CN106117289B - 2’-o-moe-3’-h-硫代磷酸酯核苷单体及其合成方法 - Google Patents

2’-o-moe-3’-h-硫代磷酸酯核苷单体及其合成方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了2’‑O‑MOE‑3’‑H‑二硫代磷酸核糖核苷和2’‑O‑MOE‑3’‑H‑单硫代磷酸核糖核苷以及前体化合物，其制备方法及应用，属于糖化学及药物化学领域。其具有通式1、通式2和通式3所示结构：

Description

2’-O-MOE-3’-H-硫代磷酸酯核苷单体及其合成方法
技术领域
本发明属于核苷化学及药物化学领域，具体涉及2’-O-甲氧乙基核苷及其3’-H-二硫代磷酸酯和3’-H-单硫代磷酸酯衍生物，以及相应的制备方法。
背景技术
RNAi技术作为后基因组时代的一种下调基因表达的工具被广泛用作调节基因功能以及疾病治疗的重要手段。小干扰RNA(siRNA)与信使RNA(mRNA)中的同源序列互补结合，导致mRNA失去功能是RNAi的关键步骤。但由于天然RNA在生物体内极易降解，因此改善天然RNA的稳定性是现在siRNA全面走向应用所面临的主要问题。
研究表明，siRNA中糖环的2’-羟基对基因沉默活性没有显著作用，因此对2’-羟基的封闭或替换作为一种重要的方法被广泛用于siRNA的改性研究中，如通过2’-甲氧基或2’-氟取代2’-羟基可显著改善siRNA的酶解稳定性(ChemMedChem,2009,5,328；Mol.Ther.,2006,13,644)。另外用一个硫原子或一个硼基团取代部分磷酸酯上一个非桥氧原子得到单硫代磷酸酯(PS)或硼代磷酸酯也能增加磷酸桥键抵抗核酸酶的能力，不同程度地改善siRNA的稳定性。但是单硫改性和硼改性后的磷原子都具有了手性，进而产生不易拆分的非对映异构体的混合物，使得siRNA的生物化学、生物物理和生物学性质多样化而不稳定。解决此问题的一种有效方法是合成非手性磷的改性RNA。如果用硫取代磷酸酯的全部两个非桥氧原子可以得到核苷酸间二硫代磷酸酯(PS2)键合的RNA(PS2-RNA，如下所示)。
并且PS2-RNA和天然的磷酸二酯键合的RNA相同，PS2-RNA的磷原子也是非手性的。PS2-RNA是天然RNA的生物电子等排体，具有和正常RNA相似的其他生物化学和生物物理性能。另外，对PS2-siRNA的活性研究表明，PS2取代不仅提高稳定性，还可提高siRNA的基因沉默活性，并具有较低的细胞毒性(ACS Chem.Biol.2012,7,1214)。因此通过改造磷酸酯骨架，合成二硫代磷酸酯核苷单体具有很大的应用价值。因此用PS2和2’-取代双重改性的核苷酸单元取代siRNA中的部分核苷酸单元制备PS2-siRNA的研究越来越引起人们的重视。传统合成PS2-RNA使用硫代磷酰亚胺法，而硫代磷酰亚胺单体(三价磷)极不稳定，储存稳定性差，不利于大规模使用。因此，发现用于合成PS2-siRNA的高稳定性的合成单体及合成方法是当务之急。
众所周知，五价磷化合物比三价磷化合物的稳定性高。因此本发明设计合成了可用于H-硫代磷酸酯法合成新型PS2-siRNA的两类磷为五价的硫代磷酸酯核苷单体，即：2’-O-MOE-3’-H-单硫代磷酸核苷和2’-O-MOE-3’-H-二硫代磷酸核苷。该发明对于开发有使用价值的RNAi药物有非常重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供可用于改性PS2-RNA合成的2’-O-MOE-3’-H-单硫代磷酸核苷单体和2’-O-MOE-3’-H-二硫代磷酸核苷单体；另一目的在于提供其制备方法。
为实现此目的，本发明选取三种核糖核苷为原料，通过化学修饰分别得到2’-甲氧乙基(MOE,methoxylethyl)保护的尿嘧啶、胞嘧啶、腺嘌呤和鸟嘌呤核糖核苷；再通过适当的选择性保护，对3’-羟基分别进行H-二硫代磷酸化或H-单硫代磷酸化得到相应的2’-O-MOE-3’-H-二硫代磷酸核糖核苷(通式一)或2’-O-MOE-3’-H-单硫代磷酸核糖核苷(通式二)：
其中：B代表碱基，分别为尿嘧啶，胞嘧啶，腺嘌呤，鸟嘌呤，N4-乙酰基胞嘧啶，N4-苯甲酰基胞嘧啶，N6-苯甲酰基腺嘌呤，N6-乙酰基腺嘌呤，N2-异丁酰基鸟嘌呤，N2-乙酰基鸟嘌呤，N2-苯甲酰基鸟嘌呤；所述碱基B优选尿嘧啶，4-乙酰基胞嘧啶，6-苯甲酰基腺嘌呤，2-异丁酰基鸟嘌呤。
其中R代表氢，三苯甲基(Tr)，4-甲氧基三苯甲基(MMTr)，4,4’-二甲氧基三苯甲基(DMTr，DMT)；所述R优选4,4’-二甲氧基三苯甲基。
制备上述通式一所示化合物的方法是：
将1,2,4-三氮唑和有机碱溶于有机溶剂中，置于冰浴中氮气保护下搅拌，加入PCl3，搅拌，然后滴加通式三所示化合物溶液，滴加完毕移去冰浴常温搅拌，然后向反应体系中通入H2S气体，反应结束后吹氮气将多余的H2S移除，浓缩反应液得黄色固体，再用二氯甲烷和饱和的碳酸氢三乙胺盐萃取分层，合并油相，干燥过夜，柱分离得通式1所示化合物。
其中，所说的有机碱是二异丙基乙胺，三乙胺，二乙胺，吗啉，N-甲基吗啉，吡啶，4-二甲胺基吡啶中的一种或两种。
其中，所说的有机溶剂是乙腈，N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，二甲亚枫(DMSO)，二氯甲烷，氯仿，四氢呋喃中的一种。
制备上述通式二所示化合物的方法是：
将通式三所示化合物与次磷酸三乙胺盐混合用无水吡啶减压带水两次，用无水吡啶溶解并氮气保护下置于冰浴中搅拌，加入偶合试剂反应，然后移除冰浴，加入升华硫搅拌反应,TLC监测反应完毕后加饱和的碳酸氢三乙胺盐溶液淬灭反应。减压蒸除溶剂得油状物，然后用二氯甲烷与碳酸氢三乙胺盐水溶液萃取分层，再用二氯甲烷萃取，合并有机层，干燥过夜，柱分离得通式二所示化合物。
其中，所说的偶合试剂是氯磷酸二苯酯、特戊酰氯、氯磷酸二(2,6-二甲基苯)酯、氯磷酸二乙酯中的一种。
制备上述通式三所示的嘧啶类核苷化合物的方法是：(1)首先用碳酸二苯酯和无机碱在极性有机溶剂中加热处理尿苷得到2,2’-缩水-1-β-D-阿糖尿苷。所说的无机碱是碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾和碳酸氢钾中的一种或两种；所说的极性有机溶剂是N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、二甲基亚砜中的一种或两种；所说的加热指反应温度在50-150℃。
(2)用有机溶剂稀释2-甲氧乙氧基金属盐，加入2,2’-缩水-1-β-D-阿糖尿苷，加热回流，柱分离得到2’-O-甲氧乙基尿苷(2’-O-MOE-尿苷)。所说的金属盐是镁盐或铝盐，由镁粉或金属铝粉与无水2-甲氧基乙醇加热回流制备；所用有机溶剂为2-甲氧基乙醇或乙二醇二甲醚或二者的混合溶液；回流时间为5-60小时。
(3)2’-O-甲氧乙基尿苷通过糖环羟基的临时保护、嘧啶4位氧转化为氨基得到2’-O-甲氧乙基胞苷；选择性氨基酰化得到2’-O-甲氧乙基-N4-酰基胞苷。
所说的羟基临时保护指采用三甲基氯硅烷使羟基硅烷化，待转化完成后加水去除三甲基硅基；嘧啶4位氧转化为氨基通过1,2,4-三氮唑/三氯氧磷/氨水或三氟乙酸酐/4-硝基苯酚/氨水等方法实现；选择性氨基酰化同样采用三甲基硅烷临时保护羟基，通过酰氯或酸酐酰化氨基来实现。
(4)2’-O-甲氧乙基尿苷或2’-O-甲氧乙基-N4-酰基胞苷与三苯甲基氯或甲氧基取代的三苯甲基氯反应，选择性保护5’-羟基得到通式三所示的选择性保护的嘧啶核苷。
制备上述通式3所示的嘌呤类核苷化合物的方法是：
(1)将腺苷或2-氨基腺苷在碱的存在下与2-溴乙基甲基醚作用，柱层析分离得到2’-O-MOE-腺苷或2’-O-MOE-2-氨基腺苷。2’-O-MOE-腺苷选择性氨基酰化生成2’-O-MOE-N6-酰基腺苷。其中，所述的碱为氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钾、氢化钠、氢化钾、叔丁醇钾和叔丁醇钠的一种。
(2)2’-O-MOE-2-氨基腺苷经选择性酰基保护得2’-O-MOE-N2-酰基-2-氨基腺苷，重氮化反应将6-氨基转化为羟基得2’-O-MOE-N2-酰基鸟苷。其中，氨基的选择性酰化所用的酰化试剂是苯甲酰氯、苯甲酸酐、乙酰氯、乙酸酐、异丁酰氯或异丁酸酐中一种；酰化反应温度为-30℃-50℃。6-氨基的重氮化转化使用亚硝酸钠/冰醋酸体系。
(3)2’-O-MOE-N6-酰基腺苷或2’-O-MOE-N2-酰基鸟苷进一步与三苯甲基氯或甲氧基取代的三苯甲基氯反应，选择性保护5’-羟基得到通式三所示的选择性保护的腺苷或鸟苷。
本发明的优点在于：
1、本发明为制备二硫代磷酸酯改性的核酸(PS2-RNA)提供了储存稳定性高的H-单硫代和H-二硫代磷酸核苷单体。
2、本发明根据siRNA的结构性能特点，针对性地将对siRNA的基因沉默活性无贡献的核苷2’-羟基改性，在2’-羟基上引入MOE保护基，同时在3’-位引入H-硫代磷酸酯基，首次得到2’,3’-双改性的储存稳定性高的H-单硫代和H-二硫代磷酸核苷单体。该类型单体用于合成改性RNA(PS2-RNA)可提高目标PS2-RNA的稳定性进而改善siRNA的基因沉默活性。
3、本发明提供的制备双改性H-单硫代和H-二硫代磷酸核苷的方法收率高、操作简单，适合规模化生产。
4、该类化合物也可作为抗肿瘤、抗病毒药物；或作为制备抗肿瘤、抗病毒药物的先导物使用。
具体实施方式
为对本发明进行更好地说明，举实施例如下：
实施例一：
2’-O-MOE-腺苷的合成
将腺苷(7.0g，1eq)溶于200mL无水DMF中，冰浴并氮气保护下加入纯度为60％的NaH(1.6g,1.5eq),充分搅拌30min后，逐滴滴加2-溴乙基甲基醚溶液(2.9mL,1.2eq)，30min后移出冰浴至室温搅拌8h。反应结束后加入冰水5mL搅拌10min,浓缩反应液，硅胶柱层析分离得2’-O-MOE-腺苷1.7g,产率20.3％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ8.39(s,1H),8.15(s,1H),7.38(s,2H),6.00(d,J＝6.3Hz,1H),5.45(d,J＝2.3Hz,1H),5.16(d,J＝4.9Hz,1H),4.56(d,J＝1.1Hz,1H),4.33(d,J＝3.0Hz,1H),3.99(d,J＝3.1Hz,1H),3.76–3.63(m,2H),3.63–3.49(m,2H),3.38(t,J＝4.7Hz,2H),3.13(s,3H).13C NMR(101MHz,DMSO-d6):δ156.6,152.9,149.5,140.3,119.8,86.8,86.6,81.6,71.6,69.5,69.4,62.0,58.4.
2’-O-MOE-N6-Bz-腺苷的合成
取化合物2’-O-MOE-腺苷(2.0g，1eq)，用无水吡啶7mL带水两次，加10mL无水吡啶使其溶解，氮气保护下置于冰浴中搅拌20min，加三甲基氯硅烷(4.7mL，8eq)，再搅拌60min后加苯甲酰氯(1.1mL，1.5eq)，继续搅拌120min，移出冰浴室温搅拌30min,然后再移入冰浴10min后，加冰水3mL，搅拌30min后再加浓氨水5mL室温搅拌30min。浓缩反应液用二氯甲烷和饱和食盐水分层，二氯甲烷相用无水硫酸钠干燥过夜，浓缩、柱层析分离得产物2.3g,产率87.1％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ11.25(s,1H),8.77(d,J＝8.8Hz,2H),8.06(d,J＝7.3Hz,2H),7.71–7.51(m,3H),6.17(d,J＝5.8Hz,1H),5.24(d,J＝5.1Hz,1H),5.19(s,1H),4.62(t,J＝5.3Hz,1H),4.38(d,J＝3.8Hz,1H),4.02(d,J＝3.7Hz,1H),3.83–3.68(m,2H),3.62(dd,J＝10.6,5.2Hz,2H),3.42(t,J＝4.7Hz,2H),3.15(s,3H).13C NMR(101MHz,DMSO-d6):δ167.9,151.9,150.4,143.0,132.4,131.2,128.5,128.2,127.4,125.8,86.1,85.8,81.3,71.1,68.9,61.1,58.0.
5’-O-DMT-2’-O-MOE-N6-Bz-腺苷(B为N6-苯甲酰基腺嘌呤，R为DMT时通式三所示化合物)的合成
取化合物2’-O-MOE-N6-Bz-腺苷(1.5g，1eq)，用无水吡啶4mL带水两次，加适量的无水吡啶7mL使其溶解，氮气保护常温搅拌30min后加4,4'-二甲氧基三苯基氯甲烷(DMTr-Cl)(1.3g，1.1eq)，继续搅拌4h后用无水甲醇淬灭反应，浓缩反应液，用二氯甲烷和5℃0.05M碳酸氢钠溶液分层，二氯甲烷萃取2次，合并有机相用无水硫酸钠干燥过夜，浓缩，柱层析分离得产物2.2g,产率86.1％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.26(s,1H),8.75(s,1H),8.25(s,1H),8.06(d,J＝7.4Hz,2H),7.68–7.19(m,14H),6.83(d,J＝8.8Hz,4H),6.22(d,J＝5.1Hz,1H),4.77(t,J＝4.9Hz,1H),4.51(t,J＝4.4Hz,1H),4.32(d,J＝3.7Hz,1H),4.01–3.90(m,1H),3.80(s,7H),3.66–3.57(m,2H),3.52(d,J＝2.7Hz,2H),3.38(s,3H).
5’-O-DMT-2’-O-MOE-3’-H-二硫代磷酸酯-N6-Bz-腺苷(B为N6-苯甲酰基腺嘌呤，R为DMT时通式一所示化合物)的合成
将1,2,4-三氮唑(1.74g，8eq)和N-甲基吗啉用无水二氯甲烷8mL溶解，然后置于冰浴中氮气保护搅拌10min，加入PCl3(0.55mL，2eq)搅拌30min，滴加含2.3g 5’-O-DMT-2’-O-MOE-N6-Bz-腺苷(1eq)的无水二氯甲烷溶液7mL，滴加完毕置于常温搅拌40min，然后通H2S气体10min，用氮气将多余的H2S移除，浓缩反应液得黄色固体，再用二氯甲烷和饱和的碳酸氢三乙胺盐溶液萃取，有机相用无水硫酸钠干燥过夜，柱分离的目标物1.7g,产率65.0％。1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.27(s,1H),9.29(s,1H),8.60(d,J＝15.3Hz,2H),8.06(d,J＝7.5Hz,2H),7.42(m,12H),6.84(dd,J＝8.9,3.2Hz,4H),6.16(d,J＝6.8Hz,1H),5.37–5.21(m,1H),5.09–4.95(m,1H),4.51(s,1H),3.88(T,J＝10.8,4.4Hz,1H),3.73(s,6H),3.67–3.55(m,2H),3.45–3.38(m,2H),3.27(dd,J＝10.2,3.5Hz,1H),3.15–3.04(m,9H),1.17(t,J＝7.3Hz,9H).31P NMR(162MHz,DMSO-d6)δ85.22.HRMS:calcd.for C38H43N5O9PS2 -:808.2245,found:m/z 808.2256[M-H]-.
5’-O-DMT-2’-O-MOE-3’-H-单硫代磷酸酯-N6-Bz-腺苷(B为N6-苯甲酰基腺嘌呤，R为DMT时通式二所示化合物)的合成
将5’-O-DMT-2’-O-MOE-N6-Bz-腺苷(2.6g，1.5eq)与次磷酸三乙胺盐(0.4g，1eq)混合用无水吡啶带水两次后，用无水吡啶溶解，并氮气保护置于冰浴中搅拌，10min后加入特戊酰氯(0.35mL，1.2eq),约30min后移除冰浴加入升华硫(85mg，1.1eq)搅拌1h,TLC监测反应完毕后加饱和的碳酸氢三乙胺盐淬灭反应。减压蒸出溶剂呈油状，然后用二氯甲烷与碳酸氢三乙胺盐水溶液萃取3次，收集有机层用无水硫酸钠干燥过夜，柱分离(三乙胺：乙酯：甲醇＝0.5：89。5:10)得淡黄色固体1.8g,产率，88.5％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.24(s,1H),9.28(s,1H),8.61(dd,J＝18.5,4.2Hz,2H),8.05(d,J＝7.4Hz,2H),7.72–7.15(m,12H),6.83(dd,J＝8.1,4.2Hz,4H),6.16(d,J＝6.2Hz,1H),5.14(m,1H),4.98(d,J＝5.3Hz,1H),4.38(d,J＝12.5Hz,1H),3.78(s,1H),3.75-3.68(m,6H),3.61(s,2H),3.29–3.20(m,3H),3.08(m,9H),1.19(t,J＝7.2Hz,9H).31P NMR(162MHz,DMSO-d6)δ49.99,49.37.HRMS:calcd.for C38H43N5O10PS-:792.2474,found:m/z792.2473[M-H]-.
实施例二：
2’-O-MOE-2-氨基-腺苷的合成
取2-氨基腺苷(7g，1.0eq)溶于无水DMF(200mL)中，冰浴并氮气保护下搅拌30min，加60％的NaH(1.5g,1.5eq),搅拌30min后逐滴滴加2-溴乙基甲基醚(MOE-Br)(2.8mL，1.2eq)，继续搅拌30min后移出冰浴，室温搅拌8h。再加冰水5mL,搅拌10min,浓缩反应液，进行柱层析分离得目标物2.9g,产率34.4％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ7.96(s,1H),6.83(s,2H),5.48(dd,J＝6.5,4.9Hz,1H),5.09(d,J＝4.7Hz,1H),4.46(dd,J＝6.5,5.0Hz,1H),4.27(d,J＝2.4Hz,1H),3.94(d,J＝2.7Hz,1H),3.64(ddd,J＝12.0,9.6,5.1Hz,2H),3.54(dd,J＝10.1,5.4Hz,2H),3.44–3.38(m,2H),3.16(s,3H).13C NMR(101MHz,DMSO-d6):δ160.6,156.7,151.9,136.5,113.9,86.5,85.5,81.3,71.5,69.6,69.3,62.1,58.5.
2’-O-MOE-N2-iBu-2-氨基腺苷的合成
取化合物2’-O-MOE-2-氨基腺苷(2g，1eq)，用无水吡啶5mL带水两次，然后加无水吡啶10mL使其溶解，氮气保护并冰浴中搅拌20min，加三甲基氯硅烷(TMS-Cl)(3.7mL，5eq)，搅拌1h后将温度调至-10℃，搅拌20min后加异丁酸酐(1mL，1.1eq)，继续搅拌2h，然后移出冰浴至室温在搅拌1h，然后再移入冰浴，加冰水3mL，搅拌30min后再加浓氨水5mL室温搅拌30min。浓缩反应液用二氯甲烷和饱和碳酸氢钠分层，油相用无水硫酸钠干燥6h，浓缩，柱层析分离得产物1.8g,产率74.6％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.86(s,1H),8.29(s,1H),7.25(s,2H),5.94(d,J＝6.1Hz,1H),5.12(d,J＝4.6Hz,1H),5.07(m,1H),4.54(t,J＝5.1Hz,1H),4.32(s,1H),3.94(s,1H),3.76–3.47(m,4H),3.41(m,2H),3.15(s,3H),2.85(m,1H),1.07(s,6H).13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ175.5,156.6,153.3,150.8,139.2,116.7,86.4,85.4,81.5,71.5,69.4,61.9,58.4,34.6,19.83,19.81.
2’-O-MOE-N2-iBu-鸟苷的合成
将2’-O-MOE-N2-iBu-2-氨基腺苷(0.9g，1eq)用8mL冰醋酸溶解，然后加2mL的水和NaNO2(1.5g，10eq)，室温搅拌24h，加10mL正丁醇稀释反应液，减压浓缩得到黄色固体，柱层析分离得目标物0.68g,产率75.6％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.09(s,1H),11.70(s,1H),8.28(s,1H),5.91(d,J＝5.9Hz,1H),5.11(d,J＝22.0Hz,2H),4.43(s,1H),4.30(s,1H),3.94(s,1H),3.70(d,J＝10.5Hz,1H),3.63–3.48(m,3H),3.40(s,2H),3.16(s,3H),2.87–2.68(m,1H),1.13(s,6H).13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ180.6,155.3,149.4,148.7,138.0,120.5,86.5,84.9,82.0,71.6,69.4,65.4,61.7,58.5,35.2,19.3,15.6.
5’-O-DMT-2’-O-MOE-N2-iBu-鸟苷的合成
取化合物2’-O-MOE-N2-iBu-鸟苷(2.5g，1.0eq)，用无水吡啶(每次10mL)带水两次，加15mL无水吡啶使其溶解，加入4,4'-二甲氧基三苯基氯甲烷(DMTr-Cl)(2.3g，1.1eq)，氮气保护下常温搅拌4h后用无水甲醇淬灭反应，浓缩反应液，用二氯甲烷和饱和碳酸氢钠分层，有机相用无水硫酸钠干燥过夜，浓缩，柱层析分离得产物3.6g,产率83％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ11.95(s,1H),7.82(s,1H),7.71(s,1H),7.54(d,J＝7.4Hz,2H),7.39(dd,J＝8.8,2.2Hz,3H),7.30–7.19(m,4H),6.80(t,J＝8.9Hz,4H),5.87(d,J＝7.2Hz,1H),4.99–4.84(m,1H),4.48(d,J＝3.3Hz,1H),4.21(s,1H),3.87(d,J＝11.5Hz,1H),3.77(d,J＝5.2Hz,6H),3.72–3.64(m,1H),3.56(dd,J＝16.6,8.4Hz,2H),3.46(d,J＝10.7Hz,1H),3.36(s,3H),3.13(dd,J＝10.7,3.1Hz,1H),1.64(dt,J＝13.7,6.8Hz,1H),0.92(d,J＝6.8Hz,3H),0.73(d,J＝6.9Hz,3H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ178.2,158.8,155.4,148.2,147.1,145.0,139.0,136.1,135.7,130.0,128.1,128.0,127.1,122.5,113.3,86.4,86.3,84.5,81.4,71.8,70.0,69.4,63.8,59.0,55.3,36.1,18.54,18.46.
5’-O-DMT-2’-O-MOE-3’-H-二硫代磷酸酯-N2-iBu-鸟苷(B为N2-异丁酰基鸟嘌呤，R为DMT时通式一所示化合物)的合成
将1,2,4-三氮唑(1.6g，8eq)和N-甲基吗啉(3.1mL，10eq)用10mL无水二氯甲烷溶解，冰浴及氮气保护下搅拌10min，加PCl3(0.5mL，2eq)继续搅拌30min，滴加含2.0g 5’-O-DMT-2’-O-MOE-N2-iBu-鸟苷的无水二氯甲烷溶液7mL，常温搅拌40min，然后通H2S气体10min，用氮气置换出多余的H2S气体，浓缩反应液得黄色固体，再用二氯甲烷和饱和的碳酸氢三乙胺盐分层，再用二氯甲烷萃取一次，合并有机相无水硫酸钠干燥过夜，柱层析分离得目标物1.3g,产率57.2％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.04(s,1H),11.85(s,1H),9.27(s,1H),8.05(s,1H),7.38(d,J＝7.2Hz,2H),7.25(dd,J＝8.8,2.1Hz,7H),6.95–6.75(m,4H),6.01(d,J＝7.8Hz,1H),5.22(dd,J＝14.3,4.0Hz,1H),4.74(dd,J＝7.7,4.6Hz,1H),4.40(s,1H),3.80(dd,J＝10.1,5.8Hz,1H),3.74(s,6H),3.61–3.53(m,1H),3.44–3.35(m,4H),3.14(s,3H),3.03(d,J＝6.8Hz,6H),2.81–2.65(m,1H),1.22–1.10(m,15H)；31P NMR(162MHz,DMSO-d6)δ84.97.HRMS:calcd.for C38H43N5O9PS2 -:808.2245,found:m/z 808.2247[M-H]-.
5’-O-DMT-2’-O-MOE-3’-H-单硫代磷酸酯-N2-iBu-鸟苷(B为N2-异丁酰基鸟嘌呤，R为DMT时通式二所示化合物)的合成
将5’-O-DMT-2’-O-MOE-N2-iBu-鸟苷(2.0g，1.5eq)与次磷酸三乙胺盐(0.31g，1eq)混合，用无水吡啶5mL带水两次后，用无水吡啶10mL溶解，并氮气保护下冰浴中搅拌10min，加入特戊酰氯(0.3mL，1.2eq),约30min后移除冰浴，加入升华硫(66mg，1.1eq)搅拌1h,TLC监测反应完毕后加饱和的碳酸氢三乙胺盐淬灭反应。减压浓缩得油状物，然后用二氯甲烷与碳酸氢三乙胺盐水溶液分层，并用二氯甲烷萃取水相二次，合并有机层，用无水硫酸钠干燥过夜，柱层析分离得淡黄色固体产物。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.03(s,1H),11.81(s,1H),8.60(d,J＝15.9Hz,1H),8.08(s,1H),7.36(d,J＝7.4Hz,2H),7.24(m,7H),6.84(m,4H),6.03(dd,J＝7.2,3.2Hz,1H),5.07(dd,J＝46.0,9.8Hz,1H),4.72(s,1H),4.32(s,1H),3.78(dd,J＝10.0,5.7Hz,1H),3.74(s,6H),3.58(dd,J＝7.4,5.3Hz,1H),3.28(m,2H),3.14(s,3H),3.04(q,J＝7.2Hz,8H),2.80–2.66(m,1H),1.16(m,15H).31P NMR(162MHz,DMSO-d6)δ49.70,49.56.HRMS:calcd.for C38H43N5O10PS-:792.2474,found:m/z 792.2473[M-H]-.
实施例三：
2,2’-缩水-1-β-D-阿糖尿苷的合成
首先将碳酸二苯酯(9.6g,1.1eq)溶于无水N,N-二甲基乙酰胺(8mL)，搅拌，加热到60℃，基本溶解完全后，加入尿苷(10.014g,1eq)和碳酸氢钠(0.172g,0.05eq)，继续升温到100℃，TLC监测反应进程，约3-4h体系中有白色固体出现，呈浑浊状态，5h反应完毕。体系冷却至常温，加乙醚搅拌2h，抽滤得白色固体。该产品无需进一步纯化，直接用于下一步合成。
2’-O-MOE-尿苷的合成
铝粉(3eq)与无水2-甲氧基乙醇(30eq)，先加热回流3h，生成2-甲氧基乙醇铝，然后加入2,2’-缩水-1-β-D-阿糖尿苷粗品(1eq)，加热回流，点板监测反应进程，约50h反应完毕。冷却至室温，向体系中加入适量乙醇和少量水，加热回流30min，在布氏漏斗中垫硅藻土，趁热抽滤，并用乙醇洗滤渣，浓缩滤液，得到褐色粘稠状物质。柱层析分离，得到白色固体粉末状产物。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.36(s,1H),7.94(d,J＝8.1Hz),5.85(d,J＝5.1Hz,1H),5.66(d,J＝8.1Hz,1H),5.15(q,J＝4.7Hz,1H),5.05(d,J＝5.6Hz,1H),4.10(dd,J＝9.9,4.9Hz,1H),3.95(t,J＝5.0Hz,1H),3.86(d,J＝3.8Hz,1H),3.74–3.60(m,3H),3.60-3.52(m,1H),3.45(t,J＝4.7Hz,2H),3.23(s,3H).13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ163.6,151.0,141.0,102.2,86.6,85.5,81.9,71.6,69.4,68.8,61.0,58.6.
5’-O-DMT-2’-O-MOE尿苷的合成
2’-O-MOE-尿苷(1eq)，用无水吡啶带水两次，然后用无水吡啶将将其溶解，氮气保护下，加4,4'-二甲氧基三苯基氯甲烷(DMTr-Cl)(1.1eq)，室温搅拌，TLC监测反应，约4小时反应完全后，减压蒸除溶剂，二氯甲烷溶解，饱和碳酸氢钠洗3次，然后用饱和食盐水洗3次，无水硫酸钠干燥过夜。过滤浓缩滤液，柱层析分离得目标物。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.98(d,J＝8.2Hz,1H),7.41–7.36(m,2H),7.33–7.21(m,7H),6.84(d,J＝8.9Hz,4H),5.96(d,J＝2.4Hz),5.29(d,J＝8.1Hz),4.45(s,1H),4.09(m,2H),4.01(dd,J＝5.0,2.4Hz,1H),3.80(d,J＝0.7Hz,7H),3.61(m,1H),3.57–3.54(m,1H),3.53(dt,J＝4.8,2.4Hz,2H),3.39(s,3H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ163.1,158.7,150.2,144.4,140.1,135.4,135.1,130.2,128.1,127.2,113.3,102.1,87.8,87.1,83.5,83.2,71.7,70.3,68.8,61.6,59.0,55.3.
2’-O-MOE-3’-H-二硫代磷酸酯尿苷(B为尿嘧啶，R为DMT时通式一所示化合物)的合成
以5’-O-DMT-2’-O-MOE-尿苷为原料，制备方法同实施例一中通式一所示化合物的制备。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.50(s,1H),8.12(s,1H),7.95(d,J＝8.2Hz,1H),7.44(d,J＝7.4Hz,2H),7.35–7.26(m,6H),7.22(t,J＝7.2Hz,1H),6.84(dd,J＝9.0,2.4Hz,4H),6.04(d,J＝3.9Hz,1H),5.31(dt,J＝14.5,5.2Hz,1H),5.20(d,J＝8.1Hz,1H),4.47–4.40(m,1H),4.32(t,J＝4.4Hz,1H),3.93(dd,J＝8.1,4.3Hz,2H),3.79(d,J＝0.7Hz,6H),3.65–3.55(m,3H),3.45(dd,J＝10.9,2.0Hz,1H),3.35(s,3H,),3.23(q,J＝7.3Hz,6H),1.35(t,J＝7.3Hz,9H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ163.5,158.6,150.5,144.4,140.5,135.4,135.1,130.3,128.3,128.0,127.0,113.3,102.0,87.5,87.2,82.5,81.8,72.2,71.4,70.3,61.7,59.0,55.2,46.2,8.7.31P NMR(162MHz,CDCl3)δ85.91.HRMS:calcd.for C33H36N2O9PS2 -:699.1605,found m/z:699.1639.
2’-O-MOE-3’-H-单硫代磷酸酯尿苷(B为尿嘧啶，R为DMT时通式二所示化合物)的合成
以5’-O-DMT-2’-O-MOE-尿苷为原料，制备方法同实施例一中通式二所示化合物的制备。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.42(s,1H),8.57(s,1H),7.72(dd,J＝12.9,8.1Hz,1H),7.40(d,J＝7.4Hz,2H),7.28(m,7H),6.90(d,J＝8.7Hz,4H),5.83(t,J＝5.7Hz,1H),5.30–5.19(m,1H),5.09–4.90(m,1H),4.18(d,J＝13.9Hz,2H),3.74(s,6H),3.49–3.42(m,2H),3.34(d,J＝6.3Hz,4H),3.23(s,3H),3.05(q,J＝7.1Hz,6H),1.17(t,J＝7.3Hz,9H).13CNMR(101MHz,DMSO-d6)δ162.9,158.1,150.4,144.5,139.9,135.3,134.9,129.8,127.8,127.8,126.8,113.2,101.5,86.1,81.9,80.0,71.2,69.1,62.2,58.1,55.0,45.5,8.6.31PNMR(162MHz,DMSO-d6)δ49.44,49.12.HRMS:calcd.for C33H36N2O10PS-:683.1834,found m/z:683.1851[M-H]-.
实施例四：
2’-O-MOE-胞苷的合成
将2’-O-MOE-尿苷(1eq)溶于无水乙腈中，室温搅拌，加入(CH3)3SiCl(3eq)，冰浴条件下加N-甲基吡咯(9.6eq)，然后升至室温反应1h，冰浴冷至0℃后逐滴加入(CF3CO)2O(2.5eq)；搅拌30min后向体系中加入4-硝基苯酚(3eq)，0℃继续反应，点板监测反应进程。约3h后，将体系倾入饱和NaHCO3溶液中，用CH2Cl2萃取3次，合并有机相，旋转蒸发溶剂，然后用二氧六环溶解，并加浓氨水，60℃加热搅拌。约24h后，浓缩体系，并用无水乙醇带体系中残留的溶剂。柱层析纯化得黄色固体产物。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.91(d,J＝7.4Hz,1H),7.23(s,2H),5.83(d,J＝3.3Hz,1H),5.72(d,J＝7.4Hz,1H),5.14(t,J＝4.7Hz,1H),5.00(d,J＝5.9Hz,1H),4.04(dd,J＝10.7,5.3Hz,1H),3.81(dd,J＝10.1,5.4Hz,2H),3.71(m,3H),3.59-3.52(m,1H),3.48-3.44(m,2H),3.24(s,3H).13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ165.6,155.1,141.1,93.9,87.2,84.0,81.9,71.1,68.8,68.0,60.1,58.0.
2’-MOE-N4-Ac-胞苷的合成
将2’-O-MOE-胞苷用无水DMF溶解，氮气保护常温搅拌10min,然后加乙酸酐(1.2eq)搅拌10h，加甲苯稀释反应液，减压浓缩，然后用二氯甲烷和饱和碳酸氢钠分层，二氯甲烷再萃取二次，合并有机相用无水硫酸钠干燥过夜，柱层析分离得目标物。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.90(s,1H),8.47(d,J＝7.5Hz,1H),7.20(d,J＝7.5Hz,1H),5.82(d,J＝2.1Hz,1H),5.23(t,J＝4.9Hz,1H),5.03(d,J＝6.5Hz,1H),4.05(dd,J＝11.8,6.7Hz,1H),3.90(d,J＝7.2Hz,1H),3.88–3.82(m,2H),3.75(dd,J＝10.3,5.7Hz,2H),3.64–3.58(m,1H),3.49(t,J＝4.8Hz,2H),3.25(s,3H),2.10(s,3H,).13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ171.5,162.9,155.0,145.6,95.7,88.8,84.6,82.8,71.6,69.6,67.9,59.9,58.6,24.8.
5’-O-DMT-2’-MOE-N4-Ac-胞苷的合成
先将2’-MOE-N4-Ac-胞苷用无水吡啶带水两次，然后用无水吡啶将其溶解，氮气保护，加4,4'-二甲氧基三苯基氯甲烷(DMTrCl)(1.1eq)，室温搅拌，TLC监测反应完全后，减压浓缩，用二氯甲烷溶解，饱和碳酸氢钠洗3次，然后用饱和食盐水洗3次，有机层用无水硫酸钠干燥过夜。过滤浓缩，柱层析分离得目标物。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.96(s,1H),8.33(d,J＝7.4Hz,1H),7.44–7.21(m,9H),7.02(d,J＝7.4Hz,1H),6.91(d,J＝8.4Hz,4H),5.82(s,1H),5.16(d,J＝7.2Hz,1H),4.26(dd,J＝12.7,7.8Hz,1H),4.03(dd,J＝12.1,5.3Hz,1H),3.97–3.85(m,2H),3.82–3.69(m,7H),3.52(t,J＝4.5Hz,2H),3.32(s,2H),3.26(s,3H),2.10(s,3H).13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ171.0,162.4,158.1,154.3,144.4,135.4,135.1,129.7,127.9,127.7,126.8,124.5,113.2,95.3,88.8,85.9,82.1,81.7,71.1,69.3,67.6,61.5,58.1,55.0,24.3.
5’-O-DMT-2’-MOE-3’-H-二硫代磷酸酯-N4-Ac-胞苷(B为N4-乙酰基胞嘧啶，R为DMT时通式一所示化合物)的合成
以5’-O-DMT-2’-MOE-N4-Ac-胞苷为原料，制备方法同实施例一中通式一所示化合物的制备。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.38(s,P-H),8.43(d,J＝7.5Hz,1H),8.00(s,1H),7.40(d,J＝7.8Hz,2H),7.33–7.14(m,7H),6.90(d,J＝7.4Hz,1H),6.84–6.73(m,4H),5.93(s,1H),5.13–5.02(m,1H),4.38(d,J＝8.3Hz,1H),4.19(d,J＝4.4Hz,1H),4.04–3.96(m,1H),3.94–3.86(m,1H),3.73(s,6H),3.56–3.46(m,4H),3.29(s,3H),3.13(q,J＝7.2Hz),2.20(s,3H),1.26(t,J＝7.3Hz).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ169.7,161.8,157.6,154.2,144.0,143.3,134.5,134.2,129.3,127.4,127.0,126.0,112.3,95.7,88.5,86.0,80.8,80.4,70.869.2,68.9,59.6,58.0,54.2,45.1,24.0,7.6.31P NMR(162MHz,CDCl3)85.50.HRMS:calcd.for C35H39N3O9PS2 -:740.1871,found m/z:740.1899[M-H]-.
5’-O-DMT-2’-MOE-3’-H-单硫代磷酸酯-N4-Ac-胞苷(B为N4-乙酰基胞嘧啶，R为DMT时通式二所示化合物)的合成
以5’-O-DMT-2’-MOE-N4-Ac-胞苷为原料，制备方法同实施例一中通式二所示化合物的制备。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.97(d,J＝10.6Hz,1H),8.55(s,1H),8.44–8.27(m,1H),7.42(d,J＝7.4Hz,2H),7.38–7.20(m,7H),6.97(dd,J＝7.3,3.8Hz,1H),6.91(d,J＝8.2Hz,4H),5.82(d,J＝9.0Hz,1H),4.90(dd,J＝14.5,10.1Hz,1H),4.21(t,J＝10.4Hz,1H),4.12–3.99(m,1H),3.95–3.84(m,2H),3.75(s,6H),3.50(t,J＝4.8Hz,2H),3.35(m,2H,),3.25(d,J＝3.6Hz,3H),3.05(q,J＝7.2Hz),2.09(s,3H),1.16(t,J＝7.3Hz).13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ170.9,162.5,158.1,154.2,144.2,135.3,135.0,129.8,127.9,126.8,113.3,95.3,88.8,86.1,81.1,71.1,69.3,60.8,58.1,55.0,45.5,24.3,8.5.31P NMR(162MHz,DMSO-d6)δ49.46,48.75.HRMS:calcd.for C35H39N3O10PS-:724.2099,found m/z:724.2090[M-H]-.
实施例五：
H-硫代磷酸酯核苷稳定性实验
以2’-O-MOE-3’-H-单硫代磷酸酯尿苷为为模型化合物进行稳定性实验。将样品溶解在无水乙腈中，核磁管中放置内封有DMSO-d6的小管进行锁场，常温下放置，通过31P NMR信号的变化来监测其化学稳定性。H-单硫代磷酸酯31P位于δ53.3(d，J＝101Hz)，分别在设置0，1，2，4，12，24h，2，5，10，20，110d时间点进行监测，结果在前20天时磷谱图上仍没有任何变化，110天时发现磷谱上在0ppm附近出现一组杂峰，为硫原子被氧取代所致，约占27％(实验31P NMR谱略)。证明H-硫代磷酸酯核苷在乙腈中较稳定。
对本发明其它化合物进行了同样上述实验，经验证，此类化合物储存稳定性好。

Claims (6)

1.2’-O-MOE-3’-H-二硫代磷酸核糖核苷或2’-O-MOE-3’-H-单硫代磷酸核糖核苷，其特征在于，分别具有通式一或通式二所示结构：
通式一 通式二
其中：B代表碱基，分别为尿嘧啶，胞嘧啶，腺嘌呤，鸟嘌呤，N4-乙酰基胞嘧啶，N4-苯甲酰基胞嘧啶，N6-苯甲酰基腺嘌呤，N6-乙酰基腺嘌呤，N2-异丁酰基鸟嘌呤，N2-乙酰基鸟嘌呤，N2-苯甲酰基鸟嘌呤；
其中R代表氢，三苯甲基，4-甲氧基三苯甲基，4,4’-二甲氧基三苯甲基。
2.如权利要求1所述的2’-O-MOE-3’-H-二硫代磷酸核糖核苷或2’-O-MOE-3’-H-单硫代磷酸核糖核苷，其特征在于，所述碱基B优选尿嘧啶，N4-乙酰基胞嘧啶，N6-苯甲酰基腺嘌呤，N2-异丁酰基鸟嘌呤；所述R优选4,4’-二甲氧基三苯甲基。
3.制备权利要求1所述2’-O-MOE-3’-H-二硫代磷酸核糖核苷的方法，其特征在于，通过如下方法实现：将1,2,4-三氮唑和有机碱溶于有机溶剂中，置于冰浴中氮气保护下搅拌，加入PCl3搅拌，然后滴加通式三所示化合物溶液，滴加完毕移去冰浴常温搅拌，然后向反应体系中通入H2S气体，反应完毕，吹氮气将多余的H2S移除，浓缩反应液得固体，再用二氯甲烷和饱和的碳酸氢三乙胺盐萃取分层，合并油相，干燥过夜，柱分离得通式一所示化合物
通式三
所述的有机碱是二异丙基乙胺，三乙胺，二乙胺，吗啉，N-甲基吗啉，吡啶，4-二甲胺基吡啶中的一种或两种；
所述的有机溶剂是乙腈，N,N-二甲基甲酰胺，二甲亚枫，二氯甲烷，氯仿，四氢呋喃中的一种。
4.制备权利要求1所述2’-O-MOE-3’-H-单硫代磷酸核糖核苷的方法，其特征在于，通过如下方法实现：将通式三所示化合物与次磷酸三乙胺盐混合用无水吡啶减压带水两次，无水吡啶溶解并氮气保护下置于冰浴中搅拌，加入偶合试剂反应，然后移除冰浴，加入升华硫搅拌反应,TLC监测反应完毕后加饱和碳酸氢三乙胺盐溶液淬灭反应；减压蒸除溶剂得油状物，然后用二氯甲烷与碳酸氢三乙胺盐水溶液萃取分层，再用二氯甲烷萃取，合并有机层，干燥过夜，柱分离得通式二所示化合物；
通式三
其中，所述的偶合试剂是氯磷酸二苯酯、特戊酰氯、氯磷酸二（2,6-二甲基苯）酯、氯磷酸二乙酯中的一种。
5.制备通式三所述2’-O-MOE-核糖核苷化合物的方法，其特征在于，
通式三
B代表胞嘧啶，通过如下方法实现：将2’-O-甲氧乙基尿苷通过羟基的临时保护，嘧啶4位氧转化为氨基得到2’-O-甲氧乙基胞苷；选择性氨基酰化得到2’-O-甲氧乙基-N4-酰基胞苷；加入三苯甲基氯或甲氧基取代的三苯甲基氯反应，选择性保护2’-O-甲氧乙基-N4-酰基胞苷的5’-羟基，得通式三所示胞嘧啶核苷类似物；
所述的羟基临时保护指采用三甲基氯硅烷使羟基硅烷化，待转化完成后加水去除三甲基硅基；嘧啶4位氧转化为氨基通过依次加入1,2,4-三氮唑/三氯氧磷/氨水或加入三氟乙酸酐/4-硝基苯酚/氨水实现；选择性氨基酰化采用三甲基硅烷临时保护羟基，通过酰氯或酸酐酰化氨基实现。
6.制备通式三所述2’-O-MOE-核糖核苷化合物的方法，其特征在于，
通式三
B代表鸟嘌呤，通过如下方法实现：将2-氨基腺苷在碱的存在下与2-溴乙基甲基醚作用，柱层析分离得到2’-O-MOE-2-氨基腺苷；加入酰化试剂，2’-O-MOE-2-氨基腺苷经选择性酰基保护得2’-O-MOE-N2-酰基胺基腺苷，重氮化反应将6-氨基转化为羟基得2’-O-MOE-N-酰基鸟苷；进一步与三苯甲基氯或甲氧基取代的三苯甲基氯反应，选择性保护5’-羟基得到通式三所示的鸟嘌呤核苷类似物；
所述的碱为氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钾、氢化钠、氢化钾、叔丁醇钾或叔丁醇钠的一种；
所述的2-氨基的选择性酰化所用的酰化试剂是苯甲酰氯、苯甲酸酐、乙酰氯、乙酸酐、异丁酰氯或异丁酸酐中一种；酰化反应温度为-30℃-50℃；6-氨基的重氮化转化使用亚硝酸钠/冰醋酸体系。
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