KR101279393B1 - 보호된 3'-아미노 뉴클레오시드 단량체의 합성 - Google Patents

보호된 3'-아미노 뉴클레오시드 단량체의 합성 Download PDF

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Abstract

직교 보호된 3'-아미노 뉴클레오시드 단량체 및 이것의 효율적인 합성 방법이 개시된다. 방법은 비보호된 뉴클레오시드 염기의 존재 하에 3'-아미노기의 선택적 보호를 사용한다.
뉴클레오시드, 단량체, 아데노신, 구아노신, 시토신, 티미딘, 보호기.

Description

보호된 3'-아미노 뉴클레오시드 단량체의 합성{Synthesis of Protected 3'-Amino Nucleoside Monomers}
본 발명은 올리고뉴클레오티드 유사체의 제조 합성에 유용한 직교 보호된 3'-아미노 뉴클레오시드 단량체의 효율적인 합성 방법, 및 이런 방법에 의하여 제조된 직교 보호된 단량체에 관한 것이다.
인용 문헌
Figure 112007007100717-pct00001
Figure 112007007100717-pct00002
표적 핵산 서열 또는 단백질과의 특정 결합을 기초로 하여, 올리고뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오티드 유사체를 치료제로 사용하는 것은 광범위하게 연구되어 왔다. 구조적으로 변형된 올리고뉴클레오티드 유사체는 천연(포스포디에스터-연결) 올리고뉴클레오티드의 뉴클레아제 감수성이 결여되도록 설계되고, 어떤 경우에는 표적으로의 결합 향상 또는 향상된 결합 특이성과 같은 다른 이점을 보이도록 설계되었다. 올리고뉴클레오티드 유사체의 이런 종류의 하나는 N3'→P5' 포스포로디아미데이트-연결 올리고뉴클레오티드이다(Gryaznov 및 Chen, 1994; Chen et al., 1994). 이들 화합물은 뉴클레아제 저항성이 있으며, 상보적 RNA 및 듀플렉스 DNA 표적과 안정한 듀플렉스를 형성하고, 생체 내 및 생체 외에서 상당한 서열-특이적 안티센스 활성을 증명하였다(Gryaznov et al., 1995; Escude et al., 1996; Gryaznov et al., 1996; Giovannangeli et al., 1997; Skorski et al., 1997). 관련 N3'→P5' 티오포스포라미데이트 올리고뉴클레오티드는 N3'→P5' 포스포라미데이트의 높은 RNA 결합 친화도를 유지하고, 또한 개선된 산 안정성을 보여준다(Pongracz 및 Gryaznov, 1999; Gryaznov et al., 2001). 어떤 N3'→P5' 티오포스포라미데이트 올리고뉴클레오티드는 치료학적으로 유망한 텔로머라제 저해 활성을 나타냈다(Gryaznov et al., 2003; Asai et al., 2003; Wang et al., 2004).
단계적으로, N3'→P5' 포스포라미데이트 또는 티오포스포라미데이트 올리고뉴클레이티드의 서열 제어된 제조는 3'-아미노 뉴클레오시드 단량체를 사용하는데, 3'-아미노기는 첨가 중에는 보호되고, 다음에 성장하는 올리고뉴클레오티드 사슬 에 추가 단량체의 첨가를 위해 탈보호된다(예를 들면 Gryaznov 및 Chen, 1994; Pongracz 및 Gryaznov, 1999 참조). 합성 중에 전형적으로 보호되어 있는 뉴클레오시드 염기상의 기는 일차 아미노기이기 때문에, 이들 기가 존재하는 데에서 3'-아미노기의 보호에 대한 필요는 이들 단량체의 제조를 복잡하게 만들었다. 기존 과정(예를 들면 Nelson et al., 1997 참조)은 보호를 위한 복수 단계를 수반하여, 3'-히드록실의 3'-아지도(-N3)기로의 전환을 일반적으로 포함하며, 이것은 나중에 3'-아민으로 환원된다. 이들 과정은 시간 소비적이고, 고비용이며, 그리고 단량체의 낮은 수율을 발생시킨다. 따라서 이들 합성에 대한 효율 개선이 요구되며, 이는 N3'→P5' 포스포라미데이트 또는 티오포스포라미데이트 올리고뉴클레오티드 제조를 용이하게 할 것이다.
발명의 개요
한 관점에서 본 발명은 보호된 뉴클레오시드 염기 및 보호된 3'-아미노기를 갖는 아데노신, 구아노신 또는 시토신 단량체의 제조 방법을 제공하며, 여기서 염기 및 3'-아미노기는 직교 보호된다. 한 구체예에서, 방법은 하기의 단계를 포함한다.
(a) 5'-히드록실 기, 뉴클레오시드 염기, 및 3'-아미노기가 비보호되어 있는 3'-아미노-3'-데옥시 아데노신, 시토신, 또는 구아노신 단량체를 제공하는 단계;
(b) 3'-아미노기를 제 1 보호기와 선택적으로 반응시키고;
5'-히드록실기를 제 2 보호기와 반응시키고; 그리고
뉴클레오시드 염기를 제 3 보호기와 반응시키는 단계이며;
여기서 제 1 보호기는 뉴클레오시드 염기를 탈보호하지 않는 조건 하에서 3'-아미노기로부터 제거될 수 있으며, 제 2 보호기는 뉴클레오시드 염기 또는 3'-아미노기를 탈보호하지 않는 조건 하에서 5'-히드록실기로부터 제거될 수 있다. 방법은 더 나아가 제 2 보호기를 뉴클레오시드 염기 또는 3'-아미노기를 탈보호하지 않는 조건 하에서 5'-히드록실기로부터 제거하는 (c) 단계를 포함할 수 있다.
제 1 보호기는 산에 불안정한, 예를 들면 트리페닐메틸(트리틸), 모노메톡시트리틸(MMT), 또는 디메톡시트리틸(DMT)과 같은 트리아릴메틸기일 수 있다. 또 다른 구체예에서, 제 1 보호기는 플루오레닐메톡시카르보닐(Fmoc) 또는 이것의 유도체이며, 이것은 DBU 또는 피페리딘 같은 염기성 아민으로 제거될 수 있다.
한 구체예에서, 아데노신 또는 시토신 단량체를 위하여 사용되는 바람직한 제 2 및 제 3 보호기는 둘 다 예를 들면 벤조일기와 같은 아실기이며, (c)의 조건은 히드록사이드 이온으로의 온화한 처리를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 제 2 보호기는 염기에 불안정한 예를 들면 트리메틸실릴(TMS) 에테르와 같은 트리알킬 실릴 에테르이며,제 3 보호기는 아실기이고, 그리고 (c)의 조건은 히드록사이드 이온으로의 온화한 처리를 포함한다.
다른 구체예에서, 제 2 보호기는 플루오라이드에 불안정한 실릴 에테르이고, 제 3 보호기는 아실기이며, 그리고 (c)의 조건은 플루오라이드 이온으로의 처리를 포함한다. 이러한 플로라이드에 불안정한 실릴 에테르는 예를 들면 tert-부틸디메틸 실릴 에테르, tert-부틸디페닐 실릴 에테르, 디페닐메틸 실릴 에테르, 및 트리(이소프로필) 실릴 에테르를 포함한다. 한 구체예에서, 플루오라이드에 불안정한 실릴 에테르는 tert-부틸디메틸 실릴(TBDMS) 에테르이다.
대안적 구체예에서, 방법은 하기의 단계를 포함한다.
(a) 5'-히드록실기, 뉴클레오시드 염기, 및 3'아미노기가 비보호 되어있는 3'-아미노-3'-데옥시 아데노신, 시토신, 또는 구아노신 단량체를 제공하는 단계;
(b) 3'-아미노기를 제 1 보호기와 선택적으로 반응시키고; 뉴클레오시드 염기를 또 다른 보호기와 선택적으로 반응시키는 단계이며;
여기서 제 1 보호기는 뉴클레오시드 염기가 탈보호되지 않는 조건 하에서 3'-아미노기로부터 제거될 수 있다.
방법의 이 구체예에서, 5'-OH기는 뉴클레오시드 염기의 보호 조건하에서 실질적으로 미반응으로 남아있으며, 별도의 보호를 요구하지 않는다. 한 구체예에서, 단량체는 시토신 단량체이고, 제 1 보호기는 상술한 바와 같으며, 그리고 다른 보호기는 아실기로서, 바람직하게는 벤조일기이다. 아실 보호기는 바람직하게는 무수 아실과의 반응에 의하여 형성된다.
다른 구체예에서, 단량체는 구아노신 또는 아데노신 단량체이고, 제 1 보호기는 상술한 바와 같으며, 그리고 또 다른 보호기는 디알킬포름아미디닐기와 같은 포름아미디닐기이다.
관련된 측면에서, 본 발명은 자유 5'-히드록실기 및 보호된 3'-아미노기를 갖는 티미딘 단량체의 제조 방법을 제공하는데, 방법은 하기를 포함한다.
(a) 5'-히드록실기 및 3'-아미노기가 비보호 되어있는 3'-아미노-3'-데옥시 티미딘 단량체를 제공하는 단계; 및
(b) 3'-아미노기를 제 1 보호기와 선택적으로 반응시키는 단계.
제 1 보호기는 산에 불안정할 수 있는데; 예를 들면 트리페닐메틸(트리틸)과 같은 트리아릴메틸기이다. 또 다른 구체예에서, 제 1 보호기는 플루오레닐메톡시카르보닐(Fmoc) 또는 이것의 유도체로서, DBU 또는 피페리딘과 같은 염기성 아민으로 제거될 수 있다.
이 합성 방법에서 시작 및 생성 단량체는 바람직하게는 수소, 히드록시, 저급 알콕시, 저급 알킬, 및 플루오로로부터 선택되는 2'기를 포함한다. 선택된 구체예에서, 단량체는 수소, 히드록시, 메톡시, 및 플루오로로부터 선택된 2'기를 포함한다. 한 구체예에서, 단량체는 2',3'-디데옥시 단량체로서, 2'기가 수소이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 보호된 3'-아미노기, 및 (i) 비보호 되거나, 또는 (ii) 뉴클레오시드 염기를 탈보호하지 않는 조건하에서 보호된 3'-아미노기가 탈보호될 수 있도록 보호된 뉴클레오시드 염기를 갖는 것을 특징으로 하는 아데노신, 구아노신 또는 시토신 단량체를 제공한다. 선택된 구체예에서, 3'-아미노기는 산에 불안정한 보호기로 보호되는데, 예를 들면 트리페닐메틸(트리틸)과 같은 트리아릴메틸기이다. 다른 구체예에서, 3'-아미노기는 플루오레닐메톡시카르보닐(Fmoc) 또는 이것의 유도체이며, DBU 또는 피페리딘과 같은 염기성 아민으로 제거될 수 있다.
한 구체예에서, 뉴클레오시드 염기는 비보호되어 있으며; 다른 구체예에서는, 뉴클레오시드 염기는 아실기로 보호되어 있다. 바람직하게는, 아실기는 단량체가 아데노신 또는 시토신 단량체일 때 벤조일이 되고, 단량체가 구아노신 단량체일 때는 이소부티릴이다. 또 다른 구체예에서, 뉴클레오시드 염기는 포름아미디닐기로 보호되며, 바람직하게는 뉴클레오시드 염기는 디알킬포름아미디닐기로 보호된다.
단량체의 5'-히드록실기는 비보호 되거나, 또는 뉴클레오시드 염기 또는 3'-아미노기를 탈보호하지 않는 조건 하에서 탈보호될 수 있도록 보호될 수 있다. 예를 들면, 상술한 바와 같이 온화한 염기 또는 플루오라이드에 불안정한 실릴 에테르로 보호될 수 있다.
단량체는 바람직하게는 수소, 히드록시, 저급 알콕시, 저급 알킬, 및 플루오로로부터 선택된 2'기를 포함한다. 선택된 구체예에서, 단량체는 수소, 히드록시, 메톡시, 및 플루오로로부터 선택된 2'기를 포함한다. 한 구체예에서, 단량체는 2',3'-디데옥시 단량체로서, 2'기가 수소이다.
본 발명의 이들 및 다른 목적과 특징은 하기 본 발명의 상세한 설명을, 첨부된 도면과 함께 읽을 때에 보다 충분히 명확해질 것이다.
도 1은 대안적인 3'-아미노 아데노신 단량체의 대표적 합성 방법을 나타내는 반응도이며, 또한 본 발명의 다양한 구체예에 따라 3'-아미노 시토신 단량체의 합 성에 적용될 수 있다.
도 2A는 본 발명의 한 구체예에 따른 3'-아미노 구아노신 단량체의 대표적 합성 방법을 나타낸다.
도 2B는 본 발명의 한 구체예에 따른 대안적인 3'-아미노 구아노신 단량체의 대표적 합성 방법을 나타낸다.
도 2C는 본 발명의 또 다른 구체예에 따른 3'-아미노 시토신 단량체의 합성 방법을 나타낸다.
도 3은 본 발명의 또 다른 구체예에 따른 3'-아미노 티미딘 단량체의 대표적 합성 방법을 나타낸다.
I. 정의
아래 용어는 달리 나타내지 않는 한 하기의 의미를 갖는다.
동일 분자에서 보호된 복수의 기능기에 관한 "직교 보호"는 임의의 선택된 기를 탈보호하되, 다른 기를 탈보호하지 않는 것이 가능하다는 것을 가리킨다.
비보호된 복수의 기능기를 갖는 분자에서 표적 기능기의 보호에 관한 "선택적 보호"는 보호 시약과 분자와의 반응에서 표적 기능기가 임의의 비-표적 기능기 보다 더 높은 정도로 보호된 것을 가리킨다. 임의의 비-표적 기능기에 대한 표적 기능기의 반응 정도는 1:1 보다 크며, 바람직하게는 2:1 보다 크며, 보다 바람직하게는 3:1 이상이며, 예를 들면 9:1을 넘는다. 주어진 기능기의 보호기와의 "선택적 반응" 이라는 술어에 대하여도 동일한 정의가 적용된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "보호기와의 반응"은 "보호기를 제공", "보호기로 보호", 또는 "보호기 시약과 반응"과 동일하다.
"알킬"은 탄소 및 수소로 구성된 완전 포화된 비-고리형 부분을 지칭하며, 이것은 선형이거나 가지형일 수 있다. 알킬기의 예는 메틸, 에틸, n-부틸, t-부틸, n-헵틸, 및 이소프로필이다. 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 저급 알킬기가 일반적으로 바람직하며, 메틸, 에틸, n-부틸, i-부틸, t-부틸, 이소아밀, n-펜틸, 및 이소펜틸로 예시된다. 다른 구체예에서, 저급 알킬은 1 내지 4개의 탄소 원자, 또는 1-2개의 탄소 원자(메틸 및 에틸)를 갖는 기를 포함한다.
"시클로알킬"은 포화 고리형 탄화수소를 지칭하며, 바람직하게는 4 내지 7개의 탄소 원자, 보다 바람직하게는 5 또는 6개의 탄소원자(즉, 시클로펜틸 또는 시클로헥실)를 갖는다.
"알켄일"은 탄소 및 수소로 구성된 불포화 비-고리형 부분을 지칭하며, 이것은 선형 또는 가지형일 수 있고, 하나 이상의 이중 결합을 갖는다. 2 내지 6, 또는 2 내지 4개의 탄소원자를 갖는 저급 알켄일기가 일반적으로 바람직하다. "알킨일"은 탄소 및 수소로 구성된 불포화 비-고리형 부분을 지칭하며, 이것은 선형 또는 가지형일 수 있고, 하나 이상의 삼중 결합을 가진다. 2 내지 6, 또는 2 내지 4개의 탄소 원자를 갖는 저급 알킨일기가 일반적으로 바람직하다.
"아릴"은 치환되거나 비치환된 1가의 방향족 라디칼을 지칭하는데, 일반적으로 단일 고리(예를 들면 벤젠) 또는 두개의 축합 고리(예를 들면 나프틸)를 가지며, 단일고리 아릴기가 바람직하다. 이 용어는 헤테로아릴기를 포함하는데, 이는 푸릴, 피롤, 피리딜, 및 인돌과 같이 고리에서 하나 이상의 질소, 산소, 또는 황 원자를 갖는 방향족 고리기이다. "치환된"이라는 용어는 아릴기에서 하나 이상의 고리 수소, 바람직하게는 하나 또는 두 개의 고리 수소가 불소, 염소, 브롬, 메틸, 에틸, 메톡시, 할로메톡시, 및 할로메틸로부터 바람직하게 선택된 기로 대체되는 것을 의미한다. 보호기에서 사용되기 위한 바람직한 아릴기는 카르보시클릭 아릴이며, 이것은 비치환되거나, 또는 (보호 부분에 기를 연결시키는 치환기에 추가하여) 저급 알콕시로 치환된다.
"아랄킬"은 알킬, 바람직하게는 저급(C1-C4, 보다 바람직하게는 C1-C2) 알킬,아릴기로 더 치환된 치환체, 바람직하게는 단일고리 아릴기를 지칭하는데; 예는 벤질(-CH2C6H5) 및 페네틸이다.
"아실"은 R(C=O)- 형태의 치환체를 지칭하는데, 여기서 R은 상기 정의된 바와 같이 알킬, 알켄일, 알킨일, 아랄킬, 또는 아릴이며, 그리고 바람직하게는 저급 알킬 및 단일고리 카르보시클릭 아릴로부터 선택된다. 예는 벤조일(Ph(C=O)-), 아세틸(CH3(C=O)-) 및 이소부티릴((CH3)2CH(C=O)-)을 포함한다.
II. 보호된 단량체의 합성
한 측면에서 본 발명은 직교 보호된 3'-아미노-5'-히드록실 뉴클레오시드 단량체의 효율적 합성을 제공하고, 여기서 3'-위치상의 아미노기 및 뉴클레오시드 염기는 직교 보호되는데, 합성은 대응하는 비보호된 3'-아미노 뉴클레오시드로부터 시작한다. 전형적으로는, 생성 단량체는 다음에 N3'→P5'포스포라미데이트 또는 티오포스포라미데이트 올리고뉴클레오티드의 합성에 사용되기 위하여, 자유 5'-히드록실에서 포스피틸화된다(도 2B 및 도 3을 참조).
A, 시작 물질
단량체 합성을 위한 시작 물질은 하기 일반식을 갖는 3'-아미노 뉴클레오시드이다:
Figure 112007007100717-pct00003
여기서 염기는 구아닌(G), 아데닌(A), 티민(C) 및 시토신(C)으로부터 선택되되는 비보호 뉴클레오시드 염기이다. 2'-치환체 X는 2',3'-디데옥시 단량체에서와 같이 DNA 유사체를 생성하기 위한 수소일 수 있다. 대안으로, X는 RNA 또는 O-알킬 RNA 유사체를 생성하기 위하여 히드록시 또는 메톡시와 같은 저급 알콕시일 수 있다. 2'-치환체는 또한 불소(예를 들면 미국 특허 번호 5,684,143 참조), 또는 메틸과 같은 저급 알킬일 수 있다.
본 명세서의 합성에서 시작 물질로 유용한 3'-아미노-2',3'-디데옥시 뉴클레오시드는 핀란드, Littoinen에 위치한 Metkinen Oy로부터 상업적으로 얻을 수 있다. 3'-아미노-2',3'-디데옥시 티미딘 시작 물질은 또한 Dalton Chemical Labs(Toronto, 캐나다) 및 MP Biomedicals 사(Irvine, CA) 같은 다양한 공급원으로부터 상업적으로 구할 수 있다. 3'-아미노-2',3'-디데옥시 뉴클레오시드의 다양한 제조 합성은 문헌에 보고되었다(예를 들면, Zaitseva et al., 1994; Cech et al., 1996; Zaitseva et al., 1984). Zaitseva et al., 1994에 따르면, 3'-아미노-2',3'-디데옥시 티미딘은 효소 트란스글리코실전이반응을 통하여 대응 아데노신 또는 구아노신 단량체로 변환될 수 있다.
B1. 보호 전략: 개관
본 발명에 따르면, 상기-묘사된 뉴클레오시드를 대응 염기-보호된(A, G, 및 C의 경우에서), 3'-아미노-보호된 단량체로 전환하기 위한 효율적인 과정이 제공된다. 보호되어야 하는 염기상의 기는 또한 아미노기이므로, 비보호된 염기가 존재하는데서 3'-아미노기의 선택적 보호는 성공적으로 수행되지 않았고, 그 반대도 마찬가지였으며, 이들 단량체 제조를 위한 기존 과정(예를 들면 Nelson et al., 1997 참조)은 복수의 보호 단계를 수반하고, 일반적으로 3'-히드록실을 아지도기로 전환하는 단계를 포함하며, 이것은 나중에 3'-아민으로 환원된다.
본 발명은 뉴클레오시드 염기가 존재하는 데서도 3'-아미노기를 선택적으로 보호하기 위한 효율적인 방법을 제공하였으며, 뉴클레오시드 염기는 다음에 직교 보호기; 즉, 3'-아미노 보호기(또는 존재한다면 5'-히드록실 보호기)를 제거하는데 효과적인 선택 조건 하에서도 제거되지 않는 것으로 보호될 수 있다.
게다가, 3'-아미노기는 또한 5'-히드록실 기의 존재에서도 선택적으로 보호되거나, 또는 그 역도 성립한다. 따라서, 자유 5'-히드록실에 보호기를 제공하는 것이 가능하며, 이 보호기는 3'-아미노 보호기 또는 염기 보호기 중 하나를 제거하지 않는 선택 조건하에서 제거될 수 있다. (대안으로, 티미딘의 경우와 같이, 자유 5'-히드록실은 직접 포스피틸화될 수 있다.)
5'-히드록실을 위한 보호기는, 예를 들면 뉴클레오티드 염기를 위하여 사용되는 보호기(전형적으로는 아실 또는 아미디닐기)를 제거하지 않는 온화한 염기 또는 플루오라이드 이온과 같은 조건 하에서 제거될 수 있는 실릴기이다. 대안으로는, 동일 보호기(아실기와 같은)가 5'-히드록실 및 뉴클레오티드 염기를 위하여 사용될 수 있으며, 히드록실기를 탈보호하게 되나 뉴클레오티드 염기 아미노기는 그렇지 않은 이것의 제거 조건(예를 들면 온화한 염기)이 사용된다.
다른 전략에서, 뉴클레오티드 염기는 5'-히드록실을 미반응으로 남겨두는 조건하에서 보호될 수 있으며, 따라서 보호를 필요로 하지 않는다.
모든 경우, 뉴클레오티드 염기를 위하여 사용된 보호기는 올리고뉴클레오티드 합성에 사용되는 단량체 커플링 조건에 안정하다. 본 명세서에 기재된 단량체로부터 N3'→P5'포스포라미데이트 또는 티오포스포라미데이트 올리고뉴클레오티드를 제조하기 위한 방법은 예를 들면 Gryaznov 와 Chen(1994) 및 Pongracz 및 Gryaznov(1999)에 기재되어 있다.
B2. 보호 전략: A, G, 및 C 단량체
본 발명은 아데노신, 구아노신 또는 시토신 단량체를 위하여 자유 5'-히드록실기, 보호된 뉴클레오시드 염기, 및 보호된 3'-아미노기를 갖는 상기 단량체의 제조 방법을 제공하는데, 여기서 염기 및 3'-아미노기는 상기 정의한 바와 같이 직교 보호된다. 시작 물질은 3'-아미노-3'-데옥시 아데노신, 시토신, 또는 구아노신 단량체이며, 여기서 5'-히드록실기, 뉴클레오시드 염기, 및 3'-아미노기는 비보호된다.
일반적 하나의 전략에서, 방법은 3'-아미노기를 제 1 보호기와 선택적으로 반응시키는 단계, 5'-히드록실 기를 제 2 보호기와 반응시키는 단계, 및 뉴클레오시드 염기를 제 3 보호기와 반응시키는 단계를 포함한다. (3'-아미노를 위한) 제 1 보호기는 뉴클레오시드 염기를 탈보호하지 않는 조건 하에서 3'-아미노기로부터 제거될 수 있다. 게다가, 제 2 보호기(5'-히드록실을 위한)가 존재하는 때에는 이것은 뉴클레오시드 염기 또는 3'-아미노기를 탈보호하지 않는 조건 하에서 5'-히드록실기로부터 제거될 수 있다.
원하는 반응기가 보호된 이후, 상기 일반적인 전략에 따라 제 2 보호기는 만약 존재한다면 뉴클레오시드 염기 또는 3'-아미노기를 탈보호하지 않는 조건 하에서 5'-히드록실기로부터 제거된다. 단량체는 이후 예를 들면 올리고뉴클레오티드 합성에 사용되기 위하여 포스피틸화될 수 있다.
전형적으로는, 비록 제 2 및 제 3 기는 사실상 동일할 수 있고, 따라서 단일 반응에 적용될 수 있지만, 제 1, 제 2, 및 제 3 기는 이 순서로 적용된다. 게다가, 5'-히드록실기의 보호는 이 단계를 사용하는 전략에 있어 3'-아미노기의 보호 이전 또는 이후에 일어날 수 있다. 바람직하게는 시약이 동시에 첨가되지 않지만, 두 반응은 전형적으로 원-폿 반응으로 수행된다. 바람직하게는, 하기 실시예에서 예시되는 바와 같이 3'-아미노 보호 시약이 먼저 첨가된다.
선택된 구체예에서, 염기에 불안정한 실릴 에테르(예를 들면 TMS)로 5'-히드록실기를 일시적으로 보호하는 것은 예를 들면 도 1(구조(2)에서 구조(6)로 전환)및 도 2B에서 나타나는 바와 같이 염기 보호 단계 중 사용되며, 이것은 아래에서 더 논의될 것이다.
다른 구체예에서. 5'-히드록실기 및 뉴클레오티드 염기는 동일 시약으로 보호되고, 이후 히드록실기의 선택적 탈보호가 이어진다. 이런 시약은 전형적으로는 예를 들면 이소부티릴 할라이드 또는 벤조일 할라이드와 같은 아실화 시약이다. 이 종류의 대표적 반응도는 도 1의 구조(2)로부터 구조(3)으로의 전환에 나타내며, 이후 온화한 조건 하에서 염기로 처리하여 선택적으로 히드록실기를 탈보호한다(3 에서 6으로 전환).
상술한 바와 같이, 3'-아민을 보호하기 위한 제 1 보호기는, 제 2 보호기가 존재하는 때에 (5'-히드록실을 위한) 제 2 보호기를 제거할 수 있는 조건 하에서는 안정한 것이지만, (뉴클레오시드 염기를 위한) 제 3 보호기를 제거하지 않는 조건 하에서는 불안정하다. 한 구체예에서, 제 1 보호기는 산에 불안정한데; 예를 들면 트리틸(트리페닐메틸), 모노메톡시트리틸(MMT), 또는 디메톡시트리틸(DMT)과 같은 트리아릴메틸기이다.
제 1 보호기로 유용한 또 다른 기는 플루오레닐메톡시카르보닐(Fmoc)이며, DBU, 모르폴린, 또는 피페리딘같은 염기성 아민과의 비-가수 분해 절단을 통하여 제거될 수 있다. 히드록사이드 염기(예를 들면 NaOH)는 이러한 용도로 부적합한데, 왜냐하면 이 시약은 분자에서 다른 보호기 또한 전형적으로 제거할 것이기 때문이다. 유사한 메커니즘에 의하여 제거될 수 있는 Fmoc의 유도체가 또한 사용될 수 있다. 이런 유도체는 전형적으로 2 및/또는 7번 위치에서, Fmoc의 플루오레닐기가 분해 메커니즘에 영향을 주지않는 저급 알킬기와 같은 기로, 또는 보호기의 염기에 대한 불안정성을 증가시키는 할로겐과 같은 전자 공여기로 치환된 것들을 포함한다(Carpino et al., 1980). Carpino et al., 1989에 기재된 티오크산틴 디옥사이드 유사체를 또한 포함한다.
도 1은 대상 단량체의 제조를 위하여 사용될 수 있는 합성 전략의 대표적 변경을 나타낸다. 이들 방법은 특히 A(아데노신) 및 C(시토신) 뉴클레오시드 단량체에 적합하다. 하기와 같이, 방법은 바람직하게는 약간의 변형과 함께 G(구아노신) 단량체에 대하여 또한 사용될 수 있다. 도 1 및 도 2A-B에 예시된 전략에서, 5'-히드록시 보호가 사용된다. 하기에서 더 논의되는 도 2C는 5'-히드록시 보호가 사용되지 않는 전략을 예시한다.
상술한 바와 같이, (3'-아민을 보호하기 위한) 바람직한 제 1 보호기는 트리틸, MMT, 또는 DMT과 같이 산에 불안정한 기이거나, 또는 Fmoc와 같이 DBU같은 염기성 아민 시약에 불안정한 기이다. 한 구체예에서, 바람직한 제 2 및 제 3 보호기는 둘 다 모두 예를 들면 벤조일기와 같은 아라실기이다. 뉴클레오시드 염기 또는 3'-아미노기를 탈보호하지 않는 조건 하에서, 5'-히드록실기를 탈보호하는데 효과적인 조건은, 이 경우 바람직하게는 예를 들면 암모늄 히드록사이드와 같은 히드록사이드로 처리하는 것과 같이 온화한 염기로 처리하는 것을 포함한다. 이런 처리는 5'-히드록실로부터 아실기를 제거하는 데 효과적이고, 디아실화된 염기를 모노아실화된 염기로 전환하는 데 효과적이다. 이러한 반응도는 도 1에서 중간체(3)의 생성물(6)로의 전환에서 예시되어 있다.
또 다른 구체예에서, 5'-히드록실의 보호를 위한 제 2 보호기는 염기에 불안정한 트리알킬 실릴 에테르로, 바람직하게는 TMS이며, (뉴클레오티드 염기의 보호를 위한) 제 3 보호기는 알칸오일같은 아실기이며, 바람직하게는 이소부티릴, 또는 벤조일기이다. 다시, 뉴클레오시드 염기 또는 3'-아미노기를 탈보호하지 않는 조건 하에서 5'-히드록실기를 탈보호하는데 효과적인 조건은, 이 경우 바람직하게는 예를 들면 히드록사이드로 처리하는 것과 같이 온화한 염기로 처리하는 것을 포함한다. 이런 처리는 트리메틸실릴 에테르를 절단하고, 디아실화 염기를, 존재한다면, 모노아실화 염기로 전환하는 데 효과적이다. 이 반응도의 예는 또한 도 1에서 중간체(2)의 생성물(6)으로의 전환에서 예시된다.
특히 아데노신 및 구아노신 단량체를 위한 뉴클레오티드 염기 보호기의 바람직한 또 다른 종류는 디알킬-, 디(시클로알킬)-, 또는 디(아랄킬)-포름아미디닐기와 같은 포름아미디닐 보호기이며, 여기서 "알킬"은 바람직하게는 C1-C4이고 "시클로알킬"은 바람직하게는 C5-C6이다. 특정한 예는 디메틸포름아미디닐기 및 디벤질포름아미디닐기를 포함한다. 이들 보호기는 일반적으로 벤조일 또는 이소부티릴 보호기를 제거하기 위하여 사용되는 것보다 더 온화한 조건 하에서 뉴클레오티드 염기로부터 (예를 들면 합성의 종점에서)제거될 수 있다. 예를 들면 Vu et al., 1990, Vincent et al., 1999, 및/또는 미국 특허 번호 5,281,701을 참조한다. 상기 참조자료에서 기재된 바와 같이, 예를 들면 1차 아민의 디알킬포름아미드 디메틸 아세탈과의 반응은 디알킬포름아미디닐-보호 아민을 제공한다. 탈보호는 일반적으로 실내 온도 내지 약 55℃에서 수성 또는 알코올성 암모늄 히드록사이드로 처리함으로써 달성된다.
다른 구체예에서, (5'-히드록실을 보호하기 위한) 제 2 보호기는 플루오라이드에 불안정한 실릴 에테르이며, (뉴클레오시드 염기를 위한)제 3 보호기는 벤조일기와 같은 아실기 또는 상술한 바와 같은 포름아미디닐기이다. 이 경우, 뉴클레오시드 염기 또는 3'-아미노기를 탈보호하지 않는 조건 하에서 5'-히드록실기를 탈보호하는 데 효과적인 조건은 바람직하게는 예를 들면 테트라부틸암모늄 플루오라이드(TBAF)와 같은 플루오라이드 이온으로의 처리를 포함한다. 이런 처리는 실릴 에테르를 절단하는 데 효과적이며, 디아실화 염기를, 만약 존재한다면, 모노아실화 염기로 전환하는 데 효과적이다. 이 반응도의 예는 또한 도 1에 중간체(5)의 생성물(6)으로의 전환에서 예시되어 있다. 대표적인 플루오라이드에 불안정한 실릴 에테르는 예를 들면 tert-부틸디메틸 실릴 에테르, tert-부틸디페닐 실릴 에테르, 디페닐메틸 실릴 에테르, 트리(이소프로필) 실릴 에테르, 및 당업계에 알려진 다른 것을 포함한다.
주로 용해도와 관련된 약간의 변형과 함께, 상기 방법은 구아노신(G) 단량체에 대하여 또한 사용될 수 있다. 도 2A에서 예시되는 한 구체예에서, 시작 단량체(7)의 5'-히드록실기는 TBDMS와 같은 친유기로 방법의 초기 단계에서 보호되어, 종래의 용매 피리딘에서의 용해도를 촉진시킨다.
상술한 바와 같이, (3'-아민을 위한) 바람직한 제 1 보호기는 트리틸, DMT, 또는 MMT와 같은 산 불안정기, 또는 DBU 같은 염기성 아민 시약에 불안정한 Fmoc같은 기이다. 트리틸기는 도 2A의 구체예에서 사용된다.
반응 조건에 따라, 원하는 3'-모노트리틸화된 화합물(8) 뿐만 아니라 소량의(예를 들면 약 5%) 디트리틸화된 화합물(9)이 관찰될 수 있다. 따라서, 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 "선택적 보호"는 원하는 보호 상태를 갖는 분자가 비-표적 기능기가 단독으로 또는 표적 기능기에 더하여 보호된 분자보다 예를 들면 1:1을 초과하는 비율 같이 더 많은 정도로 형성되는 것을 의미한다. 바람직하게는, 비율은 2:1, 더욱 바람직하게는 3:1을 초과하며, 가장 바람직하게는 9:1을 초과한다.
이 구체예에서, (5'-히드록실을 위한) 제 2 보호기는 플루오라이드에 불안정한 실릴 에테르이고, 더 바람직하게는 중간체의 용해도를 증진시키는 기이다. 도 2 A에 나타낸 바와 같이, TBDMS 에테르는 용매 피리딘에서의 용해도를 증진시킨다는 것이 발견되었다.
제 3 보호기는 바람직하게는 예를 들면 이소부티릴기와 같은 아실기, 또는 상술한 바와 같은 포름아미디닐기이다. 뉴클레오시드 염기 또는 3'-아미노기를 탈보호하지 않는 조건 하에서, 5'-히드록실기를 탈보호하는 데 효과적인 조건은 바람직하게는 예를 들면 테트라부틸암모늄 플루오라이드(TBAF)와 같은 플루오라이드 이온으로의 처리를 포함한다. 이런 처리는 도 2A에서 나타내는 바와 같이, 이소부티릴 또는 트리틸기에 영향을 주지않고, 화합물(10)에서 실릴 에테르를 절단하는 데 효과적이다.
도 2B에 예시되는 바와 같이, 또 다른 구체예에서 DMF 같이 보다 극성인 용매가 사용되어 시작 단량체(7)을 용해시키게 되며, 그렇지 않다면 반응도는 도 1에서 아데노신 단량체(1)에 대하여 나타낸 (5'-히드록실 보호기로서 TMS 에테르를 사용하는) "일시적 보호" 반응도와 유사하다.
도 2C는 시티딘 단량체에 특히 적용가능한 합성 전략의 구체예를 예시하며, 여기에서 5'-히드록실 보호는 사용되지 않는다. 이 반응도에서, 예를 들면 트리틸기에 의한 단량체(12)의 3'-아미노기의 선택적 보호 이후, 염기의 고리 바깥의 아미노기는 무수 벤조일 같은 무수 아실과 반응시킨다. 용매는 바람직하게는 5'-히드록실기의 반응과 경쟁하고, 억제하는 것으로 여겨지는 알코올을 함유한다. 예는 메탄올, 에탄올, 및 예를 들면 아세토니트릴, DMF, 또는 피리딘과 이들 용매의 혼합물이다. 실시예 4에서 기재한 바와 같이, 무수 벤조일을 에탄올 또는 9:1의 아세토니트릴:메탄올에 사용하는 반응에서, 5'-벤조일화 생성물의 매우 작은 양(<5%)이 관찰되었다. 지배적인 5'-히드록실 단량체(14)는 다음에 표준 방법에 의하여 포르피틸화될 수 있다.
특히 아데노신 또는 구아노신 단량체에 적용 가능한 또 다른 구체예에서, 예를 들면 트리틸기에 의한 단량체의 3'-아미노기의 선택적 보호 이후, 염기 고리 바깥의 아미노기는 디알킬포름아미디닐, 디(시클로알킬)포름아미디닐, 또는 디벤질포름아미디닐기, 바람직하게는 디메틸포름아미디닐기로 보호된다. 이들 단계 도중 실질적으로 또는 완전히 미반응인 상태로 남아있을 것이 기대되는 5'-히드록실 기는 다음에 표준 방법에 의하여 포스피틸화될 수 있다.
B3. 보호 전략: T 단량체
또 다른 측면에서, 본 발명은 자유 5'-히드록실기 및 보호된 3'-아미노기를 갖는 티미딘 단량체 제조 방법을 제공한다. 티미딘 염기는 일반적으로 올리고뉴클레오티드 합성의 조건 하에서 보호를 필요하지 않는다는 점에서 합성 전략은 상술한 바와는 상이하다. 이 경우 시작 물질은 3'-아미노-3'-데옥시 티미딘 단량체이고, 여기서 5'-히드록실기 및 3'-아미노기는 비보호되며, 방법은 5'-히드록실기가 실질적으로 비보호된 상태에서 상기 3'-아미노기를 제 1 보호기와 선택적으로 반응시키는 단계를 포함한다.
상기 합성에서와 같이, 3'-아민을 위한 바람직한 보호기는 트리아릴메틸기같이 산에 불안정한 기 또는 Fmoc와 같이 DBU같은 염기성 아민 시약에 대하여 불안정한 기이다. 트리틸기는 도 3의 구체예에서 사용된다.
예를 들면 하기 실시예 5에 기재된 바와 같이, 5'-히드록실기는 다음에 포스피틸화될 수 있다. 이 포스피틸화 방법은 상술한 바와 같이 5'-히드록실, 3'-아미노-보호 및 염기-보호 단량체 중 어떤 것에도 또한 적용될 수 있다.
하기 실시예는 예시적이며, 본 발명을 제한하지 않는다. 예를 들면, 용매, 촉매(예를 들면 트리에틸아민 또는 디이소프로필 에틸 아민), 반응 시간, 및 반응 온도의 선택과 같은 반응 조건은 일반적으로 당업자의 지식에 따라 일반적인 실험을 사용함으로써 이하에 예시되는 것들과 달라질 수 있다. 어떤 경우, 시약의 첨가 순서가 달라질 수 있다. 이들 반응의 다수에 적합한 용매는 달리 나타내지 않으면 일반적으로 피리딘, DMF, 아세토니트릴, 또는 이들의 혼합물과 같이 극성 비양성자 성 용매를 포함한다. 적합한 온도는 일반적으로 -10℃ 내지 실내 온도 내지 약 55℃의 범위이다.
실시예 1. 3'-아미노-2',3'-디데옥시아데노신으로부터 N 6 -벤조일-3'-아미노니트릴-2',3'-디데옥시아데노신의 합성
A. 방법 1: 퍼벤조일화 경로( 도 1에서 1→2→3→6으로 예시)
시작 단량체인 3'-아미노-2',3'-디데옥시아데노신(1)(10mmol)을 건조 피리딘으로 공증발시킨 후, 트리에틸아민 6당량을 함유하는 건조 피리딘 100ml에 현탁시키고, 혼합물을 교반하면서 50℃까지 가열하였다. 트리틸 클로라이드(1.1 당량)를 첨가하고, 교반을 50℃에서 2시간동안 계속하였다. 3'-트리틸화된 단량체(2)를 함유하는 얻어진 맑은 용액을 0℃로 냉각하고, 벤조일 클로라이드 5 당량을 적가하고, 반응 혼합물을 한 시간동안 교반한 후, 5%의 차가운 중탄산 나트륨의 100ml에 부었다. 침전된 황색의 점성물질을 에틸 아세테이트로 추출하고, 에틸 아세테이트 용액을 증발시켰다. 결과 오일(3)(5'-히드록실에서 벤조일기를 가지며 염기의 N6에서 두 개를 갖는다)을 피리딘:메탄올:물이 65:35:5 v/v/v인 50ml에 용해시키고, 용액을 0℃로 냉각시킨 후, 2M인 수산화나트륨 50ml를 첨가하였다. 0℃에서 25분간의 교반 후, 반응 혼합물을 피리디늄 히드로클로라이드로 중화시키고, 혼합물의 부피를 증발에 의하여 감소시켰다. 에틸 아세테이트로 희석한 후, 유기층을 분리하고, 포화 중탄산나트륨으로 세정하고 진공에서 증발시켰다. 생성물을, 메틸렌 클로라이드:메탄올이 95:5 v/v인 용매 시스템이 사용되는 실리카 겔 플래쉬 컬럼 크로마토 그래피에 의하여 정제하였다. 자유 5'-히드록실 및 모노벤조일화된 염기를 갖는 생성물(6)의 단리된 수득량은 2.0g이었다(33.6%).
B. 방법 2: 일시적 보호 경로(도 1에서 1→2→6으로 예시)
시작 단량체 3'-아미노-2',3'-디데옥시아데노신(1)(10mmol)을 상술한 바와 같이, 즉 트리에틸아민 6당량을 함유하는 건조 피리딘에서 1.1 당량의 트리틸 클로라이드로 50℃에서 처리함으로써 3'-보호 단량체(2)로 전환하였다.
맑은 용액(2)을 0℃로 냉각하였고, 5당량의 클로로트리메틸실란을 적가한 후, 30분간 교반하여 5'-OTMS 중간체를 생성하였다. 벤조일 클로라이드(5당량)를 다음에 적가한 후, 두 시간동안 실온에서 교반하여 모노벤조일 및/또는 디벤조일 염기로 보호된 중간체를 생성하였다.
반응 혼합물을 0℃로 냉각하고, 20ml의 차가운 물을 첨가한 후 20분 교반하고 20ml의 진한 수산화 암모늄을 첨가하였다. 교반을 30분간 계속하였고, 용액을 진공 상태에서 농축하였다. 유성의 잔류물은 에틸 아세테이트에 포함시키고, 포화 중탄산 나트륨으로 세정하고, 용액을 건조하고 진공상태에서 증발시켰다. 생성물을 상기와 같이 실리카 겔 크로마토그래피에 의하여 정제하였다. 생성물(6)의 단리된 수득량은 3.6g(60.2%)였다.
이어지는 과정에서, 첨가된 트리에틸아민과 함께 DMF 또는 DMF/피리딘을 초기 트리틸화 반응을 위한 용매로 사용하고, 중간체(2)를 방법 A 또는 방법 B 중 어느 하나를 사용하여 더 반응시켜, 약 70% 수율로 생성물(6)을 얻었다. 수율은 벤조일화 이전에 트리에틸아민을 제거함으로써(예를 들면 수성 세정) 다소 개선되는 것 으로 발견되었는데, 특히 방법 A를 사용할 때이다. 이 처리는 아데닌 염기의 고리 개방으로부터 발생하는 것으로 여겨지는 부산물 형성을 방지하는 것으로 관찰되었다. 이 부산물의 형성은 또한 트리틸화된 생성물(2)을 더 진행되는 반응 이전에 분리함으로써 제거하였다.
C. 방법 3: TBDMS 보호 경로(도 1에서 1→2→4→5→6으로 예시됨)
시작 단량체 3'-아미노-2',3'-디데옥시아데노신(1)(10mmol)을 상술한 바와 같이 즉 트리에틸아민 6당량을 함유하는 건조 피리미딘에서 1.1 당량의 트리틸 클로라이드로 50℃에서 처리함으로써 3'-보호 단량체(2)로 전환하였다.
맑은 용액에 2당량의 tert-부틸디메틸실릴 클로라이드(TBDMS Cl)를 첨가하였고, 실온에서 밤새 교반을 계속하였다 (3'-트리틸아미노-5'-TBDM 실릴옥시 중간체(4)인) 이 용액을 -5℃로 냉각하고, 3당량의 벤조일 클로라이드를 적가한 후, 실온에서 2시간 동안 교반하여 N6-디벤조일 중간체(5)를 제공하였다. 용액을 진공 상태에서 농축시키고, 유성의 잔류물은 에틸 아세테이트에 포함시키고, 포화 중탄산 나트륨으로 세정한 후, 용액을 건조하고 진공상태에서 증발시켰다.
얻어진 유성 잔류물을 100ml THF에 용해시키고, 2 당량의 TBAF(테드라부틸암모늄 플루오라이드)를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 에틸 아세테이트를 반응 혼합물에 첨가하고, 용액을 중탄산나트륨, 0.5M 나트륨 시트레이트(pH4) 및 염수로 세정하였다. 생성물을 상기와 같이 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하여, 순수한 화합물(6) 3.3g(55.5%)을 얻었다.
실시예 2. N 4 -벤조일-3'-아미노트리틸-2',3'-디데옥시시토신의 합성
3'-아미노-2',3'-디데옥시시토신으로부터 N4-벤조일-3'-아미노트리틸-2',3'-디데옥시시토신의 합성은 상기 과정의 임의의 것을 사용하는 유사한 방식 또는 하기의 실시예 4의 방법에 따라 수행될 수 있다.
실시예 3. 3'-아미노-2',3'-디데옥시구아노신으로부터 N 2 -이소부티릴-3'-아미노트리틸-2',3'-디데옥시구아노신의 합성(도 2A)
시작 물질인 3'-아미노-2',3'-디데옥시아데노신(7.2g)을 건조 피리딘으로 공증발시키고, 다음에 100ml 건조 피리딘 및 6 당량의 디이소프로필에틸아민에 현탁시켰다. tert-부틸디메틸실릴 클로라이드(2당량)을 첨가하여, 5'-TBDM 실릴옥시 중간체를 생성하였다. 30분 교반 후, 트리틸 클로라이드의 1.1 당량을 두 분할분으로 첨가하고, 교반을 실온에서 밤새 계속하였다. 두 화합물을 TLC에 의하여 검출하였는데, 더 낮게 진행하고, 더 풍부한 생성물(8)은 원하는 5'-TBDMS-3'-아미노트리틸-2',3'-디데옥시구아노신이었다. 더 높게 진행하고, 덜 풍부한 화합물(9)은 추가적으로 바닥에서 트리틸화된다. 모노트리틸 화합물(8)을 메틸렌 클로라이드:메탄올:트리에틸아민이 94:5:1 v/v/v인 용매 시스템을 사용하는 실리카 겔 크로마토그래피에 의하여 단리하였다.
이 생성물을 건조 피리딘으로 공증발시키고, 피리딘 100ml에 용해시켰다. 이 용액을 0℃로 냉각시키고, 1.1 당량의 이소부티릴 클로라이드를 첨가한 후, 30분간 교반하였다. 반응을 메탄올로 퀀칭하고 진공상태에서 증발시킨 후, 반응을 메틸렌 클로라이드-중탄산나트륨으로부터 마무리하였다. 유기상을 황산나트륨에서 건조하고, 진공상태에서 증발시켰다. 유성 잔류물(완전히 보호된 단량체(10))를 100ml 테트라히드로푸란에 용해시키고, 5 당량의 테트라부틸암모늄 플루오라이드를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반한 후, 에틸 아세테이트로 희석시키고, 중탄산나트륨으로 세정하였다. 황산나트륨에서 건조한 후 용매를 진공상태에서 증발시켜 5'-히드록실 생성물(11) 2g(46.1%)을 얻었다.
이어지는 과정에서, 화합물(7)의 트리틸화를 DMF/피리딘에서 50℃로 수행하였고, 디클로로메탄 또는 물로부터 지배적인 생성물(8)을 침전시켜 부산물(9)(<5%)을 제거하였다. 뉴클레오티드 염기는 도 2B의 일시적 보호 반응 또는 퍼아실화 반응(실시예 1A와 유사) 중 어느 하나를 사용하여 보호하였다. 생성물(11)을 CH3CN으로부터의 결정화 이후 각각 약 60% 및 53%의 수율로 단리하였다. 아실 클로라이드 시약의 가수 분해를 피하기 위한 노력이 취해졌을 때는 수율이 개선되는 것으로 관찰되었다.
실시예 4. 3'-아미노-2',3'-디데옥시시티딘으로부터 N 4 -벤조일-3'-아미노트리틸-2',3'-디데옥시시티딘의 합성(도 2C에서 예시됨)
시작 물질(12)의 3'-아미노기를 트리틸 클로라이드와 트리에틸아민의 존재하에서 1:4인 피리딘:DMF에서 반응시켰다. 중간체(13)를 무수 벤조일과 9:1인 CH3CN:MeOH에서 50℃로 반응시켰다. 원하는 생성물(14)을 실리카 겔 크로마토그로피에 따라 70% 수율로 단리하였다.
실시예 5. 3'-아미노-3'-데옥시티미딘으로부터 3'-아미노트리틸-3'-데옥시-티미딘-5'-(2-시아노에틸, N,N-디이소프로필)포스포라미다이트의 합성 및 후속하는 포스피틸화(도 3에서 예시됨)
시작 물질인 3'-아미노-3'-데옥시티미딘(15)(1.3g)을 건조 피리딘으로 공증발시키고, 다음에 30ml의 건조 피리딘에 용해시켰다. 이 용액에 5 당량의 디이소프로필에틸아민 또는 트리에틸아민을 첨가한 후, 10분간의 교반과 1 내지 1.1 당량의 트리틸 클로라이드의 첨가가 이어졌다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 (또는 대안으로 50℃에서 1시간 동안) 교반하였다. TLC에 의하여 확인되는 시작 물질의 소멸 후, 반응을 메탄올로 퀀칭하고 용액을 진공상태로 증발시켰다. 얻어진 유성 물질을 메틸렌 클로라이드에 용해시키고, 포화 중탄산나트륨으로 세정하였으며, 황산나트륨에서 건조시키고, 농축하였다. 메틸렌 클로라이드-헥산 침전은 하얀 분말로서 생성물(16) 2.2g(85%)을 제공하였다.
생성물(16, 1.7g)을 건조 피리딘으로 공증발시키고, 건조 메틸렌 클로라이드의 100ml에 용해시켰다. 이 용액에 디이소프로필에틸아민의 4당량 및 이어서 1.2당량의 2-시아노에틸-N,N-디이소프로필클로로포스포라미다이트를 첨가하였다. 반응을 TLC에 의하여 모니터하였으며, 시작 물질의 소멸 후 용액을 포화 중탄산나트륨으로 세정한 후, 황산나트륨에서 건조하고 진공상태에서 증발시켰다. 생성물을 메틸렌 클로라이드:트리에틸아민이 10:1 v/v인 용매 시스템이 사용되는 실리카 겔 플래쉬 컬럼 크로마토그래피에 의하여 정제하여, 고체 거품이고, 포스피틸화된 보호 단량체(17) 2g(83.3%)을 수득하였다. 과정의 전체 수율은 70.8%이었다.
본 발명은 특정 방법 및 구체예를 참조하여 설명되었으나, 본 발명을 벗어나지 않고서 다양한 변형이 이루어질 수 있다는 것이 인식되어야 할 것이다.

Claims (38)

  1. 보호된 뉴클레오시드 염기 및 보호된 3'-아미노기를 갖는 아데노신, 구아노신 또는 시티딘 단량체를 제조하는 방법으로서, 여기서 상기 염기 및 상기 3'-아미노기는 직교 보호되고, 하기의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
    (a) 5'-히드록실기, 뉴클레오시드 염기, 및 3'-아미노기가 비보호된, 3'-아미노-3'-데옥시 아데노신, 시티딘, 또는 구아노신 단량체를 제공하는 단계;
    (b) 상기 3'-아미노기를, 산에 불안정한 기 또는 플루오레닐메톡시카르보닐기 또는 플루오레닐메톡시카르보닐기의 유도체로 구성되는 제 1 보호기와 선택적으로 반응시키고;
    상기 5'-히드록실기를 아실, 염기에 불안정한 트리알킬 실릴 에테르, 또는 플루오라이드에 불안정한 실릴 에테르로 구성되는 제 2 보호기와 반응시키고;
    상기 뉴클레오시드 염기를 아실기인 제 3 보호기와 반응시키는 단계이고;
    여기서 상기 제 1 보호기는 상기 뉴클레오시드 염기를 탈보호하지 않는 조건하에서 상기 3'-아미노기로부터 제거될 수 있고, 상기 제 2 보호기는 상기 뉴클레오시드 염기 또는 상기 3'-아미노기를 탈보호하지 않는 조건 하에서 상기 5'-히드록실기로부터 제거될 수 있다.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 제 2 보호기를 상기 뉴클레오시드 염기 또는 상기 3'-아미노기를 탈보호하지 않는 조건하에서 상기 5'-히드록실기로부터 제거하는 (c) 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 제 1 보호기는 산에 불안정한 것을 특징으로 하는 방 법.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 제 1 보호기는 트리아릴메틸인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 제 1 보호기는 트리페닐메틸(트리틸)인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1항에 있어서, 상기 단량체는 아데노신 또는 구아노신 단량체인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 1항에 있어서, 상기 제 2 및 제 3 보호기는 둘 다 아실기인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 7항에 있어서, 상기 제 2 및 제 3 보호기는 둘 다 벤조일기인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 1항에 있어서, 상기 제 2 보호기는 염기에 불안정한 트리알킬 실릴 에테르인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 1항에 있어서, 상기 제 2 보호기는 플루오라이드에 불안정한 실릴 에테르인 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 1항에 있어서, 상기 단량체는 수소, 히드록시, 메톡시, C1-C4 알킬, 및 플루오로로부터 선택되는 2'기를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 11항에 있어서, 상기 단량체는 2',3'-디데옥시 단량체로서, 상기 2'기가 수소인 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 자유 5'-히드록실기 및 보호된 3'-아미노기를 갖는 티미딘 단량체의 제조 방법으로서, 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
    (a) 5'-히드록실기 및 3'-아미노기가 비보호되어 있는 3'-아미노-3'-데옥시 티미딘 단량체를 제공하는 단계; 및
    (b) 상기 3'-아미노기를, 산에 불안정한 기 또는 플루오레닐메톡시카르보닐기 또는 플루오레닐메톡시카르보닐기의 유도체로 구성되는 제 1 보호기와 선택적으로 반응시키는 단계.
  14. 제 13항에 있어서, 상기 제 1 기는 산에 불안정한 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 14항에 있어서, 상기 제 1 보호기는 트리아릴메틸인 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 15항에 있어서, 상기 제 1 보호기는 트리페닐메틸(트리틸)인 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 산에 불안정한 기 또는 플루오레닐메톡시카르보닐기 또는 플루오레닐메톡시카르보닐기의 유도체로 보호된 3'-아미노기와, 디알킬-, 디(시클로알킬)-, 또는 디(아랄킬)-포름아미디닐기로 보호된 뉴클레오시드 염기를 가지는 것을 특징으로 하는 아데노신, 구아노신 또는 시티딘 단량체.
  18. 제 17항에 있어서, 상기 디알킬- 또는 디(시클로알킬)-포름아미디닐기에서의 알킬은 C1-C4 알킬이고 시클로알킬은 C5-C6 시클로알킬인 것을 특징으로 하는 단량체.
  19. 제 17항에 있어서, 상기 3'-아미노기는 플루오레닐메톡시카르보닐기 또는 플루오레닐메톡시카르보닐기의 유도체로 보호되는 것을 특징으로 하는 단량체.
  20. 제 17항에 있어서, 상기 산에 불안정한 보호기는 트리아릴메틸기인 것을 특징으로 하는 단량체.
  21. 제 17항에 있어서, 상기 뉴클레오시드 염기는 디메틸포름아미디닐기 또는 디벤질포름아미디닐기로 보호되어 있는 것을 특징으로 하는 단량체.
  22. 제 17항에 있어서, 상기 뉴클레오시드 염기는 디메틸포름아미디닐기로 보호되어 있는 것을 특징으로 하는 단량체.
  23. 제 22항에 있어서, 상기 단량체는 아데노신 또는 구아노신 단량체인 것을 특징으로 하는 단량체.
  24. 제 17항에 있어서, 단량체는 비보호되어 있는 5'-히드록실기를 갖는 것을 특징으로 하는 단량체.
  25. 제 17항에 있어서, 단량체는 보호된 5'-히드록실기를 가지며, 이것은 상기 뉴클레오시드 염기 또는 상기 3'-아미노기를 탈보호하지 않는 조건 하에서 탈보호될 수 있는 것을 특징으로 하는 단량체.
  26. 제 17항에 있어서, 상기 단량체가 수소, 히드록시, 메톡시, C1-C4 알킬 및 플루오로로부터 선택되는 2'기를 포함하는 것을 특징으로 하는 단량체.
  27. 제 26항에 있어서, 상기 단량체는 2',3'-디데옥시 단량체로서, 상기 2'기가 수소인 것을 특징으로 하는 단량체.
  28. 자유 5'-히드록실기, 보호된 뉴클레오시드 염기, 및 보호된 3'-아미노기를 갖는 아데노신, 구아노신 또는 시티딘 단량체의 제조 방법으로서, 상기 염기 및 상기 3'-아미노기는 직교 보호되고, 하기의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
    (a) 5'-히드록실기, 뉴클레오시드 염기, 및 3'-아미노기가 비보호되어 있는 3'-아미노-3'-데옥시 아데노신, 시티딘, 또는 구아노신 단량체를 제공하는 단계;
    (b) 상기 3'-아미노기를, 산에 불안정한 기 또는 플루오레닐메톡시카르보닐기 또는 플루오레닐메톡시카르보닐기의 유도체로 구성되는 제 1 보호기와 선택적으로 반응시키는 단계; 및
    (c) 상기 뉴클레오시드 염기를, 단량체가 아데노신 또는 구아노신인 경우 디알킬-, 디(시클로알킬)- 또는 디(아랄킬)-포름아미디닐기로 구성되는 다른 보호기와, 단량체가 시티딘인 경우 아실기로 구성되는 다른 보호기와 선택적으로 반응시키는 단계이며; 여기서 상기 제 1 보호기는 상기 뉴클레오시드 염기를 탈보호하지 않는 조건 하에서 상기 3'-아미노기로부터 제거될 수 있는 단계.
  29. 제 28항에 있어서, 다른 보호기와의 상기 반응은 무수 아실과의 반응을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제 28항에 있어서, 상기 제 1 보호기는 트리아릴메틸인 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 제 30항에 있어서, 상기 제 1 보호기는 트리페닐메틸(트리틸)인 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 제 28항에 있어서, 상기 단량체는 수소, 히드록시, 메톡시, C1-C4 알킬, 및 플루오로로부터 선택되는 2'기를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  33. 제 28항에 있어서, 상기 단량체는 2',3'-디데옥시 단량체로서, 상기 2'기가 수소인 것을 특징으로 하는 방법.
  34. 제 28항에 있어서, 상기 디알킬- 또는 디(시클로알킬)-포름아미디닐기에서의알킬은 C1-C4 알킬이고 시클로알킬은 C5-C6 시클로알킬인 것을 특징으로 하는 방법.
  35. 제 28항에 있어서, 상기 다른 보호기는 디메틸포름아미디닐기 또는 디벤질포름아미디닐기인 것을 특징으로 하는 방법.
  36. 제 35항에 있어서, 상기 다른 보호기는 디메틸포름아미디닐기인 것을 특징으로 하는 방법.
  37. 삭제
  38. 삭제
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