CN116568696A - 二硫代磷酸酯寡核苷酸的新颖合成 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了如所定义的式(I)化合物用于制备包含至少一个二硫代磷酸酯核苷间键的寡核苷酸的用途。提供了使用式(I)化合物的多种合成方法5。
Description
背景技术
近几十年来，合成寡核苷酸作为治疗剂的用途已经取得了显著进展，从而使通过多种机制起作用的分子得到开发，包括RNA酶H活化gapmer、剪接转换寡核苷酸、微RNA抑制剂、siRNA或适体(S.T.Crooke,Antisense drug technology:principles,strategies,andapplications,第2版,编者Boca Raton,FL:CRC Press,2008)。然而，对于生物系统中的溶核降解，寡核苷酸本来就是不稳定的。此外，它们表现出非常不利的药代动力学行为。
为了改善这些缺点，近几十年来已经研究了各种各样的化学修饰。可论证地，最成功的修饰之一是引入硫代磷酸酯键(phosphorothioate linkage)，其中非桥接的磷酸氧原子中的一个被硫原子替换(F.Eckstein,Antisense and Nucleic Acid Drug Development2009,10,117-121)。与未修饰的磷酸二酯类似物相比，这种硫代磷酸酯寡脱氧核苷酸表现出增加的蛋白质结合以及明显更高的核溶降解稳定性，因此在血浆、组织和细胞中的半衰期显著更高。这些关键特征已经使得开发了第一代寡核苷酸疗法，并通过比如锁核酸(LNA)等后代修饰为寡核苷酸疗法的进一步发展打开了大门。
然而，用硫代磷酸酯取代磷酸二酯键会在磷原子上产生手性中心。因此，所有经批准的硫代磷酸酯寡核苷酸疗法都被用作大量非对映异构化合物的混合物，所有所述非对映异构化合物都可能具有不同的(并且可能相反的)物理化学性质和药理学性质。
已经报道了使用H-硫代膦酸酯的二硫代磷酸酯的几种寡聚物合成，例如Kamaike等人Tetrahedron 2006,62,11814；Kamaike等人Tetrahedron Lett.2004,45,5803；Kamaike等人Nucleic Acids Symp Ser.2003,3,93；Seeberger等人Tetrahedron 1999,55,5759；Zain等人Nucleosides,Nucleotides and Nucleic Acids,1997,16,1661和Greef等人Tetrahedron Lett.1996,37,4451。
发明人已经惊奇地发现，包含至少一个二硫代磷酸酯核苷间键的寡核苷酸的经过改进的制备可以使用H-硫代膦酸酯(在硫代磷酸酯键处包含P-H部分)来实现。该制备特别适合在固体支持物上合成，并且可以容易地与标准寡核苷酸合成(例如，从氰基乙基保护的亚酰胺)组合。另外，可以减少杂质(尤其是硫代磷酸酯杂质)的形成。
发明内容
本发明涉及式(I)化合物：
用于制备包含至少一个二硫代磷酸酯核苷间键的寡核苷酸的用途，其中PG为羟基保护基，Bn为核碱基，所述核碱基可以是天然或非天然的，并且其中核糖n在其环的2'位置处被修饰。
本发明还涉及一种用于制备含有至少一个二硫代磷酸酯核苷间键的寡核苷酸的方法，所述方法包括以下步骤：
a)将式(I)化合物：
其中在式(I)中，PG为羟基保护基，Bn为核碱基，所述核碱基可以是天然或非天然的，并且其中核糖n在其环的2'位置处被修饰，
与式(II)化合物：
其中在式(II)中，B(n-1)为核碱基，所述核碱基可以是天然或非天然的，并且其中核糖(n-1)可以在其环的2'位置处未被修饰或被修饰，
在偶联剂存在下偶联，以获得式(III)化合物：
本发明还涉及一种硫代膦酸酯单酯，其选自由以下项组成的组：
其中PG'为氨基保护基并且R5为H或羟基保护基。
本发明进一步涉及一种硫代膦酸酯单酯盐，其选自由以下项组成的组：
其中PG'为氨基保护基，M+为单价阳离子，并且R5为H或羟基保护基。
附图说明
图1示出了在偶联序列中可以如何使用H-硫代膦酸酯。
图2示出了使用式(I)化合物的在每次偶联后进行硫化(硫代烷基化)的寡聚物合成
图3示出了使用具有最终硫化的式(I)化合物的寡聚物合成
图4示出了H-硫代膦酸酯在固体支持物上偶联的特定实例。
定义
在本说明书中，术语“烷基”在单独或组合下指具有1至8个碳原子的直链或支链烷基、特别是具有1至6个碳原子的直链或支链烷基并且更特别是具有1至4个碳原子的直链或支链烷基。直链和支链C1-C8烷基的实例是甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、异构戊基、异构己基、异构庚基和异构辛基，特别是甲基、乙基、丙基、丁基和戊基。烷基的特定实例是甲基、乙基和丙基。
术语“环烷基”在单独或组合下指具有3至8个碳原子的环烷基环、特别是具有3至6个碳原子的环烷基环。环烷基的实例是环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基和环辛基，更特别是环丙基和环丁基。“环烷基”的一个特定实例是环丙基。
术语“烷氧基”单独或结合表示式烷基-O-的基团，其中术语“烷基”具有先前给出的含义，诸如甲氧基，乙氧基，正丙氧基，异丙氧基，正丁氧基，异丁氧基，仲丁氧基和叔丁氧基。特定的“烷氧基”是甲氧基和乙氧基。甲氧基乙氧基是“烷氧基烷氧基”的一个特定实例。
术语“氧基”在单独或组合下指-O-基团。
术语“链烯基”在单独或组合下指包含烯键和多达8个、优选地多达6个、特别优选多达4个碳原子的直链或支链烃残基。链烯基的实例是乙烯基、1-丙烯基、2-丙烯基、异丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、3-丁烯基和异丁烯基。
术语“炔基”在单独或组合下指包含叁键和多达8个、特别是2个碳原子的直链或支链烃残基。
术语“卤素”或“卤代”在单独或组合下指氟、氯、溴或碘并且特别地指氟、氯或溴，更特别地指氟。术语“卤代”与另一种基团组合，指经至少一个卤素取代、尤其经一个至五个卤素、特别地一个至四个卤素(即一个、两个、三个或四个卤素)取代的所述基团。
术语“卤代烷基”在单独或组合下指经至少一个卤素取代、尤其经一个至五个卤素、特别地一个至三个卤素取代的烷基。卤代烷基的实例包括单氟、二氟或三氟代的甲基、乙基或丙基，例如3,3,3-三氟丙基、2-氟乙基、2,2,2-三氟乙基、氟代甲基或三氟甲基。氟代甲基、二氟甲基和三氟甲基是特定的“卤代烷基”。
术语“卤代环烷基”在单独或组合下指经至少一个卤素取代、尤其经一个至五个卤素、特别地一个至三个卤素取代的如上定义的环烷基。“卤代环烷基”的特定实例是卤代环丙基，尤其是氟代环丙基、二氟环丙基和三氟环丙基。
术语“羟基”(hydroxyl/hydroxy)在单独或组合下指-OH基团。
术语“氢硫基”和“巯基”在单独或组合下指-SH基团。
术语“羰基”在单独或组合下指-C(O)-基团。
术语“羧基”或“酸性基”在单独或组合下指-COOH基团。
术语“氨基”在单独或组合下指伯氨基(-NH2)、仲氨基(-NH-)或叔氨基(-N-)。
术语“烷基氨基”在单独或组合下指经一个或两个如上文定义的烷基取代的如上文定义的氨基。
术语“磺酰基”在单独或组合下意指-SO2基团。
术语“亚磺酰基”在单独或组合下指-SO-基团。
术语“硫基”在单独或组合下指-S-基团。
术语“氰基”在单独或组合下指-CN基团。
术语“叠氮基”在单独或组合下指-N3基团。
术语“硝基”在单独或组合下指NO2基团。
术语“甲酰基”在单独或组合下指-C(O)H基团。
术语“氨基甲酰基”、单独或组合下，表示-C(O)NH2基团。
术语“脲基”、单独或组合下，表示-NH-C(O)-NH2基团。
术语“芳基”在单独或组合下指包含6至10个碳环原子的单价芳族碳环单环系统或双环系统，所述系统任选地经1至3个独立地选自以下的取代基取代：卤素、羟基、烷基、链烯基、炔基、烷氧基、烷氧基烷基、链烯氧基、羧基、烷氧基羰基、烷基羰基和甲酰基。芳基的实例包括苯基和萘基，特别是苯基。
术语“杂芳基”、单独或组合下，表示具有5至12个环原子的单价芳族杂环单环或双环系统，包含1、2、3或4个选自N、O和S的杂原子，其余环原子是碳，任选地经1至3个独立地选自卤素、羟基、烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷氧基烷基、烯氧基、羧基、烷氧基羰基、烷基羰基和甲酰基的取代基取代。杂芳基的实例包括吡咯基、呋喃基、噻吩基、咪唑基、噁唑基、噻唑基、三唑基、噁二唑基、噻二唑基、四唑基、吡啶基、吡嗪基、吡唑基、哒嗪基、嘧啶基、三嗪基、氮杂基(azepinyl)、二氮杂/>基(diazepinyl)、异噁唑基、苯并呋喃基、异噻唑基、苯并噻吩基、吲哚基、异吲哚基、异苯并呋喃基、苯并咪唑基、苯并噁唑基、苯并异噁唑基、苯并噻唑基、苯并异噻唑基、苯并噁二唑基、苯并噻二唑基、苯并三唑基、嘌呤基、喹啉基、异喹啉基、喹唑啉基、喹噁啉基、咔唑基或吖啶基。
术语“杂环基”在单独或组合下指4至12个、特别是4至9个环原子的单价饱和或部分不饱和的单环或双环系统，包含1个、2个、3个或4个选自N、O和S的杂原子，其余环原子是碳，任选地经1至3个独立地选自以下项的取代基取代：卤素、羟基、烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷氧基烷基、烯氧基、羧基、烷氧基羰基、烷基羰基和甲酰基。单环饱和杂环基的实例是氮杂环丁烷基、吡咯烷基、四氢呋喃基、四氢-噻吩基、吡唑烷基、咪唑烷基、噁唑啉基、异噁唑烷基、噻唑烷基、哌啶基、四氢吡喃基、四氢噻喃基、哌嗪基、吗啉基、硫代吗啉基、1,1-二氧代-硫代吗啉-4-基、氮杂环庚烷基、二氮杂环庚烷基、高哌嗪基或氧氮杂环庚烷基。双环饱和杂环烷基的实例是8-氮杂-双环[3.2.1]辛基、奎宁环基、8-氧杂-3-氮杂-双环[3.2.1]辛基、9-氮杂-双环[3.3.1]壬基、3-氧杂-9-氮杂-双环[3.3.1]壬基或3-噻-9-氮杂-双环[3.3.1]壬基。部分不饱和杂环烷基的实例是二氢呋喃基、咪唑啉基、二氢噁唑基、四氢吡啶基或二氢吡喃基。
术语“药用盐”是指那些保留游离碱或游离酸的生物学有效性和特性的盐，其并非在生物学上或其它方面所不希望的。这些盐用无机酸诸如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸(特别是盐酸)和有机酸诸如乙酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、马来酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸、N-乙酰基半胱氨酸形成。此外，这些盐可以通过向游离酸添加无机碱或有机碱制备。衍生自无机碱的盐包括但不限于钠盐、钾盐、锂盐、铵盐、钙盐、镁盐。衍生自有机碱的盐包括但不限于与下述有机碱形成的盐：伯胺、仲胺和叔胺，取代胺包括天然出现的取代胺、环状胺和碱性离子交换树脂，诸如异丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、乙醇胺、赖氨酸、精氨酸、N-乙基哌啶、哌啶、聚胺树脂。本发明的寡核苷酸也可以呈两性离子的形式存在。特别优选的本发明的药用盐是钠盐、锂盐、钾盐和三烷基铵盐。
单独或组合使用的术语“保护基”表示选择性地封闭多官能化合物中反应位点，从而可以在另一个未保护的反应位点选择性地进行化学反应的基团。保护基可以去除。示例性保护基为氨基保护基、羧基保护基或羟基保护基。
“磷酸酯保护基”是磷酸酯基团的保护基。磷酸酯保护基的实例是2-氰基乙基和甲基。磷酸酯保护基的一个特定实例是2-氰基乙基。
“羟基保护基”是羟基的保护基并且还用来保护硫醇基。羟基保护基的实例是乙酰基(Ac)、苯甲酰基(Bz)、苄基(Bn)、β-甲氧基乙氧基甲基醚(MEM)、二甲氧基三苯甲基(或双-(4-甲氧基苯基)苯基甲基)(DMT)、三甲氧基三苯甲基(或三-(4-甲氧基苯基)苯基甲基)(TMT)、甲氧基甲基醚(MOM)、甲氧基三苯甲基[(4-甲氧基苯基)二苯基甲基(MMT)、对甲氧基苄基醚(PMB)、甲硫基甲基醚、新戊酰(Piv)、四氢吡喃基(THP)、四氢呋喃(THF)、三苯甲基或三苯基甲基(Tr)、甲硅烷基醚(例如三甲基甲硅烷基(TMS)、叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)、三异丙基甲硅烷基氧基甲基(TOM)和三异丙基甲硅烷基(TIPS)醚)、甲基醚和乙氧基乙基醚(EE)。羟基保护基的特定实例是DMT和TMT，尤其是DMT。
“氢硫基保护基”是氢硫基基团的保护基。氢硫基保护基的实例是“羟基保护基”的那些基团。
如果本发明的起始材料或化合物之一含有一个或多个在一个或多个反应步骤的反应条件下不稳定或有反应性的官能团，则可在应用本领域公知方法的关键步骤之前引入适当的保护基(如例如在T.W.Greene和P.G.M.Wuts,第3版,1999,Wiley,New York的“Protective Groups in Organic Chemistry”中所述)。可以使用文献中描述的标准方法，在合成的晚期移除这类保护基。保护基的实例是叔丁氧基羰基(Boc)、9-芴基甲基氨基甲酸酯(Fmoc)、2-三甲基甲硅烷基乙基氨基甲酸酯(Teoc)、苄氧基羰基(Cbz)和对甲氧基苄氧羰基(Moz)。
可用于杂环碱基的标准氨基保护基包括苯甲酰基、乙酰基、二甲基甲酰胺基、异丁酰基、苯氧基乙酰基和异丙基苯氧基乙酰基。
本文所述的化合物可以包含几个非对称中心，并且可以以光学纯的对映体、对映体的混合物例如外消旋体、非对映异构体的混合物、非对映异构外消旋体或非对映异构外消旋体混合物的形式存在。
寡核苷酸
如本文所用，术语“寡核苷酸”如本领域技术人员通常理解的那样被定义为包含两个或更多个共价连接的核苷的分子。此类共价结合的核苷也可被称为核酸分子或寡聚物。寡核苷酸通常在实验室中通过固相化学合成然后纯化的方式制备。当提及寡核苷酸的序列时，提及的是共价联接的核苷酸或核苷的核碱基部分或其修饰的序列或顺序。本发明的寡核苷酸是人造的，并且是化学合成的，并且通常是纯化或分离的。本发明的寡核苷酸可包含一个或多个经修饰的核苷或核苷酸。
反义寡核苷酸
如本文所用，术语“反义寡核苷酸”定义为能够通过与靶核酸，特别是与靶核酸上的邻接序列杂交来调节靶基因的表达的寡核苷酸。反义寡核苷酸基本上不为双链的，因此不为siRNA或shRNA。优选地，本发明的反义寡核苷酸为单链的。应理解的是，只要序列内或序列间自身互补的程度低于跨寡核苷酸全长的50％，本发明的单链寡核苷酸便可形成发夹或分子间双链体结构(同一寡核苷酸的两个分子之间的双链体)。
连续核苷酸序列
术语“连续核苷酸序列”是指寡核苷酸的与靶核酸互补(诸如完全互补)的区域。该术语在本文中与术语“连续核碱基序列”和术语“寡核苷酸基序序列”可互换使用。在一些实施例中，寡核苷酸的所有核苷酸构成连续核苷酸序列。在一些实施例中，寡核苷酸包含连续核苷酸序列，诸如F-G-F'gapmer区域，并且可以任选地包含其他核苷酸，例如可以用于将官能团连接到连续核苷酸序列的核苷酸接头区域，例如区域D或D'。核苷酸接头区域可与靶核酸互补或不互补。本文提及的反义寡核苷酸混聚物可包含连续核苷酸序列或可由连续核苷酸序列组成。
核苷酸
核苷酸是寡核苷酸和多核苷酸的结构单元，并且出于本发明的目的，包括天然存在的和非天然存在的核苷酸。在自然界中，核苷酸，诸如DNA和RNA核苷酸包含核糖糖部分、核碱基部分和一个或多个磷酸酯基团(其不存在于核苷中)。核苷和核苷酸也可以可互换地称为“单元”或“单体”。
修饰的核苷
如本文所用，术语“修饰的核苷”或“核苷修饰”是指与等同的DNA或RNA核苷相比，通过引入糖部分或(核)碱基部分的一种或多种修饰而被修饰的核苷。在一个优选的实施例中，修饰的核苷包含修饰的糖部分。术语修饰的核苷在本文中还可与术语“核苷类似物”或修饰的“单元”或修饰的“单体”互换使用。具有未修饰的DNA或RNA糖部分的核苷在本文中被称为DNA或RNA核苷。在DNA或RNA核苷的碱基区域中具有修饰的核苷如果允许沃森克里克(Watson Crick)碱基配对，则通常仍称为DNA或RNA。
修饰的核苷间键
如技术人员通常所理解的，术语“修饰的核苷间键”定义为除磷酸二酯(PO)键以外的键，其将两个核苷共价偶联在一起。因此，本发明的寡核苷酸可包含修饰的核苷间键。在一些实施例中，与磷酸二酯键相比，经修饰的核苷间键增加了寡核苷酸的核酸酶抗性。对于天然存在的寡核苷酸，核苷间键包括在相邻核苷之间产生磷酸二酯键(phosphodiesterbond)的磷酸酯基团。修饰的核苷间键特别可用于稳定寡核苷酸供体内使用，并且可以在本发明寡核苷酸中的DNA核苷或RNA核苷区域(例如在gapmer寡核苷酸的缺口区内部)以及在修饰的核苷区域(例如，区域F和区域F')中起到保护免受核酸酶剪切的作用。
在一个实施例中，寡核苷酸包含一个或多个由天然磷酸二酯修饰的核苷间键，例如一个或多个修饰的核苷间键，其例如对核酸酶的攻击更具抗性。核酸酶抗性可以通过在血清中孵育寡核苷酸或通过使用核酸酶抗性测定(例如蛇毒磷酸二酯酶(SVPD))来确定，两者均是本领域中众所周知的。能够增强寡核苷酸的核酸酶抗性的核苷间键称为抗核酸酶核苷间键。在一些实施例中，寡核苷酸或其连续核苷酸序列中至少50％的核苷间键被修饰，诸如至少60％、诸如至少70％、诸如至少80％、诸如至少90％的寡核苷酸或其连续核苷酸序列中的核苷间键是抗核酸酶核苷间键。在一些实施例中，寡核苷酸或其连续核苷酸序列的所有核苷间键都是抗核酸酶核苷间键。应当认识到的是，在一些实施例中，将本发明的寡核苷酸与非核苷酸官能团诸如缀合物连接的核苷可以是磷酸二酯。
本发明的化合物用于制备包含至少一个二硫代磷酸酯核苷间键的寡核苷酸。二硫代磷酸酯键是其中两个非桥接氧原子均已经被硫原子取代的核苷间磷酸酯键。
二硫代磷酸酯核苷间键由于核酸酶抗性、有益的药代动力学和易于制造而特别有用。在一些实施例中，寡核苷酸或其连续核苷酸序列中至少50％的核苷间键是二硫代磷酸酯，所述寡核苷酸或其连续核苷酸序列中的诸如至少60％、诸如至少70％、诸如至少80％或诸如至少90％的核苷间键是二硫代磷酸酯。在一些实施例中，除二硫代磷酸酯核苷间键之外，寡核苷酸或其连续核苷酸序列的所有核苷间键都是硫代磷酸酯。在一些实施例中，除了二硫代磷酸酯键外，本发明的寡核苷酸还包含二硫代磷酸酯核苷间键和至少一个磷酸二酯键，诸如2个、3个或4个磷酸二酯键。在gapmer寡核苷酸中，当存在时，磷酸二酯键适地不位于缺口区G中的邻接DNA核苷之间。
抗核酸酶键，诸如二硫代磷酸酯键，在与靶核酸形成双链体时能够募集核酸酶的寡核苷酸区域中特别有用，诸如gapmer的区域G。然而，二硫代磷酸酯键还可用于非核酸酶募集区域和/或亲和力增强区域，诸如gapmer的区域F和F'。在一些实施例中，gapmer寡核苷酸可在区域F或F'或区域F和F'两者均包含一个或多个磷酸二酯键，其中区域G中的核苷间键可以完全是二硫代磷酸酯。
有利地，寡核苷酸的连续核苷酸序列中的所有核苷间键或寡核苷酸的所有核苷间键都是二硫代磷酸酯键。替代性地，根据本发明制备的寡核苷酸包含至少一个二硫代磷酸酯核苷间键和至少一种硫代磷酸酯核苷间键。作为再一个替代方案，根据本发明制备的寡核苷酸包含至少一个二硫代磷酸酯核苷间键、至少一个硫代磷酸酯核苷间键和/或至少一个磷酸二酯核苷间键。
应当认识到，如EP 2 742 135中所公开的，寡核苷酸可以包含其他核苷间键(除了磷酸二酯、硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯)。
立体定义的核苷间键
立体定义的核苷间键是在其两种非对映异构体形式Rp或Sp中的一者中具有非对映异构体过量的手性核苷间键。
应当认识到，本领域中使用的立体选择性寡核苷酸合成方法通常在每个手性核苷间键处提供至少约90％或至少约95％的非对映选择性，因此最高约10％诸如约5％的寡核苷酸分子可能具有非对映异构体的替代形式。
在一些实施例中，每个立体定义的手性核苷间键的非对映异构体比率为至少约90:10。在一些实施例中，每个手性核苷间键的非对映异构体比率为至少约95:5。
立体定义的硫代磷酸酯键是立体定义的核苷间键的一个特定实例。
立体定义的硫代磷酸酯键
立体定义的硫代磷酸酯键是在其两种非对映异构体形式Rp或Sp中的一者中具有非对映异构体过量的硫代磷酸酯键。
硫代磷酸酯核苷间键的Rp和Sp构型如下所示
其中3'R基团代表相邻的核苷(5'核苷)的3'位置，而5'R基团代表相邻的核苷(3'核苷)的5'位置。
在本文中，Rp核苷间键也可以表示为srP，并且Sp核苷间键可以表示为ssP。
在一个特定实施例中，每个立体定义的硫代磷酸酯键的非对映体比率为至少约90:10或至少95:5。
在一些实施例中，每个立体定义的硫代磷酸酯键的非对映体比率为至少约97:3。在一些实施例中，每个立体定义的硫代磷酸酯键的非对映体比率为至少约98:2。在一些实施例中，每个立体定义的硫代磷酸酯键的非对映体比率为至少约99:1。
在一些实施例中，立体定义的核苷间键在至少97％诸如至少98％诸如至少99％或(基本上)全部的存在于寡核苷酸分子群内的寡核苷酸分子中具有相同的非对映异构形式(Rp或Sp)。
可以在仅具有非手性骨架(即磷酸二酯)的模型系统中测量非对映体纯度。可通过例如将具有立体定向核苷间键的单体偶联至以下模型系统“5't-po-t-po-t-po 3'”来测量每个单体的非对映体纯度。该测量的结果随后将给出：可使用HPLC分离的5'DMTr-t-srp-t-po-t-po-t-po 3'或5'DMTr-t-ssp-t-po-t-po-t-po 3'。通过积分来自两种可能非对映异构体的UV信号并且得到这些非对映异构体的比率(例如98:2、99:1或>99:1)，确定非对映异构体纯度。
应当理解，特定的单一非对映异构体(单一立体定义的寡核苷酸分子)的非对映异构体纯度将随每个核苷间位置处限定的立体中心的偶联选择性和待引入的立体定义的核苷间键的数目而变化。以举例方式而言，如果每个位置处的偶联选择性是97％，则具有15个立体定义的核苷间键的立体定义的寡核苷酸的所得纯度将是0.9715，即如与37％的其他非对映异构体相比，所需的非对映异构体为63％。可以在合成后，通过纯化(例如通过HPLC，诸如离子交换色谱法或反相色谱法)改进定义的非对映异构体的纯度。
在一些实施例中，立体定义的寡核苷酸是指寡核苷酸群的其中至少约40％诸如至少约50％属于所需非对映异构体的寡核苷酸群。
换言之，在一些实施例中，立体定义的寡核苷酸是指寡核苷酸群的其中至少约40％诸如至少约50％由所需(特定)的立体定义的核苷间键基序(也称作立体定义的基序)组成的寡核苷酸群。
对于包含立构无规核苷间立体中心和立体定义的核苷间手性中心的立体定义的寡核苷酸，参考保留所需的立体定义的核苷间键基序的寡核苷酸群的百分比(％)，确定立体定义的寡核苷酸的纯度，计算时不考虑立构无规键。
修饰的寡核苷酸
术语经修饰的寡核苷酸描述了一种寡核苷酸，其包含一个或多个糖修饰的核苷和/或修饰的核苷间键。术语“嵌合”寡核苷酸是在文献中已用于描述具有修饰的核苷的寡核苷酸的术语。
立体定义的寡核苷酸
立体定义的寡核苷酸是一种寡核苷酸，其中至少一个核苷间键是立体定义的核苷间键。
立体定义的硫代磷酸酯寡核苷酸是一种寡核苷酸，其中至少一个核苷间键是立体定义的硫代磷酸酯核苷间键。
互补性
术语“互补性”描述了核苷/核苷酸的Watson-Crick碱基配对的能力。沃森克里克碱基对为鸟嘌呤(G)-胞嘧啶(C)和腺嘌呤(A)-胸腺嘧啶(T)/尿嘧啶(U)。应当理解，寡核苷酸可包含具有修饰的核碱基的核苷，例如经常使用5-甲基胞嘧啶代替胞嘧啶，因此，术语互补性涵盖未修饰的核碱基和修饰的核碱基之间的沃森克里克碱基配对(参见例如Hirao等人(2012)Accounts of Chemical Research，第45卷第2055页和Bergstrom(2009)CurrentProtocols in Nucleic Acid Chemistry，增刊37 1.4.1)。
如本文所用，术语“％互补的”是指核酸分子(例如寡核苷酸)中连续核苷酸序列内核苷酸的比例，其中在给定位置，所述核苷酸与不同的核酸分子(例如靶核酸)在给定位置处的连续核苷酸序列互补(即与之形成Watson Crick碱基对)。通过以下方式计算百分比：(与靶序列5'-3'和寡核苷酸序列从3'-5'对齐时)计数两个序列之间形成配对的对齐碱基的数目，除以寡核苷酸中核苷酸的总数并且乘以100。在这种比较中，未对齐(形成碱基对)的核碱基/核苷酸被称为错配。优选地，计算连续核苷酸序列的互补性％时不允许插入和缺失。
术语“完全互补”是指100％互补性。
杂交
如本文所用，术语“杂交”(hybridizing/hybridizes)应当理解为两条核酸链(例如寡核苷酸和靶核酸)在相反链上的碱基对之间形成氢键，从而形成双链体。两条核酸链之间结合的亲和力为杂交的强度。它通常根据解链温度(Tm)来描述，该解链温度被定义为一半寡核苷酸与靶核酸形成双链体的温度。在生理条件下，Tm并非确实与亲和力严格成比例(Mergny与Lacroix,2003年，Oligonucleotides 13:515–537)。标准状态Gibbs自由能ΔG°是结合亲和力的更精确的表述并且与反应的解离常数(Kd)通过ΔG°＝-RTln(Kd)相关，其中R是气体常数并且T是绝对温度。因此，寡核苷酸与靶核酸之间反应的非常低的ΔG°反映了寡核苷酸和靶核酸之间强力杂交。ΔG°是与其中水浓度为1M、pH为7并且温度为37℃的反应相关的能量。寡核苷酸与靶核酸杂交是自发反应，并且对于自发反应，ΔG°小于零。例如，可利用如Hansen等人,1965,Chem.Comm.36–38和Holdgate等人,2005,Drug Discov Today中所述的等温滴定量热法(ITC)的方法通过实验测量ΔG°。本领域的技术人员将知道商业设备可用于测量ΔG°。也可以通过使用如SantaLucia,1998,Proc Natl Acad Sci USA.95:1460–1465所述的最近邻模型，适当使用Sugimoto等人,1995,Biochemistry34:11211–11216和McTigue等人,2004,Biochemistry 43:5388–5405描述的推导的热力学参数来估计ΔG°。为了具有通过杂交调节其预期的核酸靶标的可能性，对于长度为10-30个核苷酸的寡核苷酸，本发明的寡核苷酸以低于-10kcal的ΔG°估值与靶核酸杂交。在一些实施例中，依据标准状态吉布斯自由能ΔG°测量杂交的程度或强度。对于长度为8-30个核苷酸的寡核苷酸，寡核苷酸可与靶核酸以低于-10kcal，诸如低于-15kcal、诸如低于-20kcal和诸如低于-25kcal的ΔG°估值杂交。在一些实施例中，寡核苷酸与靶核酸以-10kcal至-60kcal诸如-12kcal至-40kcal诸如-15kcal至-30kcal或-16kcal至-27kcal诸如-18kcal至-25kcal的ΔG°估计值杂交。
如上所述，本发明涉及式(I)化合物：
用于制备包含至少一个二硫代磷酸酯核苷间键的寡核苷酸的用途。
在式(I)中，PG为羟基保护基，Bn为核碱基，所述核碱基可以是天然或非天然的，并且核糖n在其环的2'位置处被修饰。
羟基保护基PG
“羟基保护基”PG是羟基基团的保护基团。羟基保护基的实例是乙酰基(Ac)、苯甲酰基(Bz)、苄基(Bn)、β-甲氧基乙氧基甲基醚(MEM)、二甲氧基三苯甲基(或双-(4-甲氧基苯基)苯基甲基)(DMT)、三甲氧基三苯甲基(或三-(4-甲氧基苯基)苯基甲基)(TMT)、甲氧基甲基醚(MOM)、甲氧基三苯甲基[(4-甲氧基苯基)二苯基甲基(MMT)、对甲氧基苄基醚(PMB)、甲硫基甲基醚、新戊酰(Piv)、四氢吡喃基(THP)、四氢呋喃(THF)、三苯甲基或三苯基甲基(Tr)、甲硅烷基醚(例如三甲基甲硅烷基(TMS)、叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)、三异丙基甲硅烷基氧基甲基(TOM)和三异丙基甲硅烷基(TIPS)醚)、甲基醚和乙氧基乙基醚(EE)。羟基保护基的特定实例是DMT和TMT，尤其是DMT。
核碱基Bn
术语核碱基包括存在于核苷和核苷酸中的嘌呤(例如腺嘌呤和鸟嘌呤)和嘧啶(例如尿嘧啶、胸腺嘧啶和胞嘧啶)部分，其在核酸杂交中形成氢键。在本发明的上下文中，术语核碱基还包括修饰的核碱基，其可不同于天然存在的核碱基，但在核酸杂交过程中为功能性的。在此上下文中，“核碱基”是指天然存在的核碱基，诸如腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸苷、尿嘧啶、黄嘌呤和次黄嘌呤，以及非天然存在的变体。此类变体例如描述于Hirao等人(2012)，Accounts of Chemical Research，第45卷第2055页和Bergstrom(2009)CurrentProtocols in Nucleic Acid Chemistry，增刊37 1.4.1中。(命名法“Bn”表示特定的核碱基“n”，而不是B部分被重复n次)。
在一些实施例中，通过以下方式修饰核碱基部分：将嘌呤或嘧啶改变为修饰的嘌呤或嘧啶，诸如取代的嘌呤或取代的嘧啶，诸如选自异胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-噻唑-胞嘧啶、5-丙炔基-胞嘧啶、5-丙炔基-尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-噻唑并-尿嘧啶、2-硫代-尿嘧啶、2'-硫代-胸腺嘧啶、肌苷、二氨基嘌呤、6-氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、2,6-二氨基嘌呤和2-氯-6-氨基嘌呤的核碱基。
核碱基部分可由每个相应核碱基的字母代码来表示，例如A、T、G、C或U，其中每个字母可任选地包括具有同等功能的修饰的核碱基。例如，在示例性的寡核苷酸中，核碱基部分选自A、T、G、C和5-甲基胞嘧啶。任选地，对于LNA gapmer，可使用5-甲基胞嘧啶LNA核苷。
核苷修饰
式(I)中的核糖n在其环的2'位置处被修饰，即，当与在DNA和RNA中发现的核糖糖部分相比时被修饰。
具体地，核糖n的2'位置处的修饰选自由以下项组成的组：锁核酸(LNA)修饰、受约束的乙基(cET)修饰、2'-O-甲氧基乙基(2'-O-MOE)修饰、2'-O-甲基修饰和2'-氟修饰、优选地LNA修饰。
已经制备了许多具有核糖部分的修饰的核苷，主要目的为改善寡核苷酸的某些特性，诸如亲和力和/或核酸酶抗性。
这样的修饰包括其中核糖环结构被修饰的那些修饰，例如替代为己糖环(HNA)或双环，其通常在核糖环(LNA)的C2与C4碳原子之间具有双基桥，或通常在C2与C3碳原子之间缺乏键的未连接核糖环(例如UNA)。其他糖修饰的核苷包括例如双环己糖核酸(WO 2011/017521)或三环核酸(WO2013/154798)。修饰的核苷还包括其中糖部分被非糖部分替换的核苷，例如在肽核酸(PNA)或吗啉代核酸的情况下。
糖修饰还包括通过将核糖环上的取代基改变为除氢以外的基团或DNA和RNA核苷中天然存在的2'-OH基团而进行的修饰。例如，可以在2'、3'、4'或5'位置引入取代基。
2'修饰的核糖。
2'修饰的核糖是在2'位置处具有除H或-OH以外的取代基(2'取代的核糖)或包含能够在2'碳与核糖环中的第二个碳之间形成桥的2'连接的双基的核糖，被称为LNA(2'-4'双基桥接的)核苷。
事实上，人们已花费很多精力开发2'取代的核苷，并且发现许多2'取代的核苷并入寡核苷酸后具有有益的特性。例如，2'修饰的核糖可提供对寡核苷酸的增强的结合亲和力和/或增加的核酸酶抗性。2'取代的修饰的核苷实例是2'-O-烷基-RNA、2'-O-甲基-RNA、2'-烷氧基-RNA、2'-O-甲氧基乙基-RNA(MOE)、2'-氨基-DNA、2'-氟-RNA和2'-F-ANA核苷。其他实例可参见例如：Freier和Altmann；Nucl.Acid Res.,1997,25,4429-4443和Uhlmann；Curr.Opinion in Drug Development,2000,3(2),293-213；以及Deleavey和Damha,Chemistry and Biology 2012,19,937。下面是具有2'取代的核糖的一些核苷的图示。
关于本发明，术语“在核糖环的2'位置处被修饰”包括2'桥接的分子，如LNA。
锁定核酸核苷(LNA核苷)
“LNA核苷”是一种2'-修饰的核苷，其包含链接所述核苷的核糖环的C2'和C4'的双基(也称为“2'-4'桥”)，其限制或锁定核糖环的构象。这些核苷在文献中也被称为桥连核酸或双环核酸(BNA)。当将LNA掺入互补RNA或DNA分子的寡核苷酸中时，核糖构象的锁定与杂交亲和力的增强(双链体稳定化)相关。这可通过测量寡核苷酸/互补双链体的解链温度来常规确定。
非限制性的示例性LNA核苷公开于WO 99/014226、WO 00/66604、WO 98/039352、WO2004/046160、WO 00/047599、WO 2007/134181、WO 2010/077578、WO 2010/036698、WO2007/090071、WO 2009/006478、WO 2011/156202、WO 2008/154401、WO 2009/067647、WO2008/150729、Morita等人,Bioorganic&Med.Chem.Lett.12,73-76,Seth etal.J.Org.Chem.2010,Vol75(5)pp.1569-81和Mitsuoka等人,Nucleic Acids Research2009,37(4),1225-1238。
本发明的LNA中的2'-4'桥可以包含2至4个桥接原子，并且特别地具有式-X-Y-，其中X与C4'连接并且Y与C2'连接，
其中
X为氧、硫、-CRaRb-、-C(Ra)＝C(Rb)-、-C(＝CRaRb)-、-C(Ra)＝N-、-Si(Ra)2-、-SO2-、-NRa-；-O-NRa-、-NRa-O-、-C(＝J)-、Se、-O-NRa-、-NRa-CRaRb-、-N(Ra)-O-或-O-CRaRb-；
Y为氧、硫、-(CRaRb)n-、-CRaRb-O-CRaRb-、-C(Ra)＝C(Rb)-、-C(Ra)＝N-、-Si(Ra)2-、-SO2-、-NRa-、-C(＝J)-、Se、-O-NRa-、-NRa-CRaRb-、-N(Ra)-O-或-O-CRaRb-；
条件是-X-Y-不为-O-O-、Si(Ra)2-Si(Ra)2-、-SO2-SO2-、-C(Ra)＝C(Rb)-C(Ra)＝C(Rb)、-C(Ra)＝N-C(Ra)＝N-、-C(Ra)＝N-C(Ra)＝C(Rb)、-C(Ra)＝C(Rb)-C(Ra)＝N-或-Se-Se-；
J为氧、硫、＝CH2或＝N(Ra)；
Ra和Rb独立地选自氢、卤素、羟基、氰基、巯基、烷基、经取代的烷基、烯基、经取代的烯基、炔基、经取代的炔基、烷氧基、经取代的烷氧基、烷氧基烷基、烯氧基、羧基、烷氧基羰基、烷基羰基、甲酰基、芳基、杂环基、氨基、烷基氨基、氨基甲酰基、烷基氨基羰基、氨基烷基氨基羰基、烷基氨基烷基氨基羰基、烷基羰基氨基、脲基、烷酰氧基、磺酰基、烷基磺酰氧基、硝基、叠氮基、巯基硫基烷基硫基、芳氧基羰基、芳氧基、芳基羰基、杂芳基、杂芳氧基羰基、杂芳氧基、杂芳基羰基、-OC(＝Xa)Rc、-OC(＝Xa)NRcRd和-NReC(＝Xa)NRcRd；
或两个偕Ra和Rb一起形成任选取代的亚甲基；
或两个偕Ra和Rb与它们所连接的碳原子一起形成环烷基或卤代环烷基，仅含-X-Y-的一个碳原子；
其中取代的烷基、取代的烯基、取代的炔基、取代的烷氧基和取代的亚甲基为被1至3个独立地选自卤素、羟基、烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷氧基烷基、烯氧基、羧基、烷氧基羰基、烷基羰基、甲酰基、杂环基、芳基和杂芳基的取代基取代的烷基、烯基、炔基和亚甲基；
Xa为氧、硫或-NRc；
Rc、Rd和Re独立地选自氢和烷基；并且
n为1、2或3。
在本发明的又一个特定实施例中，X为氧、硫、-NRa-、-CRaRb-或-C(＝CRaRb)-，特别地为氧、硫、-NH-、-CH2-或-C(＝CH2)-，更特别地为氧。
在本发明的另一个特定实施例中，Y为-CRaRb-、-CRaRb-CRaRb-或-CRaRb-CRaRb-CRaRb-，特别地为-CH2-CHCH3-、-CHCH3-CH2-、-CH2-CH2-或-CH2-CH2-CH2-。
在本发明的一个具体实施例中，-X-Y-为-O-(CRaRb)n-、-S-CRaRb-、-N(Ra)CRaRb-、-CRaRb-CRaRb-、-O-CRaRb-O-CRaRb-、-CRaRb-O-CRaRb-、-C(＝CRaRb)-CRaRb-、-N(Ra)CRaRb-、-O-N(Ra)-CRaRb-或-N(Ra)-O-CRaRb-。
在本发明的一个特定实施例中，Ra和Rb独立地选自由以下项组成的组：氢、卤素、羟基、烷基和烷氧烷基，特别是氢、卤素、烷基和烷氧烷基。
在本发明的另一个特定实施例中，Ra和Rb独立地选自由以下项组成的组：氢、氟、羟基、甲基和-CH2-O-CH3，特别是氢、氟、甲基和-CH2-O-CH3.
有利地，-X-Y-的Ra和Rb中的一者如上文所定义并且另一者全部同时为氢。
在本发明的又一个特定实施例中，Ra为氢或烷基，特别是氢或甲基。
在本发明的另一个特定实施例中，Rb为氢或烷基，特别是氢或甲基。
在本发明的一个特定实施例中，Ra和Rb中的一者或两者为氢。
在本发明的一个特定实施例中，Ra和Rb中仅有一者为氢。
在本发明的一个特定实施例中，Ra和Rb中的一者为甲基并且另一者为氢。
在本发明的一个特定实施例中，Ra和Rb两者同时均为甲基。
在本发明的一个特定实施例中，-X-Y-为-O-CH2-、-S-CH2-、-S-CH(CH3)-、-NH-CH2-、-O-CH2CH2-、-O-CH(CH2-O-CH3)-、-O-CH(CH2CH3)-、-O-CH(CH3)-、-O-CH2-O-CH2-、-O-CH2-O-CH2-、-CH2-O-CH2-、-C(＝CH2)CH2-、-C(＝CH2)CH(CH3)-、-N(OCH3)CH2-或-N(CH3)CH2-；
在本发明的一个特定实施例中，-X-Y-为-O-CRaRb-’其中Ra和Rb独立地选自由以下项组成的组：氢、烷基和烷氧烷基，特别是氢、甲基和-CH2-O-CH3。
在一个特定实施例中，-X-Y-为-O-CH2-或-O-CH(CH3)-，特别地为-O-CH2-。
2'-4'桥键可以位于核糖环平面的下方(β-D-构型)，或位于该环平面的上方(α-L-构型)，分别如式(A)和式(B)中所示。
根据本发明的LNA核苷中的核糖环可以特别地具有式(B1)或(B2)
其中
W为氧、硫、-N(Ra)-或-CRaRb-，特别地为氧；
B为核碱基或修饰的核碱基；
Z为至相邻核苷的核苷间键或5'末端基团；
Z*为至相邻核苷的核苷间键或3'末端基团；
R1、R2、R3、R5和R5*独立地选自氢、卤素、烷基、卤代烷基、链烯基、炔基、羟基、烷氧基、烷氧烷基、叠氮基、链烯氧基、羧基、烷氧基羰基、烷基羰基、甲酰基和芳基；并且
X、Y、Ra和Rb如上文所定义。
在一特定实施例中，在-X-Y-的定义中，Ra为氢或烷基，特别是氢或甲基。在另一个特定实施例中，在-X-Y-的定义中，Rb为氢或烷基，特别是氢或甲基。在又一个特定实施例中，在-X-Y-的定义中，Ra和Rb中的一者或两者为氢。在一个特定实施例中，在-X-Y-的定义中，Ra和Rb中仅有一者为氢。在一个特定实施例中，在-X-Y-的定义中，Ra和Rb中的一者为甲基并且另一者为氢。在一个特定实施例中，在-X-Y-的定义中，Ra和Rb两者同时均为甲基。
在一进一步特定实施例中，在X的定义中，Ra为氢或烷基，特别是氢或甲基。在另一个特定实施例中，在X的定义中，Rb为氢或烷基，特别是氢或甲基。在一个特定实施例中，在X的定义中，Ra和Rb中的一者或两者为氢。在一个特定实施例中，在X的定义中，Ra和Rb中仅有一者为氢。在一个特定实施例中，在X的定义中，Ra和Rb中的一者为甲基并且另一者为氢。在一个特定实施例中，在X的定义中，Ra和Rb两者同时均为甲基。
在一进一步特定实施例中，在Y的定义中，Ra为氢或烷基，特别是氢或甲基。在另一个特定实施例中，在Y的定义中，Rb为氢或烷基，特别是氢或甲基。在一个特定实施例中，在Y的定义中，Ra和Rb中的一者或两者为氢。在一个特定实施例中，在Y的定义中，Ra和Rb中仅有一者为氢。在一个特定实施例中，在Y的定义中，Ra和Rb中的一者为甲基并且另一者为氢。在一个特定实施例中，在Y的定义中，Ra和Rb两者同时均为甲基。
在本发明的一个特定实施例中，R1、R2、R3、R5和R5*独立地选自氢和烷基，特别是氢和甲基。
在本发明的又一个特别有利的实施例中，R1、R2、R3、R5和R5*全部同时为氢。
在本发明的另一个特定实施例中，R1、R2、R3全部同时为氢，R5和R5*中的一者为氢并且另一者如上文定义，特别为烷基，更特别为甲基。
在本发明的一个特定实施例中，R5和R5*独立地选自氢、卤素、烷基、烷氧烷基和叠氮基，特别选自氢、氟、甲基、甲氧基乙基和叠氮基。在本发明的特别有利实施例中，R5和R5*中的一者为氢，并且另一者为烷基，特别是甲基、卤素，特别是氟、烷氧基烷基，特别是甲氧基乙基或叠氮基；或者R5和R5*同时均为氢或卤素，特别是同时均为氢或氟。在此类特定实施例中，W可有利地为氧，并且-X-Y-有利地为-O-CH2-。
在本发明的一个特定实施例中，-X-Y-为-O-CH2-，W为氧，并且R1、R2、R3、R5和R5*全部同时为氢。此类LNA核苷公开于WO 99/014226、WO 00/66604、WO 98/039352和WO 2004/046160中，这些专利均据此以引用方式并入本文，并且包括本领域中通常已知的β-D-氧基LNA核苷和α-L-氧基LNA核苷。
在本发明的另一个特定实施例中，-X-Y-为-S-CH2-，W为氧，并且R1、R2、R3、R5和R5*全部同时为氢。此类硫代LNA核苷公开于WO 99/014226和WO 2004/046160中，这些专利据此以引用方式并入本文。
在本发明的另一个特定实施例中，-X-Y-为-NH-CH2-，W为氧，并且R1、R2、R3、R5和R5*全部同时为氢。此类氨基LNA核苷公开于WO 99/014226和WO 2004/046160中，这些专利据此以引用方式并入本文。
在本发明的另一个特定实施例中，-X-Y-为-O-CH2CH2-或-OCH2CH2CH2-，W为氧，并且R1、R2、R3、R5和R5*全部同时为氢。此类LNA核苷公开于WO 00/047599和Morita等人,Bioorganic&Med.Chem.Lett.12,73-76，所述文献据此以引用方式并入本文，并且包括本领域通常已知的2'-O-4'C-乙烯桥接的核酸(ENA)。
在本发明的另一个特定实施例中，-X-Y-为-O-CH2-，W为氧，R1、R2、R3全部同时为氢，R5和R5*中的一者为氢并且另一者不为氢，诸如为烷基(例如甲基)。此类5'取代的LNA核苷公开于WO 2007/134181中，该专利据此以引用方式并入本文。
在本发明的另一个特定实施例中，-X-Y-为-O-CRaRb-，其中Ra和Rb中的一者或两者并非氢，特别地为烷基诸如甲基，W为氧，R1、R2、R3全部同时为氢，R5和R5*中的一者为氢并且另一者不为氢，特别为烷基(例如甲基)。此类双重修饰的LNA核苷公开于WO 2010/077578中，该专利据此以引用方式并入本文。
在本发明的另一个特定实施例中，-X-Y-为-O-CHRa-，W为氧，并且R1、R2、R3、R5和R5*全部同时为氢。此类6'取代的LNA核苷公开于WO 2010/036698和WO 2007/090071中，这些专利据此以引用方式并入本文。在此类6'取代的LNA核苷中，Ra特别为C1-C6烷基诸如甲基。
在本发明的另一个特定实施例中，-X-Y-为-O-CH(CH2-O-CH3)-(“2'O-甲氧基乙基双环核酸”，Seth等人，J.Org.Chem.2010，第75卷第5期，第1569-81页)。
在本发明的另一个特定实施例中，-X-Y-为-O-CH(CH2CH3)-；
在本发明的另一个特定实施例中，-X-Y-为-O-CH(CH2-O-CH3)-，W为氧，并且R1、R2、R3、R5和R5*全部同时为氢。在本领域中，此类LNA核苷也称作环状MOE(cMOE)并且公开于WO2007/090071中。
在本发明的另一个特定实施例中，-X-Y-为-O-CH(CH3)-(“2'O-乙基双环核酸”，Seth等人，J.Org.Chem.2010，第75卷第5期，第1569-81页)。
在本发明的另一个特定实施例中，-X-Y-为-O-CH2-O-CH2-(Seth等人，J.Org.Chem2010，同上)。
在本发明的另一个特定实施例中，-X-Y-为-O-CH(CH3)-，W为氧，并且R1、R2、R3、R5和R5*全部同时为氢。此类6'-甲基LNA核苷在本领域也称作cET核苷并且可以为(S)-cET或(R)-cET非对映异构体，如WO 2007/090071(β-D)和WO 2010/036698(α-L)中所公开，这两件专利均据此以引用方式并入本文。
在本发明的另一个特定实施例中，-X-Y-为-O-CRaRb-，其中Ra和Rb均非氢，W为氧，并且R1、R2、R3、R5和R5*全部同时为氢。在一个特定实施例中，Ra和Rb两者同时均为烷基，特别地两者同时均为甲基。此类6'-双取代的LNA核苷公开于WO 2009/006478中，其据此以引用方式并入本文。
在本发明的另一特定实施例中，-X-Y-为-S-CHRa-，W为氧，并且R1、R2、R3、R5及R5*均同时为氢。此类6'-取代的硫代LNA核苷公开于WO 2011/156202中，其据此以引用方式并入本文。在此类6'-取代的硫代LNA的一个特定实施例中，Ra为烷基，特别是甲基。
在本发明的一个特定实施例中，-X-Y-为-C(＝CH2)C(RaRb)-、-C(＝CHF)C(RaRb)-或-C(＝CF2)C(RaRb)-，W为氧，并且R1、R2、R3、R5和R5*全部同时为氢。Ra和Rb有利的独立地选自氢、卤素、烷基和烷氧基烷基，特别是氢、甲基、氟代和甲氧基甲基。Ra和Rb特别地两者同时均为氢或甲基，或者Ra和Rb中的一者为氢，并且另一者为甲基。此类乙烯基碳LNA核苷公开于WO2008/154401和WO 2009/067647中，这些专利据此以引用方式并入本文。
在本发明的一个特定实施例中，-X-Y-为-N(ORa)-CH2-，W为氧，并且R1、R2、R3、R5和R5*全部同时为氢。在一个特定实施例中，Ra为烷基诸如甲基。此类LNA核苷也称作N取代的LNA并且公开于WO 2008/150729中，该专利据此以引用方式并入本文。
在本发明的一个特定实施例中，-X-Y-为-O-N(Ra)-、-N(Ra)-O-、-NRa-CRaRb-CRaRb-或-NRa-CRaRb-，W为氧，并且R1、R2、R3、R5和R5*全部同时为氢。Ra和Rb有利的独立地选自氢、卤素、烷基和烷氧基烷基，特别是氢、甲基、氟代和甲氧基甲基。在一个特定实施例中，Ra为烷基诸如甲基，Rb为氢或甲基，特别地为氢(Seth等人，J.Org.Chem 2010，同上)。
在本发明的一个特定实施例中，-X-Y-为-O-N(CH3)-(Seth等人，J.Org.Chem2010，同上)。
在本发明的一个特定实施例中，R5和R5*两者同时均为氢。在本发明的另一个特定实施例中，R5和R5*中的一者为氢，并且另一者为烷基诸如甲基。在此类实施例中，R1、R2和R3可特别地为氢，并且-X-Y-可特别地为-O-CH2-或-O-CHC(Ra)3-诸如-O-CH(CH3)-。
在本发明的一个特定实施例中，-X-Y-为-CRaRb-O-CRaRb-诸如-CH2-O-CH2-，W为氧，并且R1、R2、R3、R5和R5*全部同时为氢。在此类特定实施例中，Ra可特别为烷基诸如甲基，Rb为氢或甲基，特别为氢。此类LNA核苷也称作构象限制的核苷酸(CRN)并且公开于WO 2013/036868中，该专利据此以引用方式并入本文。
在本发明的一个特定实施例中，-X-Y-为-O-CRaRb-O-CRaRb-诸如-O-CH2-O-CH2-，W为氧，并且R1、R2、R3、R5和R5*全部同时为氢。Ra和Rb有利的独立地选自氢、卤素、烷基和烷氧基烷基，特别是氢、甲基、氟代和甲氧基甲基。在此类特定实施例中，Ra可特别地为烷基诸如甲基，Rb为氢或甲基，特别为氢。此类LNA核苷也称作COC核苷酸并且公开于Mitsuok等人，Nucleic Acids Research 2009，37(4)，1225-1238中，该文献据此以引用方式并入本文。
应当认识到，除非另外说明，否则LNA核苷的核糖可处于β-D或α-L立体异构形式。
包括2'修饰的核糖的LNA核苷的特定实例在方案1中给出(其中B如上所定义)。
方案1
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特定的LNA核苷为β-D-氧基-LNA、6'-甲基-β-D-氧基LNA诸如(S)-6'-甲基-β-D-氧基-LNA((S)-cET)和ENA。
MOE核苷
术语“MOE”代表“甲氧基-乙基”并且通过缩写指具有如下所示的在2'位置处被甲氧基-乙氧基取代的核糖的核苷。
因此，上述核苷可以被命名为“MOE”或“2'-O-MOE核苷”。
本发明还涉及一种用于制备含有至少一个二硫代磷酸酯核苷间键的寡核苷酸的方法，所述方法包括以下步骤：
a)将式(I)化合物：
其中在式(I)中，PG为羟基保护基，Bn为核碱基，所述核碱基可以是天然或非天然的，并且其中核糖n在其环的2'位置处被修饰，
与式(II)化合物：
其中在式(II)中，B(n-1)为核碱基，所述核碱基可以是天然或非天然的，并且其中核糖(n-1)可以在其环的2'位置处未被修饰或被修饰，
在偶联剂存在下偶联，以获得式(III)化合物：
式(I)化合物的细节如上所提供。该方法在图1中展示。
式(II)化合物与固体支持物结合(在式(II)中用灰色珠子展示)，从而使方法适合用于高通量寡核苷酸合成仪中。式(II)化合物通常经由接头、优选地可裂解接头与固体支持物结合。一种或多种另外的核苷酸也可以存在于表示为(n-1)的核苷酸与固相之间。在寡核苷酸合成结束时，寡核苷酸从固体支持物上裂解下来。用于本发明的方法中的合适的固体支持物和接头是技术人员已知的。
式(II)中的核碱基B(n-1)的所有细节同上式(I)中的核碱基Bn。核碱基B(n-1)可以与核碱基Bn相同或不同。
式(II)中的核糖(n-1)的所有细节同上式(I)中的核糖n，除了核糖(n-1)在其环的2'位置处可能被修饰或未被修饰。如果核糖(n-1)在其环的2'位置处被修饰，则此类修饰可以与如上所述核糖n的类型相同。如果在环的2'位置处“未被修饰”，则核糖是2-OH核糖或2-脱氧核糖。
式(I)化合物与式(II)化合物的偶联在偶联剂存在下发生。偶联剂促进式(III)中磷酸酯键的形成。优选地，偶联剂是氯磷酸二芳酯或氯磷酸二烷酯，例如氯磷酸二乙酯。
方法可以进一步包括以下步骤：
b)在与磷原子结合的氢处进行所述式(III)化合物的硫代烷基化，以获得式(IVa)化合物：
其中R1为氰基烷基，并且其中PG、Bn、B(n-1)以及所述核糖n和(n-1)如针对式(III)所定义的；
c)或进行所述式(III)化合物与氢化黄原素的反应，以获得式(IVb)化合物：
其中PG、Bn、B(n-1)以及所述核糖n和(n-1)如针对式(III)所定义的。
方法可以进一步包括以下步骤：
d)将所述式(IVa)化合物或所述式(IVb)化合物裂解并脱保护以获得式(V)化合物：
其中PG、Bn、B(n-1)以及所述核糖n和(n-1)如针对式(III)所定义的。
方法可以进一步包括以下步骤：
将所述式(IVa)化合物脱保护以提供式(VIa)化合物，
其中Bn、B(n-1)以及所述核糖n和(n-1)如针对式(III)所定义的；
然后将如上文所定义的式(I)化合物或5'-O-保护的核糖核苷亚磷酰胺在偶联剂存在下偶联至所述式(VIa)化合物的脱保护的C5'-OH；或者
将所述式(IVb)化合物脱保护以提供式(VIb)化合物，
其中Bn、B(n-1)以及所述核糖n和(n-1)如针对式(III)所定义的；
然后将如上文所定义的式(I)化合物或5'-O-保护的核糖核苷亚磷酰胺在偶联剂存在下偶联至所述式(VIb)化合物的脱保护的C5'-OH；或者
将所述式(III)化合物脱保护，以提供下式的化合物
其中Bn、B(n-1)以及所述核糖n和(n-1)如针对式(III)所定义的；
然后将如上文所定义的式(I)化合物或5'-O-保护的核糖核苷亚磷酰胺在偶联剂存在下偶联至式(VIc)化合物的脱保护的C5'-OH。
方法可以进一步包括以下步骤：
e)进行所述式(III)化合物的全局硫化，然后是裂解和脱保护以获得式(V)化合物的步骤：
偶联剂合适地是氯磷酸二烷酯、优选地氯磷酸二乙酯与吡啶的组合。
本发明还涉及一种硫代膦酸酯单酯，其选自由以下项组成的组：
其中PG'为氨基保护基并且R5为H或羟基保护基。
在特定实施例中，本发明还涉及一种硫代膦酸酯单酯盐，其选自由以下项组成的组：
其中PG'为氨基保护基，M+为单价阳离子，并且R5为H或羟基保护基。
M+是单价阳离子，诸如金属阳离子，例如碱金属阳离子，诸如Na+或K+。M+尤其可以是季铵阳离子NR4 +(其中R是H或C1-C4烷基)。
具体实施方式
在图1中，代表式(I)化合物的H-硫代膦酸酯单酯被偶联剂活化，所述偶联剂通常是酸氯，诸如特戊酰氯或氯磷酸二苯酯。氯磷酸二苯酯已被证明具有O选择性。
活化的单酯与代表式(II)化合物的所需醇反应(优选地立即)。H-硫代膦酸酯二酯(代表式(III)化合物)相对稳定。H-硫代膦酸酯二酯可以转化为各种P(V)化合物，诸如二硫代磷酸酯二酯(使用硫化剂)或二硫代磷酸酯三酯(使用硫代烷基化剂)。
图2示出了使用式(I)化合物的在每次偶联后进行硫化(硫代烷基化)的的寡聚物合成。如果H-硫代膦酸酯二酯被转化为(更稳定的)受保护的(二)硫代磷酸酯(例如，氰乙基三酯)，则膦酸酯化学可以与相同寡聚物中的常规亚酰胺化学组合。以此方式，在同一寡聚物中具有磷酸酯键、硫代磷酸酯键和二硫代磷酸酯键的寡聚物是可能的。
图3展示了使用具有最终硫化的式(I)化合物的寡聚物合成。如果在合成循环中仅使用H-磷酸酯和/或H-(硫代)膦酸酯，则氧化(硫化)步骤可以在每次偶联后被省略、反而在寡聚物合成完成后全局地进行。这在最终链中提供了两种类型的磷酸酯键，例如硫代磷酸酯/二硫代磷酸酯组合。
图4示出了H-硫代膦酸酯在固体支持物上偶联的特定实例。适合机器合成的条件首先在溶液中开发并且然后在机器上进行验证。氯磷酸二乙酯与有限量吡啶的组合构成了迄今为止发现的最佳条件。在裂解和保护之前，二酯被硫化或硫代烷基化。
本发明涉及以下带编号方面：
方面1.式(I)化合物：
用于制备包含至少一个二硫代磷酸酯核苷间键的寡核苷酸的用途，
其中PG为羟基保护基，Bn为核碱基，所述核碱基可以是天然或非天然的，并且其中核糖n在其环的2'位置处被修饰。
方面2.根据方面1所述的用途，其中核糖n的2'位置处的修饰选自由以下项组成的组：锁核酸(LNA)修饰、受约束的乙基(cET)修饰、2'-O-甲氧基乙基(2'-O-MOE)修饰、2'-O-甲基修饰和2'-氟修饰、优选地LNA修饰。
方面3.根据前述方面中任一项所述的用途，其用于制备包含至少一个二硫代磷酸酯核苷间键和至少一个硫代磷酸酯核苷间键的寡核苷酸。
方面4.根据前述方面中任一项所述的用途，其用于制备包含至少一个二硫代磷酸酯、至少一个硫代磷酸酯核苷间键和/或至少一个磷酸二酯核苷间键的寡核苷酸。
方面5.一种用于制备含有至少一个二硫代磷酸酯核苷间键的寡核苷酸的方法，所述方法包括以下步骤：
b)将式(I)化合物：
其中在式(I)中，PG为羟基保护基，Bn为核碱基，所述核碱基可以是天然或非天然的，并且其中核糖n在其环的2'位置处被修饰，
与式(II)化合物：
其中在式(II)中，B(n-1)为核碱基，所述核碱基可以是天然或非天然的，并且其中核糖(n-1)可以在其环的2'位置处未被修饰或被修饰，
在偶联剂存在下偶联，以获得式(III)化合物：
方面6.根据方面5所述的方法，其进一步包括以下步骤：
f)在与磷原子结合的氢处进行所述式(III)化合物的硫代烷基化，以获得式(IVa)化合物：
其中R1为氰基烷基，并且其中PG、Bn、B(n-1)以及所述核糖n和(n-1)如针对式(III)所定义的；
g)或进行所述式(III)化合物与氢化黄原素的反应，以获得式(IVb)化合物：
其中PG、Bn、B(n-1)以及所述核糖n和(n-1)如针对式(III)所定义的。
方面7.根据方面6所述的方法，其进一步包括以下步骤：
h)将所述式(IVa)化合物或所述式(IVb)化合物裂解并脱保护以获得式(V)化合物：
其中PG、Bn、B(n-1)以及所述核糖n和(n-1)如针对式(III)所定义的。
方面8.根据方面6所述的方法，其进一步包括以下步骤：
将所述式(IVa)化合物脱保护以提供式(VIa)化合物，
其中Bn、B(n-1)以及所述核糖n和(n-1)如针对式(III)所定义的；
然后将如上文所定义的式(I)化合物或5'-O-保护的核糖核苷亚磷酰胺在偶联剂存在下偶联至所述式(VIa)化合物的脱保护的C5'-OH；或者
将所述式(IVb)化合物脱保护以提供式(VIb)化合物，
其中Bn、B(n-1)以及所述核糖n和(n-1)如针对式(III)所定义的；
然后将如上文所定义的式(I)化合物或5'-O-保护的核糖核苷亚磷酰胺在偶联剂存在下偶联至所述式(VIb)化合物的脱保护的C5'-OH；或者
将所述式(III)化合物脱保护，以提供下式的化合物
其中Bn、B(n-1)以及所述核糖n和(n-1)如针对式(III)所定义的；
然后将如上文所定义的式(I)化合物或5'-O-保护的核糖核苷亚磷酰胺在偶联剂存在下偶联至式(VIc)化合物的脱保护的C5'-OH。
方面9.根据方面5所述的方法，其进一步包括以下步骤：
i)进行所述式(III)化合物的全局硫化，然后是裂解和脱保护以获得式(V)化合物的步骤：
方面10.根据方面2至9中任一项所述的方法，其中所述偶联剂是氯磷酸二烷酯、优选地氯磷酸二乙酯与吡啶的组合。
方面11.一种硫代膦酸酯单酯，其选自由以下项组成的组：
其中PG'为氨基保护基并且R5为H或羟基保护基。
方面12.一种硫代膦酸酯单酯盐，其选自由以下项组成的组：
其中PG'为氨基保护基，M+为单价阳离子，并且R5为H或羟基保护基。
实例
现在将通过以下实例说明本发明，所述实例不具有限制性。
DMTr-LNA-5MeCBz-H-硫代膦酸三乙铵盐
通过从吡啶共蒸发一次来干燥亚磷酸三乙铵(1.9g，11.4mmol)和DMTr-LNA-5-MeCBz(9.97g，14.8mmol，1.3当量)。将残余物溶解在乙腈(47.5mL，25vol)和吡啶(9.5mL，5vol)中。在冰上冷却溶液并加入特戊酰氯(1.6mL，1.15当量)。搅拌20分钟后，加入硫(727mg，2当量)，并将反应在室温下搅拌1小时。用10mL 1M TEAB(碳酸氢三乙铵)淬灭反应并蒸发。将残余物溶解在50mL DCM中并用50mL 1M TEAB洗涤。将有机相蒸发并在100g Biotage HC二氧化硅柱上进行色谱法分析，其中首先用DCM:MeCN 3:1来洗脱杂质和残余的核苷、然后用MeOH(0％-5％)的DCM溶液来洗脱产物。将产物级分蒸发并溶解在50％ MeOH(水溶液)中并应用于120g Biotage C18 RP柱。用50％-100％梯度的MeOH水溶液洗脱柱。在约80％ MeOH下洗脱的产物。将产物级分合并、浓缩以除去大部分甲醇并用3*50mL DCM萃取，从而加入1MTEAB以帮助分离。蒸发合并的有机相，然后与MeCN共蒸发。产量为4.5g白色泡沫(51％，基于亚磷酸三乙铵)。
31P-NMR(202MHz,CD3CN,δ以ppm为单位)53.32和52.50(1JPH＝578.0和571.5Hz,d；3JPH＝10.5和9.2Hz,d)；1H-NMR(500MHz,CD3CN,δ以ppm为单位)(由于P-非对映体的存在而导致一些信号的多样性)13.3(br s,1H),11.2(br s,1H),8.37-8.20(br 2s,2H),7.95和7.94(1JPH＝578.0和571.5Hz,1H),7.94和7.87(2s,1H),7.63-7.25(m,12H),6.96-6.90(m,4H),5.63(s,1H),5.06和4.87(2d,J＝10.6和9.20Hz,1H),4.63和4.60(2s,1H),3.93-3.81(m,2H),3.80(s,6H),3.61-3.48(m,2H),3.01(q,J＝7.27Hz,6H),1.87和1.86(2s,3H),1.20(t,J＝7.25Hz,9H)；LC-MS ESI(m/z)C39H37N3O9PS(M–TEAH+)计算值754.2,实测值754.2
DMTr-LNA-ABz-H-硫代膦酸三乙铵盐
通过从吡啶共蒸发一次来干燥亚磷酸三乙铵(1.74g，10.4mmol)和DMTr-LNA-ABz(9.28g，13.5mmol，1.3当量)。将残余物溶解在乙腈(43.5mL，25vol)和吡啶(8.7mL，5vol)中。在冰上冷却溶液并加入特戊酰氯(1.46mL，1.15当量)。搅拌20分钟后，加入硫(666mg，2当量)，并将反应在室温下搅拌1小时。用10mL 1M TEAB(碳酸氢三乙铵)淬灭反应并蒸发。将残余物溶解在50mL DCM中并用50mL 1M TEAB洗涤。将有机相蒸发并在100g Biotage HC二氧化硅柱上进行色谱法分析，其中首先用DCM:MeCN 3:1来洗脱杂质和残余的核苷、然后用MeOH(0％-5％)的DCM溶液来洗脱产物。将产物级分蒸发并溶解在50％ MeOH(水溶液)中并应用于120g Biotage C18 RP柱。用50％-100％梯度的MeOH水溶液洗脱柱。在约70％ MeOH下洗脱的产物。将产物级分合并、浓缩以除去大部分甲醇并用3*50mL DCM萃取，从而加入1MTEAB以帮助分离。蒸发合并的有机相，然后与MeCN共蒸发。产量为6.5g白色泡沫(73％，基于亚磷酸三乙铵)。
31P-NMR(202MHz,CD3CN,δ以ppm为单位)53.43和52.23(1JPH＝579.4和574.8Hz,d；3JPH＝10.5和8.9Hz,d)；1H-NMR(500MHz,CD3CN,δ以ppm为单位)(由于P-非对映体的存在而导致一些信号的多样性)11.0(br s,1H),9.51(br s,1H),8.71(br s,1H),8.59和8.50(2s,1H),8.03(br,2H),),7.94和7.91(1JPH＝575.0和579Hz,1H),7.67-7.21(m,12H),6.91-6.85(m,4H),6.16和6.15(2s,1H),5.19和5.06(2d,1JPH＝10.2和8.3Hz,1H),4.94和4.91(2s,1H),4.16-3.95(m,2H),3.77(s,6H),3.61-3.44(m,2H),2.95(q,1JPH＝7.3Hz,6H),1.15(t,1JPH＝7.3Hz,9H)；LC-MS ESI(m/z)C39H35N5O8PS(M–TEAH+)计算值764.2,实测值764.2
DMTr-LNA-T-H-硫代膦酸三乙铵盐
通过从吡啶共蒸发一次来干燥亚磷酸三乙铵(1.9g，11.4mmol)和DMTr-LNA-T(8.46g，14.8mmol，1.3当量)。将残余物溶解在乙腈(47.5mL，25vol)和吡啶(9.5mL，5vol)中。在冰上冷却溶液并加入特戊酰氯(1.6mL，1.15当量)。搅拌20分钟后，加入硫(727mg，2当量)，并将反应在室温下搅拌1小时。用10mL 1M TEAB(碳酸氢三乙铵)淬灭反应并蒸发。将残余物溶解在50mL DCM中并用50mL 1M TEAB洗涤。将有机相蒸发并在100g Biotage HC二氧化硅柱上进行色谱法分析，其中首先用DCM:MeCN 3:1来洗脱杂质和残余的核苷、然后用MeOH(0％-5％)的DCM溶液来洗脱产物。将产物级分蒸发并溶解在40％ MeOH(水溶液)中并应用于120g Biotage C18 RP柱。用40％-100％梯度的MeOH水溶液洗脱柱。在约50％ MeOH下洗脱的产物。将产物级分合并、浓缩以除去大部分甲醇并用3*50mL DCM萃取，从而加入1MTEAB以帮助分离。蒸发合并的有机相，然后与MeCN共蒸发。产量为6.6g白色泡沫(75％，基于亚磷酸三乙铵)。
31P-NMR(202MHz,CD3CN,δ以ppm为单位)53.38和53.06(1JPH＝573.3和578.3Hz,d；3JPH＝9.2和9.7Hz,d)；1H-NMR(500MHz,CD3CN,δ以ppm为单位)(由于P-非对映体的存在而导致一些信号的多样性)10.8(br s,1H),10.0和9.72(2s,1H),8.04和7.95(1JPH＝573.0和578Hz,1H),7.71-7.24(m,10H),6.97-6.88(m,4H),5.57和5.55(2d,1H),5.02和4.90(2d,1JPH＝9.8和9.2,1H),4.59和4.57(2s,1H),3.89-3.80(m,2H),3.79(s,6H),3.57-3.41(m,2H),3.05(q,1JPH＝7.3Hz,6H),1.66-1.63(m,3H),1.21(t,1JPH＝7.3Hz,9H)；LC-MS ESI(m/z)C32H32N2O9PS(M–TEAH+)计算值651.7,实测值652.2
DMTr-LNA-Gib-H-硫代膦酸三乙铵盐
通过从吡啶共蒸发来干燥亚磷酸三乙铵(1.9g，11.4mmol)和DMTr-LNA-Gib(9.86g，14.8mmol，1.3当量)。将残余物溶解在乙腈(47.5mL，25vol)和吡啶(9.5mL，5vol)中。在冰上冷却溶液并加入特戊酰氯(1.6mL，1.15当量)。搅拌20分钟后，加入硫(727mg，2当量)，并将反应在室温下搅拌1小时。用10mL 1M TEAB(碳酸氢三乙铵)淬灭反应并蒸发。将残余物溶解在50mL DCM中并用50mL 1M TEAB洗涤。将有机相蒸发并在100g Biotage HC二氧化硅柱上进行色谱法分析，其中首先用DCM:MeCN 3:1来洗脱杂质和残余的核苷、然后用MeOH(0％-5％)的DCM溶液来洗脱产物。将产物级分蒸发并溶解在50％ MeOH(水溶液)中并应用于120gBiotage C18 RP柱。用50％-100％梯度的MeOH水溶液洗脱柱。在约80％ MeOH下洗脱的产物。将产物级分合并、浓缩以除去大部分甲醇并用3*50mL DCM萃取，从而加入1M TEAB以帮助分离。蒸发合并的有机相，然后与MeCN共蒸发。产量为5.5g白色泡沫(56％，基于亚磷酸三乙铵)。
31P-NMR(202MHz,CD3CN,δ以ppm为单位)52.18和51.98(1JPH＝576.9和572.2Hz,d；3JPH＝10.4和10.0Hz,d)；1H-NMR(500MHz,CD3CN,δ以ppm为单位)(由于P-非对映体的存在而导致一些信号的多样性)12.0(br s,1H),11.0和10.8(2s,1H),10.4(br s,1H),7.99和7.96(1JPH＝572.0和577Hz,1H),7.98和7.94(2s,1H),7.49-7.20(m,9H),6.90-6.84(m,4H),5.86(2s,1H),5.60和5.54(2d,J＝10.2Hz,1H),4.87(d,J＝7.49Hz,1H),4.11-3.96(m,2H),3.77(s,6H),3.47-3.40(m,2H),3.04(q,J＝7.24Hz,6H),2.84-2.71(m,1H),1.23-1.17(m,15h)；LC-MS ESI(m/z)C36H37N5O9PS(M–TEAH+)计算值746.2,实测值746.3
寡核苷酸合成
使用来自安发玛西亚生物技术公司(Amersham Pharmacia Biotech)(思拓凡(Cytiva))的oligopilotTMplus 10合成寡核苷酸。使用载量为405μmol/g的Nittophase HL Unylinker 400在1.2mL柱中以50μmol规模进行合成。再循环回路的容积为约2.5mL。
使用氰乙基亚酰胺和标准模板合成方法引入硫代磷酸酯核苷酸和磷酸酯核苷酸。除了LNA-MeC为0.1M乙腈/THF 3:1外，亚酰胺被制备为0.1M乙腈溶液。
使用含有0.3M吡啶的0.1M H-硫代膦酸酯单酯/乙腈溶液引入二硫代磷酸酯核苷酸。使用0.2M氯磷酸二乙酯/乙腈作为H-硫代膦酸酯单酯的偶联剂。使用硫代烷基化剂2-(2-氰乙基)硫基-1H-异吲哚-1,3-(2H)-二酮作为含有0.5M吡啶的0.1M乙腈溶液。
使用含3％ DCA的甲苯进行脱三苯甲基化。使用0.3M BTT(5-(苄基硫基)-1H-四唑)作为亚酰胺活化剂。使用3当量的亚酰胺以及v/v比例为1.5:1的活化剂和亚酰胺进行亚酰胺偶联，采用的DNA再循环时间为2.5分钟并且LNA再循环时间为5分钟。用0.1M氢化黄原素(3-氨基-1,2,4-二噻唑-5-硫酮)在乙腈/吡啶1:1中的溶液进行亚磷酸三酯的硫化，使用的接触时间为5分钟。使用0.05M含碘的9:1吡啶/水进行亚磷酸三酯的氧化，使用的接触时间为5分钟。使用1/1比例的20％ N-甲基咪唑乙腈溶液比20％乙酸酐和30％二甲基吡啶乙腈溶液进行封端1分钟。
对于二硫代磷酸酯键，使用3当量的单酯和v/v比例为1:1的单酯/偶联剂以及6分钟的再循环进行偶联。使用3当量的硫代烷基化剂和3分钟的再循环将H-硫代膦酸酯二酯硫代烷基化。
使用10分钟的流通和50分钟的再循环用含20％ DEA的乙腈将氰乙基基团脱保护。
使用浓氨水在55℃下进行15小时的最终支持物裂解和核碱基脱保护。过滤支持物并用水洗涤。分析滤液的OD测量值和全长产物FLP面积百分比(DMT-on，260nm处)。用HRMS测量FLP峰中的脱硫量(O而不是S，-16amu)。
PS2指二硫代磷酸酯，并且PO指相邻核苷之间的磷酸酯键，所有其他核苷间键都是硫代磷酸酯
A、T、G、mC指LNA核苷
a、t、g、c指DNA核苷。
序列表
<110> 豪夫迈·罗氏有限公司(F. Hoffmann-La Roche AG)
<120> 二硫代磷酸酯寡核苷酸的新颖合成
<130> 22581YY00
<150> EP20212441.8
<151> 2020-12-08
<160> 12
<170> PatentIn 版本 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA/LNA 序列
<220>
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<223> LNA 核苷
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<212> DNA
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<223> DNA/LNA 序列
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<220>
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<223> LNA 核苷
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<223> 硫代磷酸酯键
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<221> 硫代磷酸酯
<222> (1)..(17)
<223> 硫代磷酸酯键
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<221> LNA
<222> (16)..(20)
<223> LNA 核苷
<220>
<221> PS2
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<223> 二硫代磷酸酯键
<220>
<221> 硫代磷酸酯
<222> (17)..(20)
<223> 硫代磷酸酯键
<400> 8
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<220>
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<210> 10
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<223> DNA/LNA 序列
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<221> LNA
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<223> LNA 核苷
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Claims (12)
1.式(I)化合物：
用于制备包含至少一个二硫代磷酸酯核苷间键的寡核苷酸的用途，
其中PG为羟基保护基，Bn为核碱基，所述核碱基可以是天然或非天然的，并且其中核糖n在其环的2'位置处被修饰。
2.根据权利要求1所述的用途，其中核糖n的2'位置处的修饰选自由以下项组成的组：锁核酸(LNA)修饰、受约束的乙基(cET)修饰、2'-O-甲氧基乙基(2'-O-MOE)修饰、2'-O-甲基修饰和2'-氟修饰、优选地LNA修饰。
3.根据前述权利要求中任一项所述的用途，其用于制备包含至少一个二硫代磷酸酯和至少一个硫代磷酸酯核苷间键的寡核苷酸。
4.根据前述权利要求中任一项所述的用途，其用于制备包含至少一个二硫代磷酸酯、至少一个硫代磷酸酯和/或至少一个磷酸二酯核苷间键的寡核苷酸。
5.一种用于制备含有至少一个二硫代磷酸酯核苷间键的寡核苷酸的方法，所述方法包括以下步骤：
a)将式(I)化合物：
其中在式(I)中，PG为羟基保护基，Bn为核碱基，所述核碱基可以是天然或非天然的，并且其中核糖n在其环的2'位置处被修饰，
与式(II)化合物：
其中在式(II)中，B(n-1)为核碱基，所述核碱基可以是天然或非天然的，并且其中核糖(n-1)可以在其环的2'位置处未被修饰或被修饰，
在偶联剂存在下偶联，以获得式(III)化合物：
6.根据权利要求5所述的方法，其进一步包括以下步骤：
b)在与磷原子结合的氢处进行所述式(III)化合物的硫代烷基化，以获得式(IVa)化合物：
其中R1为氰基烷基，并且其中PG、Bn、B(n-1)以及所述核糖n和(n-1)如针对式(III)所定义的；
c)或进行所述式(III)化合物与氢化黄原素的反应，以获得式(IVb)化合物：
其中PG、Bn、B(n-1)以及所述核糖n和(n-1)如针对式(III)所定义的。
7.根据权利要求6所述的方法，其进一步包括以下步骤：
d)将所述式(IVa)化合物或所述式(IVb)化合物裂解并脱保护以获得式(V)化合物：
其中PG、Bn、B(n-1)以及所述核糖n和(n-1)如针对式(III)所定义的。
8.根据权利要求6所述的方法，其进一步包括以下步骤：
将所述式(IVa)化合物脱保护以提供式(VIa)化合物，
其中Bn、B(n-1)以及所述核糖n和(n-1)如针对式(III)所定义的；
然后将如上文所定义的式(I)化合物或5'-O-保护的核糖核苷亚磷酰胺在偶联剂存在下偶联至所述式(VIa)化合物的脱保护的C5'-OH；或者
将所述式(IVb)化合物脱保护以提供式(VIb)化合物，
其中Bn、B(n-1)以及所述核糖n和(n-1)如针对式(III)所定义的；
然后将如上文所定义的式(I)化合物或5'-O-保护的核糖核苷亚磷酰胺在偶联剂存在下偶联至所述式(VIb)化合物的脱保护的C5'-OH；或者
将所述式(III)化合物脱保护，以提供下式的化合物
其中Bn、B(n-1)以及所述核糖n和(n-1)如针对式(III)所定义的；
然后将如上文所定义的式(I)化合物或5'-O-保护的核糖核苷亚磷酰胺在偶联剂存在下偶联至式(VIc)化合物的脱保护的C5'-OH。
9.根据权利要求5所述的方法，其进一步包括以下步骤：
e)进行所述式(III)化合物的全局硫化，然后是裂解和脱保护以获得式(V)化合物的步骤：
10.根据权利要求2至9中任一项所述的方法，其中所述偶联剂为氯磷酸二烷酯、优选地氯磷酸二乙酯与吡啶的组合。
11.一种硫代膦酸酯单酯，其选自由以下项组成的组：
其中PG'为氨基保护基并且R5为H或羟基保护基。
12.一种硫代膦酸酯单酯盐，其选自由以下项组成的组：
其中PG'为氨基保护基，M+为单价阳离子，并且R5为H或羟基保护基。
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