ES2868452T3 - Síntesis de monómeros nucleosídicos 5'fosforamidita 3 aminoprotegidos - Google Patents
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Abstract
Un monómero de adenosina o de guanosina que comprende: un grupo 3'-amino protegido que está protegido con un grupo lábil a ácidos; una base nucleosídica que está protegida con un grupo dialquil-, di(cicloalquil)- o di(aralquil)-formamidinilo y un grupo 5'-O-(2-cianoetil-N,N-diisopropilamino)fosforamidita.
Description
DESCRIPCIÓN
Síntesis de monómeros nucleosídicos 5'-fosforamidita 3'-aminoprotegidos
Campo de la invención
La presente invención se refiere a métodos de síntesis eficaces de monómeros nucleosídicos 3'-amino protegidos ortogonalmente, útiles en la preparación sintética de análogos de oligonucleótidos, y a los monómeros protegidos ortogonalmente preparados por dichos métodos.
Referencias
Asai, A. et al., Cancer Research 63(14):3931-9 (2003).
Carpino, L.A. et al., J. Org. Chem. 45:4250-2 (1980).
Carpino, L.A. et al., J. Org. Chem. 54:5887-97 (1989).
Cech, D. et al., Coll. Czech. Chem. Comm. 61:S297-S300 (1996).
Chen, J.-K., Schultz, R.G., Lloyd, D.H. y Gryaznov, S.M., Nucleic Acids Res. 23: 2661-2668 (1994).
Escude, C., Giovannageli, C., Sun, J.-S., Lloyd, D.-H., Chen, J.-K., Gryaznov, S.M., Garestier, T. y Helene, C., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:4365-4369 (1996).
Giovannangeli, C., Diviacco, S., Labrousse, V., Gryaznov, S.M., Charneau, P. y Helene, C., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:79-84 (1997).
Gryaznov, S.M. y Chen, J.-K. J. Am. Chem. Soc. 116:3143-3144 (1994).
Gryaznov, S.M. et al., Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids 22(5-8):577-581 (2003).
Gryaznov, S.M., Lloyd, D.H., Chen, J.-K., Schultz, R.G., DeDionisio, L.A., Ratmeyer, L. y Wilson, W.D., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:5798-5802 (1995).
Gryaznov, S.M., Pongracz, K., y Matray, T., PCT Pubn. No. WO 2001/018015 (Mar 152001).
Gryaznov, S.M., Skorski, T., Cucco, C., Nieborowska-Skorska, M, Chiu, C.Y., Lloyd, D.H., Chen, J. K., Koziolkiewicz, M. y Calabretta, B. Nucleic Acids Res. 24:1508-1514 (1996).
Matray, J.C. et al., Nucleic Acid Research 27(20):3976-3985 (1999).
Nelson, J.S. et al., J. Org. Chem. 62:7278-7287 (1997).
Pongracz, K. y Gryaznov, S.M., Tetrahedron Letters 40(43): 7661-7664 (1999).
Skorski, T., Perrotti, D., Nieborowska-Skorska, M., Gryaznov, S.M. y Calabretta, B., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:3966-3971 (1997).
Vincente, S. et al., J. Org. Chem. 64:991-997 (1999).
Vu, H. et al., Tetrahedron Letters 31(5):7269-7272 (1990).
Wang, E.S. et al., Blood 103(1):258-266 (2004).
Zaitseva, G.V. et al., Nucleosides & Nucleotides 13(1-3):819-838 (1994).
Zaitseva, V.E. et al., Sov. J. Bioorg. Chem. 10(5)5:369-378 (transl. from Bioorg. Khim. 10(5):670-680) (1984). Antecedentes
El uso de oligonucleótidos y análogos de oligonucleótidos como agentes terapéuticos, basado en la unión específica a secuencias de ácidos nucleicos o a proteínas diana, se ha investigado ampliamente. Se han diseñado análogos de oligonucleótidos estructuralmente modificados que carecen de la susceptibilidad nucleasa de los oligonucleótidos naturales (con enlaces fosfodiéster) y que, en algunos casos, presentan otras propiedades ventajosas tales como una unión mejorada a dianas o una especificidad de unión mejorada. Una de estas clases de análogos de nucleótidos es el oligonucleótido unido a fosforodiamidato N3'^P5' (Gryaznov y Chen, 1994; Chen et al., 1994). Estos compuestos son resistentes a nucleasas, forman dupletes estables con dianas de ARN complementario y dupletes de ADN, y han demostrado una actividad de sentido contrario específica de secuencia tanto in vitro como in vivo (Gryaznov et al., 1995; Escude et al., 1996; Gryaznov et al., 1996; Giovannangeli et al., 1997; Skorski et al., 1997). Los oligonucleótidos de tiofosforamidato N3'^P5' relacionados retienen la elevada afinidad de unión al ARN de los fosforamidatos N3'^P5' y también muestran una estabilidad a ácidos mejorada (Pongracz y Gryaznov, 1999; Gryaznov et al., 2001). Algunos oligonucleótidos de tiofosforamidato N3'^P5' han mostrado una prometedora actividad de inhibición de la telomerasa (Gryaznov et al., 2003; Asai et al., 2003; Wang et al., 2004).
Por pasos, la preparación de oligonucleótidos de fosforamidato o de tiofosforamidato N3'^P5' controlada por secuencia, utiliza monómeros de 3'-aminonucleósidos en los que el grupo 3'-amino se protege durante la adición, y posteriormente se desprotege para la adición de un monómero adicional a la cadena del oligonucleótido en crecimiento (véanse, por ejemplo Gryaznov y Chen, 1994; Pongracz y Gryaznov, 1999). Puesto que los grupos de las bases de nucleósidos que normalmente se protegen durante la síntesis son grupos amino primarios, la necesidad de proteger el grupo 3'-amino en presencia de estos grupos ha complicado la preparación de estos monómeros. Los procedimientos existentes (véanse, por ejemplo, Nelson et al., 1997; Matray et al., 1999) conllevan múltiples etapas de protección y por lo general implican la conversión de un grupo 3'-hidroxilo en un grupo 3'-azido (-N3), que posteriormente se reduce a la 3'-amina. Estos procedimientos llevan tiempo, son costosos, y dan como resultado bajos rendimientos globales de los monómeros. Por consiguiente, se desea mejorar la eficacia de esta síntesis, lo que facilitará la preparación de oligonucleótidos de fosforamidato o de tiofosforamidato N3'^P5'.
Sumario de la invención
Un primer aspecto de la invención es un monómero de adenosina o guanosina que comprende:
un grupo 3'-aminoprotegido que está protegido con un grupo lábil a ácidos;
una base nucleosídica que está protegida con un grupo dialquil- di(cicloalquil)- o di(aralquil)- formamidinilo y un grupo 5'-O-(2-cianoetil-N,N-diisopropilamino)fosforamitida.
En una realización del primer aspecto, el grupo dialquil o dicicloalquil formamidinilo es tal que el alquilo es alquilo Ci-C4 y el cicloalquilo es cicloalquilo C5-C6.
En una realización del primer aspecto, el grupo protector lábil a ácidos es un grupo triarilmetilo.
En una realización del primer aspecto, el grupo protector lábil a ácidos es un trifenilmetilo.
En una realización del primer aspecto, la base nucleosídica está protegida con un grupo dimetilformamidinilo o un grupo dibencilformamidinilo.
En una realización del primer aspecto, dicha base nucleosídica está protegida con un grupo dialquilformamidinilo. En una realización del primer aspecto, dicho monómero comprende un grupo 2' seleccionado entre hidrógeno, alcoxi C1-C4, alquilo C1-C4 y flúor.
En una realización del primer aspecto, el grupo 2' del monómero es hidrógeno.
Un segundo aspecto de la invención es un método para preparar un monómero de adenosina, guanosina o citidina que tiene una base nucleosídica protegida y un grupo 3'-amino protegido, en donde dicha base y dicho grupo 3'-amino están protegidos ortogonalmente,
comprendiendo el método:
proporcionar un monómero de 3'-amino-3'-desoxiadenosina, citidina o guanosina en donde el grupo 5'-hidroxilo, la base nucleosídica y el grupo 3'-amino están desprotegidos;
hacer reaccionar selectivamente el grupo 3'-amino con un primer grupo protector que consiste en un grupo lábil a ácidos;
hacer reaccionar el grupo 5'-hidroxilo con un segundo grupo protector que consiste en acilo, éter de trialquilsililo lábil a bases, o éter de sililo lábil a fluoruro; y
hacer reaccionar la base nucleosídica con un tercer grupo protector que es un grupo acilo o un grupo formamidinilo;
en donde el primer grupo protector se puede eliminar de dicho grupo 3'-amino en condiciones que no desprotegen dicha base nucleosídica;
eliminar el segundo grupo protector del grupo 5'-hidroxilo en condiciones que no desprotegen dicha base nucleosídica o dicho grupo 3'-amino y fosfitilar el grupo 5'-hidroxilo.
En una realización del segundo aspecto, el tercer grupo protector es un grupo acilo.
Un tercer aspecto de la invención es un método para preparar un monómero de adenosina, guanosina o citidina que tiene un grupo 5'-hidroxilo fosfitilado, una base nucleosídica protegida y un grupo 3'-amino protegido, en donde dicha base y dicho grupo 3'-amino están ortogonalmente protegidos,
comprendiendo el método:
(a) proporcionar un monómero 3'-amino-3'-desoxi adenosina, citidina o guanosina en donde el grupo 5'-hidroxilo, la base nucleosídica y el grupo 3'-amino están sin proteger;
(b) hacer reaccionar selectivamente dicho grupo 3'-amino con un primer grupo protector que consiste en un grupo lábil a ácidos y
(c) hacer reaccionar selectivamente dicha base nucleosídica con otro grupo protector que consiste en un grupo formamidinilo en donde el monómero es guanosina o adenosina o un grupo acilo en donde el monómero es un monómero de citidina;
en donde dicho primer grupo protector se puede eliminar de dicho grupo 3'-amino en condiciones que no desprotegen dicha base nucleosídica;
(d) fosfitilar el grupo 5'-hidroxilo.
En una realización del segundo o el tercer aspecto, el grupo lábil a ácidos es un triarilmetilo.
En una realización del segundo o el tercer aspecto, el grupo lábil a ácidos es un trifenilmetilo.
En una realización del tercer aspecto, dicho monómero es adenosina o guanosina y dicho otro grupo protector es un grupo dimetilformamidinilo o un grupo dibencilformamidinilo.
En una realización del tercer aspecto, dicho monómero es un monómero de citidina y dicho hacer reaccionar con otro grupo protector comprende reacción con un anhídrido de acilo.
Breve descripción
En el presente documento se describe un método para preparar un monómero de adenosina, guanosina o citidina que tiene una base nucleosídica protegida y un grupo 3'-amino protegido, en donde la base y el grupo 3'-amino están ortogonalmente protegidos. El método puede comprender las etapas de:
(a) proporcionar un monómero de 3'-amino-3'-desoxi adenosina, citidina o guanosina en donde el grupo 5'-hidroxilo, la base nucleosídica y el grupo 3'-amino están sin proteger;
(b) hacer reaccionar selectivamente el grupo 3'-amino con un primer grupo protector; hacer reaccionar el grupo 5'-hidroxilo con un segundo grupo protector y hacer reaccionar la base nucleosídica con un tercer grupo protector;
en donde el primer grupo protector se puede eliminar del grupo 3'-amino en condiciones que no desprotegen la base nucleosídica, y el segundo grupo protector se puede eliminar del grupo 5'-hidroxilo en condiciones que no desprotegen la base nucleosídica o el grupo 3'-amino. El método puede comprender además la etapa de (c) eliminar el segundo grupo protector del grupo 5'-hidroxilo, en condiciones que no desprotegen la base nucleosídica o el grupo 3'-amino.
El primer grupo protector puede ser lábil a ácidos; por ejemplo, un grupo triarilmetilo, tal como trifenilmetilo (tritilo), monometoxitritilo (MMT), o dimetoxitritilo (DMT). El primer grupo protector puede ser fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) o uno de sus derivados, que se pueda eliminar con una amina básica tal como DBU o piperidina.
Preferentemente utilizados para un monómero de adenosina o citidina, el segundo y el tercer grupos protectores pueden ser ambos grupos acilo, por ejemplo, grupos benzoílo, y las condiciones de (c) comprenden un tratamiento suave con ion hidróxido.
El segundo grupo protector puede ser un trialquil silil éter lábil a bases, por ejemplo, un éter de trimetilsililo (TMS), el tercer grupo protector puede ser un grupo acilo, y las condiciones de (c) pueden comprender un tratamiento suave con ion hidróxido.
El segundo grupo protector puede ser un éter de sililo lábil a fluoruro, el tercer grupo protector puede ser un grupo acilo, y las condiciones de (c) pueden comprender tratamiento con ion fluoruro. Dichos éteres de sililo lábiles a fluoruro incluyen, por ejemplo, un terc-butildimetil silil éter, un terc-butildifenil silil éter, un difenilmetil silil éter, y un tri(isopropil) silil éter. El éter de sililo lábil a fluoruro puede ser un terc-butildimetil silil (TBDMS) éter.
En el presente documento se describe también un método que comprende las etapas de:
(a) proporcionar un monómero de 3'-amino-3'-desoxiadenosina, citidina o guanosina en donde el grupo 5'-hidroxilo, la base nucleosídica y el grupo 3'-amino están desprotegidos;
(b) hacer reaccionar selectivamente el grupo 3'-amino con un primer grupo protector y hacer reaccionar selectivamente la base nucleosídica con un grupo protector adicional;
en donde el primer grupo protector se puede eliminar del grupo 3'-amino en condiciones que no desprotegen la base nucleosídica.
El grupo 5'-OH en este método permanece prácticamente sin reaccionar en las condiciones de protección de la base nucleosídica, y no requiere una protección individual. El monómero puede ser un monómero de citidina, el primer grupo protector puede ser como se ha descrito anteriormente, y el grupo protector adicional puede ser un grupo acilo, preferentemente un grupo benzoílo. El grupo acilo protector se puede incorporar preferentemente por reacción con un anhídrido de acilo.
El monómero puede ser un monómero de guanosina o de adenosina, el primer grupo protector puede ser como se ha descrito anteriormente, y el grupo protector adicional puede ser un grupo formamidinilo, tal como un grupo dialquilformamidinilo.
En el presente documento se describe también un método para preparar un monómero de timidina que tiene un grupo 5'-hidroxilo libre y un grupo 3'-amino protegido, comprendiendo el método:
(a) proporcionar un monómero de 3'-amino-3'-desoxitimidina en donde el grupo 5'-hidroxilo y el grupo 3'-amino están desprotegidos; y
(b) hacer reaccionar selectivamente el grupo 3'-amino con un primer grupo protector.
El primer grupo protector puede ser lábil a ácidos; por ejemplo, un grupo triarilmetilo, tal como trifenilmetilo (tritilo). El primer grupo protector puede ser fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) o uno de sus derivados, que se pueda eliminar con una amina básica tal como DBU o piperidina.
Los monómeros de partida y finales en estos métodos de síntesis comprenden, preferentemente, un grupo 2' seleccionado entre hidrógeno, hidroxi, alcoxi inferior, alquilo inferior, y flúor. El monómero puede comprender un grupo 2' seleccionado entre hidrógeno, hidroxi, metoxi, y flúor. El monómero puede ser un monómero 2',3'-didesoxi, tal como el grupo 2' es hidrógeno.
En el presente documento se describe también un monómero de adenosina, guanosina o citidina que tiene un grupo 3'-amino protegido y una base nucleosídica que está (i) desprotegida o (ii) protegida de tal forma que el grupo 3'-amino protegido se puede desproteger en condiciones que no desprotegen la base nucleosídica El grupo 3'-amino puede estar protegido con un grupo protector lábil a ácidos; por ejemplo, un grupo triarilmetilo, tal como trifenilmetilo (tritilo). El grupo 3'-amino puede estar protegido con fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) o un derivado del mismo que se pueda eliminar con una amina básica tal como DBU o piperidina.
La base nucleosídica puede estar sin proteger. La base nucleosídica puede estar protegida con un grupo acilo. Preferentemente, el grupo acilo puede ser benzoilo cuando el monómero es un monómero de adenosina o citidina, e isobutirilo cuando el monómero es un monómero de guanosina. La base nucleosídica puede estar protegida con un grupo formamidinilo, preferentemente, una base nucleosídica puede estar protegida con un grupo dialquilformamidinilo.
El grupo 5'-hidroxilo del monómero puede estar desprotegido, o puede estar protegido de tal forma que se puede desproteger en condiciones que no desprotegen la base nucleosídica o el grupo 3'-amino. Por ejemplo, puede estar protegido con un éter de sililo que es lábil a una base débil o al ion fluoruro, tal como se ha indicado anteriormente. El monómero comprende preferentemente un grupo 2' seleccionado entre hidrógeno, hidroxi, alcoxi inferior, alquilo inferior, y flúor. El monómero puede comprender un grupo 2' seleccionado entre hidrógeno, hidroxi, metoxi, y flúor. El monómero puede ser un monómero 2',3'-didesoxi, tal como el grupo 2' es hidrógeno.
Estos y otros objetivos y características de la divulgación serán más evidentes en su totalidad cuando la siguiente descripción detallada se lea junto con los dibujos adjuntos.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 es un esquema que muestra métodos ilustrativos alternativos para la síntesis de un monómero de 3'-aminoadenosina, que también son de aplicación para monómeros de 3'-aminocitidina, según se describe en el presente documento;
la Figura 2A muestra un método ilustrativo para la síntesis de un monómero de 3'-aminoguanosina, según se describe en el presente documento;
la Figura 2B muestra un método ilustrativo alternativo para la síntesis de un monómero de 3'-aminoguanosina, según se describe en el presente documento;
la Figura 2C muestra un método para la síntesis de un monómero de 3'-aminocitidina, según se describe en el presente documento y
la Figura 3 muestra un método ilustrativo para la síntesis de un monómero de 3'-aminotimidina, según se describe en el presente documento.
Descripción detallada
I. Definiciones
Los términos siguientes tienen los siguientes significados salvo que se indique otra cosa.
"Protegido ortogonalmente", con respecto a una pluralidad de grupos funcionales protegidos en la misma molécula, indica que es posible desproteger cualquier miembro seleccionado del grupo sin desproteger el resto de grupos. "Protegido selectivamente", con respecto a la protección de un grupo funcional diana en una molécula que tiene una pluralidad de grupos funcionales desprotegidos, indica que, en una reacción de la molécula con un reactivo protector, el grupo funcional diana queda protegido en mayor medida que cualquier grupo funcional no diana. La extensión de la reacción del grupo funcional diana con respecto al cualquier grupo funcional no diana es mayor de 1:1, preferentemente mayor de 2:1, y más preferentemente mayor de 3:1 o superior, por ejemplo mayor de 9:1. La misma definición se aplica a la terminología "reacción selectiva" de un grupo funcional dado con un grupo protector. "Reacción con un grupo protector", tal como se usa en el presente documento, es equivalente a "proporcionar un grupo protector", "proteger con a grupo protector", o "reaccionar con un reactivo protector de grupo".
"Alquilo" se refiere a un resto acíclico completamente saturado que consiste en carbono e hidrógeno, que puede ser lineal o ramificado. Ejemplos de grupos alquilo son metilo, etilo, n-butilo, t-butilo, n-heptilo, e isopropilo. Por lo general, se prefieren los grupos alquilo inferior, que tienen de uno a seis átomos de carbono, que se ilustran por metilo, etilo, n-butilo, i-butilo, t-butilo, isoamilo, n-pentilo, e isopentilo. Alquilo inferior puede incluir grupos que tienen de uno a cuatro átomos de carbono, o 1-2 átomos de carbono (metilo y etilo).
"Cicloalquilo" se refiere a un hidrocarburo cíclico saturado, que tiene preferentemente de 4 a 7 átomos de carbono, más preferentemente 5 o 6 (es decir ciclopentilo o ciclohexilo).
"Alquenilo" se refiere a un resto acíclico insaturado que consiste en carbono e hidrógeno, que puede ser lineal o ramificado, que tiene uno o más dobles enlaces. Por lo general, se prefieren los grupos alquenilo inferior, que tienen de dos a seis, o de dos a cuatro, átomos de carbono. "Alquinilo" se refiere a un resto acíclico insaturado que consiste en carbono e hidrógeno, que puede ser lineal o ramificado, que contiene uno o más triples enlaces. Por lo general, se prefieren los grupos alquinilo inferior, que tienen de dos a seis, o de dos a cuatro, átomos de carbono.
"Arilo" se refiere a un radical aromático monovalente sustituido o no sustituido, que tiene por lo general un solo anillo (por ejemplo, benceno) o dos anillos condensados (por ejemplo, naftilo), en donde se prefieren los grupos arilo monocíclicos. El término incluye grupos heteroarilo, que son grupos de anillo aromático que tienen uno o más átomos de nitrógeno, oxígeno o azufre en el anillo, tales como furilo, pirrol, piridilo, e indol. Por "sustituido" se entiende que uno o más átomos de hidrógeno del anillo en el grupo arilo, preferentemente uno o dos átomos de hidrógeno del anillo, está sustituido por un grupo preferentemente seleccionado entre flúor, cloro, bromo, metilo, etilo, metoxi, halometoxi, y halometilo. Los grupos arilo preferidos para su uso en los grupos protectores son arilos carbocíclicos, que están no sustituidos, o sustituidos por alcoxi inferior (además del sustituyente que une el grupo al resto protector).
"Aralquilo" se refiere a un alquilo, preferentemente un sustituyente alquilo inferior (C1-C4, más preferiblemente C1-C2), que está adicionalmente sustituido por un grupo arilo, preferiblemente un grupo arilo monocíclico; los ejemplos son bencilo (-CH2C6H5) y fenetilo.
"Acilo" se refiere a un sustituyente de la forma R(C=O)-, en donde R es alquilo, alquenilo, alquinilo, aralquilo, o arilo como se ha definido anteriormente, y se selecciona preferentemente entre alquilo inferior y arilo carbocíclico monocíclico. Los ejemplos incluyen benzoilo (Ph(C=O)-), acetilo (CH3(C=O)-) e isobutirilo ((CH3)2CH(C=O)-).
II. Síntesis de monómeros protegidos
En el presente documento se describen también síntesis eficaces de monómeros de 3'-amino-5'-hidroxil nucleósidos protegidos ortogonalmente, en las que los grupos amino en la posición 3' y la base nucleosídica están protegidos ortogonalmente, a partir de los correspondientes 3'-aminonucleósidos no protegidos. Normalmente, los monómeros producto se fosfitilan a continuación en el 5'-hidroxilo libre para su uso en la síntesis de oligonucleótidos de fosforamidato o de tiofosforamidato N3'^P5'. (Véanse por ejemplo la Figura 2B y Figura 3).
A. Materiales de partida
El material de partida para la síntesis del monómero es un 3'-aminonucleósido que tiene la siguiente fórmula general:
en donde BASE es una base nucleosídica desprotegida seleccionada entre guanina (G), adenina (A), timina (T) y citidina (C). El sustituyente 2' X puede ser hidrógeno, como en los monómeros 2',3'-didesoxi, para producir análogos de ADN. Como alternativa, X puede ser hidroxi o alcoxi inferior, tal como metoxi, para producir a Rn o análogos de O-alquil ARN. El sustituyente 2' también puede ser flúor (véase, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos n.° 5.684.143) o alquilo inferior, tal como metilo.
Los 3'-amino-2',3'-didesoxinucleósidos, útiles como materiales de partida en las síntesis del presente documento, se pueden obtener comercialmente de Metkinen Oy, situada en Littoinen, Finlandia. El material de partida de 3'-amino-2',3'-didesoxitimidina también está disponible en el mercado de varias fuentes tales como Dalton Chemical Labs (Toronto, Canadá) y MP Biomedicals Inc. (Irvine, CA). Varias preparaciones sintéticas de los 3'-amino-2',3'-didesoxinucleósidos se han notificado en la bibliografía (por ejemplo Zaitseva et al., 1994; Cech et al., 1996; Zaitseva et al., 1984). De acuerdo con Zaitseva et al., 1994, la 3'-amino-2',3'-didesoxitimidina se puede convertir en los
correspondientes monómeros de adenosina o guanosina mediante transglicolación enzimática.
B1. Estrategias de protección: Descripción general
En el presente documento se describen también procedimientos eficaces para convertir los nucleósidos anteriormente representados gráficamente en los correspondientes monómeros 3'-amino-protegidos (en el caso de A, G, y C). Como los grupos de las bases que se deben proteger son también grupos amino, la protección selectiva del grupo 3'-amino en presencia de la base no protegida, o viceversa, no se ha conseguido satisfactoriamente en el pasado, y los procedimientos existentes para la preparación de estos monómeros (véase, por ejemplo, Nelson et al., 1997) conlleva múltiples etapas de protección y por lo general implica la conversión de un grupo 3'-hidroxilo en un grupo azida, que posteriormente se reduce a la 3'-amina.
Los presentes inventores han proporcionado métodos eficaces para proteger selectivamente el grupo 3'-amino en presencia de las bases nucleosídicas, de forma que la base nucleosídica se puede proteger posteriormente con un grupo protector ortogonal; es decir, uno que no se pueda eliminar en las condiciones seleccionadas que son eficaces para eliminar el grupo protector en 3'-amino (o el grupo protector en 5'-hidroxilo, si está presente).
Además, el grupo 3'-amino también está protegido selectivamente en presencia del grupo 5'-hidroxilo o viceversa. Por consiguiente, es posible proporcionar el 5'-hidroxilo libre con un grupo protector, que se puede eliminar en condiciones seleccionadas que no eliminan ni el grupo protector de 3'-amino o el grupo protector de la base. (Como alternativa, como en el caso de la timidina, el grupo 5'-hidroxilo libre se puede fosfitilar directamente).
El grupo protector del 5'-hidroxilo puede ser, por ejemplo, un grupo sililo, que se puede eliminar en condiciones, tales como una base débil o ion fluoruro, que no eliminan los grupos protectores (normalmente grupos acilo o amidinilo) usados con la base nucleotídica. Como alternativa, el mismo grupo protector (tal como un grupo acilo) se puede usar para el 5'-hidroxilo y la base nucleotídica, en donde las condiciones utilizadas para su eliminación (por ejemplo, base débil) que desprotegerán el grupo hidroxilo no desprotegerán los grupos amino de la base nucleotídica.
En una estrategia adicional, la base nucleotídica se puede proteger en condiciones que dejan el grupo 5'-hidroxilo sin reaccionar y que, por tanto, no requieren protección.
En todos los casos, los grupos protectores empleados para las bases nucleotídicas son estables en las condiciones de acoplamiento de monómeros utilizadas en la síntesis de oligonucleótidos. Los procedimientos para preparar oligonucleótidos de fosforamidato o de tiofosforamidato N3’^ -P5’ a partir de los monómeros descritos en el presente documento se describen, por ejemplo, en Gryaznov y Chen (1994) y Pongracz and Gryaznov (1999).
B2. Estrategias de protección: monómeros A, G, y C
En el presente documento se describen también monómeros de adenosina, guanosina o citidina, métodos para preparar dichos monómeros que tienen un grupo 5’-hidroxilo libre, una base nucleosídica protegida, y un grupo 3’-amino protegido, en donde la base y el grupo 3’-amino están protegidos ortogonalmente, tal como se define anteriormente. El material de partida es un monómero de 3’-amino-3’-desoxiadenosina, citidina o guanosina en donde el grupo 5’-hidroxilo, la base nucleosídica y el grupo 3’-amino están desprotegidos.
En una estrategia general, el método comprende hacer reaccionar selectivamente el grupo 3’-amino con un primer grupo protector, hacer reaccionar el grupo 5’-hidroxilo con un segundo grupo protector, y hacer reaccionar la base nucleosídica con un tercer grupo protector. El primer grupo protector (para el 3’-amino) es tal que se puede eliminar del grupo 3’-amino en condiciones que no desprotegen la base nucleosídica. Además, el segundo grupo protector (para el 5’-hidroxilo), cuando está presente, es tal que se puede eliminar del grupo 5’-hidroxilo en condiciones que no desprotegen la base nucleosídica o el grupo 3’-amino.
Una vez que los grupos reactivos deseados se han protegido, de acuerdo con la estrategia general anterior, el segundo grupo protector, si se encuentra presente, se elimina del grupo 5’-hidroxilo, en condiciones que no desprotegen la base nucleosídica o el grupo 3’-amino. A continuación, el monómero se puede fosfitilar, por ejemplo, para su uso en la síntesis de oligonucleótidos.
Normalmente, el primer, segundo y tercer grupos protectores se aplican en dicho orden, aunque el segundo y el tercer grupos pueden, realmente, ser el mismo y, por tanto, aplicarse en una única reacción. Además, la protección del grupo 5’-hidroxilo, en las estrategias que utilizan esta etapa, se puede llevar a cabo antes o después de la protección del grupo 3’-amino. Las dos reacciones se suelen llevar a cabo en el mismo recipiente de reacción, aunque preferentemente, los agentes no se añaden simultáneamente. Preferentemente, el reactivo protector de 3’-amino se añade en primer lugar, como se ilustra en las síntesis siguientes.
La protección transitoria del grupo 5’-hidroxilo con una base lábil de éter de sililo (por ejemplo, TMS) se puede utilizar durante la etapa de protección de la base, tal como se muestra, por ejemplo, en la Fig. 1 (conversión de la estructura 2 en la estructura 6) y en la Fig. 2B, como se analiza más delante de forma detallada.
El grupo 5'-hidroxilo y las bases nucleotídicas se pueden proteger con el mismo reactivo, seguido de la desprotección selectiva del grupo hidroxilo. Dicho reactivo suele ser un agente acilante, por ejemplo, un haluro de isobutirilo o un haluro de benzoílo. Un esquema ilustrativo de este tipo se muestra en la conversión de la estructura 2 en la 3 en la Fig. 1, seguido de tratamiento con base en condiciones suaves para desproteger selectivamente el grupo hidroxilo (conversión de 3 en 6).
Como se ha mencionado anteriormente, el primer grupo protector, para proteger el grupo 3-amino, es uno que es estable en las condiciones que pueden eliminar el segundo grupo protector (del 5'-hidroxilo), cuando está presente, pero es lábil en condiciones que no eliminan el tercer grupo protector (para la base nucleosídica). El primer grupo protector puede ser lábil a ácidos; por ejemplo, un grupo triarilmetilo tal como tritilo (trifenilmetilo), monometoxitritilo (MMT), o dimetoxitritilo (DMT).
Otro grupo útil como el primer grupo protector es fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc), que se puede eliminar mediante escisión no hidrolítica con una amina básica, tal como DBU, morfolina, o piperidina. Una base de hidróxido (por ejemplo NaOH) no es adecuada para este fin, ya que este reactivo normalmente eliminará también otros grupos protectores de la molécula. También se pueden usar derivados de Fmoc que se pueden eliminar por un mecanismo similar. Dichos derivados incluyen aquellos en los que el grupo fluorenilo del Fmoc está sustituido, normalmente en la posición 2 y/o 7, por un grupo, tal como un grupo alquilo inferior, que no afectará negativamente al mecanismo de escisión, o con un grupo electroatrayente, tal como halógeno, que aumenta la labilidad a bases del grupo protector (Carpino et al., 1980). También se incluyen los análogos de dióxido de tioxanteno descritos en Carpino et al., 1989. La Figura 1 muestra permutaciones ilustrativas de una estrategia de síntesis que se puede usar en la preparación de los monómeros sujeto. Estos métodos son especialmente adecuados para los monómeros nucleósidos A (adenosina) y C (citidina). Como se describe a continuación, los métodos también se pueden usar, preferentemente con algunas modificaciones, para monómeros G (guanosina). En las estrategias ilustradas en las Figs. 1 y 2A-B, se usa protección del 5'-hidroxi. La Fig. 2C, analizada más detalladamente a continuación, ilustra una estrategia en donde no se utiliza protección del 5'-hidroxi.
Como se ha mencionado anteriormente, un primer grupo protector preferido (para el grupo 3'-amino) es un grupo lábil a ácidos, tal como tritilo, MMT, o DMT, o un grupo, tal como Fmoc, que es lábil a un reactivo de amina básico tal como DBU. Los segundo y el tercer grupos protectores preferidos son ambos grupos aracilo, por ejemplo, grupos benzoílo. Las condiciones que son eficaces para desproteger el grupo 5'-hidroxilo en condiciones que no desprotegen la base nucleosídica o el grupo 3'-amino, en este caso, comprenden preferentemente un tratamiento suave con base, tal como un tratamiento con hidróxido, por ejemplo hidróxido de amonio. Dicho tratamiento es eficaz para eliminar el grupo acilo del 5'-hidroxilo y para convertir la base diacilada en la base monoacilada. Dicho esquema se ilustra en la Fig. 1, en la conversión del compuesto intermedio 3 en el producto 6.
El segundo grupo protector, para la protección del grupo 5'-hidroxilo, puede ser un éter de trialquilsililo lábil a bases, preferentemente TMS, y el tercer grupo protector (para la protección de la base nucleotídica) es un grupo acilo, tal como un alcanoílo, preferentemente isobutirilo, o un grupo benzoílo. De nuevo, las condiciones que son eficaces para desproteger el grupo 5'-hidroxilo en condiciones que no desprotegen la base nucleosídica o el grupo 3'-amino, en este caso, comprenden preferentemente un tratamiento suave con base, por ejemplo, tratamiento con hidróxido. Dicho tratamiento es eficaz para escindir un éter de trimetilsililo y para convertir la base diacilada, si se encuentra presente, en la base monoacilada. Un ejemplo de este esquema también se ilustra en la Fig. 1, en la conversión del compuesto intermedio 2 en el producto 6.
Otro tipo preferido de grupo protector para la base nucleotídica, particularmente para los monómeros de adenosina y guanosina, es un grupo protector de formamidinilo, tal como un grupo dialquil-formamidinilo, di(cicloalquil)-formamidinilo, o di(aralquil)-formamidinilo, en donde "alquilo" es, preferentemente, C1-C4 y "cicloalquilo" es, preferentemente, C5-C6. Los ejemplos específicos incluyen dimetilformamidinilo y dibencilformamidinilo. Estos grupos protectores se pueden eliminar, por lo general, de las bases nucleotídicas (por ejemplo, al final de la síntesis) en condiciones más suaves de las utilizadas para eliminar los grupos protectores de benzoílo o isobutirilo. Véanse, por ejemplo, Vu et al., 1990, Vincent et al., 1999, y/o la patente de Estados Unidos n.° 5.281.701. Tal como se describe en el presente documento, la reacción de una amina primaria con una dimetil acetal dialquilformamida, por ejemplo, proporciona la amina protegida con dialquilformamidinilo. La desprotección se puede llevar a cabo, generalmente, por tratamiento con una solución acuosa o alcohólica de hidróxido de amonio a temperatura ambiente a aproximadamente 55°C.
El segundo protector (para proteger el 5'-hidroxilo) puede ser un éter de sililo lábil a fluoruro, y el tercer grupo protector (pata la base nucleosídica) puede ser un grupo acilo, tal como un grupo benzoílo, o un grupo formamidinilo como se ha descrito anteriormente. En este caso, las condiciones que son eficaces para desproteger el grupo 5'-hidroxilo, en condiciones que no desprotegen la base nucleosídica o el grupo 3'-amino, comprenden preferentemente tratamiento con ion fluoruro, por ejemplo, fluoruro de tetrabutilamonio (TBAF). Dicho tratamiento es eficaz para escindir el éter de sililo y convertir la base diacilada, si se encuentra presente, en la base monoacilada. Un ejemplo de este esquema también se ilustra en la Fig. 1, en la conversión del compuesto intermedio 5 en el
producto 6. Los éteres de sililo lábiles a fluoruro ilustrativos incluyen, por ejemplo, terc-butildimetil silil éter, tercbutildifenil silil éter, difenilmetil silil éter, tri(isopropil) silil éter, y otros conocidos en la técnica.
Los métodos anteriores también se pueden utilizar, con algunas modificaciones relativas principalmente a la solubilidad, para los monómeros de guanosina (G). Como se ilustra en la Figura 2A, el grupo 5'-hidroxilo del monómero de partida 7 se puede proteger con un grupo lipófilo, tal como TBDMS, en una etapa temprana del proceso, para facilitar la solubilidad en el disolvente convencional piridina.
Como se ha mencionado anteriormente, un primer grupo protector preferido (para el grupo 3'-amino) es un grupo lábil a ácidos, tal como tritilo, DMT, o MMT, o un grupo, tal como Fmoc, que es lábil a un reactivo de amina básico tal como DBU. En el método de la Fig. 2A se emplea un grupo tritilo.
Dependiendo de las condiciones de reacción, se pueden observar pequeñas cantidades (por ejemplo, aproximadamente un 5 %) del compuesto ditritilado 9 además del compuesto 8 deseado 3'-monotritilado. Por consiguiente, "protección selectiva" tal como se usa en el presente documento, indica que la molécula que tiene el estado de protección deseado se forma en mayor medida, es decir, en una relación mayor de 1:1, que las moléculas en las que los grupos funcionales no diana están protegidos, tanto de forma exclusiva o además del grupo funcional diana. Preferentemente, la relación es mayor de 2:1, más preferentemente mayor de 3:1, y lo más preferido mayor de 9:1.
El segundo grupo protector (para el 5'-hidroxilo) puede ser un éter de sililo lábil a fluoruro y, más preferentemente, un grupo que mejora la solubilidad del compuesto intermedio. Se descubrió que un éter de TBDMS, como se muestra en la Fig. 2A, mejoraba la solubilidad en el disolvente piridina.
El tercer grupo protector es, preferentemente, un grupo acilo, por ejemplo, un grupo isobutirilo, o un grupo formamidinilo, como se ha descrito anteriormente. Las condiciones que son eficaces para desproteger el grupo 5'-hidroxilo, en condiciones que no desprotegen la base nucleosídica o el grupo 3'-amino, comprenden preferentemente tratamiento con ion fluoruro, por ejemplo, fluoruro de tetrabutilamonio (TBAF). Dicho tratamiento es eficaz para escindir el éter de sililo en el compuesto 10 sin afectar los grupos isobutirilo o tritilo, como se muestra en la Fig. 2A.
Como se ilustra en la Figura 2B, un disolvente más polar, como DMF, se puede utilizar para solubilizar el monómero de partida 7 y, por otra parte, el esquema de reacción puede ser similar al esquema de la "protección transitoria" (usando un éter de TMS como el grupo protector del 5'-hidroxilo) mostrado para el monómero de adenosina 1 en la Fig. 1.
La Figura 2C ilustra una estrategia de síntesis, especialmente aplicable a los monómeros de citidina, en donde no se emplea la protección del 5'-hidroxilo. En este esquema de reacción, tras la protección selectiva del grupo 3'-amino del monómero 12 con, por ejemplo, un grupo tritilo, el grupo amino exocíclico de esta base se hace reaccionar con un anhídrido de acilo, tal como anhídrido de benzoílo. El disolvente preferiblemente contiene un alcohol, que se cree compite con una reacción de supresión del grupo 5'-hidroxilo. Los ejemplos incluyen metanol, etanol, y mezclas de estos disolventes con, por ejemplo, acetonitrilo, DMF, o piridina. En la reacción que utiliza anhídrido de benzoílo en etanol o en acetonitrilo:metanol 9:1, como se describe en la Síntesis 4, se observó poco (< 5 %) producto 5'-benzoilado. El monómero de 5'-hidroxilo 14 predominante se puede fosfitilar después por métodos convencionales. En otro método, particularmente aplicable a los monómeros de adenosina o guanosina, tras la protección selectiva del grupo 3'-amino del monómero con, por ejemplo, un grupo tritilo, el grupo amino exocíclico de esta base se puede proteger con un grupo dialquilformamidinilo, grupo di(cicloalquil)formamidinilo, o grupo dibencilformamidinilo, preferentemente un grupo dimetilformamidinilo. El grupo 5'-hidroxilo, que se espera que permanezca práctica o totalmente sin reaccionar durante estas etapas, se puede fosfitilar después por métodos convencionales.
B3. Estrategias de protección: Monómero T
En el presente documento se describe también un método para preparar un monómero de timidina que tiene un grupo 5'-hidroxilo libre y un grupo 3'-amino protegido. La estrategia de síntesis difiere de la anteriormente descrita, en que la base timina no suele necesitar protección en condiciones de síntesis de oligonucleótidos. En este caso, el material de partida es un monómero de 3'-amino-3'-desoxitimidina en donde el grupo 5'-hidroxilo y el grupo 3'-amino están desprotegidos, y el método comprende hacer reaccionar selectivamente dicho grupo 3'-amino con un primer grupo protector, de tal forma que el grupo 5'-hidroxilo permanece sustancialmente desprotegido.
Como en las síntesis anteriormente descritas, un grupo protector preferido para el grupo 3'-amino es un grupo lábil a ácidos, tal como un grupo triarilmetilo, o un grupo, tal como Fmoc, que es lábil a un reactivo de amina básico tal como DBU. En el método de la Fig. 3 se emplea un grupo tritilo.
A continuación, el grupo 5'-hidroxilo se puede fosfitilar, como se describe, por ejemplo en la síntesis 5 siguiente. A destacar que este proceso de fosfitilación también es de aplicación a cualquiera de los monómeros con protección
en el grupo 5'-hidroxilo y 3'-amino y en la base anteriormente descritos.
Síntesis
Las siguientes síntesis ilustran, pero no se pretende que limiten la divulgación. Por ejemplo, las condiciones de reacción, tales como la selección del disolvente, catalizador (por ejemplo, trietilamina o diisopropil etil amina), tiempos de reacción y temperaturas de reacción, pueden variar por lo general de los ilustrados a continuación, de acuerdo con el conocimiento del experto en la técnica, usando experimentación rutinaria. En algunos casos, el orden de adición de reactivos podría variar. Los disolventes adecuados para la mayoría de estas reacciones, cuando no se indica otra cosa, incluyen por lo general disolventes aprótico polares tales como piridina, DMF, acetonitrilo, o mezclas de los mismos. Las temperaturas adecuadas están generalmente comprendidas en el intervalo de -10°C a temperatura ambiente a aproximadamente 55°C.
Síntesis 1. Síntesis de N6-benzo¡l-3'-am¡notr¡t¡l-2',3'-d¡deox¡adenos¡na a partir de 3'-am¡no-2',3'-d¡deox¡adenos¡na A. Método 1: Ruta de perbenzoilación (como se ¡lustra en la Fig. 1, 1 ^ 2 ^ 3 ^ 6 )
El monómero de partida, 3'-amino-2',3'-didesoxiadenosina(1, 10 mmol), se evaporó simultáneamente con piridina seca, después, se suspendió en 100 ml de piridina seca que contenía 6 equiv. de trietilamina, y la mezcla se calentó a 50°C con agitación. Se añadió cloruro de tritilo (1,1 equiv.), y la agitación se continuó durante dos horas a 50°C. La solución trasparente obtenida que contenía el monómero 3'-tritilado 2 se enfrió a 0°C, se añadieron 5 equiv. de cloruro de benzoilo gota a gota, y la mezcla de reacción se agitó durante una hora y después se vertió en 100 ml de bicarbonato sódico al 5 % frío. La goma de color amarillo precipitada se extrajo con acetato de etilo, y la solución de acetato de etilo se evaporó. El aceite resultante (3, que tiene un grupo benzoílo en el 5'-hidroxilo y dos en N6 de la base) se disolvió en 50 ml de piridina:metanol:agua 65:35:5 v/v/v, la solución se enfrió a 0°C, y se añadieron 50 ml de hidróxido sódico 2 M. Después de 25 min de agitación a 0°C, la mezcla de reacción se neutralizó con clorhidrato de piridinio, y el volumen de la mezcla se redujo por evaporación. Tras dilución con acetato de etilo, la capa orgánica se separó y se lavó con una solución acuosa saturada de bicarbonato de sodio y se evaporó al vacío. El producto se purificó por cromatografía en columna ultrarrápida de gel de sílice usando un sistema disolvente de cloruro de metileno:metanol 95:5 v/v. El rendimiento del producto aislado (6), que tiene un grupo 5'-hidroxilo libre y la base monobenzoilada, fue 2,0 g (33,6 %)
B. Método 2: Ruta de protección transitoria (como se muestra en la Fig. 1, 1 ^ 2 ^ 6 )
El monómero de partida, 3'-amino-2',3'-didesoxiadenosina(1, 10 mmol), se convirtió en el monómero 3'-protedigo 2 como se ha descrito anteriormente, es decir, por tratamiento con 1,1 equiv. de cloruro de tritilo en piridina seca que contenía 6 equiv. de trietilamina a 50°C.
La solución transparente de 2 se enfrió a 0°C, y se añadieron 5 equiv. de clorotrimetilsilano gota a gota, seguido de agitación durante 30 min, produciendo un compuesto intermedio de 5'-OTMS. A continuación se añadió cloruro de benzoilo (5 equiv.) gota a gota, seguido de agitación durante dos horas a temperatura ambiente, produciendo un compuesto intermedio de base protegida con monobenzoilo y/o dibenzoilo.
La mezcla de reacción se enfrió a 0°C, y se añadieron 20 ml de agua fría, seguido de 20 min de agitación y la adición de 20 ml de una solución concentrada de hidróxido de amonio. La agitación se continuó durante 30 min, y la solución se concentró al vacío. El residuo oleoso se recogió en acetato de etilo y se lavó con una solución saturada de bicarbonato sódico, y la solución se secó y se evaporó al vacío. El producto se purificó como anteriormente por cromatografía sobre gel de sílice. El rendimiento del producto aislado (6) fue 3,6 g (60,2 %).
En procedimientos posteriores, DMF o DMF/piridina, con adición de trietilamina, se usó como disolvente en la reacción de tritilación inicial, y el compuesto intermedio 2 se hizo reaccionar adicionalmente, usando cualquiera del Método A o Método B, para dar el producto 6 con un rendimiento de aproximadamente el 70 %. Se encontró que los rendimientos mejoraban algo por eliminación de trietilamina (por ejemplo, mediante lavado acuoso) antes de la benzoilación, particularmente cuando se usa el Método A. Se observó que este tratamiento evitaba la formación de un producto secundario, que se creía resultado de la apertura del anillo de la base adenina. La formación de este producto secundario también se eliminó aislando el producto tritilado 2 antes de la reacción posterior.
C. Método 3: Ruta de protección TBDMS (como se ¡lustra en la Fig. 1, 1 ^ 2 ^ 4 ^ 5 ^ 6 )
El monómero de partida, 3'-amino-2',3'-didesoxiadenosina(1, 10 mmol), se convirtió en el monómero 3'-protedigo 2 como se ha descrito anteriormente, es decir, por tratamiento con 1,1 equiv. de cloruro de tritilo en piridina seca que contenía 6 equiv. de trietilamina a 50°C.
A la solución transparente se añadieron 2 equiv. de cloruro de terc-butildimetilsililo (TBDMS Cl), y la agitación continuó durante la noche a temperatura ambiente. Esta solución (del sililoxi intermedio 43'-tritilamino-5'-TBDM ) se enfrió a -5°C, y se añadieron 3 equiv. de cloruro de benzoilo gota a gota, seguido por agitación a temperatura
ambiente durante dos horas, proporcionando el intermedio de N6-dibenzoilo 5. La solución se concentró al vacío, y el residuo oleoso se recogió en acetato de etilo, se lavó con una solución saturada de bicarbonato sódico, se secó y se evaporó al vacío.
El residuo oleoso obtenido se disolvió en 100 ml de THF, y se añadieron 2 equiv. de TBAF (fluoruro de tetrabutilamonio). La mezcla se agitó durante toda la noche a temperatura ambiente. Se añadió acetato de etilo a la mezcla de reacción, y la solución se lavó con bicarbonato sódico, citrato de sodio 0,5 M (pH 4) y salmuera. El producto se purificó como anteriormente por cromatografía sobre gel de sílice para dar 3,3 g (55,5 %) del compuesto 6 puro.
Síntesis 2. Síntesis de N4-benzo¡l-3'-am¡notr¡til-2'.3'-d¡desox¡c¡t¡d¡na
La síntesis de N4-benzoil-3'-aminotritil-2',3'-didesoxicitidina a partir de 3'-amino-2',3'-didesoxicitidina puede realizarse de una manera similar, usando cualquiera de los procedimientos anteriores, o de acuerdo con el método de la síntesis 4, a continuación.
Síntesis 3. Síntesis de N2-¡sobut¡r¡l-3'-am¡notr¡t¡l-2',3'-d¡desox¡guanos¡na a partir de 3'-am¡no-2',3'-d¡desox¡guanos¡na (Fig. 2A)
El material de partida, 3'-amino-2',3'-didesoxiguanosina (7, 2 g), se evaporó simultáneamente con piridina seca, a continuación se suspendió en 100 ml de piridina seca y 6 equiv. de diisopropiletilamina. Se añadió cloruro de tercbutildimetilsililo (2 equiv.), produciendo un sililoxi intermedio 5'-TBDM. Después de 30 min de agitación, se añadieron 1,1 equiv. de cloruro de tritilo en dos porciones, y la agitación continuó durante la noche a temperatura ambiente. Se detectaron dos compuestos mediante TLC, siendo el producto más abundante de menor recorrido 8 la 5'-TBDMS-3'-aminotritil-2',3'-didesoxiguanosina deseada. El compuesto 9, menos abundante y de mayor recorrido, está tritilado en la base. El compuesto 8 monotritilado se aisló por cromatografía sobre gel de sílice usando un sistema disolvente de cloruro de metileno:metanol:trietilamina 94:5:1 v/v/v.
Este producto se evaporó simultáneamente con piridina seca y se disolvió en 100 ml de piridina. La solución se enfrió a 0°C, y se añadieron 1,1 equiv. de cloruro de isobutirilo, seguido de agitación durante 30 min. Después de inactivar la reacción con metanol y evaporación al vacío, la reacción se trató con cloruro de metileno-bicarbonato sódico. La fase orgánica se secó con sulfato sódico y se evaporó al vacío. El residuo oleoso (el monómero 10 completamente protegido) se disolvió en 100 ml de tetrahidrofurano, y se añadieron 5 equiv. de fluoruro de tetrabutilamonio. La mezcla de reacción se agitó durante toda la noche, a continuación se diluyó con acetato de etilo, se lavó con bicarbonato sódico. Después de secar con sulfato sódico el disolvente se evaporó al vacío para dar 2 g del producto de 5'-hidroxilo 11 (46,1 %).
En procedimientos posteriores, la tritilación de 7 se llevó a cabo en DMF/piridina a 50°C, y el producto secundario 9 (<5 %) se retiró mediante precipitación del producto predominante 8 en diclorometano o agua. La base nucleotídica se protegió usando bien el esquema de protección transitoria de la Fig. 2B o una reacción de peracilación (análogo a la síntesis 1A). El producto 11 se aisló, tras cristalización en CH3CN, en rendimientos de aproximadamente 60 % y 53 %, respectivamente. También se observó que los rendimientos mejoraban cuando se ponía cuidado en evitar la hidrólisis del reactivo de cloruro de acilo.
Síntesis 4. Síntesis de N4-benzo¡l-3'-am¡notr¡t¡l-2',3'-d¡desox¡c¡t¡d¡na a partir de 3'-am¡no-2',3'-d¡desox¡c¡t¡d¡na (como se ¡lustra en la Fig. 2C)
El grupo 3'-amino del material de partida 12 se hizo reaccionar con cloruro de tritilo en piridina:DMF 1:4 en presencia de trietilamina. El compuesto intermedio 13 se hizo reaccionar con anhídrido de benzoílo en CH3CN:MeOH 9:1 a 50°C. El producto deseado 14 se aisló, tras cromatografía sobre gel de sílice, con un 70 % de rendimiento.
Síntesis 5. Síntesis de 3'-am¡notr¡t¡l-3'-desox¡t¡m¡d¡na-5'-(2-c¡anoet¡lo, N,N-diisopropil)fosforamidita a partir de 3'-am¡no-3'-desox¡t¡m¡d¡na, seguido de fosfitilación (como se ¡lustra en la Fig. 3)
El material de partida, 3'-amino-3'-desoxitimidina (15, 1,3 g) se evaporó simultáneamente con piridina seca, se disolvió a continuación en 30 ml de piridina seca. A esta solución se añadieron 5 equiv. de diisopropiletilamina o trietilamina, seguido de 10 min de agitación y adición de 1 a 1,1 equiv. de cloruro de tritilo. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante una noche (o, como alternativa, a 50°C durante 1 hora). Tras la desaparición del material de partida según TLC, la reacción se inactivó con metanol y la solución se evaporó al vacío. El aceite obtenido se disolvió en cloruro de metileno, se lavó con una solución saturada de bicarbonato sódico, se secó con sulfato sódico y se concentró. La precipitación con cloruro de metileno-hexano proporcionó 2,2 g (85 %) del producto 16 en forma de un polvo de color blanco.
El producto 16 (1,7 g) se evaporó simultáneamente con piridina seca y se disolvió en 100 ml de cloruro de metileno seco. A esta solución se añadieron 4 equiv. de diisopropiletilamina, seguido de 1,2 equiv. de 2-cianoetil-N,N-diisopropilclorofosforamidita. La reacción se controló por TLC y, tras la desaparición del material de partida, la
solución se lavó con una solución saturada de bicarbonato sódico, se secó con sulfato sódico y se evaporó al vacío. El producto se purificó por cromatografía en columna ultrarrápida de gel de sílice usando un sistema disolvente de cloruro de metileno:trietilamina 10:1 v/v para producir 2 g (83,3 %) del monómero 17 fosfitilado en forma de una espuma sólida. El rendimiento global del procedimiento fue del 70,8 %.
Claims (15)
1. Un monómero de adenosina o de guanosina que comprende:
un grupo 3'-amino protegido que está protegido con un grupo lábil a ácidos;
una base nucleosídica que está protegida con un grupo dialquil-, di(cicloalquil)- o di(aralquil)-formamidinilo y un grupo 5'-O-(2-cianoetil-N,N-diisopropilamino)fosforamidita.
2. El monómero de la reivindicación 1, en donde los grupos dialquil o dicicloalquil formamidinilo son tales que el alquilo es alquilo C1-C4 y el cicloalquilo es cicloalquilo C5-C6.
3. El monómero de la reivindicación 1, en donde el grupo protector lábil a ácidos es un grupo triarilmetilo.
4. El monómero de la reivindicación 1, en donde el grupo protector lábil a ácidos es un trifenilmetilo.
5. El monómero de la reivindicación 1, en donde dicha base nucleosídica está protegida con un grupo dimetilformamidinilo o un grupo dibencilformamidinilo.
6. El monómero de la reivindicación 1 en donde dicha base nucleosídica está protegida con un grupo dialquilformamidinilo.
7. El monómero de la reivindicación 1, en donde dicho monómero comprende un grupo 2' seleccionado de hidrógeno, hidroxi, alcoxi C1-C4, alquilo C1-C4 y flúor.
8. El monómero de la reivindicación 1, en donde el grupo 2' del monómero es hidrógeno.
9. Un método para preparar un monómero de adenosina, guanosina o citidina que tiene una base nucleosídica protegida y un grupo 3'-amino protegido,
en donde dicha base y dicho grupo 3'-amino están ortogonalmente protegidos,
comprendiendo el método:
proporcionar un monómero de 3'-amino-3'-desoxi adenosina, citidina o guanosina en donde el grupo 5'-hidroxilo, la base nucleosídica y el grupo 3'-amino están sin proteger;
hacer reaccionar de manera selectiva el grupo 3'-amino con un primer grupo protector que consiste en un grupo lábil a ácidos;
hacer reaccionar el grupo 5'-hidroxilo con un segundo grupo protector que consiste en acilo, trialquil silil éter lábil a bases o silil éter lábil a fluoruro y
hacer reaccionar la base nucleosídica con un tercer grupo protector que es un grupo acilo o un grupo formamidinilo;
en donde el primer grupo protector se puede eliminar de dicho grupo 3'-amino en condiciones que no desprotegen dicha base nucleosídica;
eliminar el segundo grupo protector del grupo 5'-hidroxilo en condiciones que no desprotegen dicha base nucleosídica o dicho grupo 3'-amino y fosfitilar el grupo 5'-hidroxilo.
10. El método de la reivindicación 9, en donde el tercer grupo protector es un grupo acilo.
11. Un método para preparar un monómero de adenosina, guanosina o citidina que tiene un grupo 5'-hidroxilo fosfitilado, una base nucleosídica protegida y un grupo 3'-amino protegido, en donde dicha base y dicho grupo 3'-amino están ortogonalmente protegidos,
comprendiendo el método:
(a) proporcionar un monómero de 3'-amino-3'-desoxi adenosina, citidina o guanosina en donde el grupo 5'-hidroxilo y el grupo 3'-amino están desprotegidos;
(b) hacer reaccionar selectivamente dicho grupo 3'-amino con un primer grupo protector que consiste en un grupo lábil a ácidos y
(c) hacer reaccionar de manera selectiva dicha base nucleosídica con otro grupo protector que consiste en un grupo formamidinilo en donde el monómero es guanosina o adenosina o un grupo acilo en donde el monómero es un monómero de citidina;
en donde dicho primer grupo protector se puede eliminar de dicho grupo 3'-amino en condiciones que no desprotegen dicha base nucleosídica;
(d) fosfitilar el grupo 5'-hidroxilo.
12. El método de las reivindicaciones 9, 10 u 11, en donde el grupo lábil a ácidos es un triarilmetilo.
13. El método de las reivindicaciones 9, 10 u 11, en donde el grupo lábil a ácidos es un trifenilmetilo.
14. El método de la reivindicación 11, en donde dicho monómero es adenosina o guanosina y dicho otro grupo protector es un grupo dimetilformamidinilo o un grupo dibencilformamidinilo.
15. El método de la reivindicación 11, en donde dicho monómero es un monómero de citidina y dicho hacer reaccionar con otro grupo protector comprende la reacción con un anhídrido de acilo.
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US5998604A (en) * | 1997-09-15 | 1999-12-07 | The Perkin-Elmer Corporation | Polynucleotide purification method |
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