KR20060129026A - 리보핵산 화합물 및 올리고핵산 화합물의 액상 합성법 - Google Patents

리보핵산 화합물 및 올리고핵산 화합물의 액상 합성법 Download PDF

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니뽄 신야쿠 가부시키가이샤
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Abstract

올리고 RNA를 액상 합성하기 위해 중요한 인산 트리에스테르화된 신규한 리보핵산 화합물을 제공한다.
본 발명으로서, 하기 화학식으로 표시되는 리보핵산 화합물을 들 수 있다.
Figure 112006059950019-PCT00030
식 중, B는 아데닌, 구아닌, 시토신 또는 우라실, 또는 이들의 수식체를 나타내고, R21은 치환되어 있더라도 좋은 아릴 또는 1 내지 2환성으로서 치환되어 있더라도 좋은 복소환기를 나타내고, R20은 H 또는 치환되어 있더라도 좋은 알킬을 나타내고, R1은 0℃ 내지 60℃ 중 어느 한 온도에서 pH 2 내지 4의 산성 조건하 24 시간에서 90% 이상 탈리할 수 있는 보호기를 나타낸다.

Description

리보핵산 화합물 및 올리고핵산 화합물의 액상 합성법{RIBONUCLEIC ACID COMPOUND AND METHOD OF LIQUID-PHASE SYNTHESIS OF OLIGONUCLEIC ACID COMPOUND}
본 발명은 치료약, 진단약 또는 연구 시약으로서 유용한 올리고 RNA를 액상 합성하기 위해 중요한 인산 트리에스테르화된 신규한 리보핵산 화합물에 관한 것이다.
올리고핵산 화합물은, 현재 치료나 진단 방법으로서의 중요한 역할을 담당해 오고 있다. 올리고핵산 화합물의 제법으로서는, 일반적으로 3가지의 방법이 알려져 있다. Reese에 의해 개발된 인산 트리에스테르법[문헌(Tetrahedron 1978, 34, 3143)] 및 Beaucage에 의해 개발된 아미다이트법[문헌(Methods in Molecular Biology: Protocols for Oligonucleotides and Analogs; Agrawal, ed.; Humana Press: Totowa, 1993, Vol. 20, 33-61)] 및 Froehler에 의한 H-포스페이트법[문헌(Methods in Molecular Biology: Protocols for Oligonucleotides and Analogs; Agrawal, ed.; Humana Press: Totowa, 1993, Vol. 20, 63-80)]을 들 수 있다. 인산 트리에스테르법은 주로 액상 합성에서 이용되고, 아미다이트법 및 H-포스페이트법은 주로 고상 합성에서 이용된다.
현재, 올리고핵산 화합물의 제조에서 사용되고 있는 제법은 고상법이다. 고 상법은 용이하게 올리고머의 제조를 달성할 수 있지만, 수지상에서 반응을 행하는 형편상, 반응 장소에 제한이 있고, 스케일을 크게 하기 어렵다.
대량의 올리고핵산 화합물을 공급하는 데에는, 액상에 의한 올리고핵산 화합물의 합성법을 개발하는 것이 불가결하지만, 현재 대량의 올리고핵산 화합물의 공급이 가능하게 되어 있는 것은 올리고 DNA뿐이며, 대량의 올리고 RNA를 제조하는 데 상응하는 액상 합성법은 알려져 있지 않다.
올리고 RNA의 액상 합성을 행하기 위해서는, 인산 트리에스테르법에서의 원료로서 사용 가능한 구성 단량체인 리보오스 3' 위치 수산기가 인산 트리에스테르체이면서, 또한 단계적 올리고머화의 최종 단계에서, 용이하게 모든 보호기를 탈보호할 수 있는 고도로 보호된 리보핵산 화합물을 대량으로 공급할 수 있어야 한다.
올리고 RNA 합성에 필요한 구성 단량체인 고도로 보호된 리보핵산 화합물의 각 관능기의 보호기에 필요한 조건으로서, 다음과 같은 것을 생각할 수 있다. (1) 올리고 RNA가 축합 반응 조건하에서 안정적으로 존재할 수 있을 것, (2) 분자 내에 다른 보호기가 존재하는 경우, 각 보호기가 다른 조건에서 선택적으로 탈보호할 수 있을 것, (3) 올리고 RNA가 안정적으로 존재할 수 있는 조건하에서 용이하게 보호기만을 탈보호할 수 있을 것이다.
리보오스 2' 위치 수산기의 보호기로서는, 예컨대 t-부틸디메틸실릴기 등의 규소 보호기, 2-테트라히드로푸라닐, 2-테트라히드로피라닐 등의 아세탈 보호기를 들 수 있다. 특히, 아세탈 보호기는 올리고 RNA의 탈보호 단계에서 인산 전위나 그에 수반되는 단쇄화(短鎖化) 등의 부반응이 일어나지 않는 pH 2 내지 4의 온화한 수성 산성 조건하에서 제거하는 것이 가능하다.
한편, 리보오스 5' 위치 수산기의 보호기로서는 예컨대 4,4'-디메톡시트리틸기, 레불리닐기를 들 수 있다. 리보오스 2' 위치 수산기의 보호기로서 아세탈 보호기를 사용한 경우, 올리고 RNA를 제조하기 위한 최종 축합 단계에서 리보오스 5' 위치 수산기의 보호기로서 4,4'-디메톡시트리틸기를 사용하면, 최후의 탈보호 단계에서 산성 조건에서 양쪽의 보호기를 제거하는 것이 가능하다. 그러나, 올리고 RNA를 제조하는 도중의 단계에서 리보오스 5' 위치 수산기의 보호기로서 4,4'-디메톡시트리틸기를 사용하는 것은, 아세탈 보호기를 그대로 존재시켜 놓기 어렵기 때문에 피하는 편이 좋다.
대신에, 리보오스 5' 위치 수산기의 보호기로서, 레불리닐기(CH3-CO-(CH2)2-CO-)를 이용하는 경우, 아세탈 보호기가 빠지지 않는 중성 조건으로 히드라진을 처리함으로써 탈보호하는 것이 가능하다.
이들 2 종류의 보호기(레불리닐기와 테트라히드로푸라닐기)를 조합시킨 화합물로서는, 올리고 RNA의 고상 합성법에 사용 가능한 리보오스 3' 위치 수산기가 아미다이트화된 리보핵산 화합물이 알려져 있다(예컨대, 비특허 문헌 1 참조).
그러나, 올리고 RNA의 액상 합성법에 사용 가능한 리보오스 2' 위치 수산기가 아세탈 보호되고, 리보오스 5' 위치 수산기가 레불리닐화되며, 리보오스 3' 위치 수산기가 인산 트리에스테르화된 리보핵산 화합물은 아직 알려져 있지 않다.
종래, 리보오스 5' 위치 수산기에 레불리닐기를 도입한 화합물은 화학적인 방법을 이용하여 제조할 수 있음이 알려져 있다. 예컨대, 리보오스 2' 위치가 테트라히드로푸라닐기로 보호되고, 리보오스 3' 위치와 5' 위치가 수산기인 리보핵산 화합물에 대하여 레불린산과 2-클로로-1-메틸피리디늄 요오드를 반응시키는 방법이 알려져 있다(예컨대, 비특허 문헌 1 참조). 그러나, 이 방법으로는 리보오스 5' 위치 수산기만을 선택적으로 레불리닐화할 수 없고, 리보오스 3' 위치의 수산기만이 레불리닐화되거나, 리보오스 3' 위치와 5' 위치의 양쪽의 수산기가 레불리닐화되거나 한다. 이들을 분리하기 위해 정제 단계 등이 필요하게 되고, 목적으로 하는 리보오스 5' 위치만 수산기를 선택적으로 레불리닐화된 화합물은 저수율(30% 내지 68%)로 얻어지는 데 그쳐, 대량으로 원료를 얻기 위해서는 상당한 시간과 비용이 요구된다.
한편, 올리고 RNA의 합성과는 무관한 것이기는 하지만, 리보오스 3' 위치와 5' 위치가 수산기인 리보핵산 화합물에 대하여 리파아제를 이용하여 아실화하는 방법이 알려져 있다(예컨대, 비특허 문헌 2 참조). 리파아제로서 캔디다 안타크티카 리파아제 B(Candida antarctica lipase B)(CAL-B)를 사용하여, 위치 선택적으로 핵산 화합물의 리보오스 5' 위치 수산기를 아실화하는 것이다. 또한, 역시 올리고 RNA의 합성과는 무관한 것이기는 하지만, 같은 방법을 이용하여 DNA나 리보오스 2' 위치 수산기를 용이하게 빠지지 않는 치환기(메톡시에톡시, 메틸)로 치환한 핵산 화합물에 대하여 리보오스 5' 위치 수산기를 위치 선택적으로 레불리닐화하는 방법이 알려져 있다(예컨대, 특허 문헌 1 참조).
그러나, 올리고 RNA 합성에는 필수인 리보핵산 화합물이 안정적으로 존재할 수 있는 조건에서 탈보호할 수 있는 화합물, 예컨대 리보오스 2' 위치의 수산기가 0℃ 내지 60℃ 중 어느 한 온도에서 pH 2 내지 4의 산성 조건하 24 시간에서 90% 이상 탈리할 수 있는 보호기를 갖는 리보핵산 화합물에 대하여 리파아제를 이용하여 위치 선택적으로 레불리닐화하는 방법은 알려져 있지 않다.
비특허 문헌 1: Tetrahedron Vol. 46, No. 19, pp. 6673-6688, 1990
비특허 문헌 2: Journal of Organic Chemistry Vol. 58, No. 3, pp. 653-660, 1993
특허 문헌 1: WO02/079215호 팸플릿
발명의 개시
발명이 해결하고자 하는 과제
본 발명의 주된 목적은, 올리고 RNA를 액상 합성하기 위해 중요한 인산 트리에스테르화된 신규한 리보핵산 화합물을 제공하는 것에 있다.
또한, 인산 트리에스테르화된 리보핵산 화합물을 제조하기 위해 중요한, 리보오스 2' 위치의 수산기가 0℃ 내지 60℃의 어느 한 온도에서 pH 2 내지 4의 산성 조건하 24 시간에서 90% 이상 탈리할 수 있는 보호기로 보호된 리보핵산 화합물에 대하여 리보오스 5' 위치의 수산기를 위치 선택적으로 레불리닐화하는 제법을 제공하는 것에 있다.
또한, 신규한 올리고 RNA의 액상 합성법을 제공하는 것에 있다.
과제를 해결하기 위한 수단
본 발명자들은 예의 검토를 거듭한 결과, 리파아제를 이용하여 리보오스 5' 위치의 수산기를 레불리닐화함으로써 상기 목적을 달성할 수 있는 것을 발견하여, 본 발명을 완성하였다.
본 발명으로서, 하기 화학식 1로 표시되는 리보핵산 화합물(이하, 「본 발명 화합물」이라고 함)을 들 수 있다.
[화학식 1]
Figure 112006059950019-PCT00001
식 중, B는 아데닌, 구아닌, 시토신 또는 우라실, 또는 이들의 수식체(modified form)를 나타낸다. R20은 H 또는 치환되어 있더라도 좋은 알킬을 나타낸다. R21은 치환되어 있더라도 좋은 아릴 또는 1 내지 2환성으로서 치환되어 있더라도 좋은 복소환기를 나타낸다. R1은 0℃ 내지 60℃ 중 어느 한 온도에서 pH 2 내지 4의 산성 조건하 24 시간에서 90% 이상 탈리할 수 있는 보호기를 나타낸다. 바람직하게는, 15℃ 내지 40℃ 중 어느 한 온도에서 pH 2 내지 4의 산성 조건하 24 시간에서 90% 이상 탈리할 수 있는 보호기이다. 보다 바람직하게는, 2-테트라히드로푸라닐 또는 1,3-디옥솔란-2-일을 들 수 있다.
R20에 관한 「알킬」로서는, 예컨대 직쇄형 또는 분지쇄형의 탄소수 1 내지 4의 것, 예컨대 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, sec-부틸, tert-부틸을 들 수 있다. R20에 관한 「알킬」은 치환되어 있더라도 좋고, 이러한 치환기로서는, 예컨대 할로겐, 알킬, 알콕시, 시아노 및 니트로로 이루어지는 군으로부터 1 내지 3 개의 동일 또는 상이한 치환기를 선택할 수 있다. 이 「알킬」의 치환기인 「할로겐」으로서는, 예컨대 불소, 염소, 브롬, 요오드를 들 수 있다. 이 「알킬」의 치환기인 「알킬」로서는, 예컨대 직쇄형 또는 분지쇄형의 탄소수 1 내지 4의 것, 예컨대 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, sec-부틸, tert-부틸을 들 수 있다. 이 「알킬」의 치환기인「알콕시」로서는, 예컨대 직쇄형 또는 분지쇄형의 탄소수 1 내지 4의 것, 예컨대 메톡시, 에톡시, n-프로폭시, 이소프로폭시, n-부톡시, 이소부톡시, sec-부톡시, tert-부톡시를 들 수 있다. R20은 그 중에서도 2-시아노에틸, 2,2,2-트리클로로에틸, 2,2,2-트리브로모에틸이 바람직하다.
R21에 관한 「아릴」로서는, 탄소수 6 내지 12의 것, 예컨대 페닐, 1-나프틸, 2-나프틸, 비페닐을 들 수 있다. 이 「아릴」은 치환되어 있더라도 좋고, 이러한 치환기로서는, 예컨대 할로겐, 알킬, 알콕시, 시아노 및 니트로로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 내지 3 개의 동일 또는 상이한 치환기를 선택할 수 있다. 이 「아릴」의 치환기인 「할로겐」으로서는, 예컨대 불소, 염소, 브롬, 요오드를 들 수 있다. 이 「아릴」의 치환기인 「알킬」로서는, 예컨대 직쇄형 또는 분지쇄형의 탄소수 1 내지 4의 것, 예컨대 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, sec-부틸, tert-부틸을 들 수 있다. 이 「아릴」의 치환기인 「알콕시」로서는, 예컨대 직쇄형 또는 분지쇄형의 탄소수 1 내지 4의 것, 예컨대 메톡시, 에톡시, n-프로폭시, 이소프로폭시, n-부톡시, 이소부톡시, sec-부톡시, tert-부톡시를 들 수 있다. 그 중에서도 2-클로로페닐, 2-클로로-4-tert-부틸페닐이 바람직하다.
R21에 관한 「1 내지 2환성으로서 치환되더라도 좋은 복소환기」로서는, 예컨대 질소 원자, 산소 원자, 황 원자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 헤테로 원자 1 내지 3 개를 포함하고, 1 내지 6 개의 불포화 결합을 갖고 있더라도 좋은 5 내지 12원의 단환 또는 축합환을 들 수 있다. 이러한 치환기로서는, 예컨대 알킬, 알콕시, 할로겐, 니트로로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 내지 3 개의 동일 또는 상이한 치환기를 들 수 있다. 이 「1 내지 2환성으로서 치환되더라도 좋은 복소환기」의 치환기인 「할로겐」으로서는, 예컨대 불소, 염소, 브롬, 요오드를 들 수 있다. 이 「1 내지 2환성으로서 치환되더라도 좋은 복소환기」의 치환기인 「알킬」로서는, 예컨대 직쇄형 또는 분지쇄형의 탄소수 1 내지 4의 것, 예컨대 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, sec-부틸, tert-부틸을 들 수 있다. 이 「1 내지 2환성으로서 치환되더라도 좋은 복소환기」의 치환기인 「알콕시」로서는, 예컨대 직쇄형 또는 분지쇄형의 탄소수 1 내지 4의 것, 예컨대 메톡시, 에톡시, n-프로폭시, 이소프로폭시, n-부톡시, 이소부톡시, sec-부톡시, tert-부톡시를 들 수 있다. R21은 그 중에서도 1-벤조트리아졸, 1-모폴리노가 바람직하다.
여기서, 「수식체」란 복소환 염기 부분이 임의의 치환기로 치환되어 있는 화합물을 말한다.
B의 「수식체」에 관한 치환기로서는, 예컨대 할로겐, 아실, 알킬, 아릴알킬, 알콕시, 알콕시알킬, 히드록시, 아미노, 모노알킬아미노, 디알킬아미노, 카르복시, 시아노 및 니트로로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 내지 3 개의 동일 또는 상이한 치환기를 들 수 있다.
B의 수식체에 관한 「알콕시」로서는, 예컨대 직쇄형 또는 분지쇄형의 탄소수 1 내지 4의 것, 예컨대 메톡시, 에톡시, n-프로폭시, 이소프로폭시, n-부톡시, 이소부톡시, sec-부톡시, tert-부톡시를 들 수 있다. 그 중에서도 탄소수 1 내지 4의 것이 바람직하고, 특히 메톡시가 바람직하다. 「알콕시알킬」의 알콕시 부분도, 상기 B의 수식체에 관한 「알콕시」와 동일한 것을 들 수 있다.
B의 수식체에 관한 「할로겐」으로서는, 예컨대 불소, 염소, 브롬, 요오드를 들 수 있다.
B의 수식체에 관한 「알킬」로서는, 예컨대 직쇄형 또는 분지쇄형의 탄소수 1 내지 4의 것, 예컨대 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, sec-부틸, tert-부틸을 들 수 있다. 「아릴알킬」, 「알콕시알킬」, 「모노알킬아미노」, 「디알킬아미노」의 알킬 부분도, 상기 B의 수식체에 관한 「알킬」과 동일한 것을 들 수 있다. B의 수식체에 관한 「알킬」은 치환되어 있더라도 좋고, 이러한 치환기로서는, 예컨대 할로겐, 알킬, 알콕시, 시아노 및 니트로로 이루어지는 군으로부터 1 내지 3 개의 동일 또는 상이한 치환기를 선택할 수 있다. 이 「알킬」의 치환기인 「할로겐」으로서는, 예컨대 불소, 염소, 브롬, 요오드를 들 수 있다. 이 「알킬」의 치환기인 「알킬」로서는, 예컨대 직쇄형 또는 분지쇄형의 탄소수 1 내지 4의 것, 예컨대 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, sec-부틸, tert-부틸을 들 수 있다. 이 「알킬」의 치환기인 「알콕시」로서는, 예컨대 직쇄형 또는 분지쇄형의 탄소수 1 내지 4의 것, 예컨대 메톡시, 에톡시, n-프로폭시, 이소프로폭시, n-부톡시, 이소부톡시, sec-부톡시, tert-부톡시를 들 수 있다.
B의 수식체에 관한 「아릴알킬」의 「아릴」로서는, 예컨대 탄소수 6 내지 12의 것, 예컨대 페닐, 1-나프틸, 2-나프틸, 비페닐을 들 수 있다. B의 수식체에 관한 「아릴알킬」의「아릴」은 치환되어 있더라도 좋고, 이러한 치환기로서는, 예컨대 할로겐, 알킬, 알콕시, 시아노 및 니트로로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 내지 3 개의 동일 또는 상이한 치환기를 선택할 수 있다. 이 「아릴」의 치환기인 「할로겐」으로서는, 예컨대 불소, 염소, 브롬, 요오드를 들 수 있다. 이 「아릴」의 치환기인「알킬」로서는, 예컨대 직쇄형 또는 분지쇄형의 탄소수 1 내지 4의 것, 예컨대 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, sec-부틸, tert-부틸을 들 수 있다. 이 「아릴」의 치환기인 「알콕시」로서는, 예컨대 직쇄형 또는 분지쇄형의 탄소수 1 내지 4의 것, 예컨대 메톡시, 에톡시, n-프로폭시, 이소프로폭시, n-부톡시, 이소부톡시, sec-부톡시, tert-부톡시를 들 수 있다.
B의 수식체에 관한 「아실」로서는, 예컨대 직쇄형 또는 분지쇄형의 탄소수 1 내지 6의 알카노일, 탄소수 7 내지 13의 아로일을 들 수 있다. 예컨대 포르밀, 아세틸, 프로피오닐, 부티릴, 이소부티릴, 발레릴, 헥사노일, 벤조일, 나프토일을 들 수 있다. B의 수식체에 관한 「아실」은 치환되어 있더라도 좋고, 이러한 치환기로서는, 예컨대 할로겐, 알킬, 알콕시, 시아노 및 니트로로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 내지 3 개의 동일 또는 상이한 치환기를 선택할 수 있다. 이 「아실」의 치환기인 「할로겐」으로서는, 예컨대 불소, 염소, 브롬, 요오드를 들 수 있다. 이 「아실」의 치환기인 「알킬」로서는, 예컨대 직쇄형 또는 분지쇄형의 탄소수 1 내지 4의 것, 예컨대 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, sec-부틸, tert-부틸을 들 수 있다. 이 「아실」의 치환기인 「알콕시」로서는, 예컨대 직쇄형 또는 분지쇄형의 탄소수 1 내지 4의 것, 예컨대 메톡시, 에톡시, n-프로폭시, 이소프로폭시, n-부톡시, 이소부톡시, sec-부톡시, tert-부톡시를 들 수 있다. 예컨대 B가 아데닌, 시토신 및 구아닌의 경우, 아미노기를 아실기로 치환함으로써, 아실기는 보호기로서의 역활을 다 한다. 구체적으로는, 아데닌 및 시토신에 대해서는 예컨대 4-아니소일을, 구아닌에 대해서는 예컨대 이소부티릴을 들 수 있다.
본 발명 화합물은 그대로 이용할 수도 있지만, 통상의 방법에 의해 염의 형태로 이용할 수도 있다. 이러한 「염」으로서는, 예컨대 나트륨염, 칼륨염 등의 알칼리 금속염, 칼슘염 등의 알칼리토류 금속염, 또는 트리에틸아민, 피리딘 등의 3급 유기 아민염을 들 수 있다.
본 발명 화합물의 구체예로서는, 하기의 (1) 내지 (8)의 리보핵산 화합물을 들 수 있다.
(1) 2-시아노에틸 2-클로로페닐 5'-O-레불리닐-2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N4-(4-아니소일)시티딘-3'-일 포스페이트
(2) 2-클로로페닐 5'-O-레불리닐-2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N4-(4-아니소일)시티딘-3'-일 포스페이트
(3) 2-시아노에틸 2-클로로페닐 5'-O-레불리닐-2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)우리딘-3'-일 포스페이트
(4) 2-클로로페닐 5'-O-레불리닐-2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)우리딘-3'-일 포스페이트
(5) 2-시아노에틸 2-클로로페닐 5'-O-레불리닐-2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N6-(4-아니소일)아데노신-3'-일 포스페이트
(6) 2-클로로페닐 5'-O-레불리닐-2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N6-(4-아니소일)아데노신-3'-일 포스페이트
(7) 2-시아노에틸 2-클로로페닐 5'-O-레불리닐-2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N2-이소부티릴구아노신-3'-일 포스페이트
(8) 2-클로로페닐 5'-O-레불리닐-2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N2-이소부티릴구아노신-3'-일 포스페이트
또한, 본 발명으로서 예컨대, 하기 (A) 내지 (C) 중 어느 한 단계를 포함하는 리보오스 5' 위치의 수산기를 위치 선택적으로 레불리닐화하는 리보핵산 화합물의 제법을 들 수 있다.
(A) 하기 화학식 2로 표시되는 리보핵산 화합물에 레불리닐화제와 리파아제를 작용시키는 것에 의해 5' 위치의 수산기를 위치 선택적으로 레불리닐화하는 것을 특징으로 하는, 하기 화학식 3으로 표시되는 리보핵산 화합물의 제법:
Figure 112006059950019-PCT00002
식 중, B, R1은 상기와 동일한 의미이다.
(B) 하기 화학식 2로 표시되는 리보핵산 화합물에 레불리닐화제와 리파아제를 작용시키는 것에 의해 5' 위치의 수산기를 위치 선택적으로 레불리닐화하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 제법에 의해 제조되는, 하기 화학식 3으로 표시되는 리보핵산 화합물에 대하여 인산화 시약을 작용시키는 것에 의한, 하기 화학식 1a로 표시되는 리보핵산 화합물의 제법:
Figure 112006059950019-PCT00003
식 중, B, R1, R21은 상기와 동일한 의미이다.
(C) 하기 화학식 2로 표시되는 리보핵산 화합물에 레불리닐화제와 리파아제를 작용시키는 것에 의해 5' 위치의 수산기를 위치 선택적으로 레불리닐화하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 제법에 의해 제조되는, 하기 화학식 3으로 표시되는 리보핵산 화합물에 대하여 인산화 시약과 인산기를 보호하는 시약을 작용시키는 것에 의한, 하기 화학식 1b로 표시되는 리보핵산 화합물의 제법:
Figure 112006059950019-PCT00004
식 중, B, R1, R21은 상기와 동일한 의미이다. R22은 치환되어 있더라도 좋은 알킬을 나타낸다.
R22에 관한 「알킬」 및 그 치환기로서는, 예컨대 상기 R20과 동일한 것을 들 수 있다.
본 발명에 관한 「리파아제」로서는, 예컨대 각각의 기질에 적합한 리파아제를 들 수 있다. 바람직하게는, 예컨대 캔디다 안타크티카 리파아제 B(Novozym 435: 노보노디스크사제), 알칼리젠즈 트리아실글리세롤 리파아제(Alcaligenes triacylglycerol lipase)(LIPASE-QL: 메이토산교(주)사제)를 들 수 있다.
본 발명에 관한 「레불리닐화제」로서는, 예컨대 레불린산, 레불린산 무수물, 레불린산 에스테르, 레불린산 할로겐화물을 들 수 있다. 이러한 「레불린산 에스테르」로서는, 예컨대 레불린산메틸, 레불린산에틸, 레불린산비닐을 들 수 있다. 이러한 「레불린산 할로겐화물」으로서는, 예컨대 레불린산플루오라이드, 레불린산클로라이드, 레불린산브로마이드, 레불린산요오드를 들 수 있다. 그 중에서도, 레불린산 무수물이 바람직하다.
본 발명에 관한 「인산화 시약」으로서는, 예컨대 2-클로로페닐포스포로디트리아졸리드, 2-클로로페닐-O,O-비스(1-벤조트리아졸릴)포스페이트 또는 2-클로로-4-tert-부틸페닐포스포로디트리아졸리드를 들 수 있다.
「인산기를 보호하는 시약」으로서는, 예컨대 3-히드록시프로피오니트릴 또는 2,2,2-트리클로로에탄올을 들 수 있다.
또한, 본 발명으로서, 예컨대 다음 (a) 내지 (f) 단계를 포함하는, 하기 화학식 4로 표시되는 올리고핵산 화합물의 액상 합성법을 들 수 있다.
[화학식 4]
Figure 112006059950019-PCT00005
[식 중, 각 Bx는 독립적으로 아데닌, 구아닌, 시토신, 우리실 또는 티민, 또는 이들의 수식체를 나타내고,
q는 1 내지 100의 범위 내인 정수를 나타내며, q는 10 내지 50의 범위 내인 정수이더라도 좋고, 또한 보다 바람직하게는, 15 내지 30의 범위 내인 정수이더라도 좋으며,
각 R'은 하나 이상은 수산기이며, 그것 이외는 독립적으로 H 또는 수산기를 나타냄]
Bx의 수식체에 관한 치환기로서는, 예컨대 할로겐, 알킬, 아릴알킬, 알콕시, 히드록시, 아미노, 모노알킬아미노, 디알킬아미노, 카르복시, 시아노 및 니트로로 이루어지는 군으로부터 1 내지 3 개의 동일 또는 상이한 치환기를 선택할 수 있다.
Bx의 수식체에 관한 「할로겐」, 「알킬」, 「알콕시」, 「아릴알킬」의 「아릴」로서는, 상기 B와 동일한 것을 들 수 있다.
(a) 하기 화학식 2로 표시되는 리보핵산 화합물에 레불리닐화제와 리파아제를 작용시키는 것에 의해 5' 위치의 수산기를 위치 선택적으로 레불리닐화하여 하기 화학식 3으로 표시되는 리보핵산 화합물을 제조하는 단계.
Figure 112006059950019-PCT00006
[식 중, B, R1은 상기와 동일한 의미이며, 「리파아제」, 「레불리닐화제」도 상기와 동일한 의미임]
(b) 상기 (a)의 단계에 의해 제조되는 리보핵산 화합물(3)에 대하여, 인산화 시약을 작용시키는 것에 의해 3' 위치의 수산기를 인산화하여 하기 화학식 1a로 표시되는 리보핵산 화합물을 제조하는 단계.
[화학식 1a]
Figure 112006059950019-PCT00007
[식 중, B, R1, R21은 상기와 동일한 의미이며, 「인산화 시약」도 상기와 동일한 의미임]
(c) 한편, 상기 (b)와는 별도로, 상기 (a)의 단계에 의해 제조되는 리보핵산 화합물(3)에 대하여, 인산화 시약과 인산기를 보호하는 시약을 작용시키는 것에 의해 하기 화학식 1b로 표시되는 리보핵산 화합물을 제조하는 단계.
[화학식 1b]
Figure 112006059950019-PCT00008
[식 중, B, R1, R21, R22, 「인산화 시약」, 「인산기를 보호하는 시약」은 상기와 동일한 의미임]
(d) 상기 (c)의 단계에 의해 제조되는 리보핵산 화합물(1b)에 대하여, 리보오스 5' 위치의 수산기를 보호하고 있는 레불리닐기를 제거하여 하기 화학식 5로 표시되는 리보핵산 화합물을 제조하는 단계.
Figure 112006059950019-PCT00009
[식 중, B, R1, R21, R 22는 상기와 동일한 의미이며, 본 발명에 관한 「레불리닐기를 제거하는 시약」으로서는, 예컨대 0.5 M 히드라진 일수화물/피리딘-아세트산(4:1) 용액을 들 수 있음]
(e) 상기 (b) 또는 (d)의 단계에 의해 제조되는 리보핵산 화합물 (1a) 또는 (5) 중 하나 이상을 구성 단량체로서 사용하는 단계적 올리고머화의 단계.
「구성 단량체」란, 올리고핵산 화합물을 구성하는 디옥시리보핵산 화합물, 리보핵산 화합물 또는 그 수식체를 말한다.
「구성 단량체」에 관한 「수식체」로서는 상기와 동일한 것을 들 수 있다.
「단계적 올리고머화」란, 핵산 중합도가 2 내지 101의 올리고핵산 화합물 또는 핵산 중합도가 2 내지 100의 올리고핵산 블록을 제조하기 위한 축합 단계와 선택적 탈보호 단계를 포함하고 있고, 축합 단계로서는, 핵산 단량체 블록끼리의 축합 단계, 핵산 단량체 블록과 핵산 중합도가 2 내지 100의 올리고핵산 블록의 축합 단계, 또는 핵산 중합도가 2 내지 99의 상이한 올리고핵산 블록끼리의 축합 단계를 들 수 있다. 구체적으로는, 목적으로 하는 올리고핵산 화합물의 핵산 중합도에 따라 임의로 선택된 핵산 단량체 블록 또는 올리고핵산 블록을 축합함으로써, 올리고핵산 화합물을 제조할 수 있다. 예컨대, 핵산 중합도가 30인 올리고핵산을 제조하는 경우에 있어서, 핵산 단량체 블록과 핵산 중합도 29의 올리고핵산 블록을 사용하는 제법, 또는 핵산 중합도 5의 올리고핵산 블록과 핵산 중합도 25의 올리고핵산 블록을 사용하는 제법을 생각할 수 있다.
「핵산 단량체 블록」이란, 올리고핵산 화합물을 제조하기 위한 디옥시리보핵산 화합물, 리보핵산 화합물 또는 이들의 수식체이다. 「수식체」로서는 상기와 동일한 것을 들 수 있다.
「올리고핵산 블록」이란, 올리고핵산 화합물을 합성하기 위한 디옥시리보핵산 화합물, 리보핵산 화합물 또는 이들의 수식체를 구성 단량체로 하는 핵산 중합도가 2 내지 100의 화합물이다. 「수식체」로서는 상기와 동일한 것을 들 수 있다.
「핵산 중합도」는, 올리고핵산 화합물을 구성하는 핵산 단량체의 총수를 나타낸다.
본 발명에서 사용하는 「핵산 단량체 블록」, 「올리고핵산 블록」으로서는 하기 화학식 8과 9의 화합물을 들 수 있다.
하기 화학식 8로 표시되는 화합물은 핵산 단량체 블록(m=0) 또는 올리고핵산 블록(m=1 내지 99)을 나타낸다.
[화학식 8]
Figure 112006059950019-PCT00010
식 중, 각 B'는 독립적으로 아데닌, 구아닌, 시토신, 우라실 또는 티민, 또는 이들의 수식체를 나타낸다.
각 B'의「수식체」에 관한 치환기로서는 상기 B와 동일한 것을 들 수 있다.
R2는 아실, 치환되어 있더라도 좋은 인산기를 나타낸다.
각 Rk1은 독립적으로 치환되어 있더라도 좋은 아릴 또는 1 내지 2환성으로서 치환되어 있더라도 좋은 복소환기를 나타낸다. Rk1에 관한 「아릴」, 그 치환기, 「1 내지 2환성으로서 치환되어 있더라도 좋은 복소환기」및 그 치환기로서는 상기 R21과 동일한 것을 들 수 있다.
m은, 0 내지 99의 범위 내인 정수를 나타낸다.
R2에 관한 「아실」로서는, 예컨대 직쇄형 또는 분지쇄형의 탄소수 1 내지 6의 알카노일, 탄소수 7 내지 13의 아로일을 들 수 있고, 예컨대 포르밀, 아세틸, 프로피오닐, 부티릴, 이소부티릴, 발레릴, 헥사노일, 벤조일, 나프토일을 들 수 있다. R2에 관한 「아실」은 치환되어 있더라도 좋고, 이러한 치환기로서는, 예컨대 할로겐, 알킬, 알콕시, 시아노 및 니트로로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 내지 3 개의 동일 또는 상이한 치환기를 선택할 수 있다. 이 「아실」의 치환기인 「할로겐」으로서는, 예컨대 불소, 염소, 브롬, 요오드를 들 수 있다. 이 「아실」의 치환기인 「알킬」로서는, 예컨대 직쇄형 또는 분지쇄형의 탄소수 1 내지 4의 것, 예컨대 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, sec-부틸, tert-부틸을 들 수 있다. 이 「아실」의 치환기인 「알콕시」로서는, 예컨대 직쇄형 또는 분지쇄형의 탄소수 1 내지 4의 것, 예컨대 메톡시, 에톡시, n-프로폭시, 이소프로폭시, n-부톡시, 이소부톡시, sec-부톡시, tert-부톡시를 들 수 있다.
R2에 관한 「치환되어 있더라도 좋은 인산기」의 치환기로서는, 치환되어 있더라도 좋은 아릴, 1 내지 2환성으로서 치환되어 있더라도 좋은 복소환기 또는 치환되어 있더라도 좋은 알킬을 들 수 있다. 「아릴」, 그 치환기, 「1 내지 2환성으로서 치환되어 있더라도 좋은 복소환기」 및 그 치환기는, 상기 R21과 동일한 것을 들 수 있다. 「알킬」및 그 치환기로서는, 상기 R22와 동일한 것을 들 수 있다. 각 R은 H 또는 0 내지 60℃ 중 어느 한 온도에서 pH 2 내지 4의 산성 조건하 24 시간에서 90% 이상 탈리할 수 있는 보호기로 치환된 수산기를 나타낸다. 바람직하게는, H 또는 15 내지 40℃ 중 어느 한 온도에서 pH 2 내지 4의 산성 조건하 24 시간에서 90% 이상 탈리할 수 있는 보호기로 치환된 수산기이다. 보다 바람직하게는, H, 2-테트라히드로푸라닐 또는 1,3-디옥솔란-2-일로 치환된 수산기를 들 수 있다.
하기 화학식 9로 표시되는 화합물은, 핵산 단량체 블록(n=1) 또는 올리고핵산 블록(n=2-100)을 나타낸다.
[화학식 9]
Figure 112006059950019-PCT00011
식 중, 각 B', 각 R은 상기와 동일한 의미이다.
각 Rk2은 독립적으로 치환되어 있더라도 좋은 아릴 또는 1 내지 2환성으로서 치환되어 있더라도 좋은 복소환기를 나타낸다. Rk2에 관한 「아릴」, 그 치환기, 「1 내지 2환성으로서 치환되어 있더라도 좋은 복소환기」 및 그 치환기로서는, 상기 R21과 동일한 것을 들 수 있다.
R3은 레불리닐 또는 4,4'-디메톡시트리틸을 나타낸다.
n은 1 내지 100의 범위 내인 정수를 나타낸다.
「축합 단계」는 하기의 4개로 분류할 수 있다.
(i) 핵산 단량체 블록과 핵산 단량체 블록의 축합 단계
핵산 단량체 블록의 적어도 하나가, 리보핵산 화합물 (1a) 또는 (5)인 핵산 단량체 블록끼리의 축합 단계.
(ii) 핵산 단량체 블록과 핵산 중합도가 2 내지 100의 올리고핵산 블록의 축합 단계(1)
핵산 단량체 블록이 리보핵산 화합물 (1a) 또는 (5)이며, 핵산 중합도가 2 내지 100의 올리고핵산 블록이 화합물 (8) 또는 (9)인 핵산 단량체 블록과 핵산 중합도가 2 내지 100의 올리고핵산 블록의 축합 단계.
(iii) 핵산 단량체 블록과 핵산 중합도가 2 내지 100의 올리고핵산 블록의 축합 단계(2)
핵산 단량체 블록이, 화합물 (8) 또는 (9)이며, 핵산 중합도가 2 내지 100의 올리고핵산 블록 (8) 또는 (9)가 구성 단량체로서 리보핵산 화합물 (1a) 또는 (5) 중 적어도 하나를 포함하는, 핵산 단량체 블록과 핵산 중합도가 2 내지 100의 올리고핵산 블록의 축합 단계.
(iv) 핵산 중합도가 2 내지 99의 상이한 올리고핵산 블록끼리의 축합 단계
핵산 중합도가 2 내지 99의 올리고핵산 블록 (8) 또는 (9)가 구성 단량체로서 리보핵산 화합물 (1a) 또는 (5) 중 적어도 하나를 포함하는, 핵산 중합도가 2 내지 99의 상이한 올리고핵산 블록 (8)과 (9)의 축합 단계.
상기 (i) 내지 (iv)로 나타나는 축합 단계는, 핵산 단량체 블록 또는 올리고핵산 블록의 5' 위치 수산기와, 다른 핵산 단량체 블록 또는 올리고핵산 블록의 3' 위치 수산기에 치환되어 있는 인산기를. 축합 시약을 작용시키는 것에 의해 축합하는 단계이다.
본 발명에 관한 「축합 시약」으로서는, 예컨대 1-(2-메시틸렌술포닐)-3-니트로-1,2,4-트리아졸, 2,4,6-트리메틸벤젠술포닐테트라졸 또는 1-(2,4,6-트리이소프로필벤젠술포닐)-3-니트로-1,2,4-트리아졸을 들 수 있다.
「선택적 탈보호 과정」이란, 축합 단계에서 제조된 올리고핵산 화합물에서, 5' 말단 구성 단량체의 5' 위치 수산기에 치환되어 있는 보호기인, 예컨대 레불리닐기 또는 3' 말단 구성 단량체의 3' 위치 수산기에 치환되어 있는 인산기상의 보호기인, 예컨대 시아노에틸기를 제거하는 단계를 말한다.
「레불리닐기를 제거하는 시약」은 상기와 동일한 의미이다.
본 발명에 관한 리보오스 3' 위치 수산기로 치환되어 있는 인산기상의 보호기인 「시아노에틸기를 제거하는 시약」으로서는, 예컨대 피리딘-트리에틸아민-물(3:1:1) 용액을 들 수 있다.
제조되는 보호된 올리고핵산 화합물의 구체예로서는, 예컨대 하기 화학식 6으로 표시되는 것을 들 수 있다.
[화학식 6]
Figure 112006059950019-PCT00012
식 중, 각 B'는 독립적으로 상기와 동일한 의미이다.
각 R0은 독립적으로 H, 치환되어 있더라도 좋은 아릴 또는 1 내지 2환성으로서 치환되어 있더라도 좋은 복소환기를 나타낸다. 바람직하게는, 독립적으로 H, 치환되어 있더라도 좋은 페닐 또는 1 내지 2환성으로서 치환되어 있더라도 좋은 복소환기를 들 수 있다. 보다 바람직하게는, 2-클로로페닐 또는 2-클로로-4-tert-부틸페닐을 들 수 있다. R0에 관한 「아릴」, 「1 내지 2환성으로서 치환되어 있더라도 좋은 복소환기」및 그 치환기로서는, 상기 R21과 동일한 것을 들 수 있다.
R3a는 H, 레불리닐 또는 4,4'-디메톡시트리틸을 나타낸다.
q는 상기와 동일한 의미이다.
각 R1a는 하나 이상은, 0℃ 내지 60℃ 중 어느 한 온도에서 pH 2 내지 4의 산성 조건하 24 시간에서 90% 이상 탈리할 수 있는 보호기에 의해 치환된 수산기이며, 그것 이외는 독립적으로 H, 또는 0℃ 내지 60℃ 중 어느 한 온도에서 pH 2 내지 4의 산성 조건하 24 시간에서 90% 이상 탈리할 수 있는 보호기에 의해 치환된 수산기를 나타낸다. 바람직하게는, H, 또는 15℃ 내지 40℃ 중 어느 한 온도에서 pH 2 내지 4의 산성 조건하 24 시간에서 90% 이상 탈리할 수 있는 보호기로 치환된 수산기이다. 보다 바람직하게는, H, 2-테트라히드로푸라닐 또는 1,3-디옥솔란-2-일로 치환된 수산기를 들 수 있다.
R2a는 아실 또는 하기 화학식 7로 표시되는 인산기를 나타낸다.
[화학식 7]
Figure 112006059950019-PCT00013
식 중, R2aa는 치환되어 있더라도 좋은 아릴 또는 1 내지 2환성으로서 치환되어 있더라도 좋은 복소환기를 나타낸다. R2ab는 H 또는 치환되어 있더라도 좋은 알킬을 나타낸다.
R2aa에 관한 「아릴」, 그 치환기, 「1 내지 2환성으로서 치환되어 있더라도 좋은 복소환기」및 그 치환기로서는, 상기 R21과 동일한 것을 들 수 있다. 바람직하게는, 2-클로로페닐 또는 2-클로로-4-tert-부틸페닐을 들 수 있다.
R2ab에 관한 「알킬」및 그 치환기로서는, 상기 R22와 동일한 것을 들 수 있다.
R2a에 관한 「아실」로서는, 상기 R2와 동일한 것을 들 수 있다.
(f) 상기 (e)의 단계에 의해 제조되는 보호된 올리고핵산 화합물(6)의 보호기를 모두 탈보호하는 단계.
각 보호기를 제거하기 위한 시약으로서는 다음의 것을 생각할 수 있다.
1) N1,N1,N3,N3-테트라메틸구아니딘 및 피리딘-2-카르복스알독심
2) 농 암모니아수
3) 아세트산 완충액(pH=3 내지 4)
4) 80% 아세트산 수용액
5) 희염산 용액(pH=2 내지 4)
단, 3) 내지 5)의 시약에 대해서는, 그 중 하나를 사용하면 좋지만, 바람직하게는 3)을 사용하는 것이 좋다.
「아세트산 완충액」으로서는, 예컨대 아세트산나트륨-아세트산 완충액, 또는 테트라메틸에틸렌디아민-아세트산 완충액을 들 수 있다.
발명을 실시하기 위한 최선의 형태
본 발명은 다음과 같이 실시할 수 있다.
하기의 제법에서, 원료를 반응시키고 싶지 않은 치환기(예컨대, 히드록시, 아미노, 카르복시)를 갖는 경우는, 원료를 미리 공지한 방법에 의해 보호기(예컨대, 벤조일 또는 4-아니소일기)로 보호한 후에 반응에 이용하는 것이 일반적이다. 반응 후에 접촉 환원, 알카리 처리, 산 처리 등의 공지의 방법에 의해 보호기를 탈리할 수 있다.
단계 (a) (리보핵산의 리보오스 5' 위치 수산기에 레불리닐화하는 제조법)
Figure 112006059950019-PCT00014
식 중, B, R1,「리파아제」,「레불리닐화제」는 상기와 동일한 의미이다.
본 발명에서의 리보핵산 5' 위치의 수산기에 레불리닐기를 도입하는 방법에서, 화합물(2)과 과잉의 레불리닐화 시약을 적당한 용매중에 현탁하고, 리파아제와 반응시킴으로써, 소망하는 리보오스 5' 위치 수산기에 레불리닐화된 생성물(3)을 선택적으로 얻을 수 있다.
레불리닐화 시약의 사용량은 화합물(2)에 대하여 1 내지 20 배 몰량이 좋고, 보다 바람직하게는, 1 내지 10배 몰량이다.
사용하는 용매로서는, 반응에 관여하지 않으면 특별히 한정되지 않지만, 예컨대 테트라히드로푸란, 디에틸에테르, 1,4-디옥산 등의 에테르류, N,N-디메틸포름아미드, N,N-디메틸아세트아미드 등의 아미드류, 아세토니트릴, 프로피오니트릴 등의 니트릴류, 벤젠, 톨루엔 등의 탄화수소 또는 이들의 혼합 용매를 들 수 있다.
상기 반응에서의 반응 온도는, 효소 활성의 최적 온도인 20℃ 내지 50℃가 바람직하다. 반응 시간은 사용하는 원료의 종류, 반응 온도에 따라 다르지만, 통상적으로 30 분 내지 100 시간이 적당하다.
단계 (b)(리보핵산의 리보오스 3' 위치 수산기에 인산 유도체화하는 제법-그 1)
Figure 112006059950019-PCT00015
식 중, B, R1, R21, 「인산화 시약」은 상기와 동일한 의미이다.
본 발명에서, 리보핵산 화합물(3)에 유기 염기 존재하에서 인산화 시약과 작용시키는 것에 의해 고도로 보호된 리보핵산 화합물(1a)을 제조할 수 있다. 사용하는 용매로서는 반응에 관여하지 않으면 특별히 한정되지 않지만, 예컨대 테트라히드로푸란, 디에틸에테르, 1,4-디옥산 등의 에테르류, 아세토니트릴, 프로피오니트릴 등의 니트릴류, 벤젠, 톨루엔 등의 탄화수소물 또는 이들의 혼합 용매를 들 수 있다. 인산 도입 시약은 화합물(3)에 대하여 1 내지 20배 몰량, 보다 바람직하게는, 1 내지 10배 몰량이다.
반응 온도는 예컨대 -20℃ 내지 100℃가 적당하며, 0℃ 내지 80℃가 바람직하고, 5℃ 내지 30℃가 보다 바람직하다. 반응 시간은 사용하는 원료의 종류, 반응 온도에 따라 다르지만, 통상 30 분 내지 100 시간이 적당하다.
단계 (c)(리보핵산의 리보오스 3' 위치 수산기에 인산 유도체화하는 제법-그 2)
Figure 112006059950019-PCT00016
식 중, B, R1, R21, R22, 「인산화 시약」, 「인산기를 보호하는 시약」은 상기와 동일한 의미이다.
본 발명에서, 리보핵산 화합물(3)에 유기 염기 존재하에서 인산화 시약과 인산기를 보호하는 시약을 작용시키는 것에 의해 고도로 보호된 리보핵산 화합물(1b)을 제조할 수 있다. 사용하는 용매로서는, 반응에 관여하지 않으면 특별히 한정되지 않지만, 예컨대 테트라히드로푸란, 디에틸에테르, 1,4-디옥산 등의 에테르류, 아세토니트릴, 프로피오니트릴 등의 니트릴류, 벤젠, 톨루엔 등의 탄화수소 또는 이들의 혼합 용매를 들 수 있다. 인산 도입 시약의 사용량은 화합물(3)에 대하여, 1 내지 20배 몰량, 보다 바람직하게는, 1 내지 10배 몰량이다. 인산기를 보호하기 위한 시약의 사용량은 화합물(3)에 대하여 1 내지 20배 몰량, 보다 바람직하게는, 1 내지 10배 몰량이다. 반응 온도는, 예컨대 -20℃ 내지 100℃가 적당하며, 0℃ 내지 80℃가 바람직하고, 5℃ 내지 30℃가 보다 바람직하다. 반응 시간은 사용하는 원료의 종류, 반응 온도에 따라 다르지만, 통상 30 분 내지 100 시간이 적당하다.
단계 (d)(리보오스 5' 위치의 수산기를 보호하고 있는 레불리닐기를 제거하는 단계)
Figure 112006059950019-PCT00017
식 중, B, R1, R21, R22, 「레불리닐기를 제거하는 시약」은 상기와 동일한 의미이다.
화합물(1b)에 레불리닐기를 제거하는 시약을 첨가함으로써, 화합물(5)을 제조할 수 있다. 본 반응은 무용매 또는 적당한 용매중에서 행해진다. 사용되는 용매는 반응에 관여하지 않으면 특별히 한정되지 않지만, 예컨대 메탄올, 에탄올 등의 알콜류, 테트라히드로푸란, 디에틸에테르, 1,4-디옥산 등의 에테르류, N,N-디메틸포름아미드, N,N-디메틸아세트아미드 등의 아미드류, 아세토니트릴, 프로피오니트릴 등의 니트릴류, 벤젠, 톨루엔 등의 탄화수소 또는 이들의 혼합 용매를 들 수 있다. 레불리닐기를 제거하기 위한 시약의 사용량은 화합물(1b)에 대하여 1 내지 20배 몰량, 보다 바람직하게는, 1 내지 10배 몰량이다. 반응 온도는, 예컨대 -20℃ 내지 100℃가 적당하며, 0℃ 내지 80℃가 바람직하고, 15℃ 내지 65℃가 보다 바람직하다. 반응 시간은 사용하는 원료의 종류, 반응 온도에 따라 다르지만, 통상 30 분 내지 100 시간이 적당하다.
올리고핵산 화합물의 액상 합성법을 이하에 나타낸다.
단계 (e)(단계적 올리고핵산의 제조 방법-그 1)
본 단계는 올리고핵산 화합물의 단계적 제조 과정에서, 화학식 1a 또는 5로 표시되는 리보핵산 화합물을 구성 단량체로서 하나 이상은 이용하는 단계적 올리고머화이다. 단계적 올리고머화는 축합 단계와 선택적 탈보호 단계로 이루어지고 있다.
축합 단계에서, 축합 시약을 작용시킴으로써, 올리고핵산 화합물 또는 올리고핵산 블록을 제조할 수 있다. 통상적으로 적당한 용매중, 과잉의 유기 아민 존재하에서 반응을 행한다. 사용하는 용매로서는, 반응에 관여하지 않으면 특별히 한정되지 않지만, 예컨대 테트라히드로푸란, 디에틸에테르, 1,4-디옥산 등의 에테르류, 아세토니트릴, 프로피오니트릴 등의 니트릴류, 벤젠, 톨루엔 등의 탄화수소, 피리딘 등의 유기 아민류 또는 이들의 혼합 용매를 들 수 있다. 유기 아민으로서는 피리딘 등을 들 수 있다. 축합 시약의 사용량은 화학식 1a, 화학식 5로 표시되는 리보핵산 화합물 또는 화학식 8, 화학식 9로 표시되는 핵산 단량체 블록 또는 올리고핵산 블록에 대하여, 1 내지 20배 몰량, 보다 바람직하게는, 1 내지 10배 몰량이다. 상기 반응에서의 반응 온도는, 예컨대 -20℃ 내지 100℃가 적당하며, 0℃ 내지 80℃가 바람직하고, 5℃ 내지 30℃가 보다 바람직하다. 반응 시간은 사용하는 원료의 종류, 반응 온도에 따라 다르지만, 통상 30 분 내지 100 시간이 적당하다.
선택적 탈보호 단계는, 상기 축합 단계에서 제조되는 올리고핵산 블록을 다음의 축합 단계에 사용할 수 있도록 탈보호하는 시약을 작용시키고, 선택적으로 탈보호된 올리고핵산 블록을 제조하는 단계이다. 구체적으로는, 상기 축합 단계에서 제조된 올리고핵산 블록에서, 5' 말단의 핵산 분자 5' 위치 수산기에 치환되어 있는 보호기인, 예컨대 레불리닐기, 또는 3' 말단의 핵산 분자 3' 위치 수산기에 치환되어 있는 인산기상의 보호기인, 예컨대 시아노에틸기를 제거하는 단계이다.
「레불리닐기를 제거하는 시약」, 「시아노에틸기를 제거하는 시약」은 상기와 동일한 의미이다.
특히, 최종적으로 올리고핵산 화합물을 제조하는 단계에서는 R3이 4,4-디메톡시트리틸기와 같은 지용성이 매우 높은 보호기를 구비한 화학식 8, 화학식 9로 표시되는 핵산 단량체 블록 또는 올리고핵산 블록을 축합 과정에 사용하는 것이 바람직하다. 반응 종료 후, 정제 과정에서 핵산 화합물 유래의 불순물과 분리하는 단계에서 매우 적합하며, 탈보호 단계에서 각 리보오스 2' 위치의 보호기와 동일한 조건에서 탈보호할 수 있기 때문에 단계를 줄일 수 있는 이점이 있다.
단계 (f)(단계적 올리고핵산의 제조 방법-그 2)
Figure 112006059950019-PCT00018
식 중, 각 Bx, R', R0, R1a, R2a, R3a, q는 상기와 동일한 의미이다.
화합물(6)에 각 보호기를 탈보호하는 시약을 첨가하고, 반응시킴으로써 화합물(4)을 얻을 수 있다. 사용하는 용매로서는 반응에 관여하지 않으면 특별히 한정되지 않지만, 예컨대 테트라히드로푸란, 디에틸에테르, 1,4-디옥산 등의 에테르류, 피리딘 등의 유기 아민류, 28% 암모니아 수용액 또는 이들의 혼합 용매를 들 수 있다. 유기 아민으로서는 피리딘 등을 들 수 있다. 상기 반응에서의 반응 온도는, 예컨대 -20℃ 내지 100℃가 적당하며, 0℃ 내지 80℃가 바람직하고, 10℃ 내지 60℃가 보다 바람직하다. 반응 시간은 사용하는 원료의 종류, 반응 온도에 따라 다르지만, 통상 30 분 내지 100 시간이 적당하다.
본 발명에 관한 화합물은, 상기한 반응 혼합물로부터 통상의 분리 정제 수단, 예컨대 추출, 농축, 중화, 여과, 원심 분리, 재결정, 실리카겔 컬럼 크로마토그래피, 박층 크로마토그래피, 역층 ODS 컬럼 크로마토그래피, 소수 컬럼 크로마토그래피, 이온 교환 컬럼 크로마토그래피, 겔 여과 컬럼 크로마토그래피, 투석, 한외 여과 등의 수단을 이용함으로써 단리 정제할 수 있다.
이하에 참고예, 실시예를 들어 본 발명을 더 자세히 설명하지만, 본 발명은 이들에 한정되는 것이 아니다.
참고예 1
2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 4 -(4-아니소일)시티딘
단계 1 3',5'-O-(1,1,3,3-테트라이소프로필디실록산-1,3-디일)-2'-O-트리메틸실릴-N 4 -(4-아니소일)시티딘의 합성
시티딘 20.0 g을 무수의 피리딘 200 ml에 현탁하고, 1,3-디클로로-1,1,3,3-테트라이소프로필디실록산 27.2 g을 적하하여 10 분간 교반 후, 실온으로 되돌려 90 분간 교반하였다. 반응액에 0℃하에 트리메틸실릴클로라이드 20.6 g을 적하하고, 실온하 2 시간 교반하였다. 계속해서 4-아니소일클로라이드 28.1 g을 적하하고, 실온하 1.5 시간 교반하며, 반응액에 빙수 60 ml를 첨가하여 10 분간 교반 후, 암모니아수 25 ml를 첨가하고, 실온하 30 분간 교반하였다. 반응액을 물 400 ml에 따르고, 디클로로메탄으로 추출하며, 디클로로메탄층을 포화 탄산수소나트륨 수용액 및 포화 식염수로 세정하고, 건조, 농축하였다. 얻어진 잔류물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(n-헥산:아세트산에틸=3:1 내지 1:1)로 정제하여, 상기 화합물 39.5 g을 얻었다.
단계 2 3',5'-O-(1,1,3,3-테트라이소프로필디실록산-1,3-디일)-N 4 -(4-아니소일)시티딘의 합성
3',5'-O-(1,1,3,3-테트라이소프로필디실록산-1,3-디일)-2'-O-트리메틸실릴-N4-(4-아니소일)시티딘 39.5 g을 디클로로메탄 200 ml, 메탄올 200 ml에 용해하고, 피리듐 p-톨루엔술폰산 7.2 g을 첨가하며, 65℃하 3 시간 교반하였다. 트리에틸아민을 첨가하여 중화하고, 농축하였다. 잔류물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(n-헥산:아세트산에틸=1:2 내지 1:4)로 정제하여, 상기 화합물 34.0 g을 얻었다.
단계 3 3',5'-O-(1,1,3,3-테트라이소프로필디실록산-1,3-디일)-2'-O-2-(2-테트라히드로푸라닐)-N 4 -(4-아니소일)시티딘의 합성
3',5'-O-(1,1,3,3-테트라이소프로필디실록산-1,3-디일)-N4-(4-아니소일)시티딘 30.0 g, 2,3-디히드로푸란 10.2 g을 무수의 테트라히드로푸란 150 ml에 용해하고, 0℃하 캠퍼술폰산 5.62 g을 소량씩 첨가하며, 실온하 1 시간 교반하였다. 포화 탄산수소나트륨 수용액중에 따르고, 아세트산에틸로 추출하며, 포화 식염수로 세정 후, 건조, 농축하였다. 잔류물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(n-헥산:아세트산에틸=1:3)로 정제하여, 상기 화합물 31.5 g을 얻었다.
단계 4 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 4 -(4-아니소일)시티딘의 합성
3',5'-O-(1,1,3,3-테트라이소프로필디실록산-1,3-디일)-2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N4-(4-아니소일)시티딘 33.2 g을 무수의 테트라히드로푸란 80 ml에 용해하고, 1 M 테트라-n-부틸암모늄플루오라이드/테트라히드로푸란 용액 97 ml를 15 분에 걸쳐 적하하며, 실온하 1 시간 교반하였다. 반응액을 농축하고, 포화 탄산수소나트륨 수용액을 첨가하며, 디클로로메탄으로 추출하고, 포화 식염수로 세정 후, 건조, 농축하였다. 잔류물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(3% 메탄올/디클로로메탄 내지 5% 메탄올/디클로로메탄)로 정제하여, 목적 화합물 7.11 g을 얻었다.
참고예 2
시티딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 티미딘 3'-아세테이트
단계 1 3'-O-아세틸티미딘의 합성
5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)티미딘 2.0 g을 피리딘 공비 후, 0℃하 무수 아세트산 0.75 g을 첨가하여 실온하 21 시간 교반하였다. 농축 후 클로로포름에 용해하여 포화 탄산수소나트륨 수용액, 포화 식염수로 세정하고, 건조, 농축하였다. 잔류물을 n-헥산으로 세정하고, 건조하여 5'-O-(4,4-디메톡시트리틸)-3'-O-아세틸티미딘 1.84 g을 얻었다.
상기 5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-3'-O-아세틸티미딘 1.84 g을 디클로로메탄 30 ml에 용해하고, 0.38 M 벤젠술폰산/메탄올 16.5 ml를 0℃하 적하하며, 15 분간 교반하였다. 반응액에 포화 탄산수소나트륨 수용액을 첨가하여 디클로로메탄으로 추출하고, 건조, 농축하였다. 잔류물을 에테르로 세정하고, 건조하여 상기 화합물 0.32 g을 얻었다.
단계 2 2-클로로페닐 5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)티미딘-3'-일 포스페이트 트리에틸렌아민염의 합성
5'-0-(4,4'-디메톡시트리틸)티미딘 2.0 g을 피리딘 공비 후, 0.28 M의 2-클로로페닐포스포로디트리아졸리드/디옥산 용액 20 ml를 첨가하고, 실온하 1 시간 교반하였다. 50% 피리딘 수용액 8 ml를 첨가하여 농축하였다. 잔류물에 0.2 M 탄산수소트리에틸암모늄 수용액 20 ml를 첨가하고, 디클로로메탄 추출하였다. 디클로로메탄층을 0.2 M 탄산수소트리에틸암모늄 수용액 20 ml로 2회 세정하고, 건조, 농축하였다. 잔류물을 아세트산에틸, n-헥산으로부터 결정화하고, 건조하여 상기 화합물 1.88 g을 얻었다.
단계 3 5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)티미딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 티미딘 3'-아세테이트의 합성
2-클로로페닐 5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)티미딘-3'-일 포스페이트 트리에틸아민염 및 3'-O-아세틸티미딘을 피리딘 공비 후, 무수 피리딘 3 ml에 용해하고, 1-(2-메시틸렌술포닐)-3-니트로-1,2,4-트리아졸(MSNT) 0.71 g을 첨가하여 실온하 1 시간 교반하였다. 반응액에 포화 탄산수소나트륨 수용액을 첨가하고, 디클로로메탄으로 추출하며, 건조, 농축하였다. 잔류물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(2% 메탄올/클로로포름 내지 4% 메탄올/클로로포름, 0.1% 피리딘 함유)로 정제하여, 상기 화합물 1.06 g을 얻었다.
단계 4 티미딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 티미딘 3'-아세테이트의 합성
5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)티미딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴티미딘 3'-아세테이트 1.05 g을 디클로로메탄 10 ml에 용해하고, 0.38 M 벤젠 술폰산/메탄올 용액 5.2 ml를 0℃하 적하하며, 30 분간 교반하였다. 반응액을 포화 탄산수소나트륨 수용액, 포화 식염수로 세정하고, 건조, 농축하여, 목적 화합물 0.69 g을 얻었다.
참고예 3
2-클로로페닐 5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 2 -이소부티릴구아노신-3'-일 포스페이트 트리에틸아민염
단계 1 N 2 -이소부티릴구아노신의 합성
구아노신 20.0 g을 클로로포름 540 ml와 피리딘 70 ml에 현탁하고, 이소부티르산클로라이드 48 ml을 적하하며, 실온하 2 시간 교반하였다. 반응액에 빙수 교반하, 1 N 염산을 첨가하여 디클로로메탄으로 추출하였다. 유기층을 물, 계속해서 1 N 탄산나트륨 수용액으로 세정한 후, 무수 황산마그네슘으로 건조하여 감압 농축하였다. 잔류물을 톨루엔 공비 후, 메탄올 54 ml에 용해하고, 빙수 냉교반하 28% 나트륨메톡시드/메탄올 용액 54 ml를 천천히 적하하여 10 분간 교반하였다. 반응액을 다우엑스(H형)로 중화 후, 여과하여 다우엑스를 제거하여 메탄올로 잘 세정하였다. 모액과 세정액를 합쳐서 감압하 농축하였다. 잔류물을 소량의 메탄올에 용해하고, 아세톤중에 천천히 적하하여 분말로 만들었다. 얻어진 분말을 모아, 상기 화합물을 17.9 g 얻었다.
MS m/z: 354[MH]+
단계 2 3',5'-O-(1,1,3,3-테트라이소프로필디실록산-1,3-디일-N 2 -이소부티릴구아노신의 합성
N2-이소부티릴구아노신 16.9 g을 피리딘 100 ml에 용해하고, 빙수 냉교반하 1,3-디클로로-1,1,3,3-테트라이소프로필디실록산 16.6 g을 적하하여 실온에서 4 시간 교반하였다. 반응액을 수중에 적하하고, 얻어진 결정을 모아 건조하였다. 미정제 결정을 에탄올로부터 재결정하여, 상기 화합물 30.3 g을 얻었다.
융점 179 내지 183℃
MS m/z: 596[MH]+
단계 3 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 2 -이소부티릴구아노신의 합성
3',5'-O-(1,1,3,3-테트라이소프로필디실록산-1,3-디일)-N2-이소부티릴구아노신 30.0 g을 테트라히드로푸란 330 ml에 용해하고, 2,3-디히드로푸란 7.83 g과 (+)-캠퍼술폰산 6.49 g을 첨가하여 실온에서 2 시간 교반한 후, 빙수 냉교반하 1 M 테트라-n-부틸암모늄플루오라이드/테트라히드로푸란 용액 55.0 ml를 적하하여 10 분간 교반하였다. 반응액을 감압하 농축한 후, 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(1% 메탄올/디클로로메탄 내지 2% 메탄올/디클로로메탄)로 정제하여, 상기 화합물 20.2 g을 얻었다.
융점 178 내지 180℃
MS m/z: 424[MH]+
단계 4 5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 2 -이소부티릴구아노신의 합성
2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N2-이소부티릴구아노신 0.70 g을 피리딘 공비 후, 테트라히드로푸란 15 ml와 피리딘 1.34 ml에 현탁하고, 빙수 냉교반하 4,4'-디메톡시트리틸클로라이드 0.61 g을 첨가하며, 실온에서 4 시간 교반하였다. 반응액을 포화 탄산수소나트륨 수용액에 첨가하여 디클로로메탄 추출하였다. 유기층을 포화 식염수로 세정하고, 건조, 농축하였다. 잔류물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(디클로로메탄 내지 1% 메탄올/디클로로메탄)로 정제하여, 상기 화합물 1.00 g을 얻었다.
단계 5 2-클로로페닐 5'-O-(4,4'-디메톡시트리에틸)-2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 2 -이소부티릴구아노신-3-일 포스페이트 트리에틸아민염의 합성
참고예 2 단계 2의 5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)티미딘 대신에 참고예 2 단계 2에서 합성된 화합물을 사용하여 같은 반응을 행하여, 목적 화합물을 얻었다.
실시예 1
5'-O-레불리닐-2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 4 -(4-아니소일)시티딘
2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N4-(4-아니소일)시티딘 7.0 g을 무수의 테트라히드로푸란 280 ml에 현탁하고, 레불린산 무수물 10.1 g, Novozym 435 2.78 g을 첨가하며, 실온하 25 시간 진탕하였다. 레불린산 무수물 3.0 g, Novozym 435 1.0 g을 추가하여 실온하 72 시간 진탕하였다. 반응액을 셀라이트 여과하고, 디클로로메탄으로 세정하며, 여액에 포화 탄산수소나트륨 수용액을 첨가하여 15 시간 교반한 후, 분액하고, 건조, 농축하였다. 잔류물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(2% 메탄올/디클로로메탄)로 정제하여, 목적 화합물 6.02 g을 얻었다.
실시예 2
2-시아노에틸 2-클로로페닐 5'-O-레불리닐-2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 4 -(4-아니소일)시티딘-3'-일 포스페이트
5'-O-레불리닐-2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N4-(4-아니소일)시티딘 3.0 g에 0.56 M의 2-클로로페닐포스포로디트리아졸리드/디옥산 용액 19.5 ml를 첨가하여 용해하고, 이어서 1-메틸이미다졸 0.90 g을 첨가하여 실온하 1 시간 교반하였다. 3-히드록시프로피오니트릴 1.56 g을 첨가하여 실온하 2 시간 교반하였다. 0℃하 50% 피리딘 수용액 5 ml를 첨가하여 5 분간 교반 후, 반응액을 포화 탄산수소나트륨 수용액에 따르고, 디클로로메탄으로 추출하며, 포화 탄산수소나트륨 수용액, 포화 식염수로 세정 후, 건조, 농축하였다. 잔류물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(n-헥산:아세트산에틸=20:80 내지 15:85)로 정제하여, 목적 화합물 3.16 g을 얻었다.
MS m/z: 789.3[MH]+
실시예 3
2-클로로페닐 5'-O-레불리닐-2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 4 -(4-아니소일)시티딘-3'-일 포스페이트 트리에틸아민염
5'-O-레불리닐-2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N4-(4-아니소일)시티딘 3.0 g에 0.56 M의 2-클로로페닐포스포로디트리아졸리드/디옥산 용액 19.5 ml를 첨가하여 용해하고, 이어서 1-메틸이미다졸 0.90 g을 첨가하여 실온하 1 시간 교반하였다. 0℃하 50% 피리딘 수용액 10 ml을 첨가하여 10 분간 교반 후 농축하였다. 잔류물에 0.2 M 탄산수소트리에틸암모늄 수용액 35 ml를 첨가하고, 디클로로메탄 추출하였다. 디클로로메탄층을 0.2 M의 탄산수소트리에틸암모늄 수용액 15 ml로 2회 세정하고, 건조, 농축하였다. 잔류물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(10% 메탄올/디클로로메탄 내지 15% 메탄올/디클로로메탄)로 정제하여, 목적 화합물 4.03 g을 얻었다.
실시예 4
5'-O-레불리닐-2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 2 -이소부티릴구아노신
2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N2-이소부티릴구아노신 5.70 g을 아세토니트릴 270 ml에 현탁하고, 레불린산 무수물 8.66 g과 Novozym AS 2.40 g을 첨가하며, 실온에서 15 시간 교반하였다. 반응액을 여과하여 Novozym AS를 제거하고, 디클로로 메탄으로 잘 세정하였다. 모액과 세정액을 합쳐 거의 같은 체적의 포화 탄산수소나트륨 수용액을 첨가하여 밤새 격렬하게 교반하였다. 유기층을 포화 탄산수소나트륨 수용액, 계속해서 포화 식염수로 세정하고, 건조, 농축하였다. 잔류물을 소량의 디클로로메탄으로 용해하고, n-헥산과 디에틸에테르의 등량 혼합 용매에 천천히 적하하여 분말로 만들었다. 얻어진 분말을 모으고, n-헥산과 디에틸에테르의 등량 혼합 용매로 세정하여, 상기 화합물 6.80 g을 얻었다.
MS m/z: 522[MH]+
실시예 5
2-시아노에틸 2-클로로페닐 5'-O-레불리닐-2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 2 -이소부티릴구아노신-3'-일 포스페이트
실시예 2의 5'-O-레불리닐-2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N4-(4-아니소일)시티딘 대신에, 5'-O-레불리닐-2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N2-이소부티릴구아노신을 이용하여 같은 반응을 행하여, 목적물을 얻었다.
실시예 6
2-클로로페닐 5'-O-레불리닐-2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 2 -이소부티릴구아노신-3'-일 포스페이트 트리에틸아민염
실시예 3의 5'-O-레불리닐-2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N4-(4-아니소일)시 티딘 대신에, 5'-O-레불리닐-2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N2-이소부티릴구아노신을 이용하여 같은 반응을 행하여, 목적물을 얻었다.
실시예 7
2-시아노에틸 2-클로로페닐 5'-O-레불리닐-2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)우린딘-3'-일 포스페이트
실시예 2의 5'-O-레불리닐-2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N4-(4-아니소일)시티딘 대신에, 5'-O-레불리닐-2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)우리딘을 이용하여 같은 반응을 행하여, 목적물을 얻었다.
실시예 8
2-클로로페닐 5'-O-레불리닐-2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)우리딘-3'-일 포스페이트 트리에틸아민염
실시예 3의 5'-O-레불리닐-2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N4-(4-아니소일)시티딘 대신에, 5'-O-레불리닐-2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)우리딘을 이용하여 같은 반응을 행하여, 목적물을 얻었다.
실시예 9
2-시아노에틸 2-클로로페닐 5'-O-레불리닐-2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 6 -(4-아니소일)아데노신-3'-일 포스페이트
실시예 2의 5'-O-레불리닐-2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N4-(4-아니소일)시 티딘 대신에, 5'-O-레불리닐-2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N6-(4-아니소일)아데노신을 이용하여 같은 반응을 행하여, 목적물을 얻었다.
실시예 10
2-클로로페닐 5'-O-레불리닐-2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 6 -(4-아니소일)아데노신-3'-일 포스페이트 트리에틸아민염
실시예 3의 5'-O-레불리닐-2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N4-(4-아니소일)시티딘 대신에, 5'-O-레불리닐-2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N6-(4-아니소일)아데노신을 이용하여 같은 반응을 행하여, 목적물을 얻었다.
실시예 11
아데닐릴-[3'→5']-우리딜릴[3'→5']-구아닐릴-[3'→5']-시티딜릴-[3'→5']-티미딜릴-[3'→5']티미딘
(A) 올리고핵산 블록 A (2'-0-(2-테트라히드로푸라닐)-N 2 -이소부티릴구아노신 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-0-(2-테트라히드로푸라닐)-N 4 -(4-아니소일)시티딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 티미딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 티미딘 3'-아세테이트)
단계 1 2-시아노에틸 2-클로로페닐 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 4 -(4-아니소일)시티딘-3'-일 포스페이트의 합성
2-시아노에틸 2-클로로페닐 5'-O-레불리닐-2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N4-(4-아니소일)시티딘-3'-일 포스페이트 3.16 g에 0.5 M 히드라진/피리딘-아세트산(4:1) 용액 40 ml를 첨가하여 용해하고, 실온하 20 분간 교반하였다. 0℃하 아세톤 10 ml를 첨가하여 5 분간 교반 후, 아세트산에틸 200 ml로 희석하고, 포화 탄산수소나트륨 수용액에 따라서 분액하였다. 아세트산에틸층을 포화 탄산수소나트륨 수용액으로 세정하고, 건조, 농축하였다. 잔류물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(디클로로메탄 내지 5% 메탄올/디클로로메탄)로 정제하여, 상기 화합물 2.43 g을 얻었다.
단계 2 5'-O-레불리닐-2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 2 -이소부티릴구아노신 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 4 -(4-아니소일)시티딘 3'-[O-(2-시아노에틸)(2-클로로페닐)포스페이트]의 합성
2-클로로페닐 5'-O-레불리닐-2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N2-이소부티릴구아노신-3'-일 포스페이트 트리에틸아민염 1.95 g 및 2-시아노에틸 2-클로로페닐 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N4-(4-아니소일)시티딘-3'-일 포스페이트 1.38 g을 피리딘 공비 후, 무수 피리딘 3 ml에 용해하고, 1-(2-메시틸렌술포닐)-3-니트로-1,2,4-트리아졸(MSNT) 1.42 g을 첨가하여 실온하 1 시간 교반하였다. 반응액에 포화 탄산수소나트륨 수용액을 첨가하고, 디클로로메탄으로 추출하며, 건조, 농축하였다. 잔 류물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(2% 메탄올/클로로포름 내지 4% 메탄올/클로로포름, 0.1% 피리딘 함유)로 정제하여, 상기 화합물 2.21 g을 얻었다.
단계 3 5'-O-레불리닐-2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 2 -이소부티릴구아노신 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 4 -(4-아니소일)시티딘 3'-[O-(2-클로로페닐)포스페이트]트리에틸렌아민염의 합성
실시예 11(A) 단계 2에서 합성된 화합물 2.2 g에 피리딘-트리에틸아민-물(3:1:1)의 용액 32 ml를 첨가하여 실온하 30 분간 교반하였다. 반응액을 농축하고 건조하여, 상기 화합물 2.43 g을 얻었다.
단계 4 5'-O-레불리닐-2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 2 -이소부티릴구아노신 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 4 -(4-아니소일)시티딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 티미딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 티미딘 3'-아세테이트의 합성
실시예 11(A) 단계 3의 화합물과 참고예 3의 화합물을 사용하여 실시예 11(A) 단계 2와 동일하게 반응을 행하여, 목적물을 얻었다.
단계 5 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 2 -이소부티릴구아노신 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 4 -(4-아니소일)시티딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 티미딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 티미딘 3'-아세테이트의 합성
실시예 11(A) 단계 1의 2-시아노에틸 2-클로로페닐 5'-O-레불리닐-2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N4-(4-아니소일)시티딘-3'-일 포스페이트 대신에, 5'-O-레불리닐-2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N2-이소부티릴구아노신 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N4-(4-아니소일)시티딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 티미딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 티미딘 3'-아세테이트를 이용하여 같은 반응을 행하여, 목적물을 얻었다.
(B) 올리고핵산 블록 B (5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 6 -(4-아니소일)아데노신 3'-(2'-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)우리딘 3'-[O-(2-시아노에틸)(2-클로로페닐)포스페이트])
단계 1 2-시아노에틸 2-클로로페닐 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)우리딘-3'-일 포스페이트의 합성
실시예 11(A) 단계 1의 2-시아노에틸 2-클로로페닐 5'-O-레불리닐-2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N4-(4-아니소일)시티딘-3'-일 포스페이트 대신에, 2-시아노에틸 2-클로로페닐 5'-O-레불리닐-2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)우리딘-3'-일 포스페이트를 이용하여 같은 반응을 행하여, 목적물을 얻었다.
단계 2 5'-O-레불리닐-2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 6 -(4-아니소일)아데노신 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)우리딘 3'-[O-(2-시 아노에틸)(2-클로로페닐)포스페이트]의 합성
실시예 10에서 합성된 화합물과 실시예 11(B) 단계 1에서 합성된 화합물을 사용하여 실시예 11(A) 단계 2와 같은 반응을 행하여, 목적물을 얻었다.
단계 3 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 6 -(4-아니소일)아데노신 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)우리딘 3'-[O-(2-시아노에틸)(2-클로로페닐)포스페이트]의 합성
실시예 11(A) 단계 1의 2-시아노에틸 2-클로로페닐 5'-O-레불리닐 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N4-(4-아니소일)시티딘-3'-일 포스페이트 대신에, 5'-O-레불리닐-2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N6-(4-아니소일)아데노신 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)우리딘 3'-[O-(2-시아노에틸)(2-클로로페닐)포스페이트]를 이용하여 같은 반응을 행하여, 목적물을 얻었다.
단계 4 5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 6 -(4-아니소일)아데노신 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)우리딘 3'-[O-(2-시아노에틸)(2-클로로페닐)포스페이트]의 합성
실시예 11(B) 단계 3에서 합성된 화합물 0.33 g을 피리딘 공비 후, 테트라히드로푸란 1.3 ml에 용해하고, 피리딘 0.22 ml와 4,4'-디메톡시트리틸클로라이드 0.19 g을 첨가하고, 실온에서 교반하였다. 2 시간 후, 또한 4,4'-디메톡시트리틸클로라이드 0.19 g을 첨가하여 1 시간 교반하였다. 반응액을 포화 탄산수소나트륨 수 용액에 첨가하고, 아세트산에틸로 추출하였다. 유기층을 포화 식염수로 세정하고, 건조, 농축하였다. 잔류물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(디클로로메탄 내지 2% 메탄올/디클로로메탄)로 정제하여, 상기 화합물 0.42 g을 얻었다.
C) 아데닐릴-[3'→5']-우리딜릴-[3'→5']-구아닐릴-[3'→5']-시티딜릴-[3'→5']-티미딜릴-[3'→5']-티미딘
단계 1 완전 보호체의 합성
올리고핵산 블록 B 0.035 g에 피리딘과 트리에틸아민과 물의 혼합 용매(3:1:1, 0.22 ml)를 첨가하고, 실온에서 20 분간 교반하였다. 반응액을 감압 농축하여 피리딘 공비 후, 올리고핵산 블록 A 0.030 g을 첨가하여 피리딘 공비하였다. 잔류물을 피리딘 0.06 ml에 용해하고, 1-(2-메시틸렌술포닐)-3-니트로-1,2,4-트리아졸(MSNT) 0.055 g을 첨가하여 실온에서 1 시간 교반하였다. 반응액에 빙수 냉교반하, 50% 피리딘 수용액 2 ml를 첨가하여 포화 탄산수소나트륨 수용액을 첨가하고, 아세트산에틸 추출하며, 포화 식염수로 세정, 건조, 농축하였다. 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(디클로로메탄 내지 2% 메탄올/디클로로메탄)로 정제하고, 얻은 무색 기포 형태 물질을 소량의 디클로로메탄에 용해하며, 디에틸에테르중에 적하하여 분말로 만들었다. 얻어진 분말을 모아 디에틸에테르로 세정하여, 5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N6-(4-아니소일)아데노신 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)우리딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N2-이소부티릴구아노신 3'-(2-클로로페녹 시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N4-(4-아니소일)시티딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 티미딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 티미딘 3'-아세테이트 0.029 g을 얻었다.
융점 179 내지 183℃
단계 2 탈보호·정제 단계
실시예 11(C) 단계 1에서 합성된 화합물 0.005 g에 0.30 M의 피리딘-2-카르복스알독심과 N1,N1,N3,N3-테트라메틸구아니딘의 50% 디옥산 수용액을 첨가하고, 실온에서 40 시간 교반하였다. 반응액을 감압 농축 후, 피리딘 1 ml에 용해하여 28% 암모니아 수용액 2 ml를 첨가하고, 마개로 밀폐시켜 55℃에서 15 시간 방치하였다. 방냉 후, 감압 농축하여 잔류물에 아세톤을 첨가하고, 원심하여 담황색의 분말을 얻었다. 얻어진 분말을 역상 ODS 컬럼 크로마토그래피(아세토니트릴/0.05 M-TEAA 완충액)로 정제하였다.
얻어진 담황색 분말 화합물에 0.1 M의 아세트산-테트라메틸에틸렌디아민의 완충액(pH 3.88) 0.05 ml를 첨가하고, 60℃에서 30 분간 방치하였다. 반응액을 0.05 M-TEAA 완충액 0.30 ml로 희석하고, 역상 ODS(Sep-Pak VaC 2 g, 물, 계속해서 50% 아세토니트릴 수용액)를 통과시켜, 목적 화합물인 아데닐릴-[3'→5']-우리딜릴-[3'→5']-구아닐릴-[3'→5']-시티딜릴-[3'→5']-티미딜릴-[3'→5']-티미딘 50.4 OD(A260)를 얻었다.
실시예 12 시티딜릴-[3'→5']-시티딜릴-[3'→5']-시티딜릴-[3'→5']-시티딜 릴-[3'→5']-시티딜릴-[3'→5']-시티딜릴-[3'→5']시티딜릴-[3'→5']-시티딜릴-[3'→5']-시티딜릴-[3'→5']-시티딜릴-[3'→5']-시티딜릴-[3'→5']-시티딜릴-[3'→5']-시티딜릴-[3'→5']-시티딜릴-[3'→5']-시티딜릴-[3'→5']-시티딜릴-[3'→5']-시티딜릴-[3'→5']-시티딜릴-[3'→5']-시티딜릴-[3'→5']-티미딜릴-[3'→5']-티미딘
단계 1 5'-O-레불리닐-2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 4 -(4-아니소일)시티딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 4 -(4-아니소일)시티딘 3'-[O-(2-시아노에틸)(2-클로로페닐)포스페이트]의 합성
2-클로로페닐 5'-O-레불리닐-2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N4-(4-아니소일)시티딘-3'-일 포스페이트 트리에틸아민염 1.32 g 및 2-시아노에틸 2-클로로페닐 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N4-(4-아니소일)시티딘-3'-일 포스페이트 0.77 g을 피리딘 공비 후, 무수의 피리딘 4 ml에 용해하고, 1-(2-메시틸렌술포닐)-3-니트로-1,2,4-트리아졸(MSNT) 0.99 g을 첨가하여 실온하 1 시간 교반하였다. 반응액에 포화 탄산수소나트륨 수용액을 첨가하고, 아세트산에틸로 추출하며, 건조, 농축하였다. 잔류물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(1% 메탄올/디클로로메탄 내지 5% 메탄올/디클로로메탄, 0.1% 피리딘 함유)로 정제하여, 상기 화합물 1.39 g을 얻었다.
단계 2 5'-O-레불리닐-2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 4 -(4-아니소일)시티딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 4 -(4-아니소일)시티딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 티미딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 티미딘 3'-아세테이트의 합성
실시예 12 단계 1에서 합성된 화합물 90 mg에 피리딘-트리에틸아민-물(3:1:1)의 용액 0.5 ml를 첨가하고, 실온하 30 분간 교반하였다. 반응액을 농축 후, 티미딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 티미딘 3'-아세테이트 30 mg를 첨가하여 피리딘 공비하였다. 무수 피리딘 0.5 ml에 용해하고, 1-(2-메시틸렌술포닐)-3-니트로-1,2,4-트리아졸(MSNT) 38 mg을 첨가하여 실온하 1 시간 교반하였다. 반응액에 포화 탄산수소나트륨 수용액을 첨가하고, 아세트산에틸로 추출하며, 건조, 농축하였다. 잔류물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(2% 메탄올/디클로로메탄 내지 5% 메탄올/디클로로메탄, 0.1% 피리딘 함유)로 정제하여, 상기 화합물 77 mg을 얻었다.
단계 3 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 4 -(4-아니소일)시티딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 4 -(4-아니소일)시티딘 3'-[O-(2-시아노에틸)(2-클로로페닐)포스페이트]의 합성
실시예 12 단계 1에서 합성된 화합물 550 mg에 0.5 M 히드라진/피리딘-아세트산(4:1) 용액 6 ml를 첨가하여 용해하고, 실온하 30 분간 교반하였다. 0℃하 아세톤 1 ml를 첨가하여 5 분간 교반 후, 아세트산에틸로 희석하고, 포화 탄산수소나트륨 수용액에 따라서 분액하였다. 아세트산에틸층을 포화 탄산수소나트륨 수용액으로 세정하고, 건조, 농축하였다. 잔류물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(2% 메탄올/디클로로메탄 내지 5% 메탄올/디클로로메탄)로 정제하여, 상기 화합물 465 mg 을 얻었다.
단계 4 5'-O-레불리닐-2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 4 -(4-아니소일)시티딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 4 -(4-아니소일)시티딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 4 -(4-아니소일)시티딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 4 -(4-아니소일)시티딘 3'-[O-(2-시아노에틸)(2-클로로페닐)포스페이트]의 합성
실시예 12 단계 1에서 합성된 화합물 726 mg에 피리딘-트리에틸아민-물(3:1:1)의 용액 6ml을 첨가하고, 실온하 15 분간 교반하였다. 반응액을 농축 후, 실시예 12 단계 3에서 합성된 화합물 450 mg을 첨가하여 피리딘 공비하였다. 무수 피리딘 2ml에 용해하고, 1-(2-메시틸렌술포닐)-3-니트로-1,2,4-트리아졸(MSNT) 302 mg을 첨가하여 실온하 2 시간 교반하였다. 반응액에 포화 탄산수소나트륨 수용액을 첨가하고, 아세트산에틸로 추출하며, 건조, 농축하였다. 잔류물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(2% 메탄올/디클로로메탄 내지 5% 메탄올/디클로로메탄, 0.1% 피리딘 함유)로 정제하여, 상기 화합물 860 mg을 얻었다.
단계 5 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 4 -(4-아니소일)시티딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 4 -(4-아니소일)시티딘 3'-[(2-클로로페녹시)포스포릴 티미딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 티미딘 3'-아세테이트의 합 성
실시예 12 단계 2에서 합성된 화합물 70 mg에 0.5 M 히드라진/피리딘-아세트산(4:1) 용액 0.34 ml를 첨가하여 용해하고, 실온하 20 분간 교반하였다. 0℃하 아세톤 1 ml를 첨가하여 5 분간 교반 후, 아세트산에틸로 희석하고, 포화 탄산수소나트륨 수용액에 따라서 분액하였다. 아세트산에틸층을 포화 탄산수소나트륨 수용액으로 세정하고, 건조, 농축하였다. 잔류물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(2% 메탄올/디클로로메탄 내지 5% 메탄올/디클로로메탄)로 정제하여, 상기 화합물 57 mg을 얻었다.
단계 6 5'-O-레불리닐-2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 4 -(4-아니소일)시티딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 4 -(4-아니소일)시티딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐-N 4 -(4-아니소일)시티딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 4 -(4-아니소일)시티딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 4 -(4-아니소일)시티딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 4 -(4-아니소일)시티딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 티미딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 티미딘 3'-아세테이트의 합성
실시예 12 단계 4에서 합성된 화합물 113 mg에 피리딘-트리에틸아민- 물(3:1:1)의 용액 2 ml를 첨가하고, 실온하 15분간 교반하였다. 반응액을 농축 후, 실시예 12 단계 5에서 합성된 화합물 55 mg을 첨가하여 피리딘 공비하였다. 무수 피리딘 0.5 ml에 용해하고, 1-(2-메시틸렌술포닐)-3-니트로-1,2,4-트리아졸(MSNT) 25 mg을 첨가하여 실온하 2 시간 교반하였다. 반응액에 포화 탄산수소나트륨 수용액을 첨가하고, 아세트산에틸로 추출하며, 건조, 농축하였다. 잔류물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(2% 메탄올/디클로로메탄 내지 8% 메탄올/디클로로메탄, 0.1% 피리딘 함유)로 정제하여, 상기 화합물 90 mg을 얻었다.
단계 7 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 4 -(4-아니소일)시티딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 4 -(4-아니소일)시티딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 4 -(4-아니소일)시티딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 4 -(4-아니소일)시티딘 3'-[O-(2-시아노에틸)(2-클로로페닐)포스페이트]의 합성
실시예 12 단계 4에서 합성된 화합물 240 mg에 0.5 M 히드라진/피리딘-아세트산(4:1) 용액 1 ml을 첨가하여 용해하고, 실온하 30 분간 교반하였다. 0℃하 아세톤 0.5 ml를 첨가하여 5 분간 교반 후, 아세트산에틸로 희석하고, 포화 탄산수소나트륨 수용액에 따라서 분액하였다. 아세트산에틸층을 포화 탄산수소나트륨 수용액으로 세정하고, 건조, 농축하였다. 잔류물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(2% 메탄올/디클로로메탄 내지 5% 메탄올/디클로로메탄)로 정제하여, 상기 화합물 185 mg을 얻었다.
단계 8 5'-O-레불리닐-2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 4 -(4-아니소일)시티딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 4 -(4-아니소일)시티딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐-N 4 -(4-아니소일)시티딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 4 -(4-아니소일)시티딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 4 -(4-아니소일)시티딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 4 -(4-아니소일)시티딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 4 -(4-아니소일)시티딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 4 -(4-아니소일)시티딘 3'[O-(2-시아노에틸)(2-클로로페닐)포스페이트]의 합성
실시예 12 단계 4에서 합성된 화합물 288 mg에 피리딘-트리에틸아민-물(3:1:1)의 용액 4 ml을 첨가하고, 실온하 15 분간 교반하였다. 반응액을 농축 후, 실시예 12 단계 7에서 합성된 화합물 180 mg을 첨가하여 피리딘 공비하였다. 무수 피리딘 0.5 ml에 용해하고, 1-(2-메시틸렌술포닐)-3-니트로-1,2,4-트리아졸(MSNT) 63 mg을 첨가하여 실온하 1.5 시간 교반하였다. 반응액에 포화 탄산수소나트륨 수용액을 첨가하고, 아세트산에틸로 추출하며, 건조, 농축하였다. 잔류물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(2% 메탄올/디클로로메탄 내지 6% 메탄올/디클로로메 탄, 0.1% 피리딘 함유)로 정제하여, 상기 화합물 339 mg을 얻었다.
단계 9 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 4 -(4-아니소일)시티딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 4 -(4-아니소일)시티딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 4 -(4-아니소일)시티딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 4 -(4-아니소일)시티딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 4 -(4-아니소일)시티딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 4 -(4-아니소일)시티딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 티미딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 티미딘 3'-아세테이트의 합성
실시예 12 단계 6에서 합성된 화합물 90 mg에 0.5 M 히드라진/피리딘-아세트산(4:1) 용액 1 ml를 첨가하여 용해하고, 실온하 20 분간 교반하였다. 0℃하 아세톤 0.5 ml를 첨가하여 5 분간 교반 후, 아세트산에틸로 희석하고, 포화 탄산수소나트륨 수용액에 따라서 분액하였다. 아세트산에틸층을 포화 탄산수소나트륨 수용액으로 세정하고, 건조, 농축하였다. 잔류물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(2% 메탄올/디클로로메탄 내지 6% 메탄올/디클로로메탄)로 정제하여, 상기 화합물 60 mg을 얻었다.
단계 10 5'-O-레불리닐-2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 4 -(4-아니소일)시티딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 4 -(4-아니소일)시티딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐-N 4 -(4-아니소일)시티딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 4 -(4-아니소일)시티딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 4 -(4-아니소일)시티딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 4 -(4-아니소일)시티딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 4 -(4-아니소일)시티딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 4 -(4-아니소일)시티딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 4 -(4-아니소일)시티딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 4 -(4-아니소일)시티딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 4 -(4-아니소일)시티딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 4 -(4-아니소일)시티딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 4 -(4-아니소일)시티딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 4 -(4-아니소일)시티딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 티미딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 티미딘 3'-아세테이트의 합성
실시예 12 단계 8에서 합성된 화합물 105 mg에 피리딘-트리에틸아민- 물(3:1:1)의 용액 2 ml을 첨가하고, 실온하 15 분간 교반하였다. 반응액을 농축 후, 실시예 12 단계 9에서 합성된 화합물 58 mg을 첨가하여 피리딘 공비하였다. 무수 피리딘 0.5 ml에 용해하고, 1-(2-메시틸렌술포닐)-3-니트로-1,2,4-트리아졸(MSNT) 25 mg을 첨가하여 실온하 2 시간 교반하였다. 반응액에 포화 탄산수소나트륨 수용액을 첨가하고, 디클로로메탄으로 추출하며, 건조, 농축하였다. 잔류물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(2% 메탄올/디클로로메탄 내지 6% 메탄올/디클로로메탄, 0.1% 피리딘 함유)로 정제하여, 상기 화합물 80 mg을 얻었다.
단계 11 5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 4 -(4-아니소일)시티딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 4 -(4-아니소일)시티딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 4 -(4-아니소일)시티딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 4 -(4-아니소일)시티딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 4 -(4-아니소일)시티딘 3'-[O-(2-시아노에틸)(2-클로로페닐)포스페이트]의 합성
2-클로로페닐 5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N4-(4-아니소일)시티딘-3'-일 포스페이트 트리에틸아민염 107 mg과 실시예 12 단계 7에서 합성된 화합물 175 mg을 피리딘 공비 후, 무수 피리딘 1 ml에 용해하고, 1-(2-메시틸렌술포닐)-3-니트로-1,2,4-트리아졸(MSNT) 61 mg을 첨가하여 실온하 1.5 시간 교반하였다. 반응액에 포화 탄산수소나트륨 수용액을 첨가하고, 아세트산에틸로 추출하며, 건조, 농축하였다. 잔류물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(2% 메탄올/디클로로메탄 내지 6% 메탄올/디클로로메탄, 0.1% 피리딘 함유)로 정제하여, 상기 화합물 225 mg을 얻었다.
단계 12 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 4 -(4-아니소일)시티딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 4 -(4-아니소일)시티딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 4 -(4-아니소일)시티딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 4 -(4-아니소일)시티딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 4 -(4-아니소일)시티딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 4 -(4-아니소일)시티딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 4 -(4-아니소일)시티딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 4 -(4-아니소일)시티딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 4 -(4-아니소일)시티딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 4 -(4-아니소일)시티딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 4 -(4-아니소일)시티딘 3'-(2-클로로 페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 4 -(4-아니소일)시티딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 4 -(4-아니소일)시티딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 4 -(4-아니소일)시티딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 티미딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 티미딘 3'-아세테이트의 합성
실시예 12 단계 10에서 합성된 화합물 55 mg에 0.5 M 히드라진/피리딘-아세트산(4:1) 용액 1 ml를 첨가하여 용해하고, 실온하 15 분간 교반하였다. 0℃하 아세톤 0.5 ml를 첨가하여 5 분간 교반 후, 디클로로메탄으로 희석하고, 포화 탄산수소나트륨 수용액에 따라서 분액하였다. 디클로로메탄층을 포화 탄산수소나트륨 수용액으로 세정하고, 건조, 농축하였다. 잔류물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(2% 메탄올/디클로로메탄 내지 6% 메탄올/디클로로메탄)으로 정제하여, 상기 화합물 44 mg을 얻었다.
단계 13 5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 4 -(4-아니소일)시티딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 4 -(4-아니소일)시티딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 4 -(4-아니소일)시티딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 4 -(4-아니소일)시티딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 4 -(4-아 니소일)시티딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 4 -(4-아니소일)시티딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 4 -(4-아니소일)시티딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 4 -(4-아니소일)시티딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 4 -(4-아니소일)시티딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 4 -(4-아니소일)시티딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 4 -(4-아니소일)시티딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 4 -(4-아니소일)시티딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 4 -(4-아니소일)시티딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 4 -(4-아니소일)시티딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 4 -(4-아니소일)시티딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 4 -(4-아니소일)시티딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 4 -(4-아니소일)시티딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 4 -(4-아니소일)시티딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 4 -(4-아니소일)시티딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 티미딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 티미딘 3'-O-아세테이트의 합성
실시예 12 단계 11에서 합성된 화합물 27 mg에 피리딘-트리에틸아민-물(3:1:1)의 용액 2 ml를 첨가하고, 실온하 15 분간 교반하였다. 반응액을 농축 후, 실시예 12 단계 12에서 합성된 화합물 44 mg을 첨가하여 피리딘 공비하였다. 무수 피리딘 0.5 ml에 용해하고, 1-(2-메시틸렌술포닐)-3-니트로-1,2,4-트리아졸(MSNT) 5 mg을 첨가하여 실온하 3 시간 교반하였다. 반응액에 포화 탄산수소나트륨 수용액을 첨가하고, 디클로로메탄으로 추출하며, 건조, 농축하였다. 잔류물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(2% 메탄올/디클로로메탄 내지 6% 메탄올/디클로로메탄, 0.1% 피리딘 함유)로 정제하여, 상기 화합물 42 mg을 얻었다.
단계 14 탈보호 및 정제 단계
실시예 12 단계 13에서 합성된 화합물 20 mg에 0.30 M의 피리딘-2-카르복스알독심과 N1,N1,N3,N3-테트라메틸구아니딘의 50% 디옥산 수용액을 첨가하고, 실온에서 72 시간 교반하였다. 반응액을 감압 농축 후, 피리딘 1 ml에 용해하여 28% 암모니아 수용액 5 ml를 첨가하며, 마개로 밀폐시켜 55℃에서 7 시간, 그 후 실온에서 밤새 방치하였다. 반응액을 농축하여 잔류물에 아세톤을 첨가하고, 원심하여 담황색의 분말을 얻었다. 얻어진 분말을 역상 ODS 컬럼 크로마토그래피(아세토니트릴/0.05M-TEAA 완충액)로 정제하였다. 이것에 0.1 M의 아세트산-테트라메틸에틸렌디아민의 완충액(pH 3.88) 0.05 ml를 첨가하고, 60℃에서 1 시간 방치하였다. 반응액을 역상 OSD로 탈염하여, 목적 화합물인 시티딜릴-[3'→5']-시티딜릴-[3'→5']-시 티딜릴-[3'→5']-시티딜릴-[3'→5']-시티딜릴-[3'→5']-시티딜릴-[3'→5']-시티딜릴-[3'→5']-시티딜릴-[3'→5']-시티딜릴-[3'→5']-시티딜릴-[3'→5']-시티딜릴-[3'→5']-시티딜릴-[3'→5']-시티딜릴-[3'→5']-시티딜릴-[3'→5']-시티딜릴-[3'→5']-시티딜릴-[3'→5']-시티딜릴-[3'→5']-시티딜릴-[3'→5']-시티딜릴-[3'→5']-티미딜릴-[3'→5']-티미딘을 얻었다.
MALDI TOF MS: 계산치 6344.86, 실측치 6345.69
실시예 13 5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 4 -(4-아니소일)시티딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 4 -(4-아니소일)시티딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 4 -(4-아니소일)시티딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 4 -(4-아니소일)시티딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 4 -(4-아니소일)시티딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 티미딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 티미딘 3'-아세테이트
실시예 12 단계 11의 실시예 12 단계 7에서 합성된 화합물 대신에, 실시예 12 단계 3의 화합물을 사용하여 같은 반응을 행하여, 트리머 블록을 합성하였다. 다음에, 실시예 12 단계 13의 실시예 12 단계 11에서 합성된 화합물 대신에, 먼저 합성한 트리머 블록을 사용하고, 실시예 12 단계 12에서 합성된 화합물 대신에, 실시예 12 단계 5의 화합물을 사용하여 같은 반응을 행하여, 목적으로 하는 올리고핵 산 화합물을 합성하였다.
실시예 14 5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-2'-O-(2-테트라히드로피라닐)-N 4 -(4-아니소일)시티딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로피라닐)-N 4 -(4-아니소일)시티딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로피라닐)-N 4 -(4-아니소일)시티딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로피라닐)-N 4 -(4-아니소일)시티딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로피라닐)-N 4 -(4-아니소일)시티딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 티미딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 티미딘 3'-아세테이트
실시예 13과 같은 방법을 이용하여 2' 위치 수산기의 보호기가 2-테트라히드로피라닐인 핵산 단량체 블록을 사용하여, 목적으로 하는 올리고핵산 화합물을 합성하였다.
실시예 15
시험 화합물로서, 2' 위치 수산기의 보호기가 2-테트라히드로푸라닐인 실시예 13의 화합물과 2-테트라하이드로피라닐인 실시예 14의 화합물을 사용하여, 이하에 나타내는 방법으로 처리하여 탈보호 반응을 비교 검토하였다.
시험 화합물 18 mg에 0.3 M의 N1,N1,N3,N3-테트라메틸구아니딘과 피리딘-2-카 르복스알독심의 디옥산/물(1/1) 용액(2 ml)을 첨가하고, 실온에서 밤새 교반하였다. 반응액을 농축 후, 피리딘(2 ml), 농 암모니아수(10 ml)에 용해하며, 55℃에서 밤새 교반하였다. 반응액을 농축 후, 아세톤을 첨가하고, 발생한 침전을 원심 분리하여 모으며, 아세톤으로 3 회 세정하여 건조했다. 이것 1 mg에 0.1 M 아세트산나트륨-아세트산 완충액(pH 3.82)(1 ml)을 첨가하고, 각 탈보호 조건에서 반응을 행하여, 역상 HPLC로 반응을 추적하였다. 탈보호된 화합물의 수율(HPLC 피크 면적값)을 표 1에 나타낸다.
탈보호 조건 수율 (실시예 13의 화합물의 경우) 수율 (실시예 14의 화합물의 경우)
20℃/24 시간 97% 55%
20℃/48 시간 97% 79%
60℃/1 시간 97% 85%
상기 결과로부터, 2' 위치 수산기의 보호기로서 2-테트라히드로푸라닐을 이용한 경우에는 모든 조건하에서, 거의 정량적으로 탈보호된 화합물을 얻을 수 있었다. 그러나, 2' 위치 수산기의 보호기로서 2-테트라히드로피라닐을 이용한 경우에는 탈보호된 화합물의 생성이 불충분하여, 2' 위치 수산기의 보호기로서 2-테트라히드로푸라닐이 유용한 것을 명백히 알 수 있다.
실시예 16 리파아제에 의한 레불리닐화
5'-O-레불리닐-2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)우리딘
2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)우리딘 50 mg을 무수의 아세토니트릴 2.5 ml에 용해하고, 레불린산 무수물 140 mg, 각종 리파아제 28 mg를 첨가하며, 실온하 16 시간 교반하고, 역상 HPLC를 사용하여 반응 생성물인 5'-O-레불리닐-2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)우리딘의 수율을 구하였다.
결과를 표 2에 나타낸다.
리파아제 원료 회수량 반응 생성물량
Novozym 435 n. d. 95.2%
LIPASE-QL n. d. 97.8%
n. d.: 검출하지 않음
상기 결과로부터, Novozym 435(캔디다 안타크티카 리파아제 B: 노보노디스크사제) 및 LIPASE-QL(알칼리젠즈 트리아실글리세롤 리파아제: 메이토 산교(주)사제)은 원료 화합물을 모두 소비하여, 5' 위치 수산기가 레불리닐화된 화합물만을 생성하는 것이 명백해졌다.
실시예 17 아데닐릴-[3'→5']-아데닐릴-[3'→5']-우리딜릴-[3'→5']-구아닐릴-[3'→5']-구아닐릴-[3'→5']-아데닐릴-[3'→5']-우리딜릴-[3'→5']-구아닐릴-[3'→5']-우리딜릴-[3'→5']-아데닐릴-[3'→5']-시티딜릴-[3'→5']-우리딜릴-[3'→5']-우리딜릴-[3'→5']-시티딜릴-[3'→5']-아데닐릴-[3'→5']-우리딜릴-[3'→5']-시티딜릴-[3'→5']-아데닐릴-[3'→5']-시티딜릴-[3'→5']-티미딜릴-[3'→5']-티미딘
단계 1 다이머-블록의 합성
실시예 12 단계 1과 같은 방법을 이용하여 5'-O-레불리닐-2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N6-(4-아니소일)아데노신 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)우리딘 3'-[O-(2-시아노에틸)(2-클로로페닐)포스페이트]를 8.24 g(MS(EI) m/z=1321.2[M+Na]), 5'-O-레불리닐-2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N2-이소부티릴구아노신 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N2-이소부티릴구아노신 3'-[O-(2-시아노에틸)(2-클로로페닐)포스페이트]를 6.88 g(MS(EI) m/z=1382.4[M+Na]), 5'-O-레불리닐-2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N2-이소부티릴구아노신 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)우리딘 3'-[O-(2-시아노에틸)(2-클로로페닐)포스페이트]를 3.60 g(MS(EI) m/z=1273.4[M+Na]), 5'-O-레불리닐-2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N6-(4-아니소일)아데노신 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N4-(4-아니소일)시티딘 3'-[O-(2-시아노에틸)(2-클로로페닐)포스페이트]를 16.12 g(MS(EI) m/z=1454.5[M+Na]), 5'-O-레불리닐-2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)우리딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)우리딘 3'-[O-(2-시아노에틸)(2-클로로페닐)포스페이트]를 5.10 g(MS(EI) m/z=1164.3[M+Na]), 5'-O-레불리닐-2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N4-(4-아니소일)시티딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N6-(4-아니소일)아데노신 3'-[O-(2-시아노에틸)(2-클로로페닐)포스페이트]를 8.30 g(MS(EI) m/z=1454.5[M+Na]), 5'-O-레불리닐-2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)우리딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N4-(4-아니소일)시티딘 3'-[O-(2-시아노에틸)(2-클로로페닐)포스페이트]를 6.00 g(MS(EI) m/z=1297.4[M+Na]) 각각 합성하였다
또한, 참고예 3의 화합물인 티미딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 티미딘 3'-아세테이트 3.31 g을 합성하였다.
단계 2 테트라머 블록의 합성
실시예 17 단계 1에서 합성된 다이머 블록을 사용하고, 실시예 12 단계 2와 같은 방법을 이용하여 5'-O-레불리닐-2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N6-(4-아니소일)아데노신 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N4-(4-아니소일)시티딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 티미딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 티미딘 3'-아세테이트를 6.49 g(MS(EI) m/z=2062.0[M+H]) 합성하고, 실시예 12 단계 4와 동일하게 하여 5'-O-레불리닐-2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N6-(4-아니소일)아데노신 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)우리딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N2-이소부티릴구아노신 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N2-이소부티릴구아노신 3'-[O-(2-시아노에틸)(2-클로로페닐)포스페이트]를 4.20 g(MS(EI) m/z=2492.7[M+ H]), 5'-O-레불리닐-2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N6-(4-아니소일)아데노신 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)우리딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N2-이소부티릴구아노신 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)우리딘 3'-[O-(2-시아노에틸)(2-클로로페닐)포스페이트]를 2.30 g(MS(EI) m/z=2383.3[M+H]), 5'-O-레불리닐-2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N6-(4-아니소일)아데노신 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N4-(4-아니소일)시티딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)우리딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)우리딘 3'-[O-(2-시아노에틸)(2-클로로페닐)포스페이트]를 7.00 g(MS(EI) m/z=2429.2[M+Na]), 5'-O-레불리닐 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N4-(4-아니소일)시티딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N6-(4-아니소일)아데노신 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)우리딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N4-(4-아니소일)시티딘 3'-[O-(2-시아노에틸)(2-클로로페닐)포스페이트] 8.38 g(MS(EI) m/z=2562.1[M+Na])을 합성하였다.
단계 3 5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 6 -(4-아니소일)아데노신 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 6 -(4-아니소일)아데노신 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)우리딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 2 -이소부티릴구아노신 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 2 -이소부티릴구아노신 3'-(O-(2-시아노에틸)(2-클로로페닐)포스페이트]의 합성
실시예 17 단계 2에서 합성된 화합물과 실시예 10의 화합물을 사용하고, 실시예 11(B)과 같은 방법을 이용하여 상기 화합물 3.70 g을 합성하였다.
단계 4 5'-O-레불리닐-2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 4 -(4-아니소일)시티딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 6 -(4-아니소일)아데노신 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)우리딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 4 -(4-아니소일)시티딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 6 -(4-아니소일)아데노신 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 4 -(4-아니소일)시티딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 티미딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 티미딘 3'-아세테이트의 합성
실시예 17 단계 2에서 합성된 화합물과 5'-O-레불리닐-2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N6-(4-아니소일)아데노신 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N4-(4-아니소일)시티딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 티미딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 티미딘 3'-아세테이트를 사용하고, 실시예 12 단계 5 및 단계 6과 같은 방법을 이용하여 상기 화합물 6.04 g을 합성하였다.
단계 5 5'-O-레불리닐-2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 6 -(4-아니소일)아데노신 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 4 -(4-아니소일)시티딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)우리딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)우리딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 4 -(4-아니소일)시티딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 6 -(4-아니소일)아데노신 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)우리딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 4 -(4-아니소일)시티딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 6 -(4-아니소일)아데노신 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 4 -(4-아니소일)시티딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 티미딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 티미딘 3' 아세테이트의 합성
실시예 17 단계 2에서 합성된 화합물과 실시예 17 단계 4에서 합성된 화합물을 사용하고, 실시예 12 단계 5 및 단계 6과 같은 방법을 이용하여 상기 화합물 7.04 g을 합성하였다.
단계 6 5'-O-레불리닐-2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 6 -(4-아니소일)아데노신 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)우리딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 2 -이소부티릴구아노신 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)우리딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 6 -(4-아니소일)아데노신 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 4 -(4-아니소일)시티딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)우리딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)우리딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 4 -(4-아니소일)시티딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 6 -(4-아니소일)아데노신 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)우리딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 4 -(4-아니소일)시티딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 6 -(4-아니소일)아데노신 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 4 -(4-아니소일)시티딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 티미딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 티미딘 3' 아세테이트의 합성
실시예 17 단계 2에서 합성된 화합물과 실시예 17 단계 5에서 합성된 화합물을 사용하고, 실시예 12 단계 5 및 단계 6과 같은 방법을 이용하여 상기 화합물 3.60 g을 합성하였다.
단계 7 5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 6 -(4-아니소일)아데노신 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 6 -(4-아니소일)아데노신 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)우리딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 2 -이소부티릴구아노신 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 2 -이소부티릴구아노신 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 6 -(4-아니소일)아데노신 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)우리딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 2 -이소부티릴구아노신 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)우리딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 6 -(4-아니소일)아데노신 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 4 -(4-아니소일)시티딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴-2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)우리딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)우리딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 4 -(4-아니소일)시티딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴-2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 6 -(4-아니소일)아데노신 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)우리딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 4 -(4-아니소일)시티딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 6 -(4-아니소일)아데노신 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 2'-O-(2-테트라히드로푸라닐)-N 4 -(4-아니소일)시티딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴-티미딘 3'-(2-클로로페녹시)포스포릴 티미딘 3'-아세테이트의 합성
실시예 17 단계 3에서 합성된 화합물과 실시예 17 단계 6에서 합성된 화합물을 사용하고, 실시예 12 단계 12 및 단계 13과 같은 방법을 이용하여 상기 화합물 4.27 g을 합성하였다.
단계 8 탈보호 및 정제 단계
실시예 17 단계 7에 있어서 합성된 화합물 100 mg에 0.30 M의 피리딘-2-카르복스알독심과 N1,N1,N3,N3-테트라메틸구아니딘의 50% 디옥산 수용액을 첨가하고, 실온에서 44 시간 교반하였다. 반응액을 감압 농축 후, 피리딘 3 ml에 용해하여 28% 암모니아 수용액 15 ml를 첨가하고, 마개로 밀폐하여 55℃에서 11 시간, 그 후 실온에서 12 시간 방치하였다. 또한 55℃에서 11 시간, 그 후 실온에서 12 시간 방치하였다. 반응액을 농축 후, 아세톤을 첨가하고, 발생한 침전을 원심 분리하여 모으며, 아세톤으로 3 회 세정하여 건조하였다. 얻어진 분말을 역상 ODS 컬럼 크로마토그래피(아세토니트릴/0.05 M-TE AA 완충액)로 정제하였다. 이것 22 mg에 0.1 M 아세트산나트륨-아세트산 완충액(pH3.82)을 2 ml 첨가하고, 60℃에서 1 시간 방치하였다. 반응액을 역상 ODS로 탈염하여 동결 건조 후, 이온 교환 컬럼 크로마토그래피(0→0.4 M NaCl/10 mM 인산 완충액)로 정제하였다. 역상 ODS로 탈염하고 동결 건조 후, 목적 화합물인 아데닐릴[3'→5']-아데닐릴[3'→5']-우리딜릴-[3'→5']-구아닐릴-[3'→5']-구아닐릴-[3'→5']-아데닐릴-[3'→5']-우리딜릴[3'→5']-구아닐릴-[3'→5']-우리딜릴-[3'→5']-아데닐릴-[3'→5']-시티딜릴-[3'→5']-우리딜릴-[3'→5']-우리딜릴-[3'→5']-시티딜릴-[3'→5']-아데닐릴-[3'→5']-우리딜릴-[3'→5']-시티딜릴-[3'→5']-아데닐릴-[3'→5']-시티딜릴-[3'→5']-티미딜릴-[3'→5']-티미딘 12 mg을 얻었다.
MALDI TOF MS: 계산치 6615.07, 실측치 6615.34
본 발명 화합물인 신규한 리보핵산 화합물은 리보오스 2' 위치의 수산기가 0℃ 내지 60℃ 중 어느 한 온도에서 pH 2 내지 4의 산성 조건하 24 시간에서 90% 이상 탈리할 수 있는 보호기로 보호되고, 리보오스 3' 위치가 인산 트리에스테르화되며, 리보오스 5' 위치가 레불리닐화된 화합물이다. 본 발명 화합물은 올리고 RNA를 액상 합성하기 위해 매우 유용하며, 중요한 화합물이다.
또한, 인산 트리에스테르화된 리보핵산 화합물을 제조하기 위해 중요한, 리보오스 2' 위치의 수산기가 0℃ 내지 60℃ 중 어느 한 온도에서 pH 2 내지 4의 산성 조건하 24 시간에서 90% 이상 탈리할 수 있는 보호기로 보호된 리보핵산 화합물에 대하여 리보오스 5' 위치의 수산기를 위치 선택적으로 용이하게 리파아제에 의해 레불리닐화하는 제법을 제공한다.
또한, 신규한 올리고 RNA의 액상 합성법을 제공한다.

Claims (17)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 리보핵산 화합물 또는 그의 염:
    화학식 1
    Figure 112006059950019-PCT00019
    식 중, B는 아데닌, 구아닌, 시토신 또는 우라실, 또는 이들의 수식체(modified form)를 나타내고, R1은 0℃ 내지 60℃ 중 어느 한 온도에서 pH 2 내지 4의 산성 조건하 24 시간에서 90% 이상 탈리할 수 있는 보호기를 나타내며, R20은 H 또는 치환되어 있더라도 좋은 알킬을 나타내고, R21은 치환되어 있더라도 좋은 아릴 또는 1 내지 2환성으로서 치환되어 있더라도 좋은 복소환기를 나타낸다.
  2. 제1항에 있어서, R1이 2-테트라히드로푸라닐 또는 1,3-디옥솔란-2-일인 것인 리보핵산 화합물 또는 그의 염.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, R20이 H, 2-시아노에틸 또는 2,2,2-트리클로로에틸이며, R21이 2-클로로페닐 또는 2-클로로-4-tert-부틸페닐인 것인 리보핵산 화합 물 또는 그의 염.
  4. 하기 화학식 2로 표시되는 리보핵산 화합물에 레불리닐화제와 리파아제를 작용시키는 것에 의해 5' 위치의 수산기를 위치 선택적으로 레불리닐화하는 것을 특징으로 하는, 하기 화학식 3으로 표시되는 리보핵산 화합물의 제법:
    Figure 112006059950019-PCT00020
    식 중, B는 아데닌, 구아닌, 시토신 또는 우라실, 또는 이들의 수식체를 나타내고, R1은 0℃ 내지 60℃ 중 어느 한 온도에서 pH 2 내지 4의 산성 조건하 24 시간에서 90% 이상 탈리할 수 있는 보호기를 나타낸다.
  5. 하기 화학식 2로 표시되는 리보핵산 화합물에 레불리닐화제와 리파아제를 작용시키는 것에 의해 5' 위치의 수산기를 위치 선택적으로 레불리닐화하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 제법에 의해 제조되는, 하기 화학식 3으로 표시되는 리보핵산 화합물에 대하여 인산화 시약을 작용시키는 것에 의한, 하기 화학식 1a로 표시되는 리보핵산 화합물의 제법:
    Figure 112006059950019-PCT00021
    식 중, B는 아데닌, 구아닌, 시토신 또는 우라실, 또는 이들의 수식체를 나타내고, R1은 0℃ 내지 60℃ 중 어느 한 온도에서 pH 2 내지 4의 산성 조건하 24 시간에서 90% 이상 탈리할 수 있는 보호기를 나타내며, R21은 치환되어 있더라도 좋은 아릴 또는 1 내지 2환성으로서 치환되어 있더라도 좋은 복소환기를 나타낸다.
  6. 하기 화학식 2로 표시되는 리보핵산 화합물에 레불리닐화제와 리파아제를 작용시키는 것에 의해 5' 위치의 수산기를 위치 선택적으로 레불리닐화하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 제법에 의해 제조되는, 하기 화학식 3으로 표시되는 리보핵산 화합물에 대하여 인산화 시약과 인산기를 보호하는 시약을 작용시키는 것에 의한, 하기 화학식 1b로 표시되는 리보핵산 화합물의 제법:
    Figure 112006059950019-PCT00022
    식 중, B는 아데닌, 구아닌, 시토신 또는 우라실, 또는 이들의 수식체를 나타내고, R1은 0℃ 내지 60℃ 중 어느 한 온도에서 pH 2 내지 4의 산성 조건하 24 시간에서 90% 이상 탈리할 수 있는 보호기를 나타내며, R21은 치환되어 있더라도 좋은 아릴 또는 1 내지 2환성으로서 치환되어 있더라도 좋은 복소환기를 나타내고, R22는 치환되어 있더라도 좋은 알킬을 나타낸다.
  7. 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, R1이 2-테트라히드로푸라닐 또는 1,3-디옥솔란-2-일인 것인 리보핵산 화합물의 제법.
  8. 제4항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 레불리닐화제가 레불린산, 레불린산 무수물, 레불린산 에스테르 또는 레불린산 할로겐화물인 것인 리보핵산 화합물의 제법.
  9. 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 인산화 시약이 2-클로로페닐포스포로디트리아졸리드, 2-클로로페닐-O,O-비스(1-벤조트리아졸릴)포스페이트 또는 2-클로로-4-tert-부틸페닐포스포로디트리아졸리드인 것인 리보핵산 화합물의 제법.
  10. 제6항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 인산기를 보호하는 시약이 3-히드록시프로피오니트릴 또는 2,2,2-트리클로로에탄올인 것인 리보핵산 화합물의 제법.
  11. (a) 하기 화학식 2로 표시되는 리보핵산 화합물에 레불리닐화제와 리파아제를 작용시키는 것에 의해 5' 위치의 수산기를 위치 선택적으로 레불리닐화하여 하기 화학식 3으로 표시되는 리보핵산 화합물을 제조하는 단계,
    Figure 112006059950019-PCT00023
    [식 중, B는 아데닌, 구아닌, 시토신 또는 우라실, 또는 이들의 수식체를 나타내고, R1은 0℃ 내지 60℃ 중 어느 한 온도에서 pH 2 내지 4의 산성 조건하 24 시간에서 90% 이상 탈리할 수 있는 보호기를 나타냄]
    (b) 상기 (a)의 단계에 의해 제조되는 리보핵산 화합물(3)에 대하여, 인산화 시약을 작용시키는 것에 의해 3' 위치의 수산기를 인산화하여 하기 화학식 1a로 표시되는 리보핵산 화합물을 제조하는 단계,
    화학식 1a
    Figure 112006059950019-PCT00024
    [식 중, B, R1은 상기와 동일한 의미이고, R21은 치환되어 있더라도 좋은 아릴 또는 1 내지 2환성으로서 치환되어 있더라도 좋은 복소환기를 나타냄]
    (c) 한편, 상기 (b)와는 별도로, 상기 (a)의 단계에 의해 제조되는 리보핵산 화합물(3)에 대하여, 인산화 시약과 인산기를 보호하는 시약을 작용시키는 것에 의해, 하기 화학식 1b로 표시되는 리보핵산 화합물을 제조하는 단계,
    화학식 1b
    Figure 112006059950019-PCT00025
    [식 중, B, R1, R21은 상기와 동일한 의미이고, R22는 치환되어 있더라도 좋은 알킬을 나타냄]
    (d) 상기 (c)의 단계에 의해 제조되는 리보핵산 화합물(lb)에 대하여, 레불리닐기를 탈보호하여 하기 화학식 5로 표시되는 리보핵산 화합물을 제조하는 단계,
    화학식 5
    Figure 112006059950019-PCT00026
    [식 중, B, R1, R21, R22은 상기와 동일한 의미임]
    (e) 상기 (b) 또는 (d)의 단계에 의해 제조되는 리보핵산 화합물 (1a) 또는 (5) 중 하나 이상을 구성 단량체로서 사용하는 단계적 올리고머화에 의해 하기 화학식 6으로 표시되는 올리고핵산 화합물을 제조하는 단계,
    화학식 6
    Figure 112006059950019-PCT00027
    [식 중, 각 B'는 독립적으로 아데닌, 구아닌, 시토신, 우라실 또는 티민 또는 이들의 수식체를 나타내며, 각 R0은 독립적으로 H, 치환되어 있더라도 좋은 아릴 또는 1 내지 2환성으로서 치환되어 있더라도 좋은 복소환기를 나타내고,
    R3a는 H, 레불리닐 또는 4,4'-디메톡시트리틸을 나타내며,
    q는 상기와 동일한 의미이고,
    각 R1a는 하나 이상은 0℃ 내지 60℃ 중 어느 한 온도에서 pH 2 내지 4의 산성 조건하 24 시간에서 90% 이상 탈리할 수 있는 보호기에 의해 치환된 수산기이며, 그것 이외는 독립적으로 H, 또는 0℃ 내지 60℃ 중 어느 한 온도에서 pH 2 내지 4의 산성 조건하 24 시간에서 90% 이상 탈리할 수 있는 보호기에 의해 치환된 수산기를 나타내며,
    R2a는 아실 또는 하기 화학식 7로 표시되는 인산기를 나타낸다:
    화학식 7
    Figure 112006059950019-PCT00028
    식 중, R2aa는 치환되어 있더라도 좋은 아릴 또는 1 내지 2환성으로서 치환되어 있더라도 좋은 복소환기를 나타내고, R2ab는 H 또는 치환되어 있더라도 좋은 알킬을 나타냄]
    (f) 상기 (e)의 단계에 의해 제조되는 올리고핵산 화합물(6)의 보호기를 모 두 탈보호하는 단계
    를 포함하는, 하기 화학식 4로 표시되는 올리고핵산 화합물의 액상 합성법:
    화학식 4
    Figure 112006059950019-PCT00029
    식 중, 각 Bx는 독립적으로 아데닌, 구아닌, 시토신, 우라실 또는 티민, 또는 이들의 수식체를 나타내고, q는 1 내지 100의 범위 내인 정수를 나타내며, 각 R'는 하나 이상은 수산기이며, 그 이외는 독립적으로 H, 또는 수산기를 나타낸다.
  12. 제11항에 있어서, R1이 2-테트라히드로푸라닐 또는 1,3-디옥솔란-2-일인 것인 올리고핵산 화합물의 액상 합성법.
  13. 제11항 또는 제12항에 있어서, q가 1 내지 100의 범위 내의 정수인 것인 올리고핵산 화합물의 액상 합성법.
  14. 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, q가 10 내지 50의 범위 내의 정수인 것인 올리고핵산 화합물의 액상 합성법.
  15. 제11항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 레불리닐화제가 레불린산, 레불린산 무수물, 레불린산 에스테르 또는 레불린산 할로겐화물인 것인 올리고핵산 화합물의 액상 합성법.
  16. 제11항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 인산화 시약이 2-클로로페닐포스포로디트리아졸리드, 2-클로로페닐-O,O-비스(1-벤조트리아졸릴)포스페이트 또는 2-클로로-4-tert-부틸페닐포스포로디트리아졸리드인 것인 올리고핵산 화합물의 액상 합성법.
  17. 제11항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 인산기를 보호하는 시약이 3-히드록시프로피오니트릴 또는 2,2,2-트리클로로에탄올인 것인 올리고핵산 화합물의 액상 합성법.
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