JP2023503985A - ３’－ｒｎａオリゴヌクレオチドの合成 - Google Patents

Abstract

本開示は、３’－ヒドロキシル基を含む少なくとも１つのヌクレオシドを含むオリゴヌクレオチドを合成するためのモノマー及び方法に関する。

Description

関連出願の相互参照

本出願は、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）の下で、２０１９年１１月２７日に出願された米国仮特許出願第６２／９４１，１５３号明細書の利益を主張するものであり、その内容は、参照によってその全体が本明細書に援用される。

本発明は、概して、核酸化学及びオリゴヌクレオチドの化学合成に関する。より詳細には、本発明は、３’－ヒドロキシル基を含む少なくとも１つのヌクレオシドを含むオリゴヌクレオチドを合成するためのモノマー及び方法に関する。

修飾オリゴヌクレオチドは、分子生物学的研究及び治療応用において大きい価値がある。修飾オリゴヌクレオチドの化学合成は、ルーチン的であるが、多くの修飾オリゴヌクレオチドの容易さ及び収率は、低い。例えば、一般的に使用される保護基は、化学合成されたオリゴヌクレオチドを脱保護するために使用される条件に対して不安定である。３’－ヒドロキシル基を含む少なくとも１つのヌクレオシドを含むオリゴヌクレオチドを調製する場合、これは、特に問題である。したがって、当技術分野において、このようなオリゴヌクレオチドを調製するためのモノマー及び方法が依然として必要とされている。本開示は、少なくとも部分的にこの必要性に対処する。

本開示は、収率が改善され、且つ不純物がより少ない、オリゴヌクレオチドを調製するためのモノマー及び方法を提供し、ここで、オリゴヌクレオチドは、３’－ヒドロキシル基を有するヌクレオシドを少なくとも１つ、例えば２つ、３つ、４つ又はそれを超えて有する。一般に、本方法は、ヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドの遊離ヒドロキシル基を、トリイソプロピルシリルエーテル（ＴＩＰＳ）保護３’－ヒドロキシル基を有するヌクレオシドホスホロアミダイトモノマーとカップリングさせることを含む。カップリングにより、亜リン酸トリエステル中間体が形成され、これを酸化又は硫化させて、リン酸トリエステル又はホスホロチオエート中間体を形成することができる。

所定の長さ及び配列を有するオリゴヌクレオチドを本方法によって調製することができる。例えば、本明細書に記載される方法及びモノマーを用いて、約６～約５０のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを調製することができる。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、約１０～約３０のヌクレオチドを含む。

別の態様では、本開示は、モノマー、例えばトリイソプロピルシリルエーテル保護３’－ヒドロキシル基を有するヌクレオシドホスホロアミダイトモノマーを提供する。一般に、本モノマーは、式（Ｉ）：

のものである。

式（Ｉ）において、Ｂは、修飾又は非修飾核酸塩基であり；Ｒ^１は、酸に不安定なヒドロキシル保護基であり；Ｒ^２は、－Ｓｉ（Ｒ^４）_３であり；Ｒ^３は、－Ｐ（ＮＲ^５Ｒ^６）ＯＲ^７であり；各Ｒ^４は、独立して、任意選択的に置換されたアルキル、アリール、アラルキル、アルカリル、シクロアルキル、アルケニル、シクロアルケニル、アルキニル又はシクロアルキニルであり；Ｒ^５及びＲ^６は、独立して、任意選択的に置換されたアルキル、アリール、アラルキル、アルカリル、シクロアルキル、アルケニル、シクロアルケニル、アルキニル若しくはシクロアルキニルであるか、又はＲ^５及びＲ^６は、結合されて、ヘテロシクリルを形成し；及びＲ^７は、任意選択的に置換されたアルキル、アリール、アラルキル、アルカリル、シクロアルキル、アルケニル、シクロアルケニル、アルキニル又はシクロアルキニルである。

式（Ｉ）いくつかのモノマーにおいて、Ｂは、アデニン、グアニン、シトシン又はウラシルであり；Ｒ^１は、ジメトキシトリチルであり；Ｒ^４、Ｒ^５及びＲ^６は、イソプロピルであり；及びＲ^７は、β－シアノエチルである。

本特許又は出願ファイルは、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含む。カラー図面を含む本特許又は特許出願公報のコピーは、要求及び必要な料金の支払いに応じて当局により提供されるであろう。

エタノール中の水酸化アンモニウムにより脱保護した後の、Ｎ１７位にＵ－２’－ＯＴＢＳを有する配列１（ａＵｆｃａａＡｆ（Ｕ－２’－ＯＴＢＳ）ＣｆＡｆｃｕｕｕＡｆｕＵｆｇａｇｕｕｕｃ、配列番号１）のＨＰＬＣトレースであり、ＦＬＰ－２’－ＯＴＢＳ、ＦＬＰ－ＯＨ及び切断（１６ｍｅｒ）の生成が示される。 エタノール中の水酸化アンモニウムにより脱保護した後の、Ｎ１７位にＵ－３’－ＯＴＢＳを有する配列２（ａＵｆｃａａＡｆ（Ｕ－３’－ＯＴＢＳ）ＣｆＡｆｃｕｕｕＡｆｕＵｆｇａｇｕｕｕｃ、配列番号２）のＰＬＣトレースであり、ＦＬＰ－３’－ＯＴＢＳ、ＦＬＰ－ＯＨ及び切断（１６ｍｅｒ）の生成が示される。 エタノール中の水酸化アンモニウムにより脱保護した後の、Ｎ１７位にＧ－３’－ＯＴＢＳを有する配列３（ａＵｆｃａａＡｆ（Ｇ－３’－ＯＴＢＳ）ＣｆＡｆｃｕｕｕＡｆｕＵｆｇａｇｕｕｕｃ、配列番号３）のＨＰＬＣトレースであり、ＦＬＰ－３’－ＯＴＢＳ、ＦＬＰ－ＯＨ及び切断（１６ｍｅｒ）の生成が示される。 エタノール中の水酸化アンモニウムにより脱保護した後の、Ｎ１７位にＵ－２’－ＯＴＯＭを有する配列４（ａＵｆｃａａＡｆ（Ｕ－２’－ＯＴＯＭ）ＣｆＡｆｃｕｕｕＡｆｕＵｆｇａｇｕｕｕｃ、配列番号４）のＨＰＬＣトレースであり、ＦＬＰ－２’－ＯＴＯＭ、ＦＬＰ－ＯＨ及び切断（１６ｍｅｒ）の生成が示される。 エタノール中の水酸化アンモニウムにより脱保護した後の、Ｎ１７位にＵ－３’－ＯＴＯＭを有する配列５（ａＵｆｃａａＡｆ（Ｕ－３’－ＯＴＯＭ）ＣｆＡｆｃｕｕｕＡｆｕＵｆｇａｇｕｕｕｃ、配列番号５）のＨＰＬＣトレースであり、ＦＬＰ－３’－ＯＴＯＭ、ＦＬＰ－ＯＨ及び切断（１６ｍｅｒ）の生成が示される。 エタノール中の水酸化アンモニウムにより脱保護した後の、Ｎ１７位にＵ－３’－ＯＴＩＰＳを有する配列６（ａＵｆｃａａＡｆ（Ｕ－３’－ＯＴＩＰＳ）ＣｆＡｆｃｕｕｕＡｆｕＵｆｇａｇｕｕｕｃ、配列番号６）のＨＰＬＣトレースであり、ＦＬＰ－３’－ＯＴＩＰＳ、ＦＬＰ－ＯＨ及び切断（１６ｍｅｒ）の生成が示される。 エタノール中の水酸化アンモニウム及びＨＦ／ピリジンにより脱保護した後の、Ｎ１７位にＵ－３’－ＯＴＩＰＳを有する配列６（ａＵｆｃａａＡｆ（Ｕ－３’－ＯＴＩＰＳ）ＣｆＡｆｃｕｕｕＡｆｕＵｆｇａｇｕｕｕｃ、配列番号６）のＨＰＬＣトレースであり、ＦＬＰ－ＯＨの生成が示される。ＲＮＡ中の３’－ＯＴＰＳ保護基は、ＨＦ／ピリジン処理を用いて有効に切断することができる。 濃水酸化アンモニウム水溶液により室温で一晩脱保護された配列８（ａｓＣｆｓｇｕｕｕ（Ｕ２ｐ）ｃａａａｇｃＡｆｃＵｆｕｕａｕｕｓｇｓａ、配列番号８）のデコンボリューションマススペクトルを示す。主ピークは、所望のＦＬＰ（配列８）及び３’－断片（配列９（ｃａａａｇｃＡｆｃＵｆｕｕａｕｕｓｇｓａ、配列番号９））に対応する。ＦＬＰの約１４％は、依然として単一のＮ－２－イソブチリル保護基を保持している（Ｍ＝７６６３）。 濃メチルアミン水溶液により室温で一晩２時間脱保護された配列８（ａｓＣｆｓｇｕｕｕ（Ｕ２ｐ）ｃａａａｇｃＡｆｃＵｆｕｕａｕｕｓｇｓａ、配列番号８）のデコンボリューションマススペクトルを示す。主ピークは、所望のＦＬＰ（配列８）及び３’－断片（配列９（ｃａａａｇｃＡｆｃＵｆｕｕａｕｕｓｇｓａ、配列番号９））に対応する。 濃メチルアミン水溶液により室温で一晩脱保護された配列８（ａｓＣｆｓｇｕｕｕ（Ｕ２ｐ）ｃａａａｇｃＡｆｃＵｆｕｕａｕｕｓｇｓａ、配列番号８）のデコンボリューションマススペクトルを示す。主ピークは、所望のＦＬＰ（配列８）、３’－断片（配列９（ｃａａａｇｃＡｆｃＵｆｕｕａｕｕｓｇｓａ、配列番号９））及び５’－断片（配列１０、ａｓＣｆｓｇｕｕｕ（Ｕ２ｐ）Ｐ、配列番号１０））に対応する。 いくつかの例示的な３’－トリイソプロピルシリルエーテル（３’－ＴＩＰＳ）ヌクレオシドモノマーの構造を示す。

一態様において、本開示は、３’－ヒドロキシル基を有する少なくとも１つのヌクレオシドを含むオリゴヌクレオチドを調製するための改善された方法を提供する。トリイソプロピルシリルエーテル（ＴＩＰＳ）保護３’－ヒドロキシル基を含むヌクレオシドホスホロアミダイトモノマーは、ヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドの遊離ヒドロキシル、例えば５’－ＯＨ、３’－ＯＨ又は２’－ＯＨ、好ましくは５’－ＯＨにカップリングされる。

ヌクレオシドホスホロアミダイトモノマーをヒドロキシル基にカップリングさせるための方法及び試薬は、当技術分野で周知である。したがって、オリゴヌクレオチドは、当業者に知られている手順及び装置を用いて調製することができる。例えば、フラスコなどのガラス反応器を適切に使用することができる。好ましくは、固相合成手順及び制御細孔ガラスなどの固体支持体が使用される。さらにより好ましくは、本発明の方法は、自動ＤＮＡ合成機を用いて実行され得る。自動合成技術を含む適切な固相技術は、Ｆ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ（ｅｄ．），Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ，ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９１）に記載されている。

加えて、オリゴヌクレオチドは、小規模又は大規模に調製され得る。例えば、オリゴヌクレオチドは、μｍｏｌスケール又はｍｇスケールで調製され得る。

カップリングステップ及び酸化／硫化ステップは、共通溶媒中で実施することができる。例えば、カップリング及び酸化／硫化は、アセトニトリル中で実施することができる。

酸化ステップは、ホスホトリエステル官能基の形成をもたらすのに十分な時間にわたって亜リン酸トリエステル中間体を酸化試薬と接触させることによって実行され得る。本発明の亜リン酸中間体の酸化において使用するのに適した溶媒系は、２つ以上の溶媒の混合物を含む。好ましくは、非プロトン性溶媒と、プロトン性又は塩基性溶媒との混合物である。好ましい溶媒混合物には、アセトニトリルと弱塩基との混合物が含まれる。例えば、酸化ステップは、弱塩基の存在下で実行され得る。例示的な塩基としては、ピリジン、ルチジン、ピコリン又はコリジンが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、酸化ステップは、Ｉ_２／Ｈ_２Ｏの存在下で実行され得る。

硫化（硫黄転移試薬を利用する酸化）は、ホスホロチオエート官能基の形成をもたらすのに十分な時間にわたって亜リン酸トリエステル中間体を硫黄転移試薬と接触させることによって実行され得る。オリゴヌクレオチド合成において使用するための例示的な硫黄転移試薬としては、フェニルアセチルジスルフィド、アリールアセチルジスルフィド及びアリール置換フェニルアセチルジスルフィドが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、硫黄転移試薬は、３－（ジメチルアミノメチリデン）アミノ－３Ｈ－１，２，４－ジチアゾール－３－チオン（ＤＤＴＴ）又は３Ｈ－１，２－ベンゾジチオール－３－オン１，１－ジオキシド（Ｂｅａｕｃａｇｅ試薬）であり得る。

合成の完了後、オリゴヌクレオチドは、例えば、所望の生成物を得るために、オリゴヌクレオチド上の任意の保護基を除去するための方法及び試薬を用いて脱保護され得る。したがって、いくつかの実施形態では、本方法は、合成されたオリゴヌクレオチドを塩基で処理して、オリゴヌクレオチド上の任意の非ＴＩＰＳ保護基を除去することをさらに含む。オリゴヌクレオチドの合成で使用される非ＴＩＰＳ保護基の除去に使用するための例示的な塩基としては、水酸化アンモニウム、メチルアミン及びこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。塩基で処理することは、室温又は高温で適切に実行され得る。「室温」には、約２０℃～約３０℃の周囲温度が含まれる。「高温」には、３０℃よりも高い温度が含まれる。例えば、高温は、約３２℃～約６５℃の温度であり得る。いくつかの実施形態において、塩基で処理することは、約３５℃におけるものである。処理時間は、およそ数分、例えば５、１０、１５、２０、２５、３０、４５又は６０分などから数時間、例えば２時間、３時間、４時間、５時間、１０時間、１５時間、２４時間又はそれを超える時間などである。いくつかの実施形態において、塩基で処理することは、約１５時間にわたるものである。いくつかの実施形態において、塩基で処理することは、約３５℃で約１５時間にわたるものである。

非ＴＩＰＳ保護基が除去された後、ＴＩＰＳ保護基は、部分的に脱保護されたオリゴヌクレオチドを、ＴＩＰＳ保護ヒドロキシル基を遊離ヒドロキシル基に変換するのに有効な脱保護試薬で処理することによって除去され得る。シリル含有ヒドロキシル保護基を除去するための方法及び試薬は、当技術分野で周知である。一般に、脱保護試薬は、フッ化物アニオンを含む。ＴＩＰＳ保護基を除去するための１つの例示的な脱保護試薬は、ＨＦ．ピリジンである。ＴＩＰＳ基を除去するための脱保護ステップは、室温又は高温で適切に実行され得る。例えば、脱保護ステップは、３５℃～約６５℃の温度で実行され得る。いくつかの実施形態において、脱保護ステップは、約５０℃で実行される。脱保護時間は、およそ数分、例えば５、１０、１５、２０、２５、３０、４５又は６０分などから数時間、例えば２時間、３時間、４時間又は５時間などである。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、脱保護試薬で約１時間処理される。

脱保護後、所望の生成物は、オリゴヌクレオチドの単離及び精製のために、当技術分野で知られている方法を用いて単離及び精製され得る。このような方法には、ろ過及び／又はＨＰＬＣ精製が含まれるが、これらに限定されない。

別の態様において、本開示は、トリイソプロピルシリルエーテル（ＴＩＰＳ）保護３’－ヒドロキシル基を有するヌクレオシドモノマー、例えば式（Ｉ）：

の構造を有するモノマーを提供する。

式（Ｉ）のモノマーにおいて、Ｂは、修飾又は非修飾核酸塩基である。任意選択的に、核酸塩基は、１つ又は複数の保護基を含むことができる。例示的な核酸塩基としては、アデニン、グアニン、シトシン、ウラシル、チミン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、ヌブラリン、イソグアニシン、ツベルシジン並びにアデニングアニン、シトシン及びウラシルの置換又は修飾類似体、例えば２－アミノアデニン、アデニン及びグアニンの６－メチル及び他のアルキル誘導体、アデニン及びグアニンの２－プロピル及び他のアルキル誘導体、５－ハロウラシル及びシトシン、５－プロピニルウラシル及びシトシン、６－アゾウラシル、シトシン及びチミン、５－ウラシル（プソイドウラシル）、４－チオウラシル、５－ハロウラシル、５－（２－アミノプロピル）ウラシル、５－アミノアリルウラシル、８－ハロ、アミノ、チオール、チオアルキル、ヒドロキシル及び他の８－置換アデニン及びグアニン、５－トリフルオロメチル及び他の５－置換ウラシル及びシトシン、７－メチルグアニン、５－置換ピリミジン、６－アザピリミジン並びにＮ－２、Ｎ－６及びＯ－６置換プリン、例えば２－アミノプロピルアデニン、５－プロピニルウラシル及び５－プロピニルシトシン、ジヒドロウラシル、３－デアザ－５－アザシトシン、２－アミノプリン、５－アルキルウラシル、７－アルキルグアニン、５－アルキルシトシン、７－デアザアデニン、Ｎ６、Ｎ６－ジメチルアデニン、２，６－ジアミノプリン、５－アミノ－アリル－ウラシル、Ｎ３－メチルウラシル、置換１，２，４－トリアゾール、２－ピリジノン、５－ニトロインドール、３－ニトロピロール、５－メトキシウラシル、ウラシル－５－オキシ酢酸、５－メトキシカルボニルメチルウラシル、５－メチル－２－チオウラシル、５－メトキシカルボニルメチル－２－チオウラシル、５－メチルアミノメチル－２－チオウラシル、３－（３－アミノ－３カルボキシプロピル）ウラシル、３－メチルシトシン、５－メチルシトシン、Ｎ^４－アセチルシトシン、２－チオシトシン、Ｎ６－メチルアデニン、Ｎ６－イソペンチルアデニン、２－メチルチオ－Ｎ６－イソペンテニルアデニン、Ｎ－メチルグアニン又はＯ－アルキル化塩基が挙げられるが、これらに限定されない。さらなるプリン及びピリミジンには、米国特許第３，６８７，８０８号明細書に開示されるもの、Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｐａｇｅｓ ８５８－８５９，Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｉ．，ｅｄ．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９９０に開示されるもの及びＥｎｇｌｉｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９１，３０，６１３により開示されるものが含まれる。

いくつかの実施形態において、核酸塩基は、アデニン、グアニン、シトシン、ウラシル、チミン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、ヌブラリン、イソグアニシン、ツベルシジン、２－（ハロ）アデニン、２－（アルキル）アデニン、２－（プロピル）アデニン、２－（アミノ）アデニン、２－（アミノアルキル）アデニン、２－（アミノプロピル）アデニン、２－（メチルチオ）－Ｎ^６－（イソペンテニル）アデニン、６－（アルキル）アデニン、６－（メチル）アデニン、７－（デアザ）アデニン、８－（アルケニル）アデニン、８－（アルキル）アデニン、８－（アルキニル）アデニン、８－（アミノ）アデニン、８－（ハロ）アデニン、８－（ヒドロキシル）アデニン、８－（チオアルキル）アデニン、８－（チオール）アデニン、Ｎ^６－（イソペンチル）アデニン、Ｎ^６－（メチル）アデニン、Ｎ^６、Ｎ^６－（ジメチル）アデニン、２－（アルキル）グアニン、２－（プロピル）グアニン、６－（アルキル）グアニン、６－（メチル）グアニン、７－（アルキル）グアニン、７－（メチル）グアニン、７－（デアザ）グアニン、８－（アルキル）グアニン、８－（アルケニル）グアニン、８－（アルキニル）グアニン、８－（アミノ）グアニン、８－（ハロ）グアニン、８－（ヒドロキシル）グアニン、８－（チオアルキル）グアニン、８－（チオール）グアニン、Ｎ－（メチル）グアニン、２－（チオ）シトシン、３－（デアザ）－５－（アザ）シトシン、３－（アルキル）シトシン、３－（メチル）シトシン、５－（アルキル）シトシン、５－（アルキニル）シトシン、５－（ハロ）シトシン、５－（メチル）シトシン、５－（プロピニル）シトシン、５－（プロピニル）シトシン、５－（トリフルオロメチル）シトシン、６－（アゾ）シトシン、Ｎ^４－（アセチル）シトシン、３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）ウラシル、２－（チオ）ウラシル、５－（メチル）－２－（チオ）ウラシル、５－（メチルアミノメチル）－２－（チオ）ウラシル、４－（チオ）ウラシル、５－（メチル）－４－（チオ）ウラシル、５－（メチルアミノメチル）－４－（チオ）ウラシル、５－（メチル）－２，４－（ジチオ）ウラシル、５－（メチルアミノメチル）－２，４－（ジチオ）ウラシル、５－（２－アミノプロピル）ウラシル、５－（アルキル）ウラシル、５－（アルキニル）ウラシル、５－（アリルアミノ）ウラシル、５－（アミノアリル）ウラシル、５－（アミノアルキル）ウラシル、５－（グアニジニウムアルキル）ウラシル、５－（１，３－ジアゾール－１－アルキル）ウラシル、５－（シアノアルキル）ウラシル、５－（ジアルキルアミノアルキル）ウラシル、５－（ジメチルアミノアルキル）ウラシル、５－（ハロ）ウラシル、５－（メトキシ）ウラシル、ウラシル－５－オキシ酢酸、５－（メトキシカルボニルメチル）－２－（チオ）ウラシル、５－（メトキシカルボニル－メチル）ウラシル、５－（プロピニル）ウラシル、５－（プロピニル）ウラシル、５－（トリフルオロメチル）ウラシル、６－（アゾ）ウラシル、ジヒドロウラシル、Ｎ^３－（メチル）ウラシル、５－ウラシル（すなわちプソイドウラシル）、２－（チオ）プソイドウラシル、４－（チオ）プソイドウラシル、２，４－（ジチオ）プソイドウラシル、５－（アルキル）プソイドウラシル、５－（メチル）プソイドウラシル、５－（アルキル）－２－（チオ）プソイドウラシル、５－（メチル）－２－（チオ）プソイドウラシル、５－（アルキル）－４－（チオ）プソイドウラシル、５－（メチル）－４－（チオ）プソイドウラシル、５－（アルキル）－２，４－（ジチオ）プソイドウラシル、５－（メチル）－２，４－（ジチオ）プソイドウラシル、１－置換プソイドウラシル、１－置換２（チオ）－プソイドウラシル、１－置換４－（チオ）プソイドウラシル、１－置換２，４－（ジチオ）プソイドウラシル、１－（アミノカルボニルエチレニル）－プソイドウラシル、１－（アミノカルボニルエチレニル）－２（チオ）－プソイドウラシル、１－（アミノカルボニルエチレニル）－４－（チオ）プソイドウラシル、１－（アミノカルボニルエチレニル）－２，４－（ジチオ）プソイドウラシル、１－（アミノアルキルアミノカルボニルエチレニル）－プソイドウラシル、１－（アミノアルキルアミノ－カルボニルエチレニル）－２（チオ）－プソイドウラシル、１－（アミノアルキルアミノカルボニルエチレニル）－４－（チオ）プソイドウラシル、１－（アミノアルキルアミノカルボニルエチレニル）－２，４－（ジチオ）プソイドウラシル、１，３－（ジアザ）－２－（オキソ）－フェノキサジン－１－イル、１－（アザ）－２－（チオ）－３－（アザ）－フェノキサジン－１－イル、１，３－（ジアザ）－２－（オキソ）－フェンチアジン－１－イル、１－（アザ）－２－（チオ）－３－（アザ）－フェンチアジン－１－イル、７－置換１，３－（ジアザ）－２－（オキソ）－フェノキサジン－１－イル、７－置換１－（アザ）－２－（チオ）－３－（アザ）－フェノキサジン－１－イル、７－置換１，３－（ジアザ）－２－（オキソ）－フェンチアジン－１－イル、７－置換１－（アザ）－２－（チオ）－３－（アザ）－フェンチアジン－１－イル、７－（アミノアルキルヒドロキシ）－１，３－（ジアザ）－２－（オキソ）－フェノキサジン－１－イル、７－（アミノアルキルヒドロキシ）－１－（アザ）－２－（チオ）－３－（アザ）－フェノキサジン－１－イル、７－（アミノアルキルヒドロキシ）－１，３－（ジアザ）－２－（オキソ）－フェンチアジン－１－イル、７－（アミノアルキルヒドロキシ）－１－（アザ）－２－（チオ）－３－（アザ）－フェンチアジン－１－イル、７－（グアニジニウムアルキルヒドロキシ）－１，３－（ジアザ）－２－（オキソ）－フェノキサジン－１－イル、７－（グアニジニウムアルキルヒドロキシ）－１－（アザ）－２－（チオ）－３－（アザ）－フェノキサジン－１－イル、７－（グアニジニウムアルキル－ヒドロキシ）－１，３－（ジアザ）－２－（オキソ）－フェンチアジン－１－イル、７－（グアニジニウムアルキルヒドロキシ）－１－（アザ）－２－（チオ）－３－（アザ）－フェンチアジン－１－イル、１，３，５－（トリアザ）－２，６－（ジオキサ）－ナフタレン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、ヌブラリン、ツベルシジン、イソグアニシン、イノシニル、２－アザ－イノシニル、７－デアザ－イノシニル、ニトロイミダゾリル、ニトロピラゾリル、ニトロベンゾイミダゾリル、ニトロインダゾリル、アミノインドリル、ピロロピリミジニル、３－（メチル）イソカルボスチリリル、５－（メチル）イソカルボスチリリル、３－（メチル）－７－（プロピニル）イソカルボスチリリル、７－（アザ）インドリル、６－（メチル）－７－（アザ）インドリル、イミジゾピリジニル、９－（メチル）－イミジゾピリジニル、ピロロピリジニル、イソカルボスチリリル、７－（プロピニル）イソカルボスチリリル、プロピニル－７－（アザ）インドリル、２，４，５－（トリメチル）フェニル、４－（メチル）インドリル、４，６－（ジメチル）インドリル、フェニル、ナフタレニル、アントラセニル、フェナントラセニル、ピレニル、スチルベニル、テトラセニル、ペンタセニル、ジフルオロトリル、４－（フルオロ）－６－（メチル）ベンゾイミダゾール、４－（メチル）ベンゾイミダゾール、６－（アゾ）チミン、２－ピリジノン、５－ニトロインドール、３－ニトロピロール、６－（アザ）ピリミジン、２－（アミノ）プリン、２，６－（ジアミノ）プリン、５－置換ピリミジン、Ｎ^２－置換プリン、Ｎ^６－置換プリン、Ｏ^６－置換プリン、置換１、２、４－トリアゾール及びこれらの任意のＯ－アルキル化又はＮ－アルキル化誘導体からなる群から選択され得る。いくつかの実施形態において、核酸塩基は、アデニン、グアニン、シトシン及びウラシルからなる群から選択される。

Ｒ^１は、ヒドロキシル保護基である。ヌクレオシド５’－ヒドロキシルの保護のために従来使用される保護基は、４，４’－ジメトキシトリチル（「ＤＭＴ」）である。しかしながら、オリゴヌクレオチド合成のために、当技術分野で既知であり且つ使用されている任意のヒドロキシル保護基を使用することができる。このような保護基には、モノメトキシトリチル（「ＭＭＴ」）、９－フルオレニルメチルカーボネート（「Ｆｍｏｃ」）、ｏ－ニトロフェニルカルボニル、ｐ－フェニルアゾフェニルカルボニル、フェニルカルボニル、ｐ－クロロフェニルカルボニル及び５’－（α－メチル－２－ニトロピペロニル）オキシカルボニル（「ＭｅＮＰＯＣ」）が含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、Ｒ^１は、酸に不安定なヒドロキシル保護基、例えばＤＭＴ又はＭＭＴである。いくつかの実施形態において、Ｒ１は、ＤＭＴである。

各Ｒ^４は、アルキル、アリール、アラルキル、アルカリル、シクロアルキル、アルケニル、シクロアルケニル、アルキニル又はシクロアルキニルからなる群から独立して選択することができ、これらは、それぞれ例えば独立して選択される１つ、２つ、３つ、４つ又はそれを超える置換基によって任意選択的に置換され得る。例えば、各Ｒ^４は、独立して、任意選択的に置換されたＣ_１～Ｃ_６アルキルであり得る。Ｒ^４のための例示的なアルキルとしては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、２－メチルプロピル、ｔ－ブチル及びペンチルが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、各Ｒ^４は、イソプロピルである。

Ｒ^３は、Ｈ又は－Ｐ（ＮＲ^５Ｒ^６）ＯＲ^７であり得る。いくつかの実施形態において、Ｒ^３は、Ｈである。いくつかの他の実施形態において、Ｒ^３は、－Ｐ（ＮＲ^５Ｒ^６）ＯＲ^７である。Ｒ^３が－Ｐ（ＮＲ^５Ｒ^６）ＯＲ^７である場合、Ｒ^５及びＲ^６は、アルキル、アリール、アラルキル、アルカリル、シクロアルキル、アルケニル、シクロアルケニル、アルキニル及びシクロアルキニルからなる群から独立して選択することができ、これらは、それぞれ例えば独立して選択される１つ、２つ、３つ、４つ若しくはそれを超える置換基によって任意選択的に置換され得るか、又はＲ^５及びＲ^６は、結合されて、ヘテロシクリルを形成することができ、これは、例えば、独立して選択される１つ、２つ、３つ、４つ若しくはそれを超える置換基によって任意選択的に置換され得る。例えば、Ｒ^５及びＲ^６は、独立して、任意選択的に置換されたＣ_１～Ｃ_６アルキルであり得る。Ｒ^５及びＲ^６のための例示的なアルキルとしては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、２－メチルプロピル、ｔ－ブチル及びペンチルが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、Ｒ^５及びＲ^６は、イソプロピルである。

Ｒ^７は、アルキル、アリール、アラルキル、アルカリル、シクロアルキル、アルケニル、シクロアルケニル、アルキニル又はシクロアルキニルであり、これらは、それぞれ例えば独立して選択される１つ、２つ、３つ、４つ又はそれを超える置換基によって任意選択的に置換され得る。例えば、各Ｒ^７は、独立して、任意選択的に置換されたＣ_１～Ｃ_６アルキルであり得る。Ｒ^７のための例示的なアルキルとしては、任意選択的に置換されたメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、２－メチルプロピル、ｔ－ブチル及びペンチルが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、Ｒ^７は、β－シアノエチルである。

式（Ｉ）のモノマーのいくつかの実施形態において、Ｂは、アデニン、グアニン、シトシン、チミン又はウラシルであり；Ｒ^１は、モノメトキシトリチル又はジメトキシトリチルであり；Ｒ^４は、独立して、任意選択的に置換されたＣ_１～Ｃ_６アルキルであり；Ｒ^３は、Ｈであり、及びＲ^７は、任意選択的に置換されたＣ_１～Ｃ_６アルキルである。例えば、Ｂは、アデニン、グアニン、シトシン、チミン又はウラシルであり；Ｒ^１は、ジメトキシトリチルであり；Ｒ^４は、独立して、イソプロピルであり；及びＲ^３は、Ｈである。

式（Ｉ）のモノマーのいくつかの実施形態において、Ｂは、アデニン、グアニン、シトシン、チミン又はウラシルであり；Ｒ^１は、モノメトキシトリチル又はジメトキシトリチルであり；Ｒ^４は、独立して、任意選択的に置換されたＣ_１～Ｃ_６アルキルであり；Ｒ^５及びＲ^６は、独立して、任意選択的に置換されたＣ_１～Ｃ_６アルキルであるか、又はＲ^５及びＲ^５は、結合されて、４～８員ヘテロシクリルを形成し；及びＲ^７は、任意選択的に置換されたＣ_１～Ｃ_６アルキルである。例えば、Ｂは、アデニン、グアニン、シトシン、ウラシル又はチミンであり；Ｒ^１は、ジメトキシトリチルであり；Ｒ^４、Ｒ^５及びＲ^６は、イソプロピルであり；及びＲ^７は、β－シアノエチルである。

例示的な実施形態は、以下の番号付けされた実施形態によって説明され得る。

実施形態１：３’－ＯＨ基を有する少なくとも１つのヌクレオシドを有するオリゴヌクレオチドを合成するための方法であって、（ｉ）ヌクレオシド又はオリゴヌクレオチド上の遊離ヒドロキシル基を、トリイソプロピルシリルエーテル（ＴＩＰＳ）保護３’－ヒドロキシル基を有するヌクレオシドホスホロアミダイトモノマーとカップリングさせて、亜リン酸トリエステル中間体を形成することと、（ｉｉ）前記亜リン酸トリエステル中間体を酸化又は硫化させて、保護中間体を形成することとを含む方法。

実施形態２：全ての合成ステップは、自動オリゴヌクレオチド合成機において実施される、実施形態１の方法。

実施形態３：オリゴヌクレオチドは、大規模に合成される、実施形態１又は２の方法。

実施形態４：前記酸化させることは、弱塩基の存在下におけるものである、実施形態１～３のいずれか１つの方法。

実施形態５：前記弱塩基は、ピリジン、ルチジン、ピコリン又はコリジンである、実施形態４の方法。

実施形態６：前記酸化させることは、Ｉ_２／Ｈ_２Ｏの存在下におけるものである、実施形態１～５のいずれか１つの方法。

実施形態７：前記硫化させることは、硫黄転移試薬の存在下におけるものである、実施形態１～６のいずれか１つの方法。

実施形態８：前記硫黄転移試薬は、３－（ジメチルアミノメチリデン）アミノ－３Ｈ－１，２，４－ジチアゾール－３－チオン（ＤＤＴＴ）又は３Ｈ－１，２－ベンゾジチオール－３－オン１，１－ジオキシドである、実施形態７の方法。

実施形態９：保護中間体を塩基で脱保護するステップをさらに含む、実施形態１～８のいずれか１つの方法。

実施形態１０：前記塩基は、水酸化アンモニウム、メチルアミン又は水酸化アンモニウム及びメチルアミンの混合物である、実施形態９の方法。

実施形態１１：前記塩基で処理することは、室温又は高温におけるものである、実施形態９又は１０の方法。

実施形態１２：前記塩基で処理することは、３０℃以上の温度におけるものである、実施形態９～１１のいずれか１つの方法。

実施形態１３：前記塩基で処理することは、少なくとも３０分間にわたるものである、実施形態９～１２のいずれか１つの方法。

実施形態１４：前記塩基で処理することは、少なくとも４時間にわたるものである、実施形態９～１３のいずれか１つの方法。

実施形態１５：ＴＩＰＳ保護ヒドロキシル基を遊離ヒドロキシル基に変換するのに有効な脱保護試薬により、塩基処理された中間体を処理することをさらに含む、実施形態９～１４のいずれか１つの方法。

実施形態１６：脱保護試薬は、フッ化物アニオンを含む、実施形態１５の方法。

実施形態１７：脱保護試薬は、ＨＦ．ピリジンである、実施形態１５又は１６の方法。

実施形態１８：前記脱保護試薬で処理することは、３０℃以上の温度におけるものである、実施形態１５～１７のいずれか１つの方法。

実施形態１９：オリゴヌクレオチドは、約６～約５０のヌクレオチドを含む、実施形態１～１８のいずれか１つの方法。

実施形態２０：オリゴヌクレオチドは、約１０～約３０のヌクレオチドを含む、実施形態１～１９のいずれか１つの方法。

実施形態２１：式（Ｉ）：

（式中、Ｂは、修飾又は非修飾核酸塩基であり；Ｒ^１は、ヒドロキシル保護基であり；Ｒ^２は、－Ｓｉ（Ｒ^４）_３であり；Ｒ^３は、Ｈ又は－Ｐ（ＮＲ^５Ｒ^６）ＯＲ^７であり；各Ｒ^４は、独立して、任意選択的に置換されたアルキル、アリール、アラルキル、アルカリル、シクロアルキル、アルケニル、シクロアルケニル、アルキニル又はシクロアルキニルであり；Ｒ^５及びＲ^６は、独立して、任意選択的に置換されたアルキル、アリール、アラルキル、アルカリル、シクロアルキル、アルケニル、シクロアルケニル、アルキニル若しくはシクロアルキニルであるか、又はＲ^５及びＲ^６は、結合されて、ヘテロシクリルを形成し；及びＲ^７は、任意選択的に置換されたアルキル、アリール、アラルキル、アルカリル、シクロアルキル、アルケニル、シクロアルケニル、アルキニル又はシクロアルキニルである）
の構造を有するヌクレオシドモノマー。

実施形態２２：ヒドロキシル保護基は、４，４’－ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）、モノメトキシトリチル（ＭＭＴ）、９－フルオレニルメチルカーボネート（Ｆｍｏｃ）、ｏ－ニトロフェニルカルボニル、ｐ－フェニルアゾフェニルカルボニル、フェニルカルボニル、ｐ－クロロフェニルカルボニル及び５’－（α－メチル－２－ニトロピペロニル）オキシカルボニル（ＭｅＮＰＯＣ）からなる群から選択される、実施形態２１のヌクレオシドモノマー。

実施形態２３：各Ｒ^４は、独立して、任意選択的に置換されたＣ_１～Ｃ_６アルキルである、実施形態２１又は２２のヌクレオシドモノマー。

実施形態２４：各Ｒ^４は、イソプロピルである、実施形態２１～２３のいずれか１つのヌクレオシドモノマー。

実施形態２５：Ｒ^５及びＲ^６は、独立して、任意選択的に置換されたＣ_１～Ｃ_６アルキルである、実施形態２１～２４のいずれか１つのヌクレオシドモノマー。

実施形態２６：Ｒ^５及びＲ^６は、イソプロピルである、実施形態２１～２５のいずれか１つのヌクレオシドモノマー。

実施形態２７：Ｒ^７は、任意選択的に置換されたＣ_１～Ｃ_６アルキルである、実施形態２１～２６のいずれか１つのヌクレオシドモノマー。

実施形態２８：Ｒ^７は、メチル又はβ－シアノエチルである、実施形態２１～２７のいずれか１つのヌクレオシドモノマー。

実施形態２９：Ｂは、アデニン、グアニン、シトシン、チミン又はウラシルであり；Ｒ^１は、モノメトキシトリチル又はジメトキシトリチルであり；Ｒ^４は、独立して、任意選択的に置換されたＣ_１～Ｃ_６アルキルであり；Ｒ^５及びＲ^６は、独立して、任意選択的に置換されたＣ_１～Ｃ_６アルキルであるか、又はＲ^５及びＲ^５は、結合されて、４～８員ヘテロシクリルを形成し；及びＲ^７は、任意選択的に置換されたＣ_１～Ｃ_６アルキルである、実施形態２１～２８のいずれか１つのヌクレオシドモノマー。

実施形態３０：Ｂは、アデニン、グアニン、シトシン又はウラシルであり；Ｒ^１は、ジメトキシトリチルであり；Ｒ^４、Ｒ^５及びＲ^６は、イソプロピルであり；及びＲ^７は、β－シアノエチルである、実施形態１～２９のいずれか１つのヌクレオシドモノマー。

いくつかの選択される定義
便宜上、本明細書、実施例及び特許請求の範囲においてここで使用される特定の用語は、ここにまとめられる。他に明記されない限り又は文脈から暗黙的でない限り、以下の用語及び語句は、以下で提供される意味を含む。他に明確に述べられない限り又は文脈から明らかでない限り、以下の用語及び語句は、その用語又は語句が、その関連する技術分野において得ている意味を除外しない。定義は、特定の実施形態の説明に役立つように提供されるものであり、本発明の範囲は、特許請求の範囲によってのみ限定されるため、特許請求される本発明を限定することを意図されない。さらに、他に文脈により要求されない限り、単数形の用語は、複数を含むものとし、複数形の用語は、単数を含むものとする。

他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術及び科学用語は、本発明が関連する技術分野の当業者に一般的に理解されるものと同じ意味を有する。任意の既知の方法、デバイス及び材料が本発明の実施又は試験において使用され得るが、これに関連する方法、デバイス及び材料が本明細書において記載される。

さらに、本発明の実施は、他に記載されない限り、当技術分野の技能の範囲内である分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学及び免疫学の従来の技術を使用することができる。このような技術は、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９）；“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．，１９８４）；“Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ”（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．，１９８７）；“Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９８７，ａｎｄ ｐｅｒｉｏｄｉｃ ｕｐｄａｔｅｓ）；“ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ”，（Ｍｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．，１９９４）；“Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ”（Ｐｅｒｂａｌ Ｂｅｒｎａｒｄ Ｖ．，１９８８）；“Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”（Ｂａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ．，２００１）などの文献において十分に説明されている。

値の範囲が提供される場合、文脈が他に明確に指示しない限り、その範囲の上限と下限との間にある下限の単位の１０分の１までの各介在値及びその規定範囲内の任意の他の規定値又は介在値が本発明の範囲内に含まれることが理解される。これらのより小さい範囲の上限及び下限は、独立して、規定範囲内の任意の具体的に除外される限界を条件として、そのより小さい範囲に含まれ得ると共に、本発明の範囲にも包含される。規定範囲が限界の一方又は両方を含む場合、それらの含まれる限界のいずれか又は両方を除外する範囲も本発明に含まれる。

本明細書において、特定の範囲は、「約」という用語が先行する数値と共に提示される。「約」という用語は、本明細書において、その用語が先行する正確な数及びその用語が先行する数に近い数又はほぼその数に対して文字通りの支援を提供するために使用される。ある数が、具体的に記載された数に近いか又はほぼその数であるかの決定において、近いか又は近似する記載されていない数は、それが提示される文脈において、具体的に記載された数の実質的な均等物を提供する数であり得る。

本明細書で使用される場合、「含んでいる」又は「含む」という用語は、本発明に必須である組成物、方法及びそのそれぞれの成分に関して使用されるが、必須であるかどうかに関わりなく、特定されていない要素の包含も受け入れる、

単数形の用語「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」及び「その」は、文脈が他に明確に指示しない限り、複数の指示対象も含む。同様に、「又は」という語は、文脈が他に明確に指示しない限り、「及び」を含むことが意図される。さらに、特許請求の範囲は、任意選択的な要素を除外するように起草され得ることが留意される。したがって、この記載は、請求項要素の記述に関連した「単に」、「のみ」などのような排他的な用語の使用のため又は「否定的な」限定の使用のための先行詞としての機能を果たすことが意図される。

本明細書で使用される場合、「オリゴヌクレオチド」という用語は、核酸分子（ＲＮＡ又はＤＮＡ）、例えば１００、２００、３００又は４００未満の長さのヌクレオチドを指す。本明細書で使用される場合、オリゴヌクレオチドは、ジヌクレオチド、トリヌクレオチド、テトラヌクレオチド、ペンタヌクレオチド、ヘキサヌクレオチド及びヘプタヌクレオチドも包含する。さらに、本明細書で使用される「ヌクレオチド、ヌクレオシド、オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオシド」という用語は、当業者に知られているように、天然に存在する種及び天然に存在しない又は修飾された種の両方を含むことが意図される。

「任意選択的に置換された」という用語は、特定の基若しくは部分が非置換であるか、又は「置換基」の定義において以下に記載されるか若しくは他に規定される置換基の群から独立して選択される１つ若しくは複数（通常、１、２、３、４、５又は６つの置換基）によって置換されていることを意味する。「置換基」という用語は、置換される基の任意の原子におけるその置換される基上の「置換された」基を指す。適切な置換基には、ハロゲン、ヒドロキシ、カルボキシ、オキソ、ニトロ、ハロアルキル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリル、アリール、ヘテロアリール、シクリル、ヘテロシクリル、アラルキル、アルコキシ、アリールオキシ、アミノ、アシルアミノ、アルキルカルバモイル、アリールカルバモイル、アミノアルキル、アルコキシカルボニル、カルボキシ、ヒドロキシアルキル、アルカンスルホニル、アレーンスルホニル、アルカンスルホンアミド、アレーンスルホンアミド、アラルキルスルホンアミド、アルキルカルボニル、アシルオキシ、シアノ又はウレイドが含まれるが、これらに限定されない。場合により、２つの置換基は、これらが結合する炭素と一緒に環を形成することができる。

本明細書において互換的に使用されるように、「本質的に」及び「実質的に」という用語は、少なくとも約６０％又は好ましくは少なくとも約７０％、若しくは少なくとも約８０％、若しくは少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％若しくは少なくとも約９９％又はそれを超えるもの或いは７０％～１００％の任意の整数の割合を意味する。いくつかの実施形態において、「本質的に」という用語は、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％若しくはそれを超えるもの又は９０％～１００％の任意の整数の割合を意味する。いくつかの実施形態において、「本質的に」という用語は、１００％を含むことができる。

本開示を読むことで当業者に明らかであるように、本明細書に記載及び説明される個々の態様のそれぞれは、別個の構成成分及び特徴を有し、これらは、本発明の範囲又は趣旨から逸脱することなく、他のいくつかの態様のいずれかの特徴から容易に分離するか又はそれらと組み合わせることができる。記載される方法は、いずれも記載される事象の順序又は論理的に可能である任意の他の順序で実行することができる。

本発明は、さらなる限定であると解釈されてはならない以下の実施例によってさらに説明される。本出願を通して引用される全ての参考文献、係属中の特許出願及び公開特許の内容は、参照によって本明細書に明確に援用される。

以下の実施例は、本発明のいくつかの実施形態及び態様を説明する。本発明の趣旨又は範囲を変更することなく、種々の修飾形態、付加形態、置換形態などが実施され得ると共に、このような修飾形態及び変更形態が、以下の特許請求の範囲において定義される本発明の範囲内に包含されることは、当業者に明らかであろう。以下の実施例は、決して本発明を限定しない。

実施例１：ＴＩＰＳ保護基を有するホスホロアミダイトの合成

化合物２：無水ピリジン（４５０ｍＬ）中の５’－ＯＤＭＴｒウリジン１（５０ｇ、９１．４８ｍｍｏｌ）の攪拌溶液にイミダゾール（２４．９１ｇ、３６５．９２ｍｍｏｌ）及びクロロ（トリイソプロピル）シラン（４７．０ｍＬ、２２０ｍｍｏｌ）を順次添加した。５０℃で２４時間攪拌した後、揮発性物質を減圧下で除去した。残渣を飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液（４００ｍＬ）及びＥｔＯＡｃ（５００ｍＬ）と混ぜ合わせ、５分間攪拌した。混合物を分液漏斗に移し、層を分離し、有機層を飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液及び塩水で洗浄した。有機層をＮａ_２ＳＯ_４上で乾燥させ、ろ過して、蒸発乾固させた。残渣をＩＳＣＯ自動カラムにより精製した。最小限のＤＣＭ中に溶解させ、溶離液としてヘキサン中０～３０％のＥｔＯＡｃを用いる１２０ｇのシリカゲルカラムに負荷して、化合物２（２６．１ｇ、４１％）を得た。
^１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，アセトニトリル－ｄ３）δ ７．７０（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），７．４５－７．３７（ｍ，２Ｈ），７．３５－７．１９（ｍ，８Ｈ），６．９３－６．８４（ｍ，４Ｈ），５．８２（ｄ，Ｊ＝３．９Ｈｚ，１Ｈ），５．３７（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），４．４２（ｔ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，１Ｈ），４．１７（ｔｄ，Ｊ＝５．３，３．９Ｈｚ，１Ｈ），３．７７（ｓ，６Ｈ），３．４９（ｄｄ，Ｊ＝１０．９，２．７Ｈｚ，１Ｈ），３．３１－３．２３（ｍ，２Ｈ），１．０６－０．９０（ｍ，２２Ｈ）．
ＬＲＭＳ（ＥＳＩ） Ｃ３９Ｈ５０Ｎ２Ｏ８Ｓｉに対する計算値［Ｍ＋Ｈ］^＋ｍ／ｚ＝７０３．３４、実測値７０３．４。

化合物３：ＤＩＰＥＡ（１９．３ｍＬ、１１１ｍｍｏｌ）、２－シアノエチル－Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルクロロホスホロアミダイト（２４．７ｍＬ、１１０．７ｍｍｏｌ）及びＮ－メチルイミダゾール（２．９ｍＬ、３６．９ｍｍｏｌ）を０℃において無水ＥｔＯＡｃ（６００ｍＬ）中の化合物２（２５．９３ｇ、３６．８９ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に順次添加した。冷浴を除去し、反応混合物を１時間攪拌した。ＭｅＣＮ／トルエン中のトリエタノールアミン（２．７Ｍ、５０ｍＬ）の溶液により反応をクエンチし、５分間攪拌した。混合物を酢酸エチルで希釈し、分液漏斗に移し、層を分離し、有機層を５％のＮａＣｌ溶液及び塩水で順次洗浄した。有機層をＮａ_２ＳＯ_４上で乾燥させ、蒸発乾固させた。トリエチルアミンで前処理したシリカゲル上に残渣を予め吸着させた。１％のＮＥｔ_３を含有するヘキサンによりカラムを平衡化した。溶離液としてヘキサン中０～４０％のＥｔＯＡｃを用いるＩＳＣＯ自動カラムにより残渣を精製して、化合物３（２６．５ｇ、７９％）を得た。
^１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤ_３ＣＮ）δ ８．７３（ｓ，１Ｈ），７．５９（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），７．４４－７．４１（ｍ，２Ｈ），７．３６－７．２８（ｍ，７Ｈ），６．８９－６．８５（ｍ，４Ｈ），６．０６（ｄ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，１Ｈ），５．５１（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），４．３２－４．２３（ｍ，２Ｈ），４．１１－４．０７（ｍ，１Ｈ），３．８４－３．６７（ｍ，１０Ｈ），３．６７－３．５４（ｍ，３Ｈ），３．４６（ｄｄ，Ｊ＝１０．９，３．７Ｈｚ，１Ｈ），３．２８（ｄｄ，Ｊ＝１１．０，４．２Ｈｚ，１Ｈ），２．５７（ｔ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，２Ｈ），１．１６－１．１１（ｍ，１１Ｈ），１．０４－０．９５（ｍ，２３Ｈ）．^３１Ｐ ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ，ＣＤ_３ＣＮ）δ １５０．８３，１５０．８０，１４９．６４，１４９．６１．
ＬＲＭＳ（ＥＳＩ） Ｃ４８Ｈ６７Ｎ４Ｏ９ＰＳｉに対する計算値［Ｍ＋Ｎａ］^＋ｍ／ｚ＝９０２．４４、実測値９２５．２。

化合物５：無水ピリジン（１５．０ｍＬ）中の化合物４（２．０ｇ、３．０ｍｍｏｌ、１ｅｑ．）の攪拌溶液にイミダゾール（１．６２ｇ、２３．７ｍｍｏｌ、８ｅｑ．）及びクロロ（トリイソプロピル）シラン（１．５２ｍＬ、７．１２ｍｏｌ、２．４ｅｑ．）を順次添加した。５０℃で２４時間攪拌した後、飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液（５０ｍＬ）及びＥｔ_２Ｏを添加し、得られた混合物を分液漏斗に移し、層を分離し、水層をＥｔ_２Ｏ（５０ｍＬ×２）で抽出した。合わせた有機層をＮａ_２ＳＯ_４上で乾燥させ、ろ過して、蒸発乾固させた。溶離液としてヘキサン中０～４０％のＥｔＯＡｃを用いるＩＳＣＯ自動カラムにより残渣を精製して、化合物５（０．７８ｍｇ、３１％）を得た。
^１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ １１．２２（ｓ，１Ｈ），８．６４（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，２Ｈ），８．０８－８．０２（ｍ，２Ｈ），７．６７－７．６１（ｍ，１Ｈ），７．５７－７．５２（ｍ，２Ｈ），７．３９－７．３２（ｍ，２Ｈ），７．２８－７．１６（ｍ，８Ｈ），６．８８－６．８０（ｍ，４Ｈ），６．０６（ｄ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，１Ｈ），５．５０（ｄ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，１Ｈ），４．９６（ｑ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，１Ｈ），４．６５－４．５９（ｍ，１Ｈ），４．１５（ｑ，Ｊ＝４．６Ｈｚ，１Ｈ），３．７２（ｓ，６Ｈ），３．４１（ｄｄ，Ｊ＝１０．５，４．６Ｈｚ，１Ｈ），３．２０（ｄｄ，Ｊ＝１０．５，５．１Ｈｚ，１Ｈ），１．１４－０．９３（ｍ，２４Ｈ）．^１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ １６６．１５，１５８．５９，１５２．５１，１５１．８５，１５１．０１，１４５．２６，１４４．５１，１３５．９１，１３５．８８，１３３．８７，１３２．９２，１３０．１６，１２８．９８，１２８．９４，１２８．２２，１２８．０９，１２７．１５，１２６．６２，１１３．６０，１１３．５８，８８．７８，８６．２２，８４．６１，７２．８８，７２．６５，６３．８３，５５．５１，４０．０３，１８．３４，１８．１１，１８．０１，１２．２７．
ＬＲＭＳ（ＥＳＩ） Ｃ４７Ｈ５６Ｎ５Ｏ７Ｓｉに対する計算値［Ｍ＋Ｈ］^＋ｍ／ｚ＝８３０．３９、実測値８３０．４。

化合物６：無水ＤＣＭ（１０Ｖ）中の化合物５（２０１．５ｇ、１．０ｅｑ．）の攪拌溶液にピリジン（６．０ｅｑ）、２－シアノエチルＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトライソプロピルホスホロジアミダイト（３．０ｅｑ）及びＤＣＩ（２．０ｅｑ）を添加した。混合物を２５℃で４時間攪拌した。ワークアップ後、有機層をＮａ_２ＳＯ_４上で乾燥させ、ろ過して、蒸発乾固させた。ＤＣＭ／ｈｅｐｔにより反応粗生成物を沈殿させて、化合物６（１３０ｇ、５２％）を得た。
^３１Ｐ ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ １５０．８２，１５０．６６．
ＬＲＭＳ（ＥＳＩ） Ｃ５６Ｈ７３Ｎ７Ｏ８ＰＳｉに対する計算値［Ｍ＋Ｈ］^＋ｍ／ｚ＝１０３１．４９、実測値１０３１．５。

化合物８：無水ピリジン（１５０．０ｍＬ）中の化合物７（２０．０ｇ、３０．５ｍｍｏｌ）の攪拌溶液にイミダゾール（１６．６１ｇ、０．２４ｍｏｌ）及びクロロ（トリイソプロピル）シラン（２６．１ｍＬ、０．１２ｍｏｌ）を順次添加した。５０℃で２４時間攪拌した後、揮発性物質を減圧下で除去した。残渣を飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液（１００ｍＬ）及びＥｔＯＡｃ（５００ｍＬ）と混ぜ合わせ、１０分間攪拌した。混合物を分液漏斗に移し、層を分離し、有機層を飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液（５０ｍＬ）及び塩水（５０ｍＬ）で洗浄した。有機層をＮａ_２ＳＯ_４上で乾燥させ、ろ過して、蒸発乾固させた。溶離液としてヘキサン中０～７０％のＥｔＯＡｃを用いるＩＳＣＯ自動カラムにより残渣を精製して、化合物８（９．８５ｇ、４０％）を得た。１％のＮＥｔ_３を含有するヘキサンによりカラムを平衡化した。
^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ １１．９６（ｓ，１Ｈ），７．８８－７．８１（ｍ，１Ｈ），７．５４－７．４８（ｍ，１Ｈ），７．４２－７．３６（ｍ，１Ｈ），７．３０－７．１８（ｍ，１Ｈ），６．８５－６．７６（ｍ，１Ｈ），５．７０（ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，１Ｈ），４．９５－４．８８（ｍ，１Ｈ），４．６２－４．５７（ｍ，１Ｈ），４．５４－４．５０（ｍ，１Ｈ），４．１７－４．１３（ｍ，１Ｈ），３．７７（ｄ，Ｊ＝３．５Ｈｚ，９Ｈ），３．５９－３．５２（ｍ，１Ｈ），３．２７－３．１６（ｍ，１Ｈ），３．１４－３．０５（ｍ，１Ｈ），１．７２－１．６２（ｍ，１Ｈ），１．３３－１．２０（ｍ，１Ｈ），１．０１－０．８８（ｍ，１Ｈ），０．７２（ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，４Ｈ），０．６０－０．４５（ｍ，３Ｈ）．
ＬＲＭＳ（ＥＳＩ） Ｃ４４Ｈ５７Ｎ５Ｏ８Ｓｉに対する計算値［Ｍ＋Ｈ］^＋ｍ／ｚ＝８１１．４０、実測値８１２．２。

化合物９：無水ＤＣＭ（１．４Ｌ）中の化合物８（１４０ｇ、１．０ｅｑ．）の攪拌溶液に２－シアノエチルＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトライソプロピルホスホロジアミダイト（５．０ｅｑ）及びＤＣＩ（３．０ｅｑ）を添加した。混合物を２５℃で１２時間攪拌した。反応を１０％のＮａＨＣＯ_３（１０×１０００ｍＬ）及び塩水（２×１０００ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥させてから、３５℃で濃縮して、粗生成物（３８７ｇ）を淡黄色の油として得た。化合物９（８１ｇ、４６％）が白色固体として得られるまで、粗生成物（３８６ｇ）をＤＣＭ／ＭＴＢＥ中で数回（８回）沈殿させた
^３１Ｐ ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ １５０．７２，１４９．３３．
ＬＲＭＳ（ＥＳＩ） Ｃ５３Ｈ７５Ｎ７Ｏ９ＰＳｉに対する計算値［Ｍ＋Ｈ］^＋ｍ／ｚ＝１０１２．５、実測値１０１２．４。

化合物１１：無水ＣＨ_２Ｃｌ_２（２．８ｍＬ）中の化合物１０（０．５ｇ、０．８５ｍｍｏｌ、１ｅｑ．）の攪拌溶液に無水ジイソプロピルアミン（０．７２ｍＬ、５．１ｍｍｏｌ、６ｅｑ．）及びクロロ（トリイソプロピル）シラン（０．５５ｍＬ、２．５ｍｍｏｌ、３ｅｑ．）を順次添加した。室温で４日間攪拌した後、メタノール（３ｍＬ）を添加し、得られた溶液を１５分間攪拌した。混合物をＤＣＭ（１０ｍＬ）で希釈し、層を分離した。有機層を水（１０ｍＬ×２）で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥させ、ろ過して、蒸発乾固させた。ヘキサン中０～６０％のＥｔＯＡｃを溶離液として使用するＩＳＣＯ自動カラム（１％のＮＥｔ_３を含有するヘキサンでカラムを平衡化した）により残渣を精製して、化合物１１（２８７ｍｇ、４５％）を得た。
^１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ １０．８９（ｓ，１Ｈ），８．３６（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．４０－７．１８（ｍ，１０Ｈ），７．０４（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），６．８９（ｄｑ，Ｊ＝８．３，３．２Ｈｚ，４Ｈ），５．８４（ｄ，Ｊ＝２．５Ｈｚ，１Ｈ），５．４７（ｄ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，１Ｈ），４．２８（ｄｄ，Ｊ＝７．１，４．８Ｈｚ，１Ｈ），４．１２－４．０８（ｍ，１Ｈ），４．０７－４．０４（ｍ，１Ｈ），３．７５（ｄ，Ｊ＝０．８Ｈｚ，６Ｈ），３．５４（ｄｄ，Ｊ＝１１．０，２．９Ｈｚ，１Ｈ），３．２４（ｄｄ，Ｊ＝１１．０，３．８Ｈｚ，１Ｈ），２．１０（ｓ，３Ｈ），１．０５－０．８２（ｍ，２４Ｈ）．^１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ １７０．９７，１７０．３０，１６２．３５，１５８．２４，１５８．２３，１５４．４７，１４４．６９，１４４．１９，１３４．９８，１３４．９３，１２９．８１，１２９．７８，１２７．８２，１２６．９１，１１３．１７，１１３．１３，９５．３４，９１．０３，８６．２０，８２．３４，７４．１５，７０．２９，６１．９８，５９．７３，５５．０１，３９．５２，２４．３４，２０．７４，１７．７４，１４．０７，１１．６３．
ＬＲＭＳ（ＥＳＩ） Ｃ４１Ｈ５３Ｎ３Ｏ８ＳｉＮａに対する計算値［Ｍ＋Ｎａ］^＋ｍ／ｚ＝７６６．３５、実測値７６６．３。

化合物１２：無水ＤＣＭ（８Ｖ）中の化合物１１（１．０ｅｑ．）の攪拌溶液にピリジン（６．５ｅｑ）、２－シアノエチルＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトライソプロピルホスホロジアミダイト（１．３ｅｑ）及びＤＣＩ（１．２ｅｑ）を添加した。２５℃で２０時間攪拌した後、混合物を飽和ＮａＨＣＯ_３及び塩水で洗浄した。ワークアップ後、有機層を濃縮して粗化合物１２が得られ、これを、１％のピリジンを含有するｎ－ヘプタン中０～５０％のＥｔＯＡｃを溶離液として使用するカラムにより精製して、化合物１２（収率：７６．６％）を得た。
^３１Ｐ ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ １５１．９６，１４８．５６．
ＬＲＭＳ（ＥＳＩ） Ｃ５０Ｈ７１Ｎ５Ｏ９ＰＳｉに対する計算値［Ｍ＋Ｈ］^＋ｍ／ｚ＝９４４．４、実測値９４４．１。

実施例２：３’－ＴＯＭ及びＰＯＭ保護基を有するウリジンの合成

化合物１３：ＴＨＦ（５０ｍＬ）中に化合物２（７ｇ、１３．１ｍｍｏｌ）及びＮ－エチル－Ｎ－イソプロピル－プロパン－２－アミン（８．０１ｍＬ、４６．０１ｍｍｏｌ）を含有する溶液をジブチル（ジクロロ）スタンナン（４．５８ｇ、１４．４６ｍｍｏｌ、３．３６ｍＬ）で処理し、室温で１時間攪拌した。反応混合物を６６℃に加熱した後、クロロメトキシ（トリイソプロピル）シラン（４．１３ｇ、１５．７７ｍｍｏｌ、４．３１ｍＬ）を添加し、６６℃で４０分間攪拌した。反応混合物を室温まで冷却し、揮発性物質を減圧下で除去した。粗残渣をＤＣＭと飽和ＮａＨＣＯ_３溶液との間で分配させ、層を分離し、有機層をＮａＨＣＯ_３水溶液、塩水で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥させた。有機層をＮａ_２ＳＯ_４上で乾燥させ、ろ過して、蒸発乾固させた。ヘキサン中０～４０％のＥｔＯＡｃを溶離液として使用するＩＳＣＯ自動カラムにより残渣を精製して、化合物１３（３．４８ｇ、３７％）を得た。
^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ ７．７７（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），７．３９－７．２２（ｍ，１Ｈ），６．８７－６．８０（ｍ，１Ｈ），５．９６（ｄ，Ｊ＝４．４Ｈｚ，１Ｈ），５．３９（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），５．０６（ｄ，Ｊ＝４．９Ｈｚ，１Ｈ），４．９０（ｄ，Ｊ＝４．９Ｈｚ，１Ｈ），４．３５－４．２２（ｍ，１Ｈ），３．８０（ｓ，６Ｈ），３．５９－３．５１（ｍ，１Ｈ），３．４３－３．３６（ｍ，１Ｈ），２．０５（ｓ，２Ｈ），１．６０（ｓ，２Ｈ），１．１３－１．０１（ｍ，２Ｈ）．
ＬＲＭＳ（ＥＳＩ） Ｃ４０Ｈ５２Ｎ２Ｏ９Ｓｉに対する計算値［Ｍ＋Ｎａ］^＋ｍ／ｚ＝７３２．３４、実測値７５５．４。

化合物１４：ＤＩＰＥＡ（１．７ｍＬ、９．８ｍｍｏｌ）、２－シアノエチル－Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルクロロホスホロアミダイト（２．２ｍＬ、９．８１ｍｍｏｌ）及びＮ－メチルイミダゾール（０．３９ｍＬ、４．９ｍｍｏｌ）を０℃において無水ＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）中の化合物１３（３．５ｇ、４．９ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に順次添加した。冷浴を除去し、反応混合物を１時間攪拌した。ＭｅＣＮ／トルエン中のトリエタノールアミン（２．７Ｍ、１１ｍＬ）の溶液により反応をクエンチし、５分間攪拌した。混合物を酢酸エチルで希釈し、分液漏斗に移し、層を分離し、有機層を５％のＮａＣｌ溶液及び塩水で順次洗浄した。有機層をＮａ_２ＳＯ_４上で乾燥させ、蒸発乾固させた。トリエチルアミンで前処理したシリカゲル上に残渣を予め吸着させた。１％のＮＥｔ_３を含有するヘキサンによりカラムを平衡化した。ヘキサン中０～４０％のＥｔＯＡｃを溶離液として使用するＩＳＣＯ自動カラムにより残渣を精製して、化合物１４（３．２６ｇ、７１％）を得た。
^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ_３ＣＮ）δ ７．６９（ｄｄ，Ｊ＝９．７，８．２Ｈｚ，１Ｈ），７．４６（ｄｄ，Ｊ＝７．２，１．１Ｈｚ，２Ｈ），７．３６－７．２１（ｍ，７Ｈ），６．９０（ｄｄ，Ｊ＝７．６，１．３Ｈｚ，４Ｈ），６．００－５．９６（ｍ，１Ｈ），５．４３－５．３５（ｍ，１Ｈ），５．１２－４．９６（ｍ，２Ｈ），４．５６－４．４８（ｍ，１Ｈ），４．４２－４．３６（ｍ，１Ｈ），４．３３－４．２５（ｍ，１Ｈ），３．９１－３．５８（ｍ，１１Ｈ），３．４７－３．３３（ｍ，２Ｈ），２．６８－２．６１（ｍ，２Ｈ），１．２５－０．９４（ｍ，３６Ｈ）．^３１Ｐ ＮＭＲ（１６２ＭＨｚ，ＣＤ_３ＣＮ）δ １５０．６１，１５０．５５．
ＬＲＭＳ（ＥＳＩ） Ｃ４９Ｈ６９Ｎ４Ｏ１０ＰＳｉに対する計算値［Ｍ＋Ｈ］^＋ｍ／ｚ＝９３２．４５、実測値９５５．５（Ｍ＋Ｎａ）。

化合物１５：空のマイクロ波管に化合物２（２ｇ、３．７６ｍｍｏｌ）を添加した後、ジブチル（オキソ）スズ（１．２２ｇ、４．８８ｍｍｏｌ、７６９．２３ｕＬ）及びテトラブチルアンモニウムブロミド（１．５７ｇ、４．８８ｍｍｏｌ）を添加した。管をゴム隔膜で閉鎖し、系をＡｒで５分間フラッシュした。１，２－ＤＣＥ（１０ｍＬ）を添加し、得られた懸濁液を１分間攪拌した後、ピバル酸クロロメチル（１．４１ｇ、９．３９ｍｍｏｌ、１．３５ｍＬ）を添加した。隔膜を急いでマイクロ波管キャップと交換し、マイクロ波中、３００Ｗで２．５時間、管を７５℃まで加熱した。全部で６ｇの化合物２を得るために、同じ量の試薬により反応をさらに２回実行した。３つの合わせた粗反応混合物を混ぜ合わせ、減圧下で蒸発乾固させた。トリエチルアミンで前処理したシリカ上にサンプルを予め吸着させた。ヘキサン中０～４０％のＥｔＯＡｃを溶離液として使用するＩＳＣＯ自動カラム（ＮＥｔ_３でシリカを前処理した）により残渣を精製して、化合物１５（１．６８ｇ、２３％）を得た。
^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ_３ＯＤ）δ ７．８７（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），７．４８－７．３６（ｍ，３Ｈ），７．３５－７．２２（ｍ，４Ｈ），６．９４－６．８４（ｍ，２Ｈ），５．８９（ｄ，Ｊ＝４．７Ｈｚ，１Ｈ），５．４１（ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，１Ｈ），５．３７－５．２７（ｍ，１Ｈ），４．５０－４．３８（ｍ，２Ｈ），４．２３－４．１７（ｍ，１Ｈ），３．５４－３．３９（ｍ，１Ｈ），３．３５－３．２８（ｍ，１Ｈ），１．２０－１．０８（ｍ，４Ｈ）．
ＬＲＭＳ（ＥＳＩ） Ｃ３６Ｈ４０Ｎ２Ｏ１０に対する計算値［Ｍ＋Ｈ］^＋ｍ／ｚ＝６６０．２７、実測値６６１．７。

化合物１６：ＤＩＰＥＡ（１．１ｍＬ、６．２ｍｍｏｌ）、２－シアノエチル－Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルクロロホスホロアミダイト（１．４ｍＬ、６．２ｍｍｏｌ）及びＮ－メチルイミダゾール（０．１９ｍＬ、２．４ｍｍｏｌ）を０℃において無水ＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）中の化合物１５（１．６ｇ、２．５ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に順次添加した。冷浴を除去し、反応混合物を１時間攪拌した。ＭｅＣＮ／トルエン中のトリエタノールアミン（２．７Ｍ、６ｍＬ）の溶液により反応をクエンチし、５分間攪拌した。混合物を酢酸エチルで希釈し、分液漏斗に移し、層を分離し、有機層を５％のＮａＣｌ溶液及び塩水で順次洗浄した。有機層をＮａ_２ＳＯ_４上で乾燥させ、蒸発乾固させた。トリエチルアミンで前処理したシリカゲル上に残渣を予め吸着させた。１％のＮＥｔ_３を含有するヘキサンによりカラムを平衡化した。ヘキサン中０～６０％のＥｔＯＡｃを溶離液として使用するＩＳＣＯ自動カラムにより残渣を精製して、化合物１６（１．５１７ｇ、７４％）を得た。
^１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤ_３ＣＮ）δ ７．６５－７．５９（ｍ，１Ｈ），７．４６－７．４１（ｍ，１Ｈ），７．３５－７．２１（ｍ，６Ｈ），６．９３－６．８３（ｍ，３Ｈ），５．９８－５．９１（ｍ，１Ｈ），５．４６－５．３７（ｍ，１Ｈ），５．３４（ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，１Ｈ），５．２０（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，１Ｈ），４．６１－４．５０（ｍ，１Ｈ），４．４７－４．３８（ｍ，１Ｈ），４．２１－４．１４（ｍ，１Ｈ），３．６７－３．５７（ｍ，３Ｈ），３．４０－３．３１（ｍ，２Ｈ），２．６９－２．５９（ｍ，１Ｈ），１．１９－１．１６（ｍ，６Ｈ），１．１２（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，１１Ｈ）．^３１Ｐ ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ，ＣＤ_３ＣＮ）δ １５０．８４，１５０．４７．

実施例３：３’－ＯＴＩＰＳ保護ヌクレオシド及びホスホロアミダイトの選択的合成

Ｖｏｒｂｒｕｅｇｇｅｎ条件下で糖１７のアノマー位にウラシルを導入することにより合成を開始した。得られた化合物１８を炭酸カリウムで処理して酢酸基を切断し、ヌクレオシド１９を生じさせ、これをＤＭＴＣｌにより５’－Ｏ位で保護して、ヌクレオシド２を得た。ホスホロアミダイト４の形成は、標準条件下で２－シアノエチル－Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルクロロホスホロアミダイトを用いて達成した。

ヌクレオシド１８から出発して、トリアゾール化／アンモノリシスの２段階シーケンスにおいてウラシル核酸塩基をシトシンに転換して、ヌクレオシド２０を得た。ＤＭＴＣｌによる第１級ヒドロキシル基の保護と、核酸塩基における安息香酸基の選択的導入とにより、ヌクレオシド２１が得られた。ホスホロアミダイト２２の形成は、標準条件下で２－シアノエチル－Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルクロロホスホロアミダイトを用いて達成した。

糖１７のヌクレオシド２３への転換は、Ｖｏｒｂｒｕｅｇｇｅｎ条件下でＮ－ベンゾイルアデニンを用いた後、塩基性条件下で酢酸基を切断して達成した。ヌクレオシド２３の第１級ヒドロキシルをＤＭＴエーテルとして保護してヌクレオシド５が得られ、これを後に標準条件下で対応するホスホロアミダイト６に転換した。

糖１７を出発材料として使用し、グアニン部分を導入するために２段階シーケンスを用いて、ヌクレオシド２４が得られた。イソ酪酸無水物による核酸塩基の保護により、化合物２５を得た。塩基性条件下で酢酸基を切断し、第１級ヒドロキシル基をＤＭＴエーテルとして保護し、ヌクレオシド８を得た。ホスホロアミダイト９の形成は、標準条件下で２－シアノエチル－Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルクロロホスホロアミダイトを用いて達成した。

実施例４．３’－Ｏ保護ヌクレオシドによるｓｉＲＮＡ合成
オリゴヌクレオチド合成：以下の表に示されるパラメータを用いて、代表的なオリゴヌクレオチドの合成を実施した。この研究の目的は、本発明者らの現在の切断及び脱保護方法（塩基水溶液への長期の曝露を含む）と適合し、ＲＮＡの加水分解／切断をもたらし得る保護基の早期脱落などの副反応を最小限にすることになる、最適なＲＮＡ保護基を決定することであった。合成の条件は、表１及び２に示され、これらの研究のために合成されたオリゴヌクレオチドの配列は、表３に要約される。

切断及び脱保護：この脱保護は、合成の量を評価するために、より具体的にはＲＮＡ保護基の早期の脱保護から生じる不純物を同定するために使用される。合成の規模に応じて２つの異なる手順を使用した（小規模のための手順１及び大規模のための手順２）。両方の手順について、ＮＨ_４ＯＨ、ＮＨ_４ＯＨ／ＥｔＯＨ、ＭｅＮＨ_２又はアンモニア／メチルアミンの混合物（ＡＭＡ）を使用することができる。

手順１：
１．合成後、カラムを含有するプレートを９６－ディープウェルプレート上の切断チャックに置いた。
２．濃メチルアミン水溶液又は濃水酸化アンモニウム溶液（１５０μＬ）を各カラムに添加し、室温で３０分間インキュベートした。その後、真空を用いて溶液をカラムから完全に抜き取った。
３．ステップ＃２をもう一度繰り返し、プレートを密封し、規定の時間ＲＴで振とうさせた。
４．粗生成物のサンプルをＲＯＤＩ水で１００×に希釈し、ＬＣＭＳを用いて分析した。

手順２：
１．合成後の少量の乾燥支持体（約３０ｍｇ）を２ｍＬのガラススクリューキャップバイアルに入れた。
２．水酸化アンモニウム溶液（１ｍＬ）を添加し、バイアルを１５時間３５℃に保持した（注：この段階で粗生成物を室温に冷却し、次にサンプルをアリコートに分け、ＲＯＤＩ水で３０×に希釈してから、初期の粗分析のためにＨＰＬＣで分析した）。
３．脱シリル化ステップのために、粗溶液をデカントし、０．５ｍＬのＤＭＳＯで樹脂を３回洗浄した。バイアルをボルテックスしてから、樹脂の全てを沈降させるために２分間放置した。ＤＭＳＯ溶液をデカントし、４ｍＬのシンチレーションバイアル内に最初のろ液と混ぜ合わせ、次にこれを、氷浴を用いて０℃に冷却した。
４．ピリジン＊ＨＦ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、０．７５ｍＬ）を混合物に添加し（反応は懸濁した）、バイアルを１時間５０℃に保持した。
５．反応を室温に冷却し、水（２．５ｍＬ）でクエンチした。バイアルをボルテックスして、固体を全て溶解させた。
６．サンプルをアリコートに分け、ＨＰＬＣ分析のためにＲＯＤＩ水により３０×に希釈した。

ＨＰＬＣによる粗オリゴヌクレオチド混合物の分析：表４に示される条件を使用するＩＰＲＰ－ＬＣＭＳを用いて粗分析を行った。

結果：異なるＲＮＡ保護基を有する７つの異なる２３ｍｅｒオリゴヌクレオチドを合成し（表３）、種々の切断及び脱保護条件にさらした。適用可能であれば、ＨＦ処理前に初期ＨＰＬＣ分析を実行して、塩基処理間の種々の保護基の安定性を決定した。簡単にするために、全てのＨＰＬＣ及びＭＳの積分は、４つの対象の種、シリル又は他の基で保護された３’又は２’ヒドロキシル基を有する完全に脱保護されたオリゴ（ＦＬＰ－ＯＸ － Ｘ＝ＴＢＳ、ＴＯＭ、ＴＩＰＳ又はピバロイルオキシメチル）、脱保護されたオリゴ（ＦＬＰ－ＯＨ）、切断３’－断片及び切断５’－断片に関してのみ行った。表５に示されるように、シリル保護基（ＴＢＳ及びＴＩＰＳ）及びＴＯＭ保護基は、長期の塩基処理において、程度は異なるが不安定である。ＴＩＰＳ保護ＲＮＡを含有する２３ｍｅｒは、全体として最良の結果をもたらし、わずか３％の脱保護ＦＬＰ及び１％の切断加水分解生成物を有した。保護基（ＴＩＰＳ）は、過剰のＨＦピリジンを用いて容易に除去することができ（図７）、ＦＬＰ－ＯＨが生成される。加えて、ＦＬＰ－ＯＨの生成及びＦＬＰ－ＯＨの塩基性条件への長期処理は、表５及び図８～１０に示されるように、様々なレベルの鎖切断をもたらし得る。

特定される全ての特許、特許出願及び刊行物は、例えば、本発明と共に使用され得るこのような刊行物に記載される方法を説明及び開示するために、参照によって本明細書に明確に援用される。これらの刊行物は、本出願の出願日よりも前のその開示についてのみ提供される。これに関して、先行発明という理由で又は任意の他の理由のために本発明者らがこのような開示に先行する権利がないことの承認として何ら解釈されてはならない。これらの文献の日付に関する記述又は内容に関する表示は、全て本出願人が利用できる情報に基づくものであり、これらの文献の日付又は内容の正確さに関する何らかの承認を構成するものではない。

上記の詳細な説明の観点から、実施形態に対するこれら及び他の変化形態がなされ得る。一般に、以下の特許請求の範囲において、使用される用語は、特許請求の範囲を、本明細書及び特許請求の範囲に開示される特定の実施形態に限定すると解釈されてはならないが、このような特許請求の範囲が与える均等物の範囲全体と共に、全ての可能な実施形態を含むと解釈されるべきである。したがって、特許請求の範囲は、本開示により限定されない。

Claims (30)

1. ３’－ＯＨ基を有する少なくとも１つのヌクレオシドを有するオリゴヌクレオチドを合成するための方法であって、
   （ｉ）ヌクレオシド又はオリゴヌクレオチド上の遊離ヒドロキシル基を、トリイソプロピルシリルエーテル（ＴＩＰＳ）保護３’－ヒドロキシル基を有するヌクレオシドホスホロアミダイトモノマーとカップリングさせて、亜リン酸トリエステル中間体を形成することと、
   （ｉｉ）前記亜リン酸トリエステル中間体を酸化又は硫化させて、保護中間体を形成することと
   を含む方法。
2. 全ての合成ステップは、自動オリゴヌクレオチド合成機において実施される、請求項１に記載の方法。
3. オリゴヌクレオチドは、大規模に合成される、請求項１に記載の方法。
4. 前記酸化させることは、弱塩基の存在下におけるものである、請求項１に記載の方法。
5. 前記弱塩基は、ピリジン、ルチジン、ピコリン又はコリジンである、請求項４に記載の方法。
6. 前記酸化させることは、Ｉ_２／Ｈ_２Ｏの存在下におけるものである、請求項１に記載の方法。
7. 前記硫化させることは、硫黄転移試薬の存在下におけるものである、請求項１に記載の方法。
8. 前記硫黄転移試薬は、３－（ジメチルアミノメチリデン）アミノ－３Ｈ－１，２，４－ジチアゾール－３－チオン（ＤＤＴＴ）又は３Ｈ－１，２－ベンゾジチオール－３－オン１，１－ジオキシドである、請求項７に記載の方法。
9. 前記保護中間体を塩基で脱保護するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
10. 前記塩基は、水酸化アンモニウム、メチルアミン又は水酸化アンモニウム及びメチルアミンの混合物である、請求項９に記載の方法。
11. 前記塩基で前記処理することは、室温又は高温におけるものである、請求項９に記載の方法。
12. 前記塩基で前記処理することは、３０℃以上の温度におけるものである、請求項１１に記載の方法。
13. 前記塩基で前記処理することは、少なくとも３０分間にわたるものである、請求項９に記載の方法。
14. 前記塩基で前記処理することは、少なくとも４時間にわたるものである、請求項１３に記載の方法。
15. 前記ＴＩＰＳ保護ヒドロキシル基を遊離ヒドロキシル基に変換するのに有効な脱保護試薬により、前記塩基処理された中間体を処理することをさらに含む、請求項９に記載の方法。
16. 前記脱保護試薬は、フッ化物アニオンを含む、請求項１５に記載の方法。
17. 前記脱保護試薬は、ＨＦ．ピリジンである、請求項１５に記載の方法。
18. 前記脱保護試薬で前記処理することは、３０℃以上の温度におけるものである、請求項１５に記載の方法。
19. 前記オリゴヌクレオチドは、約６～約５０のヌクレオチドを含む、請求項１に記載の方法。
20. 前記オリゴヌクレオチドは、約１０～約３０のヌクレオチドを含む、請求項１０に記載の方法。
21. 式（Ｉ）：
    

    

    （式中、
    Ｂは、修飾又は非修飾核酸塩基であり；
    Ｒ^１は、ヒドロキシル保護基であり；
    Ｒ^２は、－Ｓｉ（Ｒ^４）_３であり；
    Ｒ^３は、Ｈ又は－Ｐ（ＮＲ^５Ｒ^６）ＯＲ^７であり；
    各Ｒ^４は、独立して、任意選択的に置換されたアルキル、アリール、アラルキル、アルカリル、シクロアルキル、アルケニル、シクロアルケニル、アルキニル又はシクロアルキニルであり；
    Ｒ^５及びＲ^６は、独立して、任意選択的に置換されたアルキル、アリール、アラルキル、アルカリル、シクロアルキル、アルケニル、シクロアルケニル、アルキニル若しくはシクロアルキニルであるか、又はＲ^５及びＲ^６は、結合されて、ヘテロシクリルを形成し；及び
    Ｒ^７は、任意選択的に置換されたアルキル、アリール、アラルキル、アルカリル、シクロアルキル、アルケニル、シクロアルケニル、アルキニル又はシクロアルキニルである）
    の構造を有するヌクレオシドモノマー。
22. 前記ヒドロキシル保護基は、４，４’－ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）、モノメトキシトリチル（ＭＭＴ）、９－フルオレニルメチルカーボネート（Ｆｍｏｃ）、ｏ－ニトロフェニルカルボニル、ｐ－フェニルアゾフェニルカルボニル、フェニルカルボニル、ｐ－クロロフェニルカルボニル及び５’－（α－メチル－２－ニトロピペロニル）オキシカルボニル（ＭｅＮＰＯＣ）からなる群から選択される、請求項２１に記載のヌクレオシドモノマー。
23. 各Ｒ^４は、独立して、任意選択的に置換されたＣ_１～Ｃ_６アルキルである、請求項２１に記載のヌクレオシドモノマー。
24. 各Ｒ^４は、イソプロピルである、請求項２１に記載のヌクレオシドモノマー。
25. Ｒ^５及びＲ^６は、独立して、任意選択的に置換されたＣ_１～Ｃ_６アルキルである、請求項２１に記載のヌクレオシドモノマー。
26. Ｒ^５及びＲ^６は、イソプロピルである、請求項２１に記載のヌクレオシドモノマー。
27. Ｒ^７は、任意選択的に置換されたＣ_１～Ｃ_６アルキルである、請求項６に記載のヌクレオシドモノマー。
28. Ｒ^７は、メチル又はβ－シアノエチルである、請求項２１に記載のヌクレオシドモノマー。
29. Ｂは、アデニン、グアニン、シトシン、チミン又はウラシルであり；Ｒ^１は、モノメトキシトリチル又はジメトキシトリチルであり；Ｒ^４は、独立して、任意選択的に置換されたＣ_１～Ｃ_６アルキルであり；Ｒ^５及びＲ^６は、独立して、任意選択的に置換されたＣ_１～Ｃ_６アルキルであるか、又はＲ^５及びＲ^５は、結合されて、４～８員ヘテロシクリルを形成し；及びＲ^７は、任意選択的に置換されたＣ_１～Ｃ_６アルキルである、請求項６に記載のヌクレオシドモノマー。
30. Ｂは、アデニン、グアニン、シトシン又はウラシルであり；Ｒ^１は、ジメトキシトリチルであり；Ｒ^４、Ｒ^５及びＲ^６は、イソプロピルであり；及びＲ^７は、β－シアノエチルである、請求項２９に記載のヌクレオシドモノマー。

Images