JPS6360993A - リン酸エステル結合の形成方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （座業上の利用分野） この発明はリン酸エステル結合の形成方法に関し、特に
リン酸エステル結合の形成反応において新規な縮合剤全
使用することを特徴とする。この方法は、オリゴデオキ
シヌクレオチド又はポリデオキシヌクレオチドの化学合
成における鎖延長反応において特に有用である。

（従来の技術） オリゴヌクレオチド、？リヌクレオチド等核酸関連物質
の化学合成法としてはリン酸ソエステル法、リン酸トリ
エステル法、ホスファイト法等が知られておシ、いずれ
の方法においても縮合反応を促進するために縮合剤が使
用される。

例えばリン酸トリエステル法においては、主としてアレ
ンスルホニル誘導体が使用されており、副反応が少ない
点、反応時間が短い点等からメシチレンスルホニルニト
ロトリアゾｌｊ　）’　（ＭＳＮＴ）が最も優れたもの
として多用されている。しかしながらＭＳＮＴを使用す
る場合でも、縮合反応のために通常４０分間又はそれよ
シ長時間を要し、この縮合反応がポリヌクレオチド合成
における律速要因となっている。

従って、−層短時間で縮合反応を完結することができる
強力な縮合剤の開発が望まれている。

（発明が解決しようとする問題点） 従って、この発明は新規な強力な縮合剤を使用すること
によって、極めて短時間でリン酸エステル結合の形成を
行うことができる方法を提供しようとするものである。

（問題点を解決するための手段） 本発明者等は、上記の目的を達成すべく種々の縮合剤を
検討した結果、ビス（２，４，６−ト！Ｊハロフェニル
オキシ）トリクロロホスホランがリン酸エステル結合の
形成における極めて効果的な縮合剤として機能するとい
う驚くべき事実を見出し、この発明を完成した。

従って、前記の目的は、次の反応式： ％式％（） （式中、Ｒ１はオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチ
ドの化学合成においてデオキシリボースの５位のヒドロ
キシル基の保護のために常用される保護基、保藤されて
いるモノデオキシヌクレオチド、又は保護されているオ
リゴデオキシヌクレオチドであり；Ｒ２はオリゴヌクレ
オチド又はポリヌクレオチドの化学合成においてリン酸
部分の保護のために常用される保護基でありＳＲ３はデ
オキシリボース部分の３′位のヒドロキシル基の保護の
ための常用の保護基、固体支持体に結合しているリンカ
−、モノ−、オリが−もしくはポリープオキシリボヌク
レオチド、又は場合によってはリンカ−を介して固体支
持体に連結されている七ノー、オリゴ−もしくはポリー
プオキシリボヌクレオチドであり；そしてＢ１及びＢ２
は同一であるか又は異っており、そして場合によっては
保護されている核酸構成塩基を表わす） で表わされるリン酸エステル結合形成方法により達成さ
れる。

（具体的な説明） 本発明の方法は、常用のリン酸エステル形成方法、例え
ばオリゴデオキシヌクレオチド、ポリデオキシヌクレオ
チド等の核戯関連物質の化学合成法において新規な縮合
剤を使用することを特徴とし、この縮合剤はビス（２，
４，６−）リハロフェニルオキシ）トリクロロホスホラ
ンであり、具体例としてビス（２，４，６−トリクロロ
フエニルオキシ）トリクロロホスホラン（ＣＴＣＰ）、
及びビス（２，４゜６−ドリプロモフエニルオキシ）ト
リクロロホスホラフ　（ＢＴＣＰ）を挙げることができ
る。これらの化合物は次の式： ％式％） で表わされる。これらの化合物は既知物質であるが、リ
ン酸エステル結合の形成のための縮合剤として有用であ
ることは従来知られていない。

本発明の方法は一般に、リン酸エステル結合を形成する
ための反応に広く適用することができるが、トリエステ
ル法によるオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドの
合成において特に有用である。

トリエステル法においては、前記の反応式により示され
るように、糖成分の５′位のヒドロキシル基及びリン酸
成分の酸基が適切に保護されており、さらに塩基部分中
の官能基が場合によっては保護されているヌクレオチド
（りと、糖成分の３′位のヒドロキシル基が保護されて
おりそして塩基の官能基が場合によっては保護されてい
るヌクレオチド（ＩＩ）とを縮合せしめる。

式（１）のヌクレオチドの保護基Ｒ１はオリゴヌクレオ
チド又はポリヌクレオチドの化学合成において糖成分、
例えばデオキシリボ−ス部分の５′位のヒドロキシル基
の保護のために常用されている保護基であって、Ｒ１が
このようないかなる保護基でちってもこの発明の方法を
適用することができる。好ましい保護基としてはＰａ１
）’−ジメトキシトリチル基を挙げることができるが、
その他に各種のシリル基、各種のアシル基、各種のアル
キル基等を使用することができる。Ｒ４が保護すれたモ
ノヌクレオチド９又はオリゴヌクレオチドである場合、
式（１）の反応体は保護されたオリゴヌクレオチド全意
味し、この場合、複数個のヌクレオチドを延長単位とし
てヌクレオチド鎖の延長を行うことができる。

保護基Ｒ２はオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド
の化学合成においてリン酸成分の保護のために常用され
ている保護基であって、Ｒ２がいかなる保霞基であって
もこの発明の方法を適用することができる。好ましい保
護基Ｒ２としてはアリールチオ基、例えばフェニルチオ
基を挙げることができ、でらにｐ−メトキシフェニルチ
オ基が挙げられる。その他の保護基としてアリールオキ
シ基、例えば０−クロロフェニルオキシ基及びｐ−クロ
ロフェニルオキシ基、槁々のアルキルオキシ基、例えば
シアンエチルオキシ基を挙げることができる。さらに、
アルキルチオ基、例えばエチルチオ基が挙げられる。

式（１）で示されるヌクレオチドの反応に関与するリン
酸基は通常塩の形で存在し、対応する陽イオンとして例
えばアンモニウムイオン、例えばトリエチルアンモニウ
ムイオンを挙げることができる。この場合、式（１）の
ヌクレオチドは例えば次の式二 Ｒ２ で表わされる。

式（ＩＩ）で表わされる反応体はＲ３の種類によシ極め
て多様である。例えば、式（Ｉｆ）の反応体がモノヌク
レオチドである場合、Ｒ３は該ヌクレオチドの糖成分の
３′位のヒドロキシル基の保護基であり、例えばベンゾ
イル基である。本発明のリン酸エステル形成反応がオリ
ゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドの合成における鎖
延長反応として行われる場合であって、この反応が液相
合成法として行われる場合、Ｒ３はオリゴヌクレオチド
又はポリヌクレオチドである。前記の反応が固相合成法
として行われる場合、Ｒ５は固相支持体に連結されてい
るモノヌクレオチド、オリゴヌクレオチド又はポリヌク
レオチドである。これらはその一端において直接固体支
持体に連結されている場合があり、また、適当なリンカ
−を介して固体支持体に連結されている場合もある。こ
れらすべての場合に本発明の方法を適用することが可能
である。

固体支持体の種類、これとヌクレオチドとの連結方法、
リンカ−の種類、連結方法等は当業者によシよく知られ
ておシ、本発明においてはこれらの常法を用いることが
できる。

Ｂ、及びＢ２は、同一でも異っていてもよく、場合によ
っては保護されている核酸構成塩基である。

これらの塩基として、シトシン、アデニン、グアニン、
チミン、ウラシル等が挙げられる。嘔らに、核酸中に微
量に存在する他の塩基類及び人工合成塩基を用いること
もできる。これらの塩基は通常、保護された状態で使用
され、このための保護基としてはオリゴヌクレオチド又
はポリヌクレオチドの化学合成において常用されている
任意の保護基を使用することができ、これらは当業者に
よく知られている。例えば、シトシンのＮ４はｐ−メト
キシベンゾイル基によシ、アデニンのＮ６はベンゾイル
基ニより、そしてグアニンのＮ　はプロピオニル基、Ｃ
６はジフェニルカルバモイル基によシ保護するのが好ま
しい。チミジン及びウラシルは３Ｎをベンゾイル基など
で保護するのが好ましい。

本発明の反応は、ピリジン、アセトニトリル、塩化メチ
レン等、種々の媒体中で行うことができ、３−ニトロ−
１，２，４−）リアゾールの存在下ピリジン中で行うの
が好ましい。

反応は１５℃〜５０℃の範囲の温度で行い、室温で行う
のが特に便利である。

例えば、液相法によるオリゴデオキシリがヌクレオチド
の合成に当ってはデオキシリデシル基の５′位のヒドロ
キシル基が遊離している反応体（ｎ）とリン酸基の反応
に関与する部分が塩例えばトリエチルアンモニウム塩の
形である反応体（１）とを適当な溶剤、例えば３−ニト
ロ−１，２，３−）リアゾールを含むピリジン中の浴液
とし、これに本発明の縮合剤であるビス（２，４，６−
）リクロロフェニルオキシ）トリクロロホスホラン又は
ビス（２，４，６−トリブロモフェニルオキシ）トリク
ロロホスホランを、反応体と等モル量又はやや過剰モル
シ添加し、室温にて約１０分間反応せしめる。

次に、必要に応じて反応体（１）の５′位の未反応の水
酸基をキャッピングした後、反応生成物（ＩＩＩ）の保
護基Ｒ４を除去し、５′位を遊離のヒドロキシル基に転
換する。次に、上記の操作を繰り返してヌクレオチド鎖
を５′方向に延長する。

固相合成法の場合も上記と同様であるが、反応体（Ｉｆ
）は固体支持体に連結されており、固体支持体は通常は
カラムに充填されている。従って、上記の縮合反応、キ
ャッピング反応、脱保護反応等はそのために必要な試薬
形′ｔＬをカラムに通すことにより行われ、これらの各
工程の間に洗浄液を流過せしめる。これらは常法に従っ
て行うことができ、このような一般的方法はすでによく
知られている。

（発明の効果） 本発明によれば、非常に短時間でリン酸エステル結合形
成反応を行うことができ、しかも副反応が少ない。本発
明の方法は、液相法によるオリゴヌクレオチド０又はポ
リヌクレオチドの合成、固相法によるオリゴヌクレオチ
ド又はポリヌクレオチドの合成等に広く利用することが
できる。

次に、実施例によシこの発明を畑らに具体的に説明する
。

実施例１゜ ２−の無水ビリノンに２．４　ｍ　ｍｏｌｅのＳ−フェ
ニル５’−０−（４，４’−ジメトキシトリチル）−３
−Ｎ−ベンゾイルチミジン３′−ホスホロチオエート、
２．０　ｍ　ｍｏｌｅの３’−０，３−Ｎ−ジベンゾイ
ルチミジン、及び７．８　ｍｍｏｌｅの３−ニトロ−１
，２，４−トリアゾールを溶解し、真空下で共沸乾燥し
た。この共沸乾燥を３回縁υ返した。泡状の混合物を２
−の無水ピリジンに浴解し、これに２．６ｍｍｏｌｅの
ヒス（２，４，６−トリクロロフェニルオキシ）トリク
ロロホスホランを加え、室温にて１２分間攪拌した。こ
の反応混合物を５ｆｎｔずつのクロロホルムで３回分液
漏斗に洗い出し、５％炭酸水素ナトリウム水浴液１５ｍ
ｔずつで３回抽出・洗浄した。水相は１０ｒｎｔのクロ
ロホルムで逆抽出し、その有畷相は５チ炭酸水累すｌ−
ＩＪウム水耐液で１回抽出した。これら２つの有機ｒｄ
’ｘ混合し、無水炭酸ナトリウムで乾燥し、セしてｌ容
媒を減圧留去した。残留ｆる少量のピリジンを３Ｔｎ！
、ずつのトリエンと共に２回共沸留去した。泡状の残渣
を２−の塩化メチレンに溶解し、シリカダルカラム（３
０ｇ）Ｋ負荷し、塩化メチレン中メタノールの０〜０．
５多グラノエントにより溶出した。目的物のみを含有す
る画分を集め、減圧下で溶媒を留去して１．８６ｍ　ｍ
　ｏ　ｌ　ｅのＳ−フェニル５’−０−（４，４’−ジ
メトキシトリチル）−３Ｎ−ベンゾイルチミジン−３′
３’−０−３Ｎ−ノベンゾイルチミノンー５′ホスホロ
チオエートを得た。

この生成物を、別途合成したダイマー〔Ｊ。

Ｍａｔｓｕｚａｋｉ等、Ｔｅｔｒａｈｓｄｒｏｎ　Ｌｅ
ｔｔ　、　２５　。

４０９１　（１９８４）：］と比較することにより目的
とするダイマーであることｋｍ認した。この分析にオイ
テ、元素分析、’Ｈ−ＮＭＲ１”ｐ−吊ｍｏ結果が一致
することが確認された。

上記の反応においては８分間で反応が完了し、収率は９
３チ 実施例２゜ 実施例１と同様の方法を行った。但し、３−二ト（：ｌ
−１，２，４−）リアゾールの使用量を２．６ｍｍｏｌ
ｅとし、縮合剤としてビス（２，４，６−トリクロロフ
ェニルオキシ）トリクロロホスホラ／を２．４　ｍｍｏ
　ｌ　ｅ使用した。縮合反応は５分間で完了し、目的ダ
イマーの収率は８７％であった。

実施例λ 固相合成法によシｄ　（ＧｐＧｐＧｐＧｐＣｐＣｐＣｐ
Ｃ）を合成した。この合成は次の手順により行った。

（ト）常法に従って、アミノグロビルーコントロールド
・ボア・グラス（ＣＰＧ）（孔サイズ５６０Ｘ）にＮ４
−アニソイル−５’−０−（４，４’−ジメトキシトリ
チル）−２′−デオキシシチノンを導入した。

４入址は３９μｍｎ１ｏ　１　ｅ　／　ｉであった。

（Ｂ）　　次に、上記の固体担体５Ｑ＋＋夕をコック付
ガラスフィルターに入れ、次の段階によυヌクレオチド
９の連結を行った。

（１）１％（Ｙ／Ｖ　）　トＩＪりｏｏ酢酸／塩化メチ
レン混合液１−ずつによシ固体担体を３回処理し５′位
のジメトキシトリチル基の脱係ｉｔ１行った。

（２）固体担体−１２−ずつの塩化メチレンにより３回
洗浄した。

（３）担体を３００μｌの乾燥ピリジンで浸し、真空下
で乾燥を行った。

（４）　　５’位のヒドロキンル基および塩基部分の官
能基を保護したリン酸ソエステル体（トリエチルアンモ
ニウムＳ−フェニル５′−〇−ジメトキシトリチルーＮ
４−アニソイル２′−デオキシフチノン−３′ホスホロ
チオエート）４０μｍｏｌｅ及び３−ニトロ−１，２，
４−トリアゾール１００μｍｏ　ｌｅを１１ｎｔの乾燥
ピリジンと伴に共沸乾燥し、２０μｍｏｌｅのビス（２
，４，６−）　ＩＪジブロモェニルオキシ）トリクロロ
ホスホランと共に４００μｌの乾燥ピリジンに溶解した
。

（５）前記（４）で調製した溶液を前記（３）の担体に
添加し、室温にて１０分間放置することにより縮合反応
を行った。

（６）担体を１−ずつのピリノンで２回洗浄し、きらに
２−ずつのクロロホルムで３回洗浄し、次に真空乾燥し
た。

（７）０．ＩＮジメトキシアミノピリジンを含む無水酢
酸／ピリジン（１：　９　ｖ／マ）混合液１−で固体単
体を処理することによシ未反応の５′−ヒドロキシル基
のキャッピングを行った。

（８）　　前記（６）と同様の洗浄を行った。

前記（１）〜（８）の操作を目的の配列が得られるまで
反復した。但し、デオキシグアニル酸の導入に当っては
段階（４）において使用するリン酸ジエステル体トして
トリエチルアンモニウムＳ−フェニル５′−０−（４，
４’−ジメトキシトリチル）−Ｎ　　−ノロピオニル−
６−〇−ジフエニルカルバモイル−２′−デオキシグア
ノシン−３′ホスホロチオエート’を使用した。

（Ｑ　最後に、次のようにしてオリゴヌクレオチド鎖の
固体担体からの切シ離し及びオリゴヌクレオチドの脱保
護を行った。次に示す操作は担体２０ｍｇ当りのもので
ある。ジオキサン／水（９：１　ｖ／マ）混合液中０．
５Ｍ２−ピリジルカルボアルドオキシム（ＰＡＯ）、Ｎ
、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’−テトラメチルグアニジン（ＴＭＧ　
）の浴液２１ｒＬｔにより室温にて２４時間処理した後
、固相担体全戸去し、固体担体はジオキサン／水（９：
ＩＶ／ｖ）混合液１−ずつにてさらに２回洗浄した。こ
れらのＦ液及び洗浄液を一緒にして減圧下で溶媒を留去
した。蒸発残渣に濃アンモニア水５ｍを加え、室温にて
１９時間及び５０℃にて３時間処理し、再度溶媒を留去
した。

この操作により５′位のヒドロキシル基の保護基以外の
保護基を除去した。次に、μＢｏｎｄａｐａｋ　Ｃ１８
カラムを用いる高速液体クロマトグラフィーにより目的
分を分取した。このクロマトグラフィーは溶液Ａ：０．
ＩＭ酢酸アンモニウム、及び液Ｂ：ＣＨ，ＣＨを用いる
直線グラジェント（Ｂｏｏ→５０係）（２５分間）によ
シ、５０℃にて行った。目的物の画分を集め、凍結乾燥
した。

この凍結乾燥物を５−の８０％酢酸により室温にて１５
分間処理して５′位の保護基を除去し、次に溶媒を留去
した。蒸発残渣を、上記と同様の高速液体りａマドグラ
フィーによシ処理することによって目的物を精製し、凍
結乾燥した。次に、Ｄｏｗｅｘ　５０ＷＸ８　（Ｎａ＋
型）カラム（温容量３−）を通すことにより塩交換を行
い、さらに８ｅｐｈａｄｅｘＧ２５により脱塩し、凍結
乾燥することによシ白色繊維状の目的物質を得た。

収量は１１Ａ２５４ユニツトであった。

Ｕν：λ　　２５３　ｎｍ　＃λ　　２２５　ｎｍ　。

ｍａｘ　　　　　　　　　　　　　　　　ｍａｘ２　ｓ
　ｏ　ｎｍ（ｓｈ）　。

ヘビ毒ホスホノエステラーゼによる分解の結果、生成物
のヌクレオチド比率はｐｄＣ：　ｐｄＱ　：　ｄＧ　＝
４　：　３．１　：　１．３であった。

また、前記の反応における各段階の収率は次の通りであ
った。

１ソ、下全白 −Ｃ− １Ｃ９１ ２Ｃ９１ ３Ｃ９０ ４Ｇ　　　　　　　　　８４ ５　　　　　　　　　　Ｇ　　　　　　　　７４６　　
　　　　　　　　Ｇ　　　　　　　　８７７　　　　　
　　　　　Ｇ 特許用ん通人 東亜燃料工業株式会社 特許出願代理人

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、次の反応式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｒ＿１はオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオ
   チドの化学合成においてデオキシリボース部分の５′位
   のヒドロキシル基の保護のために常用される保護基、保
   護されているモノデオキシヌクレオチド、又は保護され
   ているオリゴデオキシヌクレオチドであり；Ｒ＿２はオ
   リゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドの化学合成にお
   いてリン酸部分の保護のために常用される保護基であり
   ；Ｒ＿３はデオキシリボース部分の３′位のヒドロキシ
   ル基の保護のための常用の保護基、固体支持体に結合し
   ているリンカー、モノ−、オリゴ−もしくはポリ−デオ
   キシリボヌクレオチド、又は場合によってはリンカーを
   介して固体支持体に連結されているモノ−、オリゴ−も
   しくはポリ−デオキシリボヌクレオチドであり；そして
   Ｂ＿１及びＢ＿２は同一であるか又は異っており、そし
   て場合によっては保護されている核酸構成塩基を表わす
   ） で表わされるリン酸エステル結合形成方法において、縮
   合剤としてビス（２，４，６−トリハロフェニルオキシ
   ）トリクロロホスホランを使用することを特徴とする方
   法。 ２、前記縮合剤がビス（２，４，６−トリクロロフェニ
   ルオキシ）トリクロロホスホラン、又はビス（２，４，
   ６−トリブロモフェニルオキシ）トリクロロホスホラン
   である特許請求の範囲第１項に記載の方法。 ３、Ｒ＿１がｐ，ｐ′−ジメトキシトリチル基、シリル
   基、アルキル基又はアシル基である特許請求の範囲第１
   項に記載の方法。 ４、Ｒ＿２がアリールチオ基、アリールオキシ基、アル
   キルチオ基、又はアルキルオキシ基である特許請求の範
   囲第１項に記載の方法。 ５、前記反応を３−ニトロ−１，２，４−トリアゾール
   の存在下ピリジン中で行う特許請求の範囲第１項に記載
   の方法。 ６、前記反応をオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチ
   ドの化学合成における鎖延長反応として行う特許請求の
   範囲第１項に記載の方法。 ７、前記反応の基質中の反応に関与するリン酸基がトリ
   エチルアンモニウム塩の形である特許請求の範囲第１項
   に記載の方法。