JPH07501794A - 新規な脱保護剤を用いたリボ核酸（ｒｎａ）の合成方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、リボ核酸（ＲＮＡ）の２°位の水酸基の全脱保護を迅速に行なうこと の可能な、脱保護剤を用いたリボ核酸の合成方法に関する。

何年もの間、多くの細胞方法（ｃｅｌｌｕｌａｒ　ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ）におい て重要な役割を果たすＲＮＡに対する注目が増すに連れて、リボ核酸フラグメン トの合成方法が、開発されつつある。

これらの合成方法は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の合成に使用されるものと類 似の方法であり、たとえば、オシルビーらによる文献（Ｏｇｉｌｖｉｅ　ｅｔ　 ａｔ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、’Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、Ｖｏ１．８５．ｐｐ、５７ ６４−５７６８．１９８８年８月）およびガスパルートらによる文献（Ｇａｓｐ ａｒｕｔｔｏ　ｅｔ　ａｌ、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ　＆　Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄ ｅｓ　９　（８）、Ｉ）ｐ、１０８７−１０９８．１９９０）に開示されている 。

この合成原料は、２′位の水酸基が適当な基で保護されており、また、ヌクレオ チド合成に適した基を有するリボヌクレオシドからなる。リボ核酸を形成するた めには、これらのヌクレオシド誘導体の連続縮合を行なうものである。

このように、上記オシルビーらによる文献においては、２°位の水酸基がｔ−ブ チル−ジメチルシリル基により保護されたりボヌクレオシド誘導体が使用されて いる。全てのヌクレオシドの結合後、２°位の水酸基が保護されたリボ核酸が得 られる。したがって、これら２°位の水酸基の保護基を除去するためには、最後 に脱保護処理を行なうのが適当である。

これまで、前記脱保護は、グレン　リサーチ　レポート、４巻、１号、１９９１ 年３月、ＲＮＡ　シンセシスーブロブレムズ　イン　デプロテクションに記載さ れているように、テトラヒドロフラン中で脱保護剤としてテトラブチルアンモニ ウムフルオリドを用いることにより行なわれていた。【−ブチルジメチルシリル （ＴＢＤＭＳ）で保護されたヌクレオシドまたはヌクレオチドの２′位水酸官能 基の脱保護は、テトラブチルアンモニウムフルオリドにより２．３分でおこる。

２゛位に［−ブチルジメチルシリル基を有するオリゴヌクレオチドの場合には、 脱保護はより困難となり、数時間（図３、曲線５参照）かかる。非常に長いＲＮ Ａフラグメントの場合には、たとえば、２５塩基より多い場合には、水酸基の脱 保護はこの薬剤では不完全である。というのは、１塩基あたり少なくと６１−２ ％の脱保護されていない水酸基が残っているからである。すなわち、各ＲＮＡ分 子は、少なくとも１つの脱保護されていない水酸基を有し、これは、オシルビー により示されているように、ＲＮＡの生物学的な活性に不利となるものである。

本発明は、合成されたリボ核酸の２′位における水酸基の全脱保護を迅速に行な うことの可能な、リボ核酸（ＲＮＡ）の合成方法に関する。

本方法は、 ［ここで、Ｒ１は、以下の式で表される基から選択されたピリミジン塩基または プリン塩基から誘導された基であり、］［ここで、Ｒ′は、ＨまたはＣＨ３であ り、Ｒ６、Ｒ７、およびＲ８は、水素原子または環外ＮＨ，基を保護するアシル 基であり、Ｒ２は、ヌクレオチド合成に適当な酸媒体において不安定な基であり 、Ｒ１は、固体支持体であり、 Ｒ４は、トリアルキルシリル基である、］で表される第１ヌクレオシドを、−２ ゛位の全水酸基はＲ４により保護されている合成リボ核酸を形成するために、式 （１）で表される、１以上の同一または異なったヌクレオシド、［ここで、Ｒ１ 、Ｒ４、およびＲ４は、上記と同様の意味を有し、Ｒ３はヌクレオチド合成に適 当なリン基である、］と連続縮合し、 ｂ）上記合成されたリボ核酸を、式： ［ここで、Ｒ９は、直鎖状または分岐したＣ　がらＣアルキル基、ＲＩＧおよび ＲＩ　Ｉは、同じでも異なっていてもよい直鎖状または分岐したＣ１がら０１゜ アルキル基であり、Ｒ９と同じでも異なっていてもよく、ｎは１がら３の数であ り、整数であっても整数でなくてもよい、］で表される脱保護剤で処理すること により、２゛位の全ての水酸基を脱保護することからなる。

この方法においては、連続縮合サイクルは、異なったヌクレオシドを他のヌクレ オシドに、常法、すなわちＲＮＡ合成に関する公知のプロトコールおよび化学剤 を用いて、結合させることにより行なわれる。

最後に、各結合に使用される式（１）のヌクレオシドは、ヌクレオチド合成に適 当なＲ２およびＲ１基と、使用された塩基に依存するＲ１とからなる。この塩基 が環外ＮＨ２基を有する場合、後者は、ヌクレオチド合成に一般的に使用される 適当な保護基により保護されている。

適当な保護基は、たとえば、米国特許第４９８０４６０号、コスタ−らによるテ トラヘドロン、３７巻、３６３−３６９ページ、１９８１年、ウーらによる、ヌ クレイツク　アシズ　リサーチ、１７巻、９．１９８９．３５０１−３５１７ペ ージに記載されたアシル基である。

本発明において、塩基がアデニンまたはグアニンの場合には、保護基は、フェノ キシアセチル基、すなわち、前記式においてＲ７とＲゝがフェノキシアセチル基 からなることが好ましい。

塩基がシトシンの場合には、保護基は、好ましくはアセチル基からなり、すなわ ち、Ｒ６が上記式において、アセチル基であるものである。この場合、イソブチ リル基またはプロピオニル基を使用することも可能である。

Ｒ２としては、適当に使用可能な酸媒体において不安定な基、たとえば：式： ［ここで、Ｒ１２、Ｒｌ　３、およびＲｌ　＋は、各々同じでも異なっていても よい、水素原子、アルキル基、またはアルコキシ基であり、たとえば、モノメト キシトリチルまたはジメトキシトリチル基である、］で表されるトリチル基、 ビクシル基、および ９−フェニル−キサンテニル基が埜げられる。

Ｒ１としては、使用可能なリン基は、たとえば、式：［ここで、ＲＩ　Ｓ、ＲＩ 　Ａ、Ｒｌ　７、ＨＩ８、およびＲｌ　９は、直鎖状または分岐したアルキル基 である、］ が使用可能である。

好ましくは、本発明の方法においては、Ｒ３として、式：［ここで、Ｒ１５およ びＲ１６は、同じでも異なっていてもよい、Ｃ１から０４アルキル基である、］ であられされるホスホラミシト　（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉ　ｔｅ）基が使 用たとえば、ＲＩ　Ｓがメチル基であり、ＲＩ　Ｉｉがエチル基であるか、また は、Ｒ１５およびＲｌ　６の双方がイソプロピル基であってもよい。

Ｒｌ　３およびＲｌ　６にエチル基およびメチル基を使用することは、非常に興 味深いことである。なぜならば、これらの基を用いると、ヌクレオチド（インタ ーヌクレオチド結合は３分で形成される）の迅速な結合が、優れた収率（９８％ ）で副反応もなく少なく、可能となるものである。しかも、２゛位にｔ−ブチル −ジメチルシリル保護基を有するこれらの基を使用すると、ＲＮＡ合成に対して 優れた反応性を有する安定なヌクレオシド誘導体が得られる。ここで、これらの エチル基およびメチル基は、ＤＮＡ合成用の非常に不安定な誘導体を与えるもの である。

本発明の方法によれば、ヌクレオシドの連続縮合サイクルを行なった後、２゜位 の全ての水酸基が保護された、合成リボ核酸が、式：［ここで、Ｒ９は直鎖状ま たは分岐したＣ１からＣ１３，アルキＪし基であ＃ン、ＲＩＬｌおよびＲ１は同 じでも異なって１／１てもよＩ／）、Ｈまた（ま直シ貞４大また１よ分岐したＣ からＣアルキル基であり、Ｒ９と同じであっても異なってし）ても良く、ｎ（よ １から３の数字であり、整数であってもなくてもよし）、］で表される薬剤を脱 保護剤として用いる脱保護処理１二ふされる。

このような薬剤の例としては、Ｎ　（Ｃ２Ｈ５）　３．　３ＨＦ　；Ｎ　（ＣＨ ３）　３．　２ＨＦ　；　Ｎ　（ＣＨ，）：＋　ＨＦ　；イソプロピルアミン、 Ｈ置イソプロビルアミン。

１．８ＨＦ；ジイソプロピノげミン、２ＨＦ；およびシイソプロビλレアミン、 ３ＨＦが挙げられる。

好ましくは１本発明においては、式： ％式％ で表される脱保護剤が使用される。

この公知の薬剤は、これまで炭水化物の７ノ′ノ化剤として用し１られてきたも のである。

本発明によれば、リボ核酸の２゛位における水酸基の脱保護用にこの薬剤１を使 用することは非常に興味探し）ことであり、なぜならＩＩ、これＧこよ＃ン、Ｐ ＋１０時間で非常に長いリボ核酸の全脱保護が完了可能となる力・らである。さ ら（こ、精製された状態で使用することが可能であり、蒸発ｌ：より簡単１二除 去可能である。

一般には、脱保護処理は、約２時間から２０時間、常？鼠で１〒なわれる。

この薬剤を、たとえばアセトニトリルなどの有機ｉ各課で希釈してイ史用するこ とも可能である。

本発明の他の特徴部および優位点は、以下【こ示す実施例力・ら開力・どなるで あろう。ただし、本発明はこれらの実施例および図面に限定されるものではない 。

図１は、実施例１で合成された転移ＲＮＡを示す。

図２は、実施例１で合成された転移ＲＮＡの合成に使用されるリボヌクレオシド のホスホラミシトを示す。

図３は、異なる脱保護剤による、時間（ｈ）に対する４２塩基のオリゴヌクレオ チドの脱保護％を示す。

図４から９は、高速液体クロマトグラフィーの場合に得られるオリゴヌクレオチ ドのクロマトグラムである。

施例１．大　菌Ｋ　つのアラニンの転移リボ核酸ｔ−ＲＮＡの合成この転移ＲＮ Ａは図１に示すものである。

この合成をおこなうために、図２に示された保護されたりボヌクレオシドホスホ ラミジトを使用した。図２において、ＤＭｔはジメトキシトリチル基を示し、Ｂ Ｐは任意に保護されてもよいプリン塩基またはピリミジン塩基を示す。塩基がア デニンまたはグアニンである場合には、その環外Ｎｌ２基はフェノキシアセチル 基により保護されており、塩基がシトシンである場合には、その環外Ｎｌ２基は アセチル基により保護されている。

塩基ＢＰはまた、ウラシル、チミン、５．６−シトドロウラシルおよびプソイド ウラシルであってもよい。

ヌクレオシドの連続縮合段階は、キャップ剤としてフェノキシ無水酢酸を用いて 行なわれる。合成は、制御された大きさの孔のシリカゲルサポートを用いて０． ２マイクロモルのスケールで、固体相において行なわれる。

各縮合サイクルは、以下の段階を含有する：脱トリチル化：２％のトリクロロ酢 酸、ジクロロメタン中、９０分間、洗浄ニアセトニトリル、２分間、 縮合：ヌクレオシド誘導体十活性化剤、無水アセトニトリル中、３分間、不完全 な鎖の延長を止めるための、反応していないヒドロキシル官能基のマスキング、 フェノキシ無水酢酸およびｌ−メチルイミダゾール、無水アセトニトリル中、１ 分間、 酸化：０．４５％ヨウ素、テトラヒドロ７ラン／水／ルチジン（８９，５／１０ １０．５）中、４５秒間、および 洗浄ニアセトニトリル中、９０秒間。

各サイクルにおいては、４５ヌクレオシド当量が使用される。

上記処理の最後に、オリゴヌクレオチドは、サポートから外され、シアノエチル 基が、エタノールおよび濃縮アンモニア水溶液（２８％アンモニア：エタノール 、３／１容積）の混合物を用いて２時間常温で処理することにより加水分解され る。

このオリゴヌクレオチドを次いで、５５℃で１時間加熱し、塩基の環外Ｎｌ２基 の保護基を除去して、次いで、この溶液を減圧濃縮し、残渣を常温で、３００マ イクロリツトルの精製状態（ＴＥＡ、３８Ｆ）の脱保護剤Ｎ　（Ｃ２Ｈ−、）３ ＋３ＨＦで１６時間処理した。

液相を次いで蒸発させて乾燥し、塩全プロダクトの混合物から除去し、次いで、 １５％ポリアクリルアミドゲル（１，５ｍｍ厚さ）において電気泳動することに より得られた、合成リボ核酸を精製する。

３゛位または５゛位のＯＨ端部をリン３２により標識化した後、得られたリボ核 酸が実際、図１に示すＲＮＡと一致するかを、酵素分解方法を用いて配列決定を 調べることにより、チェックする。

すべての場合において、転移リボ核酸の構造は、図１の配列にしたがうものであ る。

このようにして得られた合成リボ核酸の構造は、次いで、少量の前記ＲＮＡにお ける、その３゛位末端のハイブリッド形成を、１６塩基の長さの相補オリゴデオ キシヌクレオチドを用いて行ない、これをインバーストランスクリプターゼでコ ピーする。ＰＣＲ増幅の後、２つのＤＮＡ鎖は配列され、完全に所望の配列であ ることが確かめられた。

寒將岨Ｉ この実施例においては、評価は、【−ブチルジメチルシリル基により保護された １つのりボヌクレオチドｒＵを含有する、Ｄ　Ｎ　Ａ　５Ｍを有するオリゴヌク レオチドである、モデルとしてのｄＴ：！、ｒＵｄＴ、ｏにおいて、本発明によ る脱保護レベルでおこなう。

このオリゴヌクレオチドｄＴ、ｒＵｄＴ、を合成するために、原料となるヌクレ オシドが、図２に示す化合物、［ここで、Ｂゝはチミンを表し、がＨで置換され る］および、図２に示す化合物［ここで、ＢＰがウラシルである］ からなること以外は、実施例１と同様の方法が用いられた。

合成後、脱保護が、種々の時間で行なわれ、各脱保護の処理後、脱保護レベルは 、［−ブチルジメチルシリル基をまだ有している同族体から完全に脱保護された フラグメントを分離することの可能な、逆相Ｃ１８カラムにおいてプロダクトを 分離することにより決定される。

得られた結果は、図３の曲！　（１）に表される。これから、４時間で１００％ 脱保護されていることがわかる。

寒將霞ｌ オリゴヌクレオチドｄＴ２．ｒＵｄＴ２ｏを合成するために、実施例２と同様の 方法がもちいられるが、脱保護は、本発明による薬剤（ＴＥＡ、３ＨＦ）とアセ トニトリルの１／１容量比の混合物を用いて行なわれる。

得られた結果は、図３の曲ｍ（２）に表される。図３から、本発明による脱保護 剤のアセトニトリルによる希釈により、完全な脱保護は８時間後に得られるこの 例においては、オリゴヌクレオチドｄＴ、、ｒＵｄＴ２ｏを合成するために、実 施例２と同様の方法がもちいられるが、脱保護は、従来の脱保護剤、すなわちテ トラブチルアンモニウムトリハイドレートフロリド（ＴＢＡＦ、３Ｈ，Ｏ）をジ メチルスルホキシドにおいて１モル／Ｌの量で用いることにより行なう。

得られた結果は、図３の曲線（３）に表される。図３から、従来の脱保護剤を用 いると、完全な脱保護には１１時間かかることがわかる。

比較例２ この例においては、オリゴヌクレオチドｄＴ２．−ｒＵ　ｄＴ２ｏを合成するた めに、実施例２と同様の方法がもちいられるが、脱保護は、従来の脱保護剤、Ｔ ＢＡＦ、３Ｈ２０のジメチルホルムアミドの１モル／上溶液を用いることにより 行なう。

得られた結果は、図３の曲線（４）に表される。この場合、完全な脱保護には２ ４時間かかることがわかる。

里箆霞ｌ この例においては、オリゴヌクレオチドｄＴ２．−ｒＵ−ｄＴ’、ｏを合成する ために、実施例２と同様の方法がもちいられるが、脱保護は、テトラヒドロフラ ン（Ｔ　ＨＦ　）中、ＴＢＡＦ、３Ｈ２０の１モル／上溶液を用いることにより 行なう。

得られた結果は、図３の曲線（５）に表される。図３から、ＴＨＦ中において、 現在使用されているテトラブチルアンモニウムフルオリドを用いると、完全な脱 保護が不可能であることがわかる。

大旗辺土 この実施例は、１８塩基の長さを有し、以下の配列：５’　ＵＴＵＡＣＵＡＵＣ ＵＡＵＣＵＣＣＣＡＡ３゜を有するオリゴヌクレオチドを合成するために、実施 例１と同様の方法を用いる。

アンモニア性媒体において塩基の環外ＮＨ，基の保護基を除去した後、約４０マ イクログラムのシリル化されたオリゴヌクレオチド（すなわち２６０ｎｍ（２０ Ｄ）において２吸収単位）をエノペンドルフマイクロチューブにおいて、６０マ イクロリツトルの脱保護剤Ｎ　（Ｃ２Ｈ，、）　３，３ＨＦ　（ＴＥＡ、３ＨＦ ）で２０時間常温で処理する。ただし１反応混合物を、反応進行を評価するため に、ＴＥＡ、３ＨＦと反応させる前のものと、４時間反応させるものと、２００ 時間反応せるものとの、いくつかのサンプルに分ける。サンプル分けした後、各 サンプルはトリエチルアンモニウムアセテート、ＴＥＡＡ　（ｐＨ７，０，２５ ｍＭ）の４容積で中性化し、次いでモノリカラム（ＬＫＢ）を用いてＫＨ２ＰＯ ｊｌｉ液（ｐＨ６，０）において４０分でＯから１％ＫＣＩの勾配で溶出する高 速液体カラムクロマトグラフィーにより分析を行なう。２０時間の反応後のサン プルの場合は、中性化の後、前記サンプルと同様にして分析し、他の部分は、セ ファデックスＧ２５カラム（ファルマシアＮＡＰＩＯ）においてＴＥＡＡにより 中性化後、塩を除去し、次いで高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で同様 に分析する。塩の除去により、ＴＥＡ、３ＨＦ混合物による副生ピークを除去す ることが可能となる。

得られた結果を、図４から７に示す。図４は、時間Ｏにおけるクロマトグラムで あり、すなわち、ＴＥＡ、３ＨＦで反応する前のものである。図５は、４時間反 応した後のクロマトグラムである。図６は、２００時間反応た後のクロマトグラ ムである。図７は、２０時間反応後のサンプルされたプロダクトから塩除去した 場合のクロマトグラムである。全ての場合において、プロダクトは１マイクロリ ツトル、注入するものであるが、図７の場合は、プロダクトが２．５マイクロリ ツトル、注入されたものである。

これらのクロマトグラムから、脱保護されたオリゴヌクレオチドは、４時間の反 応後（図５．６、および７のクロマトグラム）、２７分の保持時間【、で現われ ることがわかる。２０時間までの明白な脱保護は少しずつ行なわれ、はとんど補 助劣化（図６参照）はおこらない。

塩除去（図７）の後、塩−除去されたプロダクトは、粗オリゴリボヌクレオチド の純度を有する。不完全な配列は明らかにクロマトグラムで見つけることができ る。

このようにして、脱保護して塩除去されたオリゴヌクレオチドは、非常に純度が 高く、高い収率で得られるものである。

夾胤辺ｌ この実施例においては、ＴＥＡ−３ＨＦの存在下における天然転移ＲＮＡの安定 性を研究することにより、脱保護用に使用されたＴＥＡ−３ＨＦが、得られたオ リゴヌクレオチドを分解しないことをチェックする。

フロントベージの続き （７２）発明者　ガスパルット、ディプイエフランス国　３８４００　サンーマ ルタン　プレ　リュ　ドウ　ペルトン　１２ （７２）発明者　リヴアシェ、チェリーフランス国　３８０００　グレノーブル 　リュフェリックス　ニスクランボン　２２ （７２）発明者　モルコ、ディプイエ フランス国　３８２１０　チュリンーフユーレアヴエニュ　ドウ　ラ　ガール　 １１　レノワイエ　ア１−１ （７２）発明者　テウル、ロベール フランス国　３８０００　グレノーブル　リュチェ　５２

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. １．リボ核酸の合成方法であり、 ａ）式： ▲数式、化学式、表等があります▼（Ｉ）［ここで、Ｒ１は、以下の式で表され る基から選択されたピリミジン塩基またはプリン塩基から誘導された基である、 ］▲数式、化学式、表等があります▼ ［ここで、Ｒ５は、ＨまたはＣＨ３であり、Ｒ６、Ｒ７、およびＲ８は、水素原 子または環外ＮＨ２基を保護するアシル基であり、Ｒ２は、ヌクレオチド合成に 適当な酸媒体において不安定な基であり、Ｒ３は、固体支持体であり、 Ｒ４は、トリアルキルシリル基である、］で表される第１ヌクレオシドを、２′ 位の全水酸基はＲ４により保護されている合成リボ核酸を形成するために、式（ Ｉ）で表される、１以上の同一または異なったヌクレオシド、［ここで、Ｒ１、 Ｒ２、およびＲ４は、上記と同様の意味を有し、Ｒ３はヌクレオチド合成に適当 なリン基である、］と連続縮合し、 ｂ）上記合成されたリボ核酸を、式： ▲数式、化学式、表等があります▼（ＩＩ）［ここで、Ｒ９は、直鎖状または分 岐したＣ１からＣ１０アルキル基、Ｒ１０およびＲ１１は、同じでも異なってい てもよい直鎖状または分岐したＣ１からＣ１０アルキル基であり、Ｒ９と同じで も異なっていてもよく、ｎは１から３の数であり、整数であっても整数でなくて もよい、］で表される脱保護剤で処理することにより、２′位の全ての水酸基を 脱保護することからなることを特徴とする、リボ核酸の合成方法。
2. ２．脱保護剤が、 式： Ｎ（Ｃ２Ｈ５）３・３ＨＦ で表されるものからなることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
3. ３．脱保護剤による処理が、常温で１４０分間行なわれることを特徴とする、請 求項１または２に記載の方法。
4. ４．Ｒ４が、ｔ−ブチルジメチルシリル基である、請求項１ないし３のいずれか 一項に記載の方法。
5. ５．Ｒ３が、式： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［ここで、Ｒ１５およびＲ１６が、同じでも異なっていてもよいＣ１からＣ４ア ルキル基である、］ である、請求項１ないし４のいずれか一項に記載の方法。
6. ６．Ｒ１５が、メチル基であり、Ｒ１６が、エチル基である、請求項５に記載の 方法。
7. ７．Ｒ１５およびＲ１６が、イソプロピル基である、請求項５に記載の方法。
8. ８．Ｒ２が、ジメトキシトリチル基である、請求項１ないし７のいずれか一項に 記載の方法。