CN115181147A - C4′-三氟甲硫基修饰核苷和c4′-三氟甲硫基修饰核酸的制备方法 - Google Patents
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Abstract
Description
技术领域
本发明涉及核苷、寡聚核苷酸的化学合成领域,具体涉及C4′-三氟甲硫基 取代脱氧胸苷、C4′-三氟甲硫基取代脱氧胸苷亚磷酰胺单体、C4′-三氟甲硫基取 代脱氧胸苷修饰的DNA、C4′-三氟甲硫基取代尿苷、C4′-三氟甲硫基取代尿苷亚 磷酰胺单体、C4′-三氟甲硫基尿苷修饰的RNA的制备方法。
背景技术
向核糖上引入卤代、甲基等取代基,能够通过立体电子效应改变糖环的构 象,进而调控核苷和核酸的结构和功能。这些修饰的核苷和核酸具有广泛的应 用价值。比如,2′,3′-二脱氧胞苷(扎西他宾)、去氧氟尿苷(Doxifluridine)等核苷 被用作抗病毒、抗肿瘤药物;2′-F,2′-OMe修饰的反义核酸和核酸适体被FDA 批准用以治疗一些罕见病;锁核酸(LNA)被广泛应用于核酸分子识别和核酸 纳米结构构筑;将2′-F,2′-SCF3和2′-OCF3取代的核苷定点引入RNA链,可以 基于19F NMR探测RNA的结构动态变化。C4′修饰位于核糖-磷酸骨架的外侧, 远离碱基和C2′-OH/H,对核苷和核酸的核心结构和功能扰动较小。因此,相对于C2′修饰,C4′修饰的核苷和核苷酸可能是更为优异的探针。但是,很多C4′ 修饰能够降低糖苷键的稳定性,导致C4′修饰的核苷和核苷酸报导较少。最近, 我们发展了分层次保护多羟基的策略,合成了C4′-氟代修饰尿嘧啶亚磷酰胺单 体,并基于固相合成策略化学合成了的C4′-氟代修饰尿嘧啶修饰的RNA,用于 基于19F NMR的RNA结构和功能研究[J.Am.Chem.Soc.2020,142,4739–4748]。 基于对提高灵敏度的需要,在C4′-位引入含有多个等价氟原子的氟代官能团(例 如三氟甲硫基)探测DNA和RNA的结构动态应该具有广泛的应用前景。
发明内容
本发明的目的是针对发展新型C4′-含氟官能团修饰核酸实际需要,提供一 种高选择性引入三氟甲硫基的策略,包括C4′-三氟甲硫基取代脱氧胸苷和C4′- 三氟甲硫基取代脱氧胸苷亚磷酰胺单体的制备方法,C4′-三氟甲硫基取代尿苷和 C4′-三氟甲硫基取代尿苷亚磷酰胺单体的制备方法,以及利用C4′-三氟甲硫基取 代脱氧胸苷亚磷酰胺单体制备C4′-三氟甲硫基取代脱氧胸苷修饰的DNA的方法, 和利用C4′-三氟甲硫基取代尿苷亚磷酰胺单体制备C4′-三氟甲硫基取代尿苷修 饰的RNA的方法。
本发明技术方案
为了实现上述目的,本发明第一方面提供了一种C4′-三氟甲硫基取代脱氧 胸苷,其中,该C4′-三氟甲硫基取代脱氧胸苷的化学结构式为:
式(1)所示的化合物可以称为4′-C-(三氟甲硫基)-2′-脱氧-β-D-胸苷。
本发明第二方面提供了一种C4′-三氟甲硫基取代脱氧胸苷的制备方法,该 方法包括以下步骤:
(1)将N-(三氟甲硫基)邻苯二甲酰亚胺和三乙胺、无水二氯甲烷形成第一 混合溶液;15分钟后将所述第一混合溶液与3′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-5′-醛 -2′-β-D-苏糖脱氧胸苷进行反应,将反应后得到的溶液用二氯甲烷稀释后洗涤、 干燥、过滤、柱层析得到3′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-4′-C-(三氟甲硫基)-5′-醛-2′- 脱氧-β-D-苏糖胸苷;
(2)将步骤(1)得到的3′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-4′-C-(三氟甲硫基)-5′- 醛-2′-脱氧-β-D-苏糖胸苷与无水甲醇进行第二混合,形成第二混合溶液;再将所 述第二混合溶液与硼氢化钠进行反应,旋蒸除去溶剂,用二氯甲烷溶解后洗涤、 干燥、过滤、柱层析得到3′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-4′-C-(三氟甲硫基)-2′-脱氧 -β-D-苏糖胸苷;
(3)将步骤(2)得到的3′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-4′-C-(三氟甲硫基)-2′- 脱氧-β-D-苏糖胸苷与4-二甲氨基吡啶、三乙胺、无水二氯甲烷进行第三混合, 形成第三混合溶液;再将所述第三混合溶液与4,4′-二甲氧基三苯甲基氯进行反 应,旋蒸除去溶剂,用二氯甲烷溶解后洗涤、干燥、过滤、柱层析得到3′-O-(叔 丁基二甲基硅烷基)-4′-C-(三氟甲硫基)-5′-O-(二甲氧基三苯甲基)-2′-脱氧-β-D-苏 糖胸苷;
(4)将四正丁基氟化铵的四氢呋喃溶液与乙酸混合调节pH为7后,加入 无水四氢呋喃进行第四混合,形成第四混合溶液;再将所述第四混合溶液与步 骤(3)得到的3′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-4′-C-(三氟甲硫基)-5′-O-(二甲氧基三 苯甲基)-2′-脱氧-β-D-苏糖胸苷进行反应,然后将反应得到的有机相用乙酸乙酯 稀释后洗涤、干燥、过滤、柱层析得到4′-C-(三氟甲硫基)-5′-O-(二甲氧基三苯甲 基)-2′-脱氧-β-D-苏糖胸苷;
(5)将重铬酸吡啶鎓与分子筛、无水二氯甲烷进行第五混合,形成第 五混合溶液;再将所述第五混合溶液与步骤(4)得到的4′-C-(三氟甲硫 基)-5′-O-(二甲氧基三苯甲基)-2′-脱氧-β-D-苏糖胸苷进行反应,然后将反应得到 的有机相旋干后,用乙酸乙酯溶解后硅藻土过滤、旋干得到3′-脱氧-3′-氧代 -4′-C-(三氟甲硫基)-5′-O-(二甲氧基三苯甲基)-2′-脱氧-β-D-苏糖胸苷中间体;
(6)将步骤(5)得到的中间体与无水甲苯、无水甲醇进行第六混合,形 成第六混合溶液;再将所述第六混合溶液与对甲基苯磺酸进行前段反应,之后 加入硼氢化钠继续后段反应,用乙酸调节pH至中性,旋蒸除去溶剂,用二氯甲 烷溶解后柱层析得到4′-C-(三氟甲硫基)-2′-脱氧-β-D-胸苷。
优选地,在步骤(1)中,所述N-(三氟甲硫基)邻苯二甲酰亚胺与所述三乙 胺、所述无水乙腈和所述3′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-5′-醛-2′-β-D-苏糖脱氧胸苷 的用量比为3mmol:6mmol:10mL:1mmol;以及,
所述反应的条件包括:温度为18-25℃,时间为4-6小时,搅拌速度为250-500 转/分钟。
优选地,在步骤(2)中,所述3′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-4′-(三氟甲硫基)-5′-醛-2′-脱氧-β-D-苏糖胸苷与所述无水甲醇、所述硼氢化钠用量的比为1mmol:10 mL:1.5mmol;以及,
在步骤(2)中,所述反应的条件包括:温度为18-25℃,时间为10-15分 钟,搅拌速度为250-500转/分钟。
优选地,在步骤(3)中,所述3′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-4′-C-(三氟甲硫 基)-2′-脱氧-β-D-苏糖胸苷与所述4-二甲氨基吡啶、所述三乙胺、所述无水二氯 甲烷、所述4,4′-二甲氧基三苯甲基氯用量的比为1mmol:2mmol:4mmol:20 mL:3mmol;所述4,4′-二甲氧基三苯甲基氯分三次加入所述第三混合溶液中, 间隔时间6小时;以及,
所述反应的条件包括:温度为18-25℃,时间为20-24小时,搅拌速度为 250-500转/分钟。
优选地,在步骤(4)中,所述四正丁基氟化铵的四氢呋喃溶液与所述乙酸、 所述无水四氢呋喃、所述3′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-4′-C-(三氟甲硫基)-5′-O-(二 甲氧基三苯甲基)-2′-脱氧-β-D-苏糖胸苷的用量比为1.05mmol:3mmol:10mL: 1mmol;以及,
在步骤(4)中,所述四正丁基氟化铵的四氢呋喃溶液浓度为1摩尔每升; 所述乙酸以滴加的方式加入到所述四正丁基氟化铵的四氢呋喃溶液中调节pH 为7,以及
所述反应的条件包括:温度为18-25℃,时间为3-4小时,搅拌速度为250-500 转/分钟。
优选地,在步骤(5)中,所述重铬酸吡啶鎓与所述分子筛、所述无水 二氯甲烷、所述4′-C-(三氟甲硫基)-5′-O-(二甲氧基三苯甲基)-2′-脱氧-β-D-苏糖胸 苷的用量比为2mmol:1g:10mL:1mmol;以及,
所述反应的条件包括:温度为18-25℃,时间为3-4小时,搅拌速度为250-500 转/分钟。
优选地,在步骤(6)中,所述中间体所述无水甲苯、所述无水甲醇、所述 对甲基苯磺酸以及所述硼氢化钠的用量比为1mmol:40mL:1mL:80mg:2 mmol;以及,
所述反应的条件包括:温度为18-25℃,前段时间为1.5-2.0小时;后段时 间为10-15分钟,搅拌速度为250-500转/分钟。
本发明第三方面提供了一种C4′-三氟甲硫基取代脱氧胸苷亚磷酰胺单体, 其中,该C4′-三氟甲硫基取代脱氧胸苷亚磷酰胺单体的化学结构式为:
式(2)所示的化合物可以称为3′-O-[(2-氰基乙氧基)-N,N′-二异丙基亚磷酰胺]-4′-C-(三氟甲硫基)-5′-O-(二甲氧基三苯甲基)-2′-脱氧-β-D-胸苷。
其中,在式(2)中,“DMTr-”为二甲氧基三苯甲基。
本发明第四方面提供了一种C4′-三氟甲硫基取代脱氧胸苷亚磷酰胺单体的 制备方法,该方法包括以下步骤:
(1)将4′-C-(三氟甲硫基)-2′-脱氧-β-D-胸苷与吡啶以及4,4′-二甲氧基三苯 甲基氯进行反应,旋蒸除去溶剂,用二氯甲烷溶解后然后将有机相洗涤、过滤、 干燥、柱层析得到4′-C-(三氟甲硫基)-5′-O-(二甲氧基三苯甲基)-2′-脱氧-β-D-胸苷;
(2)将步骤(1)得到的4′-C-(三氟甲硫基)-5′-O-(二甲氧基三苯甲基)-2′-脱 氧-β-D-胸苷与二氯甲烷、N,N′-二异丙基乙胺以及N-甲基咪唑进行第七混合,形 成第七混合溶液;再将所述第七混合溶液与(2-氰基乙氧基)-N,N′-二异丙基亚磷 酰氯进行反应,旋蒸除去溶剂,用二氯甲烷溶解后然后将有机相洗涤、过滤、 干燥、柱层析得到3′-O-[(2-氰基乙氧基)-N,N′-二异丙基亚磷酰胺]-4′-C-(三氟甲 硫基)-5′-O-(二甲氧基三苯甲基)-2′-脱氧-β-D-胸苷,即C4′-三氟甲硫基取代脱氧 胸苷亚磷酰胺单体。
优选地,在步骤(1)中,所述4′-C-(三氟甲硫基)-2′-脱氧-β-D-胸苷与所述 吡啶以及所述4,4′-二甲氧基三苯甲基氯的用量比为1mmol:10mL:1.3mmol; 以及,
所述反应的条件包括:温度为18-25℃,时间为20-24小时,搅拌速度为 250-500转/分钟。
优选地,在步骤(2)中,所述4′-C-(三氟甲硫基)-5′-O-(二甲氧基三苯甲基)-2′-脱氧-β-D-胸苷与所述二氯甲烷、所述N,N′-二异丙基乙胺、所述2-甲基咪唑、 所述(2-氰基乙氧基)-N,N′-二异丙基亚磷酰氯的用量比为1mmol:10mL:8 mmol:4mmol:3mmol;以及,
所述反应的条件包括:温度为18-25℃,时间为0.5-1小时,搅拌速度为250-500转/分钟。
本发明第五方面提供了一种C4′-三氟甲硫基取代脱氧胸苷修饰DNA的制备 方法,其中,该制备方法中的合成试剂包括以上所述的制备方法制备得到的C4′- 三氟甲硫基取代脱氧胸苷亚磷酰胺单体。
优选地,该制备方法在ABI 394 DNA/RNA合成仪上进行以得到寡聚核苷酸, 其中:
优选地,所述合成试剂还包括Ac-dC、Bz-dA、dmf-dG和dT亚磷酰胺单体;
优选地,三氯乙酸/二氯甲烷用于脱保护;
优选地,Cap A试剂为乙酸酐、吡啶和四氢呋喃的组合物,且所述乙酸酐、 所述吡啶和所述四氢呋喃的体积比为10体积%:(5-15)体积%:(75-85)体积%;
优选地,Cap B试剂为N-甲基咪唑和四氢呋喃的组合物,且所述N-甲基咪 唑和所述四氢呋喃的体积比为10体积%:90体积%;
优选地,活化剂为乙硫基四唑和乙腈的组合物;
优选地,氧化剂为碘、水、吡啶和四氢呋喃的组合物,且所述碘、所述水、 所述吡啶和所述四氢呋喃的用量比为0.02M:(1-2)体积%:(10-30)体积%: (75-85)体积%;以及所述,
优选地,所述C4′-三氟甲硫基取代脱氧胸苷亚磷酰胺单体的偶合时间为10 分钟;
优选地,将上述固相合成得到的寡聚核苷酸用1mL浓度为28重量%的氨 水在20℃下处理16-60小时,然后,取出上清液离心浓缩后,经C18柱脱盐处 理后,离心浓缩,采用20重量%的变性聚丙烯凝胶电泳纯化。
本发明第六方面提供了一种C4′-三氟甲硫基代尿苷,其中,该C4′-三氟甲 硫基代尿苷的化学结构式为:
式(3)所示的化合物可以称为4′-C-(三氟甲硫基)-β-D-尿苷。
本发明第七方面提供了一种C4′-三氟甲硫基代尿苷的制备方法,该方法包 括以下步骤:
(1)将2′,3′-O-异亚丙基-5′-脱氧-5′-尿嘧啶醛与N-(三氟甲硫基)邻苯二甲 酰亚胺和二甲基亚砜进行第八混合,形成第八混合液;再将所述第八混合溶液 与1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯进行反应;将反应得到的有机相洗涤、过滤、 干燥、柱层析得到2′,3′-O-异亚丙基-4′-C-三氟甲硫基-5′-脱氧-5'-尿嘧啶醛。
(2)将步骤(1)得到的2′,3′-O-异亚丙基-4′-C-三氟甲硫基-5′-脱氧-5′-尿嘧 啶醛与无水甲醇进行第九混合,形成第九混合溶液;再将所述第九混合溶液与 硼氢化钠进行反应;旋蒸除去溶剂,柱层析得到产物2′,3′-O-异亚丙基-4′-C-三氟 甲硫基尿嘧啶。
(3)将步骤(2)得到的2′,3′-O-异亚丙基-4′-C-三氟甲硫基尿嘧啶与三氟乙 酸进行反应;旋蒸除去溶剂,柱层析得到4′-C-三氟甲硫基尿苷。
优选地,在步骤(1)中,所述2',3'-O-异亚丙基-5'-脱氧-5'-尿嘧啶醛与所述 N-(三氟甲硫基)邻苯二甲酰亚胺、所述二甲基亚砜和所述1,8-二氮杂双环[5.4.0] 十一碳-7-烯的用量比为1mmol:2mmol:4mL:0.5mL;以及,
所述反应的条件包括:温度为18-25℃,时间为1.5-2小时,搅拌速度为 250-500转/分钟。
优选地,在步骤(2)中,所述2',3'-O-异亚丙基-4'-C-三氟甲硫基-5'-脱氧-5'-尿嘧啶醛与所述无水甲醇、所述硼氢化钠用量的比为1mmol:4mL:2mmol; 以及,
所述反应的条件包括:温度为0-3℃,时间为1-2小时,搅拌速度为250-500 转/分钟。
优选地,在步骤(3)中,所述2',3'-O-异亚丙基-4'-C-三氟甲硫基尿嘧啶与 所述三氟乙酸的用量比为1mmol:5mL;其中所述三氟乙酸纯度为80%;
以及,
所述反应的条件包括:温度为18-25℃,时间为1.5-2小时,搅拌速度为 250-500转/分钟。
本发明第八方面提供了一种C4′-三氟甲硫基代尿苷亚磷酰胺单体,其中, 该C4′-三氟甲硫基代尿苷亚磷酰胺单体的化学结构式为:
其中,在式(4)中,“DMTr-”为二甲氧基三苯甲基,“-TBDMS”为叔丁 基二甲基硅烷基。R1为甲基或腈乙基,R2为乙基或异丙基。
本发明的第九方面提供了一种C4′-三氟甲硫基代尿苷亚磷酰胺单体的制备 方法,该方法包括以下步骤:
(1)将4′-C-三氟甲硫基尿苷与吡啶、4,4′-二甲氧基三苯甲基氯进行反应; 旋蒸除去溶剂,用二氯甲烷溶解后然后将有机相洗涤、过滤、干燥、柱层析得 到4′-C-三氟甲硫基-5′-O-二甲氧基三苯甲基尿苷。
(2)将步骤(1)得到的产物4′-C-三氟甲硫基-5′-O-二甲氧基三苯甲基尿苷 与吡啶、硝酸银进行第十混合,形成第十混合液;再将所述第十混合溶液与叔 丁基二甲基氯硅烷进行反应;旋蒸除去溶剂,用二氯甲烷溶解后然后将有机相 洗涤、过滤、干燥、柱层析得到2′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-4′-C-三氟甲硫基-5′-O- 二甲氧基三苯甲基尿苷。
(3)将步骤(2)得到的2′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-4′-C-三氟甲硫基-5′-O- 二甲氧基三苯甲基尿苷与二氯甲烷、2-甲基咪唑进行第十一混合,形成第十一混 合液;再将所述第十一混合溶液与N,N-二乙基氯代亚磷酸甲酯或(2-氰基乙氧 基)-N,N-二异丙基亚磷酰氯进行反应;旋蒸除去溶剂,用二氯甲烷溶解后然后将 有机相洗涤、过滤、干燥、柱层析得到2′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-3′-[(2-甲氧 基)-N,N-二乙基亚磷酰胺]-4′-C-三氟甲硫基-5′-O-二甲氧基三苯甲基尿苷或 2′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-3′-[(2-氰基乙氧基)-N,N′-二异丙基亚磷酰胺]-4′-C- 三氟甲硫基-5′-O-二甲氧基三苯甲基尿苷,即C4′-三氟甲硫基代尿苷亚磷酰胺单 体。
优选地,在步骤(1)中,所述4′-C-三氟甲硫基尿苷与所述吡啶以及所述 4,4′-二甲氧基三苯甲基氯的用量比为1mmol:8mL:1.2mmol,以及,
所述反应的条件包括:温度为18-25℃,时间为5-6小时,搅拌速度为250-500 转/分钟。
优选地,在步骤(2)中,所述4′-C-三氟甲硫基-5′-O-二甲氧基三苯甲基尿 苷与所述吡啶、所述硝酸银以及叔丁基二甲基氯硅烷的用量比为1mmol:4mL: 3mmol:3mmol;以及,
所述反应的条件包括:温度为18-25℃,时间为12-13小时,搅拌速度为 250-500转/分钟。
优选地,在步骤(3)中,所述2′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-4′-C-三氟甲硫 基-5′-O-二甲氧基三苯甲基尿苷与所述二氯甲烷、所述2-甲基咪唑、所述N,N- 二乙基氯代亚磷酸甲酯/(2-氰基乙氧基)-N,N-二异丙基亚磷酰氯的用量比为1 mmol:10mL:0.9mL:0.4mL;以及,
所述反应的条件包括:温度为18-25℃,时间为1.5-2小时,搅拌速度为 250-500转/分钟。
本发明第十方面提供了一种C4′-三氟甲硫基代尿苷定点修饰RNA的制备方 法,其中,该制备方法中的合成试剂包括以上所述的制备方法制备得到的C4′- 三氟甲硫基代尿苷亚磷酰胺单体2′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-3′-[(2-甲氧基)-N, N′-二乙基]-4′-C-三氟甲硫基-5′-O-二甲氧基三苯甲基尿苷。
优选地,该制备方法在ABI 394 DNA/RNA合成仪上进行以得到寡聚核苷酸, 其中:
优选地,所述合成试剂还包括叔丁基二甲基氯硅烷保护2′-OH的Ac-rC、 Bz-rA、Ac-rG和rU;
优选地,三氯乙酸/二氯甲烷用于脱保护;
优选地,Cap A试剂为乙酸酐、吡啶和四氢呋喃的组合物,且所述乙酸酐、 所述吡啶和所述四氢呋喃的体积比为10体积%:(5-15)体积%:(75-85)体积%;
优选地,Cap B试剂为N-甲基咪唑和四氢呋喃的组合物,且所述N-甲基咪 唑和所述四氢呋喃的体积比为10体积%:90体积%;
优选地,活化剂为乙硫基四唑和乙腈的组合物;
优选地,氧化剂为碘、水、吡啶和四氢呋喃的组合物,且所述碘、所述水、 所述吡啶和所述四氢呋喃的用量比为0.02M:(1-2)体积%:(10-30)体积%: (75-85)体积%;以及所述,
优选地,所述C4′-三氟甲硫基代RNA亚磷酰胺单体的偶合时间为0.5-1小 时;
优选地,将上述固相合成得到的寡聚核苷酸用0.75mL浓度为28重量%的 氨水混合0.25mL无水乙醇在室温下处理34-36h,然后,取出上清液离心浓缩 后,加入0.5mL三乙胺三氢三氟甲硫基酸盐处理20-24h,经C18柱脱盐处理后, 离心浓缩,采用20重量%的变性聚丙烯凝胶电泳纯化。
本发明的优点和有益效果是:(1)设计高选择性引入三氟甲硫基的策略, 成功制备了C4′-三氟甲硫基取代脱氧胸苷;(2)C4′-三氟甲硫基取代脱氧胸苷亚 磷酰胺单体成功应用于制备C4′-三氟甲硫基取代脱氧胸苷定点修饰的DNA。(3) 通过选择极性非质子性溶剂,以较短路线成功制备了C4′-三氟甲硫基代尿苷。(4) C4′-三氟甲硫基代尿苷亚磷酰胺单体成功应用于制备C4′-三氟甲硫基代尿苷定 点修饰的RNA。本发明所述的C4′-三氟甲硫基取代脱氧胸苷和C4′-三氟甲硫基 取代脱氧胸苷定点修饰的DNA,C4′-三氟甲硫基取代尿苷和C4′-三氟甲硫基取 代尿苷定点修饰的RNA,在核苷类药物开发和核酸的结构与功能研究领域具有 应用前景。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。此处所描述的具体实施方式 仅用于说明和解释本发明,并不用于限制本发明。
3′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-5′-醛-2′-β-D-苏糖脱氧胸苷和N-(三氟甲硫基)邻苯二甲酰亚胺(自制);二氯甲烷(天津市河东区广达服务部,货号1220);Na2CO3·10H2O晶体(天津市河东区广达服务部,货号2093);氯化钠(天津市化学试 剂供销公司,货号017);吡啶[阿拉丁试剂(上海)有限公司,货号P111511]; 四氢呋喃(北京华威锐科化工有限公司,货号HWMT818767);甲醇(北京百灵 威科技有限公司,货号980290-500ML);三乙胺(从北京伊诺凯公司购买,货 号T9710);对甲基苯磺酸(从药明康德公司购买,货号200000883);冰乙酸(从 天津市化学试剂供销公司购买,货号44A)、浓盐酸(从天津市化学试剂供销公 司购买,货号46A);重铬酸吡啶酯(从Alfa公司购买,货号L15132);分子筛 (从Alfa公司购买,货号B21165);N-甲基咪唑[梯希爱(上海)化成工业发 展有限公司,货号M0508]、N,N-二异丙基乙胺[梯希爱(上海)化成工业发展 有限公司,货号D1599];叔丁基二甲基氯硅烷[梯希爱(上海)化成工业发展 有限公司,货号B0995];硝酸银(安耐吉,货号A01W5100190250)、间氯过氧 苯甲酸(安耐吉,货号A01W520002-100g)、2-氰乙基N,N-二异丙基氯亚磷酰胺 (安耐吉,货号A07M901005-01);4-二甲氨基吡啶(Adamas,货号14766B)、 4,4′-二甲氧基三苯甲基氯(Adamas,货号55311C);四正丁基氟化铵(从天津 希恩思奥普德科技有限公司购买,货号T-21412);硼氢化钠(从Acros公司购 买,货号448481000)等原料为市售品。
实施例1:
C4′-三氟甲硫基取代脱氧胸苷的合成。
其合成步骤如下:
步骤一、化合物(6)的制备:在氩气保护下,将5.39gN-(三氟甲硫基)邻苯 二甲酰亚胺(21.8mmol,3.0eq.)和6mL三乙胺(43.56mmol,6.0eq.)溶解在 200mL无水二氯甲烷中,室温搅拌15分钟后,加入2.57g(5)所示的单体(7.2 mmol,1.0eq.)。继续搅拌6小时。反应达到平衡,加入50mL二氯甲烷稀释, 用50mL饱和NaCl溶液清洗。有机相用无水硫酸镁干燥,旋干溶剂,用乙酸乙 酯/石油醚(v/v,1:3)柱色谱分离,得到白色泡沫状固体(6)所对应的单体2.1 g(4.7mmol,产率65摩尔质量%)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)9.55(s,1H,NH),7.59(s,1H,H-6,=CH), 6.57-6.50(m,1H,H-1′),4.55-4.51(m,1H,H-3′),4.16(d,J=12.3Hz,1H,H-5′), 4.07(d,J=12.2Hz,1H,H-5″),3.07-2.96(m,1H,H-2′),2.58(br,1H,-OH), 2.00-1.93(m,1H,H-2″),1.91(s,3H,CH3),0.91(s,9H,tBu),0.16(s,3H,-CH 3), 0.12(s,3H,-CH 3);13C NMR(100.6MHz,CDCl3)δ(ppm)190.1,168.3,163.7, 150.3,135.6,134.3,132.7,129.5(q,J=309.0Hz,SCF3),123.6,111.7,98.8,86.2, 40.6,29.7,25.4,17.8,12.7,-4.9,-5.3;19F NMR(376MHz,CDCl3)δ(ppm)-35.99; m/z:cacld for C17H26F3N2O5SSi[M+H]+,455.1284;found,455.1267.
步骤二、化合物(7)的制备:称取4.36g(9.6mmol,1.0eq.)式(6)所示 的单体溶于100mL甲醇中。在氩气保护下,加入0.55g(14.4mmol,1.5eq.)硼 氢化钠。室温搅拌10分钟。旋干溶剂,加入50mL二氯甲烷稀释,用50mL饱 和氯化钠水溶液清洗,有机层用无水硫酸镁干燥,旋干溶剂,用乙酸乙酯/石油 醚(v/v,1:3)柱层析,得白色固体式(7)对应单体3.4g(7.4mmol,产率77 摩尔质量%)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)9.55(s,1H,NH),7.59(s,1H,H-6,=CH), 6.57-6.50(m,1H,H-1′),4.55-4.51(m,1H,H-3′),4.16(d,J=12.3Hz,1H,H-5′), 4.07(d,J=12.2Hz,1H,H-5″),3.07-2.96(m,1H,H-2′),2.58(br,1H,-OH), 2.00-1.93(m,1H,H-2″),1.91(s,3H,CH3),0.91(s,9H,tBu),0.16(s,3H,-CH 3), 0.12(s,3H,-CH 3);13C NMR(100.6MHz,CDCl3)δ(ppm)163.7,150.4,135.5, 129.1(q,J=309.0Hz,1C),111.8,101.1,84.6,77.0,63.5,40.6,25.5,17.9,12.5,-5.1, -5.3;19F NMR(376MHz,CDCl3)δ(ppm)-35.34;m/z:cacld forC17H28F3N2O5SSi [M+H]+,457.1440;found,457.1450.
步骤三、化合物(8)的制备:在氩气保护下,将1.0g式(7)所对应的单 体(2.20mmol,1.0eq.)、0.54g 4-二甲氨基吡啶(8.8mmol,4.0eq.)、1.2mL三 乙胺(8.8mmol,4.0eq.)溶解在50mL无水二氯甲烷中,分三次加入总量为2.2 g的4,4′-二甲氧基三苯甲基氯(6.6mmol,3.0eq.),每次时间间隔为6小时。室 温搅拌24小时后,加入1mL甲醇淬灭反应,旋干溶剂。加入50mL二氯甲烷 稀释,用50mL饱和氯化钠水溶液清洗,有机层用无水硫酸镁干燥,旋干溶剂, 用甲醇/二氯甲烷(体积%,0.5%,加入0.5体积%的三乙胺)柱层析,得白色固 体式(8)对应单体1.17g(1.54mmol,产率70摩尔质量%)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)9.44(s,1H,NH),7.56-7.07(s,10H,H-6, Ar-H),6.85-6.81(m,4H,Ar-H),6.54(dd,J=7.3,4.2Hz,1H,H-1′),4.37-4.31(m, 1H,H-3′),3.84(d,J=10.6Hz,1H,H-5′),3.79(s,6H,OCH3),3.47(d,J=10.6Hz, 1H,H-5″),3.11-3.03(m,1H,H-2′),2.10-2.03(m,1H,H-2″),1.60(s,3H,CH3),0.75 (s,9H,tBu),0.00(s,3H,-CH 3),-0.03(s,3H,-CH 3);13C NMR(100.6MHz,CDCl3)δ (ppm)163.8,158.7,150.4,149.7,144.1,136.1,136.0,135.5,135.2,130.4,130.3, 129.3(q,J=325.0Hz,1C),128.5,127.9,127.1,113.1,111.2,100.4,87.1,85.0,65.1, 55.2,40.2.25.5,17.8,12.2,-5.2,-5.4;19FNMR(376MHz,CDCl3)δ(ppm)-35.96; m/z:cacld for C38H45F3N2NaO7SSi[M+Na]+,781.2567;found,781.2589.
步骤四、化合物(9)的制备:在氩气保护下,将300mg式(8)所对应的 单体(0.4mmol,1.0eq.)溶解在5mL无水四氢呋喃中,加入溶解有420μL四正 丁基氟化铵(0.42mmol,1.05eq.,浓度为1摩尔每升的四氢呋喃溶液)和69μL 乙酸(1.2mmol,3.0eq.)的5mL四氢呋喃溶液。室温搅拌3小时后,加入40mL 乙酸乙酯稀释,依次用40mL饱和碳酸氢钠水溶液、40mL饱和氯化钠水溶液 清洗,有机层用无水硫酸镁干燥,旋干溶剂,用乙酸乙酯/石油醚(v/v,1:3)柱 层析,得白色固体式(9)对应单体231mg(0.36mmol,产率90摩尔质量%)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)7.50-7.20(m,10H,H-6,Ar-H),6.88-6.84 (m,4H,Ar-H),6.54(d,J=6.4Hz,1H,H-1′),4.38(d,J=5.6Hz,1H,H-3′),3.95(d, J=9.8Hz,1H,H-5′),3.79(s,6H,OCH3),3.53(d,J=9.8Hz,1H,H-5″),3.07-2.97 (m,1H,H-2′),2.07-1.99(m,1H,H-2″),1.75(s,3H,CH3);13C NMR(100.6MHz, CDCl3)δ(ppm)164.2,158.9,150.7,143.8,136.6,135.0,134.1,130.0,129.9,129.4 (q,J=320.9Hz,1C),128.1,127.9,127.3,124.9,113.5,111.7,99.9,87.4,86.3,76.1, 64.1,55.2,38.2,12.4;19F NMR(376MHz,CDCl3)δ(ppm)-40.51;m/z:cacld for C32H31F3N2NaO7S[M+Na]+,667.1702;found,667.1691.
步骤五、化合物(1)的制备:在氩气保护下,将465mg重铬酸吡啶鎓(1.24 mmol,2.0eq.)、500mg分子筛加入至6mL无水二氯甲烷中,加入400mg式 (9)所对应的单体(0.62mmol,1.0eq.)。室温搅拌3小时后,用硅藻土过滤除 去不溶物,旋干溶剂,加入6mL乙酸乙酯稀释,静置5分钟后用硅藻土过滤, 得到式(10)对应的中间体;将所得固体溶解在含有1mL甲醇的40mL无水甲 苯中,加入80mg对甲基苯磺酸(质量/体积,2%),室温搅拌1.5小时后,加入 45mg硼氢化钠(1.2mmol,2.0eq),继续在室温条件下搅拌15分钟。加入150μL 乙酸调节pH至中性。旋干溶剂,用甲醇/二氯甲烷(体积%,4%)柱层析,得 白色固体式(1)对应单体97mg(0.29mmol,产率46摩尔质量%)。
1H NMR(400MHz,CD3OD)δ(ppm)7.56(s,1H,H-6),6.38(dd,J=8.3,3.5Hz, 1H,H-1′),4.94(t,J=8.5Hz,1H,H-3′),4.16(d,J=12.5Hz,1H,H-5′),3.85(d,J=12.5Hz,1H,H-5″),2.54(dt,J=14.0,8.5Hz,1H,H-2″),2.39(ddd,J=14.0,8.6,3.6 Hz,1H,H-2′),1.83(s,3H,CH3);13C NMR(100.6MHz,CD3OD)δ(ppm)166.2, 150.0,138.1,132.3(q,J=306.8Hz,1C),112.2,103.5,85.5,71.7,64.7,38.4,12.5; 19F NMR(376MHz,CD3OD)δ(ppm)-36.49;m/z:cacld for C11H14F3N2O5S[M+H]+, 343.0576;found,343.0620。
实施例2:
C4′-三氟甲硫基取代脱氧胸苷亚磷酰胺单体的合成。
其合成步骤如下:
步骤一、化合物(11)的制备:在氩气保护下,将89mg式(1)所对应的 单体(0.26mmol,1.0eq.)溶解至10mL无水吡啶中,加入114mg 4,4′-二甲氧 基三苯甲基氯(0.34mmol,1.0eq.)。室温搅拌24小时后,加入一滴甲醇淬灭, 旋干溶剂,用甲醇/二氯甲烷(体积%,2%)柱层析,得白色固体式(11)对应 单体94mg(0.15mmol,产率56摩尔质量%)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)7.45-7.21(m,10H,H-6,Ar-H),6.85(s,2H, Ar-H),6.83(s,2H,Ar-H),6.44-6.37(m,1H,H-1′),4.95(t,J=7.9Hz,1H,H-3′), 3.94(d,J=10.5Hz,1H,H-5′),3.77(s,6H,OCH3),3.72(d,J=12.5Hz,1H,H-5″), 2.72-2.60(m,1H,H-2″),2.47-2.36(m,1H,H-2′),1.48(s,3H,CH3);13C NMR (100.6MHz,CD3OD)δ(ppm)164.0158.9,150.1,144.1,135.8,135.0,130.3(q,J= 311.8Hz,1C),130.2,130.1,128.2,128.1,127.3,113.4,111.8,100.6,87.6,84.8,72.9, 65.7,55.3,37.9,11.9;19F NMR(376MHz,CDCl3)δ(ppm)-35.05;m/z:cacld for C32H31F3N2NaO7S[M+Na]+,667.1702;found,667.1691.
步骤二、化合物(2)的制备:称取90mg(0.14mmol,1.0eq.)式(11)所 对应的单体,在氩气保护下溶于2mL二氯甲烷中。依次加入180μL(1.12mmol, 8.0eq.)N,N’-二异丙基乙胺,45μL(0.56mmol,4.0eq.)N-甲基咪唑,93μL(0.42 mmol,3.0eq.)(2-氰基乙氧基)-N,N’-二异丙基亚磷酰氯,常温下搅拌1小时。反 应结束后,在氩气保护下将体系减压蒸干,然后用少量二氯甲烷溶解,快速柱 层析乙酸乙酯/石油醚(v/v,3:2,+0.5体积%三乙胺)纯化得到浅黄色固体式(2) 所对应的单体71mg(0.084mmol,产率60摩尔质量%)。产物有2个异构体, 比例为:0.85:1。
31PNMR(162MHz,CDCl3)δ(ppm)150.86(s,1P),150.78(s,0.85P);19F NMR (376MHz,CDCl3)δ(ppm)-35.08,-35.15;m/z:cacld for C41H48F3N4NaO8PS [M+Na]+,867.2780;found867.2822。
实施例3:
本实施例在于说明由实施1制备的C4′-三氟甲硫基取代脱氧胸苷亚磷酰胺 单体(2)进行DNA固相合成DNA序列(12):5′-CCATXATAGC。在序列(12)
中,X为C4′-三氟甲硫基取代脱氧胸苷。
在ABI 394 DNA/RNA合成仪上通过常规程序和试剂进行1μmol寡聚核苷 酸合成。合成试剂包括Ac-dC,Bz-dA,dmf-dG,dT和实施例1制备的C4′-三氟甲 硫基取代脱氧胸苷亚磷酰胺单体(2);3重量%三氯乙酸/二氯甲烷用于脱保护; Cap A试剂:10体积%乙酸酐/10体积%吡啶/80体积%四氢呋喃(v/v/v),Cap B试剂:10体积%N-甲基咪唑/90体积%四氢呋喃(v/v);活化剂:0.25M乙硫 基四唑/乙腈;氧化剂:0.02M碘/2体积%水/20体积%吡啶/78体积%四氢呋 喃(v/v/v)。C4′-三氟甲硫基取代脱氧胸苷亚磷酰胺单体的偶合时间是10分钟。
将上述固相合成得到的DNA分子用1mL(28重量%)氨水在20℃下处理 16小时,然后,取出上清液离心浓缩后,采用20重量%的变性聚丙烯凝胶电泳 纯化。得到纯的DNA(12)经过了UPLC-MS分析鉴定。
可见,实施例1制备的C4′-三氟甲硫基取代脱氧胸苷亚磷酰胺单体(2)可 以用于常规的DNA固相合成与纯化。
实施例4:
C4′-三氟甲硫基取代尿苷的合成。
其合成步骤如下:
步骤一、化合物(14)的制备:在氩气保护下,将式(13)对应单体(0.52 g,1.8mmol,1.0eq.)与N-(三氟甲硫基)邻苯二甲酰亚胺(0.90g,3.7mmol,2.0 eq.)溶于7mL干燥的二甲基亚砜。室温下搅拌2.0小时。加入14mL二氯甲烷 稀释,用140mL饱和氯化钠水溶液清洗,有机层用无水硫酸镁干燥,用乙酸乙 酯/石油醚(梯度,v/v,1:1~3:2)柱层析,得黄色固体式(14)对应单体。
步骤二、化合物(15)的制备:在氩气保护下,称取0.44g(1.2mmol,1.0eq.) 式(14)所示的单体溶于2.4mL干燥的无水甲醇,加入87mg(2.4mmol,2.0eq.) 硼氢化钠。在冰浴条件(0℃)下,搅拌2小时。旋干溶剂,用乙酸乙酯/石油醚 (梯度,v/v,1:1~2:1)柱层析,得白色固体式(15)对应单体0.3g(1.9mmol, 两步产率45重量%)。
1H NMR(400MHz,MeOD-d4)δ(ppm):7.63(d,J=8.1Hz,1H,H6),6.16(d,J =2.9Hz,1H,H1′),5.73(d,J=8.0Hz,1H,H5),5.26(d,J=7.3Hz,1H,H3′),5.09 (dd,J=7.3,3.0Hz,1H,H2′),4.4(d,J=12.0Hz,1H,H5′),3.85(d,J=12.2Hz,1H, H5″),1.58(s,3H,CH3),1.31(s,3H,CH3).13C NMR(100.6MHz,MeOD-d4)δ (ppm):165.8,151.8,143.7,131.6(q,J=307.8Hz,SCF3),118.5,103.7,101.8,92.7, 84.7,83.7,66.2,25.1,24.9.19F NMR(376MHz,MeOD-d4)δ(ppm):-36.85.m/z: calcd for C13H15F3N2O6S[M+H]+,385.0681;found,385.0678.
步骤三、化合物(3)的制备:在氩气保护下,将2.2g(5.8mmol,1.0eq.) 式(15)对应的单体溶于29mL三氟乙酸,常温搅拌2h。旋干溶剂,用无水甲 醇/二氯甲烷(v/v/v,5:95~1:9)柱层析,得白色固体式(3)所对应的单体1.86 g(5.4mmol,产率93.5重量%)。
1H NMR(400MHz,MeOD-d4)δ(ppm):7.74(d,J=8.1Hz,1H,H6),6.20(d,J =5.5Hz,1H,H1′),5.79(d,J=8.1Hz,1H,H5),4.66(d,J=6.9Hz,1H,H3′),4.34 (dd,J=6.7,5.7Hz,1H,H2′),4.15(d,J=12.2Hz,1H,H5′),3.90(d,J=12.2Hz,1H, H5″).13C NMR(100.6MHz,MeOD-d4)δ(ppm):165.8,152.1,142.7,132.1(q,J= 307.3Hz,SCF3),103.6,101.8,91.4,73.7,72.3,66.1.19F NMR(376MHz, MeOD-d4)δ(ppm):-36.44.m/z:calcd for C10H11F3N2O6S[M+H]+,345.0368; found,345.0343。
实施例5:
C4′-三氟甲硫基取代尿苷亚磷酰胺单体的合成。
其合成步骤如下:
步骤一、化合物(16)的制备:在氩气保护下,将0.3g(0.87mmol,1.0eq.) 式(3)所对应的单体加入到7mL干燥吡啶中,加入0.35g(1.05mmol,1.2eq.) 的4,4′-二甲氧基三苯甲基氯,常温搅拌5h。旋干除去溶剂,用无水甲醇/二氯甲 烷(梯度,v/v,2:96~6:94)柱层析,得式(16)对应的单体0.5g(0.77mmol)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ(ppm):11.54(s,1H,NH),7.67(d,J=8.1Hz, 1H,H6),7.42-7.25(m,9H,DMTr),6.92(d,J=8.0Hz,4H,DMTr),6.42(d,J=5.9 Hz,1H,OH),6.08(d,J=5.2Hz,1H,H1′),5.76(d,J=5.3Hz,1H,OH),5.48(d,J= 8.2Hz,1H,H5),4.72(t,J=6.2Hz,1H,H3′),4.40-4.36(m,1H,H2′),3.74(s,6H, OCH3),3.68(d,J=10.2Hz,1H,H5′),3.42(d,J=10.3Hz,1H,H5″),13C NMR (100.6MHz,DMSO-d6)δ(ppm):163.1,158.3,150.4,149.6,144.3,141.1,136.2, 135.0,134.9,130.7(d,J=308Hz,SCF3),129.9,127.9,127.0,123.9,113.3,102.5, 100.5,89.8,86.6,71.6,71.3,66.6,55.1.19F NMR(376MHz,MeOH-d4)δ(ppm): -34.64.m/z:calcd for C31H29F3N2O8S[M+H]+,647.1675;found,647.1681.
步骤二、化合物(17)的制备:在氩气保护下,称取0.17g(0.26mmol,1.0 eq.)式(16)所对应的单体,溶于1mL干燥的吡啶中。依次加入0.13g (0.78mmol,3.0eq.)硝酸银及0.12g(0.78mmol,3.0eq.)叔丁基二甲基氯硅烷, 常温下搅拌12小时。反应结束后,旋干溶剂,用乙酸乙酯/石油醚(v/v,1:1,) 柱层析,得(17)所对应的单体0.3g(1.9mmol,两步产率45重量%)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ(ppm):11.53(d,J=1.9Hz,1H,NH),7.72(d, J=8.1Hz,1H,H6),7.40-7.25(m,9H,DMTr),6.92(d,J=8.2Hz,DMTr),6.48(d,J =6.6Hz,1H,),6.06(d,J=4.4Hz,1H,),5.37(dd,J=8.0,2.0Hz,1H,H5),4.74(t,J =6.4Hz,1H,H3′),4.44(dd,J=6.1,4.6Hz,1H,H2′),3.75-3.71(m,7H,OCH3,H5′), 3.46(d,J=10.5Hz,1H,H5″),0.86(s,9H,C(CH3)3),0.08(s,3H,CH3),0.06(s,3H, CH3).13C NMR(100.6MHz,DMSO-d6)δ(ppm):162.8,158.3,150.2,144.3,140.7, 130.7(q,J=308.3Hz,SCF3),129.9,127.9,127.0,113.3,102.3,100.4,90.0,86.7, 73.5,71.1,65.1,55.1,25.5,17.9,-4.8,-5.3.19F NMR(376MHz,MeOH-d4) δ(ppm):-34.62.m/z:calcd for C37H43F3N2O8SSi[M+H]+,761.2540;found, 761.2501.
步骤三、化合物(4a)的制备:氩气保护下,将0.15g(0.20mmol,1.0eq.)式 (17)所对应的单体溶于干燥的二氯甲烷中,加入162μL(1.97mmol,10.0eq.) 的DIPEA,在加入180μL(0.59mmol,3.0eq.)的氰乙氧基-N,N-二乙丙基亚磷酸 酰氯,室温反应4h,一滴甲醇淬灭,旋干,过柱。石油醚/乙酸乙酯(v/v,40%) 柱层析分离,得固体0.15g(0.16mmol,总产率79.0%),Rf=0.6(石油醚/乙酸 乙酯:50%,v/v)。
31P NMR(162MHz,CDCl3)δ(ppm):152.58.19F NMR(376MHz,CDCl3) δ(ppm):-35.09.
步骤四、化合物(4b)的制备:称取0.41g(0.54mmol,1.0eq.)式(17) 所对应的单体,在氩气保护下溶于2mL二氯甲烷中。依次加入0.9mL(10.79 mmol,20.0eq.)N-甲基咪唑,0.4mL(2.7mmol,5.0eq.)N,N-二乙基氯代亚磷酸 甲酯,常温下搅拌2小时。反应结束后,在氩气保护下将体系减压蒸干,然后 用少量二氯甲烷溶解,乙酸乙酯/石油醚(v/v,1:1,+0.5体积%三乙胺)快速柱 层析,得式(1)所对应的单体0.37g(0.41mmol,产率76.8重量%)。
31P NMR(162MHz,CDCl3)δ(ppm):152.68,148.47.19F NMR(376MHz,CDCl3) δ(ppm):-35.19,-35.21。
实施例6:
本实施例在于说明由实施5制备的C4′-三氟甲硫基代尿嘧啶核苷亚磷酰胺 单体(4b)进行RNA固相合成RNA序列(18):5′-CCAUXAUAGC。在序列(18) 中,X为C4′-三氟甲硫基代尿嘧啶核苷。
在ABI 394 DNA/RNA合成仪上通过常规程序和试剂进行1μmol寡聚核苷 酸合成。合成试剂包括Ac-rC,Bz-rA,Ac-rG,rU和实施例1制备的C4′-三氟甲硫 基代尿嘧啶亚磷酰胺单体(4b);3重量%三氯乙酸/二氯甲烷用于脱保护;Cap A试剂:10体积%乙酸酐/10体积%吡啶/80体积%四氢呋喃(v/v/v),Cap B 试剂:10体积%N-甲基咪唑/90体积%四氢呋喃(v/v);活化剂:0.25M乙硫基 四唑/乙腈;氧化剂:0.02M碘/2体积%水/20体积%吡啶/78体积%四氢呋喃 (v/v/v)。C4′-三氟甲硫基代尿嘧啶核苷亚磷酰胺单体的偶合时间是0.5小时。
将上述固相合成得到的RNA分子用0.75mL(28重量%)氨水混合0.25mL 无水乙醇在室温下处理36h,然后,取出上清液离心浓缩后,加入0.5mL三乙 胺三氢三氟甲硫基酸盐处理24h,经C18柱脱盐处理后,离心浓缩,采用20重 量%的变性聚丙烯凝胶电泳纯化。得到纯的RNA(18)经过了UPLC-MS分析 鉴定。
可见,实施例1制备的C4′-三氟甲硫基代尿嘧啶亚磷酰胺单体(4b)可以 用于常规的RNA固相合成与纯化。
以上详细描述了本发明的优选实施方式,但是,本发明并不限于此。在本 发明的技术构思范围内,可以对本发明的技术方案进行多种简单变型,包括各 个技术特征以任何其它的合适方式进行组合,这些简单变型和组合同样应当视 为本发明所公开的内容,均属于本发明的保护范围。
Claims (16)
2.一种权利要求1所述C4′-三氟甲硫基取代脱氧胸苷的制备方法,其特征在于,该方法包括以下步骤:
(1)将N-(三氟甲硫基)邻苯二甲酰亚胺和三乙胺、无水二氯甲烷形成第一混合溶液;15分钟后将所述第一混合溶液与3′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-5′-醛-2′-β-D-苏糖脱氧胸苷进行反应,且所述N-(三氟甲硫基)邻苯二甲酰亚胺与所述三乙胺、所述无水乙腈和所述3′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-5′-醛-2′-β-D-苏糖脱氧胸苷的用量比为3mmol:6mmol:10mL:1mmol,将反应后得到的溶液用二氯甲烷稀释后洗涤、干燥、过滤、柱层析得到3′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-4′-C-(三氟甲硫基)-5′-醛-2′-脱氧-β-D-苏糖胸苷;
(2)将步骤(1)得到的3′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-4′-C-(三氟甲硫基)-5′-醛-2′-脱氧-β-D-苏糖胸苷与无水甲醇进行第二混合,形成第二混合溶液;再将所述第二混合溶液与硼氢化钠进行反应,所述3′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-4′-(三氟甲硫基)-5′-醛-2′-脱氧-β-D-苏糖胸苷与所述无水甲醇、所述硼氢化钠用量的比为1mmol:10mL:1.5mmol;旋蒸除去溶剂,用二氯甲烷溶解后洗涤、干燥、过滤、柱层析得到3′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-4′-C-(三氟甲硫基)-2′-脱氧-β-D-苏糖胸苷;
(3)将步骤(2)得到的3′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-4′-C-(三氟甲硫基)-2′-脱氧-β-D-苏糖胸苷与4-二甲氨基吡啶、三乙胺、无水二氯甲烷进行第三混合,形成第三混合溶液;再将所述第三混合溶液与4,4′-二甲氧基三苯甲基氯进行反应,所述3′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-4′-C-(三氟甲硫基)-2′-脱氧-β-D-苏糖胸苷与所述4-二甲氨基吡啶、所述三乙胺、所述无水二氯甲烷、所述4,4′-二甲氧基三苯甲基氯用量的比为1mmol:2mmol:4mmol:20mL:3mmol;旋蒸除去溶剂,用二氯甲烷溶解后洗涤、干燥、过滤、柱层析得到3′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-4′-C-(三氟甲硫基)-5′-O-(二甲氧基三苯甲基)-2′-脱氧-β-D-苏糖胸苷;
(4)将四正丁基氟化铵的四氢呋喃溶液与乙酸混合调节pH为7后,加入无水四氢呋喃进行第四混合,形成第四混合溶液;再将所述第四混合溶液与步骤(3)得到的3′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-4′-C-(三氟甲硫基)-5′-O-(二甲氧基三苯甲基)-2′-脱氧-β-D-苏糖胸苷进行反应,且所述四正丁基氟化铵的四氢呋喃溶液与所述乙酸、所述无水四氢呋喃、所述3′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-4′-C-(三氟甲硫基)-5′-O-(二甲氧基三苯甲基)-2′-脱氧-β-D-苏糖胸苷的用量比为1.05mmol:3mmol:10mL:1mmol;然后将反应得到的有机相用乙酸乙酯稀释后洗涤、干燥、过滤、柱层析得到4′-C-(三氟甲硫基)-5′-O-(二甲氧基三苯甲基)-2′-脱氧-β-D-苏糖胸苷;
(5)将重铬酸吡啶鎓与分子筛、无水二氯甲烷进行第五混合,形成第五混合溶液;再将所述第五混合溶液与步骤(4)得到的4′-C-(三氟甲硫基)-5′-O-(二甲氧基三苯甲基)-2′-脱氧-β-D-苏糖胸苷进行反应,且所述重铬酸吡啶鎓与所述分子筛、所述无水二氯甲烷、所述4′-C-(三氟甲硫基)-5′-O-(二甲氧基三苯甲基)-2′-脱氧-β-D-苏糖胸苷的用量比为2mmol:1g:10mL:1mmol;然后将反应得到的有机相旋干后,用乙酸乙酯溶解后硅藻土过滤、旋干得到3′-脱氧-3′-氧代-4′-C-(三氟甲硫基)-5′-O-(二甲氧基三苯甲基)-2′-脱氧-β-D-苏糖胸苷中间体;
(6)将步骤(5)得到的中间体与无水甲苯、无水甲醇进行第六混合,形成第六混合溶液;再将所述第六混合溶液与对甲基苯磺酸进行前段反应,之后加入硼氢化钠继续后段反应,且所述中间体所述无水甲苯、所述无水甲醇、所述对甲基苯磺酸以及所述硼氢化钠的用量比为1mmol:40mL:1mL:80mg:2mmol;用乙酸调节pH至中性,旋蒸除去溶剂,用二氯甲烷溶解后柱层析得到4′-C-(三氟甲硫基)-2′-脱氧-β-D-胸苷。
3.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于,在步骤(1)中,所述反应的条件包括:温度为18-25℃,时间为4-6小时,搅拌速度为250-500转/分钟;
在步骤(2)中,所述反应的条件包括:温度为18-25℃,时间为10-15分钟,搅拌速度为250-500转/分钟;
在步骤(3)中,所述4,4′-二甲氧基三苯甲基氯分三次加入所述第三混合溶液中,间隔时间6小时;以及,
所述反应的条件包括:温度为18-25℃,时间为20-24小时,搅拌速度为250-500转/分钟;
在步骤(4)中,所述四正丁基氟化铵的四氢呋喃溶液浓度为1摩尔每升;所述乙酸以滴加的方式加入到所述四正丁基氟化铵的四氢呋喃溶液中调节pH为7,以及
所述反应的条件包括:温度为18-25℃,时间为3-4小时,搅拌速度为250-500转/分钟;
在步骤(5)中,所述反应的条件包括:温度为18-25℃,时间为3-4小时,搅拌速度为250-500转/分钟;
在步骤(6)中,所述反应的条件包括:温度为18-25℃,前段时间为1.5-2.0小时;后段时间为10-15分钟,搅拌速度为250-500转/分钟。
5.一种权利要求4所述C4′-三氟甲硫基取代脱氧胸苷亚磷酰胺单体的制备方法,其特征在于,该方法包括以下步骤:
(1)将4′-C-(三氟甲硫基)-2′-脱氧-β-D-胸苷与吡啶以及4,4′-二甲氧基三苯甲基氯进行反应,且所述4′-C-(三氟甲硫基)-2′-脱氧-β-D-胸苷与所述吡啶以及所述4,4′-二甲氧基三苯甲基氯的用量比为1mmol:10mL:1.3mmol;旋蒸除去溶剂,用二氯甲烷溶解后然后将有机相洗涤、过滤、干燥、柱层析得到4′-C-(三氟甲硫基)-5′-O-(二甲氧基三苯甲基)-2′-脱氧-β-D-胸苷;
(2)将步骤(2)得到的4′-C-(三氟甲硫基)-5′-O-(二甲氧基三苯甲基)-2′-脱氧-β-D-胸苷与二氯甲烷、N,N′-二异丙基乙胺以及N-甲基咪唑进行第七混合,形成第七混合溶液;再将所述第七混合溶液与(2-氰基乙氧基)-N,N′-二异丙基亚磷酰氯进行反应,且所述4′-C-(三氟甲硫基)-5′-O-(二甲氧基三苯甲基)-2′-脱氧-β-D-胸苷与所述二氯甲烷、所述N,N′-二异丙基乙胺、所述2-甲基咪唑、所述(2-氰基乙氧基)-N,N′-二异丙基亚磷酰氯的用量比为1mmol:10mL:8mmol:4mmol:3mmol;旋蒸除去溶剂,用二氯甲烷溶解后然后将有机相洗涤、过滤、干燥、柱层析得到3′-O-[(2-氰基乙氧基)-N,N′-二异丙基亚磷酰胺]-4′-C-(三氟甲硫基)-5′-O-(二甲氧基三苯甲基)-2′-脱氧-β-D-胸苷,即C4′-三氟甲硫基取代脱氧胸苷亚磷酰胺单体。
6.根据权利要求5所述的制备方法,其特征在于,在步骤(1)中,所述反应的条件包括:温度为18-25℃,时间为20-24小时,搅拌速度为250-500转/分钟;
在步骤(2)中,所述反应的条件包括:温度为18-25℃,时间为0.5-1小时,搅拌速度为250-500转/分钟。
7.一种含有C4′-三氟甲硫基取代脱氧胸苷定点修饰的DNA的制备方法,其特征在于,该制备方法中的合成试剂包括权利要求5-6任意一项所述的制备方法制备得到的权利要求4所述的C4′-三氟甲硫基取代脱氧胸苷亚磷酰胺单体。
8.根据权利要求7所述的制备方法,其中,该制备方法在ABI 394DNA/RNA合成仪上进行以得到寡聚核苷酸,其中:
所述合成试剂还包括Ac-dC、Bz-dA、dmf-dG和dT亚磷酰胺单体;
三氯乙酸/二氯甲烷用于脱保护;
CapA试剂为乙酸酐、吡啶和四氢呋喃的组合物,且所述乙酸酐、所述吡啶和所述四氢呋喃的体积比为10体积%:(5-15)体积%:(75-85)体积%;
Cap B试剂为N-甲基咪唑和四氢呋喃的组合物,且所述N-甲基咪唑和所述四氢呋喃的体积比为10体积%:90体积%;
活化剂为乙硫基四唑和乙腈的组合物;
氧化剂为碘、水、吡啶和四氢呋喃的组合物,且所述碘、所述水、所述吡啶和所述四氢呋喃的用量比为0.02M:(1-2)体积%:(10-30)体积%:(75-85)体积%;以及,
所述C4′-三氟甲硫基取代脱氧胸苷亚磷酰胺单体的偶合时间为10分钟;
将上述固相合成得到的寡聚核苷酸用1mL浓度为28重量%的氨水在20℃下处理16-60小时,然后,取出上清液离心浓缩后,经C18柱脱盐处理后,离心浓缩,采用20重量%的变性聚丙烯凝胶电泳纯化。
10.一种权利要求9所述C4′-三氟甲硫基取代尿苷的制备方法,其特征在于,该方法包括以下步骤:
(1)将2′,3′-O-异亚丙基-5′-脱氧-5′-尿嘧啶醛与N-(三氟甲硫基)邻苯二甲酰亚胺和二甲基亚砜进行第八混合,形成第八混合液;再将所述第八混合溶液与1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯进行反应;所述2',3'-O-异亚丙基-5'-脱氧-5'-尿嘧啶醛与所述N-(三氟甲硫基)邻苯二甲酰亚胺、所述二甲基亚砜和所述1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯的用量比为1mmol:2mmol:4mL:0.5mL;将反应得到的有机相洗涤、过滤、干燥、柱层析得到2′,3′-O-异亚丙基-4′-C-三氟甲硫基-5′-脱氧-5'-尿嘧啶醛;
(2)将步骤(1)得到的2′,3′-O-异亚丙基-4′-C-三氟甲硫基-5′-脱氧-5′-尿嘧啶醛与无水甲醇进行第九混合,形成第九混合溶液;再将所述第九混合溶液与硼氢化钠进行反应;所述2',3'-O-异亚丙基-4'-C-三氟甲硫基-5'-脱氧-5'-尿嘧啶醛与所述无水甲醇、所述硼氢化钠用量的比为1mmol:4mL:2mmol;旋蒸除去溶剂,柱层析得到产物2′,3′-O-异亚丙基-4′-C-三氟甲硫基尿嘧啶;
(3)将步骤(2)得到的2′,3′-O-异亚丙基-4′-C-三氟甲硫基尿嘧啶与三氟乙酸进行反应;所述2',3'-O-异亚丙基-4'-C-三氟甲硫基尿嘧啶与所述三氟乙酸的用量比为1mmol:5mL;旋蒸除去溶剂,柱层析得到4′-C-三氟甲硫基尿苷。
11.根据权利要求10所述的制备方法,其特征在于,在步骤(1)中,所述反应的条件包括:温度为18-25℃,时间为1.5-2小时,搅拌速度为250-500转/分钟;
在步骤(2)中,所述反应的条件包括:温度为0-3℃,时间为1-2小时,搅拌速度为250-500转/分钟;
在步骤(3)中,所述三氟乙酸纯度为80%;所述反应的条件包括:温度为18-25℃,时间为1.5-2小时,搅拌速度为250-500转/分钟。
13.一种权利要求12所述C4′-三氟甲硫基取代尿苷亚磷酰胺单体的制备方法,其特征在于,该方法包括以下步骤:
(1)将4′-C-三氟甲硫基尿苷与吡啶、4,4′-二甲氧基三苯甲基氯进行反应;所述4′-C-三氟甲硫基尿苷与所述吡啶以及所述4,4′-二甲氧基三苯甲基氯的用量比为1mmol:8mL:1.2mmol;旋蒸除去溶剂,用二氯甲烷溶解后然后将有机相洗涤、过滤、干燥、柱层析得到4′-C-三氟甲硫基-5′-O-二甲氧基三苯甲基尿苷;
(2)将步骤(1)得到的产物4′-C-三氟甲硫基-5′-O-二甲氧基三苯甲基尿苷与吡啶、硝酸银进行第十混合,形成第十混合液;再将所述第十混合溶液与叔丁基二甲基氯硅烷进行反应;所述4′-C-三氟甲硫基-5′-O-二甲氧基三苯甲基尿苷与所述吡啶、所述硝酸银以及叔丁基二甲基氯硅烷的用量比为1mmol:4mL:3mmol:3mmol;旋蒸除去溶剂,用二氯甲烷溶解后然后将有机相洗涤、过滤、干燥、柱层析得到2′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-4′-C-三氟甲硫基-5′-O-二甲氧基三苯甲基尿苷;
(3)将步骤(2)得到的2′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-4′-C-三氟甲硫基-5′-O-二甲氧基三苯甲基尿苷与二氯甲烷、2-甲基咪唑进行第十一混合,形成第十一混合液;再将所述第十一混合溶液与N,N-二乙基氯代亚磷酸甲酯或(2-氰基乙氧基)-N,N-二异丙基亚磷酰氯进行反应;所述2′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-4′-C-三氟甲硫基-5′-O-二甲氧基三苯甲基尿苷与所述二氯甲烷、所述2-甲基咪唑、所述N,N-二乙基氯代亚磷酸甲酯/(2-氰基乙氧基)-N,N-二异丙基亚磷酰氯的用量比为1mmol:10mL:0.9mL:0.4mL;旋蒸除去溶剂,用二氯甲烷溶解后然后将有机相洗涤、过滤、干燥、柱层析得到2′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-3′-[(2-甲氧基)-N,N-二乙基亚磷酰胺]-4′-C-三氟甲硫基-5′-O-二甲氧基三苯甲基尿苷或2′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-3′-[(2-氰基乙氧基)-N,N′-二异丙基亚磷酰胺]-4′-C-三氟甲硫基-5′-O-二甲氧基三苯甲基尿苷,即C4′-三氟甲硫基代尿苷亚磷酰胺单体。
14.根据权利要求13所述的制备方法,其特征在于,在步骤(1)中,所述反应的条件包括:温度为18-25℃,时间为5-6小时,搅拌速度为250-500转/分钟;
在步骤(2)中,所述反应的条件包括:温度为18-25℃,时间为12-13小时,搅拌速度为250-500转/分钟;
在步骤(3)中,所述反应的条件包括:温度为18-25℃,时间为1.5-2小时,搅拌速度为250-500转/分钟。
15.一种含有C4′-三氟甲硫基代尿苷定点修饰的RNA的制备方法,其特征在于,该制备方法中的合成试剂包括权利要求13-14任意一项所述的制备方法制备得到的权利要求12所述的C4′-三氟甲硫基代尿苷亚磷酰胺单体。
16.根据权利要求15所述的制备方法,其中,该制备方法在ABI 394DNA/RNA合成仪上进行以得到寡聚核苷酸,其中:
所述合成试剂还包括叔丁基二甲基氯硅烷保护2′-OH的Ac-rC、Bz-rA、Ac-rG和rU;
三氯乙酸/二氯甲烷用于脱保护;
CapA试剂为乙酸酐、吡啶和四氢呋喃的组合物,且所述乙酸酐、所述吡啶和所述四氢呋喃的体积比为10体积%:(5-15)体积%:(75-85)体积%;
Cap B试剂为N-甲基咪唑和四氢呋喃的组合物,且所述N-甲基咪唑和所述四氢呋喃的体积比为10体积%:90体积%;
活化剂为乙硫基四唑和乙腈的组合物;
氧化剂为碘、水、吡啶和四氢呋喃的组合物,且所述碘、所述水、所述吡啶和所述四氢呋喃的用量比为0.02M:(1-2)体积%:(10-30)体积%:(75-85)体积%;以及,
所述C4′-三氟甲硫基代RNA亚磷酰胺单体的偶合时间为0.5-1小时;
将上述固相合成得到的寡聚核苷酸用0.75mL浓度为28重量%的氨水混合0.25mL无水乙醇在室温下处理34-36h,然后,取出上清液离心浓缩后,加入0.5mL三乙胺三氢三氟甲硫基酸盐处理20-24h,经C18柱脱盐处理后,离心浓缩,采用20重量%的变性聚丙烯凝胶电泳纯化。
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Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
QIANG LI, 等: "4′-Fluorinated RNA: Synthesis, Structure, and Applications as a Sensitive 19 F NMR Probe of RNA Structure and Function", 《J. AM. CHEM. SOC.》, vol. 142, 18 February 2020 (2020-02-18), pages 4739 - 4748, XP055924601, DOI: 10.1021/jacs.9b13207 * |
Cited By (2)
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---|---|---|---|---|
CN116444593A (zh) * | 2023-04-28 | 2023-07-18 | 南通大学 | 一种7-脱氮鸟苷亚磷酰胺单体的合成方法 |
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