WO2007029641A1 - 軽度の低温により遺伝子の発現を促進させる配列 - Google Patents

軽度の低温により遺伝子の発現を促進させる配列 Download PDF

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    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/001—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination

Definitions

  • the present invention relates to a mild low-temperature transcription control element (oligonucleotide) that promotes gene transcription at a mild low temperature and to an enzyme sensor that includes the mild low-temperature transcription control element.
  • the present invention also relates to an assembly method and a purification method for a mild low temperature transcription control factor (protein) using the mild low temperature transcription control element.
  • the yield of the target protein may be reduced due to a decrease in the target protein.
  • the low temperature shock protein CspA promoter and 5, untranslated region (UTR) are used as an expression promoter for the target protein.
  • UTR untranslated region
  • fission yeast the simplest eukaryote, has a genome size of 13 million base pairs and a small cocoon has the basic functions of eukaryotic cells, and has a gene strength intron of 30% or more.
  • human genes with high amino acid sequence conservation with known human homologous genes are normally expressed in the yeast, and functional analysis is easy.
  • fungi including yeast, and cells derived from eukaryotes closer to humans, such as plants, linear animals, insects, fish, amphibians, birds, etc. should have appropriate genes as necessary.
  • Non-patent literature 1 Kauftnann H, Mazur X, Marone R, Bailey JE, Fussenegger M. Biotech nol. Bioeng. 2001 Mar 20; 72 (6): 592-602
  • Non-Patent Document 2 Yoon SK, Song JY, Lee GM., Biotechnol. Bioeng. 2003 May 5; 82 (3): 289-98
  • Non-patent literature 3 Fujita J., J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 1999 Nov; l (2): 243-55
  • Non-patent literature 4 Molecular Biology of the Cell. 4th edition, Alberts B, Johnson A, Lewis J,
  • An object of the present invention is to provide a method for increasing the protein yield per unit time per cell at a low temperature and increasing the total yield.
  • An object of the present invention is to provide a method for identifying and purifying a mild low-temperature transcription factor (protein).
  • xl represents c, t, or a
  • x5 represents g, c, a, or t
  • x6 represents c, t, a, or g
  • x7 represents c, a, , G, or t
  • nucleotide sequences that is, the present invention provides nucleotide sequences:
  • a mild low-temperature transcription control element consisting of a nucleotide sequence complementary to this sequence.
  • millild low temperature transcription control element refers to a unit of nucleotide sequence that specifically promotes transcription of a gene at a low temperature.
  • mild low temperature means a temperature of 15 to 36 ° C., preferably 30 to 34 ° C., particularly preferably 32 ° C.
  • the mild low temperature transcription control element of the present invention acts as a mild low temperature specific enhancer for gene transcription.
  • the light low-temperature transcription control element of the present invention can exert its function even when used alone, but it is preferable to use 2 to 350, preferably 200 to 100, of the same or different sequences.
  • the same or different nucleotide sequences may be directly linked to each other, but may be connected via any kind and number of nucleotide residues between the sequences.
  • a combination of light low temperature transfer control elements is referred to herein as “light low temperature transfer control enhancer” or simply “enhancer”.
  • the light low temperature transfer control enhancer of the present invention is a light low temperature transfer control element that is connected to the 3 side of the t, nucleotide sequence: ccccgcc ccccgtc ⁇ ccccgct ⁇ 7 ccccgaa; on the 3rd side of the g Subsequent nucleotide sequence: ccccgcc; nucleotide sequence ccccgcc following the 3, side of a, ggcgggg preceding the a at the end, or those containing only ggggggg are excluded.
  • the light cold transcription control element and the light cold transcription control enhancer of the present invention are independent of the distance and direction from the promoter.
  • “mild low temperature transcription factor (protein) J” means 4/1
  • the present invention also relates to a vector comprising the mild low temperature transcription control element or the mild low temperature transcription control enhancer described above.
  • the present invention also relates to a eukaryotic cell transformed with the vector.
  • the invention also relates to a eukaryote transformed with the vector.
  • the low-temperature transcription control enhancer can be stably integrated into the cell chromosome.
  • the present invention also relates to a mild low temperature transcription control factor and an assay method for the control substance.
  • the method involves contacting a double-stranded DNA probe containing a light cold transcription control element with a protein solution to be targeted and binding the amount of the light cold transcription regulator specifically bound to the light cold transcription control element. Measurement by detecting a double stranded DNA probe. Regulator activity is assessed by quantifying changes in the amount of mild low temperature transcription factors that bind to the DNA probe.
  • the present invention also relates to a method for purifying a mild low-temperature transcription factor.
  • the method involves contacting a double-stranded DNA probe containing a mild low temperature transcription control element with a protein solution to obtain a mild low temperature transcription factor (protein) that specifically binds to the light low temperature transcription control element, and then the mild low temperature transcription factor. Isolating the transcriptional regulator.
  • protein protein
  • gene transcription can be promoted at a light low temperature.
  • a mild low-temperature transcription factor (protein) and its regulatory substance can be identified or purified.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing a pCAT3 promoter vector.
  • MCS represents the cloning site
  • SV40 promoter represents the SV40 virus-derived promoter
  • CAT represents the chloramphee-cholase transferase coding sequence
  • PA represents the SV40 virus-derived polyaduration signal
  • FIG. 2 is a schematic diagram showing a pcDNA3.1 (+) vector (Invitrogen).
  • MCS represents a multi-cloning site.
  • the firefly luciferase coding sequence is inserted between EcoRV and Xba I of this multicloning site, and lightly placed 5 'to the CMV promoter. 6
  • N e o r represents the G 4 18 resistance gene.
  • FIG. 3 Nuclear protein of mouse B a 1 b / 3 T 3 cells cultured at 37 ° C (1 lane) or 32 ° C (2 lanes) for 8 hours with 3 2 P-ATP Using the labeled 5, -ttccccgccgacggatccag-3 'as a probe, we performed a genore shift assembly to detect a mild low-temperature transcriptional regulatory factor that binds to the low-temperature transcriptional control element.
  • Examples of light low temperature transcription control elements include but are not limited to ccccgcc, ccccgca, ccccgcg, ccccgct ⁇ ccccgtcgt ccccgta ccccgtg, ccccgtt ⁇ ccccgac, ccccgaa, ccccgag, ccccggt ccccggc cccccg ⁇ cccccct ⁇ ccccctc, cccccta ⁇ ccccctg ⁇ ccccctt N ccccac N ccccaa cccccsg ⁇ ccccccgc, ccccga, cccccgg, cccccgt ⁇ ccccacc, ccccaca
  • the mild low-temperature transcription control element and the low-temperature transcription control enhancer are four solid-phase synthesis methods using phosphoramidites using four types of deoxyliponucleotides with protecting groups, and solid-phase synthesis methods using hydrogen phosphonates.
  • O l igonucleotide Synthesis A Practical Approach, IRL Press, 35-81,83-115 (1984); J. Org. Chem., 49,2139 (1984); Tetrahedron Lett., 27,469 (1986); Tetrahedron Let t., 22 , 1859-1862; Tetrahedron Lett., 21, 719-722 (1980); J. Am. Chem. Soc, 103,318 5-3191 (1981)).
  • prokaryotic, eukaryotic, and viral promoters can be used as the promoter.
  • Mammalian promoters and viral promoters are preferred.
  • preferred plug motors include, but are not limited to, mouse thymidine kinase (TK), cytomegalovirus (CMV), SV40 promoter.
  • RNA that does not encode a protein
  • the light cold transcription control element or light cold transcription control element of the present invention, a promoter, and a coding sequence encoding a protein to be expressed or a target sequence not encoding a protein are ligated and inserted into a vector.
  • the vector is a vector for expression of prokaryotic cells and eukaryotic cells.
  • examples of preferred vectors include, but are not limited to, pCMV (Invitrogen), pCAT3 promoter vector (Promega), pSV2-Neovector.
  • Transfect host cells with the vector It is preferred to use eukaryotic cells as host cells, especially mammalian cells.
  • eukaryotic cells are human cell lines 293, 293T, U-2 OS, Huh-7, HeLa, monkey cell lines COS-7, Vero, etc., mouse cell lines NIH / 3T3, Balb / 3T3. , B-6, Hepal-6, Chinese nomstar cell line CHO, etc.
  • Examples of the transfer method include a calcium phosphate method, a lipofussion method, a retrovirus method, and an electroporation method.
  • a calcium phosphate method DN Add a drop of salt-calcium solution containing A (vector) with stirring.
  • DNA—calcium phosphate can be finely precipitated.
  • this solution is applied to the host cell, the DNA-calcium phosphate precipitate is taken into the host cell by phagocytosis, resulting in DNA being taken into the cell. It will be.
  • Host cells are cultured at mild low temperatures. It is not necessary to use a special medium, and a medium usually used for each cell may be used.
  • An example of a typical medium for mammalian cell culture is Dulbecco's Modified Eagle Medium (D-MEM) (Invitrogen) supplemented with 10% ushi fetal serum (FCS).
  • D-MEM Dulbecco's Modified Eagle Medium
  • FCS 10% ushi fetal serum
  • the present invention also relates to a mild low temperature transcription factor (protein) and an assay method for the regulator.
  • the method involves contacting a double-stranded DNA probe containing a light cold transcription control element with a protein solution to be assayed and binding the amount of light cold transcription regulator specifically bound to the light cold transcription control element. And measuring by detecting the double-stranded DNA probe. The activity of the regulator is assessed by quantifying the change in the amount of mild cold transcription regulators that bind to the DNA probe.
  • a DNA oligonucleotide containing a light low temperature transcription control element and its complementary strand are prepared according to a standard method.
  • the ends of the prepared oligonucleotides are labeled with, for example, piotin and annealed to form double strands.
  • the oligonucleotide can be double-stranded and force-labeled, or unlabeled and finally detected as double-stranded.
  • EMSA gel shift assembly
  • a double-stranded oligonucleotide and a mild low-temperature transcription regulator are mixed with a protein solution, such as a nuclear extract, which may contain the regulator, and the double-stranded oligonucleotide and a mild low-temperature transcription regulator. And react.
  • a protein solution such as a nuclear extract, which may contain the regulator
  • the double-stranded oligonucleotide and a mild low-temperature transcription regulator are mixed with a protein solution, such as a nuclear extract, which may contain the regulator, and the double-stranded oligonucleotide and a mild low-temperature transcription regulator. And react.
  • the oligonucleotide, the protein, and the combination of both are separated by gel electrophoresis, for example, polyacrylamide gel electrophoresis. Free oligonucleotides flow faster and force the lower part. Protein-bound oligonucleotides flow slowly and appear in the upper part.
  • the gonoctide is labeled with piotin
  • the polyacrylamide gel is blotted onto a nylon membrane and cross-linked to the membrane using ultraviolet light.
  • Piotin-labeled on membrane and peroxidase-labeled streptavidin are specifically bound to emit light by reaction with a chemiluminescent substrate, exposed to X-ray film, and detected.
  • the oligonucleotide bound to the protein can be detected by reacting and electrophoresis with an unlabeled oligonucleotide, and staining the gel with a dye as it is.
  • a mild low-temperature transcription factor is estimated from the amount of the oligonucleotide bound specifically to the protein. Furthermore, by quantifying the effect on the amount of this mild low-temperature transcription control factor, the activity of the control substance can be assessed.
  • the present invention also relates to a method for purifying a mild low-temperature transcription factor.
  • the method involves contacting a double-stranded DNA probe containing a light low temperature transcription control element with a protein solution to obtain a light low temperature transcription control factor that specifically binds to the light low temperature transcription control element, and then the light low temperature transcription control factor. Isolating.
  • a DNA oligonucleotide containing a light low temperature transcription control element and its complementary strand are prepared according to a standard method.
  • the prepared oligonucleotide is bound to a carrier and immobilized.
  • oligonucleotides are piotinized and complementary strands are aligned to bind to avidinized magnetic beads as double strands.
  • the solid-phased double-stranded oligonucleotide and a protein solution that is thought to contain a mild low-temperature transcription factor are mixed together, and the double-stranded oligonucleotide and Contact with mild low temperature transcription factor.
  • a mild low-temperature transcription factor for example, a fraction obtained by dividing the size of a nuclear-extracted protein
  • the double-stranded oligonucleotide and Contact with mild low temperature transcription factor is recovered, for example, using a magnetic bead as a carrier, and then with a magnet.
  • the mild low temperature transcription factor is purified. If necessary, it can be further purified by gel electrophoresis or column chromatography. Amino acid sequence and gene of mild low-temperature transcription factor can be identified from purified protein
  • CAT3 promoter vector was used as a negative control.
  • Each 2.5 to 5.0 ⁇ g Z35mm dish of these plasmids was a CDM8-LacZ (j8-galatatosidase expression vector, used to correct the efficiency of each transfection. ATCC) Cotransformation was performed on human cell line 293 cultured at 37 ° C for 1 day with 0.5-1.0 gZ35mm dishes.
  • Transfected cells were divided into two, one was cultured at 32 ° C and the other at 37 ° C.
  • the medium is D-MEM supplemented with 10% FCS.
  • Example 1 since the first base in 8 bases was T, C, A, or G, it was not related to the activity, so tcccgcc, acccgcc, gcccgcc, ccccgct! , U; ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ [J
  • Each of the 5 'sides with T, C, A, or G connected in series by connecting 3 bases in series of 3 PCAT3 promoter as in Example 1 The results were shown in Table 2 after being incorporated into a multicloning site of a vector (Promega) and measuring the low-temperature transcription promoting activity.
  • the transcription activity the value obtained by dividing the amount of CAT protein by / 3 galactosidase activity was used.
  • a low temperature transcription control sensor can be prepared based on 7 bases instead of 8 bases, for example, ccccgcc.
  • a mutant of the first base to T exhibits a low-temperature transcription promoting activity equivalent to that of the wild type. Mutant to A is slightly lower than wild type and exhibits low temperature transcription promoting activity, while mutant to G has low activity. Mutants of the 2nd, 3rd or 4th base to A, G and T are less active.
  • the first base is mutated to 6.
  • the sixth base is mutated to A, G, or T, and
  • the first base is mutated to ⁇ .
  • the seventh base is mutated to A, G, or T.
  • the fifth base mutation to C, A, or T the sixth base to T, ⁇ , or G
  • the mutation of 7 and the mutation of the 7th base to A, G, or T show significant activity, although the low-temperature transcription promoting activity is lower than that of the wild type.
  • nucleotide sequence xlcccx5x6x7 (wherein xl represents c, t, or a, x5 represents g, c, a, or t, x6 represents c, t, a, or g) X7 represents c, a, g, 3; or t.)
  • xlcccx5x6x7 (wherein xl represents c, t, or a, x5 represents g, c, a, or t, x6 represents c, t, a, or g)
  • X7 represents c, a, g, 3; or t.)
  • Base sequence activity Base sequence activity Shionogi ffi sequence activity Base sequence activity ccccgc 5. 0 ccccgcA 3-5 ccccgcG 1. 7 ccc cgcT 5.1 ccccgTc 4. 9 ccccgTA 3.6 ccccgTG 8, ccccgTT 4, 0 ccccgAc 4, 5 ccccgAG 2.2 cccgAT 3.0 ccccgGc 2.0 ccccgGA 2.
  • Tcc cgTc 3 1 TcccgTA 2. 9 Tccc ⁇ TG 2.5 i cccgTT 2.4
  • TcccgAc 1.
  • I TcccgAA 2.5 TcccgAG 2, 0 TcccgAT 2.
  • TcccgGc 2.0 TcccgGA I. 4 TcccgGG 1.5 TcccCcc 2.5
  • TcccCcA 2.5 TcccCcG 2.9 TcccCcT 3 Tcc cCTc 2.2
  • TcccCTA 2 2 TcccCTG 1. 9 TcccCTT ⁇ . 0 Tcc cCAc 1. 9
  • TcccCAA 2. 0 TcccCAG 2. 0 TcccCAT 2.1 TcccCGc 1. 9
  • TcccCGA 1. 3 TcccAcc 2. 1 TcccAcA 1.9 TcccAcG 2. 0
  • TcccTcc L 6 TcccTcA 1.TcccTcG 1.1 Tcc cTcT 1, 1
  • AcccCAA 1. 4 AcccCAG 1. 3 AcccCAT 1, 3 AcccCGc 1.2
  • GcccTcc 1 2 GcccAcc 1.1 ggcgggg 4.5 4.5 agcgggg 4, 4 gacgggg 4.0 0 t tcgggg 3.9 ggggggg 2. 0 ggcggga 4.0 0 tgcggga 2. 1 gacggga 3.0 0 tggggga 1. 9 ggcgggt 3.0 Wild Type (c CCC SC C ) 5.0
  • nucleotide sequence From negative control 'L 0 or more, nucleotide sequence: xlcccx5x6x7 (wherein xl is preferably c or t, but a may be used, x5 is preferably g, but c or a, and in some cases t may be used, x6 is preferably c, but may be a, or in some cases g, x7 is preferably c, but a or g Also good. ), And nucleotide sequences complementary to these sequences have low temperature transcription promoting activity.
  • Example 5 From the results of Example 5, it is expected that a nucleotide sequence containing two ccccgcc is a mild low-temperature transcription control enhancer. Therefore, from the pGL3-basic vector (Promega) to the multicloning site (between EcoRV and Xbal) of the pcDNA3.1 (+) vector (Invitrogen) with cytomegalovirus (CMV) promoter (Fig. 2). Insert the excised firefly luciferase cDNA and place it on the 5th side of the CMV promoter.
  • CMV cytomegalovirus
  • this plasmid 5.0 ⁇ g Z60mm dish was transferred to the human cell line U-2 OS and cultured at 37 ° C in the presence of G418 (Invitrogen) for 3 weeks to stabilize the plasmid.
  • G418 Invitrogen
  • a cell clone that was integrated into the chromosome and expressed was obtained.
  • the cultured cells were divided into two and both were cultured at 37 ° C for 2 days, then one was further cultured at 32 ° C and the other at 37 ° C.
  • the medium is 10% FCS + D-MEM.
  • 48 hours after the temperature change the cells were collected by centrifugation and a whole cell lysate was prepared. Firefly luciferase activity produced at each temperature was measured using the Dua Luciferase Reporter Assay kit (Promega). The results are shown in Table 6. The activity showed firefly luciferase activity per extracted protein.
  • Mouse BalbZ3T3 fibroblasts were cultured in Dulbecco's Modified Eagle Medium (D-MEM) (Invitrogen) supplemented with 10% urine serum (CS) for 24 hours at 37 ° C. Cultivated at 37 ° C for another 8 hours, followed by conventional methods (John David Dignani, Russell M. Lebovitz, and Robert G. Roeder, Accurate transcription initiation by RNA polymerase II in a soluble extract from isolated mammalian nuclei. Nucleic Acids Res , 1983; 11: 1475-1489).
  • D-MEM Dulbecco's Modified Eagle Medium
  • CS urine serum
  • Oligonucleotide, 5, ttccccgccgacggatccag—3, (Umi 5) was labeled with T4 polynuclotide kinase and gamma-32P-ATP, purified with a Sephadex G50 column (Amersham Bioscience), and then complemented. Annealing with the chain ctggatccgtcggcggaa (SEQ ID NO: 6) gave a probe of 5X105 cpm / ng.
  • the present invention can be widely used for protein production.

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Abstract

　真核生物、特に哺乳動物細胞を用いる組み換えＤＮＡ法において産生するタンパク質を増加させることを目的とする。この目的は、ヌクレオチド配列： ｘ1ｃｃｃｘ5ｘ6ｘ7 （式中、ｘ１は、c、ｔ、またはａを表し、ｘ5は、ｇ、c、a、またはtを表し、ｘ6は、ｃ、t、ａ、またはgを表し、ｘ7は、ｃ、a、g、またはtを表す。） またはこの配列に相補的なヌクレオチド配列を含む軽度低温転写制御エレメント、または軽度低温転写制御エレメントを連結してなる軽度低温転写制御エンハンサーを用いることによって達成される。

Description

明 細 書
軽度の低温により遺伝子の発現を促進させる配列
技術分野
[0001] 本発明は軽度の低温にお!、て遺伝子の転写を促進させる軽度低温転写制御エレ メント (オリゴヌクレオチド）、該軽度低温転写制御エレメントを含むェンノヽンサ一に関 する。本発明は該軽度低温転写制御エレメントを利用した軽度低温転写制御因子（ タンパク質)のアツセィ方法、精製方法にも関する。
背景技術
[0002] モノクローナル抗体、成長因子、凝固因子など多くの医薬品や検査試薬がバイオ テクノロジ一により産生されるようになってきた。
一般に 10— 15°Cと!、う低温にぉ 、ては、リコンビナントタンパク質の正し!/、フォー ルディングが促進され、そのタンパク質分解酵素による分解も抑制されることから (Ba neyx, P ., In vivo folding of recombinant proteins in Eschencnia coli. In Manual of in dustrial microbiology and biotechnology, 2nd ed. (Demain, A.L., Davies, J.E., Altas , R.M., et al" eds.) , ASM Press, Washingtonm D.C., pp.551- 565, 1999)、組換えタ ンパク質をバクテリアに産生させる場合には、 37°Cではなく 20°C以下の低温での培 養が利用されている。この際、低温ではタンパク質合成が一般に低下するために、 目 的タンパク質の収量が悪くなる可能性がある。そこで、 目的タンパク質の発現プロモ 一ターとして低温ショックタンパク質 CspAのプロモーターと 5，非翻訳領域（UTR)を 利用し、この問題を解決している。（Baneyx, F. and Mujacic, M., Cold- inducible pro moters for heterologous protein expression. Methods in Molecular Biology, 205, 1—1 8, 2001.)
[0003] しかし、バクテリアと哺乳動物細胞では、タンパク質の翻訳後修飾に大きな違 、が あり、特に医薬品の場合にはグリコシルイ匕の状態が治療効果に重要である。そこで、 組換えタンパク質医薬品の産生には、哺乳動物細胞 (特にチャイニーズハムスター の細胞株）が利用されて 、る。この細胞培養を利用した製造のコストを減らすために は、タンパク質の収量を上げる必要がある。 37°Cで通常の培養を行った場合、細胞 は急激に増殖した後死滅するために、細胞が生存して目的タンパク質を生産する期 間が短いという欠点がある。そこで、細胞増殖を抑制し、長期間細胞を生存させること 力 細胞増殖阻害剤添加、増殖阻害遺伝子 p27の発現、軽い低温 (30— 32°C)で の培養、その他の方法により試みられている。（Schatz SM et al, Biotechnol Bioeng 2 003 Nov 20;84 (4) :433- 438参照）
[0004] なかでも軽い低温での培養では、 1)培養温度が 37°Cの場合よりも細胞が長い期 間生存してタンパク質合成を行う。 2)タンパク質分解酵素の活性が低下して目的タン ノ ク質の分解が減少する。 3)タンパク質のグリコシルイ匕や異性体の産生は 37°C培養 の時と同程度である。また、シアル酸付カ卩はかえつて 37°Cでよりも良好である。 4)バ クテリアでの場合と同様に目的タンパク質の正しいフォールデイングが起きやすい可 能性があるという特徴がある（Kau&iann H, Mazur X, Marone R, Bailey JE, Fusseneg ger M. Biotechnol Bioeng. 2001 Mar 20;72 (6) :592-602 ;Yoon SK, Song JY, Lee GM ., Biotechnol Bioeng. 2003 May 5;82 (3) :289- 98)。
[0005] 肝心のリコンビナントタンパク質収量に関しては、細胞の生存期間が延びるために 総収量が増える場合が多い。しかし、細胞あたりの単位時間でのタンパク質産生量 (s pecific productivity)をみた場合には、ばらつき（細胞の種類や目的タンパク質の種 類によるの力 未知の要因による）があり、 37°Cでの specific productivityよりもかえつ て低下する例が多く問題点となっている（Kauftnann H, Mazur X, Marone R, Bailey J E, Fussenegger M. Biotechnol Bioeng. 2001 Mar 20;72 (6) :592-602 ;Yoon SK, Song JY, Lee GM., Biotechnol Bioeng. 2003 May 5;82 (3) :289- 98)。なお、遺伝子発現 制御機構が異なるために、バクテリアの低温ショックタンパク質 CspAのプロモーター と 5 '非翻訳領域（UTR)を哺乳動物に利用することはできな!、。
一方、最も単純な真核生物である分裂酵母は、そのゲノムサイズが 1300万塩基対と 小さ ヽが真核細胞の基本的な機能を備えて 、ること、 30%以上の遺伝子力イントロン を持つこと、ヒトの既知相同遺伝子とのアミノ酸配列保存性が高ぐヒトの遺伝子が酵 母内で正常に発現すること、機能解析が容易であること、などから、ヒトのモデルとし て生物科学研究で利用されている（Molecular Biology of the Cell.第 4版、 Alberts B, Johnson A, Lewis J, Raff M, Roberts K, Walter P著、 Garland Science社、ニューョー ク、 2002) oそこで、酵母を含む菌類、及びそれよりもヒトに近い真核生物、例えば植 物、線形動物、昆虫、魚類、両生類、鳥類等由来の細胞は、必要に応じ適切な遺伝 子を補うことにより、哺乳動物細胞と同様にタンパク質の翻訳後修飾を行わせ低温で タンパク質産生のために培養することも可能であると考えられる。さらに遺伝子工学 的技術を利用すれば、これら遺伝子改変を行った真核生物細胞を含む真核生物個 体を得て、タンパク質産生を行わせることも可能であると考えられる。
非特干文献 1 : Kauftnann H, Mazur X, Marone R, Bailey JE, Fussenegger M. Biotech nol. Bioeng. 2001 Mar 20;72 (6) :592-602
非特許文献 2 :Yoon SK, Song JY, Lee GM., Biotechnol. Bioeng. 2003 May 5;82 (3) : 289-98
非特許文献 3 : Fujita J., J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 1999 Nov;l (2) :243- 55 非特許文献 4 : Molecular Biology of the Cell.第 4版、 Alberts B, Johnson A, Lewis J,
Raff M, Roberts K, Walter P著、 Garland Science社、ニューヨーク、 2002
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0006] 本発明は低温において細胞あたりの単位時間でのタンパク質産生量を高め、総収 量を上げる方法を提供することを目的とする。
本発明は軽度低温転写制御因子 (タンパク質)の同定方法および精製方法を提供 することをち目的とする。
課題を解決するための手段
[0007] 本発明者は、出願中の国際特許出願 (PCTZJP2005Z003385)に開示したよう に、軽い低温温度下において転写を促進させるェンノ、ンサ一として作用する遺伝子 発現制御配列（以下、「軽度低温転写制御エレメント」 t ヽぅ）を発見した。その配列の 例は、ヌクレオチド配列：
tccccgcc
またはこの配列に相補的なヌクレオチド配列である。
[0008] 本発明者は軽度低温転写制御エレメントにつ 、てさらに研究をすすめた結果、 ヌクレオチド配列： 1 c c c x5 x6x 7
(式中、 x lは、 c、 t、 または aを表し、 x5は、 g、 c、 a、 または tを表し、 x6は, c、 t、 a、 または gを表し、 x7は、 c、 a、 g、 または tを表す。 )
が軽度低温において特異的に遺伝子の転写を促進させることを見出した。
[000 9]
即ち本発明は、 ヌクレオチド配列：
1 c c c x5x6x7
(式中、 X 1は、 c、 t、 または aを表し、 x5は、 g、 c、 a、 または tを表し、 x6は. c、 t、 a、 または gを表し、 x7は、 c、 a、 g、 または tを表す。 )
またはこの配列に相補的なヌクレオチド配列よりなる軽度低温転写制御ェレメントに 関する。
[0010]
本明細書において 「軽度低温転写制御エレメント」 とは、 軽度低温において特異的 に遺伝子の転写を促進させるヌクレオチド配列の単位をいう。
本明細書において、 「軽度低温」 とは 1 5〜 36 °C、 好ましくは 30〜 34 °C、 特 に好ましくは 3 2 °Cの温度をいう。 本発明の軽度低温転写制御エレメントは遺伝子の 転写に軽度低温特異的なェンハンサーとして作用する。
[001 1]
本発明の軽度低温転写制御エレメントは単独で用いて,もその機能を発揮し得るが、 同一または異なる該配列を 2〜 3 50個、 好ましくは 2~1 00個結合して用いるの が好ましい。 結合させて用いる場合、 同一または異なる該ヌクレオチド配列を相互に 直接連結してもよいが、 該配列間に任意の種類および数のヌクレオチド残基を介在さ せて結合させてもよい。 軽度低温転写制御ェレメントを結合させたものを本明細書で は 「軽度低温転写制御ェンハンサー」 または単に 「ェンハンサー」 と呼ぶ。 伹し、 本 発明の軽度低温転写制御ェンハンサ一は、 軽度低温転写制御エレメントとして、 tの 3側に続、ヌクレオテド酉己列： ccccgcc ccccgtcヽ ccccgctヽ ま 7こは ccccgaa; gの 3， 側に続くヌクレオチド配列： ccccgcc； aの 3，側に続くヌクレオチド配列 ccccgcc、 3，末 端の aに先行する ggcgggg、 または gggggggのみを含むものを除かれる。 本発明の軽 度低温転写制御エレメントおよび軽度低温転写制御ェンハンサ一はプロモーターから の距離、 方向には無関係である。
また本発明において 「軽度低温転写制御因子 （タンパク質） J とは、 軽度の低温に 4/1
より活性化されて軽度低温転写制御エレメントに結合し、 エレメントの近傍にある遺 伝子の転写を制御、 多くの場合は促進、 するタンパク質である。
訂 ΪΕさ た胆 [0012] 本発明は、上に記載の軽度低温転写制御エレメントまたは軽度低温転写制御ェン ハンサーを含むベクターにも関する。
[0013] 本発明は該ベクターで形質転換された真核生物細胞にも関する。
本発明は該ベクターで形質転換された真核生物にも関する。後の実施例で示すよ うに低温転写制御ェンハンサ一は細胞染色体に安定に組み込まれ得る。
[0014] 本発明は、軽度低温転写制御因子およびその制御物質のアツセィ法にも関する。
その方法は、軽度低温転写制御エレメントを含む二本鎖 DNAプローブとアツセィ対 象のタンパク質溶液とを接触させ、特異的に軽度低温転写制御エレメントに結合した 軽度低温転写制御因子の量を、結合している二本鎖 DNAプローブを検出すること により測定することを含む。制御物質の活性は、 DNAプローブに結合する軽度低温 転写制御因子の量の変化を定量することによりアツセィされる。
[0015] 本発明は、軽度低温転写制御因子の精製方法にも関する。その方法は、軽度低温 転写制御エレメントを含む二本鎖 DNAプローブとタンパク質溶液とを接触させ、軽度 低温転写制御エレメントに特異的に結合した軽度低温転写制御因子 (タンパク質)を 得、次に軽度低温転写制御因子を単離することを含む。
発明の効果
[0016] 本発明の軽度低温転写制御エレメントによれば、軽度低温において遺伝子の転写 を促進させることができる。本発明によれば、軽度低温転写制御因子 (タンパク質)お よびその制御物質を同定または精製することができる。
図面の簡単な説明
[0017] [図 l]pCAT3プロモーターベクターを表わす模式図である。 MCSはマルチクロー- ングサイトを表わし、 SV40プロモーターは SV40ウィルス由来のプロモーターを表わ し、 CATはクロラムフエ-コールァセチルトランスフェラーゼのコード配列を表わし、 P Aは SV40ウィルス由来のポリアデュル化シグナルを表わし、 Amprはアンピシリン耐 性遺伝子を表わす。
[0018] [図 2]pcDNA3. 1 (+ )ベクター（インビトロジェン社）を表わす模式図である。 MCS はマルチクロー-ングサイトを表わす。このマルチクロー-ングサイトの EcoRVと Xba Iの間にホタルルシフェラーゼのコード配列を挿入し、 CMVプロモーターの 5'側に軽 6
度低温転写制御ェンハンサーを組み込んだ。 N e o rは G 4 1 8耐性遺伝子を表わす。
[ 0 0 1 9 ]
[図 3 ]マウス B a 1 b / 3 T 3細胞を 3 7 °C ( 1レーン） または 3 2 °C ( 2レー ン） で 8時間培養したときの核タンパク質を、 3 2 P— A T Pで標識した 5， - ttccccgccgacggatccag-3' をプローブとしてゲノレシフトアツセィし、 軽度低温転写制 御エレメントに結合する軽度低温転写制御因子の検出をした。
発明を実施するための最良の形態
[ 0 0 2 0 ]
軽度低温転写制御エレメントの例は、 限定するものではないが ccccgcc、 ccccgca, ccccgcg、 ccccgct^ ccccgtcヽ ccccgta ccccgtg、 ccccgttヽ ccccgac、 ccccgaa、 ccccgag、 ccccgat、 ccccggc、 ccccgga、 ccccgggヽ ccccggtヽ cccccccヽ cccccca、 ccccccgヽ cccccct^ ccccctc、 cccccta^ ccccctgヽ cccccttN cccccacN cccccaa cccccsgヽ cccccat cccccgc、 cccccga、 cccccgg、 cccccgtヽ ccccacc、 ccccacas ccccacgヽ ccccact、 ccccatc、 ccccata、 cccca gヽ ccccattヽ ccccaac ccccaaa、 ccccaag ccccaatN ccccagcヽ ccccagaN ccccaggヽ ccccagt^ cccctac、 cccctcc、 tcccgcc、 tcccgcaヽ tcccgcg、 tcccgct tcccgtcN tcccgta^ tcccgtg、 tcccgtt、 tcccgac tcccgaa、 tcccgag、 tcccgat：、 tcccggcヽ tcccgga^ tcccggg、 tcccccc、 tccccca tcccccg、 tccccct、 tcccctc、 tccccta^ tcccctg tcccctt、 tccccac、 tccccaa、 tccccagN tccccatヽ tccccgcヽ tcccacc tcccaca^ tcccacg^ tcccact、 tcccatcN tcccata tcccatgヽ tcccattヽ tcccaac、 tcccaaa^ tcccaagヽ tcccaatN tcccagc^ tcccaga、 tccctcc、 acccgcc^ acccgca、 acccgcg、 acccgct acccgtcヽ acccgta、 acccgtgヽ acccgtts acccgac acccgaa acccgag、 acccgat^ scccggcヽ acccgga^ acccggg acccggt、 3CCCCCC accccca acccccg^ accccctヽ acccctc accccta acccctg^ accccttN accccac^ accccaaN accccgaN acccacc acccacaヽ acccacgヽ scccactヽ acccatc^ aCCC i b3>、 acccatgヽ acccatt^ acccaacN acccaaaヽ acccaag、 acccaat gcccccc、 ggcggggヽ agcgggg、 gacgggg ttcgggg、
Figure imgf000008_0001
tgcggga, gacggga tggggga、 および ggcgggtを含む。
[ 0 0 2 1 ]
( i ) 軽度低温転写制御ェレメントの製造
軽度低温転写制御ェレメント、 及び軽度低温転写制御ェンハンサ一は保護基のつい た 4種類のデォキシリポヌクレオチドを用いホスホロァミダイドを用いる固相合成法、 ハイドロジェンホスホネートを用いた固相合成法などで得ることができる （例えば、 O l igonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press, 35-81,83-115 (1984)； J. Org. Chem., 49,2139 (1984) ; Tetrahedron Lett., 27,469 (1986) ; Tetrahedron Let t.,22, 1859-1862; Tetrahedron Lett.,21, 719-722 (1980) ; J. Am. Chem. Soc, 103,318 5-3191 (1981) を参照）。今日では市販の DNA合成装置（例えば Applied Biosystem 社製など）によって容易に合成できる。
[0022] (ii)使用するプロモーター
プロモーターとしては、原核生物、真核生物、ウィルスのプロモーターを使用できる 。好ましくは哺乳動物プロモーター、およびウィルスプロモーターである。好ましいプ 口モーターの例は、限定されるものではないがマウスチミジンキナーゼ (TK)、サイトメ ガロウィルス (CMV)、 SV40のプロモーターを含む。
[0023] (iii)コード配列
発現させるべき遺伝子には制限がなくいずれのタンパク質をコードする配列も用い ることができる。なお、タンパク質をコードしない RNAを発現させることも可能である。
[0024] (iv)使用するベクター
本発明の軽度低温転写制御エレメントまたは軽度低温転写制御ェンノヽンサ一、プ 口モーターおよび、発現させるべきタンパク質をコードするコード配列またはタンパク 質をコードしない目的配列を連結してベクターに挿入する。ベクターとしては原核細 胞及び真核細胞発現用ベクターである。哺乳動物細胞の場合、好ましいベクターの 例は、限定されるものではないが pCMV (インビトロジェン社）、 pCAT3プロモーター ベクター（プロメガ社）、 pSV2—ネオベクターを含む。
[0025] (V)使用する宿主細胞
該ベクターで宿主細胞をトランスフエタトする。宿主細胞としては真核生物細胞、特 に哺乳動物細胞を用いるのが好まし 、。好まし 、哺乳動物細胞株の例はヒト細胞株 293、 293T, U- 2 OS, Huh— 7、 HeLa等、サル細胞株 COS— 7、 Vero等、マウ ス細胞株 NIH/3T3, Balb/3T3, B— 6, Hepal— 6、チャイニーズノヽムスター細 胞株 CHO等である。
トランスフエクシヨンの方法としてはリン酸カルシウム法、リポフエクシヨン法、レトロゥ ィルス法、電気穿孔法等がある。例えば、リン酸カルシウム法では、リン酸溶液に DN A (ベクター）を含む塩ィ匕カルシウム溶液を攪拌しながら 1滴ずつ加える。 DNA—リン 酸カルシウムの微細な沈殿ができ、この溶液を宿主細胞にカ卩えると DNA -リン酸カ ルシゥムの沈殿が宿主細胞に食作用により取りこまれる結果、 DNAが細胞内に取り こまれることになる。
[0026] (vi)培養条件
宿主細胞は軽度低温にぉ 、て培養する。培地は特別のものを使用する必要はなく 、それぞれの細胞に通常使われるもので良い。哺乳動物細胞培養用の典型的な培 地の例は、 10%ゥシ胎児血清（FCS)添カ卩のダルベッコ改変イーグル培地（D— ME M) (インビトロジェン社)である。
[0027] 本発明は、軽度低温転写制御因子 (タンパク質)およびその制御物質のアツセィ法 にも関する。その方法は、軽度低温転写制御エレメントを含む二本鎖 DNAプローブ とアツセィ対象のタンパク質溶液とを接触させ、特異的に軽度低温転写制御エレメン トに結合した軽度低温転写制御因子の量を、結合して 、る二本鎖 DNAプローブを 検出することにより測定することを含む。制御物質の活性は、 DNAプローブに結合 する軽度低温転写制御因子の量の変化を定量することによりアツセィされる。
[0028] 先ず、軽度低温転写制御エレメントを含む DNAオリゴヌクレオチドおよびその相補 鎖を標準的な方法に従って作製する。作製したオリゴヌクレオチドの末端を、例えば ピオチンで標識し、アニーリングさせて二本鎖とする。あるいは、オリゴヌクレオチドを 二本鎖にして力 標識することも、標識せずに二本鎖として最後に検出することも可 能である。これ以下は市販のゲルシフトアツセィ（EMSA： electrophoretic mobility shi ft assay )キット（PIERCE社、 Molecular Probes社等）の利用が可能である。次に、二 本鎖オリゴヌクレオチドと、軽度低温転写制御因子、さらに場合によりその制御物質 を含むと考えられるタンパク質溶液、例えば核抽出物とを混合し、二本鎖オリゴヌタレ ォチドと軽度低温転写制御因子とを反応させる。次にゲル電気泳動、例えばポリアク リルアミドゲル電気泳動でオリゴヌクレオチド、タンパク質、および両者の結合物を分 離する。遊離のオリゴヌクオチドは早く流れるため下部にくる力 タンパク質が結合し たオリゴヌクオチドはゆっくり流れるため上部にあらわれる。特異的にオリゴヌクレオチ ドに結合しているタンパク質として軽度低温転写制御因子を検出する。例えば、オリ ゴヌクオチドがピオチン標識してあれば、電気泳動の後、ポリアクリルアミドゲルをナイ ロンメンブレンへブロッテイングし、紫外線を用いてメンブレンへクロスリンクさせる。メ ンブレン上のピオチン標識とペルォキシダーゼ標識ストレプトアビジンとを特異的に 結合させ、化学発光基質との反応で発光させ、 X線フィルムへ感光させ検出する。上 記の Molecular Probes社のキットであれば、標識無しのオリゴヌクレオチドを用いて反 応、電気泳動させ、ゲルをそのまま色素で染色することによりタンパク質が結合したォ リゴヌクオチドを検出することが出来る。この特異的にタンパク質が結合したオリゴヌク ォチドの量から、軽度低温転写制御因子がアツセィされる。さらに、この軽度低温転 写制御因子の量に与える影響を定量することにより、その制御物質の活性をアツセィ することができる。
[0029] 本発明は、軽度低温転写制御因子の精製方法にも関する。その方法は、軽度低温 転写制御エレメントを含む二本鎖 DNAプローブとタンパク質溶液とを接触させ、特異 的に軽度低温転写制御エレメントに結合した軽度低温転写制御因子を得、次に軽度 低温転写制御因子を単離することを含む。
[0030] まず軽度低温転写制御エレメントを含む DNAオリゴヌクレオチドおよびその相補鎖 を標準的な方法に従って作製する。次に、例えば、作製したオリゴヌクレオチドを担 体に結合させ固相化する。例えば、オリゴヌクレオチドをピオチンィ匕し、相補鎖をァ- 一リングさせて二本鎖としてアビジン化磁気ビーズに結合させる。次に固相化した二 本鎖オリゴヌクレオチドと、軽度低温転写制御因子を含むと考えられるタンパク質溶 液、例えば核抽出タンパク質をサイズで分けた分画、とを混合し、二本鎖オリゴヌタレ ォチドと軽度低温転写制御因子とを接触させる。次に、軽度低温転写制御因子と結 合した二本鎖オリゴヌクレオチドを、例えば磁気ビーズを担体として用いて 、ればマ グネットで、回収する。よく洗浄した後に、特異的に結合したタンパク質、即ち軽度低 温転写制御因子を溶出させれば、軽度低温転写制御因子が精製される。なお必要 に応じ、ゲル電気泳動やカラムクロマトグラフィー等でさらに精製できる。精製したタン パク質から、軽度低温転写制御因子のアミノ酸配列、遺伝子を同定することも出来る
[0031] 以下に本発明を実施例によって更に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定 されるものではな 、ことは勿論である。
[0032] 実施例 1
tccccgccを含む 8塩基を直列に 3個つな!/、で連続させたもの（tccccgcctccccgcctccc cgcc) (配列番号 1)、あるいは、 tccccgccの 5'末端の tを他の塩基に変異させた変異 体を同様に直列に 3個つないで連続させたものを pCAT3プロモーターベクター（プ 口メガ社）のマルチクローユングサイトに組み込んだ。このベクターは SV40のプロモ 一ターを有する。レポータータンパク質としてクロラムフエニコールァセチルトランスフ エラーゼ (CAT)遺伝子を有する。陰性コントロールとしてなにも ヽれて ヽな 、pCAT 3プロモーターベクターを用いた。
[0033] これらのプラスミド各 2. 5〜5. 0 μ gZ35mmディッシュを、 CDM8— LacZ ( j8—ガ ラタトシダーゼ発現ベクターであり、各トランスフエクシヨンの効率を補正するために使 用した。 ATCC社） 0. 5〜1. 0 gZ35mmディッシュとともに、 37°Cで 1日培養した ヒト細胞株 293にコトランスフエクシヨンした。
トランスフエクシヨンした細胞を 2つに分け、 1方を 32°Cで、他方を 37°Cでそれぞれ 培養した。培地は 10%FCS添加 D— MEMである。
[0034] 36時間後、遠心分離によって細胞を回収し、全細胞溶解液を作成した。それぞれ の温度で生成したクロラムフエ-コールァセチルトランスフェラーゼ（CAT)タンパク質 の量を CAT ELISAキット（ロシュ'ダイァグノステック社)を用いて測定し、 β—ガラ クトシダーゼ (LacZ)活性を 13—ガラタトシダーゼアツセィキット (ストラタジーン社)を 用いて測定した。
[0035] 36時間でのデータを下表に示す。転写活性としては CATタンパク質量を /3ーガラ クトシダーゼ活性で割った値を用いた。コントロールとしてなにも ヽれて ヽな 、pCAT 3プロモーターベクターを用いときの 32°CZ37°Cの比を 1として、それぞれの変異体 の低温転写促進 (ェンハンサー)活性を示した。
[表 1] 最初の 1塩基の変異体の低温転写促進 （ェンハンサ、一） 活性
エレメ ント 塩基配列 ェンハンサー活性
野生型 ot tccccgc c 5. 8
変異体 0c Cccccgc c 4. 5
変異体 0a Accccgc c 5. 5
変異体 0g Gccccgc c 5. 4
コントローノレ 1. 0
[0036] 最初の塩基の C、 A、または Gへの変異体は、野生型とほぼ同様の低温転写促進 活性を示した。このことは、軽度低温転写制御エレメントは、 7つのヌクレオチドよりな る ccccgccで十分であることを示す。
上記軽度低温転写制御ェンハンサー tccccgcctccccgcctccccgcc (配列番号 1)に変 えて、 ttccccgccgttccccgccgttccccgccgを（配列番号 2)を用いた場合にも同様な結果 が得られた。
[0037] 施例 2
実施例 1で 8塩基中の最初の塩基が T、 C、 A、 Gのいずれであっても活性には関係 な 、こと力 されたので、 tcccgcc、 acccgcc、 gcccgcc、 ccccgctと！、う;^ 酉己歹 [Jそれぞ れの 5 '側に T、 C、 A、または Gを付けた 8塩基を直列に 3個つないで連続させたもの を実施例 1と同様に PCAT3プロモーターベクター（プロメガ社）のマルチクロー-ング サイトに組み込み、低温転写促進 (ェンノ、ンサ一)活性を測定し、表 2の結果を得た。 転写活性としては CATタンパク質量を /3 ガラクトシダーゼ活性で割った値を用い た。陰性コントロールとしてなにも 、れて 、な 、pCAT3プロモーターベクターを用い ときの 32°CZ37°Cの比を 1とし、さらに陽性コントロールとして野生型 tccccgccを直列 に 3個つないで連続させたものを用いときの 32°CZ37°Cの比を 5として補正し、それ ぞれの変異体の低温転写促進 (ェンノヽンサ一)活性を示した。
[0038] [表 2] 最初の 1塩基が低温転写促進 （ェンハンサー） 活性に与える影響
エレメント 塩基配列 ェンハンサー活性
野生型 Ot tccccgcc 5.0
変異体 Otlt tTcccgcc 5.1
変異体 Oclt CTcccgcc 4.6
変異体 Oalt ATcccgcc 4.8
変異体 Oglt GTcccgcc 4.9
変異体 Otla tAcccgcc 3.1
変異体 Ocla CAcccgcc 3.0
変異体 Oala Mcccgcc 2.9
変異体 Ogla GAcccgcc 2.8
変異体 Otlg tGcccgcc 1.1
変異体 Oclg CGcccgcc 1.0
変異体 Oalg AGcccgcc 1.1
変異体 Oglg GGcccgcc 1.2
変異体 0t7t tccccgcT 4.8
変異体 0c7t CccccgcT 4.8
変異体 0a7t AccccgcT 5.2
変異体 0g7t GccccgcT 5.0
陰性コントロール 1.0
[0039] 低温転写促進活性を示す軽度低温転写制御エレメント 8塩基、例えば tccccgcc、の うち 1番目の塩基が T、 C、 A、 Gのいずれであってもその活性には影響しないことが 再確認され、従って 8塩基ではなく 7塩基、例えば ccccgcc、を基に軽度低温転写制 御ェンノヽンサ一を作製できる。
上記軽度低温転写制御ェンハンサー tccccgcctccccgcctccccgcc (配列番号 1)に変 えて、 ccccgccccccgccccccgccを（酉 S列番号 4)を用いた場合にも同様な結果がえられ た。
[0040] 実飾 13
ccccgccという 7塩基配列の 5'末端から 1番目、 2番目、 3番目あるいは 4番目の 1塩 基 cを他の塩基に変異させ、 5'側に ttを、 3'側に gまたは t を付加して 10塩基とし たものをそれぞれ直列に 3個つないで連続させたものを pCAT3プロモーターベクタ 一（プロメガ社)のマルチクローユングサイトに組み込んだ。その後は実施例 2と同様 に行って以下のような結果を得た。結果を表 3に示す。
[0041] [表 3] 1番、 2番、 3番、 あるいは 4番目の 1塩基の変異体の
低温転写促進（ヱンノヘンサー）活性
エレメント 塩基配列 ェンハンサー活性
野生型 ccccgcc 5.0
変異体 la Acccgcc 3.0
変異体 lg LiCCCgCC 1.1
変異体 It Tcccgcc 5.1
変異体 2a cAccgcc 1.3
変異体 CLiCCgCC 1.0
変異体 2t cTccgcc 1.1
変異体 3a ccAcgcc 1.0
変異体 3g ccGcgcc 1.3
変異体 3t ccTcgcc 1.2
変異体 4a cccAgcc 1.2
変異体 4g cccGgcc 1.2
変異体 4t cccTgcc 1.1 陰性コントロール 1.0
[0042] 1番目の塩基の Tへの変異体は野生型と同等の低温転写促進活性を示す。 Aへの 変異体は野生型よりやや低 、低温転写促進活性を示すが、 Gへの変異体は活性が 低 、。 2番目、 3番目あるいは 4番目の塩基の A、 G、 Tへの変異体は活性が低 、。
[0043] 実施例 4
ccccgcc塩基配列の 1番目の塩基の Tへの変異にカ卩え、 1塩基の変異が存在する場 合の低温転写促進活性を調べた。即ち
1番目の塩基の Tへの変異にカ卩ぇ 5番目の塩基の A、 C、または Tへの変異した変異 体、
1番目の塩基の Τへの変異にカ卩ぇ 6番目の塩基の A、 G、または Tへの変異した変異 体、および
1番目の塩基の Τへの変異にカ卩ぇ 7番目の塩基の A、 G、または Tへの変異した変異 体
をそれぞれ直列に 3個含むオリゴヌクレオチドを実施例 3と同様に pCAT3プロモータ 一ベクター（プロメガ社)のマルチクロー-ングサイトに組み込んで、以下のような結果 を得た。結果を表 4に示す。
[表 4] 2塩基の変異体の低温転写促進 （ェ:ンハンサー） 活性
エレメント 塩基配列 ヱンハンサー活性
野生型 ccc cgc c 5. 0
変異体 lt5a Tcc cAc c 2. 1
変異体 lt5c "Tcc cし c c 2. 3
変異体 lt5t Tec c ic e 1. 6
変異体 lt6a Tcc cgAc 2. 1
変異体 lt6g Tcc cgGc 2. 0
変異体 lt6t Tcc cgTc 3. 1
変異体 lt7a Tcc cgcA 2. 8
変異体 lt7g Tcc cgcG 2. 6
変異体 lt7t Tcc cgcT 2. 6 陰性コントロール 1. 0
[0044] 1番目の塩基の Tへの変異に加え 1塩基の変異が存在する場合、 5番目の塩基の C 、 A、または Tへの変異、 6番目の塩基の T、 Α、または Gへの変異、 7番目の塩基の A、 G、または Tへの変異は低温転写促進活性が野生型に比べ低下するものの、有 意な活性が認められる。
[0045] 実施例 5
以上の結果より、ヌクレオチド配列： xlcccx5x6x7 (式中、 xlは、 c、 t、または aを表 し、 x5は、 g、 c、 a、または t 表し、 x6は、 c、 t、 a、または g 表し、 x7は、 c、 a、 g、 3;た は tを表す。）は軽度低温転写制御エレメントであり、これらを連結したオリゴヌクレオ チド配列はェンノヽンサ一であることから、これらの配列に相補的なヌクレオチド配列で あれば低温転写促進活性が認められることが考えられる。そこでこれに適合する配列 、あるいは適合しな!、単一の配列をそれぞれ直列に 3個含むオリゴヌクレオチドを実 施例 3と同様に pCAT3プロモーターベクター（プロメガ社）に組み込んで、以下のよう な結果を得た。結果を表 5に示す。
[表 5] いろいろな変異体の低温転写促進 （ェンハンサー） 活性
塩基配列 活性 塩基配列 活性 塩某 ffi列 活性 塩基配列 活性 ccccgcc 5. 0 ccccgcA 3- 5 ccccgcG 1. 7 ccc cgcT 5. 1 ccccgTc 4. 9 ccccgTA 3. 6 ccccgTG 8 ccccgTT 4, 0 ccccgAc 4, 5 ccccgAA 4. 8 ccccgAG 2. 2 ccccgAT 3. 0 ccccgGc 2. 0 ccccgGA 2. 1 ccccgGG 2. 0 ccccgGT 2, 1 ccccCcc 2, 9 ccccCcA 2. 3 c c cCcG 2. 9 ccccCcT 2. S ccccC i c 2. 3 ccccCTA 2. 0 c cccCTG 2. 0 ccccCTT 2, 2
2. 2 ccccCAA 2. 0 ccccCAG 2. 0 ccccCAT 2. 1 ccccCGc 3. 2 ccccC A 2. 5 ccccCGG 2. 4 ccccCGT 2. 8 ccccAcc 2, 9 ccccAcA I . 9 ccccAcG 1. 9 ccc cAcT 2. 2 ccccATc 2, 1 ccccATA 2. 0 ccccATG 1. 9 ccc cAT f 2. 1 ccccAAc 2. 1 ccccAAA 2. 1 ccccAAG 2. 1 ccccAAT 2. 0 ccccAGc 2. 1 ccccAGA 2. 1 ccccAGG 2. 0 ccccAGT 2. 0 ccccTAc 1. 5 ccccTAA 1. 3 ccccTGc 1 ' ! cccclcc 1 5
Tcccgcc 5. 1 TcccgcA 2. 8 TcccgcG 2. 6 TcccgcT 2, 6
Tcc cgTc 3, 1 TcccgTA 2. 9 Tccc^TG 2. 5 i cccgTT 2. 4
TcccgAc 2. I TcccgAA 2. 5 TcccgAG 2, 0 TcccgAT 2. 9
TcccgGc 2. 0 TcccgGA I . 4 TcccgGG 1. 5 TcccCcc 2. 5
TcccCcA 2. 5 TcccCcG 2. 9 TcccCcT 3 Tcc cCTc 2. 2
TcccCTA 2, 2 TcccCTG 1. 9 TcccCTT Ξ. 0 Tcc cCAc 1. 9
TcccCAA 2. 0 TcccCAG 2. 0 TcccCAT 2. 1 TcccCGc 1. 9
TcccCGA 1. 3 TcccAcc 2. 1 TcccAcA 1. 9 TcccAcG 2. 0
Tc ccAcT 2. 0 TcccATc 2, 0 TcccATA 1. 9 TcccATG I . 9
TcccATT つ 0 TcccAAc 1 , 9 Tec cAAA 0 TcccAAG 2. 0
TcccAAT 1 TcccAGc 1. 9 TcccAGA i . 4 Tcc cAGG 1. 2
TcccTcc L 6 TcccTcA 1. TcccTcG 1. 1 Tcc cTcT 1 , 1
TcccTTc 1. 2 TcccTAc 1. 2 TcccTGc 1. 0 Acc cgcc 3. 0
AcccgcA 2. 9 AcccgcG 2. 2 Acccgc Γ 1 . 9 AcccgTc 2. 2
AcccgTA 2. 1 AcccgTG 2. 0 Acccgl Γ 2. 0 AcccgAc 4
AcccgAA 2. 0 AcccgAG 1. 9 A cccgAT 2 , 1 AcccgGc 1. 6
AcccgGA 1. 4 AcccgGti L 4 AcccgGT 1 , 4 AcccCcc 3. 0
AcccCcA L 9 AcccCcG 2. 3 AcccCc ί 1. 9 Accede 2. I
AcccCTA 2. 0 AcccCTG 2, 1 AcccCTT 2. 0 AcccCAc 〗., 5
AcccCAA 1. 4 AcccCAG 1. 3 AcccCAT 1, 3 AcccCGc 1. 2
AcccCOA i . 4 AcccCGG 1, 3 AcccCGT 1 . 2 AcccAcc 1. 9
AcccAcA 2. 1 AcccAcG 1. 9 AcccAcT 1 . 9 AcccATc 2
AcccATA 1. 9 AcccATG 1. 9 AcccATT 2. 2 AcccAAc 2. 0
AcccAAA 1. 9 AcccAAG 2. 0 AcccAAT 2. 0 AcccAGc 1. 3
AcccACrA 1. i AcccAGG 1. 1 AcccAGT 1. 2 Accc Tcc 1. 1
AcccTcT L 0 AcccTTc 1. 0 AcccTGc i . 0 Gcc cgcc L i
GcccgTc L 2 GcccgcA 1. 3 GcccgGc 1 . 3 Gcc cCcc 1. 5
GcccTcc 1 , 2 GcccAcc 1. 1 ggcgggg 4. 5 agcgggg 4, 4 gacgggg 4. 0 t tcgggg 3. 9 ggggggg 2. 0 ggcggga 4. 0 tgcggga 2. 1 gacggga 3. 0 tggggga 1. 9 ggcgggt 3. 0 野生型 （cC C C SC C) 5. 0
陰性コン トロール' L 0 以上より、ヌクレオチド配列： xlcccx5x6x7 (式中、 xlは、 cまたは tが望ましいが、 a でもよい、 x5は、 gが望ましいが、 cまたは a、場合によっては tでもよい、 x6は、 cが望ま しいが、ほたは a、場合によっては gでもよい、 x7は、 cが望ましいが、 a、または gで もよい。）、およびこれらの配列に相補的なヌクレオチド配列に低温転写促進活性が 認められる。
[0047] 実施例 6
実施例 5の結果より、 ccccgccを 2個含むヌクレオチド配列は軽度低温転写制御ェ ンハンサ一であると予想される。そこで、サイトメガロウィルス（CMV)プロモーターを 持つ pcDNA3. 1 ( + )ベクター（インビトロジェン社）（図 2)のマルチクローユングサイ ト（EcoRVと Xbalの間）に、 pGL3— basicベクター（プロメガ社）から切り出したホタ ルルシフェラーゼ cDNAを組み込み、 CMVプロモーターの 5，側に
ttccccgccg caggacaaac gggtcgggaa cgcggaagtg ggtcagctcc gcctccaaat cagctgtcc c cgcctcctag tcgctag (酉己列番
を直列に 2個組み込んだ。
[0048] 次いで、このプラスミド 5. 0 μ gZ60mmディッシュを、ヒト細胞株 U— 2 OSにトラン スフエクシヨンして、 37°Cで G418 (インビトロジェン社)存在下に 3週間培養し、このプ ラスミドを安定に染色体に組み込み発現する細胞クローンを得た。この培養細胞を 2 つに分け、ともに 37°Cで 2日間培養した後、 1方を 32°Cで、他方を 37°Cでそれぞれ さらに培養した。培地は 10%FCS + D— MEMである。温度変更 48時間後、遠心分 離によって細胞を回収し、全細胞溶解液を作成した。それぞれの温度で生成したホ タルルシフェラーゼ活性を、 Dua卜 Luciferase Reporter Assayキット（プロメガ社）を用 いて測定した。結果を表 6に示す。活性としては抽出タンパク質あたりのホタルルシフ エラーゼ活性を示した。
[0049] [表 6]
染色体に組み込まれた軽度低温転写制御ェンハンサ一の転写促進活性
Figure imgf000018_0001
[0050] この結果は、低温転写制御ェンノヽンサ一が細胞染色体に安定に組み込まれた状 態でも、また異なる軽度低温転写制御エレメントが他のヌクレオチド配列を介して結 合されていても、 32°Cでの転写を促進し、タンパク質産生量を増やすことを示す。 [0051] 実施例 7
哺乳類細胞にタンパク質を産生させる場合には、 2つのタンパク質の遺伝子を同時 に一つの発現ベクターに組み込む可能性が考えられる。そこで実施例 6で使用した CMVプロモーターによりホタルルシフェラーゼを発現するベクターの低温転写制御 ェンハンサ一の 5，上流側に、さらに CMVプロモーターをもう 1個ルシフェラーゼ発現 とは逆の向き（3 'から 5 'の向き）に追加して、ルシフェラーゼ発現に対する影響を調 ベた。実施例 6と同様に、ヒト細胞株 U— 2 OSにトランスフエクシヨンして、 1方を 32°C で、他方を 37°Cでそれぞれさらに培養したところ、逆向きの CMVプロモーターが 5 ' 上流に加わったことによる発現の低下はなぐかえって 5— 10%程度 32°Cでの転写 促進、タンパク質産生の増加が認められた。このこと力も、 2つのタンパク質を逆向の プロモーターから同時に産生させるベクターにも低温転写制御ェンノ、ンサ一が利用 可能であると考えられた。
[0052] 実施例 8
ゲノレシフトアツセィ
マウス BalbZ3T3線維芽細胞を 10%ゥシ血清（CS)添カ卩のダルベッコ改変ィーグ ル培地（D— MEM) (インビトロジェン社）で 37°Cで 24時間培養し、一部を 32°C、残 りを 37°Cでさらに 8時間培養した後、常法（John David Dignani, Russell M. Lebovitz, and Robert G. Roeder、 Accurate transcription initiation by RNA polymerase II in a soluble extract from isolated mammalian nuclei. Nucleic Acids Res., 1983; 11: 1475— 1489)により核タンパク質抽出液を作製した。
オリゴヌクレオチド、 5，—ttccccgccgacggatccag— 3， (酉己歹 U番号 5)、を T4 polynuclotide k inaseと gamma- 32P- ATPで標識し、 Sephadex G50カラム（アマシャムバイオサイエ ンス社)で精製した後、相補鎖 ctggatccgtcggcggggaa (配列番号 6)とアニーリングさせ 5X105 cpm/ngのプローブを得た。
このプローブ 0. 1ナノグラムを poly (dI-dC) 0. 5マイクログラムとともに核タンパク質 抽出液に混ぜ、 20°Cに置いた（この結合バッファーの組成は、 10mM Tris (pH7. 5) , lOOmM NaCl, 2mM EDTA, 10%グリセロールである）。 30分経過後に 4 %ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行ない、ゲルを 80°Cで乾燥させ、 X線フィルムを 感光させ軽度低温転写制御エレメントに結合するタンパク質、軽度低温転写制御因 子を検出した。 （図 3)
産業上の利用可能性
本発明はタンパク質の生産に広く用いることができる。

Claims

19 請求の範囲
[ 1 ] ヌクレオチド配列：
X 1 c c c x 5 x 6 x 7
(式中、 x lは、 c t、 または aを表し、 x 5は、 g c a、 または tを表し、 x 6は、 c t a、 または gを表し、 x 7は、 c a g、 または tを表す。 ) 、 またはこの配列に相補的なヌクレオチド配列よりなる軽度低温転写制御エレメン 卜。
[ 2 ] (捕正後） ヌクレオチド配歹 (1力 ccccgcc ccccgcaN ccccgcg^ ccccgct ccccgtc ccccgta ccccgtg ccccgtt ccccgac^ ccccgaaN ccccgagN ccccgat ccccggc ccccggaN ccccgggN ccccggt ccccccc ccccc ccccccg cccccctN ccccctc cccccta ccccctg ccccctt cccccacs cccccaa cccccag^ cccccat cccccgc cccccga^ cccccggs cccccgt ccccaccN ccccaca ccccacg^ ccccactN ccccatc^ ccccataN ccccatg ccccatt^ ccccaac^ ccccaaa-, ccccaag^ ccccaat^ ccccagcN ccccaga ccccagg ccccagt cccctacs cccctcc tcccgcc tcccgca tcccgcg tcccgct tcccgtc tcccgta tcccgtg tcccgtt tcccgac^ tcccgaa tcccgag tcccgat tcccggc tcccggaN tcccggg tcccccc tccccca tcccccg tccccct tcccctc tcccctaN tcccctg tcccctt tccccacN tccccaa tccccag tccccat tccccgcx tcccaccN tcccaca^ tcccacg^ tcccactN tcccatc^ tcccata^ tcccatg^ tcccatt^ tcccaacN tcccaaa^ tcccaag tcccaats tcccagc tcccaga tccctcc acccgcc^ acccgca acccgcg acccgct^ acccgtc^ acccgtaN acccgtg acccgtt acccgac^ acccgaaN acccgagN acccgat acccggcs acccgga^ acccggg scccggt acccccc^ accccca acccccg acccccts acccctcN accccta acccctg acccctt accccac^ accccaa accccgaN dCccacc acccacaN acccacg acccactN acccatc acccata acccatgN acccatt acc acccaaaN acccaag acccaat gcccccc ggcgggg agcggggN gacgggg ttcgggg
Figure imgf000021_0001
ggcgggaN tgcgggaN gacggga, tggggga, および ggcgggt よりなる群から選択される、 請求項 1に記載 の軽度低温転写制御エレメント。
[ 3 ] (補正後） 同一または異なる、 請求項 1に記載の軽度低温転写制御ェレ メントが連結されている軽度低温転写制御ェンハンサー （伹し、 軽度低温転写制 御ェレメントとして、 tの 3'側に続くヌクレオチド配列： ccccgcc ccccgtc, ccccgct、 または ccccgaa ; gの 3，側に続くヌクレオチド配列： ccccgcc ; aの 3'側に 20
続くヌクレオチド配歹 (Jccccgccヽ 3，末端の aに先行する ggcggggヽ または ggggggg のみを含むものを除く） 。
[ 4 ] (補正後） 同一または異なる、 請求項 1に記載の軽度低温転写制御エレ メントが他のヌクレオチド残基を介して結合されている軽度低温転写制御ェンハ ンサー （伹し、 軽度低温転写制御エレメントとして、 の3'側に続くヌクレオチ ド酉己列 ·· ccccgcc ccccgtcヽ ccccgctヽ まには ccccgaa ; gの 3，側に続くヌクレオ チド配列： ccccgcc ; aの 3，側に続くヌクレオチド配列 ccccgcc、 3'末端の aに先行 する ggcgggg、 または gggggggのみを含むものを除く） 。
[ 5 ] ヌクレオチド配列：
ttccccgccg caggacaaac gggtcgggaa cgcggaagtg ggtcagctcc gcctccaaat cagctgtccc cgcctcctag tcgctag
(配列番号 3 )
を有する請求項 4に記載の軽度低温転写制御ェンハンサ一。
[ 6 ] 請求項 1または 2のいずれかに記載の軽度低温転写制御エレメント、 ま たは請求項 3〜 5のいずれかに記載の軽度低温転写制御ェンハンサーを含むベタ ター。
[ 7 ] 請求項 6に記載のベクターで形質転換された真核生物細胞。
[ 8 ] 請求項 6に記載のベタタ一で形質転換された真核生物。
[ 9 ] 軽度低温転写制御因子およびその制御物質のアツセィ方法であって、 請 求項 1または 2に記載の軽度低温転写制御エレメントを含む二本鎖 D N Aプロ一 ブとァッセィ対象のタンパク質溶液とを接触させ、 特異的に軽度低温転写制御ェ レメントに結合した軽度低温転写制御因子の量を、 結合している二本鎖 D NAプ ローブを検出することによって測定することを含む方法。
[ 1 0 ] 軽度低温転写制御因子の精製方法であって、 請求項 1または 2に記載 の軽度低温転写制御エレメントを含む二本鎖 D N Aプローブとタンパク質溶液と を接触させ、 特異的に軽度低温転写制御エレメントに結合した軽度低温転写制御 因子を得、 その後軽度低温転写制御因子を単離することを含む方法。
訂正された用紙
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