KR20080041672A

KR20080041672A - 경도의 저온에서 유전자의 발현을 촉진시키는 서열

Info

Publication number: KR20080041672A
Application number: KR1020087005152A
Authority: KR
Inventors: 준 후지타
Original assignee: 준 후지타
Priority date: 2005-09-05
Filing date: 2006-09-04
Publication date: 2008-05-13
Also published as: EP1930425A4; WO2007029641A1; US20100143896A1; AU2006288394A1; EP1930425A1; JPWO2007029641A1; CA2620136A1

Abstract

진핵생물, 특히 포유동물 세포를 이용한 재조합 DNA 법으로 생산하는 단백질을 증가시키는 것을 목적으로 한다. 이 목적은, 뉴클레오티드 서열 : x 1 c c c x 5 x 6 x 7(식 중, x 1은 c, t, 또는 a를 나타내고, x 5는 g, c, a, 또는 t를 나타내고, x 6은 c, t, a, 또는 g를 나타내고, x 7은 c, a, g, 또는 t를 나타낸다.) 또는 이 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 경도 저온 전사 제어 엘레멘트, 또는 경도 저온 전사 제어 엘레멘트를 연결하여 이루어진 경도 저온 전사 제어 인핸서를 이용함으로써 달성된다.

재조합 DNA, 벡터, 엘레멘트, 인핸서, 단백질

Description

경도의 저온에서 유전자의 발현을 촉진시키는 서열{SEQUENCE CAPABLE OF ENHANCING THE EXPRESSION OF GENE UNDER MODERATELY LOW TEMPERATURE}

본 발명은 경도의 저온에서 유전자의 전사를 촉진시키는 경도 저온 전사 제어 엘레멘트(올리고뉴클레오티드)와, 상기 경도 저온 전사 제어 엘레멘트를 포함하는 인핸서(enhancer)에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 경도 저온 전사 제어 엘레멘트를 이용한 경도 저온 전사 제어 인자(단백질)의 에세이(assaying) 방법과 정제 방법에 관한 것이다.

모노클로날(monoclonal) 항체, 성장인자, 응고인자 등 많은 의약품이나 검사시약이 바이오테크놀로지에 의해 생산되고 있다.

일반적으로 10 ~ 15℃의 저온에서는, 재조합(recombinant) 단백질의 올바른 폴딩(folding)이 촉진되고, 그 단백질 분해효소에 의한 분해도 억제되기 때문에(Baneyx, F., In vivo folding of recombinant proteins in Escherichia coli. In Manual of industrial microbiology and biotechnology, 2nd ed.(Demain, A.L., Davies, J.E., Altas, R.M., et al., eds.), ASM Press, Washington D.C., pp.551-565, 1999), 재조합 단백질을 박테리아로 생산하는 경우에는, 37℃가 아닌 20℃ 이하의 저온에서의 배양이 이용되고 있다. 이때, 저온에서는 단백질 합성이 일반적으 로 저하되기 때문에, 목적 단백질의 수득률이 나빠질 가능성이 있다. 그 때문에, 목적 단백질의 발현 프로모터로서 저온 쇼크 단백질(cold shock protein) CspA의 프로모터와 5' 비번역 영역(untranslated region; UTR)을 이용해서 이 문제를 해결하고 있다(Baneyx, F. and Mujacic, M., Cold-inducible promoters for heterologous protein expression. Methods in Molecular Biology, 205, 1-18, 2001.).

그러나, 박테리아와 포유동물 세포에서, 단백질의 번역 후 수식에 큰 차이가 있고, 특히 의약품의 경우에는 글리코실화(glycosylation)의 상태가 치료효과에 중요하다. 그 때문에, 재조합 단백질 의약품의 생산에 포유동물 세포(특히 차이니즈 햄스터의 세포주)가 이용되고 있다. 이 세포 배양을 이용한 제조 비용을 줄이기 위해서는, 단백질의 수득률을 높일 필요가 있다. 37℃에서 통상적인 배양을 행하는 경우, 세포는 급격히 증식한 후 사멸하기 때문에, 세포가 생존해서 목적 단백질을 생산하는 기간이 짧다고 하는 결점이 있다. 그 때문에, 세포증식을 억제하고, 장기간 세포를 생존시키는 것이, 세포증식 저해제 첨가, 증식 저해 유전자 p27의 발현, 경(輕)한 저온(30-32℃)에서의 배양, 기타의 방법에 의해 시도되고 있다(Schatz SM et al, Biotechnol Bioeng 2003 Nov 20;84(4) : 433-438 참조).

그 중에서도 경한 저온에서의 배양은, 1) 배양 온도가 37℃인 경우보다도 세포가 장기간 생존해서 단백질 합성을 행한다. 2) 단백질 분해효소의 활성이 저하되어 목적 단백질의 분해가 감소한다. 3) 단백질의 글리코실화나 이성체의 생산은 37℃에서 배양할 때와 같은 정도이다. 또한, 시알산 부가(sialylation)는 오히려 37 ℃에서 보다도 양호하다. 4) 박테리아에서의 경우와 마찬가지로 목적 단백질의 올바른 폴딩이 일어나기 쉬운 가능성이 있다고 하는 특징이 있다(Kaufmann H, Mazur X, Marone R, Bailey JE, Fusseneg ger M. Biotechnol Bioeng. 2001 Mar 20;72(6): 592-602; Yoon SK, Song JY, Lee GM., Biotechnol Bioeng. 2003 May 5;82(3): 289-98).

중요한 재조합 단백질 수득률에 관해서는, 세포의 생존기간이 연장되기 때문에 총 수득률이 증가되는 경우가 많다. 그러나, 세포 당 단위시간에서의 단백질 생산량(specific productivity)을 볼 경우, 편차(세포의 종류나 목적 단백질의 종류에 의하거나, 미지의 요인에 의한)가 있고, 37℃에서의 생산량보다도 오히려 저하되는 예가 많아 문제점으로 되고 있다(Kaufmann H, Mazur X, Marone R, Bailey J E, Fussenegger M. Biotechnol Bioeng. 2001 Mar 20;72(6): 592-602; Yoon SK, Song JY, Lee GM., Biotechnol Bioeng. 2003 May 5;82(3): 289-98). 한편, 유전자 발현 제어기구가 다르기 때문에, 박테리아의 저온 쇼크 단백질 CspA의 프로모터와 5' 비번역 영역(UTR)을 포유동물에 이용할 수가 없다.

한편, 가장 단순한 진핵생물인 분열효모는, 그 게놈 사이즈가 1300만 염기쌍(base pairs)으로 작으나 진핵세포의 기본적인 기능을 구비하고 있는 것, 30% 이상의 유전자가 인트론(introns)을 가진 것, 인간의 이미 알려져 있는 상동 유전자와 아미노산 서열 보존성이 높고, 인간의 유전자가 효모 내에서 정상적으로 발현하는 것, 기능 해석이 용이한 것 등의 점에서, 인간의 모델로서 생물과학 연구에 이용되고 있다(Molecular Biology of the Cell. 제4판, Alberts B, Johnson A, Lewis J, Raff M, Roberts K, Walter P 저, Garland Science사, 뉴욕, 2002). 따라서, 효모를 포함한 균류 및 그보다도 인간에 가까운 진핵생물, 예를 들어, 식물, 선형 동물, 곤충, 어류, 양서류, 조류 등 유래의 세포는, 필요에 따라 적절한 유전자를 보충하는 것에 의해, 포유동물 세포와 마찬가지로 단백질의 번역 후 수식을 행하여 저온에서 단백질 생산을 위해 배양하는 것도 가능할 것으로 생각될 수 있다. 또한, 유전자 공학적 기술을 이용하면, 이들 유전자 수식을 행한 진핵생물 세포를 포함한 진핵생물 개체를 얻어, 단백질을 생산하는 것도 가능하다고 생각될 수 있다.

비특허문헌 1 : Kaufmann H, Mazur X, Marone R, Bailey JE, Fussenegger M. Biotechnol. Bioeng. 2001 Mar 20; 72(6) : 592-602

비특허문헌 2: Yoon SK, Song JY, Lee GM., Biotechnol. Bioeng. 2003 May 5;82(3) : 289-98

비특허문헌 3 : Fujita J., J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 1999 Nov; 1(2): 243-55

비특허문헌 4 : Molecular Biology of the Cell. 제4판, Alberts B, Johnson A, Lewis J, Raff M, Roberts K, Walter P 저, Garland Science사, 뉴욕, 2002

본 발명은 저온에서 세포 당 단위시간에서의 단백질 생산량을 높여, 총 수득률을 높이는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 경도 저온 전사 제어 인자(단백질)의 동정방법 및 정제방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명자는, 출원 중의 국제특허출원(PCT/JP2005/003385)에 개시한 것과 같이, 경한 저온 온도 하에서 전사를 촉진시키는 인핸서로서 작용하는 유전자 발현 제어 서열(이하, 「경도 저온 전사 제어 엘레멘트」라 함)을 발견하였다. 그 서열의 예는, 뉴클레오티드 서열:

tccccgcc

또는 이 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열이다.

본 발명자는 경도 저온 전사 제어 엘레멘트에 대해 더 연구를 진행시킨 결과, 뉴클레오티드 서열:

x 1 c c c x 5 x 6 x 7

(식 중, x 1은 c, t 또는 a를 나타내고, x 5는 g, c, a 또는 t를 나타내고, x 6은 c, t, a 또는 g를 나타내고, x 7은 c, a, g 또는 t를 나타낸다.)

이 경도의 저온에서 특이적으로 유전자의 전사를 촉진한다는 것을 알아내었다.

즉, 본 발명은, 뉴클레오티드 서열:

x 1 c c c x 5 x 6 x 7

또는 이 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 경도 저온 전사 제어 엘레멘트에 관한 것이다.

본 명세서에서 「경도 저온 전사 제어 엘레멘트」라 함은, 경도의 저온에서 특이적으로 유전자의 전사를 촉진시키는 뉴클레오티드 서열의 단위를 말한다.

본 명세서에서 「경도의 저온」이라 함은, 15 ~ 36℃, 바람직하기는 30 ~ 34℃, 특히 바람직하기는 32℃의 온도를 말한다. 본 발명의 경도 저온 전사 제어 엘레멘트는 유전자의 전사에 있어 경도의 저온의 특이적 인핸서로서 작용한다.

본 발명의 경도 저온 전사 제어 엘레멘트는 단독으로 이용하여도 그 기능을 발휘할 수 있으나, 동일 또는 상이한 서열을 2 ~ 350개, 바람직하기는 2 ~ 100개를 결합해서 사용하는 것이 바람직하다. 결합시켜 사용하는 경우, 동일 또는 상이한 뉴클레오티드 서열을 상호 직접 연결하여도 좋으나, 당해 서열 사이에 임의의 종류 및 수의 뉴클레오티드 잔기를 개재하여 결합시켜도 좋다. 경도 저온 전사 제어 엘레멘트를 결합시킨 것을 본 명세서에서는 「경도 저온 전사 제어 인핸서」 또는 단지 「인핸서」로 부르기로 한다. 단, 본 발명의 경도 저온 전사 제어 인핸서는, 경도 저온 전사 제어 엘레멘트로서, t의 3'측에 계속되는 뉴클레오티드 서열: ccccgcc, ccccgtc, ccccgct, 또는 ccccgaa; g의 3'측에 계속되는 뉴클레오티드 서열: ccccgcc; a의 3'측에 계속되는 뉴클레오티드 서열 ccccgcc, 3'말단의 a에 선행하는 ggcgggg, 또는 ggggggg 만을 포함하는 것을 제외한다. 본 발명의 경도 저온 전사 제어 엘레멘트 및 경도 저온 전사 제어 인핸서는 프로모터로부터의 거리, 방향에는 무관하다.

또한 본 발명에서 「경도 저온 전사 제어 인자(단백질)」라 함은, 경도의 저온에 의해 활성화되어 경도 저온 전사 제어 엘레멘트에 결합해서, 엘레멘트의 근방에 있는 유전자의 전사를 제어, 많은 경우는 촉진하는 단백질이다.

본 발명은 또한, 상기 기재의 경도 저온 전사 제어 엘레멘트 또는 경도 저온 전사 제어 인핸서를 포함하는 벡터에 관한 것이다.

본 발명은 또한, 상기 벡터로 형질전환된 진핵생물 세포에 관한 것이다.

본 발명은 또한, 상기 벡터로 형질전환된 진핵생물에 관한 것이다. 이하의 실시예에 나타낸 바와 같이, 저온 전사 제어 인핸서는 세포 염색체에 안정하게 융합되어 얻어진다.

본 발명은 또한, 경도 저온 전사 제어 인자 및 그 제어 물질의 에세이법에 관한 것이다. 그 방법은, 경도 저온 전사 제어 엘레멘트를 포함하는 2중 사슬 DNA 프로브와 에세이 대상인 단백질 용액을 접촉시켜, 특이적으로 경도 저온 전사 제어 엘레멘트에 결합된 경도 저온 전사 제어 인자의 양을, 결합된 2중 사슬 DNA 프로브를 검출하는 것에 의해 측정하는 것을 포함한다. 제어물질의 활성은, DNA 프로브에 결합되는 경도 저온 전사 제어 인자의 양의 변화를 정량하는 것에 의해 에세이된다.

본 발명은 또한, 경도 저온 전사 제어 인자의 정제방법에 관한 것이다. 그 방법은, 경도 저온 전사 제어 엘레멘트를 포함하는 2중 사슬 DNA 프로브와 단백질 용액을 접촉시켜, 경도 저온 전사 제어 엘레멘트에 특이적으로 결합된 경도 저온 전사 제어 인자(단백질)를 얻고, 이어서 경도 저온 전사 제어 인자를 단리하는 것을 포함한다.

본 발명의 경도 저온 전사 제어 엘레멘트에 의하면, 경도의 저온에서 유전자의 전사를 촉진시킬 수 있다. 본 발명에 의하면, 경도 저온 전사 제어 인자(단백질) 및 그 제어물질을 동정 또는 정제할 수 있다.

도 l은, pCAT3 프로모터 벡터를 나타내는 모식도이다. MCS는 멀티클로닝 사이트(multi-cloning site)를 나타내고, SV40 프로모터는 SV40 바이러스 유래의 프로모터를 나타내며, CAT는 클로람페니콜 아세틸트란스페라제(chloramphenicol acetyltransferase)의 코딩 서열을 나타내고, PA는 SV40 바이러스 유래의 폴리아데 닐화 시그널(polyadenylation signal)을 나타내며, Amp^r은 암피실린(ampicillin) 내성 유전자를 나타낸다.

도 2는, pcDNA3.1(+) 벡터(Invitrogen 사)를 나타내는 모식도이다. MCS는 멀티클로닝 사이트를 나타낸다. 이 멀티클로닝 사이트의 EcoRV와 XbaI의 사이에 반딧불 루시페라제(luciferase)의 코딩 서열을 삽입하고, CMV 프로모터의 5'측에 경도 저온 전사 제어 인핸서를 융합하였다. Neo^r는 G418 내성 유전자를 나타낸다.

도 3은, 마우스 Ba1b/3T3 세포를 37℃(1레인) 또는 32℃(2레인)에서 8시간 배양했을 때의 단백질을, 32P-ATP로 표지한 5'-ttccccgccgacggatccag-3'를 프로브로서 겔 시프트 에세이(gel shift assay)하여, 경도 저온 전사 제어 엘레멘트에 결합된 경도 저온 전사 제어 인자를 검출하였다.

경도 저온 전사 제어 엘레멘트의 예는, 한정되는 것은 아니나 ccccgcc, ccccgca, ccccgcg, ccccgct, ccccgtc, ccccgta, ccccgtg, ccccgtt, ccccgac, ccccgaa, ccccgag, ccccgat, ccccggc, ccccgga, ccccggg, ccccggt, ccccccc, cccccca, ccccccg, cccccct, ccccctc, cccccta, ccccctg, ccccctt, cccccac, cccccaa, cccccag, cccccat, cccccgc, cccccga, cccccgg, cccccgt, ccccacc, ccccaca, ccccacg, ccccact, ccccatc, ccccata, ccccatg, ccccatt, ccccaac, ccccaaa, ccccaag, ccccaat, ccccagc, ccccaga, ccccagg, ccccagt, cccctac, cccctcc, tcccgcc, tcccgca, tcccgcg, tcccgct, tcccgtc, tcccgta, tcccgtg, tcccgtt, tcccgac, tcccgaa, tcccgag, tcccgat, tcccggc, tcccgga, tcccggg, tcccccc, tccccca, tcccccg, tccccct, tcccctc, tccccta, tcccctg, tcccctt, tccccac, tccccaa, tccccag, tccccat, tccccgc, tcccacc, tcccaca, tcccacg, tcccact, tcccatc, tcccata, tcccatg, tcccatt, tcccaac, tcccaaa, tcccaag, tcccaat, tcccagc, tcccaga, tccctcc, acccgcc, acccgca, acccgcg, acccgct, acccgtc, acccgta, acccgtg, acccgtt, acccgac, acccgaa, acccgag, acccgat, acccggc, acccgga, acccggg, acccggt, acccccc, accccca, acccccg, accccct, acccctc, accccta, acccctg, acccctt, accccac, accccaa, accccga, acccacc, acccaca, acccacg, acccact, acccatc, acccata, acccatg, acccatt, acccaac, acccaaa, acccaag, acccaat, gcccccc, ggcgggg, agcgggg, gacgggg, ttcgggg, ggggggg, ggcggga, tgcggga, gacggga, tggggga 및 ggcgggt를 포함한다.

(i) 경도 저온 전사 제어 엘레멘트의 제조

경도 저온 전사 제어 엘레멘트 및 경도 저온 전사 제어 인핸서는, 보호기가 붙은 4종류의 디옥시리보뉴클레오티드(deoxyribonucleotide)를 사용하여 포스포로 아미다이드(phosphoroamidide)를 이용한 고상합성법(固相合成法), 하이드로겐 포스포네이트(hydrogen phosphonate)를 이용한 고상합성법 등으로 얻을 수 있다(예컨대, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press, 35-81,83-115(1984); J. Org. Chem., 49,2139(1984); Tetrahedron Lett., 27,469(1986); Tetrahedron Lett., 22,1859-1862; Tetrahedron Lett., 21, 719-722(1980); J. Am. Chem. Soc., 103, 3185-3191(1981)을 참조). 오늘날에는 시판되는 DNA 합성장치(예컨대 Applied Biosystem 사 제 등)로 용이하게 합성할 수 있다.

(ii) 사용하는 프로모터

프로모터(promoter)로는, 원핵생물, 진핵생물, 바이러스의 프로모터를 사용할 수 있다. 바람직한 것은 포유동물 프로모터 및 바이러스 프로모터이다. 바람직한 프로모터의 예는, 한정되는 것은 아니지만, 마우스 티미딘 키나제(mouse thymidine kinase; TK) 프로모터, 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus; CMV) 프로모터, SV40 프로모터를 포함하다.

(iii) 코드 서열

발현시키고자 하는 유전자에는 제한이 없고, 어떤 단백질을 코드하는 서열도 이용할 수 있다. 한편, 단백질을 코드하지 않는 RNA를 발현시키는 것도 가능하다.

(iv) 사용하는 벡터

본 발명의 경도 저온 전사 제어 엘레멘트 또는 경도 저온 전사 제어 인핸서, 프로모터 및, 발현시키고자 하는 단백질을 코드하는 코드 서열 또는 단백질을 코드하지 않는 목적 서열을 연결해서 벡터(vector)에 삽입한다. 벡터는 원핵세포 및 진 핵세포 발현용 벡터이다. 포유동물 세포의 경우, 바람직한 벡터의 예는, 한정되지는 않지만, pCMV(Invitrogen 사), pCAT3 프로모터 벡터(Promega 사), pSV2-네오 벡터를 포함한다.

(v) 사용하는 숙주세포

당해 벡터로 숙주세포를 트랜스펙트(transfect) 시킨다. 숙주세포로서는 진핵생물 세포, 특히 포유동물 세포를 사용하는 것이 바람직하다. 바람직한 포유동물 세포주의 예는 인간 세포주 293, 293T, U-2 OS, Huh-7, HeLa 등, 원숭이 세포주 COS-7, Vero 등, 마우스 세포주 NIH/3T3, Balb/3T3, B-6, Hepal-6, 차이니즈 햄스터 세포주 CHO 등이다.

트랜스펙션의 방법으로는 인산칼슘법, 리포펙션(lipofection)법, 레트로바이러스(retrovirus)법, 전기천공법 등이 있다. 예컨대, 인산칼슘법에서는, 인산 용액에 DNA(벡터)를 함유하는 염화칼슘 용액을 교반하면서 한 방울씩 가한다. DNA-인산칼슘의 미세한 침전이 일어나고, 이 용액을 숙주세포에 가하면 DNA-인산칼슘의 침전이 숙주세포에 식작용(食作用)에 의해 들어가게 되는 결과, DNA가 세포 내로 들어가게 된다.

(vi) 배양 조건

숙주세포는 경도의 저온에서 배양한다. 배지는 특별한 것을 사용할 필요는 없고, 각각의 세포에 통상 사용되는 것으로도 좋다. 포유동물 세포 배양용의 전형적인 배지의 예는, 10% 소 태아 혈청(FCS) 첨가의 Dulbecco's modified Eagle's medium(D-MEM, Invitrogen 사)이다.

본 발명은 또한, 경도 저온 전사 제어 인자(단백질) 및 그 제어 물질의 에세이법에 관한 것이다. 그 방법은, 경도 저온 전사 제어 엘레멘트를 포함하는 2중 사슬 DNA 프로브와 에세이 대상의 단백질 용액을 접촉시켜, 특이적으로 경도 저온 전사 제어 엘레멘트에 결합한 경도 저온 전사 제어 인자의 양을, 결합되어 있는 2중 사슬 DNA 프로브를 검출하는 것에 의해 측정하는 것을 포함한다. 제어물질의 활성은, DNA 프로브에 결합되는 경도 저온 전사 제어 인자의 양의 변화를 정량(定量)함으로써 에세이 하게 된다.

먼저, 경도 저온 전사 제어 엘레멘트를 포함하는 DNA 올리고뉴클레오티드 및 그 상보 사슬을 표준적인 방법에 따라 제작한다. 제작한 올리고뉴클레오티드의 말단을, 예를 들면 비오틴(biotin)으로 표지하고, 어닐링(annealing)시켜 2중 사슬로 한다. 또는, 올리고뉴클레오티드를 2중 사슬로 하고 나서 표지할 수도 있고, 표지하지 않은 2중 사슬로서 최후에 검출할 수도 있다. 이 이하는 시판하는 겔 시프트 에세이(EMSA: electrophoretic mobility shift assay) 킷(PIERCE 사, Molecular Probes 사 등)을 이용할 수 있다. 이어서, 2중 사슬 올리고뉴클레오티드와, 경도 저온 전사 제어 인자, 그리고 경우에 따라 그 제어 물질을 포함하는 것으로 생각되는 단백질 용액, 예컨대 핵 추출물을 혼합해서, 2중 사슬 올리고뉴클레오티드와 경도 저온 전사 제어 인자를 반응시킨다. 다음에 겔 전기영동, 예컨대 폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로, 올리고뉴클레오티드, 단백질 및 양자의 결합물을 분리한다. 유리된 올리고뉴클레오티드는 빨리 흐르기 때문에 하부로 오지만, 단백질이 결합된 올리고뉴클레오티드는 천천히 흐르기 때문에 상부에 나타난다. 특이적으로 올리고 뉴클레오티드에 결합되어 있는 단백질로서 경도 저온 전사 제어 인자를 검출한다. 예컨대, 올리고뉴클레오티드가 비오틴 표지 되어 있으면, 전기영동 후, 폴리아크릴아미드 겔을 나일론 멤브레인에 브롯팅하고, 자외선을 이용해서 멤브레인에 크로스링크(cross-link)시킨다. 멤브레인 상의 비오틴 표지와 퍼옥시다제가 표지된 스트렙토아비딘을 특이적으로 결합시켜, 화학발광 기질(化學發光基質)과의 반응으로 발광시키고, X선 필름에 감광시켜 검출한다. 상기의 Molecular Probes 사의 킷을 사용하면, 표지가 없는 올리고뉴클레오티드를 이용해서 반응, 전기영동시켜, 겔을 그대로 색소로 염색함으로써 단백질이 결합된 올리고뉴클레오티드를 검출할 수가 있다. 이 특이적으로 단백질이 결합된 올리고뉴클레오티드의 양으로부터, 경도 저온 전사 제어 인자가 에세이 된다. 그리고, 이 경도 저온 전사 제어 인자의 양에 대한 영향을 정량함으로써, 그 제어 물질의 활성을 에세이 할 수 있다.

본 발명은 또한, 경도 저온 전사 제어 인자의 정제 방법에 관한 것이다. 그 방법은, 경도 저온 전사 제어 엘레멘트를 포함하는 2중 사슬 DNA 프로브와 단백질 용액을 접촉시켜, 특이적으로 경도 저온 전사 제어 엘레멘트에 결합된 경도 저온 전사 제어 인자를 얻고, 다음에 경도 저온 전사 제어 인자를 단리하는 것을 포함한다.

먼저 경도 저온 전사 제어 엘레멘트를 포함하는 DNA 올리고뉴클레오티드 및 그 상보사슬을 표준적인 방법에 따라 제작한다. 다음에는, 예컨대, 제작한 올리고뉴클레오티드를 담체에 결합시켜 고상화(固相化) 한다. 예컨대, 올리고뉴클레오티드를 비오틴화하고, 상보사슬을 어닐링시켜 2중 사슬로서, 아비딘화된 자기 비 드(avidinylated magnetic beads)에 결합시킨다. 다음에, 고상화 한 2중 사슬 올리고뉴클레오티드와, 경도 저온 전사 제어 인자를 포함하는 것으로 생각되는 단백질 용액, 예컨대 핵 추출 단백질을 사이즈로 나눈 분획(分劃)을 혼합하여, 2중 사슬 올리고뉴클레오티드와 경도 저온 전사 제어 인자를 접촉시킨다. 다음에, 경도 저온 전사 제어 인자와 결합된 2중 사슬 올리고뉴클레오티드를, 예컨대 자기 비즈를 담체로 사용하고 있으면 자석으로, 회수한다. 잘 세정한 후에, 특이적으로 결합된 단백질, 즉 경도 저온 전사 제어 인자를 용출시키면, 경도 저온 전사 제어 인자가 정제된다. 한편 필요에 따라, 겔 전기영동이나 컬럼 크로마토그래피(column chromatography) 등으로 다시 정제할 수 있다. 정제한 단백질로부터, 경도 저온 전사 제어 인자의 아미노산 서열, 유전자를 동정할 수도 있다.

이하 본 발명을 실시예에 의해 다시 설명하는바, 본 발명은 이들 실시예에 한정되지 않음은 물론이다.

실시예 1

tccccgcc를 포함하는 8염기를 직렬로 3개를 이어 연속시킨 것(tccccgcctccccgcctccccgcc)(서열번호 1), 또는, tccccgcc의 5' 말단의 t를 다른 염기로 변이시킨 변이체를 마찬가지로 직렬로 3개 이어 연속시킨 것을 pCAT3 프로모터 벡터(Promega 사)의 멀티 클로닝 사이트에 삽입하였다. 이 벡터는 SV40의 브로모터를 갖고 있다. 리포터 단백질로서 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT) 유전자를 갖고 있다. 음성 대조군으로서 아무것도 삽입하지 않은 pCAT3 프로모터 벡터를 이용하였다.

이들 플라스미드의 각 2.5 ~ 5.0㎍/35mm 디쉬(dish)를, CDM8- LacZ( β-갈락토시다제 발현벡터로서, 각 트랜스펙션의 효율을 보정하기 위해 사용하였다. ATCC 사) 0.5 ~ 1.0㎍/35mm 디쉬와 함께, 37℃에서 1일 배양한 인간 세포주 293에 코-트랜스펙션(co-transfection) 하였다.

트랜스펙션 한 세포를 둘로 나누어, 한쪽을 32℃에서, 다른 쪽을 37℃에서 각각 배양하였다. 배지는 10% FCS 첨가 D-MEM이었다.

36시간 후, 원심분리에 의해 세포를 회수하여, 전(全) 세포 용해액을 준비하였다. 각각의 온도에서 생성된 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT) 단백질의 양을 CAT ELISA 킷(Roche Diagnostics 사)을 이용해서 측정하고, β-갈락토시다아제(LacZ) 활성을 β-갈락토시다아제 에세이 킷(Stratagene 사)을 이용해서 측정하였다.

36시간에서의 데이터를 아래 표에 나타내었다. 전사 활성은, CAT 단백질량을 β-갈락토시다아제 활성으로 나눈 값을 이용하였다. 대조군으로서 아무것도 삽입하지 않은 pCAT3 프로모터 벡터를 이용했을 때의 32℃/37℃의 비를 1로 하고, 각각의 변이체의 저온 전사 촉진(인핸서) 활성을 나타내었다.

최초의 1염기의 변이체의 저온 전사 촉진(인핸서) 활성
엘레멘트	염기서열	인핸서 활성
야생형 Ot	tccccgcc	5.8
변이체 Oc	Cccccgcc	4.5
변이체 Oa	Accccgcc	5.5
변이체 Og 대조군	Gccccgcc	5.4
변이체 Og 대조군		1.0

최초의 염기의 C, A, 또는 G 변이체는, 야생형과 거의 같은 저온 전사 촉진 활성을 나타내었다. 이것은, 경도 저온 전사 제어 엘레멘트는, 7개의 뉴클레오티드로 된 ccccgcc 로 충분하다는 것을 나타낸다.

상기 경도 저온 전사 제어 인핸서 tccccgcctccccgcctccccgcc(서열번호 1) 대신 ttccccgccgttccccgccgttccccgccg(서열번호 2)를 사용한 경우에도 마찬가지 결과가 얻어졌다.

실시예 2

실시예 1에서 8염기 중의 최초의 염기 T, C, A, G 어느 것도 활성에는 관계가 없는 것으로 나타났으므로, tcccgcc, acccgcc, gcccgcc, ccccgct 염기서열 각각의 5' 측에 T, C, A, 또는 G를 부착한 8염기를 직렬로 3개를 이어 연속시킨 것을 실시예 1과 마찬가지로 pCAT3 프로모터 벡터(Promega 사)의 멀티 클로닝 사이트에 삽입하여, 저온 전사 촉진(인핸서) 활성을 측정해서, 표 2의 결과를 얻었다. 전사 활성으로서 CAT 단백질 양을 β-갈락토시다아제 활성으로 나눈 값을 사용하였다. 음성 대조군으로서 아무것도 삽입하지 않은 pCAT3 프로모터 벡터를 사용했을 때의 32℃/37℃의 비를 1로 하고, 또한 양성 대조군으로서 야생형 tccccgcc를 직렬로 3개 이어 연속시킨 것을 사용했을 때의 32℃/37℃의 비를 5로 보정하여, 각각의 변이체의 저온 전사 촉진(인핸서) 활성을 나타내었다.

최초의 1염기가 저온 전사 촉진(인핸서) 활성에 미치는 영향

엘레멘트	염기서열	인핸서 활성
야생형 0t	tccccgcc	5.0
변이체 0t1t	tTcccgcc	5.1
변이체 0c1t	CTcccgcc	4.6
변이체 0a1t	ATcccgcc	4.8
변이체 0g1t	GTcccgcc	4.9
변이체 0t1a	tAcccgcc	3.1
변이체 0c1a	CAcccgcc	3.0
변이체 0a1a	AAcccgcc	2.9
변이체 0g1a	GAcccgcc	2.8
변이체 0t1g	tGcccgcc	1.1
변이체 0c1g	CGcccgcc	1.0
변이체 0a1g	AGcccgcc	1.1
변이체 0g1g	GGcccgcc	1.2
변이체 0t7t	tccccgcT	4.8
변이체 0c7t	CccccgcT	4.8
변이체 0a7t	AccccgcT	5.2
변이체 0g7t	GccccgcT	5.0
음성 대조군		1.0

저온 전사 촉진 활성을 나타내는 경도 저온 전사 제어 엘레멘트 8염기, 예컨대 tccccgcc 중 첫 번째 염기가 T, C, A, G의 어느 것이라도 그 활성에는 영향을 미치지 않는다는 것이 재확인되었고, 따라서 8염기가 아닌 7염기, 예컨대 ccccgcc 를 기초로 경도 저온 전사 제어 인핸서를 제작할 수 있다.

상기 경도 저온 전사 제어 인핸서 tccccgcctccccgcctccccgcc(서열번호 1) 대신, ccccgccccccgccccccgcc(서열번호 4)를 이용한 경우에도 마찬가지의 결과가 얻어졌다.

실시예 3

ccccgcc 7염기 서열의 5' 말단으로부터 1번째, 2번째, 3번째 또는 4번째의 1 염기 c를 다른 염기로 변이시켜, 5' 측에 tt를, 3' 측에 g 또는 t를 부가해서 10염기로 한 것을 각각 직렬로 3개 이어 연속시킨 것을 pCAT3 프로모터 벡터(Promega 사)의 멀티 클로닝 사이트에 삽입하였다. 그 후는 실시예 2와 마찬가지로 행하여 이하와 같은 결과를 얻었다. 결과를 표 3에 나타내었다.

1번째, 2번째, 3번째 또는 4번째의 1 염기의 변이체의 저온 전사 촉진(인핸서) 활성

엘레멘트	염기서열	인핸서 활성
야생형	ccccgcc	5.0
변이체 1a	Acccgcc	3.0
변이체 1g	Gcccgcc	1.1
변이체 1t	Tcccgcc	5.1
변이체 2a	cAccgcc	1.3
변이체 2g	cGccgcc	1.0
변이체 2t	cTccgcc	1.1
변이체 3a	ccAcgcc	1.0
변이체 3g	ccGcgcc	1.3
변이체 3t	ccTcgcc	1.2
변이체 4a	cccAgcc	1.2
변이체 4g	cccGgcc	1.2
변이체 4t	cccTgcc	1.1
음성 대조군		1.0

1번째 염기의 T로의 변이체는 야생형과 동등한 저온 전사 촉진 활성을 나타낸다. A로의 변이체는 야생형보다 조금 낮은 저온 전사 촉진 활성을 나타내지만, G로의 변이체는 활성이 낮다. 2번째, 3번째 또는 4번째 염기의 A, G, T로의 변이체는 활성이 낮다.

실시예 4

ccccgcc 염기서열 중 1번째 염기의 T로의 변이에 더해, 1염기의 변이가 존재하는 경우의 저온 전사 촉진 활성을 조사하였다. 즉,

1번째 염기의 T로의 변이에 더해 5번째 염기가 A, C, 또는 T로 변이된 변이체,

1번째 염기의 T로의 변이에 더해 6번째 염기가 A, G, 또는 T로 변이된 변이체, 및

1번째 염기의 T로의 변이에 더해 7번째 염기가 A, G, 또는 T로 변이된 변이체

를 각각 직렬로 3개 포함하는 올리고뉴클레오티드를 실시예 3과 마찬가지로 pCAT3 프로모터 벡터(Promega 사)의 멀티 클로닝 사이트에 삽입하여, 이하와 같은 결과를 얻었다. 결과를 표 4에 나타내었다.

2염기의 변이체의 저온 전사 촉진(인핸서) 활성

엘레멘트	염기서열	인핸서 활성
야생형	ccccgcc	5.0
변이체 1t5a	TcccAcc	2.1
변이체 1t5c	TcccCcc	2.3
변이체 1t5t	TcccTcc	1.6
변이체 1t6a	TcccgAc	2.1
변이체 1t6g	TcccgGc	2.0
변이체 1t6t	TcccgTc	3.1
변이체 1t7a	TcccgcA	2.8
변이체 1t7g	TcccgcG	2.6
변이체 1t7t	TcccgcT	2.6
음성 대조군		1.0

1번째 염기의 T로의 변이에 더해 1염기의 변이가 존재하는 경우, 5번째 염기의 C, A, 또는 T로의 변이, 6번째 염기의 T, A, 또는 G로의 변이, 7번째 염기의 A, G, 또는 T로의 변이는 저온 전사 촉진 활성이 야생형에 비해 낮지만, 유의한 활성이 인정되었다.

실시예 5

이상의 결과로부터, 뉴클레오티드 서열 : xlcccx5x6x7(식 중, x1은 c, t, 또는 a를 나타내고, x5는 g, c, a, 또는 t를 나타내고, x6은 c, t, a, 또는 g를 나타내고, x7은 c, a, g, 또는 t를 나타낸다)은 경도 저온 전사 제어 엘레멘트이고, 이들을 연결한 올리고뉴클레오티드 서열은 인핸서이므로, 이들 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열이라면 저온 전사 촉진 활성을 가진다고 생각할 수 있다. 따라서, 이에 적합한 서열, 또는 적합하지 않은 단일의 서열을 각각 직렬로 3개 포함하는 올리고뉴클레오티드를 실시예 3과 마찬가지로 pCAT3 프로모터 벡터(Promega 사)에 삽입하여, 이하와 같은 결과를 얻었다. 결과를 표 5에 나타내었다.

이상으로 뉴클레오티드 서열 x1cccx5x6x7(식 중, x1은 c 또는 t가 바람직하지만 a이어도 좋고, x5는 g가 바람직하나, c 또는 a, 경우에 따라서는 t이어도 좋고, x6은 c가 바람직하나, t 또는 a, 경우에 따라서는 g이어도 좋고, x7은 c가 바람직하나, t, a, 또는 g 이어도 좋다), 및 이들 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열에 저온 전사 촉진 활성이 인정될 수 있다.

실시예 6

실시예 5의 결과로부터, ccccgcc를 2개 포함하는 뉴클레오티드 서열은 경도 저온 전사 제어 인핸서라 예상된다. 따라서, 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터를 가지는 pcDNA3.1(+) 벡터(Invitrogen 사)(도 2)의 멀티 클로닝 사이트(EcoRV와 XbaI의 사이)에, pGL3-basic 벡터(Promega 사)로부터 잘라낸 반딧불 루시페라제 cDNA를 삽입하고, CMV 프로모터의 5' 측에 ttccccgccg caggacaaac gggtcgggaa cgcggaagtg ggtcagctcc gcctccaaat cagctgtccc cgcctcctag tcgctag(서열번호 3)를 직렬로 2개 삽입하였다.

다음에, 이 플라스미드 5.0㎍/60mm 디쉬를, 인간 세포주 U-2 OS에 트랜스펙션하여, 37℃에서 G418(Invitrogen 사) 존재 하에 3주간 배양하고, 이 플라스미드를 안정하게 염색체에 삽입하여 발현하는 세포 클론(cell clone)을 얻었다. 이 배양 세포를 둘로 나누고, 함께 37℃에서 2일간 배양한 후, 한쪽을 32℃에서, 다른 쪽을 37℃에서 각각 더 배양하였다. 배지는 10% FCS + D-MEM이다. 온도 변경 48시간 후, 원심분리에 의해 세포를 회수하여, 전 세포 용해액을 제조하였다. 각각의 온도에서 생성된 반딧불 루시페라제 활성을, Dual-Luciferase Reporter Assay 킷(Promega 사)을 이용해서 측정하였다. 결과를 표 6에 나타내었다. 활성으로서는, 추출 단백질 당 반딧불 루시페라제 활성을 나타낸다.

염색체에 삽입된 경도 저온 전사 제어 인핸서의 전사 촉진 활성

회수시간	반딧불 루시페라제 활성 (단백질 중량 당)
회수시간	32℃	37℃	32℃/37℃의 비
0시간 후	6500	6500	1
48시간 후	26904	3116	8.63

이 결과는, 저온 전사 제어 인핸서가 세포 염색체에 안정하게 삽입된 상태에서도, 또한 다른 경도 저온 전사 제어 엘레멘트가 다른 뉴클레오티드 서열을 매개로 결합되어 있어도, 32℃에서의 전사를 촉진하고, 단백질 생산량을 늘리는 것을 보여준다.

실시예 7

포유류 세포에서 단백질을 생산하는 경우, 2개의 단백질 유전자를 동시에 1개의 발현벡터에 삽입하는 것도 생각할 수 있다. 이에, 실시예 6에서 사용한 CMV 프로모터에 의해 반딧불 루시페라제를 발현하는 벡터의 저온 전사 제어 인핸서의 5' 상류 측에, 또 다른 CMV 프로모터 1개를 루시페라제 발현과는 역방향(3'으로부터 5' 방향)으로 추가해서, 루시페라제 발현에 대한 영향을 조사하였다. 실시예 6과 마찬가지로, 인간 세포주 U-2 OS에 트랜스펙션해서, 한쪽을 32℃에서, 다른 쪽을 37℃에서 각각 다시 배양하였더니, 역방향의 CMV 프로모터를 5' 상류에 첨가한 것에 따른 발현의 저하는 없고, 오히려 5 ~ 10% 정도 32℃에서의 전사 촉진, 단백질 생산의 증가가 확인되었다. 이로부터, 2개의 단백질을 역방향의 프로모터로 동시에 생산하는 벡터에도 저온 전사 제어 인핸서가 이용될 수 있다고 생각될 수 있다.

실시예 8

겔 쉬프트 에세이

마우스 Balb/3T3 섬유아세포를 10% 소 혈청(CS) 첨가의 D-MEM(Invitrogen 사)에서 37℃에서 24시간 배양하고, 일부를 32℃, 나머지를 37℃에서 다시 8시간 배양한 후, 통상적인 방법(John David Dignani, Russell M. Lebovitz, and Robert G. Roeder, Accurate transcription initiation by RNA polymerase II in a soluble extract from isolated mammalian nuclei. Nucleic Acids Res., 1983; 11: 1475-1489)으로 핵 단백질 추출액을 제조하였다.

올리고뉴클레오티드, 5'-ttccccgccgacggatccag-3'(서열번호 5)를 T4 폴리뉴클레오티드 키나제와 감마-32P-ATP로 표지하고, Sephadex G50 칼럼(Amersham Bioscience 사)으로 정제한 후, 상보 사슬 ctggatccgtcggcggggaa(서열번호 6)과 어닐링시켜 5X105 cpm/ng의 프로브를 얻었다.

이 프로브 0.1 나노그램을 폴리(dI-dC) 0.5 마이크로그램과 함께 핵 단백질 추출액에 혼합해서 20℃에 두었다(이 결합 버퍼의 조성은, 10mM Tris(pH7.5), 100mM NaCl, 2mM EDTA, 10% 글리세롤이다). 30분 경과 후 4% 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 행하고, 겔을 80℃에서 건조시키고, X선 필름을 감광시켜 경도 저온 전사 제어 엘레멘트에 결합하는 단백질과, 경도 저온 전사 제어 인자를 검출하였다(도 3).

본 발명은 단백질의 생산에 널리 이용할 수 있다.

SEQUENCE LISTING <110> FUJITA, Jun <120> SEQUENCE CAPABLE OF ENHANCING THE EXPRESSION OF GENE UNDER MODERATELY LOW TEMPERATURE <130> 666864 <150> JP 2005-256085 <151> 2005-09-05 <150> JP 2005-355117 <151> 2005-12-08 <150> JP 2006-157422 <151> 2006-06-06 <160> 6 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Enhancer <400> 1 tccccgcctc cccgcctccc cgcc 24 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Enhancer <400> 2 ttccccgccg ttccccgccg ttccccgccg 30 <210> 3 <211> 87 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Enhancer <400> 3 ttccccgccg caggacaaac gggtcgggaa cgcggaagtg ggtcagctcc gcctccaaat 60 cagctgtccc cgcctcctag tcgctag 87 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Enhancer <400> 4 ccccgccccc cgccccccgc c 21 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Probe <400> 5 ttccccgccg acggatccag 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Probe <400> 6 ctggatccgt cggcggggaa 20

Claims

뉴클레오티드 서열 :

x 1 c c c x 5 x 6 x 7

(식 중, x 1은 c, t, 또는 a를 나타내고, x 5는 g, c, a, 또는 t를 나타내고, x 6은 c, t, a, 또는 g를 나타내고, x 7은 c, a, g, 또는 t를 나타낸다.), 또는 이 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 경도 저온 전사 제어 엘레멘트.
제1항에 있어서, 뉴클레오티드 서열이 ccccgcc, ccccgca, ccccgcg, ccccgct, ccccgtc, ccccgta, ccccgtg, ccccgtt, ccccgac, ccccgaa, ccccgag, ccccgat, ccccggc, ccccgga, ccccggg, ccccggt, ccccccc, cccccca, ccccccg, cccccct, ccccctc, cccccta, ccccctg, ccccctt, cccccac, cccccaa, cccccag, cccccat, cccccgc, cccccga, cccccgg, cccccgt, ccccacc, ccccaca, ccccacg, ccccact, ccccatc, ccccata, ccccatg, ccccatt, ccccaac, ccccaaa, ccccaag, ccccaat, ccccagc, ccccaga, ccccagg, ccccagt, cccctac, cccctcc, tcccgcc, tcccgca, tcccgcg, tcccgct, tcccgtc, tcccgta, tcccgtg, tcccgtt, tcccgac, tcccgaa, tcccgag, tcccgat, tcccggc, tcccgga, tcccggg, tcccccc, tccccca, tcccccg, tccccct, tcccctc, tccccta, tcccctg, tcccctt, tccccac, tccccaa, tccccag, tccccat, tccccgc, tcccacc, tcccaca, tcccacg, tcccact, tcccatc, tcccata, tcccatg, tcccatt, tcccaac, tcccaaa, tcccaag, tcccaat, tcccagc, tcccaga, tccctcc, acccgcc, acccgca, acccgcg, acccgct, acccgtc, acccgta, acccgtg, acccgtt, acccgac, acccgaa, acccgag, acccgat, acccggc, acccgga, acccggg, acccggt, acccccc, accccca, acccccg, accccct, acccctc, accccta, acccctg, acccctt, accccac, accccaa, accccga, acccacc, acccaca, acccacg, acccact, acccatc, acccata, acccatg, acccatt, acccaac, acccaaa, acccaag, acccaat, gcccccc, ggcgggg, agcgggg, gacgggg, ttcgggg, ggggggg, ggcggga, tgcggga, gacggga, tggggga, 및 ggcgggt로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 경도 저온 전사 제어 엘레멘트.
동일 또는 상이한, 제1항에 기재된 경도 저온 전사 제어 엘레멘트가 연결되어 있는 경도 저온 전사 제어 인핸서(단, 경도 저온 전사 제어 엘레멘트로서, t의 3' 측에 계속되는 뉴클레오티드 서열 : ccccgcc, ccccgtc, ccccgct, 또는 ccccgaa; g의 3' 측에 계속되는 뉴클레오티드 서열 : ccccgcc; a의 3' 측에 계속되는 뉴클레오티드 서열 ccccgcc, 3' 말단의 a에 선행하는 ggcgggg, 또는 ggggggg 만을 포함하는 것을 제외함).
동일 또는 상이한, 제1항에 기재된 경도 저온 전사 제어 엘레멘트가 다른 뉴클레오티드 잔기를 매개로 결합되어 있는 경도 저온 전사 제어 인핸서(단, 경도 저온 전사 제어 엘레멘트로서, t의 3' 측에 계속되는 뉴클레오티드 서열 : ccccgcc, ccccgtc, ccccgct, 또는 ccccgaa; g의 3' 측에 계속되는 뉴클레오티드 서열 : ccccgcc; a의 3' 측에 계속되는 뉴클레오티드 서열 ccccgcc, 3' 말단의 a에 선행하는 ggcgggg, 또는 ggggggg 만을 포함하는 것을 제외함).
제4항에 있어서, 뉴클레오티드 서열 :

ttccccgccg caggacaaac gggtcgggaa cgcggaagtg ggtcagctcc gcctccaaat cagctgtccc cgcctcctag tcgctag (서열번호 3)를 가지는 것을 특징으로 하는 경도 저온 전사 제어 인핸서.
제1항 또는 제2항 중 어느 하나에 기재된 경도 저온 전사 제어 엘레멘트, 또는 제3항 내지 제5항 중 어느 하나에 기재된 경도 저온 전사 제어 인핸서를 포함하는 벡터.
제6항에 기재된 벡터에 의해 형질전환된 진핵생물 세포.
제6항에 기재된 벡터에 의해 형질전환된 진핵생물.
경도 저온 전사 제어 인자 및 그 제어 물질의 에세이 방법으로서, 제1항 또는 제2항에 기재된 경도 저온 전사 제어 엘레멘트를 포함하는 2중 사슬 DNA 프로브와 에세이 대상의 단백질 용액을 접촉시켜, 특이적으로 경도 저온 전사 제어 엘레 멘트에 결합된 경도 저온 전사 제어 인자의 양을, 결합되어 있는 2중 사슬 DNA 프로브를 검출함으로써 측정하는 것을 포함하는 방법.
경도 저온 전사 제어 인자의 정제 방법으로서, 제1항 또는 제2항에 기재된 경도 저온 전사 제어 엘레멘트를 포함하는 2중 사슬 DNA 프로브와 단백질 용액을 접촉시켜, 특이적으로 경도 저온 전사 제어 엘레멘트에 결합된 경도 저온 전사 제어 인자를 얻고, 그 후 경도 저온 전사 제어 인자를 단리하는 것을 포함하는 방법.