JPWO2005070946A1 - リボ核酸化合物及びオリゴ核酸化合物の液相合成法 - Google Patents

リボ核酸化合物及びオリゴ核酸化合物の液相合成法 Download PDF

Info

Publication number
JPWO2005070946A1
JPWO2005070946A1 JP2005517313A JP2005517313A JPWO2005070946A1 JP WO2005070946 A1 JPWO2005070946 A1 JP WO2005070946A1 JP 2005517313 A JP2005517313 A JP 2005517313A JP 2005517313 A JP2005517313 A JP 2005517313A JP WO2005070946 A1 JPWO2005070946 A1 JP WO2005070946A1
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
tetrahydrofuranyl
acid compound
phosphoryl
chlorophenoxy
ribonucleic acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
JP2005517313A
Other languages
English (en)
Other versions
JP4802712B2 (ja
Inventor
忠明 大木
忠明 大木
稔浩 上田
稔浩 上田
泰史 丸山
泰史 丸山
博文 増田
博文 増田
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nippon Shinyaku Co Ltd
Original Assignee
Nippon Shinyaku Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nippon Shinyaku Co Ltd filed Critical Nippon Shinyaku Co Ltd
Priority to JP2005517313A priority Critical patent/JP4802712B2/ja
Publication of JPWO2005070946A1 publication Critical patent/JPWO2005070946A1/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP4802712B2 publication Critical patent/JP4802712B2/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/16—Purine radicals
    • C07H19/167—Purine radicals with ribosyl as the saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/06—Pyrimidine radicals
    • C07H19/10—Pyrimidine radicals with the saccharide radical esterified by phosphoric or polyphosphoric acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7042—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings
    • A61K31/7052—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides
    • A61K31/706—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom
    • A61K31/7064—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines
    • A61K31/7068—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines having oxo groups directly attached to the pyrimidine ring, e.g. cytidine, cytidylic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7042—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings
    • A61K31/7052—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides
    • A61K31/706—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom
    • A61K31/7064—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines
    • A61K31/7068—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines having oxo groups directly attached to the pyrimidine ring, e.g. cytidine, cytidylic acid
    • A61K31/7072—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines having oxo groups directly attached to the pyrimidine ring, e.g. cytidine, cytidylic acid having two oxo groups directly attached to the pyrimidine ring, e.g. uridine, uridylic acid, thymidine, zidovudine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7042—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings
    • A61K31/7052—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides
    • A61K31/706—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom
    • A61K31/7064—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines
    • A61K31/7076—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines containing purines, e.g. adenosine, adenylic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/06—Pyrimidine radicals
    • C07H19/067—Pyrimidine radicals with ribosyl as the saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/16—Purine radicals
    • C07H19/20—Purine radicals with the saccharide radical esterified by phosphoric or polyphosphoric acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/02—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with ribosyl as saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

オリゴＲＮＡを液相合成するために重要であるリン酸トリエステル化された新規なリボ核酸化合物を提供する。本発明として、次の一般式で表されるリボ核酸化合物を挙げることができる。式中、Ｂは、アデニン、グアニン、シトシン、若しくはウラシル又はそれらの修飾体を示す。Ｒ２１は置換されていてもよいアリール又は１〜２環性であって置換されていてもよい複素環基を示す。Ｒ２０はＨ又は置換されていてもよいアルキルを示す。Ｒ１は、０℃〜６０℃のいずれかの温度においてｐＨ２〜４の酸性条件下２４時間で９０％以上脱離することができる保護基を示す。

Description

本発明は、治療薬、診断薬又は研究試薬として有用なオリゴＲＮＡを液相合成するために重要である、リン酸トリエステル化された新規なリボ核酸化合物に関するものである。
オリゴ核酸化合物は、現在治療や診断の方法としての重要な役割を担ってきている。オリゴ核酸化合物の製法としては、一般に３つの方法が知られている。Ｒｅｅｓｅにより開発されたリン酸トリエステル法（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ １９７８， ３４， ３１４３）およびＢｅａｕｃａｇｅにより開発されたアミダイト法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ： Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｓ； Ａｇｒａｗａｌ， ｅｄ． ； Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ： Ｔｏｔｏｗａ， １９９３， Ｖｏｌ． ２０， ３３−６１）およびＦｒｏｅｈｌｅｒによるＨ−Ｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ： Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｓ； Ａｇｒａｗａｌ， ｅｄ．； Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ： Ｔｏｔｏｗａ， １９９３， Ｖｏｌ． ２０， ６３−８０）を挙げることができる。リン酸トリエステル法は、主として液相合成で用いられ、アミダイト法およびＨ−Ｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ法は、主として固相合成で用いられる。
現在、オリゴ核酸化合物の製造において使用されている製法は、固相法である。固相法は、容易にオリゴマーの製造を達成しうるが、樹脂上で反応を行う都合上、反応場に制限があり、スケールを大きくすることが困難である。
大量のオリゴ核酸化合物を供給するには、液相によるオリゴ核酸化合物の合成法を開発することが不可欠であるが、現在、大量のオリゴ核酸化合物の供給が可能となっているのは、オリゴＤＮＡのみであり、大量のオリゴＲＮＡを製造するのに相応しい液相合成法は知られていない。
オリゴＲＮＡの液相合成を行うためには、リン酸トリエステル法における原料として使用可能な構成モノマーである、リボース３’位水酸基がリン酸トリエステル体であり、かつ段階的オリゴマー化の最終段階において、容易にすべての保護基が脱保護できる高度に保護されたリボ核酸化合物を大量に供給できる必要がある。
オリゴＲＮＡ合成に必要な構成モノマーである、高度に保護されたリボ核酸化合物の各官能基の保護基に必要な条件として、次のようなものが考えられる。（１）オリゴＲＮＡが縮合反応条件下において安定に存在できること、（２）分子内に他の保護基が存在する場合、各保護基が異なる条件において選択的に脱保護できること、（３）オリゴＲＮＡが安定に存在できる条件下において、容易に保護基だけを脱保護できることである。
リボース２’位水酸基の保護基としては、例えばｔ−ブチルジメチルシリル基等のケイ素保護基、２−テトラヒドロフラニル、２−テトラヒドロピラニル等のアセタール保護基を挙げることができる。特に、アセタール保護基は、オリゴＲＮＡの脱保護工程において、リン酸転位やそれに伴う短鎖化等の副反応が起きないようなｐＨ２〜４の温和な水性酸性条件下において除去することが可能である。
一方、リボース５’位水酸基の保護基としては、例えば４，４’−ジメトキシトリチル基、レブリニル基を挙げることができる。リボース２’位水酸基の保護基としてアセタール保護基を使用した場合、オリゴＲＮＡを製造するための最終の縮合工程に、リボース５’位水酸基の保護基として４，４’−ジメトキシトリチル基を使用すると、最後の脱保護工程において、酸性条件で両方の保護基を除去することが可能である。しかし、オリゴＲＮＡを製造する途中の工程において、リボース５’位水酸基の保護基として４，４’−ジメトキシトリチル基を使用することは、アセタール保護基をそのまま存在させておくことが困難であるので避けた方がよい。
代わりに、リボース５’位水酸基の保護基として、レブリニル基（ＣＨ３−ＣＯ−（ＣＨ２）２−ＣＯ−）を利用する場合、アセタール保護基がはずれない中性条件でヒドラジンを処理することにより脱保護することが可能である。
これら２種類の保護基（レブリニル基とテトラヒドロフラニル基）を組み合わせた化合物としては、オリゴＲＮＡの固相合成法に使用可能なリボース３’位水酸基がアミダイト化されたリボ核酸化合物が知られている（例えば、非特許文献１参照）。
しかし、オリゴＲＮＡの液相合成法に使用可能なリボース２’位水酸基がアセタール保護され、リボース５’位水酸基がレブリニル化され、リボース３’位水酸基がリン酸トリエステル化されたリボ核酸化合物はまだ知られていない。
従来、リボース５’位水酸基にレブリニル基を導入した化合物は、化学的な方法を用いて製造できることが知られている。例えば、リボース２’位がテトラヒドロフラニル基で保護され、リボース３’位と５’位が水酸基であるリボ核酸化合物に対し、レブリン酸と２−クロロ−１−メチルピリジニウム ヨージドを反応させる方法が知られている（例えば、非特許文献１参照）。しかし、この方法ではリボース５’位水酸基のみを選択的にレブリニル化できず、リボース３’位の水酸基のみがレブリニル化されたり、リボース３’位と５’位の両方の水酸基がレブリニル化されたりする。これらを分離するために精製工程等が必要となり、目的とするリボース５’位のみ水酸基を選択的にレブリニル化された化合物は低収率（３０％〜６８％）で得られるにとどまり、大量に原料を得るにはかなりの時間とコストが必要になる。
一方、オリゴＲＮＡの合成とは無関係なものではあるが、リボース３’位と５’位が水酸基であるリボ核酸化合物に対して、リパーゼを用いてアシル化する方法が知られている（例えば、非特許文献２参照）。リパーゼとしてＣａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ ｌｉｐａｓｅ Ｂ（ＣＡＬ−Ｂ）を使用し、位置選択的に核酸化合物のリボース５’位水酸基をアシル化するものである。また、やはりオリゴＲＮＡの合成とは無関係なものではあるが、同様の方法を利用し、ＤＮＡやリボース２’位水酸基を容易にはずれない置換基（メトキシエトキシ、メチル）で置換した核酸化合物に対し、リボース５’位水酸基を位置選択的にレブリニル化する方法が知られている（例えば、特許文献１参照）。
しかし、オリゴＲＮＡ合成には必須である、リボ核酸化合物が安定に存在できる条件で脱保護できる化合物、例えばリボース２’位の水酸基が０℃〜６０℃のいずれかの温度においてｐＨ２〜４の酸性条件下２４時間で９０％以上脱離することができる保護基を有するリボ核酸化合物に対して、リパーゼを用いて、位置選択的にレブリニル化する方法は知られていない。
Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｖｏｌ．４６， Ｎｏ．１９， ｐｐ．６６７３−６６８８， １９９０ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｖｏｌ．５８， Ｎｏ．３， ｐｐ．６５３−６６０， １９９３ ＷＯ０２／０７９２１５号パンフレット
本発明の主な目的は、オリゴＲＮＡを液相合成するために重要であるリン酸トリエステル化された新規なリボ核酸化合物を提供することにある。
また、リン酸トリエステル化されたリボ核酸化合物を製造するために重要である、リボース２’位の水酸基が０℃〜６０℃のいずれかの温度においてｐＨ２〜４の酸性条件下２４時間で９０％以上脱離することができる保護基で保護されたリボ核酸化合物に対して、リボース５’位の水酸基を位置選択的にレブリニル化する製法を提供することにある。
また、新規なオリゴＲＮＡの液相合成法を提供することにある。
本発明者らは、鋭意検討を重ねた結果、リパーゼを用いてリボース５’位の水酸基をレブリニル化することにより上記目的を達成し得ることを見出し、本発明を完成した。
本発明として、次の一般式（１）で表されるリボ核酸化合物（以下、「本発明化合物」という）を挙げることができる。

式中、Ｂは、アデニン、グアニン、シトシン若しくはウラシル又はそれらの修飾体を示す。Ｒ２０はＨ又は置換されていてもよいアルキルを示す。Ｒ２１は置換されていてもよいアリール又は１〜２環性であって置換されていてもよい複素環基を示す。Ｒ１は、０℃〜６０℃のいずれかの温度においてｐＨ２〜４の酸性条件下２４時間で９０％以上脱離することができる保護基を示す。好ましくは、１５℃〜４０℃のいずれかの温度においてｐＨ２〜４の酸性条件下２４時間で９０％以上脱離することができる保護基である。より好ましくは、２−テトラヒドロフラニル又は１，３−ジオキソラン−２−イルを挙げることができる。
Ｒ２０に係る「アルキル」としては、例えば直鎖状又は分岐鎖状の炭素数１〜４のもの、例えばメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチルを挙げることができる。Ｒ２０に係る「アルキル」は置換されていてもよく、かかる置換基としては、例えばハロゲン、アルキル、アルコキシ、シアノおよびニトロからなる群から１〜３個の同一又は異なる置換基を選ぶことができる。該「アルキル」の置換基である「ハロゲン」としては、例えばフッ素、塩素、臭素、ヨウ素を挙げることができる。該「アルキル」の置換基である「アルキル」としては、例えば直鎖状又は分岐鎖状の炭素数１〜４のもの、例えばメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチルを挙げることができる。該「アルキル」の置換基である「アルコキシ」としては、例えば直鎖状又は分岐鎖状の炭素数１〜４のもの、例えばメトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシ、イソブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシを挙げることができる。Ｒ２０は、なかでも、２−シアノエチル、２，２，２−トリクロロエチル、２，２，２−トリブロモエチルが好ましい。
Ｒ２１に係る「アリール」としては、炭素数６〜１２のもの、例えばフェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、ビフェニルを挙げることができる。該「アリール」は置換されていてもよく、かかる置換基としては、例えばハロゲン、アルキル、アルコキシ、シアノおよびニトロからなる群から選択される１〜３個の同一又は異なる置換基を選ぶことができる。該「アリール」の置換基である「ハロゲン」としては、例えばフッ素、塩素、臭素、ヨウ素を挙げることができる。該「アリール」の置換基である「アルキル」としては、例えば直鎖状又は分岐鎖状の炭素数１〜４のもの、例えばメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチルを挙げることができる。該「アリール」の置換基である「アルコキシ」としては、例えば直鎖状又は分岐鎖状の炭素数１〜４のもの、例えばメトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシ、イソブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシを挙げることができる。なかでも、２−クロロフェニル、２−クロロ−４−ｔｅｒｔ−ブチルフェニルが好ましい。
Ｒ２１に係る「１〜２環性であって置換されてもよい複素環基」としては、例えば窒素原子、酸素原子、硫黄原子からなる群から選択されるヘテロ原子１〜３個を含み、１〜６個の不飽和結合を有していてもよい、５〜１２員の単環又は縮合環を挙げることができる。かかる置換基としては、例えばアルキル、アルコキシ、ハロゲン、ニトロからなる群から選択される１〜３個の同一又は異なる置換基を挙げることができる。該「１〜２環性であって置換されてもよい複素環基」の置換基である「ハロゲン」としては、例えばフッ素、塩素、臭素、ヨウ素を挙げることができる。該「１〜２環性であって置換されてもよい複素環基」の置換基である「アルキル」としては、例えば直鎖状又は分岐鎖状の炭素数１〜４のもの、例えばメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチルを挙げることができる。該「１〜２環性であって置換されてもよい複素環基」の置換基である「アルコキシ」としては、例えば直鎖状又は分岐鎖状の炭素数１〜４のもの、例えばメトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシ、イソブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシを挙げることができる。Ｒ２１は、なかでも、１−ベンゾトリアゾール、１−モルホリノが好ましい。
ここで、「修飾体」とは、複素環塩基部分が任意の置換基で置換されている化合物をいう。
Ｂの「修飾体」に係る置換基としては、例えばハロゲン、アシル、アルキル、アリールアルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、ヒドロキシ、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、カルボキシ、シアノおよびニトロからなる群から選択される１〜３個の同一又は異なる置換基を挙げることができる。
Ｂの修飾体に係る「アルコキシ」としては、例えば直鎖状又は分岐鎖状の炭素数１〜４のもの、例えばメトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシ、イソブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシを挙げることができる。なかでも炭素数１〜４のものが好ましく、とりわけメトキシが好ましい。「アルコキシアルキル」のアルコキシ部分も、上記Ｂの修飾体に係る「アルコキシ」と同じものを挙げることができる。
Ｂの修飾体に係る「ハロゲン」としては、例えばフッ素、塩素、臭素、ヨウ素を挙げることができる。
Ｂの修飾体に係る「アルキル」としては、例えば直鎖状又は分岐鎖状の炭素数１〜４のもの、例えばメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチルを挙げることができる。「アリールアルキル」、「アルコキシアルキル」、「モノアルキルアミノ」、「ジアルキルアミノ」のアルキル部分も、上記Ｂの修飾体に係る「アルキル」と同じものを挙げることができる。Ｂの修飾体に係る「アルキル」は置換されていてもよく、かかる置換基としては、例えばハロゲン、アルキル、アルコキシ、シアノおよびニトロからなる群から１〜３個の同一又は異なる置換基を選ぶことができる。該「アルキル」の置換基である「ハロゲン」としては、例えばフッ素、塩素、臭素、ヨウ素を挙げることができる。該「アルキル」の置換基である「アルキル」としては、例えば直鎖状又は分岐鎖状の炭素数１〜４のもの、例えばメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチルを挙げることができる。該「アルキル」の置換基である「アルコキシ」としては、例えば直鎖状又は分岐鎖状の炭素数１〜４のもの、例えばメトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシ、イソブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシを挙げることができる。
Ｂの修飾体に係る「アリールアルキル」の「アリール」としては、例えば炭素数６〜１２のもの、例えばフェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、ビフェニルを挙げることができる。Ｂの修飾体に係る「アリールアルキル」の「アリール」は置換されていてもよく、かかる置換基としては、例えばハロゲン、アルキル、アルコキシ、シアノおよびニトロからなる群から選択される１〜３個の同一又は異なる置換基を選ぶことができる。該「アリール」の置換基である「ハロゲン」としては、例えばフッ素、塩素、臭素、ヨウ素を挙げることができる。該「アリール」の置換基である「アルキル」としては、例えば直鎖状又は分岐鎖状の炭素数１〜４のもの、例えばメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチルを挙げることができる。該「アリール」の置換基である「アルコキシ」としては、例えば直鎖状又は分岐鎖状の炭素数１〜４のもの、例えばメトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシ、イソブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシを挙げることができる。
Ｂの修飾体に係る「アシル」としては、例えば直鎖状又は分岐鎖状の炭素数１〜６のアルカノイル、炭素数７〜１３のアロイルを挙げることができる。例えば、ホルミル、アセチル、プロピオニル、ブチリル、イソブチリル、バレリル、ヘキサノイル、ベンゾイル、ナフトイルを挙げることができる。Ｂの修飾体に係る「アシル」は置換されていてもよく、かかる置換基としては、例えばハロゲン、アルキル、アルコキシ、シアノおよびニトロからなる群から選択される１〜３個の同一又は異なる置換基を選ぶことができる。該「アシル」の置換基である「ハロゲン」としては、例えばフッ素、塩素、臭素、ヨウ素を挙げることができる。該「アシル」の置換基である「アルキル」としては、例えば直鎖状又は分岐鎖状の炭素数１〜４のもの、例えばメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチルを挙げることができる。該「アシル」の置換基である「アルコキシ」としては、例えば直鎖状又は分岐鎖状の炭素数１〜４のもの、例えばメトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシ、イソブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシを挙げることができる。例えば、Ｂがアデニン、シトシン及びグアニンの場合、アミノ基をアシル基で置換することによって、アシル基は保護基としての役割を果たす。具体的には、アデニン及びシトシンに対しては、例えば４−アニソイルを、グアニンに対しては、例えばイソブチリルを挙げることができる。
本発明化合物はそのまま用いることもできるが、常法により塩の形で用いることもできる。かかる「塩」としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウム塩などのアルカリ土類金属塩又は、トリエチルアミン、ピリジンなどの三級有機アミン塩を挙げることができる。
本発明化合物の具体例としては、次の（１）〜（８）のリボ核酸化合物を挙げることができる。
（１）２−シアノエチル ２−クロロフェニル ５’−Ｏ−レブリニル−２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ４−（４−アニソイル）シチジン−３’−イル ホスフェート
（２）２−クロロフェニル ５’−Ｏ−レブリニル−２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ４−（４−アニソイル）シチジン−３’−イル ホスフェート
（３）２−シアノエチル ２−クロロフェニル ５’−Ｏ−レブリニル−２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）ウリジン−３’−イル ホスフェート
（４）２−クロロフェニル ５’−Ｏ−レブリニル−２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）ウリジン−３’−イル ホスフェート
（５）２−シアノエチル ２−クロロフェニル ５’−Ｏ−レブリニル−２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ６−（４−アニソイル）アデノシン−３’−イル ホスフェート
（６）２−クロロフェニル ５’−Ｏ−レブリニル−２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ６−（４−アニソイル）アデノシン−３’−イル ホスフェート
（７）２−シアノエチル ２−クロロフェニル ５’−Ｏ−レブリニル−２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ２−イソブチリルグアノシン−３’−イル ホスフェート
（８）２−クロロフェニル ５’−Ｏ−レブリニル−２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ２−イソブチリルグアノシン−３’−イル ホスフェート
また、本発明として例えば、次の（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかの工程を有する、リボース５’位の水酸基を位置選択的にレブリニル化するリボ核酸化合物の製法を挙げることができる。
（Ａ）次の一般式（２）で表されるリボ核酸化合物にレブリニル化剤とリパーゼとを作用させることによって、５’位の水酸基を位置選択的にレブリニル化することを特徴とする、次の一般式（３）で表されるリボ核酸化合物の製法。


式中、Ｂ、Ｒ１は、前記と同義である。
（Ｂ）次の一般式（２）で表されるリボ核酸化合物にレブリニル化剤とリパーゼとを作用させることによって、５’位の水酸基を位置選択的にレブリニル化する工程を有することを特徴とする製法により製造される、次の一般式（３）で表されるリボ核酸化合物に対して、リン酸化試薬を作用させることにより、次の一般式（１ａ）で表されるリボ核酸化合物の製法。

式中、Ｂ、Ｒ１、Ｒ２１は、前記と同義である。
（Ｃ）次の一般式（２）で表されるリボ核酸化合物にレブリニル化剤とリパーゼとを作用させることによって、５’位の水酸基を位置選択的にレブリニル化する工程を有することを特徴とする製法により製造される、次の一般式（３）で表されるリボ核酸化合物に対して、リン酸化試薬とリン酸基を保護する試薬とを作用させることにより、次の一般式（１ｂ）で表されるリボ核酸化合物の製法。
式中、Ｂ、Ｒ１、Ｒ２１は、前記と同義である。Ｒ２２は置換されていてもよいアルキルを示す。
Ｒ２２に係る「アルキル」及びその置換基としては、例えば前記Ｒ２０と同じものを挙げることができる。
本発明に係る「リパーゼ」としては、例えば、それぞれの基質に適合するリパーゼを挙げることができる。好ましくは、例えばＣａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ ｌｉｐａｓｅ Ｂ（Ｎｏｖｏｚｙｍ４３５：ノボ・ノルディスク社製）、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｔｒｉａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ ｌｉｐａｓｅ （ＬＩＰＡＳＥ−ＱＬ：名糖産業（株）社製）を挙げることができる。
本発明に係る「レブリニル化剤」としては、例えばレブリン酸、レブリン酸無水物、レブリン酸エステル、レブリン酸ハロゲン化物を挙げることができる。かかる「レブリン酸エステル」としては、例えばレブリン酸メチル、レブリン酸エチル、レブリン酸ビニルを挙げることができる。かかる「レブリン酸ハロゲン化物」としては、例えばレブリン酸フルオリド、レブリン酸クロリド、レブリン酸ブロミド、レブリン酸ヨージドを挙げることができる。なかでも、レブリン酸無水物が好ましい。
本発明に係る「リン酸化試薬」としては、例えば２−クロロフェニルホスホロジトリアゾリド、２−クロロフェニル−Ｏ，Ｏ−ビス（１−ベンゾトリアゾリル）ホスフェート又は２−クロロ−４−ｔｅｒｔ−ブチルフェニルホスホロジトリアゾリドを挙げることができる。
「リン酸基を保護する試薬」としては、例えば３−ヒドロキシプロピオニトリル又は２，２，２−トリクロロエタノ−ルを挙げることができる。
また、本発明として、例えば、次の（ａ）〜（ｆ）工程を有する，次の一般式（４）で表されるオリゴ核酸化合物の液相合成法を挙げることができる。

［式中、各Ｂｘは、独立して、アデニン、グアニン、シトシン、ウラシル若しくはチミン又はそれらの修飾体を示す。
ｑは、１〜１００の範囲内である整数を示す。ｑは、１０〜５０の範囲内である整数であってもよく、またより好ましくは１５〜３０の範囲内である整数であってもよい。
各Ｒ’は、少なくとも一つは水酸基であり、それ以外は独立してＨ、又は水酸基を示す。］
Ｂｘの修飾体に係る置換基としては、例えばハロゲン、アルキル、アリールアルキル、アルコキシ、ヒドロキシ、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、カルボキシ、シアノおよびニトロからなる群から１〜３個の同一又は異なる置換基を選ぶことができる。
Ｂｘの修飾体に係る「ハロゲン」、「アルキル」、「アルコキシ」、「アリールアルキル」の「アリール」としては、前記Ｂと同じものを挙げることができる。
（ａ）次の一般式（２）で表されるリボ核酸化合物にレブリニル化剤とリパーゼとを作用させることによって、５’位の水酸基を位置選択的にレブリニル化して、次の一般式（３）で表されるリボ核酸化合物を製造する工程、
［式中、Ｂ、Ｒ１は、前記と同義である。「リパーゼ」、「レブリニル化剤」も、前記と同義である。］
（ｂ）上記（ａ）の工程により製造されるリボ核酸化合物（３）に対して、リン酸化試薬を作用させることによって、３’位の水酸基をリン酸化して、次の一般式（１ａ）で表されるリボ核酸化合物を製造する工程、
［式中、Ｂ、Ｒ１、Ｒ２１は、前記と同義である。「リン酸化試薬」も、前記と同義である。］
（ｃ）一方、上記（ｂ）とは別に、上記（ａ）の工程により製造されるリボ核酸化合物（３）に対して、リン酸化試薬とリン酸基を保護する試薬とを作用させることによって、次の一般式（１ｂ）で表されるリボ核酸化合物を製造する工程、

［式中、Ｂ、Ｒ１、Ｒ２１、Ｒ２２、「リン酸化試薬」、「リン酸基を保護する試薬」は、前記と同義である。］
（ｄ）上記工程（ｃ）の工程により製造されるリボ核酸化合物（１ｂ）に対して、リボース５’位の水酸基を保護しているレブリニル基を除去して、次の一般式（５）で表されるリボ核酸化合物を製造する工程、
［式中、Ｂ、Ｒ１、Ｒ２１、Ｒ２２は、前記と同義である。本発明に係る「レブリニル基を除去する試薬」としては、例えば、０．５Ｍヒドラジン一水和物／ピリジン―酢酸（４：１）溶液を挙げることができる。］
（ｅ）上記（ｂ）又は（ｄ）の工程により製造されるリボ核酸化合物（１ａ）又は（５）を少なくとも一つは構成モノマーとして使用する段階的オリゴマー化の工程、
「構成モノマー」とは、オリゴ核酸化合物を構成するデオキシリボ核酸化合物、リボ核酸化合物又はその修飾体をいう。
「構成モノマー」に係る「修飾体」としては、前記と同じものを挙げることができる。
「段階的オリゴマー化」とは、核酸重合度が２〜１０１のオリゴ核酸化合物又は核酸重合度が２〜１００のオリゴ核酸ブロックを製造するための縮合工程と選択的脱保護工程を含んでおり、縮合工程としては、核酸モノマーブロックどうしの縮合工程、核酸モノマーブロックと核酸重合度が２〜１００のオリゴ核酸ブロックの縮合工程、又は核酸重合度が２〜９９の異なるオリゴ核酸ブロックどうしの縮合工程を挙げることができる。具体的には、目的とするオリゴ核酸化合物の核酸重合度に応じて、任意に選択された核酸モノマーブロック又はオリゴ核酸ブロックを縮合することによって、オリゴ核酸化合物を製造することができる。例えば、核酸重合度が３０であるオリゴ核酸を製造する場合において、核酸モノマーブロックと核酸重合度２９のオリゴ核酸ブロックとを使用する製法、又は核酸重合度５のオリゴ核酸ブロックと核酸重合度２５のオリゴ核酸ブロックとを使用する製法を考えることができる。
「核酸モノマーブロック」とは、オリゴ核酸化合物を製造するためのデオキシリボ核酸化合物、リボ核酸化合物又はそれらの修飾体である。「修飾体」としては、前記と同じものを挙げることができる。
「オリゴ核酸ブロック」とは、オリゴ核酸化合物を合成するためのデオキシリボ核酸化合物、リボ核酸化合物又はそれらの修飾体を構成モノマーとする核酸重合度が２〜１００の化合物である。「修飾体」としては、前記と同じものを挙げることができる。
「核酸重合度」は、オリゴ核酸化合物を構成する核酸モノマーの総数を示す。
本発明において使用する「核酸モノマーブロック」、「オリゴ核酸ブロック」としては、次の一般式（８）と（９）の化合物を挙げることができる。
次の一般式（８）で表される化合物は、核酸モノマーブロック（ｍ＝０）又はオリゴ核酸ブロック（ｍ＝１〜９９）を示す。
式中、各Ｂ’は、独立してアデニン、グアニン、シトシン、ウラシル若しくはチミン又はそれらの修飾体を示す。
各Ｂ’の「修飾体」に係る置換基としては、前記Ｂと同じものを挙げることができる。
Ｒ２はアシル、置換されていてもよいリン酸基を示す。
各Ｒｋ１は、独立して置換されていてもよいアリール又は１〜２環性であって置換されていてもよい複素環基を示す。Ｒｋ１に係る「アリール」、その置換基、「１〜２環性であって置換されていてもよい複素環基」及びその置換基としては、前記Ｒ２１と同じものを挙げることができる。
ｍは、０〜９９の範囲内である整数を示す。
Ｒ２に係る「アシル」としては、例えば直鎖状又は分岐鎖状の炭素数１〜６のアルカノイル、炭素数７〜１３のアロイルを挙げることができ、例えばホルミル、アセチル、プロピオニル、ブチリル、イソブチリル、バレリル、ヘキサノイル、ベンゾイル、ナフトイルを挙げることができる。Ｒ２に係る「アシル」は置換されていてもよく、かかる置換基としては、例えばハロゲン、アルキル、アルコキシ、シアノおよびニトロからなる群から選択される１〜３個の同一又は異なる置換基を選ぶことができる。該「アシル」の置換基である「ハロゲン」としては、例えばフッ素、塩素、臭素、ヨウ素を挙げることができる。該「アシル」の置換基である「アルキル」としては、例えば直鎖状又は分岐鎖状の炭素数１〜４のもの、例えばメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチルを挙げることができる。該「アシル」の置換基である「アルコキシ」としては、例えば直鎖状又は分岐鎖状の炭素数１〜４のもの、例えばメトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシ、イソブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシを挙げることができる。
Ｒ２に係る「置換されていてもよいリン酸基」の置換基としては、置換されていてもよいアリール、１〜２環性であって置換されていてもよい複素環基又は置換されていてもよいアルキルを挙げることができる。「アリール」、その置換基、「１〜２環性であって置換されていてもよい複素環基」及びその置換基は、前記Ｒ２１と同じものを挙げることができる。「アルキル」及びその置換基としては、前記Ｒ２２と同じものを挙げることができる。
各Ｒは、Ｈ又は０℃〜６０℃のいずれかの温度においてｐＨ２〜４の酸性条件下２４時間で９０％以上脱離することができる保護基によって置換された水酸基を示す。好ましくは、Ｈ又は１５℃〜４０℃のいずれかの温度においてｐＨ２〜４の酸性条件下２４時間で９０％以上脱離することができる保護基で置換された水酸基である。より好ましくは、Ｈ、２−テトラヒドロフラニル又は１，３−ジオキソラン−２−イルで置換された水酸基を挙げることができる。
次の一般式（９）で表される化合物は、核酸モノマーブロック（ｎ＝１）又はオリゴ核酸ブロック（ｎ＝２〜１００）を示す。
式中、各Ｂ’、各Ｒは、前記と同義である。
各Ｒｋ２は、独立して置換されていてもよいアリール又は１〜２環性であって置換されていてもよい複素環基を示す。Ｒｋ２に係る「アリール」、その置換基、「１〜２環性であって置換されていてもよい複素環基」及びその置換基としては、前記Ｒ２１と同じものを挙げることができる。
Ｒ３は、レブリニル又は４，４’−ジメトキシトリチルを示す。
ｎは、１〜１００の範囲内である整数を示す。
「縮合工程」は、下記の４つに分類できる。
（ｉ）核酸モノマーブロックと核酸モノマーブロックの縮合工程
核酸モノマーブロックの少なくとも一つが、リボ核酸化合物（１ａ）又は（５）である、核酸モノマーブロックどうしの縮合工程。
（ｉｉ）核酸モノマーブロックと核酸重合度が２〜１００のオリゴ核酸ブロックの縮合工程（１）
核酸モノマーブロックが、リボ核酸化合物（１ａ）又は（５）であり、核酸重合度が２〜１００のオリゴ核酸ブロックが化合物（８）又は（９）である、核酸モノマーブロックと核酸重合度が２〜１００のオリゴ核酸ブロックの縮合工程。
（ｉｉｉ）核酸モノマーブロックと核酸重合度が２〜１００のオリゴ核酸ブロックの縮合工程（２）
核酸モノマーブロックが、化合物（８）又は（９）であり、核酸重合度が２〜１００のオリゴ核酸ブロック（８）又は（９）が、構成モノマーとしてリボ核酸化合物（１ａ）又は（５）の少なくとも一つを含む、核酸モノマーブロックと核酸重合度が２〜１００のオリゴ核酸ブロックの縮合工程。
（ｉｖ）核酸重合度が２〜９９の異なるオリゴ核酸ブロックどうしの縮合工程
核酸重合度が２〜９９のオリゴ核酸ブロック（８）又は（９）が、構成モノマーとしてリボ核酸化合物（１ａ）又は（５）の少なくとも一つを含む、核酸重合度が２〜９９の異なるオリゴ核酸ブロック（８）と（９）の縮合工程。
上記（ｉ）〜（ｉｖ）で示される縮合工程は、核酸モノマーブロック又はオリゴ核酸ブロックの５’位水酸基と、他の核酸モノマーブロック又はオリゴ核酸ブロックの３’位水酸基に置換しているリン酸基とを、縮合試薬を作用させることによって縮合する工程である。
本発明に係る「縮合試薬」としては、例えば１−（２−メシチレンスルホニル）−３−ニトロ−１，２，４−トリアゾール、２，４，６−トリメチルベンゼンスルホニルテトラゾール又は１−（２，４，６−トリイソプロピルベンゼンスルホニル）−３−ニトロ−１，２，４−トリアゾールを挙げることができる。
「選択的脱保護過程」とは、縮合工程で製造されたオリゴ核酸化合物において、５’末端構成モノマーの５’位水酸基に置換している保護基である、例えば、レブリニル基又は３’末端構成モノマーの３’位水酸基に置換しているリン酸基上の保護基である、例えばシアノエチル基を除去する工程をいう。
「レブリニル基を除去する試薬」は、前記と同義である。
本発明に係るリボース３’位水酸基に置換しているリン酸基上の保護基である「シアノエチル基を除去する試薬」としては、例えば、ピリジン−トリエチルアミン−水（３：１：１）溶液を挙げることができる。
製造される保護されたオリゴ核酸化合物の具体例としては、例えば次の一般式（６）で表されるものを挙げることができる。
式中、各Ｂ’は、独立して前記と同義である。
各Ｒｏは、独立してＨ、置換されていてもよいアリール又は１〜２環性であって置換されていてもよい複素環基を示す。好ましくは、独立してＨ、置換されていてもよいフェニル又は１〜２環性であって置換されていてもよい複素環基が挙げられる。より好ましくは、２−クロロフェニル又は２−クロロ−４−ｔｅｒｔ−ブチルフェニルが挙げられる。Ｒｏに係る「アリール」、「１〜２環性であって置換されていてもよい複素環基」及びその置換基としては、前記Ｒ２１と同じものを挙げることができる。
Ｒ３ａはＨ、レブリニル又は４，４’−ジメトキシトリチルを表す。
ｑは、前記と同義である。
各Ｒ１ａは、少なくとも一つは、０℃〜６０℃のいずれかの温度においてｐＨ２〜４の酸性条件下２４時間で９０％以上脱離することができる保護基によって置換された水酸基であり、それ以外は独立してＨ、又は０℃〜６０℃のいずれかの温度においてｐＨ２〜４の酸性条件下２４時間で９０％以上脱離することができる保護基によって置換された水酸基を示す。好ましくは、Ｈ又は１５℃〜４０℃のいずれかの温度においてｐＨ２〜４の酸性条件下２４時間で９０％以上脱離することができる保護基で置換された水酸基である。より好ましくは、Ｈ、２−テトラヒドロフラニル又は１，３−ジオキソラン−２−イルで置換された水酸基を挙げることができる。
Ｒ２ａは、アシル又は次の一般式（７）で表されるリン酸基を示す。
式中、Ｒ２ａａは、置換されていてもよいアリール又は１〜２環性であって置換されていてもよい複素環基を示す。Ｒ２ａｂは、Ｈ又は置換されていてもよいアルキルを示す。
Ｒ２ａａに係る「アリール」、その置換基、「１〜２環性であって置換されていてもよい複素環基」及びその置換基としては、前記Ｒ２１と同じものを挙げることができる。好ましくは、２−クロロフェニル又は２−クロロ−４−ｔｅｒｔ−ブチルフェニルが挙げられる。
Ｒ２ａｂに係る「アルキル」及びその置換基としては、前記Ｒ２２と同じものを挙げることができる。
Ｒ２ａに係る「アシル」としては、前記Ｒ２と同じものを挙げることができる。］
（ｆ）上記（ｅ）の工程により製造される保護されたオリゴ核酸化合物（６）の保護基をすべて脱保護する工程。
各保護基を除去するための試薬としては次のものが考えられる。
１）Ｎ１，Ｎ１，Ｎ３，Ｎ３−テトラメチルグアニジン及びピリジン−２−カルボキサアルドキシム
２）濃アンモニア水
３）酢酸緩衝液（ｐＨ＝３〜４）
４）８０％酢酸水溶液
５）希塩酸溶液（ｐＨ＝２〜４）
但し、３）〜５）の試薬については、そのうち一つを使用すればよいが、好ましくは、３）を使用するのがよい。
「酢酸緩衝液」としては、例えば、酢酸ナトリウム−酢酸緩衝液、又はテトラメチルエチレンジアミン−酢酸緩衝液を挙げることができる。
本発明は次のように実施することができる。
下記の製法において、原料が反応させたくない置換基（例えば、ヒドロキシ、アミノ、カルボキシ）を有する場合は、原料をあらかじめ公知の方法により、保護基（例えば、ベンゾイル又は４−アニソイル基）で保護した後に反応に用いるのが一般的である。反応後に、接触還元、アルカリ処理、酸処理などの公知の方法により保護基を脱離することができる。
工程（ａ）（リボ核酸のリボース５’位水酸基にレブリニル化する製造法）
式中、Ｂ、Ｒ１、「リパーゼ」、「レブリニル化剤」は、前記と同義である。
本発明におけるリボ核酸５’位の水酸基にレブリニル基を導入する方法において、化合物（２）と過剰のレブリニル化試薬を適当な溶媒中に懸濁し、リパーゼと反応させることにより、望むリボース５’位水酸基にレブリニル化された生成物（３）を選択的に得ることができる。
レブリニル化試薬の使用量は、化合物（２）に対して、１〜２０倍モル量がよく、より好ましくは、１〜１０倍モル量である。
使用する溶媒としては、反応に関与しなければ特に限定されないが、例えばテトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、１，４−ジオキサンなどのエーテル類、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミドなどのアミド類、アセトニトリル、プロピオニトリルなどのニトリル類、ベンゼン、トルエンなどの炭化水素又はこれらの混合溶媒が挙げられる。
上記反応における反応温度は、酵素活性の至適温度である、２０℃〜５０℃が好ましい。反応時間は、使用する原料の種類、反応温度によって異なるが、通常３０分〜１００時間が適当である。
工程（ｂ）（リボ核酸のリボース３’位水酸基にリン酸誘導体化する製法−その１）
式中、Ｂ、Ｒ１、Ｒ２１、「リン酸化試薬」は、前記と同義である。
本発明において、リボ核酸化合物（３）に有機塩基存在下においてリン酸化試薬と作用させることによって、高度に保護されたリボ核酸化合物（１ａ）を製造することができる。使用する溶媒としては、反応に関与しなければ特に限定されないが、例えばテトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、１，４−ジオキサンなどのエーテル類、アセトニトリル、プロピオニトリルなどのニトリル類、ベンゼン、トルエンなどの炭化水素水又はこれらの混合溶媒が挙げられる。リン酸導入試薬は、化合物（３）に対して、１〜２０倍モル量、より好ましくは、１〜１０倍モル量である。
反応温度は、例えば−２０℃〜１００℃が適当であり、０℃〜８０℃が好ましく、５℃〜３０℃がより好ましい。反応時間は、使用する原料の種類、反応温度によって異なるが、通常３０分〜１００時間が適当である。
工程（ｃ）（リボ核酸のリボース３’位水酸基にリン酸誘導体化する製法−その２）
式中、Ｂ、Ｒ１、Ｒ２１、Ｒ２２、「リン酸化試薬」、「リン酸基を保護する試薬」は、前記と同義である。
本発明において、リボ核酸化合物（３）に有機塩基存在下においてリン酸化試薬とリン酸基を保護する試薬とを作用させることによって、高度に保護されたリボ核酸化合物（１ｂ）を製造することができる。使用する溶媒としては、反応に関与しなければ特に限定されないが、例えば、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、１，４−ジオキサンなどのエーテル類、アセトニトリル、プロピオニトリルなどのニトリル類、ベンゼン、トルエンなどの炭化水素又はこれらの混合溶媒が挙げられる。リン酸導入試薬の使用量は、化合物（３）に対して、１〜２０倍モル量、より好ましくは、１〜１０倍モル量である。リン酸基を保護するための試薬の使用量は、化合物（３）に対して、１〜２０倍モル量、より好ましくは、１〜１０倍モル量である。反応温度は、例えば−２０℃〜１００℃が適当であり、０℃〜８０℃が好ましく、５℃〜３０℃がより好ましい。反応時間は、使用する原料の種類、反応温度によって異なるが、通常３０分〜１００時間が適当である。
工程（ｄ）（リボース５’位の水酸基を保護しているレブリニル基を除去する工程）
式中、Ｂ、Ｒ１、Ｒ２１、Ｒ２２、「レブリニル基を除去する試薬」は前記と同義である。
化合物（１ｂ）に、レブリニル基を除去する試薬を加えることにより、化合物（５）を製造することができる。本反応は、無溶媒または適当な溶媒中で行われる。使用される溶媒は、反応に関与しなければ特に限定されないが、例えば、メタノール、エタノールなどのアルコール類、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、１，４−ジオキサンなどのエーテル類、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミドなどのアミド類、アセトニトリル、プロピオニトリルなどのニトリル類、ベンゼン、トルエンなどの炭化水素又はこれらの混合溶媒が挙げられる。レブリニル基を除去するための試薬の使用量は、化合物（１ｂ）に対して、１〜２０倍モル量、より好ましくは、１〜１０倍モル量である。反応温度は、例えば−２０℃〜１００℃が適当であり、０℃〜８０℃が好ましく、１５℃〜６５℃がより好ましい。反応時間は、使用する原料の種類、反応温度によって異なるが、通常３０分〜１００時間が適当である。
オリゴ核酸化合物の液相合成法を以下に示す。
工程（ｅ）（段階的オリゴ核酸の製造方法−その１）
本工程は、オリゴ核酸化合物の段階的製造過程において、一般式（１ａ）又は（５）で表されるリボ核酸化合物を構成モノマーとして少なくとも一つは用いられる段階的オリゴマー化である。段階的オリゴマー化は、縮合工程と選択的脱保護工程から成っている。
縮合工程において、縮合試薬を作用させることにより、オリゴ核酸化合物又はオリゴ核酸ブロックを製造することができる。通常、適当な溶媒中、過剰の有機アミン存在下において反応を行う。使用する溶媒としては、反応に関与しなければ特に限定されないが、例えばテトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、１，４−ジオキサンなどのエーテル類、アセトニトリル、プロピオニトリルなどのニトリル類、ベンゼン、トルエンなどの炭化水素、ピリジンなどの有機アミン類又はこれらの混合溶媒が挙げられる。有機アミンとしては、ピリジンなどが挙げられる。縮合試薬の使用量は、（１ａ）、（５）で表されるリボ核酸化合物又は（８）、（９）で表される核酸モノマーブロック若しくはオリゴ核酸ブロックに対して、１〜２０倍モル量、より好ましくは、１〜１０倍モル量である。上記反応における反応温度は、例えば−２０℃〜１００℃が適当であり、０℃〜８０℃が好ましく、５℃〜３０℃がより好ましい。反応時間は、使用する原料の種類、反応温度によって異なるが、通常３０分〜１００時間が適当である。
選択的脱保護工程は、上記縮合工程で製造されるオリゴ核酸ブロックを次の縮合工程に使用できるように脱保護する試薬を作用し、選択的に脱保護されたオリゴ核酸ブロックを製造する工程である。具体的には、上記縮合工程で製造されたオリゴ核酸ブロックにおいて、５’末端の核酸分子５’位水酸基に置換している保護基である、例えば、レブリニル基、又は３’末端の核酸分子３’位水酸基に置換しているリン酸基上の保護基である、例えばシアノエチル基を除去する工程である。
「レブリニル基を除去する試薬」、「シアノエチル基を除去する試薬」は、前記と同義である。
特に、最終的にオリゴ核酸化合物を製造する工程では、Ｒ３が、４，４−ジメトキシトリチル基のような脂溶性の非常に高い保護基を備えた一般式（８）、（９）で表される核酸モノマーブロック又はオリゴ核酸ブロックを縮合過程に使用することが好ましい。反応終了後、精製過程において核酸化合物由来の不純物と分離する工程において好都合であり、脱保護工程において各リボース２’位の保護基と同じ条件で脱保護できるので、工程を減らすことができる利点がある。
工程（ｆ）（段階的オリゴ核酸の製造方法−その２）
式中、各Ｂｘ、Ｒ’、Ｒ０、Ｒ１ａ、Ｒ２ａ、Ｒ３ａ 、ｑは、前記と同義である。
化合物（６）に、各保護基を脱保護する試薬を加え、反応することにより化合物（４）を得ることができる。使用する溶媒としては、反応に関与しなければ特に限定されないが、例えばテトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、１，４−ジオキサンなどのエーテル類、ピリジンなどの有機アミン類、２８％アンモニア水溶液又はこれらの混合溶媒が挙げられる。有機アミンとしては、ピリジンなどが挙げられる。上記反応における反応温度は、例えば−２０℃〜１００℃が適当であり、０℃〜８０℃が好ましく、１０℃〜６０℃がより好ましい。反応時間は、使用する原料の種類、反応温度によって異なるが、通常３０分〜１００時間が適当である。
本発明に係る化合物は、上記の反応混合物から通常の分離精製手段、例えば、抽出、濃縮、中和、濾過、遠心分離、再結晶、シリカゲルカラムクロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、逆層ＯＤＳカラムクロマトグラフィー、疎水カラムクロマトグラフィー、イオン交換カラムクロマトグラフィー、ゲルろ過カラムクロマトグラフィー、透析、限外ろ過などの手段を用いることにより単離精製することができる。
以下に参考例、実施例を掲げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
参考例１
２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ４ −（４−アニソイル）シチジン
工程１ ３’，５’−Ｏ−（１，１，３，３−テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−２’−Ｏ−トリメチルシリル−Ｎ ４ −（４−アニソイル）シチジンの合成
シチジン ２０．０ｇを無水のピリジン２００ｍｌに懸濁し、１，３−ジクロロ−１，１，３，３−テトライソプロピルジシロキサン２７．２ｇを滴下し１０分間撹拌後、室温に戻し９０分間撹拌した。反応液に０℃下トリメチルシリルクロリド ２０．６ｇを滴下し、室温下２時間撹拌した。次いで４−アニソイルクロリド２８．１ｇを滴下し、室温下１．５時間撹拌し、反応液に氷水６０ｍｌを加え１０分間撹拌後、アンモニア水２５ｍｌを加え、室温下３０分間撹拌した。反応液を水４００ｍｌに注ぎ、ジクロロメタンにて抽出し、ジクロロメタン層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液および飽和食塩水にて洗浄し、乾燥、濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝３：１〜１：１）にて精製し、上記化合物３９．５ｇを得た。
工程２ ３’，５’−Ｏ−（１，１，３，３−テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−Ｎ ４ −（４−アニソイル）シチジンの合成
３’，５’−Ｏ−（１，１，３，３−テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−２’−Ｏ−トリメチルシリル−Ｎ４−（４−アニソイル）シチジン３９．５ｇをジクロロメタン２００ｍｌ、メタノール２００ｍｌに溶解し、ピリジウムｐ−トルエンスルホン酸７．２ｇを加え、６５℃下３時間撹拌した。トリエチルアミンを加え中和し、濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝１：２〜１：４）にて精製し、上記化合物３４．０ｇを得た。
工程３ ３’，５’−Ｏ−（１，１，３，３−テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ４ −（４−アニソイル）シチジンの合成
３’，５’−Ｏ−（１，１，３，３−テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−Ｎ４−（４−アニソイル）シチジン ３０．０ｇ、２，３−ジヒドロフラン１０．２ｇを無水のテトラヒドロフラン１５０ｍｌに溶解し、０℃下カンファースルホン酸５．６２ｇを少量ずつ加え、室温下１時間撹拌した。飽和炭酸水素ナトリウム水溶液中に注ぎ、酢酸エチルにて抽出し、飽和食塩水にて洗浄後、乾燥、濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝１：３）にて精製し、上記化合物３１．５ｇを得た。
工程４ ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ４ −（４−アニソイル）シチジンの合成
３’，５’−Ｏ−（１，１，３，３−テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ４−（４−アニソイル）シチジン ３３．２ｇを無水のテトラヒドロフラン８０ｍｌに溶解し、１Ｍテトラ−ｎ−ブチルアンモニウムフルオリド／テトラヒドロフラン溶液９７ｍｌを１５分かけて滴下し、室温下１時間撹拌した。反応液を濃縮し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、ジクロロメタンにて抽出し、飽和食塩水にて洗浄後、乾燥、濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（３％メタノール／ジクロロメタン〜５％メタノール／ジクロロメタン）にて精製し、目的化合物７．１１ｇを得た。
参考例２
チミジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル チミジン ３’−アセテート
工程１ ３’−Ｏ−アセチルチミジンの合成
５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）チミジン２．０ｇをピリジン共沸後、０℃下無水酢酸０．７５ｇを加え室温下２１時間撹拌した。濃縮後クロロホルムに溶解し飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水にて洗浄し、乾燥、濃縮した。残渣をｎ−ヘキサンにて洗浄し、乾燥して５’−Ｏ−（４，４−ジメトキシトリチル）−３’−Ｏ−アセチルチミジン１．８４ｇを得た。
上記、 ５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−３’−Ｏ−アセチルチミジン１．８４ｇをジクロロメタン３０ｍｌに溶解し、０．３８Ｍベンゼンスルホン酸／メタノール１６．５ｍｌを０℃下滴下し、１５分間撹拌した。反応液に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えジクロロメタンにて抽出し、乾燥、濃縮した。残渣をエーテルにて洗浄し、乾燥して上記化合物０．３２ｇを得た。
工程２ ２−クロロフェニル ５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）チミジン−３’−イル ホスフェート トリエチルアミン塩の合成
５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）チミジン２．０ｇをピリジン共沸後、０．２８Ｍの２−クロロフェニルホスホロジトリアゾリド／ジオキサン溶液２０ｍｌを加え、室温下１時間撹拌した。５０％ピリジン水溶液８ｍｌを加え濃縮した。残渣に０．２Ｍ炭酸水素トリエチルアンモニウム水溶液２０ｍｌを加え、ジクロロメタン抽出した。ジクロロメタン層を０．２Ｍ炭酸水素トリエチルアンモニウム水溶液２０ｍｌで２回洗浄し、乾燥、濃縮した。残渣を酢酸エチル、ｎ−ヘキサンから結晶化し、乾燥して上記化合物１．８８ｇを得た。
工程３ ５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）チミジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル チミジン ３’−アセテートの合成
２−クロロフェニル ５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）チミジン−３’−イル ホスフェート トリエチルアミン塩および３’−Ｏ−アセチルチミジンをピリジン共沸後、無水ピリジン３ｍｌに溶解し、１−（２−メシチレンスルホニル）−３−ニトロ−１，２，４−トリアゾール（ＭＳＮＴ）０．７１ｇを加え室温下１時間撹拌した。反応液に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、ジクロロメタンで抽出し、乾燥、濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（２％メタノール／クロロホルム〜４％メタノール／クロロホルム、０．１％ピリジン含有）にて精製し、上記化合物１．０６ｇを得た。
工程４ チミジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル チミジン ３’−アセテートの合成
５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）チミジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル チミジン ３’−アセテート１．０５ｇをジクロロメタン１０ｍｌに溶解し、０．３８Ｍベンゼンスルホン酸／メタノール溶液５．２ｍｌを０℃下滴下し、３０分間撹拌した。反応液を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水にて洗浄し、乾燥、濃縮し、目的化合物０．６９ｇを得た。
参考例３
２−クロロフェニル ５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ２ −イソブチリルグアノシン−３’−イル ホスフェート トリエチルアミン塩
工程１ Ｎ ２ −イソブチリルグアノシンの合成
グアノシン２０．０ｇをクロロホルム５４０ｍｌとピリジン７０ｍｌに懸濁し、イソ酪酸クロリド４８ｍｌを滴下し、室温下２時間撹拌した。反応液に氷水冷撹拌下、１Ｎ塩酸を加えジクロロメタンで抽出した。有機層を水、続いて１Ｎ炭酸ナトリウム水溶液で洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥し減圧濃縮した。残渣をトルエン共沸後、メタノール５４ｍｌに溶解し、氷水冷撹拌下２８％ナトリウムメトキシド／メタノール溶液５４ｍｌをゆっくりと滴下して１０分間撹拌した。反応液をダウエックス（Ｈフォーム）にて中和後、ろ過してダウエックスを除きメタノールでよく洗浄した。母液と洗液を合わせ、減圧下濃縮した。残渣を少量のメタノールに溶解し、アセトン中にゆっくり滴下し粉末とした。得られた粉末を集め、上記化合物を１７．９ｇ得た。
ＭＳ ｍ／ｚ： ３５４［ＭＨ］＋
工程２ ３’，５’−Ｏ−（１，１，３，３−テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−Ｎ ２ −イソブチリルグアノシンの合成
Ｎ２−イソブチリルグアノシン１６．９ｇをピリジン１００ｍｌに溶解し、氷水冷撹拌下１，３−ジクロロ−１，１，３，３−テトライソプロピルジシロキサン１６．６ｇを滴下して室温で４時間撹拌した。反応液を水中に滴下し、得られた結晶を集め、乾燥した。 粗結晶をエタノールから再結晶し、上記化合物３０．３ｇを得た。
融点１７９−１８３℃
ＭＳ ｍ／ｚ： ５９６［ＭＨ］＋
工程３ ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ２ −イソブチリルグアノシンの合成
３’，５’−Ｏ−（１，１，３，３−テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−Ｎ２−イソブチリルグアノシン３０．０ｇをテトラヒドロフラン３３０ｍｌに溶解し、２，３−ジヒドロフラン７．８３ｇと（＋）−カンファースルホン酸６．４９ｇを加え室温で２時間撹拌した後、氷水冷撹拌下１Ｍテトラ−ｎ−ブチルアンモニウムフルオリド／テトラヒドロフラン溶液５５．０ｍｌを滴下し１０分間撹拌した。反応液を減圧下濃縮した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（１％メタノール／ジクロロメタン〜２％メタノール／ジクロロメタン）で精製し、上記化合物２０．２ｇを得た。
融点１７８−１８０℃
ＭＳ ｍ／ｚ： ４２４［ＭＨ］＋
工程４ ５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ２ −イソブチリルグアノシンの合成
２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ２−イソブチリルグアノシン０．７０ｇをピリジン共沸後、テトラヒドロフラン１５ｍｌとピリジン１．３４ｍｌに懸濁し、氷水冷撹拌下４，４’−ジメトキシトリチルクロリド０．６１ｇを加え、室温で４時間撹拌した。反応液を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液にあけ、ジクロロメタン抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、乾燥、濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン〜１％メタノール／ジクロロメタン）で精製し、上記化合物１．００ｇを得た。
工程５ ２−クロロフェニル ５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ２ −イソブチリルグアノシン−３’−イル ホスフェート トリエチルアミン塩の合成
参考例２工程２の５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）チミジンの代わりに参考例２工程２で合成された化合物を使用して同様の反応を行い、目的化合物を得た。
実施例１
５’−Ｏ−レブリニル−２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ４ −（４−アニソイル）シチジン
２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ４−（４−アニソイル）シチジン ７．０ｇを無水のテトラヒドロフラン２８０ｍｌに懸濁し、レブリン酸無水物１０．１ｇ、Ｎｏｖｏｚｙｍ４３５ ２．７８ｇを加え、室温下２５時間振盪した。レブリン酸無水物３．０ｇ、Ｎｏｖｏｚｙｍ４３５ １．０ｇを追加し室温下７２時間振盪した。反応液をセライトろ過し、ジクロロメタンで洗浄し、ろ液に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え１５時間撹拌した後、分液し、乾燥、濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（２％メタノール／ジクロロメタン）にて精製し、目的化合物６．０２ｇを得た。
実施例２
２−シアノエチル ２−クロロフェニル ５’−Ｏ−レブリニル−２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ４ −（４−アニソイル）シチジン−３’−イル ホスフェート
５’−Ｏ−レブリニル−２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ４−（４−アニソイル）シチジン３．０ｇに０．５６Ｍの２−クロロフェニルホスホロジトリアゾリド／ジオキサン溶液１９．５ｍｌを加え溶解し、ついで１−メチルイミダゾール０．９０ｇを加え室温下１時間撹拌した。３−ヒドロキシプロピオニトリル１．５６ｇを加え室温下２時間撹拌した。０℃下５０％ピリジン水溶液５ｍｌを加え５分間撹拌後、反応液を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液に注ぎ、ジクロロメタンにて抽出し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水にて洗浄後、乾燥、濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝２０：８０〜１５：８５）にて精製し、目的化合物３．１６ｇを得た。
ＭＳ ｍ／ｚ： ７８９．３［ＭＨ］＋
実施例３
２−クロロフェニル ５’−Ｏ−レブリニル−２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ４ −（４−アニソイル）シチジン−３’−イル ホスフェート トリエチルアミン塩
５’−Ｏ−レブリニル−２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ４−（４−アニソイル）シチジン ３．０ｇに０．５６Ｍの２−クロロフェニルホスホロジトリアゾリド／ジオキサン溶液１９．５ｍｌを加え溶解し、ついで１−メチルイミダゾール０．９０ｇを加え室温下１時間撹拌した。０℃下５０％ピリジン水溶液１０ｍｌを加え１０分間撹拌後、濃縮した。残渣に０．２Ｍ炭酸水素トリエチルアンモニウム水溶液３５ｍｌを加え、ジクロロメタン抽出した。ジクロロメタン層を０．２Ｍの炭酸水素トリエチルアンモニウム水溶液１５ｍｌで２回洗浄し、乾燥、濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（１０％メタノール／ジクロロメタン〜１５％メタノール／ジクロロメタン）にて精製し、目的化合物４．０３ｇを得た。
実施例４
５’−Ｏ−レブリニル−２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ２ −イソブチリルグアノシン
２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ２−イソブチリルグアノシン５．７０ｇをアセトニトリル２７０ｍｌに懸濁し、レブリン酸無水物８．６６ｇとＮｏｖｏｚｙｍｅ ＡＳ２．４０ｇを加え、室温で１５時間撹拌した。反応液をろ過してＮｏｖｏｚｙｍｅ ＡＳを除き、ジクロロメタンでよく洗浄した。母液と洗液を合わせ、ほぼ同体積の飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え終夜激しく撹拌した。有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液続いて飽和食塩水で洗浄し、乾燥、濃縮した。残渣を少量のジクロロメタンに溶解し、ｎ−ヘキサンとジエチルエーテルの等量混合溶媒にゆっくり滴下し粉末とした。得られた粉末を集め、ｎ−ヘキサンとジエチルエーテルの等量混合溶媒で洗浄し、上記化合物６．８０ｇを得た。
ＭＳ ｍ／ｚ： ５２２［ＭＨ］＋
実施例５
２−シアノエチル ２−クロロフェニル ５’−Ｏ−レブリニル−２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ２ −イソブチリルグアノシン−３’−イル ホスフェート
実施例２の５’−Ｏ−レブリニル−２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ４−（４−アニソイル）シチジンの代わりに、５’−Ｏ−レブリニル−２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ２−イソブチリルグアノシンを用いて同様の反応を行い、目的物を得た。
実施例６
２−クロロフェニル ５’−Ｏ−レブリニル−２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ２ −イソブチリルグアノシン−３’−イル ホスフェート トリエチルアミン塩
実施例３の５’−Ｏ−レブリニル−２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ４−（４−アニソイル）シチジンの代わりに、５’−Ｏ−レブリニル−２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ２−イソブチリルグアノシンを用いて同様の反応を行い、目的物を得た。
実施例７
２−シアノエチル ２−クロロフェニル ５’−Ｏ−レブリニル−２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）ウリジン−３’−イル ホスフェート
実施例２の５’−Ｏ−レブリニル−２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ４−（４−アニソイル）シチジンの代わりに、５’−Ｏ−レブリニル−２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）ウリジンを用いて同様の反応を行い、目的物を得た。
実施例８
２−クロロフェニル ５’−Ｏ−レブリニル−２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）ウリジン−３’−イル ホスフェート トリエチルアミン塩
実施例３の５’−Ｏ−レブリニル−２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ４−（４−アニソイル）シチジンの代わりに、５’−Ｏ−レブリニル−２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）ウリジンを用いて同様の反応を行い、目的物を得た。
実施例９
２−シアノエチル ２−クロロフェニル ５’−Ｏ−レブリニル−２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ６ −（４−アニソイル）アデノシン−３’−イル ホスフェート
実施例２の５’−Ｏ−レブリニル−２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ４−（４−アニソイル）シチジンの代わりに、５’−Ｏ−レブリニル−２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ６−（４−アニソイル）アデノシンを用いて同様の反応を行い、目的物を得た。
実施例１０
２−クロロフェニル ５’−Ｏ−レブリニル−２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ６ −（４−アニソイル）アデノシン−３’−イル ホスフェート トリエチルアミン塩
実施例３の５’−Ｏ−レブリニル−２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ４−（４−アニソイル）シチジンの代わりに、５’−Ｏ−レブリニル−２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ６−（４−アニソイル）アデノシンを用いて同様の反応を行い、目的物を得た。
実施例１１
アデニリル−〔３’→５’〕−ウリジリル−〔３’→５’〕−グアニリル−〔３’→５’〕−シチジリル−〔３’→５’〕−チミジリル−〔３’→５’〕−チミジン
（Ａ）オリゴ核酸ブロックＡ （２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ２ −イソブチリルグアノシン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ４ −（４−アニソイル）シチジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル チミジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル チミジン ３’−アセテート）
工程１ ２−シアノエチル ２−クロロフェニル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ４ −（４−アニソイル）シチジン−３’−イル ホスフェートの合成
２−シアノエチル ２−クロロフェニル ５’−Ｏ−レブリニル−２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ４−（４−アニソイル）シチジン−３’−イル ホスフェート３．１６ｇに０．５Ｍヒドラジン／ピリジン−酢酸（４：１）溶液４０ｍｌを加え溶解し、室温下２０分間撹拌した。０℃下アセトン１０ｍｌを加え５分間撹拌後、酢酸エチル２００ｍｌで希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液に注ぎ分液した。酢酸エチル層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄し、乾燥、濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン〜５％メタノール／ジクロロメタン）にて精製し、上記化合物２．４３ｇを得た。
工程２ ５’−Ｏ−レブリニル−２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ２ −イソブチリルグアノシン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ４ −（４−アニソイル）シチジン ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）（２−クロロフェニル）ホスフェート］の合成
２−クロロフェニル ５’−Ｏ−レブリニル−２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ２−イソブチリルグアノシン−３’−イル ホスフェート トリエチルアミン塩１．９５ｇおよび２−シアノエチル ２−クロロフェニル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ４−（４−アニソイル）シチジン−３’−イル ホスフェート １．３８ｇをピリジン共沸後、無水ピリジン３ｍｌに溶解し、１−（２−メシチレンスルホニル）−３−ニトロ−１，２，４−トリアゾール（ＭＳＮＴ）１．４２ｇを加え室温下１時間撹拌した。反応液に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、ジクロロメタンで抽出し、乾燥、濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（２％メタノール／クロロホルム〜４％メタノール／クロロホルム、０．１％ピリジン含有）にて精製し、上記、化合物２．２１ｇを得た。
工程３ ５’−Ｏ−レブリニル−２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ２ −イソブチリルグアノシン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ４ −（４−アニソイル）シチジン ３’−［Ｏ−（２−クロロフェニル）ホスフェート］ トリエチルアミン塩の合成
実施例１１（Ａ）工程２において合成された化合物２．２ｇにピリジン−トリエチルアミン−水（３：１：１）の溶液３２ｍｌを加え、室温下３０分間撹拌した。反応液を濃縮し乾燥して上記化合物２．４３ｇを得た。
工程４ ５’−Ｏ−レブリニル−２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ２ −イソブチリルグアノシン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ４ −（４−アニソイル）シチジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル チミジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル チミジン ３’−アセテートの合成
実施例１１（Ａ）工程３の化合物と参考例３の化合物とを使用して、実施例１１（Ａ）工程２と同様に反応を行い、目的物を得た。
工程５ ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ２ −イソブチリルグアノシン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ４ −（４−アニソイル）シチジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル チミジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル チミジン ３’−アセテートの合成
実施例１１（Ａ）工程１の２−シアノエチル ２−クロロフェニル ５’−Ｏ−レブリニル−２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ４−（４−アニソイル）シチジン−３’−イル ホスフェートの代わりに、５’−Ｏ−レブリニル−２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ２−イソブチリルグアノシン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ４−（４−アニソイル）シチジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル チミジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル チミジン ３’−アセテートを用いて同様の反応を行い、目的物を得た。
（Ｂ）オリゴ核酸ブロックＢ （５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ６ −（４−アニソイル）アデノシン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）ウリジン ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）（２−クロロフェニル）ホスフェート］）
工程１ ２−シアノエチル ２−クロロフェニル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）ウリジン−３’−イル ホスフェートの合成
実施例１１（Ａ）工程１の２−シアノエチル ２−クロロフェニル ５’−Ｏ−レブリニル−２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ４−（４−アニソイル）シチジン−３’−イル ホスフェートの代わりに、２−シアノエチル ２−クロロフェニル ５’−Ｏ−レブリニル−２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）ウリジン−３’−イル ホスフェートを用いて同様の反応を行い、目的物を得た。
工程２ ５’−Ｏ−レブリニル−２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ６ −（４−アニソイル）アデノシン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）ウリジン ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）（２−クロロフェニル）ホスフェート］の合成
実施例１０において合成された化合物と実施例１１（Ｂ）工程１において合成された化合物とを使用して、実施例１１（Ａ）工程２と同様の反応を行い、目的物を得た。
工程３ ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ６ −（４−アニソイル）アデノシン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）ウリジン ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）（２−クロロフェニル）ホスフェート］の合成
実施例１１（Ａ）工程１の２−シアノエチル ２−クロロフェニル ５’−Ｏ−レブリニル−２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ４−（４−アニソイル）シチジン−３’−イル ホスフェートの代わりに、５’−Ｏ−レブリニル−２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ６−（４−アニソイル）アデノシン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）ウリジン ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）（２−クロロフェニル）ホスフェート］を用いて同様の反応を行い、目的物を得た。
工程４ ５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ６ −（４−アニソイル）アデノシン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）ウリジン ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）（２−クロロフェニル）ホスフェート］の合成
実施例１１（Ｂ）工程３において合成された化合物０．３３ｇをピリジン共沸後、テトラヒドロフラン１．３ｍｌに溶解し、ピリジン０．２２ｍｌと４，４’−ジメトキシトリチルクロリド０．１９ｇを加え、室温で撹拌した。２時間後、さらに４，４’−ジメトキシトリチルクロリド０．１９ｇを加え、１時間撹拌した。反応液を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液にあけ、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、乾燥、濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン〜２％メタノール／ジクロロメタン）で精製し、上記化合物０．４２ｇを得た。
Ｃ） アデニリル−〔３’→５’〕−ウリジリル−〔３’→５’〕−グアニリル−〔３’→５’〕−シチジリル−〔３’→５’〕−チミジリル−〔３’→５’〕−チミジン
工程１ 完全保護体の合成
オリゴ核酸ブロックＢ０．０３５ｇにピリジンとトリエチルアミンと水の混合溶媒（３：１：１、０．２２ｍｌ）を加え、室温で２０分間撹拌した。反応液を減圧濃縮しピリジン共沸後、オリゴ核酸ブロックＡ０．０３０ｇを加えピリジン共沸した。残渣をピリジン０．０６ｍｌに溶解し、１−（２−メシチレンスルホニル）−３−ニトロ−１，２，４−トリアゾール（ＭＳＮＴ）０．０５５ｇを加えて室温で１時間撹拌した。反応液に氷水冷撹拌下、５０％ピリジン水溶液２ｍｌを加え飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、酢酸エチル抽出し、飽和食塩水で洗浄乾燥、濃縮した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン〜２％メタノール／ジクロロメタン）で精製し、得た無色泡状物を少量のジクロロメタンに溶解し、ジエチルエーテル中に滴下し粉末とした。得られた粉末を集め、ジエチルエーテルで洗浄し、５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ６−（４−アニソイル）アデノシン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）ウリジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ２−イソブチリルグアノシン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ４−（４−アニソイル）シチジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル チミジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル チミジン ３’−アセテート０．０２９ｇを得た。
融点１７９−１８３℃
工程２ 脱保護・精製工程
実施例１１（Ｃ）工程１において合成された化合物０．００５ｇに０．３０Ｍのピリジン−２−カルボキサアルドキシムとＮ１，Ｎ１，Ｎ３，Ｎ３−テトラメチルグアニジンの５０％ジオキサン水溶液を加え、室温で４０時間撹拌した。反応液を減圧濃縮後、ピリジン１ｍｌに溶解し２８％アンモニア水溶液２ｍｌを加え、密栓して５５℃で１５時間放置した。放冷後、減圧濃縮し残渣にアセトンを加え、遠心して淡黄色の粉末を得た。得られた粉末を逆相ＯＤＳカラムクロマトグラフィー（アセトニトリル／０．０５Ｍ−ＴＥＡＡ緩衝液）で精製した。
得られた淡黄色粉末化合物に０．１Ｍの酢酸−テトラメチルエチレンジアミンの緩衝液（ｐＨ３．８８）０．０５ｍｌを加え、６０℃で３０分間放置した。反応液を０．０５Ｍ−ＴＥＡＡ緩衝液０．３０ｍｌで希釈し、逆相ＯＤＳ（Ｓｅｐ−Ｐａｋ ＶａＣ ２ｇ、水続いて５０％アセトニトリル水溶液）を通して、目的化合物である、アデニリル−〔３’→５’〕−ウリジリル−〔３’→５’〕−グアニリル−〔３’→５’〕−シチジリル−〔３’→５’〕−チミジリル−〔３’→５’〕−チミジン５０．４ＯＤ（Ａ２６０）を得た。
実施例１２ シチジリル−〔３’→５’〕−シチジリル−〔３’→５’〕−シチジリル−〔３’→５’〕−シチジリル−〔３’→５’〕−シチジリル−〔３’→５’〕−シチジリル−〔３’→５’〕シチジリル−〔３’→５’〕−シチジリル−〔３’→５’〕−シチジリル−〔３’→５’〕−シチジリル−〔３’→５’〕−シチジリル−〔３’→５’〕−シチジリル−〔３’→５’〕シチジリル−〔３’→５’〕−シチジリル−〔３’→５’〕−シチジリル−〔３’→５’〕−シチジリル−〔３’→５’〕−シチジリル−〔３’→５’〕−シチジリル−〔３’→５’〕−シチジリル−〔３’→５’〕−チミジリル−〔３’→５’〕−チミジン
工程１ ５’−Ｏ−レブリニル−２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ４ −（４−アニソイル）シチジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ４ −（４−アニソイル）シチジン ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）（２−クロロフェニル）ホスフェート］の合成
２−クロロフェニル ５’−Ｏ−レブリニル−２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ４−（４−アニソイル）シチジン−３’−イル ホスフェート トリエチルアミン塩１．３２ｇおよび２−シアノエチル ２−クロロフェニル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ４−（４−アニソイル）シチジン−３’−イル ホスフェート ０．７７ｇをピリジン共沸後、無水ピリジン４ｍｌに溶解し、１−（２−メシチレンスルホニル）−３−ニトロ−１，２，４−トリアゾール（ＭＳＮＴ）０．９９ｇを加え室温下１時間撹拌した。反応液に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、酢酸エチルで抽出し、乾燥、濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（１％メタノール／ジクロロメタン〜５％メタノール／ジクロロメタン、０．１％ピリジン含有）にて精製し、上記化合物１．３９ｇを得た。
工程２ ５’−Ｏ−レブリニル−２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ４ −（４−アニソイル）シチジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ４ −（４−アニソイル）シチジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル チミジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル チミジン ３’−アセテートの合成
実施例１２工程１において合成された化合物９０ｍｇにピリジン−トリエチルアミン−水（３：１：１）の溶液０．５ｍｌを加え、室温下３０分間撹拌した。反応液を濃縮後、チミジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル チミジン ３’−アセテート３０ｍｇを加えピリジン共沸した。無水ピリジン０．５ｍｌに溶解し、１−（２−メシチレンスルホニル）−３−ニトロ−１，２，４−トリアゾール（ＭＳＮＴ）３８ｍｇを加え室温下１時間撹拌した。反応液に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、酢酸エチルで抽出し、乾燥、濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（２％メタノール／ジクロロメタン〜５％メタノール／ジクロロメタン、０．１％ピリジン含有）にて精製し、上記化合物７７ｍｇを得た。
工程３ ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ４ −（４−アニソイル）シチジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ４ −（４−アニソイル）シチジン ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）（２−クロロフェニル）ホスフェート］の合成
実施例１２工程１において合成された化合物５５０ｍｇに０．５Ｍヒドラジン／ピリジン−酢酸（４：１）溶液６ｍｌを加え溶解し、室温下３０分間撹拌した。０℃下アセトン１ｍｌを加え５分間撹拌後、酢酸エチルで希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液に注ぎ分液した。酢酸エチル層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄し、乾燥、濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（２％メタノールジクロロメタン〜５％メタノール／ジクロロメタン）にて精製し、上記化合物４６５ｍｇを得た。
工程４ ５’−Ｏ−レブリニル−２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ４ −（４−アニソイル）シチジシ ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ４ −（４−アニソイル）シチジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ４ −（４−アニソイル）シチジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ４ −（４−アニソイル）シチジン ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）（２−クロロフェニル）ホスフェート］の合成
実施例１２工程１において合成された化合物７２６ｍｇにピリジン−トリエチルアミン−水（３：１：１）の溶液６ｍｌを加え、室温下１５分間撹拌した。反応液を濃縮後、実施例１２工程３において合成された化合物４５０ｍｇを加えピリジン共沸した。無水ピリジン２ｍｌに溶解し、１−（２−メシチレンスルホニル）−３−ニトロ−１，２，４−トリアゾール（ＭＳＮＴ）３０２ｍｇを加え室温下２時間撹拌した。反応液に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、酢酸エチルで抽出し、乾燥、濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（２％メタノール／ジクロロメタン〜５％メタノール／ジクロロメタン、０．１％ピリジン含有）にて精製し、上記化合物８６０ｍｇを得た。
工程５ ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ４ −（４−アニソイル）シチジン３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ４ −（４−アニソイル）シチジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル チミジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル チミジン ３’−アセテートの合成
実施例１２工程２において合成された化合物７０ｍｇに０．５Ｍヒドラジン／ピリジン−酢酸（４：１）溶液０．３４ｍｌを加え溶解し、室温下２０分間撹拌した。０℃下アセトン１ｍｌを加え５分間撹拌後、酢酸エチルで希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液に注ぎ分液した。酢酸エチル層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄し、乾燥、濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（２％メタノールジクロロメタン〜５％メタノール／ジクロロメタン）にて精製し、上記化合物５７ｍｇを得た。
工程６ ５’−Ｏ−レブリニル−２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ４ −（４−アニソイル）シチジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ４ −（４−アニソイル）シチジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ４ −（４−アニソイル）シチジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ４ −（４−アニソイル）シチジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ４ −（４−アニソイル）シチジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ４ −（４−アニソイル）シチジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル チミジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル チミジン ３’−アセテートの合成
実施例１２工程４において合成された化合物１１３ｍｇにピリジン−トリエチルアミン−水（３：１：１）の溶液２ｍｌを加え、室温下１５分間撹拌した。反応液を濃縮後、実施例１２工程５において合成された化合物５５ｍｇを加えピリジン共沸した。無水ピリジン０．５ｍｌに溶解し、１−（２−メシチレンスルホニル）−３−ニトロ−１，２，４−トリアゾール（ＭＳＮＴ）２５ｍｇを加え室温下２時間撹拌した。反応液に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、酢酸エチルで抽出し、乾燥、濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（２％メタノール／ジクロロメタン〜８％メタノール／ジクロロメタン、０．１％ピリジン含有）にて精製し、上記化合物９０ｍｇを得た。
工程７ ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ４ −（４−アニソイル）シチジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ４ −（４−アニソイル）シチジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ４ −（４−アニソイル）シチジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ４ −（４−アニソイル）シチジン ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）（２−クロロフェニル）ホスフェート］の合成
実施例１２工程４において合成された化合物２４０ｍｇに０．５Ｍヒドラジン／ピリジン−酢酸（４：１）溶液１ｍｌを加え溶解し、室温下３０分間撹拌した。０℃下アセトン０．５ｍｌを加え５分間撹拌後、酢酸エチルで希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液に注ぎ分液した。酢酸エチル層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄し、乾燥、濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（２％メタノールジクロロメタン〜５％メタノール／ジクロロメタン）にて精製し、上記化合物１８５ｍｇを得た。
工程８ ５’−Ｏ−レブリニル−２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ４ −（４−アニソイル）シチジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ４ −（４−アニソイル）シチジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ４ −（４−アニソイル）シチジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ４ −（４−アニソイル）シチジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ４ −（４−アニソイル）シチジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ４ −（４−アニソイル）シチジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ４ −（４−アニソイル）シチジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ４ −（４−アニソイル）シチジン ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）（２−クロロフェニル）ホスフェート］の合成
実施例１２工程４において合成された化合物２８８ｍｇにピリジン−トリエチルアミン−水（３：１：１）の溶液４ｍｌを加え、室温下１５分間撹拌した。反応液を濃縮後、実施例１２工程７において合成された化合物１８０ｍｇを加えピリジン共沸した。無水ピリジン０．５ｍｌに溶解し、１−（２−メシチレンスルホニル）−３−ニトロ−１，２，４−トリアゾール（ＭＳＮＴ）６３ｍｇを加え室温下１．５時間撹拌した。反応液に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、酢酸エチルで抽出し、乾燥、濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（２％メタノール／ジクロロメタン〜６％メタノール／ジクロロメタン、０．１％ピリジン含有）にて精製し、上記化合物３３９ｍｇを得た。
工程９ ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ４ −（４−アニソイル）シチジン３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ４ −（４−アニソイル）シチジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ４ −（４−アニソイル）シチジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ４ −（４−アニソイル）シチジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ４ −（４−アニソイル）シチジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ４ −（４−アニソイル）シチジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル チミジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル チミジン ３’−アセテートの合成
実施例１２工程６において合成された化合物９０ｍｇに０．５Ｍヒドラジン／ピリジン−酢酸（４：１）溶液１ｍｌを加え溶解し、室温下２０分間撹拌した。０℃下アセトン０．５ｍｌを加え５分間撹拌後、酢酸エチルで希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液に注ぎ分液した。酢酸エチル層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄し、乾燥、濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（２％メタノールジクロロメタン〜６％メタノール／ジクロロメタン）にて精製し、上記化合物６０ｍｇを得た。
工程１０ ５’−Ｏ−レブリニル−２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ４ −（４−アニソイル）シチジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ４ −（４−アニソイル）シチジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ４ −（４−アニソイル）シチジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ４ −（４−アニソイル）シチジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ４ −（４−アニソイル）シチジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ４ −（４−アニソイル）シチジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ４ −（４−アニソイル）シチジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ４ −（４−アニソイル）シチジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ４ −（４−アニソイル）シチジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ４ −（４−アニソイル）シチジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ４ −（４−アニソイル）シチジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ４ −（４−アニソイル）シチジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ４ −（４−アニソイル）シチジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ４ −（４−アニソイル）シチジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル チミジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル チミジン ３’−アセテートの合成
実施例１２工程８において合成された化合物１０５ｍｇにピリジン−トリエチルアミン−水（３：１：１）の溶液２ｍｌを加え、室温下１５分間撹拌した。反応液を濃縮後、実施例１２工程９において合成された化合物５８ｍｇを加えピリジン共沸した。無水ピリジン０．５ｍｌに溶解し、１−（２−メシチレンスルホニル）−３−ニトロ−１，２，４−トリアゾール（ＭＳＮＴ）２５ｍｇを加え室温下２時間撹拌した。反応液に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、ジクロロメタンで抽出し、乾燥、濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（２％メタノール／ジクロロメタン〜６％メタノール／ジクロロメタン、０．１％ピリジン含有）にて精製し、上記化合物８０ｍｇを得た。
工程１１ ５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ４ −（４−アニソイル）シチジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ４ −（４−アニソイル）シチジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ４ −（４−アニソイル）シチジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ４ −（４−アニソイル）シチジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ４ −（４−アニソイル）シチジン ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）（２−クロロフェニル）ホスフェート］の合成
２−クロロフェニル ５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ４−（４−アニソイル）シチジン−３’−イル ホスフェート トリエチルアミン塩１０７ｍｇと実施例１２工程７において合成された化合物１７５ｍｇをピリジン共沸後、無水ピリジン１ｍｌに溶解し、１−（２−メシチレンスルホニル）−３−ニトロ−１，２，４−トリアゾール（ＭＳＮＴ）６１ｍｇを加え室温下１．５時間撹拌した。反応液に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、酢酸エチルで抽出し、乾燥、濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（２％メタノール／ジクロロメタン〜６％メタノール／ジクロロメタン、０．１％ピリジン含有）にて精製し、上記化合物２２５ｍｇを得た。
工程１２ ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ４ −（４−アニソイル）シチジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ４ −（４−アニソイル）シチジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ４ −（４−アニソイル）シチジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ４ −（４−アニソイル）シチジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ４ −（４−アニソイル）シチジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ４ −（４−アニソイル）シチジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ４ −（４−アニソイル）シチジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ４ −（４−アニソイル）シチジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ４ −（４−アニソイル）シチジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ４ −（４−アニソイル）シチジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ４ −（４−アニソイル）シチジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ４ −（４−アニソイル）シチジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ４ −（４−アニソイル）シチジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ４ −（４−アニソイル）シチジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル チミジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリルチミジン ３’−アセテートの合成
実施例１２工程１０において合成された化合物５５ｍｇに、０．５Ｍヒドラジン／ピリジン−酢酸（４：１）溶液１ｍｌを加え溶解し、室温下１５分間撹拌した。０℃下アセトン０．５ｍｌを加え５分間撹拌後、ジクロロメタンで希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液に注ぎ分液した。ジクロロメタン層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄し、乾燥、濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（２％メタノールジクロロメタン〜６％メタノール／ジクロロメタン）にて精製し、上記化合物４４ｍｇを得た。
工程１３ ５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ４ −（４−アニソイル）シチジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ４ −（４−アニソイル）シチジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ４ −（４−アニソイル）シチジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ４ −（４−アニソイル）シチジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ４ −（４−アニソイル）シチジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ４ −（４−アニソイル）シチジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ４ −（４−アニソイル）シチジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ４ −（４−アニソイル）シチジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ４ −（４−アニソイル）シチジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ４ −（４−アニソイル）シチジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル− ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ４ −（４−アニソイル）シチジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ４ −（４−アニソイル）シチジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ４ −（４−アニソイル）シチジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ４ −（４−アニソイル）シチジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ４ −（４−アニソイル）シチジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ４ −（４−アニソイル）シチジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ４ −（４−アニソイル）シチジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ４ −（４−アニソイル）シチジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ４ −（４−アニソイル）シチジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル チミジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル チミジン ３’−Ｏ−アセテートの合成
実施例１２工程１１において合成された化合物２７ｍｇにピリジン−トリエチルアミン−水（３：１：１）の溶液２ｍｌを加え、室温下１５分間撹拌した。反応液を濃縮後、実施例１２工程１２において合成された化合物４４ｍｇを加えピリジン共沸した。無水ピリジン０．５ｍｌに溶解し、１−（２−メシチレンスルホニル）−３−ニトロ−１，２，４−トリアゾール（ＭＳＮＴ）５ｍｇを加え室温下３時間撹拌した。反応液に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、ジクロロメタンで抽出し、乾燥、濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（２％メタノール／ジクロロメタン〜６％メタノール／ジクロロメタン、０．１％ピリジン含有）にて精製し、上記化合物４２ｍｇを得た。
工程１４ 脱保護及び精製工程
実施例１２工程１３において合成された化合物２０ｍｇに０．３０Ｍのピリジン−２−カルボキサアルドキシムとＮ１，Ｎ１，Ｎ３，Ｎ３−テトラメチルグアニジンの５０％ジオキサン水溶液を加え、室温で７２時間撹拌した。反応液を減圧濃縮後、ピリジン１ｍｌに溶解し２８％アンモニア水溶液５ｍｌを加え、密栓して５５℃で７時間、その後、室温で終夜放置した。反応液を濃縮し残渣にアセトンを加え、遠心して淡黄色の粉末を得た。得られた粉末を逆相ＯＤＳカラムクロマトグラフィー（アセトニトリル／０．０５Ｍ−ＴＥＡＡ緩衝液）で精製した。このものに０．１Ｍの酢酸−テトラメチルエチレンジアミンの緩衝液（ｐＨ３．８８）０．０５ｍｌを加え、６０℃で１時間放置した。反応液を逆相ＯＤＳにて脱塩し、目的化合物である、シチジリル−〔３’→５’〕−シチジリル−〔３’→５’〕−シチジリル−〔３’→５’〕−シチジリル−〔３’→５’〕−シチジリル−〔３’→５’〕−シチジリル−〔３’→５’〕−シチジリル−〔３’→５’〕−シチジリル−〔３’→５’〕−シチジリル−〔３’→５’〕−シチジリル−〔３’→５’〕−シチジリル−〔３’→５’〕−シチジリル−〔３’→５’〕−シチジリル−〔３’→５’〕−シチジリル−〔３’→５’〕−シチジリル−〔３’→５’〕−シチジリル−〔３’→５’〕−シチジリル−〔３’→５’〕−シチジリル−〔３’→５’〕−シチジリル−〔３’→５’〕−チミジリル−〔３’→５’〕−チミジンを得た。
ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ ＭＳ：計算値 ６３４４．８６， 実測値 ６３４５．６９
実施例１３ ５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ４ −（４−アニソイル）シチジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ４ −（４−アニソイル）シチジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ４ −（４−アニソイル）シチジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ４ −（４−アニソイル）シチジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ４ −（４−アニソイル）シチジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル チミジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル チミジン ３’−アセテート
実施例１２工程１１の実施例１２工程７において合成された化合物の代わりに、実施例１２工程３の化合物を使用して同様の反応を行い、トリマーブロックを合成した。次に、実施例１２工程１３の実施例１２工程１１において合成された化合物の代わりに、先に合成したトリマーブロックを使用し、実施例１２工程１２において合成された化合物の代わりに、実施例１２工程５の化合物を使用して同様の反応を行い、目的とするオリゴ核酸化合物を合成した。
実施例１４ ５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−（２−テトラヒドロピラニル）−Ｎ ４ −（４−アニソイル）シチジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロピラニル）−Ｎ ４ −（４−アニソイル）シチジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロピラニル）−Ｎ ４ −（４−アニソイル）シチジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロピラニル）−Ｎ ４ −（４−アニソイル）シチジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロピラニル）−Ｎ ４ −（４−アニソイル）シチジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル チミジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル チミジン ３’−アセテート
実施例１３と同様の方法を用いて、２’位水酸基の保護基が２−テトラヒドロピラニルである核酸モノマーブロックを使用し、目的とするオリゴ核酸化合物を合成した。
実施例１５
試験化合物として、２’位水酸基の保護基が２−テトラヒドロフラニルである実施例１３の化合物と２−テトラヒドロピラニルである実施例１４の化合物とを使用し、以下に示す方法で処理し脱保護反応を比較検討した。
試験化合物１８ｍｇに０．３ＭのＮ１，Ｎ１，Ｎ３，Ｎ３−テトラメチルグアニジンとピリジン−２−カルボキサアルドキシムのジオキサン／水（１／１）溶液（２ｍｌ）を加え、室温で終夜攪拌した。反応液を濃縮後、ピリジン（２ｍｌ）、濃アンモニア水（１０ｍｌ）に溶解し、５５℃で終夜攪拌した。反応液を濃縮後、アセトンを加え、生じた沈殿を遠心分離して集め、アセトンで３回洗浄して乾燥した。このもの１ｍｇに０．１Ｍ酢酸ナトリウム−酢酸緩衝液（ｐＨ３．８２）（１ｍｌ）を加え、各脱保護条件において反応を行い、逆相ＨＰＬＣにて反応を追跡した。脱保護された化合物の収率（ＨＰＬＣピーク面積値）を表１に示す。
上記結果より、２’位水酸基の保護基として２−テトラヒドロフラニルを用いた場合は、全ての条件下において、ほぼ定量的に脱保護された化合物が得られた。しかしながら、２’位水酸基の保護基として２−テトラヒドロピラニルを用いた場合は、脱保護された化合物の生成が不十分であり、明らかに２’位水酸基の保護基として２−テトラヒドロフラニルが有用であることが判る。
実施例１６ リパーゼによるレブリニル化
５’−Ｏ−レブリニル−２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）ウリジン
２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）ウリジン５０ｍｇを無水のアセトニトリル２．５ｍｌに溶解し、レブリン酸無水物１４０ｍｇ、各種リパーゼ２８ｍｇを加え、室温下１６時間攪拌し、逆相ＨＰＬＣを使用して反応生成物である、５’−Ｏ−レブリニル−２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）ウリジンの収率を求めた。
結果を表２に示す。
上記結果から、Ｎｏｖｏｚｙｍ４３５（Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ ｌｉｐａｓｅ Ｂ：ノボ・ノルディスク社製）及びＬＩＰＡＳＥ−ＱＬ（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｔｒｉａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ ｌｉｐａｓｅ：名糖産業（株）社製）は、原料化合物をすべて消費し、５’位水酸基をレブリニル化された化合物のみを生成することが明らかとなった。
実施例１７ アデニリル−〔３’→５’〕−アデニリル−〔３’→５’〕−ウリジリル−〔３’→５’〕−グアニリル−〔３’→５’〕−グアニリル−〔３’→５’〕−アデニリル−〔３’→５’〕−ウリジリル−〔３’→５’〕−グアニリル−〔３’→５’〕−ウリジリル−〔３’→５’〕−アデニリル−〔３’→５’〕−シチジリル−〔３’→５’〕−ウリジリル−〔３’→５’〕−ウリジリル−〔３’→５’〕−シチジリル−〔３’→５’〕−アデニリル−〔３’→５’〕−ウリジリル−〔３’→５’〕−シチジリル−〔３’→５’〕−アデニリル−〔３’→５’〕−シチジリル−〔３’→５’〕−チミジリル−〔３’→５’〕−チミジン
工程１ ダイマーブロックの合成
実施例１２工程１と同様の方法を用いて、５’−Ｏ−レブリニル−２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ６−（４−アニソイル）アデノシン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）ウリジン ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）（２−クロロフェニル）ホスフェート］を８．２４ｇ（ＭＳ（ＥＩ） ｍ／ｚ ＝１３２１．２［Ｍ＋Ｎａ］）、５’−Ｏ−レブリニル−２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ２−イソブチリルグアノシン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ２−イソブチリルグアノシン ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）（２−クロロフェニル）ホスフェート］を６．８８ｇ（ＭＳ（ＥＩ） ｍ／ｚ ＝１３８２．４［Ｍ＋Ｎａ］）、５’−Ｏ−レブリニル−２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ２−イソブチリルグアノシン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）ウリジン ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）（２−クロロフェニル）ホスフェート］を３．６０ｇ（ＭＳ（ＥＩ） ｍ／ｚ ＝１２７３．４［Ｍ＋Ｎａ］、５’−Ｏ−レブリニル−２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ６−（４−アニソイル）アデノシン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ４−（４−アニソイル）シチジン ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）（２−クロロフェニル）ホスフェート］を１６．１２ｇ（ＭＳ（ＥＩ） ｍ／ｚ ＝１４５４．５［Ｍ＋Ｎａ］）、５’−Ｏ−レブリニル−２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）ウリジン 〔３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）ウリジン ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）（２−クロロフェニル）ホスフェート］を５．１０ｇ（ＭＳ（ＥＩ） ｍ／ｚ ＝１１６４．３［Ｍ＋Ｎａ］）、５’−Ｏ−レブリニル−２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ４−（４−アニソイル）シチジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ６−（４−アニソイル）アデノシン ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）（２−クロロフェニル）ホスフェート］を８．３０ｇ（ＭＳ（ＥＩ） ｍ／ｚ ＝１４５４．５［Ｍ＋Ｎａ］）、５’−Ｏ−レブリニル−２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）ウリジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ４−（４−アニソイル）シチジン ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）（２−クロロフェニル）ホスフェート］を６．００ｇ（ＭＳ（ＥＩ） ｍ／ｚ ＝１２９７．４［Ｍ＋Ｎａ］）それぞれ合成した。
また、参考例３の化合物であるチミジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル チミジン ３’−アセテート３．３１ｇを合成した。
工程２ テトラマーブロックの合成
実施例１７工程１において合成されたダイマーブロックを使用し、実施例１２工程２と同様の方法を用いて、５’−Ｏ−レブリニル−２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ６−（４−アニソイル）アデノシン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ４−（４−アニソイル）シチジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル チミジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル チミジン ３’−アセテートを６．４９ｇ（ＭＳ（ＥＩ） ｍ／ｚ ＝２０６２．０［Ｍ＋Ｈ］）合成し、実施例１２工程４と同様にして、５’−Ｏ−レブリニル−２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ６−（４−アニソイル）アデノシン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）ウリジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ２−イソブチリルグアノシン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ２−イソブチリルグアノシン ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）（２−クロロフェニル）ホスフェート］を４．２０ｇ（ＭＳ（ＥＩ） ｍ／ｚ ＝２４９２．７［Ｍ＋Ｈ］）、５’−Ｏ−レブリニル−２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ６−（４−アニソイル）アデノシン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル−２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）ウリジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ２−イソブチリルグアノシン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）ウリジン ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）（２−クロロフェニル）ホスフェート］を２．３０ｇ（ＭＳ（ＥＩ） ｍ／ｚ ＝２３８３．３［Ｍ＋Ｈ］）、５’−Ｏ−レブリニル−２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ６−（４−アニソイル）アデノシン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ４−（４−アニソイル）シチジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）ウリジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）ウリジン ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）（２−クロロフェニル）ホスフェート］を７．００ｇ（ＭＳ（ＥＩ） ｍ／ｚ ＝２４２９．２［Ｍ＋Ｎａ］）、５’−Ｏ−レブリニル− ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ４−（４−アニソイル）シチジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ６−（４−アニソイル）アデノシン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）ウリジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ４−（４−アニソイル）シチジン ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）（２−クロロフェニル）ホスフェート］８．３８ｇ（ＭＳ（ＥＩ） ｍ／ｚ ＝２５６２．１［Ｍ＋Ｎａ］）を合成した。
工程３ ５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ６ −（４−アニソイル）アデノシン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ６ −（４−アニソイル）アデノシン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）ウリジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ２ −イソブチリルグアノシン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ２ −イソブチリルグアノシン ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）（２−クロロフェニル）ホスフェート］の合成
実施例１７工程２で合成された化合物と実施例１０の化合物とを使用し、実施例１１（Ｂ）と同様の方法を用いて、上記化合物３．７０ｇを合成した。
工程４ ５’−Ｏ−レブリニル− ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ４ −（４−アニソイル）シチジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ６ −（４−アニソイル）アデノシン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）ウリジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ４ −（４−アニソイル）シチジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ６ −（４−アニソイル）アデノシン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ４ −（４−アニソイル）シチジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル チミジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル チミジン ３’−アセテートの合成
実施例１７工程２で合成された化合物と５’−Ｏ−レブリニル−２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ６−（４−アニソイル）アデノシン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ４−（４−アニソイル）シチジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル チミジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル チミジン ３’−アセテートとを使用し、実施例１２工程５及び工程６と同様の方法を用いて、上記化合物６．０４ｇを合成した。
工程５ ５’−Ｏ−レブリニル−２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ６ −（４−アニソイル）アデノシン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ４ −（４−アニソイル）シチジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）ウリジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）ウリジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ４ −（４−アニソイル）シチジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ６ −（４−アニソイル）アデノシン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）ウリジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ４ −（４−アニソイル）シチジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ６ −（４−アニソイル）アデノシン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ４ −（４−アニソイル）シチジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル チミジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル チミジン ３’−アセテートの合成
実施例１７工程２で合成された化合物と実施例１７工程４で合成された化合物とを使用し、実施例１２工程５及び工程６と同様の方法を用いて、上記化合物７．０４ｇを合成した。
工程６ ５’−Ｏ−レブリニル−２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ６ −（４−アニソイル）アデノシン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）ウリジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ２ −イソブチリルグアノシン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）ウリジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ６ −（４−アニソイル）アデノシン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ４ −（４−アニソイル）シチジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）ウリジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）ウリジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ４ −（４−アニソイル）シチジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ６ −（４−アニソイル）アデノシン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）ウリジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ４ −（４−アニソイル）シチジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ６ −（４−アニソイル）アデノシン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ４ −（４−アニソイル）シチジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル チミジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル チミジン ３’−アセテートの合成
実施例１７工程２で合成された化合物と実施例１７工程５において合成された化合物とを使用し、実施例１２工程５及び工程６と同様の方法を用いて、上記化合物３．６０ｇを合成した。
工程７ ５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ６ −（４−アニソイル）アデノシン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ６ −（４−アニソイル）アデノシン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）ウリジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ２ −イソブチリルグアノシン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ２ −イソブチリルグアノシン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ６ −（４−アニソイル）アデノシン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）ウリジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ２ −イソブチリルグアノシン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）ウリジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ６ −（４−アニソイル）アデノシン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ４ −（４−アニソイル）シチジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル−２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）ウリジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）ウリジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ４ −（４−アニソイル）シチジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル−２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ６ −（４−アニソイル）アデノシン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）ウリジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ４ −（４−アニソイル）シチジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ６ −（４−アニソイル）アデノシン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル ２’−Ｏ−（２−テトラヒドロフラニル）−Ｎ ４ −（４−アニソイル）シチジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル−チミジン ３’−（２−クロロフェノキシ）ホスホリル チミジン ３’−アセテートの合成
実施例１７工程３において合成された化合物と実施例１７工程６において合成された化合物とを使用し、実施例１２工程１２及び工程１３と同様の方法を用いて、上記化合物４．２７ｇを合成した。
工程８ 脱保護及び精製工程
実施例１７工程７において合成された化合物１００ｍｇに０．３０Ｍのピリジン−２−カルボキサアルドキシムとＮ１，Ｎ１，Ｎ３，Ｎ３−テトラメチルグアニジンの５０％ジオキサン水溶液を加え、室温で４４時間撹拌した。反応液を減圧濃縮後、ピリジン３ｍｌに溶解し２８％アンモニア水溶液１５ｍｌを加え、密栓して５５℃で１１時間、その後、室温で１２時間放置した。さらに５５℃で１１時間、その後、室温で１２時間放置した。反応液を濃縮後、アセトンを加え、生じた沈殿を遠心分離して集め、アセトンで３回洗浄して乾燥した。得られた粉末を逆相ＯＤＳカラムクロマトグラフィー（アセトニトリル／０．０５Ｍ−ＴＥＡＡ緩衝液）で精製した。このもの２２ｍｇに０．１Ｍ酢酸ナトリウム−酢酸緩衝液（ｐＨ３．８２）を２ｍｌ加え、６０℃で１時間放置した。反応液を逆相ＯＤＳにて脱塩し凍結乾燥後、イオン交換カラムクロマトグラフィー（０→０．４Ｍ ＮａＣｌ／１０ｍＭリン酸緩衝液）で精製した。逆相ＯＤＳにて脱塩し凍結乾燥後、目的化合物である、アデニリル−〔３’→５’〕−アデニリル−〔３’→５’〕−ウリジリル−〔３’→５’〕−グアニリル−〔３’→５’〕−グアニリル−〔３’→５’〕−アデニリル−〔３’→５’〕−ウリジリル−〔３’→５’〕−グアニリル−〔３’→５’〕−ウリジリル−〔３’→５’〕−アデニリル−〔３’→５’〕−シチジリル−〔３’→５’〕−ウリジリル−〔３’→５’〕−ウリジリル−〔３’→５’〕−シチジリル−〔３’→５’〕−アデニリル−〔３’→５’〕−ウリジリル−〔３’→５’〕−シチジリル−〔３’→５’〕−アデニリル−〔３’→５’〕−シチジリル−〔３’→５’〕−チミジリル−〔３’→５’〕−チミジン１２ｍｇを得た。
ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ ＭＳ：計算値 ６６１５．０７，実測値 ６６１５．３４
本発明化合物である新規なリボ核酸化合物は、リボース２’位の水酸基が０℃〜６０℃のいずれかの温度においてｐＨ２〜４の酸性条件下２４時間で９０％以上脱離することができる保護基で保護され、リボース３’位がリン酸トリエステル化され、リボース５’位がレブリニル化された化合物である。本発明化合物は、オリゴＲＮＡを液相合成するために非常に有用であり、重要な化合物である。
また、リン酸トリエステル化されたリボ核酸化合物を製造するために重要である、リボース２’位の水酸基が０℃〜６０℃のいずれかの温度においてｐＨ２〜４の酸性条件下２４時間で９０％以上脱離することができる保護基で保護されたリボ核酸化合物に対して、リボース５’位の水酸基を位置選択的に容易にリパーゼによりレブリニル化する製法を提供する。
また、新規なオリゴＲＮＡの液相合成法を提供する。

Claims (17)

  1. 次の一般式（１）で表されるリボ核酸化合物又はその塩。
    式中、Ｂは、アデニン、グアニン、シトシン若しくはウラシル又はそれらの修飾体を示す。Ｒ１は、０℃〜６０℃のいずれかの温度においてｐＨ２〜４の酸性条件下２４時間で９０％以上脱離することができる保護基を示す。Ｒ２０はＨ又は置換されていてもよいアルキルを示す。Ｒ２１は置換されていてもよいアリール又は１〜２環性であって置換されていてもよい複素環基を示す。
  2. Ｒ１が、２−テトラヒドロフラニル又は１，３−ジオキソラン−２−イルである、請求項１記載のリボ核酸化合物又はその塩。
  3. Ｒ２０がＨ、２−シアノエチル又は２，２，２−トリクロロエチルであり、Ｒ２１が２−クロロフェニル又は２−クロロ−４−ｔｅｒｔ−ブチルフェニルである、請求項１又は２のいずれかに記載のリボ核酸化合物又はその塩。
  4. 次の一般式（２）で表されるリボ核酸化合物にレブリニル化剤とリパーゼとを作用させることによって、５’位の水酸基を位置選択的にレブリニル化することを特徴とする、次の一般式（３）で表されるリボ核酸化合物の製法。
    式中、Ｂは、アデニン、グアニン、シトシン若しくはウラシル又はそれらの修飾体を示す。Ｒ１は、０℃〜６０℃のいずれかの温度においてｐＨ２〜４の酸性条件下２４時間で９０％以上脱離することができる保護基を示す。
  5. 次の一般式（２）で表されるリボ核酸化合物にレブリニル化剤とリパーゼとを作用させることによって、５’位の水酸基を位置選択的にレブリニル化する工程を有することを特徴とする製法により製造される、次の一般式（３）で表されるリボ核酸化合物に対して、リン酸化試薬を作用させることにより、次の一般式（１ａ）で表されるリボ核酸化合物の製法。
    式中、Ｂは、アデニン、グアニン、シトシン若しくはウラシル又はそれらの修飾体を示す。Ｒ１は、０℃〜６０℃のいずれかの温度においてｐＨ２〜４の酸性条件下２４時間で９０％以上脱離することができる保護基を示す。Ｒ２１は置換されていてもよいアリール又は１〜２環性であって置換されていてもよい複素環基を示す。
  6. 次の一般式（２）で表されるリボ核酸化合物にレブリニル化剤とリパーゼとを作用させることによって、５’位の水酸基を位置選択的にレブリニル化する工程を有することを特徴とする製法により製造される、次の一般式（３）で表されるリボ核酸化合物に対して、リン酸化試薬とリン酸基を保護する試薬とを作用させることにより、次の一般式（１ｂ）で表されるリボ核酸化合物の製法。

    式中、Ｂは、アデニン、グアニン、シトシン若しくはウラシル又はそれらの修飾体を示す。Ｒ１は、０℃〜６０℃のいずれかの温度においてｐＨ２〜４の酸性条件下２４時間で９０％以上脱離することができる保護基を示す。Ｒ２１は置換されていてもよいアリール又は１〜２環性であって置換されていてもよい複素環基を示す。Ｒ２２は置換されていてもよいアルキルを示す。
  7. Ｒ１が２−テトラヒドロフラニル又は１，３−ジオキソラン−２−イルである請求項４〜６のいずれかに記載のリボ核酸化合物の製法。
  8. レブリニル化剤がレブリン酸、レブリン酸無水物、レブリン酸エステル、又はレブリン酸ハロゲン化物である、請求項４〜７のいずれかに記載のリボ核酸化合物の製法。
  9. リン酸化試薬が、２−クロロフェニルホスホロジトリアゾリド、２−クロロフェニル−Ｏ，Ｏ−ビス（１−ベンゾトリアゾリル）ホスフェート又は２−クロロ−４−ｔｅｒｔ−ブチルフェニルホスホロジトリアゾリドである、請求項５〜８のいずれかに記載のリボ核酸化合物の製法。
  10. リン酸基を保護する試薬が、３−ヒドロキシプロピオニトリル又は２，２，２−トリクロロエタノールである、請求項６〜９のいずれかに記載のリボ核酸化合物の製法。
  11. 次の（ａ）〜（ｆ）の工程を有する次の一般式（４）で表されるオリゴ核酸化合物の液相合成法。
    式中、各Ｂｘは、独立して、アデニン、グアニン、シトシン、ウラシル若しくはチミン又はそれらの修飾体を示す。ｑは、１〜１００の範囲内である整数を示す。各Ｒ’は、少なくとも一つは水酸基であり、それ以外は独立してＨ、又は水酸基を示す。
    （ａ） 次の一般式（２）で表されるリボ核酸化合物にレブリニル化剤とリパーゼとを作用させることによって、５’位の水酸基を位置選択的にレブリニル化して、次の一般式（３）で表されるリボ核酸化合物を製造する工程、
    ［式中、Ｂは、アデニン、グアニン、シトシン若しくはウラシル又はそれらの修飾体を示す。Ｒ１は、０℃〜６０℃のいずれかの温度においてｐＨ２〜４の酸性条件下２４時間で９０％以上脱離することができる保護基を示す。］
    （ｂ） 上記（ａ）の工程により製造されるリボ核酸化合物（３）に対して、リン酸化試薬を作用させることによって、３’位の水酸基をリン酸化して、次の一般式（１ａ）で表されるリボ核酸化合物を製造する工程、
    ［式中、Ｂ、Ｒ１は、前記と同義である。Ｒ２１は置換されていてもよいアリール又は１〜２環性であって置換されていてもよい複素環基を示す。］
    （ｃ） 一方、上記（ｂ）とは別に、上記（ａ）の工程により製造されるリボ核酸化合物（３）に対して、リン酸化試薬とリン酸基を保護する試薬とを作用させることによって、次の一般式（１ｂ）で表されるリボ核酸化合物を製造する工程、
    ［式中、Ｂ、Ｒ１、Ｒ２１は、前記と同義である。Ｒ２２は置換されていてもよいアルキルを示す。］
    （ｄ） 上記（ｃ）の工程により製造されるリボ核酸化合物（１ｂ）に対して、レブリニル基を脱保護して、次の一般式（５）で表されるリボ核酸化合物を製造する工程、
    ［式中、Ｂ、Ｒ１、Ｒ２１、Ｒ２２は、前記と同義である。］
    （ｅ） 上記（ｂ）又は（ｄ）の工程により製造されるリボ核酸化合物（１ａ）又は（５）を少なくとも一つは構成モノマーとして使用する段階的オリゴマー化によって、次の一般式（６）で表されるオリゴ核酸化合物を製造する工程、
    ［式中、各Ｂ’は、独立して、アデニン、グアニン、シトシン、ウラシル若しくはチミン又はそれらの修飾体を示す。各Ｒ０は、独立してＨ、置換されていてもよいアリール又は１〜２環性であって置換されていてもよい複素環基を示す。
    Ｒ３ａは、Ｈ、レブリニル又は４，４’−ジメトキシトリチルを示す。
    ｑは、前記と同義である。
    各Ｒ１ａは、少なくとも一つは０℃〜６０℃のいずれかの温度においてｐＨ２〜４の酸性条件下２４時間で９０％以上脱離することができる保護基によって置換された水酸基であり、それ以外は独立してＨ、又は０℃〜６０℃のいずれかの温度においてｐＨ２〜４の酸性条件下２４時間で９０％以上脱離することができる保護基によって置換された水酸基を示す。
    Ｒ２ａは、アシル又は次の一般式（７）で表されるリン酸基を示す。
    式中、Ｒ２ａａは、置換されていてもよいアリール又は１〜２環性であって置換されていてもよい複素環基を示す。Ｒ２ａｂは、Ｈ又は置換されていてもよいアルキルを示す。］
    （ｆ） 上記（ｅ）の工程により製造されるオリゴ核酸化合物（６）の保護基をすべて脱保護する工程。
  12. Ｒ１が、２−テトラヒドロフラニル又は１，３−ジオキソラン−２−イルである、請求項１１記載のオリゴ核酸化合物の液相合成法。
  13. ｑが１〜１００の範囲内の整数である、請求項１１又は１２に記載のオリゴ核酸化合物の液相合成法。
  14. ｑが１０〜５０の範囲内の整数である、請求項１１〜１３のいずれかに記載のオリゴ核酸化合物の液相合成法。
  15. レブリニル化剤がレブリン酸、レブリン酸無水物、レブリン酸エステル、又はレブリン酸ハロゲン化物である、請求項１１〜１４のいずれかに記載のオリゴ核酸化合物の液相合成法。
  16. リン酸化試薬が、２−クロロフェニルホスホロジトリアゾリド、２−クロロフェニル−Ｏ，Ｏ−ビス（１−ベンゾトリアゾリル）ホスフェート又は２−クロロ−４−ｔｅｒｔ−ブチルフェニルホスホロジトリアゾリドである、請求項１１〜１５のいずれかに記載のオリゴ核酸化合物の液相合成法。
  17. リン酸基を保護する試薬が、３−ヒドロキシプロピオニトリル又は２，２，２−トリクロロエタノ−ルである請求項１１〜１６のいずれかに記載のオリゴ核酸化合物の液相合成法。
JP2005517313A 2004-01-27 2005-01-26 リボ核酸化合物及びオリゴ核酸化合物の液相合成法 Active JP4802712B2 (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2005517313A JP4802712B2 (ja) 2004-01-27 2005-01-26 リボ核酸化合物及びオリゴ核酸化合物の液相合成法

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2004018060 2004-01-27
JP2004018060 2004-01-27
PCT/JP2005/000974 WO2005070946A1 (ja) 2004-01-27 2005-01-26 リボ核酸化合物及びオリゴ核酸化合物の液相合成法
JP2005517313A JP4802712B2 (ja) 2004-01-27 2005-01-26 リボ核酸化合物及びオリゴ核酸化合物の液相合成法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPWO2005070946A1 true JPWO2005070946A1 (ja) 2007-09-06
JP4802712B2 JP4802712B2 (ja) 2011-10-26

Family

ID=34805550

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2005517313A Active JP4802712B2 (ja) 2004-01-27 2005-01-26 リボ核酸化合物及びオリゴ核酸化合物の液相合成法

Country Status (7)

Country Link
US (1) US20070172925A1 (ja)
EP (1) EP1710249A4 (ja)
JP (1) JP4802712B2 (ja)
KR (1) KR20060129026A (ja)
CN (1) CN1910193A (ja)
CA (1) CA2554618A1 (ja)
WO (1) WO2005070946A1 (ja)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2005224486B2 (en) * 2004-03-23 2008-12-04 Jun Fujita Sequence capable of accelerating gene expression at moderately low temperature
KR20080041672A (ko) * 2005-09-05 2008-05-13 준 후지타 경도의 저온에서 유전자의 발현을 촉진시키는 서열
US11725073B2 (en) 2020-12-29 2023-08-15 Hongene Biotech Corporation Compositions and methods for liquid phase oligonucleotide synthesis
US11851454B2 (en) 2021-12-30 2023-12-26 Hongene Biotech Corporation Compositions and methods for liquid phase oligonucleotide synthesis

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6677120B2 (en) * 2001-03-30 2004-01-13 Isis Pharmaceuticals, Inc. Building blocks for the solution phase synthesis of oligonucleotides

Also Published As

Publication number Publication date
CN1910193A (zh) 2007-02-07
EP1710249A4 (en) 2008-02-20
EP1710249A1 (en) 2006-10-11
US20070172925A1 (en) 2007-07-26
WO2005070946A1 (ja) 2005-08-04
KR20060129026A (ko) 2006-12-14
CA2554618A1 (en) 2005-08-04
JP4802712B2 (ja) 2011-10-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5157168B2 (ja) ホスホロアミダイト化合物及びオリゴｒｎａの製法
CA2080231C (en) 2'-o-alkylnucleotides as well as polymers which contain such nucleotides
KR101279393B1 (ko) 보호된 3'-아미노 뉴클레오시드 단량체의 합성
JPWO2019208571A1 (ja) アミダイト化合物及び該化合物を用いたポリヌクレオチドの製造方法
CA2528294A1 (en) Processes for preparing 4'-azido nucleoside derivatives
WO1995035102A1 (en) Novel method of preparation of known and novel 2'-modified nucleosides by intramolecular nucleophilic displacement
JP2017522387A (ja) ゲムシタビン−［フェニル（ベンゾキシ−ｌ−アラニニル）］ホスフェートの製造方法リン酸誘導体を製造する方法
EP1645561A1 (en) Method of synthesizing cyclic bisdinucleoside
WO2023282245A1 (ja) ヌクレオチド類の精製方法及びヌクレオチド類の精製装置並びに疎水性試薬及び疎水性基質
CN109563121B (zh) 5’s-lna核苷酸和寡核苷酸
EP1995253B1 (en) Method for detaching protecting group on nucleic acid
WO2019053476A1 (en) SYNTHESIS OF FLOXURIDINE
JP4802712B2 (ja) リボ核酸化合物及びオリゴ核酸化合物の液相合成法
KR20060035652A (ko) β-Ｌ-2-데옥시 뉴클레오시드의 합성
EP2017282A1 (en) Method of capping oligonucleic acid
EP0611075A1 (en) Modified oligodeoxyribonucleotides, their preparation and their therapeutic use
EP1995252A1 (en) Method for removal of nucleic acid-protecting group
EP2053054B1 (en) Method for introducing nucleic-acid-protecting group
KR20130029108A (ko) 올리고뉴클레오타이드 합성을 위한 n-thio 화합물의 새로운 사용 방법
EP0735044B1 (en) Preparation of D4T from 5-methyluridine
WO2021079617A1 (ja) 配糖体化合物、アミダイト化合物、およびこれら化合物を用いたポリヌクレオチドの製造方法
EP0850248B1 (en) Compositions and methods for the synthesis of organophosphorus derivatives
RU2131880C1 (ru) Способ получения обогащенных бета-аномером нуклеозидов
JP2004107329A (ja) ４’−ｃ−エチニル−２’−デオキシプリンヌクレオシドの製造法
Damha Developments in the chemical synthesis of nucleic acids and their analogues

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20071029

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20071029

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20110222

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20110419

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20110712

A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20110725

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

Ref document number: 4802712

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20140819

Year of fee payment: 3

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250