JP2006512411A - オリゴヌクレオチドの調製方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明によれば、テトラゾールでも置換テトラゾールでもない活性化物質の存在下で、ホスホラミダイトアプローチを用いてオリゴヌクレオチドを膨張性固体担体上にアセンブリするオリゴヌクレオチドの合成方法が提供される。
サッカリンもしくはサッカリン誘導体と一緒に塩錯体を形成することができる有機塩基は、pH7でプロトンを受容する傾向を有する有機化合物である。好ましい有機塩基は、二級アミン、三級アミン又はアザヘテロシクリル塩基であり、それぞれは1種以上の置換基で置換されていてもよく又は未置換でもよい。非プロトン性有機塩基は、プロトンを受容する前には化学構造中に水素結合プロトンを有していない有機塩基である。三級アミンなどの非プロトン性有機塩基及び非プロトン性アザヘテロシクリル化合物は、好ましくは本明細書に記載するように式1の化合物と併用される。
オリゴヌクレオチド合成は、固体担体の官能基への直接結合により行うことができる。しかし、多くの実施形態において、オリゴヌクレオチドを官能基を介して固体担体に取り付けるための開裂可能なリンカーを用いることが好ましい。このようなリンカーの例は当該分野で周知であり、特にスクシニル、オキサロイル及びトリチルリンカーを挙げることができる。
有機硫化剤の例としては、3H-ベンゾジチオール-3-オン-1,1-ジオキシド("Beaucage 試薬"ともよばれる)、ジベンゾイルテトラスルフィド、フェニルアセチルジスルフィド、N,N,N',N'-テトラエチルチウラムジスルフィド及び3-アミノ-[1,2,4]-ジチアゾール-5-チオン(米国特許U.S. Patent No. 6,096,881参照、この教示全体は本願に参照として組み込まれる)を挙げることができる。
オリゴヌクレオチドの硫化は、例えばピリジン/アセトニトリル(1:9)混合物又はピリジンなどの有機溶媒中約0.05M〜約0.2Mの濃度の3-アミノ-[1,2,4]-ジチアゾール-5-チオン溶液の使用により実施することができる。
望ましいオリゴヌクレオチドは、例えば、通常は5'-保護である保護ヌクレオシドホスホラミダイトを遊離ヒドロキシ基とカップリングする工程と、カップリング工程で形成された保護ホスファイトトリエステルを酸化もしくは硫化してホスフェートもしくはホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを形成する工程と、オリゴヌクレオチドから保護基を取り除く工程と、所望のシーケンスがアセンブルされるまでサイクル単位を繰り返す工程と、を含む一連の工程により実施することができる。オリゴヌクレオチドは、固体担体から開裂させることができ、任意の残留保護基、例えば核酸塩基及びリン保護基などは当該分野で公知の条件を用いて取り除くことができる。
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されない。
DMTrOABz-3'-サクシネートの合成
5'-DMTrOABz-3'-OH(75.0g、117mmol)をオーブンで乾燥させた500mlのフローレンティン(florentine)に仕込み、続いて無水コハク酸(15.6g、160mmol)及びN,N-ジメチルアミノピリジンを仕込んだ。フラスコを窒素ガスでフラッシュ洗浄し、首にゴム製隔膜を嵌め込んだ。無水ピリジン(250ml)をシリンジでフラスコに仕込んだ。得られた溶液を室温で82時間撹拌し、その後、ピリジンの塊を真空中で取り除いた。得られた粗油をストッパ付きのフラスコに50時間保存した。
Novabiochemから得たアミノメチル化ポリスチレン樹脂(ジビニルベンゼンで1%架橋した)(cat. no. 01-64-0010)(5g、"5.65mmol"、1eq)を大型直線縁(straight-edged)焼結漏斗(sinter funnel)内に置いて、N-メチルピロリドン(NMP、およそ30ml)で予備膨張させ、枝口から窒素の正圧を付与して、高粘度のペーストをバブリングした。NMPをおよそ10分後に排出した。
標準カイザーテスト(Kaiser tests)により反応の進行を確認したところ、この時間の後、否定的な結果(黄色)を与え、反応は完了したとみなされた。
カップリング反応中のすべての「乾燥」工程のために(すなわち、予備カップリング洗浄から硫化まで)、用いたDMFは市販の無水DMF(Aldrich)であり、必要に応じておよそ100mlバッチ内でモレキュラーシーブ上で一晩乾燥させた。こうして、10〜50ppmの含水率のDMF(Karl-Fischer)を与えた。最初に供給された150ppm以下と比較せよ。溶液を排出することは、Rotafloタップを介して反応器の上部にN2ガスの正圧を付与することにより、これらの工程で達成された。この系列の反応器内で最初に用いた樹脂は、上記で調製したHOABz-ポリスチレン樹脂0.5mmolg-1であった。すべてのホスホラミダイト類は、保護デオキシリボ-3'-βシアノエチルオキシ-N,N-ジイソプロピルホスホラミダイト類であった。
5'-AcOG(isobu)TABzCBzABz-3'-PDMA樹脂の調製
密閉した2L丸底フラスコ中で、アクリロイル-サルコシンメチルエステル、N,N-ジメチルアクリルアミド及びビス−アクリロイルエチレンジアミンの共重合により製造したポリ(アクリルアミド)樹脂(PL-DMA樹脂、例えばPolymer Labs、69g)をエチレンジアミン(700ml)で処理し、一晩、室温に放置した。次いで、スラリーを焼結漏斗(sinter funnel)に移し、DMF(12×700ml)で洗浄した。こうして、痕跡量のアミンも含まないDMF洗浄物を製造した。次いで、DCMを段階的に増量させ(2.5L;0〜100%DCM)、次いでDCM中エーテルを段階的に増量させて(900ml;0〜100%エーテル)、樹脂をDMFで洗浄した。次いで、樹脂を窒素流中で40℃にて一晩乾燥させた。製造された樹脂("PDMA")は、1グラムあたり973マイクロモルのアミノ官能基を有していた。
トリチル-テトラエチレングリコキシスチレンの10リットルスケールでの調製
ステージ 1
テトラエチレングリコール(4188g、21.5mol)を窒素雰囲気下で、機械的撹拌手段を具備する10L容器に添加して、60rpmで撹拌した。ピリジン(544g、6.9mol)をこの容器に添加して、混合物を50℃まで加熱した。トリフェニルメチルクロライド(1000g、3.6mol)をN2雰囲気下でトルエン(3000ml)中に溶解させ、温度を60℃以下に維持しながらグリコールにゆっくりと添加した。温度は、50℃に2時間保持し、次いで、室温まで冷却した。2Lのトルエンを添加して、混合物を6Lの脱イオン水で抽出し、水層を5Lのトルエンで抽出した。集めた有機抽出物を4Lの脱イオン水で2回洗浄し、500gの硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧下で溶媒を除去して、淡黄色油を收率1230g(トリチルを基準として74%)、94.3%純度(NMR)で得た。
モノ(トリチル)テトラエチレングリコール(1766.4g、3.8mol)を3Lのテトラヒドロフラン(THF)と一緒に10L容器に添加し、撹拌しながら-12℃まで冷却した。p-トルエンスルフォニルクロライド(945g、5mol)をグリコール/THF混合物に添加した。脱イオン水中KOH(880g、15.7mol)溶液(3L)を-5℃以下の温度に維持しながら1時間かけて、この溶液に添加した。添加の完了後、容器を25℃まで暖めて12時間保持した。層を分離して、下層の水層を2.5LのTHFで2回洗浄し、有機層を集めて、溶媒を減圧下で除去した。7.5Lのイソプロピルアセテート中の橙色/茶色油を10Lの水で抽出し、次いで2Lの水で5回抽出し、硫酸マグネシウム(500g)で乾燥させ、溶媒を除去して、粘性の橙色油1837g(78.0%)、純度95.3%(NMR)を得た。
脱イオン水(1.5L)及びTHF(2.1L)を10L容器に添加して、100rpmで撹拌を始めた。容器を-12℃まで冷却して、水酸化カリウム(535g、9.5mol)をゆっくりと添加した。THF中アセトキシスチレン(575ml、3.7mol)(1L)を冷却しながら約30分かけて容器に添加した。容器を30℃まで加熱して、1時間保持し、次いで20℃まで冷却した。1050mlのTHF中のステージ2生成物(1800g、2.9mol)を反応容器に15分かけて添加して、次いで混合物を40時間にわたり60℃に加熱した。反応物を冷却し、層を分離して、有機層を2Lの8M水酸化カリウム水溶液で2回洗浄した。溶媒を減圧下で除去して、残留物をトルエン(5L)中に溶解させ、2Lの脱イオン水で3回洗浄し、次いで2Lの1M水酸化ナトリウム水溶液で2回洗浄し、最後に3Lの脱イオン水で2回洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム(500g)で乾燥させ、溶媒を減圧下で除去して、橙色油の生成物を收率1471g(75%)、純度79.7%(NMR)で得た。
部分的に加水分解されたポリ(ビニルアルコール)(Airvol 540、34.9gの2.5wt%水溶液)及び塩化ナトリウム(31.2g)を、機械的撹拌手段を具備する脱イオン水(1181ml)含有の2Lの筒状バッフル付反応器に仕込んだ。ステージ3の生成物(79.7%、87.2g)、スチレン(59.1g)、ジビニルベンゼン(80%、1.4g)及び過酸化ラウロイルの混合物を反応器に仕込み、400rpmで撹拌した。20分後、撹拌速度を300rpmに減速し、反応物を水浴で80℃まで50分かけて加熱した。16時間後、反応混合物を冷却し、50μm濾布袋に移し、脱イオン水で洗浄した(5×1L)。次いで、ポリマービーズをTHF(4×1L)及びジクロロメタン(DCM、2×1L)で洗浄し、5Lフランジフラスコ/オーバーヘッド攪拌機内で室温にて窒素下で、ジクロロメタン(1800ml)、トリフルオロ酢酸(128g)及びトリエチルシラン(51.5g)の混合物と一緒に、4時間にわたり撹拌した。次いで、生成物をジクロロメタン(4×1L)及びヘキサン(5×1L)で洗浄してから、真空オーブン中で重さを一定にするために乾燥させて、0.97mmol/gのヒドロキシ負荷を有する白色ポリマービーズ78gを得た。
カップリング
前述の工程により調製したテトラエチレングリコール-官能基化ポリマー(0.51g、0.357mmol)を、小さな磁石撹拌子(magnetic follower)を具備する50mL丸底フラスコに仕込んだ。5'-DMTrOABz-3'-サクシネート(1.28g、4eq)及びヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt、0.29g、6eq)をN-メチルピロリドン(NMP、およそ5ml)中に溶解させ、ジイソプロピルカルボジイミド(DIC、0.19g、4.2eq)をこの溶液に添加した。DICを添加してからおよそ2分後、ジイソプロピルエチルアミン(0.19g、4.1eq)をこの溶液に添加した。この全溶液を旋回撹拌し、次いで、樹脂を含むフラスコに速やかに添加した。DICで汚染されたガラス製品及び等価物を2M水酸化ナトリウム浴内で解毒した。
前述の工程で調製した5'-DMTrOABz-3'-サクシネート-テトラエチレングリコール-官能基化ポリマー(0.739g)を、窒素雰囲気下での運転に適するジャケット付焼結反応器を含む隔膜入口及びRotafloタップを嵌め込んだ固相反応器に仕込んだ。窒素入口及び出口の両者とも自己指示(self-indicating)P2O5を充填したインライン乾燥管(in-line drying tubes)を取り付けた。ポリマーをDCM(10ml以下)で洗浄した。反応器ジャケットを流体循環機で0℃まで冷却した。DCM中3% v/vジクロロ酢酸(DCA)(60ml)を吸引下で樹脂床に通過させた。赤色はビーズ上に展開したが、溶液中には速やかに拡散しなかった。ビーズは、溶液の上部にも浮かんでいた。酸溶液のすべてを反応器に通過させてしまったら、樹脂をDMF(5×5ml以下)で洗浄し、次いでDCM(5×5ml以下)で洗浄した。樹脂を洗浄することは、窒素ガスフローを樹脂床を通して上方に通過させ、溶媒を添加し、次いで窒素供給を真空で置換して樹脂を抜き出すことにより達成された。
濾物のHPLC分析は、Aヌクレオシドの脱プリン反応が生じたとしたならば予想されるようにN-ベンゾイルアデニンの存在を示さなかった。
これは、下記のカップリング及び脱トリチル化条件を用い、ホスホラミダイト化学を用いて達成された。慣用の5'-ジメトキシトリチルデオキシリボヌクレオシド-3'-βシアノエチルオキシ-N,N-ジイソプロピルホスホラミダイトを用いた。
カップリング反応中のすべての「乾燥」工程(すなわち、予備カップリング洗浄から硫化を含む工程まで)について、用いたDMFは、市販の無水DMF(Aldrich)であり、必要に応じて、およそ100mlバッチで4Åモレキュラーシーブ上で一晩乾燥させた。こうして、含水率が5〜50ppm(Karl-Fischer)のDMFを得た。最初に供給されたものは150ppm以下であったことと比較せよ。溶液の排出は、正圧のN2ガスを反応器の上部にRotafloタップを介して付与して、焼結漏斗(sinter funnel)の下方から吸引することにより、これらの工程において達成された。この一連の反応で最初に用いた担体は、上述の方法で調製した5'-HOABz-3'-サクシネート-テトラエチレングリコール-官能基化ポリマーであった。
脱トリチル化の前に、反応器ジャケットを0℃まで冷却して、樹脂をDCMで洗浄/膨張させた。DCM中3% (v/v) DCA(「酸溶液」)を用いて、樹脂を脱トリチル化した。各脱トリチル化サイクルについて、用いた酸溶液の容積は、樹脂に結合すると仮定したDMTの1mmolあたり167mlを基準とした。
4カップリング工程を経た平均カップリング収率は、トリチル分析により97.5%と算出された。
Claims (12)
- テトラゾール又は置換テトラゾールではない活性化物質の存在下で、ホスホラミダイトアプローチを用いてオリゴヌクレオチドを膨張性固体担体上にアセンブルするオリゴヌクレオチドの合成プロセス。
- 前記活性化物質は、ピリジニウム塩、イミダゾリニウム塩及びベンズイミダゾリニウム塩;ベンゾトリアゾール及びこれらの誘導体;及びサッカリンもしくはサッカリン誘導体からなる群から選択される、請求項1に記載のプロセス。
- 前記活性化物質は、N-メチルイミダゾール、ピリジンもしくはサッカリンの3-メチルピリジン塩である、請求項3に記載のプロセス。
- 前記膨張性担体は、官能基化ポリスチレン、部分的に加水分解されたポリビニルアセテートもしくはポリ(アクリルアミド)を含む、請求項1〜4のいずれか1項に記載のプロセス。
- ヌクレオシドホスホラミダイトを、遊離ヒドロキシ基を含むヌクレオシドもしくはオリゴヌクレオチドとカップリングさせることを含む、請求項1〜5のいずれか1項に記載のプロセス。
- ヌクレオシドホスホラミダイトは、デオキシリボヌクレシド-3'-ホスホラミダイトもしくはリボヌクレシド-3'-ホスホラミダイトである、請求項6に記載のプロセス。
- 遊離ヒドロキシ基を含むヌクレオシドもしくはオリゴヌクレオチドは遊離5'-ヒドロキシ基を含む、請求項6又は7に記載のプロセス。
- 遊離ヒドロキシ基を含むヌクレオシドもしくはオリゴヌクレオチドは開裂可能なリンカーによって、固体担体に結合している、請求項6〜8のいずれか1項に記載のプロセス。
- 固体担体を膨張させる溶媒を用いる、請求項1〜9のいずれか1項に記載のプロセス。
- 前記溶媒は、アセトニトリル、ジメチルフォルムアミド、N-メチルピロリドン、ジクロロメタン、テトラヒドロフラン又はピリジンである、請求項10に記載のプロセス。
- アセンブルされたオリゴヌクレオチドは、固体担体から開裂される、請求項1〜11のいずれか1項に記載のプロセス。
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