CN100484949C

CN100484949C - 用于rna寡核苷酸合成中的核苷亚磷酰胺及其合成方法

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Publication number: CN100484949C
Application number: CNB2005100358493A
Authority: CN
Inventors: 张必良; 崔智勇
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2005-07-18
Filing date: 2005-07-18
Publication date: 2009-05-06
Anticipated expiration: 2025-07-18
Also published as: CN1900103A

Abstract

本发明公开了一种用于RNA寡核苷酸合成中的核苷亚磷酰胺(I)及其合成方法。本发明用-[2，2-二甲基-2-(邻硝基苯基)乙酰基氧甲基]醚(DNPA)作为核苷2’-羟基的保护基团。该保护基团和常规的5’-羟基的保护基团具有兼容性。另外，可在非常温和的条件下去除DNPA基团，从而能完全保证RNA的完整性，使其特别适用于RNA寡核苷酸的合成。本发明提供了一条新的RNA寡核苷酸的合成路线，而且在RNA分子合成方面，可用于任何的天然核苷、非天然核苷、标记核苷或其衍生物。

Description

用于RNA寡核苷酸合成中的核苷亚磷酰胺及其合成方法

技术领域

本发明涉及一种寡核苷酸的化学合成方法，更具体地讲，本发明涉及一种用于RNA寡核苷酸合成中的核苷亚磷酰胺(或称RNA寡核苷酸衍生物)及其合成方法。

背景技术

关于RNA干扰(RNAi)的研究以空前的速度发展，其应用范围也越来越广泛，例如，已经在功能基因组、药物靶点确认和生物功能等方面开展了大量研究，这导致了急需低成本、高效率的siRNA合成以及化学方法改良的siRNA分子衍生物。目前，大多数合成RNA的成功策略是建立在之前的DNA合成方法的基础上，除了2’-羟基必须被保护，其它化学过程与DNA合成过程很类似。即绝大多数策略是使用叔丁基二甲基硅醚(TBDMS)保护核糖的2’-羟基。这种保护方法使得每个循环的耦合时间加长，通常需要10分钟，因为临近的TBDMS基团的空间体积阻碍了与3’-亚磷酰胺的反应。

虽然DNA合成在无数的研究实验室里是非常普遍的工作，但RNA的合成并不那么成功。尽管很多研究小组用过这种TBDMS保护方法来合成寡聚RNA，但这种方法在实际应用中遇到了很多困难。直到现在，想得到高质量的核苷亚磷酰胺单体都非常困难。一个难题在于2’-O-TBDMS基团可以容易地迁移到3’-OH位置上形成异构物；另一个难题是，核苷亚磷酰胺的耦合效率总不是很高。通常来说，整个合成的每个步骤的耦合效率应都大于98％的效率，这样才有实际应用价值。最后，最终产品所含有的杂质是由于效率较低的耦合及副产品引起的。关于这些杂质产生的原因有很多的争论，但最后的结果是RNA的合成不是通常可以达到的。

改良的甲硅烷基保护方法是把三异丙基硅氧甲基(TOM)醚作为2’-羟基的保护基团。TOM保护基团避免了异构物的形成和提高了耦合效率，而且可用除去TBDMS的同样方法去除TOM保护基团。TOM保护基团比2’-O-TBDMS基团的位阻更少，所以TOM保护基团可达到更高的耦合效率。但是2’-TOM核苷亚磷酰胺单体的合成成本很高。

针对应用标准的DNA合成方法进行RNA合成的困难，人们开发了多种其它的2’-羟基的保护基团。Searge Beaucage等对各种不同的方法进行了总结。这些方法大多集中在简单地用其他类型的保护基团替代2’-O-TBDMS，在不同条件下除去保护基团的同时也消除其移向3’-羟基。例如，对光不稳定的基团，如邻位硝基苄基团，曾被用作2’-羟基的保护基团，但没有被其他研究者广泛的应用。这种方法的困难在于核酸能强烈地吸收UV，对光不稳定的基团很难被大量的移走而没有副产物。另一种方法则利用酸不稳定的乙缩醛基团，该方法是Reese发现并在25后再被其他人利用。利用这种保护基团的合成路线的难点在于，要找到一个在DMTr(4，4’-二甲氧基三苯甲基)基团酸性条件去保护时、在每个核苷加成步骤都稳定的乙缩醛。同时，这个乙缩醛在最后的酸的去保护步骤的条件下必须是不稳定的，不能降解天然的RNA产品。最近，发现并报道了一种新的乙缩醛(ACE)即bis(2-acetoxyethoxy)methyl原酸酯基团来保护2’-羟基基团，以及用来硅烷基保护5’-羟基基团，可符合这些标准。尽管这些方法看起来是有前途的，但在大规格合成时仍有一些障碍，并且成本很高。

虽然乙缩醛方法存在一些缺陷，但看来是保护2’-羟基的方法中非常具有吸引力的基团，原因如下：乙缩醛是一种成本低、很易引入2’-位置且产量又高的方法。除了在5’-O-DMTr酸的去保护步骤中，它们看起来在所有寡核苷酸合成的条件下都很稳定。最后，这类化合物涵盖了范围很广的不稳定性(labilities)。因此，乙缩醛能在寡核苷酸合成中非常稳定并且在最后的去保护反应中又很容易除去。最后的去保护是完全在温和的酸性溶液的条件下，而不使用有机溶剂，这是其另一个吸引人的特征。RNA很易溶于水，但通常较少溶于有机溶剂，且在有机溶剂中RNA的结构可能会复杂的折叠起来。

使用不稳定的酸性乙缩醛的障碍是5’-O-DMTr基团，它也一起被酸除去了。在过去的很多年里，进一步的研究发现RNA在pH2时降解的比较慢，因而必须要寻找一种特别的不稳定的酸性2’-保护基团。因此，在最后酸性的去保护步骤，必须保持在最小的酸浓度和去保护时间。结果，RNA合成中2’-端的乙缩醛与5’-端的可选基团结合可在非酸性的条件下被除去。例如，FMOC基团和levulinoyl基团应用。然而，他们并没有将2’-TBDMS方法应用于实践。

现在DNA和RNA寡核苷酸合成的方法学都是依据用DMTr基团和甲硅烷基基团来保护5’-羟基。通过多年的研究，化学耦合和以前大部分的保护基团已被准确化或被替代，然而在5’-羟基端DMTr仍被利用。人们试图寻找一个适合的替代物，但没有成功。或许是在合成寡核苷酸时5’-羟基保护基团的特性的原因。DMTr有很多保护5’-羟基所必须的主要特性：(1)在亚磷酰胺合成、储存时的稳定性，(2)在温和的条件下迅速并定量的除去，(3)除去条件不会降解聚合体，(4)在寡核苷酸合成条件下的稳定性，(5)在单体的合成过程中，对主要的5’-羟基相对于次要的2’和3’-羟基的区域选择性，(6)去保护时的可见特性帮助监控寡核苷酸的合成，(7)成本可控制。条件1、2、3、4对高效合成寡核苷酸是必要的。条件5、6、7不是合成所必须的，但可使化学合成用于实践。DMTr基团对这些必要条件非常适合。DMTr在寡核苷酸合成过程中变的非常重要。其它保护的位点是在A，C，G环外的胺基，磷酸盐骨架和2’-羟基。保护的位点在寡核苷酸合成条件下必须是稳定的，特别是在每个碱基加入的过程中5’-O-DMTr基团酸性去保护时。这个限制在DNA合成时不存在，但可影响RNA的合成。

由于在选择2’-羟基保护时位点的限制，在RNA合成中DMTr基团的效果并不理想。在合成RNA时，附加的2’-羟基保护基团必须很容易引入，稳定的贯穿于寡核苷酸合成过程中，最后完成RNA合成，必须高质高量的除去最后2’-的保护基团。天然的未被保护的RNA很容易被化学方法及酶降解。在化学方面，RNA在高或低的pH下不稳定，但在中性PH时就稳定的多。因而，最后去除2’-羟基必须在温和的条件下进行。这些RNA2’-羟基保护的约束和附加的5’-O-DMTr的约束限制了2’-基团的选择。结果导致RNA合成虽是可能的，但并不象DNA合成那样成功。

缩醛类通常是2’-保护基团选择得最多的。缩醛类主要的缺点是与酸性不稳定的DMTr的兼容性较差。

发明内容

本发明的目的是提供一种可以满足以上每种需求的新的保护基团，由这种保护基团可以得到杂质含量很低的核苷亚磷酰胺单体，这种单体可以用于RNA寡核苷酸的合成。

一方面，本发明提供了一种利用-[2，2-二甲基-2-(邻硝基苯基)乙酰基氧甲基]醚基团保护化学合成过程或化学反应中羟基的用途。

更优选地，上述的-[2，2-二甲基-2-(邻硝基苯基)乙酰基氧甲基]醚基团是用于保护核苷或核苷衍生物上的2’-羟基，核苷包括腺苷、鸟苷、胞苷或尿苷，核苷的衍生物包括腺苷衍生物、鸟苷衍生物、胞苷衍生物或尿苷衍生物。本发明的保护基团和常规的5’-羟基的保护基团如4，4’-DMTr、4，4’，4”-TMTr等具有兼容性。

另一方面，本发明提供了一种具有化学通式(I)所示结构的核苷亚磷酰胺，该核苷亚磷酰胺可用于RNA寡核苷酸的合成：

式中，R¹是N保护的腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶；

R²是4，4’-二甲氧基三苯甲基；

R³是氨基磷酸酯或者磷酸基团；

R⁴是氢或甲基；

R⁵是2，2-二甲基-2-(邻硝基苯基)乙酰基。

在上述化学通式(I)中，2’-羟基上的保护基团-CH(R⁴)-OR⁵优选为(2，2-二甲基-2-(邻硝基苯基)乙酰基)氧甲基。

优选地，上述的核苷亚磷酰胺具有化学通式(II)所示的结构：

式中，B^P表示N保护的腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶；优选地，

B^P表示N保护的腺嘌呤或胞嘧啶；

DNPA表示[2，2-二甲基-2-(邻硝基苯基)乙酰基]氧甲基。

更优选地，上述的核苷亚磷酰胺是具有化学通式(III)所示结构的腺苷亚磷酰胺：

再一方面，本发明提供了一种用于RNA寡核苷酸合成中的核苷亚磷酰胺的合成方法，该方法的特征在于，其采用(2，2-二甲基-2-(邻硝基苯基)乙酰基)氧甲基来保护核苷或核苷衍生物上2’-羟基的步骤。其中，一种采用2’-O-DNPA保护的核苷亚磷酰胺单体的合成路线如下所示：

(合成路线I：2’-O-DNPA保护的核苷亚磷酰胺单体的合成路线)

即上述的方法可依次包括如下步骤：

(1)对核苷上的碱基进行保护，所述的碱基为腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶；

(2)对核苷上的2’-羟基用(2，2-二甲基-2-(邻硝基苯基)乙酰基)氧甲基进行保护；

(3)对2’-羟基已被(2，2-二甲基-2-(邻硝基苯基)乙酰基)氧甲基保护的、核苷上的5’-羟基进行保护；

(4)对步骤(3)中所得到的中间产物的3’-羟基进行磷酸化反应，得到所需的核苷亚磷酰胺；

其中，在步骤(2)之前，优选先将核苷上的3’-羟基和5’-羟基进行保护，然后在在步骤(2)之后、步骤(3)之前，脱除掉3’-羟基和5’-羟基上的保护基团。

以腺苷为例，来进一步详细描述本发明的合成核苷亚磷酰胺单体的方法：

腺苷首先在吡啶中跟三甲硅烷氯反应，然后跟苯甲酰氯反应，最后在同一反应器中加入氢氧化铵去掉三甲硅生成6-N-苯甲酰-腺苷，产率达到94％。6-N-苯甲酰-腺苷与1，3-二氯-1，1，3，3-四异丙基-1，3-二硅氧烷(TIPDSCl₂)在吡啶中反应生成6-N-苯甲酰-3’，5’-O-(四异丙基二硅氧烷-1，3-二醚)腺苷，产率为90％。在DMF中先经NaH处理，然后跟DNPA-Cl反应，生成6-N-苯甲酰-2’-DNPA-3’，5’-O-(四异丙基-1，3-二硅氧)腺苷。在2’位置引入DNPA基团后，用四丁基氟化铵处理，去除3’，5’-四异丙基二硅氧烷-1，3-二醚基团，生成6-N-苯甲酰基-2’-O-[2，2-二甲基-2-(邻硝基苯基)乙酰基氧甲基醚-腺苷，产率为90％的。先与4，4’-二甲氧基散苯甲基氯选择性地保护5’-羟基，在标准条件下，再与O-2-乙氰基-N，N-二异丙基胺亚磷酰氯反应生成6-N-苯甲酰-2’-O-DNPA-5’-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)腺苷-3’-O-(2-乙氰基-N，N-二异丙基亚磷酰胺，产率为65-86％。

其他的核苷亚磷酰胺均可以通过上述的同样方法或类似方法来合成。

利用上述得到核苷亚磷酰胺单体，可以合成RNA寡核苷酸链，例如20-25个核苷酸的寡核苷酸。例如，利用上面所述的DNPA保护基团，制备出2’-O-DNPA-5’-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)核苷-3’-O-(2-乙氰基-N，N-二异丙基亚磷酰胺，作为合成RNA亚磷酰胺单体，按如下所示的路线合成寡核苷酸：

(合成路线II：寡核苷酸的固相合成路线)

利用本发明的方法，可以合成天然或非天然RNA寡核苷酸。本发明中所描述的2’-O-[2，2-二甲基-2-(邻硝基苯基)乙酰基氧甲基]醚核苷(G、A、C和U)亚磷酰胺的合成过程，并且可以用于任何天然核苷、非天然核苷、标记核苷和信号基团或在RNA寡核苷酸分子中的其他衍生物的合成。

在生产核苷亚磷酰胺单体时，采用本发明的(2，2-二甲基-2-(邻硝基苯基)乙酰基)氧甲基(DNPA)作为稳定的核苷2’-位羟基的保护基团，具有之前其它所有保护基所没有的优点，可以得到高纯度的核苷亚磷酰胺单体。此外，去除DNPA基团的条件非常温和，不影响寡核苷酸产品和质量。

下面，结合具体实施方式来详细地描述本发明。但这些具体的实施例并非是对本发明保护范围的限制；本领域的普通技术人员可以理解，在本发明的基础上，无需任何创造性劳动，即可对本发明进行适当地改进或改变，因而所有这些改进或改变仍在本发明的保护范围内。

具体实施方式

实验中所采用的条件为通常合成的一般条件。其中，溶剂必须保证干燥，二氯甲烷、乙晴、嘧啶由氢化钙蒸馏制备；反应在氩气流保护下进行；TLC：滤层硅胶薄层60 F254 from EM，Flash色谱(FC)：硅胶

，EM网眼180-240。¹H NMR光谱Varian VNMR 400分光计中进行。用上述方法蒸得的CDCl₃或DMSO-d₆作为溶剂，数据用百万分之几作为记录。所有溶剂、有机化学药品、无机化学药品买自ACROS或Aldrich。

实施例1 腺苷亚磷酰胺的合成

合成6-N-苯甲酰基腺苷(化合物1)：将腺苷(10.68g，39.96mmol)溶于200mL吡啶形成悬浮液，加入三甲基氯硅烷(38.1mL，300mmol)于其中，在室温下、氩气流保护下充分混合反应45min，然后加入苯甲酰基氯(23.1mL，200mmol)充分混合反应4h，混合物在冰浴中冷却后加40mL水，20min后慢慢加入29％氢氧化铵的水溶液(96mL，713.3mmol)，在室温下混合45min，离心抽真空至干粉，加320mL水溶解。溶液用乙酸乙酯(100mL)冲洗一次即刻形成结晶。过滤后依次用30mL EtOAc、40mL冰水、40mL丙酮(两次)冲洗得到白色固体6-N-苯甲酰基腺苷(化合物1)(14.17g，95.6％)：R_f＝0.24(13.3％甲醇混合氯仿)；¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ 3.55-3.70(m，2H)，3.96-3.99(m，1H)，4.17-4.19(m，1H)，4.63-4.67(m，1H)，5.14(t，J＝5.50Hz，1H)，5.26(d，J＝4.77Hz，1H)，5.58(d，J＝5.87Hz，1H)，6.04(d，J＝5.51Hz，1H)，7.53-7.64(m，3H)，8.03-8.04(m，2H)，8.72(s，1H)，8.75(s，1H)，11.22(br s，1H)；¹³C NMR(100MHz，DMSO-d₆)δ 62.00，71.05，74.33，86.40，88.24，126.58，129.18，133.17，133.99，143.86，151.09，152.33，152.91，166.31.

合成6-N-苯甲酰-3’，5’-O-(四异丙基二硅氧烷-1，3-二醚)腺苷(化合物6)：在0℃下，将化合物1即6-N-苯甲酰基腺苷(14.45mmol)溶于200mL无水吡啶形成悬浮液，再慢慢加入1，3-二氯-1，1，3，3-四异丙基-1，3-二硅氧烷(5.5mL，17.34mmol)。在室温下、氩气流保护下充分混合反应6h，然后在0℃下加入4mL水结束反应。除去溶剂后，残留物中加入600mL CH₂Cl₂溶解，然后加入100mL水和90mL饱和NaCl冲洗。有机层可通过anh干燥.Na₂SO₄和溶剂在低压下除去。残留物通过flash柱层析(SiO₂)纯化得到白色固体化合物2即6-N-苯甲酰-3’，5’-O-(四异丙基二硅氧烷-1，3-二醚)腺苷(94.0％)：R_f＝0.57(9.1％甲醇混合氯仿)。产品通过¹H NMR(400MHz，CDCl₃)，¹³CNMR(100MHz，CDCl₃)和ESI-MS得到证实。

合成6-N-苯甲酰-2’-O-DNPA-3’，5’-O-(四异丙基二硅氧烷-1，3-二醚)腺苷(化合物3)：将化合物2即6-N-苯甲酰-3’，5’-O-(四异丙基二硅氧烷-1，3-二醚)腺苷(21.87mmol)通过油泵抽干燥5h，然后溶于250mLDMF.在0℃，NaH(64.5mmol)加入以上溶液中，搅拌5h，再用注射器慢慢加入DNPA-Cl(64.5mmol)。在0℃下、氩气流保护下充分混合反应3h，然后在80℃加热2h，在低温低压下除去溶剂，残渣溶于800mL CHCl₃，用饱和NaHCO₃(100mL)和水(100mL)冲洗。水层被CHCl₃萃取，结合的有机层通过Na₂SO₄干燥，溶剂通过低压除去。残渣通过flash柱层析(SiO₂)纯化得到白色固体6-N-苯甲酰-2’-O-DNPA-3’，5’-O-(四异丙基二硅氧烷-1，3-二醚)腺苷(化合物3)(97.0％)：R_f＝0.67(75％EtOAc in hexane)；产品通过¹H NMR(400MHz，CDCl₃)，¹³CNMR(100MHz，CDCl₃)和ESI-MS得到证实。合成6-N-苯甲酰-2’-O-DNPA-腺苷(化合物4)：在0℃、氩气流保护下，将化合物3即6-N-苯甲酰-2’-O-DNPA-3’，5’-O-(四异丙基二硅氧烷-1，3-二醚)腺苷(5.24mmol)溶于THF(200mL)，再加入四丁基氟化铵(5.3mL，5.24mmol)，充分混合反应6h，加入5％NH₄HCO₃(6mL)终止反应。溶剂除去后，残渣加入CH₂Cl₂和吡啶(600mL，v/v＝3/1)的混合液溶解，用50mL饱和NaHCO₃清洗(2次)。结合的有机层通过Na₂SO₄干燥，溶剂通过低压除去。残渣通过flash柱层析(SiO₂)纯化得到白色固体6-N-苯甲酰-2’-O-DNPA-腺苷(90％)产品通过：¹HNMR(400MHz，CDCl₃)，¹³C NMR(100MHz，DMSO-d₆)和ESI-MS得到证实。

合成6-N-苯甲酰-2’-O-DNPA-5’-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)腺苷(化合物5).将化合物4的溶液(1.13mmol)与4，4’-二甲氧基三苯甲基氯(0.763g，2.25mmol)(用真空泵干燥过夜)于吡啶(40mL)，加入二异丙基乙基胺(0.98mL，5.63mmol).这些反应混合物在氩气保护下室温搅拌12小时。加入乙醇(2mL)后，除去溶剂。残余物溶解于CHCl₃(300mL)，用饱和的NaHCO₃(30mL)溶液和饱和的NaCl(30mL)溶液洗涤.有机层通过无水Na₂SO₄干燥，且溶剂在低压下除去。残余物用flash柱层析(SiO₂)纯化，得到化合物5(90.1％)的淡黄色固体：R_f＝0.36(4.8％甲醇混合氯仿).产品用¹H NMR(400MHz，CDCl₃)，¹³C-NMR(100MHz，CDCl₃)和ESI-MS鉴定。

合成6-N-苯甲酰-2’-O-DNPA-5’-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)腺苷-3’-O-(2-乙氰基-N，N-二异丙基亚磷酰胺(化合物6)：化合物5(1.11mmol)用油泵干燥过夜，在冰浴冷却下溶于无水CH₂Cl₂(25mL)。二异丙基乙胺(0.794mL，4.56mmol)和2-乙氰基-N，N-二异丙基胺亚磷酰氯在氩气流下加入以上溶液。过20分钟后，至于室温下混合反应4.5h，加入250mL EtOAc稀释反应混合物，有机层用饱和NaHCO₃(25mL)和饱和NaCl(25mL)洗涤。有机层用Na₂SO₄干燥，溶剂在低压下除去。残渣用柱层析(SiO₂)纯化得到化合物6的黄色固体(75.5％)：R_f＝0.59，0.70(4.8％ EtOAc in chloroform)。产品用¹H NMR(400MHz，CDCl₃)，¹³C-NMR(100MHz，CDCl₃)和ESI-MS鉴定。

实施例2 胞苷亚磷酰胺的合成

合成4-N-苯甲酰胞苷(化合物7)：胞苷(9.72g，39.96mmol)加到200mL嘧啶形成悬浮液，然后将三甲基氯硅烷(38.1mL，300mmol)加入其中。在室温下、氩气流保护下充分混合反应1h，然后在室温下加入苯甲酰氯(23.0mL，200mmol)混合反应4h，混合物在冰浴中冷却后加40mL水，20min后加29％氢氧化铵溶液(60mL，445.8mmol)，在室温下混合25min，离心抽真空至干粉，加400mL水溶解。再加入150mLEtOAc后便会出现结晶。过滤后依次用30mL乙酰乙酯、30mL冰水、30mL丙酮(两次)冲洗得到白色固体的4-N-苯甲酰胞苷(化合物7)(13.1g，94.4％)。R_f＝0.55(20％甲醇-乙酰乙酯)；¹H NMR(DMSO-d₆，400MHz) δ 3.57-3.77(m，2H)，3.89-4.01(m，3H)，5.06(d，J＝5.47Hz，1H)，5.18(t，J＝5.08Hz，1H)，5.52(d，J＝5.09Hz，1H)，5.79(d，J＝2.74Hz，1H)，7.31(m，1H)，7.48-7.63(m，3H)，7.97-7.99(m，2H)，8.47(d，J＝7.42Hz，1H)，11.16(br s，1H)；¹³C NMR(DMSO-d₆，100MHz)δ 60.57，69.32，75.23，84.90，90.88，96.80，129.14，133.42，133.86，145.94，155.22，163.70，168.03。

合成4-N-苯甲酰-3’，5’-O-(四异丙基二硅氧烷-1，3-二醚)胞苷(化合物8)：在0℃下将4-N-苯甲酰胞苷(化合物7)(5.02g，14.45mmol)加到200mL无水吡啶中形成悬浮液，再慢慢加入1，3-二氯-1，1，3，3-四异丙基-1，3-二硅氧烷(5.5mL，17.34mmol)。在室温下、氩气流保护下充分混合反应6h，然后在0℃下加入4mL水结束反应。除去溶剂后，残留物中加入600mL CH₂Cl₂溶解，然后加入100mL水和90mL饱和NaCl冲洗。有机层Na₂SO₄干燥后和在低压下除去溶剂。残留物通过柱色谱(SiO₂)纯化得到白色固体4-N-苯甲酰-3’，5’-O-(四异丙基二硅氧烷-1，3-二醚)胞苷(化合物8)(8g，94.0％)，R_f＝0.57(9:1＝甲醇：氯仿)；¹H NMR(400MHz，CDCl₃) δ 0.94-1.11(m，28H)，2.88(br s，1H)，4.01-4.05(dd，J＝13.44，2.69Hz，1H)4.20-4.35(m，4H)，5.86(s，1H)，7.50-7.63(m，4H)，7.87-7.89(d，J＝6.59Hz，2H)，8.22(d，J＝6.60Hz，1H)，8.67(br s，1H)；¹³C NMR(100MHz，CDCl₃)δ 12.70，13.13，13.15，13.60，17.05，17.12，17.21，17.52，17.63，17.68，60.23，68.82，75.46，82.26，91.80，96.24，127.70，129.34，133.49，144.92，162.56；ESI-MS计算为M589.2640，检测为(M+H)590。

其余步骤与实施例1中的相应步骤相同，最后制得6-N-苯甲酰-2’-O-DNPA-5’-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)胞苷-3’-O-(2-乙氰基-N，N-二异丙基亚磷酰胺。

实施例3 鸟苷亚磷酰胺的合成

按与实施例1中相应的方法制得6-N-苯甲酰-2’-O-DNPA-5’-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)鸟苷-3’-O-(2-乙氰基-N，N-二异丙基亚磷酰胺。

实施例4 尿苷亚磷酰胺的合成

按与实施例1中相应的方法制得6-N-苯甲酰-2’-O-DNPA-5’-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)尿苷-3’-O-(2-乙氰基-N，N-二异丙基亚磷酰胺。

实施例5 寡核苷酸的合成

分别利用上面实施例1-4制备的2’-O-DNPA-5’-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)腺苷-3’-O-(2-乙氰基-N，N-二异丙基亚磷酰胺、2’-O-DNPA-5’-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)胞苷-3’-O-(2-乙氰基-N，N-二异丙基亚磷酰胺、2’-O-DNPA-5’-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)鸟苷-3’-O-(2-乙氰基-N，N-二异丙基亚磷酰胺、2’-O-DNPA-5’-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)尿苷-3’-O-(2-乙氰基-N，N-二异丙基亚磷酰胺为RNA亚磷酰胺单体，用Applied Biosystems DNA/RNA合成仪(Model394)自动化合成RNA寡核苷酸。合成好的RNA寡核苷酸，在氢氧化铵中反应24h能完全去碱基上等保护基团；用1.0M的SnCl₂DMF溶液，在50℃温度下5h除去DNPA保护基团，之后通过寡核苷酸纯化去盐。

Claims

1、一种具有化学通式(I)所示结构的核苷亚磷酰胺：

式中，R¹是N保护的腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶；

R²是4，4’-二甲氧基三苯甲基；

R³是氨基磷酸酯或者磷酸基团；

R⁴是氢或甲基；

R⁵是2，2-二甲基-2-(邻硝基苯基)乙酰基。

2、如权利要求1所述的核苷亚磷酰胺，其特征在于，化学通式(I)中2’-羟基上的保护基团-CH(R⁴)-OR⁵为(2，2-二甲基-2-(邻硝基苯基)乙酰基)氧甲基。

3、如权利要求2所述的核苷亚磷酰胺，其特征在于，所述的核苷亚磷酰胺具有化学通式(II)所示的结构：

式中，B^P表示N保护的腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶；

DNPA表示(2，2-二甲基-2-(邻硝基苯基)乙酰基)氧甲基。

4、如权利要求3所述的核苷亚磷酰胺，其特征在于，所述的B^P表示N保护的腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶。

5、如权利要求4所述的核苷亚磷酰胺，其特征在于，所述的核苷亚磷酰胺是具有化学通式(III)所示结构的腺苷亚磷酰胺：

6、如权利要求4所述的核苷亚磷酰胺，其特征在于，所述的B^P表示N保护的胞嘧啶。

7、一种用于RNA寡核苷酸合成中的如权利要求1所述的核苷亚磷酰胺的合成方法，其特征在于，该方法包括采用(2，2-二甲基-2-(邻硝基苯基)乙酰基)氧甲基来保护核苷上2’-羟基的步骤。

8、如权利要求7所述的方法，其特征在于，该方法依次包括如下步骤：

(4)对步骤(3)中所得到的中间产物的3’-羟基进行磷酸化反应，得到所需的核苷亚磷酰胺。

9、如权利要求8所述的方法，其特征在于，在步骤(2)之前，先将核苷上的3’-羟基和5’-羟基进行保护，然后步骤(2)之后、步骤(3)之前，脱除掉3’-羟基和5’-羟基上的保护基团。