JP6065263B2 - プロドラッグ化合物、オリゴヌクレオチド型プロドラッグ化合物の合成用試薬、及びオリゴヌクレオチド型プロドラッグ化合物の製造方法 - Google Patents
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Description
5’−位に結合されたモノ又はポリリン酸基のOH基の少なくとも一部が下記一般式(3)に示す基で保護されたリボヌクレオチド若しくはデオキシリボヌクレオチド、又は、
5’−位に結合されたモノ又はポリリン酸基のOH基の少なくとも一部がSH基に置換され、かつ上記OH基及び上記SH基の少なくとも一部が下記一般式(3)に示す基で保護された、リボヌクレオチドのホスホロチオエート型アナログ若しくはデオキシリボヌクレオチドのホスホロチオエート型アナログ、からなるプロドラッグ化合物である。
本発明のプロドラッグ化合物は、所定の保護基でリン酸基のOH基が保護されたオリゴヌクレオチド又はリボヌクレオチド若しくはデオキシリボヌクレオチド、及びこれらのホスホロチオエートアナログにあっては上記の保護基でSH基が保護されたものであり、細胞内でエステラーゼ等の酵素の作用を受けることにより保護基が脱離し、DNA又はRNAの合成を阻害する、mRNAと結合してタンパク質合成を阻害する、等の作用を発現する。なお、リボ(又はデオキシリボ)ヌクレオシドの5’−位にモノリン酸基が結合したものをリボ(又はデオキシリボ)ヌクレオチドと呼ぶのが一般的だが、本発明では、便宜上、リボ(又はデオキシリボ)ヌクレオシドの5’−位にポリリン酸が結合したものも含めてリボ(又はデオキシリボ)ヌクレオチドと呼ぶ。また、本明細書では、特に断りのない限り、リボヌクレオシド及びデオキシヌクレオシドをまとめてヌクレオシドとも呼び、リボヌクレオチド及びデオキシリボヌクレオチドをまとめてヌクレオチドとも呼ぶ。さらに、ヌクレオシド及びヌクレオチドは、天然のものであってもよいし、リボース環若しくはデオキシリボース環及び/又は核酸塩基に化学修飾を受けたものであってもよい。化学修飾を受けたヌクレオシド及びヌクレオチド並びにこれらからなるオリゴヌクレオチドを用いることにより、上記の阻害作用をより増大させることもできる。
本発明のプロドラッグ化合物として、まずは、オリゴヌクレオチドを説明する。このオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチドとヌクレオチドとを結合させるリン酸基の一部又は全部が下記一般式(1)又は(2)に示すリン酸トリエステル構造になっていることを特徴とする。下記一般式(1)又は(2)に示す部分構造は、Zが酸素原子であればオリゴヌクレオチドを由来とするものであり、Zが硫黄原子であればオリゴヌクレオチドのホスホロチオエートアナログを由来とするものである。なお、Zが硫黄原子である場合には、正確にはリン酸エステルでなくリン酸チオエステルとなるが、本明細書ではそのようなリン酸チオエステルも含めてリン酸エステルと呼ぶ。オリゴヌクレオチドはリン酸ジエステル結合により複数のヌクレオチドがオリゴマーを形成してなるものであり、リン酸ジエステル結合を形成しているリン酸基にはフリー(エステル結合をしていない)のOH基(P−OH基)が存在する。そのため、オリゴヌクレオチドは、複数のP−OH基を持ち、特に生体内ではこのP−OH基がP−O−に解離することにより高い極性を備えており、脂質である細胞膜を通過して細胞内に入ることができない。そこで、本発明では、オリゴヌクレオチドに含まれるリン酸基の一部又は全部について、P−OH基に保護基を導入して、下記(1)又は(2)で表されるリン酸トリエステル構造とすることによりオリゴヌクレオチドの脂溶性を高めている。なお、上記のように、P−OH基は生体内で解離してP−O−となるが、解離前及び解離後の化学種は互いに平衡関係にあるものであり、本発明の作用を考える上で両者を別の化学種として区別して扱うことに意味は無い。そこで、本明細書では、リン酸基の解離前及び解離後の化学種を含む概念としてP−OH基の用語を用いる。なお、Zが硫黄原子であるホスホロチオエートアナログについては、P−OH基に代えてP−SH基が存在する点を除いて、上記と同様に説明できる。
本発明のプロドラッグ化合物として、次に、ヌクレオチドを説明する。このヌクレオチドは、5’−位に結合されたモノ又はポリリン酸基のOH基の少なくとも一部が下記一般式(3)又は(4)に示す基で保護されていることを特徴とする。モノ又はポリリン酸基のOH基(P−OH基)は、生体内ではP−O−に解離することにより高い極性を備えた化合物となっており、脂質である細胞膜を通過して細胞内に入ることができない。そこで、本発明では、ヌクレオチドに含まれるP−OH基の一部又は全部に下記一般式(3)又は(4)で示す保護基を導入し、リン酸エステルとすることでヌクレオチドの脂溶性を高めている。
オリゴヌクレオチド型プロドラッグ化合物の合成試薬(以下、「本発明の合成試薬」又は「合成試薬」とも呼ぶ。)も本発明の一つである。本発明の合成試薬は、上述のオリゴヌクレオチドからなるプロドラッグ化合物の製造に用いられ、下記一般式(5)又は(6)で表す構造を備えた化合物である。
オリゴヌクレオチド型プロドラッグ化合物の製造方法(以下、「本発明の製造方法」とも呼ぶ。)も本発明の一つである。本発明の製造方法は、上述の合成用試薬を用いてプロドラッグ化合物であるオリゴヌクレオチドを製造するものであり、下記一般式(5)又は(6)で示す構造を備えた化合物を用いてホスホアミダイド法によるオリゴヌクレオチドの伸長を行う工程を含む、ホスホチオエート型アナログであってもよいオリゴヌクレオチド型プロドラッグ化合物の製造方法である。
・3’−O−{ビス(N,N,N’,N’−ジイソプロピルアミノ)ホスフィニル}−5’−O−(4,4’−ジメトキシトリチル)チミジン(7)の合成
化合物(7)の各物性値は、以下の通りである。
1H NMR(500MHz、CDCl3)δ(ppm):1.08−1.24(m,24H,イソプロピル基のCH3),1.44(s,3H,5−CH3),2.25−2.59(m,2H,2’,2’’−H),3.37−3.55(m,6H,5’,5’’−H,イソプロピル基のCH),3.77(s,6H,Ar−OCH3),4.07(s,1H,4−H),4.49−4.66(m,1H,3’−H),6.48(dd,1H,J=5.75Hz,1’−H),6.82−6.84(t,4H,J=4.50Hz,Ar−H),7.21−7.68(m,9H,Ar−H),7.68(s,1H,6−H)
31P NMR(202MHz,CDCl3)δ(ppm):116.5
化合物(9A)の各物性値は、以下の通りである。
1H NMR(500MHz、CDCl3)δ(ppm):0.99−1.13(m,15H,イソプロピル基のCH3,アシルγCH2),1.36−1.37(d,6H,CH3×2,J=1.1Hz),1.76−1.78(m,2H,アシルβCH2),1.99−2.02(d,3H,Ar−CH3,J=10.3Hz),2.46−2.52(m,7H,2’−H,2”−H,Ar−CH3,アシルαCH2),3.28−3.53(m,4H,5’−H,5”−H,−CH2−),3.79(s,6H,Ar−OCH3),4.12−4.16(s,1H,4’−H),4.60(s,1H,3’−H),6.39−6.42(t,1H,1’−H,J=7.0Hz),6.80−7.23(m,15H,DMTr,Ar−H,Ar−H),7.60−7.64(d,1H,6−H,J=18.3Hz),7.99(s,1H,3−NH)
化合物(13)の各物性値は、以下の通りである。
1H NMR(500MHz、CDCl3)δ(ppm):0.99−1.03(m,3H,アシルγCH2),1.25−1.36(m,6H,5−CH3×2),1.33−1.47(m,6H,CH3×2),1.74(m,2H,アシルβCH2),1.86−2.13(m,8H,OAc,−CH2−,Ar−CH3),2.30−2.39(m,2H,2’−H,2”−H),2.46−2.54(m,5H,アシルαCH2,Ar−CH3),3.33−3.50(m,2H,5’−H,5”−H)3.79(s,6H,Ar−OCH3),3.84−3.90(m,2H,−CH2−),4.10−4.14(q,2H,4’−H×2,J=7.2Hz),4.19−4.24(m,2H,3’−H×2),6.28−6.32(m,1H,1’−H),6.39−6.45(m,1H,1’−H),6.86−6.88(m,1H,Ar−H),6.91−6.93(m,1H,Ar−H),6,82−6.84,7.24−7.40(m,13H,DMTr),7.53−7.55(d,1H,6−H,J=10.7Hz),8.70(s,1H,3−NH),8.60−8.82(s,1H,3−NH)
なお、HPLC分析の条件は、逆相シリカゲル(ジーエルサイエンス株式会社製、Intersil ODS−3)を担体とし、下記の展開溶媒A及び展開溶媒Bの割合を変えながら混合することで、アセトニトリルの濃度を下記のように変化させた。
展開溶媒A:100mMトリエチルアンモニウムアセテート緩衝液中に5質量%のアセトニトリルを混合
展開溶媒B:アセトニトリル100%
アセトニトリル濃度の変化パターン:10%→38%(10分)→75%(10分)
・化合物(9B)の合成
・4,4,5,8−テトラメチル−3,4−ジヒドロクマリン(21)の合成
化合物(21)の各物性値は、以下の通りである。
1H NMR(500MHz、DMSO−d6)δ(ppm):1.34(s,6H,β−(CH3)2),2.15(s,3H,5−CH3),2.41(s,3H,2−CH3),2.66(s,2H,α−CH2),6.82−6.83(d,1H,J=7.5Hz,H−3),7.00−7.01(d,1H,J=7.5Hz,H−4)
化合物(22)の各物性値は、以下の通りである。
1H NMR(500MHz、DMSO−d6)δ(ppm):1.48(s,6H,−C(CH3)2),2.07−2.09(t,2H,J=4.0Hz,―CH2−),2.01(s,3H,5−CH3),2.38(s,3H,2−CH3),3.20−3.22(t,2H,J=6.5Hz,−CH2−),4.14(s,1H,OH),6.43−6.45(d,1H,J=8.0Hz,H−4),6.74−6.75(d,1H,J=8.0Hz,H−3),7.81(s,1H,1−OH)
化合物(23)の各物性値は、以下の通りである。
1H NMR(500MHz、DMSO−d6)δ(ppm):0.00(s,6H,Si(CH3)2),0.88(s,9H,t−Bu),1.57(s,6H,−C(CH3)2),2.18(s,3H,5−CH3),2.21−2.24(t,2H,J=7.5Hz,−CH2−),2.47(s,3H,2−CH3),3.46−3.49(t,2H,J=7.5Hz,−CH2−),6.51−6.53(d,1H,J=7.5Hz,H−4),6.82−6.84(d,1H,J=8.0Hz,H−3),7.91(s,1H,1−OH)
化合物(24)の各物性値は、以下の通りである。
1H NMR(500MHz、DMSO−d6)δ(ppm):0.00(s,6H,Si(CH3)2),0.87(s,9H,t−Bu),1.04−1.05(t,3H,J=6.0Hz,γ−CH3),1.46−1.52(s,6H,−C(CH3)2),1.69−1.77(m,2H,β−CH2),2.02(s,3H,5−CH3),1.89−2.17(m,2H,α−CH2),2.16(s,3H,2−CH3),2.54−2.68(m,2H,−CH2O−),3.46−3.47(m,2H,−CH2−),6.97−6.99(d,1H,J=8.0Hz,H−4),7.04−7.06(d,1H,J=8.0Hz,H−3)
化合物(8A)の各物性値は、以下の通りである。
1H NMR(500MHz、DMSO−d6)δ(ppm):0.97−0.99(m,3H,γ−CH3),1.39−1.44(s,6H,−C(CH3)2),1.64−1.69(m,2H,β−CH2),1.80−1.96(m,2H,CH2O),1.99(s,3H,5−CH3),2.49(s,3H,2−CH3),2.50−2.64(m,2H,α−CH2),3.21−3.34(m,2H,−CH2−),4.24−4.26(t,1H,J=5.0Hz,OH),6.91−6.93(d,1H,J=7.5Hz,H−4),6.98−7.00(d,1H,J=7.5Hz,H−3)
・1−O−(tert−ブチルジメチルシリル)−3−(2’−アセチル−3’,6’−ジメチルフェニル)−3,3−ジメチルプロパノール(25)の合成
化合物(25)の各物性値は、以下の通りである。
1H NMR(500MHz、DMSO−d6)δ(ppm):0.00(s,6H,Si(CH3)2),0.87(s、9H,t−Bu),1.42−1.57(s,6H,−C(CH3)2),1.92−2.15(m,2H,CH2O),2.03(s,3H,5−CH3),2.34(s,3H,AcO),2.54(s,3H,2−CH3),3.46(m,2H,−CH2−),6.98−6.99(d,1H,J=6.0Hz,H−4),7.05−7.06(d,1H,J=6.0Hz,H−3)
化合物(8B)の各物性値は、以下の通りである。
1H NMR(500MHz、DMSO−d6)δ(ppm):1.41−1.44(s,6H,−C(CH3)2),1.87−2.00(m,2H,CH2O),1.98(s,3H,5−CH3),2.29(s,3H,AcO),2.51(s,3H,2−CH3),3.22(m,2H,−CH2−),4.24(t,1H,J=6.0Hz,OH),6.92−6.93(d,1H,J=6.0Hz,H−4),6.99−7.00(d,1H,J=6.0Hz,H−3)
Claims (4)
- ヌクレオチドとヌクレオチドとを結合させるリン酸基の一部又は全部が下記一般式(1)に示すリン酸トリエステル構造であるオリゴヌクレオチド、
5’−位に結合されたモノ又はポリリン酸基のOH基の少なくとも一部が下記一般式(3)に示す基で保護されたリボヌクレオチド若しくはデオキシリボヌクレオチド、又は、
5’−位に結合されたモノ又はポリリン酸基のOH基の少なくとも一部がSH基に置換され、かつ前記OH基及び前記SH基の少なくとも一部が下記一般式(3)に示す基で保護された、リボヌクレオチドのホスホロチオエート型アナログ若しくはデオキシリボヌクレオチドのホスホロチオエート型アナログ、からなるプロドラッグ化合物。
- 前記一般式(1)又は(3)におけるR2、R3及びR4がそれぞれメチル基である請求項1記載のプロドラッグ化合物。
- 下記一般式(5)で表す構造を備えた化合物からなる、ホスホロチオエート型アナログであってもよいオリゴヌクレオチド型プロドラッグ化合物の合成用試薬。
- 下記一般式(5)で示す構造を備えた化合物を用いてホスホアミダイド法によるオリゴヌクレオチドの伸長を行う工程を含む、ホスホチオエート型アナログであってもよいオリゴヌクレオチド型プロドラッグ化合物の製造方法。
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