moieties. It is presumed that the rate will increase.
  • the nucleoside phosphoramidite in at least the last one of the two or more coupling steps in the method of producing the oligonucleotide, is (a) a nucleoside having two or more nucleoside moieties. Phosphoramidite, or (b) a nucleoside phosphoramidite having one or more nucleoside and linker moieties.
  • the nucleoside phosphoramidite in at least the last one of the two or more coupling steps in the method of producing said oligonucleotides, is a nucleoside phosphoramidite having three nucleoside moieties. is there.
  • the nucleoside phosphoramidite is a nucleoside phosphoramidite having one nucleoside moiety in at least one of the coupling steps performed two or more times in the method for producing the oligonucleotide.
  • the nucleoside phosphoramidite in only the last one of the two or more coupling steps in the method of producing the oligonucleotide, is (a) a nucleoside phosphorami having three nucleoside moieties. Loamidite, or (b) a nucleoside phosphoramidite having one or more nucleoside and linker moieties, and in the other coupling steps, the nucleoside phosphoramidite is a nucleoside phosphorami having one nucleoside moiety. Amidite.
  • nucleoside phosphoramidite having two or more nucleoside moieties can be prepared, for example, as described in WO 2019/212061.
  • the nucleoside phosphoramidite having two or more nucleoside moieties is represented by the following formula (I). Nucleoside phosphoramidite represented by or a stereoisomer thereof.
  • X 1 is -O- or -S-, respectively.
  • X 2 is -O- or -S-, respectively.
  • X 3 is independently of -O-, -S-, -CH 2- or-(CH 2 ) 2- .
  • R 1 is a protecting group, preferably an acid-labile protecting group, or a trialkylsilyl group such as t-butyldimethylsilyl or triisopropylsilyl.
  • Acid-labile protecting groups are protecting groups that can be removed by contacting the group with a protonic acid or Lewis acid. Acid-labile protecting groups are known to those of skill in the art. Examples of acid-unstable protecting groups include substituted or unsubstituted trityl groups, substituted or unsubstituted tetrahydropyranyl groups, substituted or unsubstituted tetrahydrofuranyl groups, pixyl groups and the like.
  • R 1 is a substituted or unsubstituted trityl, 9-phenylxanthenyl (hereinafter “Pixil”) or tetrahydropyranyl (hereinafter "THP").
  • R 1 is an unsubstituted trityl, monoalkoxytrityl, dialkoxytrityl, trialkoxytrityl, THP or pixil. Most preferably, R 1 is 4,4'-dimethoxytrityl.
  • R 2 is independently any of H, NHR 6 , halogen, CN, CF 3 , or hydroxyl group protected with an acyl protecting group, an ether protecting group or a silyl protecting group. It is one.
  • Halogen is, for example, F, Cl, Br, and I.
  • the acyl-based protecting group include acetyl, benzoyl, pivaloyl and the like.
  • the ether-based protecting group include benzyl, p-methoxybenzyl (PMB), allyl and the like.
  • silyl protecting group examples include t-butyldimethylsilyl (TBS), t-butyldiphenylsilyl (TBDPS), t-triisopropylsilyl (TIPS), triethylsilyl (TES), trimethylsilyl (TMS) and the like. ..
  • TBS t-butyldimethylsilyl
  • TDPS t-butyldiphenylsilyl
  • TIPS t-triisopropylsilyl
  • TES triethylsilyl
  • TMS trimethylsilyl
  • R 3 is independently each of -OCH 2 CH 2 CN, -SCH 2 CH 2 CN, substituted or unsubstituted aliphatic group, -OR 7 or -SR 7 .
  • it is ⁇ OCH 2 CH 2 CN.
  • Substituted or unsubstituted aliphatic groups include, but are not limited to, 4-cyanobut-2-enylthio, 4-cyanobut-2-enyloxy, allylthio, allyloxy, crotylthio or crotyloxy and the like.
  • R 4 and R 5 are independently substituted or unsubstituted aliphatic groups, substituted or unsubstituted aromatic groups, substituted or unsubstituted alalkyl groups, respectively. Or R 4 and R 5 together with the nitrogen to which they are attached form a heterocycloalkyl group or a heteroaromatic group.
  • Substituted or unsubstituted aliphatic groups include, but are not limited to, methyl, ethyl, isopropyl and the like, and isopropyl is preferable.
  • Substituted or unsubstituted aromatic groups include, but are not limited to, phenyl, benzyl, naphthyl, 2-pyrenylmethyl, and are preferably phenyl and benzyl.
  • Substituted or unsubstituted alalkyl groups include, but are not limited to, 2-fluorophenylmethoxypiperidine-4-yl and the like.
  • the heterocycloalkyl group is not limited to these, and examples thereof include pyrrolidino and morpholino, and morpholino is preferable.
  • each of R 6 is independently ⁇ H, a substituted or unsubstituted aliphatic group, a substituted or unsubstituted aromatic group, a substituted or unsubstituted alalkyl group.
  • one of the protective groups including the acyl group.
  • Substituted or unsubstituted aliphatic groups include, but are not limited to, methyl, ethyl, allyl, 1-pentenyl, 2-methoxyethyl, preferably methyl, allyl, 2-methoxyethyl. is there.
  • Substituted or unsubstituted aromatic groups include, but are not limited to, phenyl, benzyl, naphthyl, 2-pyrenylmethyl, and are preferably phenyl and benzyl.
  • Substituted or unsubstituted alalkyl groups include, but are not limited to, 2-fluorophenylmethoxypiperidine-4-yl and the like.
  • Protecting groups are, for example, t-butyldimethylsilyl, trifluoroacetyl, tert-butoxycarbonyl, benzyloxycarbonyl, phthaloyl, p-toluenesulfonyl.
  • R 7 is a substituted or unsubstituted aliphatic group, a substituted or unsubstituted aromatic group, or a substituted or unsubstituted alalkyl group.
  • Substituted or unsubstituted aliphatic groups include, but are not limited to, THP, 4-methoxytetrahydropyranyl and the like.
  • Substituted or unsubstituted aromatic groups include, but are not limited to, o-chlorophenyl, p-chlorophenyl, and the like.
  • Substituted or unsubstituted alalkyl groups include, but are not limited to, 2-fluorophenylmethoxypiperidine-4-yl and the like.
  • B 1 , B 2 and B 3 are H, or protected or unprotected bases, respectively.
  • Protected or unprotected bases include, but are not limited to, naturally occurring bases such as adenin, guanine, cytosine, thymine, and uracil, as well as 7-deazaguanine, 7-deaza-8-azaguanine.
  • n is 0 or a positive integer, preferably an integer of 0 or more and 4 or less, and more preferably 0 or 1.
  • a nucleoside phosphoramidite having one or more nucleoside and linker moieties is located at the 5'position of the nucleoside via a phosphorus atom, eg, a phosphite ester, a phosphate ester, a thiophosphate. It is a nucleoside phosphoramidite in which a linker is bound via an ester and a dithiophosphate.
  • the nucleoside phosphoramidite having one or more nucleoside moieties and linker moieties is not limited to these, but can be obtained from, for example, Glen Research, as shown below. It may be prepared from phosphoramidite having: PC Linker Phosphoramidite (3- (4,4'-dimethoxytrityl) -1- (2-nitrophenyl) -propane-1-yl-[(2-cyanoethyl)-(N, N-diisopropyl)]-phosphoroamidite )
  • ⁇ -Tocopherol-TEG Phosphoramidite (1-dimethoxytrityloxy-3-O-[(9-DL- ⁇ -tocopherol) -triethylene glycol-1-yl] -glyceryl-2-O-[(2-cyanoethyl)- (N, N, -diisopropyl)]-Phosphoramidite)
  • 5'-DBCO-TEG Phosphoramidite (10- (6-oxo-6- (dibenzo [b, f] azacycloocta-4-in-1-yl) -caproamide-N-ethyl) -O-triethylene glycol- 1-[(2-Cyanoethyl)-(N, N-diisopropyl)]-Phosphoramidite)
  • DNP-TEG Phosphoramidite (1-dimethoxytrityloxy-3-O- [N- (2,4-dinitrophenyl) -3-N-aminopropyl- (triethylene glycol)]-glyceryl-2-O- (2-) Cyanoethyl)-(N, N-diisopropyl) -phosphoromidite)
  • Cholesteryl-TEG Phosphoramidite (1-dimethoxytrityloxy-3-O- (N-cholesteryl-3-aminopropyl) -triethylene glycol-glyceryl-2-O- (2-cyanoethyl)-(N, N, -diisopropyl) -Phosphoramidite)
  • TEG CE-Phosphoramidite (10- (O-trifluoroacetamide-N-ethyl) -triethylene glycol-1-[(2-cyanoethyl)-(N, N-diisopropyl)]-phosphoroamidite )
  • Spacer Phosphoramidite 18 (18-O-dimethoxytritylhexaethylene glycol, 1-[(2-cyanoethyl)-(N, N-diisopropyl)]-phosphoroamidite)
  • Spacer Phosphoramidite 9 (9-O-dimethoxytrityl-triethylene glycol, 1-[(2-cyanoethyl)-(N, N-diisopropyl)]-phosphoroamidite)
  • PC Amino-Modifier Phosphoramidite [(6-trifluoroacetylamide caproamide methyl) -1- (2-nitrophenyl) -ethyl] -2-cyanoethyl- (N, N-diisopropyl) -phosphoroamidite)
  • Thiol-Modifier C6 SS (1-O-dimethoxytrityl-hexyl-disulfide, 1'-[(2-cyanoethyl)-(N, N-diisopropyl)]-phosphoroamidite)
  • 5'-Carboxy-Modifier C10 (10-carboxy-decyl- (2-cyanoethyl)-(N, N-diisopropyl) -phosphoromidite, N-hydroxysuccinimide ester)
  • PC Biotin Phosphoramidite (1- [2-nitro-5-(6- (N- (4,4'-dimethoxytrityl))-biotinamide caproamide methyl) phenyl] -ethyl- [2-cyanoethyl- (N, N) -Diisopropyl)]-Phosphoramidite)
  • Azobenzene Phosphoramidite (3-O- (dimethoxytrityl) -2-N- (4-carboxyazobenzene) -D-threonine-1-yl-O-[(2-cyanoethyl)-(N, N-diisopropyl)]-phospho Loamidite)
  • Psoralen C6 Phosphoramidite (6- [4'-(hydroxymethyl) -4,5', 8-trimethylsoleran] -hexyl-1-O- (2-cyanoethyl)-(N, N-diisopropyl) -phosphoroamidite )
  • Psoralen C2 Phosphoramidite (2- [4'-(hydroxymethyl) -4,5', 8-trimethylsoleran] -ethyl-1-O- (2-cyanoethyl)-(N, N-diisopropyl) -phosphoroamidite )
  • CNVK 3-Cyanovinylcarbazole Phosphoramidite
  • nucleoside phosphoramidite having one or more nucleoside moieties and a linker moiety is represented by the following formula (II). Nucleoside phosphoramidite represented by or a stereoisomer thereof.
  • X 1 is -O- or -S-, respectively.
  • X 2 is -O- or -S-, respectively.
  • X 3 is independently of -O-, -S-, -CH 2- or-(CH 2 ) 2- .
  • L is a linker. The linker is not limited to these, but for example,
  • R 2 was independently protected with -H, -NHR 6 , halogen, -CN, -CF 3 , or an acyl-based protecting group, an ether-based protecting group, or a silyl-based protecting group. It is one of the hydroxyl groups.
  • Halogen is, for example, F, Cl, Br, and I.
  • Examples of the acyl-based protecting group include acetyl, benzoyl, pivaloyl and the like.
  • the ether-based protecting group include benzyl, p-methoxybenzyl (PMB), allyl and the like.
  • silyl protecting group examples include t-butyldimethylsilyl (TBS), t-butyldiphenylsilyl (TBDPS), t-triisopropylsilyl (TIPS), triethylsilyl (TES), trimethylsilyl (TMS) and the like. ..
  • TBS t-butyldimethylsilyl
  • TDPS t-butyldiphenylsilyl
  • TIPS t-triisopropylsilyl
  • TES triethylsilyl
  • TMS trimethylsilyl
  • R 3 are independently -OCH 2 CH 2 CN, -SCH 2 CH 2 CN, substituted or unsubstituted aliphatic groups, -OR 7 or -SR 7 .
  • it is ⁇ OCH 2 CH 2 CN.
  • Substituted or unsubstituted aliphatic groups include, but are not limited to, 4-cyanobut-2-enylthio, 4-cyanobut-2-enyloxy, allylthio, allyloxy, crotylthio or crotyloxy and the like.
  • R 4 and R 5 are independently substituted or unsubstituted aliphatic groups, substituted or unsubstituted aromatic groups, substituted or unsubstituted alalkyl groups, respectively. Or R 4 and R 5 together with the nitrogen to which they are attached form a heterocycloalkyl group or a heteroaromatic group.
  • Substituted or unsubstituted aliphatic groups include, but are not limited to, methyl, ethyl, isopropyl and the like, and isopropyl is preferable.
  • Substituted or unsubstituted aromatic groups include, but are not limited to, phenyl, benzyl, toluyl, aniryl and the like, with preference given to phenyl and benzyl.
  • Heterocycloalkyl groups include, but are not limited to, pyrrolidino, morpholino, and the like.
  • each of R 6 is independently ⁇ H, a substituted or unsubstituted aliphatic group, a substituted or unsubstituted aromatic group, a substituted or unsubstituted alalkyl group.
  • one of the protective groups including the acyl group.
  • Substituted or unsubstituted aliphatic groups include, but are not limited to, methyl, ethyl, allyl, 1-pentenyl, 2-methoxyethyl, preferably methyl, allyl, 2-methoxyethyl. is there.
  • Substituted or unsubstituted aromatic groups include, but are not limited to, phenyl, benzyl, naphthyl, 2-pyrenylmethyl, and are preferably phenyl and benzyl.
  • the protecting group is, for example, t-butyldimethylsilyl.
  • R 7 is a substituted or unsubstituted aliphatic group, a substituted or unsubstituted aromatic group, or a substituted or unsubstituted alalkyl group.
  • Substituted or unsubstituted aliphatic groups include, but are not limited to, THP, 4-methoxytetrahydropyranyl and the like.
  • Substituted or unsubstituted aromatic groups include, but are not limited to, o-chlorophenyl, p-chlorophenyl, and the like.
  • Substituted or unsubstituted alalkyl groups include, but are not limited to, 2-fluorophenylmethoxypiperidine-4-yl and the like.
  • B 1 and B 2 are H, or protected or unprotected bases, respectively.
  • Protected or unprotected bases include, but are not limited to, naturally occurring bases such as adenin, guanine, cytosine, thymine, and uracil, as well as 7-deazaguanine, 7-deaza-8-azaguanine.
  • B 1 and B 2 are adenine.
  • n is 0 or a positive integer, preferably an integer of 0 or more and 4 or less, and more preferably 0 or 1.
  • Example 1 Comparison between sequential method and segment method (1) Synthesis of oligonucleotides dT NittoPhase (registered trademark) HL dT300 (manufactured by Nitto Denko KK) was packed in a reaction column in an amount corresponding to 1573 ⁇ mol, and a nucleic acid synthesizer AKTA oligopilot was added. A 17mer (5'CCG ATT AAG CGA AGC TT 3') DNA oligonucleotide was synthesized using plus100 (Cytiva, formerly manufactured by GE Healthcare Japan).
  • a solid phase carrier with 17mer DNA was packed in the reaction column in an amount corresponding to 205 ⁇ mol, and dC, dT, using 5-ethylthio-1H-tetrazole (ETT) as an activator with the nucleic acid synthesizer AKTA oligopilot plus100.
  • ETT 5-ethylthio-1H-tetrazole
  • the dATC was made as described in International Publication No. 2019/212061.
  • the solid-phase carrier to which the DNA oligonucleotide was bound was immersed in 28% aqueous ammonia, and the DNA oligonucleotide was cut out from the solid-phase carrier. A part of this solution was diluted with water to prepare a DNA oligonucleotide sample solution. The remaining solution was a crude solution.
  • the contents of impurity I and impurity II were 2.9% and 2.8%, respectively, whereas when synthesized by the segment method 1, impurities I and impurities were contained.
  • the content of II was 0.6% and 0.4%, respectively, and when synthesized by the segment method 2, it was 0.7% and 1.8%, respectively.
  • the contents of impurity I and impurity II could be significantly reduced as compared with the case of synthesis by the successive method.
  • Table 2 shows the analysis results of the purified DNA oligonucleotide sample solution.
  • the purity of the target oligonucleotide was 90.46% in the successive method, 92.34% in the segment method 1, and 92.53% in the segment method 2, and the oligonucleotide was synthesized by the segment method. In some cases, the desired oligonucleotide could be obtained with higher purity than when synthesized by the successive method. Further, the FLP (total length product, purity ⁇ total OD) is 9302 in the successive method, 10702 in the segment method 1, and 10724 in the segment method 2, and when synthesized by the segment method, it is 10724. Compared with the case of synthesis by the successive method, the desired oligonucleotide could be obtained with a high yield.
  • Example 2 Comparison of reaction rates (1) Synthesis of DNA oligonucleotide Nitto Phase (registered trademark) HL UnyLinker 350 (manufactured by Nitto Denko KK) was packed in a reaction column in an amount corresponding to 2935 ⁇ mol, and a nucleic acid synthesizer AKTA oligopilot plus 100 was used. A 17mer (5'CCG ATT AAG CGA AGC TT 3') DNA oligonucleotide was synthesized.
  • HL UnyLinker 350 manufactured by Nitto Denko KK
  • Suitable synthetic reagents include 3% DCA in toluene as a deprotecting agent, pyridine in water and iodine as an oxidizing agent, pyridine in acetonitrile as a capping agent, N-methylimidazole, acetic anhydride or isobutyric anhydride, and an amine wash reaction solution. TBA in acetonitrile was used.
  • the dGCC was made as described in International Publication No. 2019/212061.
  • the solid-phase carrier to which the DNA oligonucleotide was bound was immersed in aqueous ammonia, and the DNA oligonucleotide was cut out from the solid-phase carrier.
  • Activator42 has the following structure: Have.
  • RNA oligonucleotide NittoPhase registered trademark
  • HL rU250 manufactured by Kinovate Life Science
  • 17mer synthesis was performed using a nucleic acid synthesizer AKTA oligopilot plus100.
  • RNA oligonucleotides of CCG AUU AAG CGA AGC UU 3' were synthesized.
  • a solid phase carrier with 17 mer RNA was loaded into the reaction column in an amount corresponding to 85 ⁇ mol, and 5-mercapto-1-methyltetrazole (1-Me-MCT) and saccharin were used as activators with the nucleic acid synthesizer AKTA oligopilot plus10.
  • RNA oligonucleotide was excised from the solid-phase carrier by slowly dropping 3HF and shaking.
  • Table 3 shows the results in DNA synthesis
  • Table 4 shows the results in RNA synthesis.
  • the HOMO energy and orbital coefficients of the activators used in this experiment are also shown in Tables 3 and 4.
  • the HOMO energy and orbital coefficient were obtained by optimization calculation using the Gaussian quantum chemistry calculation program Gaussian16 manufactured by Gaussian and adopting the Becke-type 3-parameter density functional theory (B3LYP).
  • the structure of the active species BIT is a neutral species, the others are anionic species
  • the actuator makes a nucleophilic attack on amidite
  • the activators showing higher reaction rates than Activator 42 had higher HOMO energy levels and / or higher orbital coefficients. It is considered that the high HOMO energy level of the activator reduces the energy difference between the HOMO energy level of the activator and the LUMO energy level of the segmented amidite, and facilitates the reaction. Further, it is considered that the large orbital coefficient of the activator causes the orbital overlap between the nitrogen atom of the activator and the phosphorus atom of the segmented amidite to be large, and the reaction is likely to occur.
  • Example 3 Comparison of degradation of segmented amidite (1) Synthesis of oligonucleotide using dGCC as segmented amidite Reaction column using the solid phase carrier with 17mer DNA obtained in Example 2 (1) in an amount corresponding to 90 ⁇ mol.
  • nucleic acid synthesizer AKTA oligopilot plus10 0.6M 5-mercapto-1-methyltetrazole (1-Me-MCT) and 0.5M 5-mercapto-1-phenyltetrazole (1-Ph-MCT) were used as activators.
  • BTT 0.25M 5-benzylthiotetrazole
  • SMI 0.25M saccharin 1-methylimidazole
  • ETT 0.6M 5-ethylthio-1H-tetrazole
  • Activator42 0.25M 5- [3,5 -Bis (trifluoromethyl) phenyl] -1H-tetrazole
  • Other synthetic reagents include 3% DCA in toluene as a deprotecting agent, pyridine in water and iodine as an oxidizing agent, pyridine in acetonitrile as a capping agent, N-methylimidazole, acetic anhydride, and TBA in acetonitrile as an amine wash reaction solution.
  • the dGCC was made as described in International Publication No. 2019/212061.
  • the solid-phase carrier to which the DNA oligonucleotide was bound was immersed in aqueous ammonia at 55 ° C. for 12 to 16 hours, and the DNA oligonucleotide was cut out from the solid-phase carrier.
  • Table 5 also shows the pKa values of the activators used in this experiment in water.
  • the peak area of Impurity II was 9.089%, and remarkable decomposition of segmented amidite was observed.
  • the peak area of Impurity II was about 1 to 2%, and almost no decomposition was observed. It is highly probable that Impurity II was generated by the decomposition of the phosphoric acid diester bond that connects the oligonucleotide and the segmented amidite with an acid.

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Abstract

本発明は、セグメント型アミダイトを用いてオリゴヌクレオチドを合成する方法の提供を目的とする。オリゴヌクレオチドを製造する方法であって、アクチベータの存在下で、ヌクレオチドまたはヌクレオシドの３'または５'の水酸基またはチオール基に、ヌクレオシドホスホロアミダイトを結合させるカップリング工程を１回以上行うことを含み、少なくとも１回のカップリング工程において、前記ヌクレオシドホスホロアミダイトが（ａ）２個以上のヌクレオシド部分を有するヌクレオシドホスホロアミダイト、または（ｂ）１個以上のヌクレオシド部分およびリンカー部分を有するヌクレオシドホスホロアミダイトであり、前記アクチベータが、以下の式（１）： 式（１）中、Ｘは、有機塩基である、 または、以下の式（２）： 式（２）中、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、Ｈ、直鎖または分岐鎖のＣ１～７アルキル基、および任意に置換されていてもよい芳香族基からなる群から選択される、で表される構造を有する、前記方法などにより、上記課題が解決された。

Description

セグメント型アミダイトを用いた核酸合成法
　本発明は、セグメント型アミダイトを用いてオリゴヌクレオチドを合成する方法に関する。
　ＤＮＡオリゴヌクレオチドやＲＮＡオリゴヌクレオチド等の核酸の化学合成において、ホスホロアミダイト法が広く用いられている。この方法において、所望の配列を有するオリゴヌクレオチドは、典型的には、適切に保護されたヌクレオシドを１つずつ、順次付加していくことによって合成される。しかしながら、反応は１００％の確率で生じることはなく、また、付加されたヌクレオシドが合成反応中に分解されてしまうこともあり、所望の長さ（Ｎ）に対して１以上（ｎ）短い長さを有するオリゴヌクレオチド（Ｎ－ｎ）ｍｅｒは必然的に生じ得る。合成後、オリゴヌクレオチドは、クロマトグラフィー等によって精製されるが、所望の長さを有するオリゴヌクレオチドである（Ｎ）ｍｅｒと、所望の長さ（Ｎ）に対して１ヌクレオチド短い（Ｎ－１）ｍｅｒは、クロマトグラフィー移動度が近いため、（Ｎ－１）ｍｅｒの存在は、オリゴヌクレオチドの精製効率や精製品の純度に大きな影響を与える。
　特許文献１および２ならびに非特許文献１には、（Ｎ－１）ｍｅｒのオリゴヌクレオチドの生成を抑えるための方法として、合成において、２個または３個のヌクレオシド部分を有するヌクレオシドホスホロアミダイト（セグメント型アミダイト）を利用する方法が記載されているが、それらの方法は十分に効率な方法ではなかった。
　また、特許文献３には、オリゴヌクレオチドの合成において１Ｈ－テトラゾールよりも安全に使用することができるアクチベータとして、サッカリンの誘導体が記載されている。しかしながら、特許文献３においては、サッカリンの誘導体のアクチベータとしての性能については十分に検討されていない。また、特許文献４には、１Ｈ－テトラゾールに代わるアクチベータとして、少なくとも１つのピリジニウム塩および少なくとも１つの置換されたイミダゾールを含むアクチベータ、イミダゾリウム塩およびベンゾイミダゾリウム塩が記載されている。しかしながら、特許文献４においては、アクチベータとして、サッカリンとの塩を用いることについては記載されていない。
国際公開第０２／２０５４３号 特表第２０１７－５１４４７９号 米国特許第７，５０１，５０５号 米国特許第６，６４２，３７３号
RNA synthesis via dimer and trimer phosphoramidite block coupling [Tetrahedron Letters 52 (2011) 2575-2578]
　本発明は、セグメント型アミダイトを用いてオリゴヌクレオチドを合成する方法の提供を目的とする。
　本発明者らは、セグメント型アミダイトを用いてオリゴヌクレオチドを合成する方法について鋭意研究に取り組む中で、当該方法において有用なアクチベータを見出した。そしてかかる知見に基づいてさらに研究を続けた結果、本発明を完成させた。
　すなわち、本発明は以下に関する。
　[１]オリゴヌクレオチドを製造する方法であって、
アクチベータの存在下で、ヌクレオチドまたはヌクレオシドの３’または５’の水酸基またはチオール基に、ヌクレオシドホスホロアミダイトを結合させるカップリング工程を１回以上行うことを含み、
少なくとも１回のカップリング工程において、前記ヌクレオシドホスホロアミダイトが
（ａ）２個以上のヌクレオシド部分を有するヌクレオシドホスホロアミダイト、または
（ｂ）１個以上のヌクレオシド部分およびリンカー部分を有するヌクレオシドホスホロアミダイト
であり、
前記アクチベータが、以下の式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
  
式中、
Ｘは、有機塩基である、
または、以下の式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
  
式中、
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、Ｈ、直鎖または分岐鎖のＣ１～７アルキル基、および任意に置換されていてもよい芳香族基からなる群から選択される、
で表される構造を有する、前記方法。
　[２]Ｘは、Ｎ－メチルイミダゾール、ピリジンまたは３－メチルピリジンであり、
Ｒ１は、Ｈ、ＣｎＨ２ｎ＋１またはベンジル基であり、
Ｒ２は、Ｈ、ＣＨ３、またはＣ６Ｈ５であり、
ｎは、１、２または３である、
[１]に記載の方法。
　[３]前記アクチベータが、５－メルカプト－１－メチルテトラゾール（１－Ｍｅ－ＭＣＴ）、５－メルカプト－１－フェニルテトラゾール（１－Ｐｈ－ＭＣＴ）、サッカリン１－メチルイミダゾール（ＳＭＩ）、または５－エチルチオ－１Ｈ－テトラゾール（ＥＴＴ）である、[１]または[２]に記載の方法。
　[４]２回以上行われるカップリング工程の少なくとも最後の１回において、
ヌクレオシドホスホロアミダイトが
（ａ）２個以上のヌクレオシド部分を有するヌクレオシドホスホロアミダイト、または
（ｂ）１個以上のヌクレオシド部分およびリンカー部分を有するヌクレオシドホスホロアミダイト
である、[１]～[３]のいずれか一つに記載の方法。
　[５]２回以上行われるカップリング工程の少なくとも最後の１回において、
ヌクレオシドホスホロアミダイトが３個のヌクレオシド部分を有するヌクレオシドホスホロアミダイトである、
[１]～[４]のいずれか一つに記載の方法。
　[６]２回以上行われるカップリング工程の少なくとも１回において、
ヌクレオシドホスホロアミダイトが１個のヌクレオシド部分を有するヌクレオシドホスホロアミダイトである、
[１]～[５]のいずれか一つに記載の方法。
　[７]２回以上行われるカップリング工程の最後の１回のみにおいて、
ヌクレオシドホスホロアミダイトが
（ａ）３個のヌクレオシド部分を有するヌクレオシドホスホロアミダイト、または
（ｂ）１個以上のヌクレオシド部分およびリンカー部分を有するヌクレオシドホスホロアミダイト
であり、
　その他の回のカップリング工程において、
ヌクレオシドホスホロアミダイトが１個のヌクレオシド部分を有するヌクレオシドホスホロアミダイトである、
[１]～[６]のいずれか一つに記載の方法。
　[８]２個以上のヌクレオシド部分を有するヌクレオシドホスホロアミダイトが、下記式（Ｉ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
 式中、
Ｘ１は、各々独立して、－Ｏ－または－Ｓ－であり；
Ｘ２は、各々独立して、－Ｏ－または－Ｓ－であり；
Ｘ３は、各々独立して、－Ｏ－、－Ｓ－、－ＣＨ２－または－（ＣＨ２）２－であり；
Ｒ１は保護基であり；
Ｒ２は、各々独立して、－Ｈ、－ＮＨＲ６、ハロゲン、－ＣＮ、－ＣＦ３、またはアシル系保護基、エーテル系保護基もしくはシリル系保護基で保護された水酸基であり；
Ｒ３は、各々独立して、－ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ、－ＳＣＨ２ＣＨ２ＣＮ、置換されたもしくは未置換の脂肪族基、－ＯＲ７または－ＳＲ７であり；
Ｒ４およびＲ５は、各々独立して、置換されたもしくは未置換の脂肪族基、置換されたもしくは未置換の芳香族基、置換されたもしくは未置換のアルアルキル基であり；または
Ｒ４およびＲ５は、それらが結合している窒素と一緒になって、ヘテロシクロアルキル基またはヘテロ芳香族基を形成し；
Ｒ６は、各々独立して、－Ｈ、置換されたもしくは未置換の脂肪族基、置換されたもしくは未置換の芳香族基、置換されたもしくは未置換のアルアルキル基、または保護基であり；
Ｒ７は、各々独立して、置換されたもしくは未置換の脂肪族基、置換されたもしくは未置換の芳香族基、または置換されたもしくは未置換のアルアルキル基であり；
Ｂ１、Ｂ２およびＢ３は、各々独立して、－Ｈ、または保護されたもしくは無保護の塩基であり；および
ｎは０または正の整数である； 
で示されるヌクレオシドホスホロアミダイトまたはその立体異性体である、[１]～[７]のいずれか一つに記載の方法。
　[９]ｎが０または１である、[８]に記載の方法。
　[１０]Ｒ２が－Ｈである、[８]または[９]に記載の方法。
　[１１]Ｒ３が－ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮである、[８]～[１０]のいずれか一つに記載の方法。
　[１２]１個以上のヌクレオシド部分およびリンカー部分を有するヌクレオシドホスホロアミダイトが、下記式（ＩＩ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
 式中、
Ｘ１は、各々独立して、－Ｏ－または－Ｓ－であり；
Ｘ２は、各々独立して、－Ｏ－または－Ｓ－であり；
Ｘ３は、各々独立して、－Ｏ－、－Ｓ－、－ＣＨ２－または－（ＣＨ２）２－であり；
Ｌはリンカーであり；
Ｒ２は、各々独立して、－Ｈ、－ＮＨＲ６、ハロゲン、－ＣＮ、－ＣＦ３、またはアシル系保護基、エーテル系保護基もしくはシリル系保護基で保護された水酸基であり；
Ｒ３は、各々独立して、－ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ、－ＳＣＨ２ＣＨ２ＣＮ、置換されたもしくは未置換の脂肪族基、－ＯＲ７または－ＳＲ７であり；
Ｒ４およびＲ５は、各々独立して、置換されたもしくは未置換の脂肪族基、置換されたもしくは未置換の芳香族基、置換されたもしくは未置換のアルアルキル基であり；または
Ｒ４およびＲ５は、それらが結合している窒素と一緒になって、ヘテロシクロアルキル基またはヘテロ芳香族基を形成し；Ｒ６は、各々独立して、－Ｈ、置換されたもしくは未置換の脂肪族基、置換されたもしくは未置換の芳香族基、置換されたもしくは未置換のアルアルキル基、または保護基であり；
Ｒ７は、各々独立して、置換されたもしくは未置換の脂肪族基、置換されたもしくは未置換の芳香族基、または置換されたもしくは未置換のアルアルキル基であり；
Ｂ１およびＢ２は、各々独立して、－Ｈ、または保護されたもしくは無保護の塩基であり；および
ｎは０または正の整数である； 
で示されるヌクレオシドホスホロアミダイトまたはその立体異性体である、[１]～[１１]のいずれか一つに記載の方法。
　[１３]オリゴヌクレオチドを製造する方法であって、
アクチベータの存在下で、ヌクレオチドまたはヌクレオシドの３’または５’の水酸基またはチオール基に、ヌクレオシドホスホロアミダイトを結合させるカップリング工程を１回以上行うことを含み、
少なくとも１回のカップリング工程において、前記ヌクレオシドホスホロアミダイトが
（ａ）２個または３個のヌクレオシド部分を有するヌクレオシドホスホロアミダイト、または
（ｂ）１個以上のヌクレオシド部分およびリンカー部分を有するヌクレオシドホスホロアミダイト
であり、
前記アクチベータが、以下の式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
 式中、
Ｘは、有機塩基である、
または、以下の式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
 式中、
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、Ｈ、直鎖または分岐鎖のＣ１～7アルキル基、および任意に置換されていてもよい芳香族基からなる群から選択される、で表される構造を有する、前記方法。
　[１４]Ｘは、Ｎ－メチルイミダゾール、ピリジンまたは３－メチルピリジンであり、
Ｒ１は、Ｈ、ＣｎＨ２ｎ＋１またはベンジル基であり、
Ｒ２は、Ｈ、ＣＨ３、またはＣ６Ｈ５であり、
ｎは、１、２または３である、
[１３]に記載の方法。
　[１５]オリゴヌクレオチドを製造する方法であって、
アクチベータの存在下で、ヌクレオチドまたはヌクレオシドの３’または５’の水酸基またはチオール基に、ヌクレオシドホスホロアミダイトを結合させるカップリング工程を１回以上行うことを含み、
少なくとも１回のカップリング工程において、前記ヌクレオシドホスホロアミダイトが
（ａ）２個以上のヌクレオシド部分を有するヌクレオシドホスホロアミダイト、または
（ｂ）１個以上のヌクレオシド部分およびリンカー部分を有するヌクレオシドホスホロアミダイト
であり、
前記アクチベータのＨＯＭＯエネルギー（ａ．ｕ．）が、アセトニトリル中において、－０．２１４０７～－０．１６８５８であり、かつ、
前記アクチベータの軌道係数が、アセトニトリル中において、０．３１５３１～０．５９４０５である、
前記方法。
　[１６]前記アクチベータのｐＫａが、水中において、３．６５～７である、[１５]に記載の方法。
　[１７]オリゴヌクレオチドを製造する方法であって、
アクチベータの存在下で、ヌクレオチドまたはヌクレオシドの３’または５’の水酸基またはチオール基に、ヌクレオシドホスホロアミダイトを結合させるカップリング工程を１回以上行うことを含み、
少なくとも１回のカップリング工程において、ヌクレオシドホスホロアミダイトが
（ａ）２個または３個のヌクレオシド部分を有するヌクレオシドホスホロアミダイト、または
（ｂ）１個以上のヌクレオシド部分およびリンカー部分を有するヌクレオシドホスホロアミダイトであり、
前記アクチベータのＨＯＭＯエネルギー（ａ．ｕ．）が、アセトニトリル中において、－０．２２０２４～－０．１６８５８であり、かつ、
前記アクチベータの軌道係数が、アセトニトリル中において、０．３１５３１～０．５９４０５である、
前記方法。
　[１８]アクチベータのｐＫａが、水中において、３．６５～７である、[１７]に記載の方法。
　[１９]オリゴヌクレオチドを製造する方法であって、
アクチベータの存在下で、ヌクレオチドまたはヌクレオシドの３’または５’の水酸基またはチオール基に、ヌクレオシドホスホロアミダイトを結合させるカップリング工程を１回以上行うことを含み、
少なくとも１回のカップリング工程において、ヌクレオシドホスホロアミダイトが
（ａ）２個または３個のヌクレオシド部分を有するヌクレオシドホスホロアミダイト、または
（ｂ）１個以上のヌクレオシド部分およびリンカー部分を有するヌクレオシドホスホロアミダイトであり、
前記アクチベータのｐＫａが、水中において、３．６５～７である、
前記方法。
　[２０]オリゴヌクレオチドを製造する方法であって、
アクチベータの存在下で、ヌクレオチドまたはヌクレオシドの３’または５’の水酸基またはチオール基に、ヌクレオシドホスホロアミダイトを結合させるカップリング工程を１回以上行うことを含み、
少なくとも１回のカップリング工程において、ヌクレオシドホスホロアミダイトが
（ａ）２個以上のヌクレオシド部分を有するヌクレオシドホスホロアミダイト、または
（ｂ）１個以上のヌクレオシド部分およびリンカー部分を有するヌクレオシドホスホロアミダイトであり、
前記アクチベータのｐＫａが、水中において、４．３～７である、
前記方法。
　本発明のアクチベータを用いることにより、２個以上のヌクレオシド部分を有するヌクレオシドホスホロアミダイト、すなわちセグメント型アミダイト、または、１個以上のヌクレオシド部分およびリンカー部分を有するヌクレオシドホスホロアミダイトを用いて、高効率でオリゴヌクレオチドを合成することができる。また、カップリング工程の最後の１回において、２個以上のヌクレオシド部分を有するヌクレオシドホスホロアミダイト、すなわちセグメント型アミダイトを用いることにより、所望の目的のオリゴヌクレオチドとクロマトグラフィー移動度が近く、精製により取り除き困難な（Ｎ－１）ｍｅｒの生成を抑制することができる。また、アクチベータとして、本発明のアクチベータを用いることは、合成過程におけるセグメント型アミダイトの分解の抑制にも寄与する。
　以下、本発明を詳細に説明する。
　本明細書において別様に定義されない限り、本明細書で用いる全ての技術用語および科学用語は、当業者が通常理解しているものと同じ意味を有する。本明細書中で参照する全ての特許、出願および他の出版物や情報は、その全体を参照により本明細書に援用する。また本明細書において参照された出版物と本明細書の記載に矛盾が生じた場合は、本明細書の記載が優先されるものとする。
　本発明は、一側面において、オリゴヌクレオチドを製造する方法であって、アクチベータの存在下で、未置換の水酸基または未置換のチオール基を有するヌクレオチドまたはヌクレオシドに、ヌクレオシドホスホロアミダイトを結合させるカップリング工程を１回以上行うことを含む、前記方法に関する。
　本発明において、オリゴヌクレオチドの製造は、溶液中または固体支持体上で、好適な活性化剤の存在下で、ヌクレオシドホスホロアミダイトとヌクレオシドとの縮合反応によってヌクレオチドの付加が行われる、いわゆるホスホロアミダイト法を用いて行われる。
　本発明において、オリゴヌクレオチドとは、塩基、糖、リン酸がホスホジエステル結合で連なった構造を有する化合物を指し、天然に存在するオリゴヌクレオチド、例えば２’－デオキシリボ核酸（以下、「ＤＮＡ」）およびリボ核酸（以下、「ＲＮＡ」）と、修飾糖部分、修飾リン酸部分、または修飾ヌクレオ塩基を含有する核酸とが含まれる。糖部分への修飾には、リボース環をヘキソース、シクロペンチル、またはシクロヘキシル環に置き換えることが含まれる。あるいは、天然に存在する核酸のＤ－リボース環をＬ－リボース環に置き換えてもよく、または、天然に存在する核酸のβ－アノマーをα－アノマーに置き換えてもよい。オリゴヌクレオチドはまた、１以上の非塩基性部分を含んでいてもよい。修飾リン酸部分には、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、メチルホスホネート、およびリン酸メチルが含まれる。こうした核酸類似体は当業者に知られている。上記の２以上の混合物を含んでなるオリゴヌクレオチドは、例えば、デオキシリボおよびリボヌクレオシドの混合物、特にデオキシリボヌクレオシドと２’－Ｏ－メチルまたは２’－Ｏ－メトキシエチルリボヌクレオシドのような２’－Ｏ－置換リボヌクレオシドの混合物を含んでなるオリゴヌクレオチドから製造可能である。ヌクレオシドの混合物を含んでなるオリゴヌクレオチドの例には、リボザイムが含まれる。
　本発明において、ヌクレオシドホスホロアミダイト（セグメント型アミダイト）とは、アミダイトで誘導体化されたヌクレオシドを指す。アミダイト化は、例えば、アクチベータとして１Ｈ－テトラゾールを用い、適切に保護されたヌクレオシドに対し、２－シアノエチル－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトライソプロピルホスホロジアミダイトを反応させることによって行うことができる。
　本発明において、ヌクレオシドとは、塩基と糖が結合した化合物を指し、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジンのような天然に存在するヌクレオシド、または修飾ヌクレオシドであってもよい。塩基は、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、およびウラシルのような天然に存在する塩基、または修飾塩基であってもよい。ヌクレオシドの糖部分は、天然に存在するデオキシリボースやリボースであってもよく、Ｄ配置もしくはＬ配置をとってもよい。
　本発明において、アクチベータは、ヌクレオシドホスホロアミダイトと、ヌクレオチドまたはヌクレオシドとを反応させるために用いられ、活性化剤またはカップリング剤とも称される。
　本発明の一態様において、アクチベータは、以下の式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
 式中、
Ｘは、有機塩基であり、サッカリンと塩複合体を形成し、好ましくはＮ－メチルイミダゾール、ピリジンまたは３－メチルピリジンである、
または、以下の式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
 式中、
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、Ｈ、直鎖または分岐鎖のＣ１～７アルキル基、および任意に置換されていてもよい芳香族基からなる群から選択される、
で表される構造を有する。
　好ましくは、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、Ｈ、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、フェニル基、ベンジル基であり、さらに好ましくは、Ｒ１は、Ｈ、ＣｎＨ２ｎ＋１またはベンジル基であり、Ｒ２は、Ｈ、ＣＨ３、またはＣ６Ｈ５であり、ｎは、１、２または３である。
　本発明の一態様において、アクチベータは、例えば、５－メルカプト－１－メチルテトラゾール（１－Ｍｅ－ＭＣＴ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
 ５－メルカプト－１－フェニルテトラゾール（１－Ｐｈ－ＭＣＴ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
 ５－ベンジルチオテトラゾール（ＢＴＴ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
 サッカリン １－メチルイミダゾール（ＳＭＩ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
 ５－エチルチオ－１Ｈ－テトラゾール（ＥＴＴ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
 ４，５－ジシアノイミダゾール（ＤＣＩ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
 またはベンズイミダゾールトリフルオロメタンスルホン酸塩（ＢＩＴ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
 であり、好ましくは、１－Ｍｅ－ＭＣＴ、１－Ｐｈ－ＭＣＴ、ＳＭＩ、ＥＴＴ、またはＢＴＴであり、より好ましくは、１－Ｍｅ－ＭＣＴ、１－Ｐｈ－ＭＣＴ、またはＳＭＩである。
　本発明の一態様において、本発明のアクチベータのＨＯＭＯエネルギー（ａ．ｕ．）は、アセトニトリル中において、－０．２２０２４～－０．１６８５８である。例えば、本発明のアクチベータのＨＯＭＯエネルギー（ａ．ｕ．）は、アセトニトリル中において、－０．２１９９５～－０．１６８５８、－０．２１４０７～－０．１６８５８、－０．１９９２８～－０．１６８５８、－０．１８９０４～－０．１６８５８、または－０．１８７４１～－０．１６８５８であり、好ましくは、－０．２１４０７～－０．１６８５８（ａ．ｕ．）であり、より好ましくは、－０．１８９０４～－０．１６８５８（ａ．ｕ．）である。
　本発明の一態様において、本発明のアクチベータの軌道係数は、アセトニトリル中において、０．３１５３１～０．５９４０５である。例えば、本発明のアクチベータの軌道係数は、アセトニトリル中において、０．３１５３１～０．５９４０５、０．３９９３１～０．５９４０５、０．５１８０２～０．５９４０５、または０．５３７８７～０．５９４０５であり、好ましくは、０．３９９３１～０．５９４０５である。
　本発明の一態様において、アクチベータのＨＯＭＯエネルギー（ａ．ｕ．）は、アセトニトリル中において、－０．２２０２４～－０．１６８５８であり、かつ、前記アクチベータの軌道係数は、アセトニトリル中において、０．３１５３１～０．５９４０５である。
　本発明の一態様において、アクチベータのＨＯＭＯエネルギー（ａ．ｕ．）は、アセトニトリル中において、－０．２１４０７～－０．１６８５８であり、かつ、前記アクチベータの軌道係数は、アセトニトリル中において、０．３１５３１～０．５９４０５である。
　ＨＯＭＯエネルギーおよび軌道係数は、量子化学計算プログラムによって求めることができ、例えば、Gaussian社製の量子化学計算プログラムGaussian16において、Becke-型３－パラメータ密度汎関数法（Ｂ３ＬＹＰ）を採用した最適化計算によって求めることができる。
　本発明の一態様において、本発明のアクチベータの２５℃の水中におけるｐＫａは、３．６５～７．０であり、例えば、３．８６～７．０、４．１～７．０、４．３～７．０、４．５～７．０、５．０～７．０、５．５～７．０、６．０～７．０、または６．５～７．０である。
　本発明の一態様において、前記オリゴヌクレオチドを製造する方法における、少なくとも１回のカップリング工程において、ヌクレオシドホスホロアミダイトは、（ａ）２個以上のヌクレオシド部分を有するヌクレオシドホスホロアミダイト、または（ｂ）１個以上のヌクレオシド部分およびリンカー部分を有するヌクレオシドホスホロアミダイトである。
　本発明の一態様において、前記オリゴヌクレオチドを製造する方法における、少なくとも１回のカップリング工程において、ヌクレオシドホスホロアミダイトは、（ａ）２個または３個のヌクレオシド部分を有するヌクレオシドホスホロアミダイト、または（ｂ）１個以上のヌクレオシド部分およびリンカー部分を有するヌクレオシドホスホロアミダイトである。
　２個または３個のヌクレオシド部分を有するヌクレオシドホスホロアミダイトは、４個以上のヌクレオシド部分を有するヌクレオシドホスホロアミダイトと比較して、分子サイズの小ささから運動性が高く反応速度が速いため、反応率が高くなることが推測される。
　本発明の一態様において、前記オリゴヌクレオチドを製造する方法における、２回以上行われるカップリング工程の少なくとも最後の１回において、ヌクレオシドホスホロアミダイトは、（ａ）２個以上のヌクレオシド部分を有するヌクレオシドホスホロアミダイト、または（ｂ）１個以上のヌクレオシド部分およびリンカー部分を有するヌクレオシドホスホロアミダイトである。
　本発明の一態様において、前記オリゴヌクレオチドを製造する方法における、２回以上行われるカップリング工程の少なくとも最後の１回において、ヌクレオシドホスホロアミダイトは、３個のヌクレオシド部分を有するヌクレオシドホスホロアミダイトである。
　本発明の一態様において、前記オリゴヌクレオチドを製造する方法における、２回以上行われるカップリング工程の少なくとも１回において、ヌクレオシドホスホロアミダイトは、１個のヌクレオシド部分を有するヌクレオシドホスホロアミダイトである。
　本発明の一態様において、前記オリゴヌクレオチドを製造する方法における、２回以上行われるカップリング工程の最後の１回のみにおいて、ヌクレオシドホスホロアミダイトは、（ａ）３個のヌクレオシド部分を有するヌクレオシドホスホロアミダイト、または（ｂ）１個以上のヌクレオシド部分およびリンカー部分を有するヌクレオシドホスホロアミダイトであり、その他の回のカップリング工程において、ヌクレオシドホスホロアミダイトは、１個のヌクレオシド部分を有するヌクレオシドホスホロアミダイトである。
　本発明において、２個以上のヌクレオシド部分を有するヌクレオシドホスホロアミダイトは、例えば、国際公開第２０１９／２１２０６１号に記載のように作製することができる。
　本発明の一態様において、２個以上のヌクレオシド部分を有するヌクレオシドホスホロアミダイトは、下記式（Ｉ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
 で示されるヌクレオシドホスホロアミダイトまたはその立体異性体である。
　式（Ｉ）において、Ｘ１は、各々独立して、－Ｏ－または－Ｓ－である。
　式（Ｉ）において、Ｘ２は、各々独立して、－Ｏ－または－Ｓ－である。
　式（Ｉ）において、Ｘ３は、各々独立して、－Ｏ－、－Ｓ－、－ＣＨ２－または－（ＣＨ２）２－である。
　式（Ｉ）において、Ｒ１は保護基であり、好ましくは、酸に不安定な保護基、またはｔ－ブチルジメチルシリルまたはトリイソプロピルシリルのようなトリアルキルシリル基である。酸に不安定な保護基とは、プロトン酸またはルイス酸と該基を接触させることによって除去可能である保護基である。酸に不安定な保護基は、当業者に知られている。酸に不安定保護基の例としては、置換または非置換トリチル基、置換または非置換テトラヒドロピラニル基、置換または非置換テトラヒドロフラニル基、またはピキシル基などが挙げられる。トリチル基は、通常、アルコキシ基のような電子供与基により置換される。より好ましい態様において、Ｒ１は、置換されたもしくは未置換のトリチル、９－フェニルキサンテニル（以下、「ピキシル」）またはテトラヒドロピラニル（以下、「ＴＨＰ」）である。なお一層好ましい態様において、Ｒ１は、未置換のトリチル、モノアルコキシトリチル、ジアルコキシトリチル、トリアルコキシトリチル、ＴＨＰまたはピキシルである。最も好ましくは、Ｒ１は４，４’－ジメトキシトリチルである。
　式（Ｉ）において、Ｒ２は、各々独立して、Ｈ、ＮＨＲ６、ハロゲン、ＣＮ、ＣＦ３、またはアシル系保護基、エーテル系保護基もしくはシリル系保護基で保護された水酸基のいずれか一つである。ハロゲンは、例えば、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、およびＩである。アシル系保護基としては、例えば、アセチル、ベンゾイル、ピバロイルなどが挙げられる。エーテル系保護基としては、例えば、ベンジル、ｐ－メトキシベンジル（ＰＭＢ）、アリルなどが挙げられる。シリル系保護基としては、例えば、t－ブチルジメチルシリル（ＴＢＳ）、t－ブチルジフェニルシリル（ＴＢＤＰＳ）、t－トリイソプロピルシリル（ＴＩＰＳ）、トリエチルシリル（ＴＥＳ）、トリメチルシリル（ＴＭＳ）などが挙げられる。好ましくは、－Ｈである。
　式（Ｉ）において、Ｒ３は、各々独立して、－ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ、－ＳＣＨ２ＣＨ２ＣＮ、置換されたもしくは未置換の脂肪族基、－ＯＲ７または－ＳＲ７であり、好ましくは、－ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮである。置換されたもしくは未置換の脂肪族基としては、これらに限定されないが、例えば、４－シアノブト－２－エニルチオ、４－シアノブト－２－エニルオキシ、アリルチオ、アリルオキシ、クロチルチオまたはクロチルオキシなどが挙げられる。
　式（Ｉ）において、Ｒ４およびＲ５は、各々独立して、置換されたもしくは未置換の脂肪族基、置換されたもしくは未置換の芳香族基、置換されたもしくは未置換のアルアルキル基であり；またはＲ４およびＲ５は、それらが結合している窒素と一緒になって、ヘテロシクロアルキル基またはヘテロ芳香族基を形成する。置換されたもしくは未置換の脂肪族基としては、これらに限定されないが、例えば、メチル、エチル、イソプロピルなどが挙げられ、好ましくはイソプロピルである。置換されたもしくは未置換の芳香族基としては、これらに限定されないが、例えば、フェニル、ベンジル、ナフチル、２－ピレニルメチルが挙げられ、好ましくはフェニル、ベンジルである。置換されたもしくは未置換のアルアルキル基としては、これらに限定されないが、例えば、２－フルオロフェニルメトキシピペリジン－４－イルなどが挙げられる。ヘテロシクロアルキル基としては、これらに限定されないが、例えば、ピロリジノ、モルホリノなどが挙げられ、好ましくはモルホリノである。
　式（Ｉ）において、Ｒ６は、各々独立して、－Ｈ、置換されたもしくは未置換の脂肪族基、置換されたもしくは未置換の芳香族基、置換されたもしくは未置換のアルアルキル基、またはアシル基をはじめとする保護基のいずれか一つである。置換されたもしくは未置換の脂肪族基としては、これらに限定されないが、例えば、メチル、エチル、アリル、１－ペンテニル、２－メトキシエチルが挙げられ、好ましくはメチル、アリル、２－メトキシエチルである。置換されたもしくは未置換の芳香族基としては、これらに限定されないが、例えば、フェニル、ベンジル、ナフチル、２－ピレニルメチルが挙げられ、好ましくはフェニル、ベンジルである。置換されたもしくは未置換のアルアルキル基としては、これらに限定されないが、例えば、２－フルオロフェニルメトキシピペリジン－４－イルなどが挙げられる。保護基は、例えば、ｔ－ブチルジメチルシリル、トリフルオロアセチル、tert－ブトキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニル、フタロイル、p－トルエンスルホニルである。
　式（Ｉ）において、Ｒ７は、置換されたもしくは未置換の脂肪族基、置換されたもしくは未置換の芳香族基、または置換されたもしくは未置換のアルアルキル基である。置換されたもしくは未置換の脂肪族基としては、これらに限定されないが、例えば、ＴＨＰ、４－メトキシテトラヒドロピラニルなどが挙げられる。置換されたもしくは未置換の芳香族基としては、これらに限定されないが、例えば、ｏ－クロロフェニルまたはｐ－クロロフェニルなどが挙げられる。置換されたもしくは未置換のアルアルキル基としては、これらに限定されないが、例えば、２－フルオロフェニルメトキシピペリジン－４－イルなどが挙げられる。
　式（Ｉ）において、Ｂ１、Ｂ２およびＢ３は、各々独立して、Ｈ、または保護されたもしくは無保護の塩基である。保護されたもしくは無保護の塩基としては、これらに限定されないが、例えば、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、およびウラシルのような天然に存在する塩基や、７－デアザグアニン、７－デアザ－８－アザグアニン、５－プロピニルシトシン、５－プロピニルウラシル、７－デアザアデニン、７－デアザ－８－アザアデニン、７－デアザ－６－オキソプリン、６－オキソプリン、３－デアザアデノシン、２－オキソ－５－メチルピリミジン、２－オキソ－４－メチルチオ－５－メチルピリミジン、２－チオカルボニル－４－オキソ－５－メチルピリミジン、４－オキソ－５－メチルピリミジン、２－アミノプリン、５－フルオロウラシル、２，６－ジアミノプリン、８－アミノプリン、４－トリアゾロ－５－メチルチミン、および４－トリアゾロ－５－メチルウラシルのような修飾塩基などが挙げられる。
　式（Ｉ）において、ｎは０または正の整数であり、好ましくは、０以上４以下の整数であり、より好ましくは、０または１である。
　本発明の一態様において、１個以上のヌクレオシド部分およびリンカー部分を有するヌクレオシドホスホロアミダイトは、ヌクレオシドの５’位において、リン原子を介して、例えば、亜リン酸エステル、リン酸エステル、チオリン酸エステル、ジチオリン酸エステルを介してリンカーが結合しているヌクレオシドホスホロアミダイトである。
　本発明の一態様において、１個以上のヌクレオシド部分およびリンカー部分を有するヌクレオシドホスホロアミダイトは、これらに限定されないが、例えば、Glen Research社からから入手することができる、以下に示すようなリンカー部分を有するホスホロアミダイトを原料として調製されてもよい：
PC Linker Phosphoramidite（３－（４，４’－ジメトキシトリチル）－１－（２－ニトロフェニル）－プロパン－１－イル－［（２－シアノエチル）－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）］－ホスホロアミダイト）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
5'-Aminooxy-Modifier-11-CE Phosphoramidite（１０－［Ｎ－ジメトキシトリチル－アミノオキシエチル）］－トリエチレングリコール－１－［（２－シアノエチル）－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）］－ホスホロアミダイト）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
α-Tocopherol-TEG Phosphoramidite（１－ジメトキシトリチルオキシ－３－Ｏ－［（９－ＤＬ－α－トコフェリル）－トリエチレングリコール－１－イル］－グリセリル－２－Ｏ－［（２－シアノエチル）－（Ｎ，Ｎ，－ジイソプロピル）］－ホスホロアミダイト）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
5'-DBCO-TEG Phosphoramidite（１０－（６－オキソ－６－（ジベンゾ［ｂ，ｆ］アザシクロオクタ－４－イン－１－イル）－カプロアミド－Ｎ－エチル）－Ｏ－トリエチレングリコール－１－［（２－シアノエチル）－（Ｎ，Ｎ－ジイ
ソプロピル）］－ホスホロアミダイト）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000026
5'-Cholesteryl-TEG Phosphoramidite（１０－Ｏ－［１－プロピル－３－Ｎ－カルバモイルコレステリル］－トリエチレングリコール－１－［（２－シアノエチル）－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）］－ホスホロアミダイト）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000027
DNP-TEG Phosphoramidite（１－ジメトキシトリチルオキシ－３－Ｏ－［Ｎ－（２，４－ジニトロフェニル）－３－Ｎ－アミノプロピル－（トリエチレングリコール）］－グリセリル－２－Ｏ－（２－シアノエチル）－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）－ホスホロアミダイト）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000028
Cholesteryl-TEG Phosphoramidite（１－ジメトキシトリチルオキシ－３－Ｏ－（Ｎ－コレステリル－３－アミノプロピル）－トリエチレングリコール－グリセリル－２－Ｏ－（２－シアノエチル）－（Ｎ，Ｎ，－ジイソプロピル）－ホスホロアミダイト）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000029
5'-Amino-Modifier TEG CE-Phosphoramidite（１０－（Ｏ－トリフルオロアセトアミド－Ｎ－エチル）－トリエチレングリコール－１－［（２－シアノエチル）－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）］－ホスホロアミダイト）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000030
Spacer Phosphoramidite 18（１８－Ｏ－ジメトキシトリチルヘキサエチレングリコール，１－［（２－シアノエチル）－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）］－ホスホロアミダイト）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000031
Spacer Phosphoramidite 9（９－Ｏ－ジメトキシトリチル－トリエチレングリコール，１－［（２－シアノエチル）－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）］－ホスホロアミダイト）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000032
PC Amino-Modifier Phosphoramidite（［（６－トリフルオロアセチルアミドカプロアミドメチル）－１－（２－ニトロフェニル）－エチル］－２－シアノエチル－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）－ホスホロアミダイト）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000033
Thiol-Modifier C6 S-S（１－Ｏ－ジメトキシトリチル－ヘキシル－ジスルフィド，１’－［（２－シアノエチル）－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）］－ホスホロアミダイト）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000034
5'-Carboxy-Modifier C10（１０－カルボキシ－デシル－（２－シアノエチル）－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）－ホスホロアミダイト，Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000035
5'-Thiol-Modifier C6（Ｓ－トリチル－６－メルカプトヘキシル－１－［（２－シアノエチル）－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）］－ホスホロアミダイト）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000036
Dithiol Serinol Phosphoramidite（３－ジメトキシトリチルオキシ－２－（３－（（Ｒ）－α－リポアミド）プロパンアミド）プロピル－１－Ｏ－（２－シアノエチル）－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）－ホスホロアミダイト）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000037
5'-Maleimide-Modifier Phosphoramidite（２－（１，７－ジメチル－３，５－ジオキソ－１０－オキサ－４－アザトリシクロ［５．２．１．０２，６］デカ－８－エン－４－イル）－エチル－１－Ｏ－［（２－シアノエチル）－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）］－ホスホロアミダイト）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000038
PC Biotin Phosphoramidite（１－［２－ニトロ－５－（６－（Ｎ－（４，４’－ジメトキシトリチル））－ビオチンアミドカプロアミドメチル）フェニル］－エチル－［２－シアノエチル－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）］－ホスホロアミダイト）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000039
Protected BiotinLC Serinol Phosphoramidite（３－ジメトキシトリチルオキシ－２－（３－（（４－ｔ－ブチルベンゾイル）－ビオチニル－３－アミノプロピル）－ジエチレングリコリル－プロピルアミド－グリカノイルアミド）プロピル－１－Ｏ－（２－シアノエチル）－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）－ホスホロアミダイト）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000040
6-Fluorescein Serinol Phosphoramidite（３－ジメトキシトリチルオキシ－２－（３－（６－カルボキシ－（ｄｉ－Ｏ－ピバロイル－フルオレセイン）プロパンアミド）プロピル）－１－Ｏ－（２－シアノエチル）－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）－ホスホロアミダイト）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000041
Protected Biotin Serinol Phosphoramidite（３－ジメトキシトリチルオキシ－２－（３－（（４－ｔ－ブチルベンゾイル）－ビオチニル）プロパンアミド）プロピル－１－Ｏ－（２－シアノエチル）－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）－ホスホロアミダイト）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000042
1-Ethynyl-dSpacer CE Phosphoramidite（５’－Ｏ－ジメトキシトリチル－１’－エチニル－２’－デオキシリボース－３’－［（２－シアノエチル）－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）］－ホスホロアミダイト）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000043
Azobenzene Phosphoramidite（３－Ｏ－（ジメトキシトリチル）－２－Ｎ－（４－カルボキシアゾベンゼン）－Ｄ－トレオニン－１－イル－Ｏ－［（２－シアノエチル）－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）］－ホスホロアミダイト）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000044
5'-I-dT-CE Phosphoramidite（５’－ヨード－２’－デオキシチミジン，３’－［（２－シアノエチル）－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）］－ホスホロアミダイト）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000045
Psoralen C6 Phosphoramidite（６－［４’－（ヒドロキシメチル）－４，５’，８－トリメチルソレラン］－ヘキシル－１－Ｏ－（２－シアノエチル）－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）－ホスホロアミダイト）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000046
Psoralen C2 Phosphoramidite（２－［４’－（ヒドロキシメチル）－４，５’，８－トリメチルソレラン］－エチル－１－Ｏ－（２－シアノエチル）－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）－ホスホロアミダイト）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000047
3-Cyanovinylcarbazole Phosphoramidite (CNVK)（５’－Ｏ－（４，４’－ジメトキシトリチル）－１’－（３－シアノビニルカルバゾール－９－イル）－２’－デオキシ－β－Ｄ－リボフラノシル－３’－［（２－シアノエチル）－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）］－ホスホロアミダイト）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000048
　本発明の一態様において、１個以上のヌクレオシド部分およびリンカー部分を有するヌクレオシドホスホロアミダイトは、下記式（ＩＩ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000049
 で示されるヌクレオシドホスホロアミダイトまたはその立体異性体である。
　式（ＩＩ）において、Ｘ１は、各々独立して、－Ｏ－または－Ｓ－である。
　式（ＩＩ）において、Ｘ２は、各々独立して、－Ｏ－または－Ｓ－である。
　式（ＩＩ）において、Ｘ３は、各々独立して、－Ｏ－、－Ｓ－、－ＣＨ２－または－（ＣＨ２）２－である。
　式（ＩＩ）において、Ｌはリンカーである。リンカーとしては、これらに限定されないが、例えば、
 
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000050
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000051
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000052
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000053
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000054
 などが挙げられる。
　式（ＩＩ）において、Ｒ２は、各々独立して、－Ｈ、－ＮＨＲ６、ハロゲン、－ＣＮ、－ＣＦ３、またはアシル系保護基、エーテル系保護基もしくはシリル系保護基で保護された水酸基のいずれか一つである。ハロゲンは、例えば、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、およびＩである。アシル系保護基としては、例えば、アセチル、ベンゾイル、ピバロイルなどが挙げられる。エーテル系保護基としては、例えば、ベンジル、ｐ－メトキシベンジル（ＰＭＢ）、アリルなどが挙げられる。シリル系保護基としては、例えば、t－ブチルジメチルシリル（ＴＢＳ）、t－ブチルジフェニルシリル（ＴＢＤＰＳ）、t－トリイソプロピルシリル（ＴＩＰＳ）、トリエチルシリル（ＴＥＳ）、トリメチルシリル（ＴＭＳ）などが挙げられる。好ましくは、－Ｈである。
　式（ＩＩ）において、Ｒ３は、各々独立して、－ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ、－ＳＣＨ２ＣＨ２ＣＮ、置換されたもしくは未置換の脂肪族基、－ＯＲ７または－ＳＲ７であり、好ましくは、－ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮである。置換されたもしくは未置換の脂肪族基としては、これらに限定されないが、例えば、４－シアノブト－２－エニルチオ、４－シアノブト－２－エニルオキシ、アリルチオ、アリルオキシ、クロチルチオまたはクロチルオキシなどが挙げられる。
　式（ＩＩ）において、Ｒ４およびＲ５は、各々独立して、置換されたもしくは未置換の脂肪族基、置換されたもしくは未置換の芳香族基、置換されたもしくは未置換のアルアルキル基であり；またはＲ４およびＲ５は、それらが結合している窒素と一緒になって、ヘテロシクロアルキル基またはヘテロ芳香族基を形成する。置換されたもしくは未置換の脂肪族基としては、これらに限定されないが、例えば、メチル、エチル、イソプロピルなどが挙げられ、好ましくはイソプロピルである。置換されたもしくは未置換の芳香族基としては、これらに限定されないが、例えば、フェニル、ベンジル、トルイル、アニリルなどが挙げられ、好ましくはフェニル、ベンジルである。ヘテロシクロアルキル基としては、これらに限定されないが、例えば、ピロリジノ、モルホリノなどが挙げられる。
　式（ＩＩ）において、Ｒ６は、各々独立して、－Ｈ、置換されたもしくは未置換の脂肪族基、置換されたもしくは未置換の芳香族基、置換されたもしくは未置換のアルアルキル基、またはアシル基をはじめとする保護基のいずれか一つである。置換されたもしくは未置換の脂肪族基としては、これらに限定されないが、例えば、メチル、エチル、アリル、１－ペンテニル、２－メトキシエチルが挙げられ、好ましくはメチル、アリル、２－メトキシエチルである。置換されたもしくは未置換の芳香族基としては、これらに限定されないが、例えば、フェニル、ベンジル、ナフチル、２－ピレニルメチルが挙げられ、好ましくはフェニル、ベンジルである。保護基は、例えば、ｔ－ブチルジメチルシリルである。
　式（ＩＩ）において、Ｒ７は、置換されたもしくは未置換の脂肪族基、置換されたもしくは未置換の芳香族基、または置換されたもしくは未置換のアルアルキル基である。置換されたもしくは未置換の脂肪族基としては、これらに限定されないが、例えば、ＴＨＰ、４－メトキシテトラヒドロピラニルなどが挙げられる。置換されたもしくは未置換の芳香族基としては、これらに限定されないが、例えば、ｏ－クロロフェニルまたはｐ－クロロフェニルなどが挙げられる。置換されたもしくは未置換のアルアルキル基としては、これらに限定されないが、例えば、２－フルオロフェニルメトキシピペリジン－４－イルなどが挙げられる。
　式（ＩＩ）において、Ｂ１およびＢ２は、各々独立して、Ｈ、または保護されたもしくは無保護の塩基である。保護されたもしくは無保護の塩基としては、これらに限定されないが、例えば、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、およびウラシルのような天然に存在する塩基や、７－デアザグアニン、７－デアザ－８－アザグアニン、５－プロピニルシトシン、５－プロピニルウラシル、７－デアザアデニン、７－デアザ－８－アザアデニン、７－デアザ－６－オキソプリン、６－オキソプリン、３－デアザアデノシン、２－オキソ－５－メチルピリミジン、２－オキソ－４－メチルチオ－５－メチルピリミジン、２－チオカルボニル－４－オキソ－５－メチルピリミジン、４－オキソ－５－メチルピリミジン、２－アミノプリン、５－フルオロウラシル、２，６－ジアミノプリン、８－アミノプリン、４－トリアゾロ－５－メチルチミン、および４－トリアゾロ－５－メチルウラシルのような修飾塩基などが挙げられる。好ましい態様において、Ｂ１およびＢ２の少なくとも一つは、アデニンである。
　式（ＩＩ）において、ｎは０または正の整数であり、好ましくは、０以上４以下の整数であり、より好ましくは、０または１である。
　本発明を以下の例を参照してより詳細に説明するが、これらは本発明の特定の具体例を示すものであり、本発明はこれらに限定されるものではない。
例１　逐次法とセグメント法の比較
（１）オリゴヌクレオチドの合成
　ｄＴ　ＮｉｔｔｏＰｈａｓｅ（登録商標）ＨＬ　ｄＴ３００（日東電工株式会社製））を１５７３μｍｏｌに相当する量で反応カラムに充填し、核酸合成装置AKTA oligopilot plus100（Cytiva社、旧ＧＥヘルスケアジャパン社製）を用いて、１７ｍｅｒ（５’　ＣＣＧ　ＡＴＴ　ＡＡＧ　ＣＧＡ　ＡＧＣ　ＴＴ　３’）のＤＮＡオリゴヌクレオチドを合成した。その後、１７ｍｅｒ ＤＮＡ付固相担体を２０５μｍｏｌに相当する量で反応カラム内に充填し、核酸合成装置AKTA oligopilot plus100で、アクチベータとして５－エチルチオ－１Ｈ－テトラゾール（ＥＴＴ）を用いて、ｄＣ、ｄＴ、ｄＡを順に縮合する逐次法、ｄＡＴＣをアミダイト当量１．８当量、縮合時間５分で縮合したセグメント法１、ｄＡＴＣをアミダイト当量３．０当量、縮合時間１０分で縮合したセグメント法２の３条件で合成した。その他の合成試薬は、通常用いられる脱保護試薬、キャッピング試薬及び酸化溶液を用いた。ｄＡＴＣは、国際公開第２０１９／２１２０６１号に記載されるように作製した。
　ＤＮＡオリゴヌクレオチドが結合した固相担体を２８％アンモニア水に浸し、固相担体から該ＤＮＡオリゴヌクレオチドの切り出しを行った。この液の一部を水で希釈し、ＤＮＡオリゴヌクレオチド試料溶液を作成した。残る溶液はクルード溶液とした。
（２）オリゴヌクレオチドの精製
　得られたクルード溶液について、精製装置AKTA pure 25（Cytiva社、旧ＧＥヘルスケアジャパン社製）による精製を行った。(精製条件：カラム；２５ｃｍ×１０ｍｍ　ＣＶ＝１９．６ｍＬ　ＧＥ　ｓｏｕｒｃｅ　１５Ｑ　ｒｅｓｉｎ、Ｂｕｆｆｅｒ；ＮａＯＨ、ＮａＣｌ、超純水で調整)。
（３）ＤＮＡオリゴヌクレオチドの分析
　精製前および精製後のＤＮＡオリゴヌクレオチド試料溶液について、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による測定を行った（測定条件：カラム；Waters XBridge OST C18 ２．５μｍ ５０×４．６ｍｍ、ＵＶ検出；２６０ｎｍ、ＢｕｆｆｅｒＡ；ＨＦＩＰ／ＴＥＡ ｉｎ Ｗａｔｅｒ、ＢｕｆｆｅｒＢ；メタノール）。
（４）結果
　精製前のＤＮＡオリゴヌクレオチド試料溶液の分析結果を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000055
  
　ここで、不純物Ｉは、ＨＰＬＣ測定においてＮ－１ｍｅｒ付近に出る不純物を、不純物ＩＩは、ＨＰＬＣ測定においてＮ－２ｍｅｒ付近に出る不純物を、不純物ＩＩＩは、ＨＰＬＣ測定においてＮ－３ｍｅｒ付近に出る不純物をそれぞれ指す、以下同じ。
　逐次法で合成した場合には、不純物Ｉと不純物ＩＩの含有量が、それぞれ２．９％、２．８％であったのに対し、セグメント法１によって合成した場合には、不純物Ｉと不純物ＩＩの含有量は、それぞれ０．６％、０．４％であり、またセグメント法２によって合成した場合には、それぞれ０．７％、１．８％であった。セグメント法で合成した場合には、逐次法で合成した場合と比較して、不純物Ｉと不純物ＩＩの含有量を大幅に低下させることができた。
　精製後のＤＮＡオリゴヌクレオチド試料溶液の分析結果を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000056
  
　目的のオリゴヌクレオチドの純度は、逐次法において９０．４６％であるのに対し、セグメント法１においては、９２．３４％、セグメント法２においては、９２．５３％であり、セグメント法で合成した場合には、逐次法で合成した場合と比較して、高い純度で目的のオリゴヌクレオチドを得ることができた。また、ＦＬＰ（全長生成物、純度×合計ＯＤ）は、逐次法では９３０２であるのに対し、セグメント法１では、１０７０２、セグメント法２では、１０７２４であり、セグメント法で合成した場合には、逐次法で合成した場合と比較して、高い収量で目的のオリゴヌクレオチドを得ることができた。
例２　反応率の比較
（１）ＤＮＡオリゴヌクレオチドの合成
　NittoPhase（商標登録）HL UnyLinker 350（日東電工株式会社製）を２９３５μｍｏｌに相当する量で反応カラムに充填し、核酸合成装置AKTA oligopilot plus100を用いて、１７ｍｅｒ（５’　ＣＣＧ　ＡＴＴ　ＡＡＧ　ＣＧＡ　ＡＧＣ　ＴＴ　３’）のＤＮＡオリゴヌクレオチドを合成した。その後、１７ｍｅｒ　ＤＮＡ付固相担体を９０μｍｏｌに相当する量で反応カラム内に充填し、核酸合成装置AKTA oligopilot plus10で、アクチベータとして、５－メルカプト－１－メチルテトラゾール（１－Ｍｅ－ＭＣＴ）、５－メルカプト－１－フェニルテトラゾール（１－Ｐｈ－ＭＣＴ）、５－ベンジルチオテトラゾール（ＢＴＴ）、サッカリン １－メチルイミダゾール（ＳＭＩ）、５－エチルチオ－１Ｈ－テトラゾール（ＥＴＴ）、４，５－ジシアノイミダゾール（ＤＣＩ）、５－［３，５－ビス（トリフルオロメチル）フェニル］－１Ｈ－テトラゾール（Activator42）、またはベンズイミダゾールトリフルオロメタンスルホン酸塩（ＢＩＴ）を用いて、ｄＧＣＣをアミダイト当量数１．８当量、縮合時間５分で縮合した。アクチベータは全てアセトニトリルに溶解させ、０．２５Ｍに調製した。その他の合成試薬は、脱保護剤としてトルエン中３％ＤＣＡ、酸化剤として水中ピリジン、ヨウ素、キャップ化剤としてアセトニトリル中ピリジン、Ｎ－メチルイミダゾール、無水酢酸または無水イソ酪酸、アミンウォッシュ反応液として、アセトニトリル中ＴＢＡを用いた。ｄＧＣＣは、国際公開第２０１９／２１２０６１号に記載されるように作製した。
　ＤＮＡオリゴヌクレオチドが結合した固相担体をアンモニア水に浸し、固相担体から該ＤＮＡオリゴヌクレオチドの切り出しを行った。
　なお、Activator42は、以下の構造：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000057
 を有する。
（２）ＲＮＡオリゴヌクレオチドの合成
　NittoPhase（商標登録）HL rU250（Kinovate Life Science社製）を３２７μｍｏｌに相当する量で反応カラムに充填し、核酸合成装置AKTA oligopilot plus100を用いて、１７ｍｅｒ合成（５’　ＣＣＧ　ＡＵＵ　ＡＡＧ　ＣＧＡ　ＡＧＣ　ＵＵ　３’）のＲＮＡオリゴヌクレオチドを合成した。その後、１７ｍｅｒ　ＲＮＡ付固相担体を８５μｍｏｌに相当する量で反応カラム内に充填し、核酸合成装置AKTA oligopilot plus10で、アクチベータとして、５－メルカプト－１－メチルテトラゾール（１－Ｍｅ－ＭＣＴ）、サッカリン １－メチルイミダゾール（ＳＭＩ）、または５－［３，５－ビス（トリフルオロメチル）フェニル］－１Ｈ－テトラゾール（Activator42）を用いてｒＡＵＣをアミダイト当量数２．０当量、縮合時間１５分で縮合した。アクチベータは全てアセトニトリルに溶解させ、０．２５Ｍに調製した。その他の合成試薬は、脱保護剤としてトルエン中３％ＤＣＡ、酸化剤として水中ピリジン、ヨウ素、キャップ化剤としてアセトニトリル中ピリジン、Ｎ－メチルイミダゾール、無水酢酸、アミンウォッシュ反応液として、アセトニトリル中ＴＢＡを用いた。ｒＡＵＣは、国際公開第２０１９／２１２０６１号に記載されるように作成した。
　ＲＮＡオリゴヌクレオチドが結合した固相担体をＡＭＡ試薬（２８～３０％アンモニア水：メチルアミン水溶液＝１：１）に浸し、フィルターでろ過し、ＤＭＳＯで洗浄した。その後、氷浴下でＴＥＡ．３ＨＦをゆっくりと滴下し、振盪することで固相担体から該ＲＮＡオリゴヌクレオチドの切り出しを行った。
（３）反応率の分析
　切り出し後の各オリゴヌクレオチド試料溶液について、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による測定を行った（測定条件：カラム；Waters XBridge OST C18　２．５μｍ　５０×４．６ｍｍ、ＵＶ検出；２６０ｎｍ、ＢｕｆｆｅｒＡ；ＨＦＩＰ／ＴＥＡ　ｉｎ　Ｗａｔｅｒ、ＢｕｆｆｅｒＢ；メタノール）。
　ＤＮＡ合成においては、ＨＰＬＣ測定結果において不純物ＩＩＩのピークが観測された後、１．１分後までに検出されたピークの面積の総和を１００％とし、不純物ＩＩＩのピーク面積（％）を差し引くことにより、反応率を算出した。ＲＮＡ合成においては、ＨＰＬＣ測定結果において不純物ＩＩＩのピークが観測された後、１．４分後までに検出されたピークの面積の総和を１００％とし、不純物ＩＩＩのピーク面積（％）を差し引くことにより、反応率を算出した。
（４）結果
　ＤＮＡ合成における結果を表３に、ＲＮＡ合成における結果を表４に示す。
　また、本実験に用いたアクチベータのＨＯＭＯエネルギーおよび軌道係数を、併せて表３および表４に示す。ＨＯＭＯエネルギー、軌道係数は、Gaussian社製の量子化学計算プログラムGaussian16を利用し、Becke-型３－パラメータ密度汎関数法（Ｂ３ＬＹＰ）を採用した最適化計算によって求めた。具体的には、アクチベータがアミダイトに対し求核攻撃をする際の活性種（ＢＩＴは中性種、その他はアニオン種）の構造、すなわちアクチベータの初期構造を、Ｗｅｂベースの計算支援プログラムＷｅｂＭＯを用いて計算前の分子の初期構造を作成し、基底関数に６－３１Ｇ（ｄ）、電荷にアニオンの場合は－１、中性種の場合には０、多重度に１重項、溶媒にアセトニトリルを入力し、構造最適化、軌道計算の順に実行することにより、ＨＯＭＯエネルギーおよび軌道係数を求めた。分子モデルの原子間の衝突を避けるための初期構造の簡易的な構造修正を、ＷｅｂＭＯにおいてCleanup機能のMechanics Optimizeを実行することにより、適宜行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000058
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000059
　表３および表４から、Activator42よりも高い反応率を示したアクチベータは、ＨＯＭＯエネルギー準位が高く、および／または軌道係数が大きいものであったことが分かる。アクチベータのＨＯＭＯエネルギー準位が高いことにより、アクチベータのＨＯＭＯエネルギー準位とセグメント型アミダイトのＬＵＭＯエネルギー準位のエネルギー差が小さくなり、反応が生じやすくなったと考えられる。また、アクチベータの軌道係数が大きいことにより、アクチベータの窒素原子とセグメント型アミダイトのリン原子における軌道の重なりが大きくなり、反応が生じやすくなったと考えられる。
例３　セグメント型アミダイトの分解の比較
（１）セグメント型アミダイトとしてｄＧＣＣを用いて行ったオリゴヌクレオチドの合成
　例２（１）で得られた１７ｍｅｒ　ＤＮＡ付固相担体を９０μｍｏｌに相当する量で反応カラムに充填し、核酸合成機AKTA oligopilot plus10で、アクチベータとして０．６Ｍ　５－メルカプト－１－メチルテトラゾール（１－Ｍｅ－ＭＣＴ）、０．５Ｍ　５－メルカプト－１－フェニルテトラゾール（１－Ｐｈ－ＭＣＴ）、０．２５Ｍ　５－ベンジルチオテトラゾール（ＢＴＴ）、０．２５Ｍ　サッカリン　１－メチルイミダゾール（ＳＭＩ）、０．６Ｍ　５－エチルチオ－１Ｈ－テトラゾール（ＥＴＴ）、または０．２５Ｍ　５－［３，５－ビス（トリフルオロメチル）フェニル］－１Ｈ－テトラゾール（Activator42）を用いて、ｄＧＣＣをアミダイト当量数１．８当量、縮合時間１０分で縮合した。その他の合成試薬は、脱保護剤としてトルエン中３％ＤＣＡ、酸化剤として水中ピリジン、ヨウ素、キャップ化剤としてアセトニトリル中ピリジン、Ｎ－メチルイミダゾール、無水酢酸、アミンウォッシュ反応液として、アセトニトリル中ＴＢＡを用いた。ｄＧＣＣは、国際公開第２０１９／２１２０６１号に記載されるように作製した。
　ＤＮＡオリゴヌクレオチドが結合した固相担体をアンモニア水に５５℃で１２～１６時間浸し、固相担体から該ＤＮＡオリゴヌクレオチドの切り出しを行った。
（２）ＤＮＡオリゴヌクレオチドの分析
　切り出し後のＤＮＡオリゴヌクレオチド試料溶液について、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による測定を行った（測定条件：カラム；Waters XBridge OST C18　２．５μｍ　５０×４．６ｍｍ、ＵＶ検出；２６０ｎｍ、ＢｕｆｆｅｒＡ；１００ｍＭ　ＨＦＩＰ／７ｍＭ　ＴＥＡ　ｉｎ　Ｗａｔｅｒ、ｐＨ８．０、ＢｕｆｆｅｒＢ；メタノール、温度；６０℃）。
　ＨＰＬＣ測定結果において不純物ＩＩＩのピークが観測された後、１．１分後までに検出されたピークの面積の総和を１００％とした場合における、不純物ＩＩのピーク面積（％）を算出した。
（４）結果
　結果を表５に示す。また、本実験に用いたアクチベータの水中におけるｐＫa値を、併せて表５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000060
  
　Activator42を用いて合成した場合には、不純物ＩＩのピーク面積は９．０８９％であり、セグメント型アミダイトの顕著な分解が観測された。一方で、その他のアクチベータを用いた場合には、不純物ＩＩのピーク面積は、１～２％程度であり、分解はほとんど観測されなかった。不純物ＩＩは、オリゴヌクレオチドとセグメント型アミダイトを繋ぐリン酸ジエステル結合部が酸により分解されることで生じた可能性が高いと推測される。

Claims (20)

  1. 　オリゴヌクレオチドを製造する方法であって、
    アクチベータの存在下で、ヌクレオチドまたはヌクレオシドの３’または５’の水酸基またはチオール基に、ヌクレオシドホスホロアミダイトを結合させるカップリング工程を１回以上行うことを含み、
    少なくとも１回のカップリング工程において、前記ヌクレオシドホスホロアミダイトが
    （ａ）２個以上のヌクレオシド部分を有するヌクレオシドホスホロアミダイト、または
    （ｂ）１個以上のヌクレオシド部分およびリンカー部分を有するヌクレオシドホスホロアミダイト
    であり、
    前記アクチベータが、以下の式：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
      
    式中、
    Ｘは、有機塩基である、
    または、以下の式：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
      
    式中、
    Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、Ｈ、直鎖または分岐鎖のＣ１～７アルキル基、および任意に置換されていてもよい芳香族基からなる群から選択される、
    で表される構造を有する、前記方法。
  2. 　Ｘは、Ｎ－メチルイミダゾール、ピリジンまたは３－メチルピリジンであり、
    Ｒ１は、Ｈ、ＣｎＨ２ｎ＋１またはベンジル基であり、
    Ｒ２は、Ｈ、ＣＨ３、またはＣ６Ｈ５であり、
    ｎは、１、２または３である、
    請求項１に記載の方法。
  3. 　前記アクチベータが、５－メルカプト－１－メチルテトラゾール（１－Ｍｅ－ＭＣＴ）、５－メルカプト－１－フェニルテトラゾール（１－Ｐｈ－ＭＣＴ）、サッカリン１－メチルイミダゾール（ＳＭＩ）、または５－エチルチオ－１Ｈ－テトラゾール（ＥＴＴ）である、請求項１または２に記載の方法。
  4. 　２回以上行われるカップリング工程の少なくとも最後の１回において、
    ヌクレオシドホスホロアミダイトが
    （ａ）２個以上のヌクレオシド部分を有するヌクレオシドホスホロアミダイト、または
    （ｂ）１個以上のヌクレオシド部分およびリンカー部分を有するヌクレオシドホスホロアミダイト
    である、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 　２回以上行われるカップリング工程の少なくとも最後の１回において、
    ヌクレオシドホスホロアミダイトが３個のヌクレオシド部分を有するヌクレオシドホスホロアミダイトである、
    請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 　２回以上行われるカップリング工程の少なくとも１回において、
    ヌクレオシドホスホロアミダイトが１個のヌクレオシド部分を有するヌクレオシドホスホロアミダイトである、
    請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 　２回以上行われるカップリング工程の最後の１回のみにおいて、
    ヌクレオシドホスホロアミダイトが
    （ａ）３個のヌクレオシド部分を有するヌクレオシドホスホロアミダイト、または
    （ｂ）１個以上のヌクレオシド部分およびリンカー部分を有するヌクレオシドホスホロアミダイト
    であり、
    　その他の回のカップリング工程において、
    ヌクレオシドホスホロアミダイトが１個のヌクレオシド部分を有するヌクレオシドホスホロアミダイトである、
    請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 　２個以上のヌクレオシド部分を有するヌクレオシドホスホロアミダイトが、下記式（Ｉ）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
       
    式中、
    Ｘ１は、各々独立して、－Ｏ－または－Ｓ－であり；
    Ｘ２は、各々独立して、－Ｏ－または－Ｓ－であり；
    Ｘ３は、各々独立して、－Ｏ－、－Ｓ－、－ＣＨ２－または－（ＣＨ２）２－であり；
    Ｒ１は保護基であり；
    Ｒ２は、各々独立して、－Ｈ、－ＮＨＲ６、ハロゲン、－ＣＮ、－ＣＦ３、またはアシル系保護基、エーテル系保護基もしくはシリル系保護基で保護された水酸基であり；
    Ｒ３は、各々独立して、－ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ、－ＳＣＨ２ＣＨ２ＣＮ、置換されたもしくは未置換の脂肪族基、－ＯＲ７または－ＳＲ７であり；
    Ｒ４およびＲ５は、各々独立して、置換されたもしくは未置換の脂肪族基、置換されたもしくは未置換の芳香族基、置換されたもしくは未置換のアルアルキル基であり；または
    Ｒ４およびＲ５は、それらが結合している窒素と一緒になって、ヘテロシクロアルキル基またはヘテロ芳香族基を形成し；
    Ｒ６は、各々独立して、－Ｈ、置換されたもしくは未置換の脂肪族基、置換されたもしくは未置換の芳香族基、置換されたもしくは未置換のアルアルキル基、または保護基であり；
    Ｒ７は、各々独立して、置換されたもしくは未置換の脂肪族基、置換されたもしくは未置換の芳香族基、または置換されたもしくは未置換のアルアルキル基であり；
    Ｂ１、Ｂ２およびＢ３は、各々独立して、－Ｈ、または保護されたもしくは無保護の塩基であり；および
    ｎは０または正の整数である； 
    で示されるヌクレオシドホスホロアミダイトまたはその立体異性体である、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 　ｎが０または１である、請求項８に記載の方法。
  10. 　Ｒ２が－Ｈである、請求項８または９に記載の方法。
  11. 　Ｒ３が－ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮである、請求項８～１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 　１個以上のヌクレオシド部分およびリンカー部分を有するヌクレオシドホスホロアミダイトが、下記式（ＩＩ）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
      
    式中、
    Ｘ１は、各々独立して、－Ｏ－または－Ｓ－であり；
    Ｘ２は、各々独立して、－Ｏ－または－Ｓ－であり；
    Ｘ３は、各々独立して、－Ｏ－、－Ｓ－、－ＣＨ２－または－（ＣＨ２）２－であり；
    Ｌはリンカーであり；
    Ｒ２は、各々独立して、－Ｈ、－ＮＨＲ６、ハロゲン、－ＣＮ、－ＣＦ３、またはアシル系保護基、エーテル系保護基もしくはシリル系保護基で保護された水酸基であり；
    Ｒ３は、各々独立して、－ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ、－ＳＣＨ２ＣＨ２ＣＮ、置換されたもしくは未置換の脂肪族基、－ＯＲ７または－ＳＲ７であり；
    Ｒ４およびＲ５は、各々独立して、置換されたもしくは未置換の脂肪族基、置換されたもしくは未置換の芳香族基、置換されたもしくは未置換のアルアルキル基であり；または
    Ｒ４およびＲ５は、それらが結合している窒素と一緒になって、ヘテロシクロアルキル基またはヘテロ芳香族基を形成し；Ｒ６は、各々独立して、－Ｈ、置換されたもしくは未置換の脂肪族基、置換されたもしくは未置換の芳香族基、置換されたもしくは未置換のアルアルキル基、または保護基であり；
    Ｒ７は、各々独立して、置換されたもしくは未置換の脂肪族基、置換されたもしくは未置換の芳香族基、または置換されたもしくは未置換のアルアルキル基であり；
    Ｂ１およびＢ２は、各々独立して、－Ｈ、または保護されたもしくは無保護の塩基であり；および
    ｎは０または正の整数である； 
    で示されるヌクレオシドホスホロアミダイトまたはその立体異性体である、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. 　オリゴヌクレオチドを製造する方法であって、
    アクチベータの存在下で、ヌクレオチドまたはヌクレオシドの３’または５’の水酸基またはチオール基に、ヌクレオシドホスホロアミダイトを結合させるカップリング工程を１回以上行うことを含み、
    少なくとも１回のカップリング工程において、前記ヌクレオシドホスホロアミダイトが
    （ａ）２個または３個のヌクレオシド部分を有するヌクレオシドホスホロアミダイト、または
    （ｂ）１個以上のヌクレオシド部分およびリンカー部分を有するヌクレオシドホスホロアミダイト
    であり、
    前記アクチベータが、以下の式：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
      
    式中、
    Ｘは、有機塩基である、
    または、以下の式：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
      
    式中、
    Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、Ｈ、直鎖または分岐鎖のＣ１～7アルキル基、および任意に置換されていてもよい芳香族基からなる群から選択される、で表される構造を有する、前記方法。
  14. 　Ｘは、Ｎ－メチルイミダゾール、ピリジンまたは３－メチルピリジンであり、
    Ｒ１は、Ｈ、ＣｎＨ２ｎ＋１またはベンジル基であり、
    Ｒ２は、Ｈ、ＣＨ３、またはＣ６Ｈ５であり、
    ｎは、１、２または３である、
    請求項１３に記載の方法。
  15. 　オリゴヌクレオチドを製造する方法であって、
    アクチベータの存在下で、ヌクレオチドまたはヌクレオシドの３’または５’の水酸基またはチオール基に、ヌクレオシドホスホロアミダイトを結合させるカップリング工程を１回以上行うことを含み、
    少なくとも１回のカップリング工程において、前記ヌクレオシドホスホロアミダイトが
    （ａ）２個以上のヌクレオシド部分を有するヌクレオシドホスホロアミダイト、または
    （ｂ）１個以上のヌクレオシド部分およびリンカー部分を有するヌクレオシドホスホロアミダイト
    であり、
    前記アクチベータのＨＯＭＯエネルギー（ａ．ｕ．）が、アセトニトリル中において、－０．２１４０７～－０．１６８５８であり、かつ、
    前記アクチベータの軌道係数が、アセトニトリル中において、０．３１５３１～０．５９４０５である、
    前記方法。
  16. 　前記アクチベータのｐＫａが、水中において、３．６５～７である、請求項１５に記載の方法。
  17. 　オリゴヌクレオチドを製造する方法であって、
    アクチベータの存在下で、ヌクレオチドまたはヌクレオシドの３’または５’の水酸基またはチオール基に、ヌクレオシドホスホロアミダイトを結合させるカップリング工程を１回以上行うことを含み、
    少なくとも１回のカップリング工程において、ヌクレオシドホスホロアミダイトが
    （ａ）２個または３個のヌクレオシド部分を有するヌクレオシドホスホロアミダイト、または
    （ｂ）１個以上のヌクレオシド部分およびリンカー部分を有するヌクレオシドホスホロアミダイトであり、
    前記アクチベータのＨＯＭＯエネルギー（ａ．ｕ．）が、アセトニトリル中において、－０．２２０２４～－０．１６８５８であり、かつ、
    前記アクチベータの軌道係数が、アセトニトリル中において、０．３１５３１～０．５９４０５である、
    前記方法。
  18. 　アクチベータのｐＫａが、水中において、３．６５～７である、請求項１７に記載の方法。
  19. 　オリゴヌクレオチドを製造する方法であって、
    アクチベータの存在下で、ヌクレオチドまたはヌクレオシドの３’または５’の水酸基またはチオール基に、ヌクレオシドホスホロアミダイトを結合させるカップリング工程を１回以上行うことを含み、
    少なくとも１回のカップリング工程において、ヌクレオシドホスホロアミダイトが
    （ａ）２個または３個のヌクレオシド部分を有するヌクレオシドホスホロアミダイト、または
    （ｂ）１個以上のヌクレオシド部分およびリンカー部分を有するヌクレオシドホスホロアミダイトであり、
    前記アクチベータのｐＫａが、水中において、３．６５～７である、
    前記方法。
  20. 　オリゴヌクレオチドを製造する方法であって、
    アクチベータの存在下で、ヌクレオチドまたはヌクレオシドの３’または５’の水酸基またはチオール基に、ヌクレオシドホスホロアミダイトを結合させるカップリング工程を１回以上行うことを含み、
    少なくとも１回のカップリング工程において、ヌクレオシドホスホロアミダイトが
    （ａ）２個以上のヌクレオシド部分を有するヌクレオシドホスホロアミダイト、または
    （ｂ）１個以上のヌクレオシド部分およびリンカー部分を有するヌクレオシドホスホロアミダイトであり、
    前記アクチベータのｐＫａが、水中において、４．３～７である、
    前記方法。
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