ES2202447T3

ES2202447T3 - Metodos de sintesis de derivados organofosforados.

Info

Publication number: ES2202447T3
Application number: ES96917829T
Authority: ES
Inventors: Wojciech J. Stec; Lucyna Wozniak; Timothy Riley
Original assignee: Polska Akademia Nauk; Polska Akademia Nauk Instytut; Genta Inc
Current assignee: Polska Akademia Nauk; Polska Akademia Nauk Instytut; Genta Inc
Priority date: 1995-05-26
Filing date: 1996-05-24
Publication date: 2004-04-01
Anticipated expiration: 2016-05-24
Also published as: JP2002500617A; DK0828749T3; EP1323727A2; EP0828749A4; DE69629112D1; WO1996037503A1; ATE245161T1; PT828749E; EP0828749B1; AU6024096A; EP0828749A1; EP1323727A3; DE69629112T2; AU707369B2; CA2222048A1

Abstract

SE PROPORCIONAN NUEVOS DERIVADOS DE MONONUCLEOSIDOS ORGANOFOSFORADOS, UN METODO DE SINTESIS DE LOS MISMOS Y METODOS DE SINTESIS DE DERIVADOS DE DINUCLEOTIDOS ORGANOFOSFORADOS, UTILIZANDO DICHOS DERIVADOS MONONUCLEOSIDOS ORGANOFOSFORADOS. LOS DERIVADOS DE MONONUCLEOSIDOS ORGANOFOSFORADOS DE LA PRESENTE INVENCION SE REPRESENTAN MEDIANTE LA FORMULA (1).

Description

Método de síntesis de derivados organofosforados.

Sector de la técnica al que pertenece la invención

La presente invención se refiere generalmente a métodos de síntesis para derivados mono- y di-nucleósidos organofosforados.

Antecedentes de la invención

Se conoce que la mayoría de los estados corporales en los animales, incluyendo estados de enfermedad, están ocasionados por las proteínas. Dichas proteínas, actuando directamente o a través de sus funciones enzimáticas, contribuyen a varios estados de enfermedad en los animales y en los seres humanos.

Generalmente, se han centrado los terapéuticos clásicos en las interacciones con dichas proteínas con el fin de moderar las funciones que causan o que potencian la enfermedad. Sin embargo, recientemente se ha intentado moderar la producción actual de dichas proteínas mediante las interacciones con las moléculas (ARN intercelular) que dirigen su síntesis. Estas interacciones implican la hibridización de los oligonucleótidos "antisentido" complementarios con ARN o bien de ciertos análogos de los mismos. La hibridización se refiere a la secuencia específica de unión hidrógeno de los oligonucleótidos o análogos de los oligonucleótidos enlazado con ARN o ADN. Cuando ocurre la hibridización, se puede interrumpir la biosíntesis de las proteínas. Es deseable que esta interferencia con la producción de las proteínas diera lugar a resultados terapéuticos con efectos máximos y efectos secundarios mínimos. También se pueden utilizar los análogos de los oligonucleótidos para moderar la producción de las proteínas mediante un mecanismo similar.

La actividad farmacológica de los oligonucleótidos antisentido y los análogos de oligonucleótidos, como otros efectos terapéuticos, depende del número de factores que afectan la concentración efectiva de estos agentes en los blancos intercelulares específicos. Un factor importante para los oligonucleótidos es la estabilidad de las especies en presencia de las nucleasas. Es improbable que los oligonucleótidos no modificados sean agentes terapéuticos útiles porque se degradan rápidamente por las nucleasas. Por consiguiente, es muy deseable la modificación de los oligonucleótidos para que se vuelvan resistentes a las nucleasas.

Generalmente, las modificaciones de los oligonuecleótidos para incrementar la resistencia a las nucleasas tienen lugar en el átomo fósforo de la cadena principal del azúcar-fosfato. Se han descrito fosforotioatos, metilfosfonatos, fosforamidatos y fosforotriésteres para conferir varios niveles de resistencia a las nucleasas. Sin embargo, generalmente los fosfatos modificados en los oligonuecleótidos de este tipo sufren de las propiedades de la hibridización inferior (Cohen, J.S., ed. Oligonucleotides: Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Inc. Boca Raton FL, 1989)

Otro factor clave es la habilidad de los compuestos antisentido de atravesar la membrana plasmática de las células específicas involucradas en el proceso de la enfermedad. Las membranas celulares consisten en bicapas lípido-proteína que son libremente permeables a compuestos pequeños, no iónicos y lipofílicos, pero que son esencialmente impermeables a la mayoría de los metabolitos naturales y a los agentes terapéuticos (Wilson, D.B. Ann Rev. Biochem. 47:933, 1978). Se han documentado adecuadamente los efectos biológicos y antivíricos de los oligonucleótidos naturales y modificados en las células cultivadas de mamíferos. Por consiguiente, parece ser que estos agentes pueden penetrar en las membranas para alcanzar sus blancos u objetivos intercelulares. La absorción de los compuestos antisentido por varias células de mamíferos que incluyen HL-60, fibroblasto de un Hámster Sirio, U937, L929, CV-1 y células ATH8, ha sido estudiada utilizando oligonucleótidos naturales y algunos análogos resistentes a las nucleasas, como por ejemplo los triésteres de alquilo (Millar P.S y Otros, Biochem. 16:1988, 1977) y los metilfosfonatos (Marcus-Sekura, C.H. y otros, Nuc. Acids Res. 15:5749, 1987; Millar P.S. y otros, Biochem 16:1988, 1977, y Loke S.K y otros, Top. Microbiol. Immunol. 141:282, 1988).

Los oligonucleótidos modificados y sus análogos pueden ser internalizados con menos facilidad que sus homólogos naturales. Como resultado, la actividad de muchos oligonucleótidos antisentido previamente disponibles no es suficiente para propósitos terapéuticos prácticos, de investigación o de diagnóstico. Otras dos deficiencias reconocidas por el estado de la técnica se caracterizan en que muchos de los terapéuticos oligonucleotídicos antisentido previamente designados hibridizan con menos eficiencia con el ARN intercelular y carecen del producto químico definido o del evento mediado por enzimas para terminar la función esencial de la ARN.

Se han realizado muchas formas de las modificaciones para incrementar la eficacia de los oligonucleótidos antisentido y superar estos problemas. Estas modificaciones incluyen modificaciones en el anillo base, modificaciones en el medio azúcar y modificaciones en el azúcar-fosfato de la cadena principal. Anteriormente a las modificaciones en el azúcar-fosfato en la cadena principal, particularmente en el átomo fósforo, se han llevado a cabo varios niveles de resistencia a las nucleasas. Sin embargo, mientras que la habilidad del oligonucleótido antisentido de enlazarse adecuadamente con un ARN o ADN específico es fundamental para la metodología antisentido, los oligonucleótidos fosforados modificados sufren generalmente de las propiedades de la hibridización inferior.

Una aproximación alternativa ha sido el reemplazo del átomo fósforo para intentar evitar problemas asociados con la modificación de la parte del fosfato proquiral. Algunas modificaciones en las cuales se complementa el

\hbox{reemplazo}

del átomo fósforo están descritas por Matteucci, (Tetrahedron Letters 31:2385, 1990), en el que el reemplazo del átomo fósforo con un grupo metileno está limitado por una metodología disponible que no proporciona una inserción uniforme del enlace formacetal a lo largo de la cadena principal, y por su inestabilidad, lo que le convierte en inadecuado para su uso; Cormier, (Nuc. Acids Res. 16:4583, 1988), en el que el reemplazo del medio fósforo con un diisopropilsililo está limitado por la metodología, solubilidad de los homopolímeros y por las propiedades de hibridización; Stirchak (J. Org. Chem. 52:4202, 1987), en el que el reemplazo del enlace fósforo por homopolímeros cortos que contienen enlaces carbamato o morfolino está limitado por la metodología, la solubilidad de la molécula resultante y por las propiedades de hibridización; Mazur (Tetrahedron, 40:3949, 1984), en el que el reemplazo del enlace fósforo con un enlace fosfónico no ha sido desarrollado más allá de la síntesis de una molécula homotrímero; y Goodrich (Bioconj. Chem. 1:165, 1990) en el que los enlaces ésteres están enzimáticamente degradados por esterasas y por consiguiente son inadecuados para reemplazar el enlace fosfonato en las aplicaciones antisentido.

Otro factor clave son los efectos esteroquímicos que surgen en los oligómeros que tienen centros quirales. En general, un oligómero con una distancia de n nucleósidos constituirá una mezcla de 2^{n-1} isómeros en síntesis sucesiva de cadena no estereoespecífica.

Se ha observado que las cadenas homoquirales Rp y Sp, cuya conLa figuración absoluta en todos los átomos fósforo metanfosfonato internucleotídicos son Rp o bien Sp, y las cadenas no-estereorregulares muestran diferentes propiedades fisicoquímicas y también diferentes capacidades de formar centros principales con los oligonucleótidos de la secuencia complementaria. Adicionalmente, los análogos fosforotioatos de los nucleótidos han mostrado diferencias sustanciales de la estereoselectividad en la resistencia a la actividad de las nucleasas entre los oligonucleótidos Oligo-Rp y Oligo-Sp (Potter, biochemistry, 22:1369, 1983, Bryant y otros, Biochemistry, 18:2825, 1979).

Lesnikowski (Nucl. Acids Res., 18:2109, 1990) observó que los diastereoméricos puros metanfosfonatos octatimidina, en los cuales seis de los siete enlaces metanfosfonatos que definen una conLa figuración en el átomo fósforo mientras forman un complejo con la matriz del ácido pentadecadesoxiriboadenílico, muestran diferencias sustanciales en la temperatura de fusión. Se preparan los compuestos oligonucleótidos con una conLa figuración predeterminada en el átomo fósforo, utilizada en estos estudios, mediante el proceso esterocontrolado entre el grupo nucleósido 5'-hidroxilo activado mediante el reactivo de Grignard y el nucleósido p-nitrofenilmetanfosfonato diastereoméricamente puro (Lesnikowski y otros, Nucl. Acids Res., 18:2109, 1990; Lesnikowski y otros, Nucleosides & Nucleotides, 10:773, 1991; Lesnikowski, Nucl. Acids Res., 16:11675, 1988). Sin embargo, este método requiere un tiempo de reacción largo, y se ha verificado solamente en el caso de la síntesis de fragmentos homotimidina tetrámeros y heteroméricos hexámeros.

Los intentos de preparar compuestos oligometilfosfonatos diastereoméricamente puros mediante la reacción a bajas temperaturas (-80ºC) de metildiclorofosfina con nucleósidos apropiados protegidos en las posiciones 5' o 3', han resultado en la formación de isómeros Rp de un dinucleósido metilfosfanato relevante en un predominio máximo de 8:1 (Loschner, Tetrahedron Lett., 30:5587, 1989; y Engels y otros, Nucleosides & nucleotides, 10:347, 1991).

Wozniak L.A., y otros (The journal of Organic chemistry, Vol. 59, Nº20, 1994, páginas 5843 bis 5846) describe un nuevo método estereoespecífico de síntesis de (Sp)- y (Rp)- Dinucleosido (3',5')metanfosfonatos. Brill y Caruthers describen en "Tetrahedron Letters, vol. 29, Nº 11, páginas 1227-1230" la síntesis y la resolución P-diastereomérica del nucleósido 3'-O(S-Aril)metilfosfonotioato. En la patente europea EP 0 136 543, se describe un método para la preparación de nucleósidos alquil-, aralquil-, arilfosfonitos y fosfonatos.

Sin embargo, no se pueden preparar las cadenas estereorregulares más largas mediante este método porque los nucleósidos intermediarios 3'-O-clorometilfosfonitos, formados durante la condensación, tiene una conLa figuración lábil incluso a bajas temperaturas.

Las limitaciones de los métodos disponibles para la modificación y síntesis de los derivados organofosforados han llevado a una necesidad continua y larga para otras modificaciones que proporcionan resistencia a las nucleasas y propiedades satisfactorias de hibridización para llevar a cabo un diagnóstico, terapéutico e investigación de los oligonucleótidos antisentido.

Características de la invención

De acuerdo con la invención, se proporcionan métodos para la síntesis de derivados organofosforados dinucleósidos utilizando derivados organofosforados monoméricos.

En una realización, un método para la síntesis de una mezcla diastereomérica de dinucleósidos P-quirales de fórmulas (6a) y (6b)

1

R_{1} es un grupo de protección;

R_{2} es H o una fracción alcoxi de 1 a 10 átomos de carbono;

R_{9} es un grupo acilo de protección, un grupo de acoplamiento o un grupo sililo de protección;

Z es una fracción alquilo, una fracción aralquilo, una fracción haloalquilo, una fracción alquenilo, una fracción alquinilo, una fracción alcarilo, una fracción arilo de 1 a 20 átomos de carbono, un aminometilo o un aminoetilo;

B es un nucleósido base N-protegido;

comprende las etapas de:

(a): reaccionar nucleósidos de fórmulas (8a) y (8b)

2

: con hidruro sódico o con 1,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno y dióxido de carbono para formar nucleósidos transientes ácidos 3'-O-(Z-sustituido)fosfonotióico;

(b): reaccionar los nucleósidos transientes con un agente alquilante de fórmula R_{8}W, en la que R_{8} es CH_{2}C_{6}H_{4} R_{7}, en la que R_{7} es H, Cl o NO_{2}, y W es Cl, Br o I, para formar nucleósidos alquilatos intermediarios de fórmulas (7a) y (7b)

3

(c): reaccionar los nucleósidos alquilatos intermediarios con un nucleósido de la fórmula (5)

4

: en presencia de un activador y una sal de litio en un disolvente orgánico aprótico para formar la mezcla diastereomérica de dinucleósidos P-quirales de las fórmulas (6a) y (6b).

En otra realización, un método para la síntesis de una mezcla diastereomérica de dinucleósidos P-quirales de fórmulas (6a) y (6b)

5

R_{1} es un grupo de protección;

R_{2} es H o una fracción alcoxi de 1 a 10 átomos de carbono;

B es un nucleósido base N-protegido;

comprende las etapas de:

(a): reaccionar nucleósidos de fórmulas (10a) y (10b)

6

: con hidruro sódico o 1,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno y dióxido de carbono para formar nucleósidos transientes ácidos 3'-O-(Z-sustituido)fosfonoselenóico;

(b): reaccionar los nucleósidos transientes con un agente alquilante de fórmula R_{8}W, en la que R_{8} es CH_{2}C_{6}H_{4} R_{7}, en la que R_{7} es H, Cl o NO_{2}, y W es Cl, Br o I, para formar nucleósidos alquilatos intermediarios de fórmulas (11a) y (11b)

7

8

Todavía en otra realización, un método para la síntesis de una mezcla diastereomérica de dinucleósidos P-quirales de fórmulas (6a) y (6b)

9

R_{1} es un grupo de protección;

R_{2} es H, OH o una fracción alcoxi de 1 a 10 átomos de carbono;

B es un nucleósido base N-protegido;

comprende las etapas de:

(a): reaccionar nucleósidos de fórmulas (8a) y (8b)

10

: con peroximonosulfato potásico o peróxido de hidrógeno para formar nucleósidos intermediarios de fórmulas (9a) y (9b)

11

(b): reaccionar los nucleósidos intermediarios con hidruro sódico o 1,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno y disulfuro de carbono para formar nucleósidos transientes ácidos 3'-O-(Z-sustituido)fosfonotióico;

(c): reaccionar los nucleósidos transientes con un agente alquilante de fórmula R_{8}W, en la que R_{8} es CH_{2}C_{6}H_{4} R_{7}, en la que R_{7} es H, Cl o NO_{2}, y W es Cl, Br o I, para formar nucleósidos alquilatos intermediarios de fórmulas (7a) y (7b)

12

(d): reaccionar los nucleósidos alquilatos intermediarios con un nucleósido de la fórmula (5)

13

14

R_{1} es un grupo de protección;

R_{2} es H, OH o una fracción alcoxi de 1 a 10 átomos de carbono;

B es un nucleósido base N-protegido;

comprende las etapas de:

(a): reaccionar los nucleósidos de fórmulas (10a) y (10b)

15

16

(b): reaccionar los nucleósidos intermediarios con hidruro sódico o DBU y diselenuro de carbono para formar nucleósidos transientes ácidos 3'-O-(Z-sustituido)fosfonoselenóico;

(c): reaccionar los nucleósidos transientes con un agente alquilante de fórmula R_{8}W, en la que R_{8} es CH_{2}C_{6}H_{4} R_{7}, en la que R_{7} es H, Cl o NO_{2}, y W es Cl, Br o I, para formar nucleósidos alquilatos intermediarios de fórmulas (11a) y (11b)

17

18

En otro aspecto de la presente invención, métodos para la síntesis de los derivados de dinucleótidos organofosforados quiralmente puros, se proporciona un método para la síntesis de un dinucleósido quiralmente puro de la fórmula (6a)

19

R_{1} es un grupo de protección;

R_{2} es H, OH o una fracción alcoxi de 1 a 10 átomos de carbono;

B es un nucleósido base N-protegido;

comprende las etapas de:

(a): reaccionar un nucleósido de fórmula (8a)

20

: con hidruro sódico o 1,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno y dióxido de carbono para formar un nucleósido transiente ácido 3'-O-(Z-sustituido) fosfonotióico;

(b): reaccionar el nucleósido transiente con un agente alquilante de fórmula R_{8}W, en la que R_{8} es CH_{2}C_{6}H_{4}R_{7}, en la que R_{7} es H, Cl o NO_{2}, y W es Cl, Br o I, para formar un nucleósido alquilato intermediario de fórmula (7a)

21

(c): reaccionar el nucleósido alquilato intermediario con un nucleósido de la fórmula (5)

22

: en presencia de un activador y de una sal de litio en un disolvente orgánico aprótico para formar el dinucleósido quiralmente puro de fórmula (6a).

En otra realización de la invención, un método para la síntesis de un dinucleósido quiralmente puro de fórmula (6a)

23

R_{1} es un grupo de protección;

R_{2} es H, OH o una fracción alcoxi de 1 a 10 átomos de carbono;

B es un nucleósido base N-protegido;

comprende las etapas de:

(a): reaccionar un nucleósido de fórmula (10a)

24

: con hidruro sódico o 1,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno y dióxido de carbono para formar un nucleósido transiente ácido 3'-O-(Z-sustituido) fosfonoselenóico;

(b): reaccionar el nucleósido transiente con un agente alquilante de fórmula R_{8}W, en la que R_{8} es CH_{2}C_{6}H_{4}R_{7}, en la que R_{7} es H, Cl o NO_{2}, y W es Cl, Br o I, para formar un nucleósido alquilato intermediario de fórmula (11a)

25

26

En otra realización, un método para la síntesis de un dinucleósido quiralmente puro de fórmula (6a)

27

R_{1} es un grupo de protección;

R_{2} es H o una fracción alcoxi de 1 a 10 átomos de carbono;

B es un nucleósido base N-protegido;

comprende las etapas de:

(a): reaccionar un nucleósido de fórmula (8b)

28

: con peroximonosulfato potásico o peróxido de hidrógeno para formar un nucleósido intermediario de fórmula (9b)

29

(b): reaccionar el nucleósido intermediario con hidruro sódico o DBU y disulfuro de carbono para formar un nucleósido transiente ácido 3'-O-(Z-sustituido)fosfonotióico;

(c): reaccionar el nucleósido transiente con un agente alquilante de fórmula R_{8}W, en la que R_{8} es CH_{2}C_{6}H_{4}R_{7}, en la que R_{7} es H, Cl o NO_{2}, y W es Cl, Br o I, para formar un nucleósido alquilato intermediario de fórmula (7a)

30

(d): reaccionar el nucleósido alquilato intermediario con un nucleósido de la fórmula (5)

31

32

\newpage

R_{1} es un grupo de protección;

R_{2} es H o una fracción alcoxi de 1 a 10 átomos de carbono;

B es un nucleósido base N-protegido;

comprende las etapas de:

(a): reaccionar un nucleósido de fórmula (10b)

33

34

(b): reaccionar el nucleósido intermediario con hidruro sódico o 1,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno y diselenuro de carbono para formar un nucleósido transiente ácido 3'-O-(Z-sustituido)fosfonoselenóico;

(c): reaccionar el nucleósido transiente con un agente alquilante de fórmula R_{8}W, en la que R_{8} es CH_{2}C_{6}H_{4}R_{7}, en la que R_{7} es H, Cl o NO_{2}, y W es Cl, Br o I, para formar un nucleósido alquilato intermediario de fórmula (11a)

35

36

: en presencia de un activador y una sal de litio en un disolvente orgánico aprótico para formar el dinucleósido quiralmente puro de fórmula (6a).

En otra realización, un método para la síntesis de un dinucleósido quiralmente puro de fórmula (6b)

37

R_{1} es un grupo de protección;

R_{2} es H o una fracción alcoxi de 1 a 10 átomos de carbono;

B es un nucleósido base N-protegido;

comprende las etapas de:

(a): reaccionar un nucleósido de fórmula (8b)

38

: con hidruro sódico o 1,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno y dióxido de carbono para formar un nucleósido transiente ácido 3'-O-(Z-substituido)fosfonotióico;

\newpage

(b): reaccionar el nucleósido transiente con un agente alquilante de fórmula R_{8}W, en la que R_{8} es CH_{2}C_{6}H_{4}R_{7}, en la que R_{7} es H, Cl o NO_{2}, y W es Cl, Br o I, para formar un nucleósido alquilato intermediario de fórmula (7b)

39

40

: en presencia de un activador y una sal de litio en un disolvente orgánico aprótico para formar el dinucleósido quiralmente puro de fórmula (6b).

En todavía otra realización, un método para la síntesis de un dinucleósido quiralmente puro de fórmula (6b)

41

R_{1} es un grupo de protección;

R_{2} es H o una fracción alcoxi de 1 a 10 átomos de carbono;

B es un nucleósido base N-protegido;

comprende las etapas de:

\newpage

(a): reaccionar un nucleósido de fórmula (10b)

42

: con hidruro sódico o 1,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno y dióxido de carbono para formar un nucleósido transiente ácido 3'-O-(Z-sustituido)fosfonoselenóico

(b): reaccionar el nucleósido transiente con un agente alquilante de fórmula R_{8}W, en la que R_{8} es CH_{2}C_{6}H_{4}R_{7}, en la que R_{7} es H, Cl o NO_{2}, y W es Cl, Br o I, para formar un nucleósido alquilato intermediario de fórmula (11b)

43

44

45

R_{1} es un grupo de protección;

R_{2} es H o una fracción alcoxi de 1 a 10 átomos de carbono;

B es un nucleósido base N-protegido;

comprende las etapas de:

(a): reaccionar un nucleósido de fórmula (8a)

46

: con peroximonosulfato potásico o peróxido de hidrógeno para formar un nucleósido intermediario de fórmula (9a)

47

(b): reaccionar el nucleósido intermediario con hidruro sódico o DBU y disulfuro de carbono para formar un nucleósidotransiente ácido 3'-O-(z-sustituido)fosfonotióico;

(c): reaccionar el nucleósido transiente con un agente alquilante de fórmula R_{8}W, en la que R_{8} es CH_{2}C_{6}H_{4}R_{7}, en la que R_{7} es H, Cl o NO_{2}, y W es Cl, Br o I, para formar un nucleósido alquilato intermediario de fórmula (7b)

48

49

En otra realización de la invención, un método para la síntesis de un dinucleósido quiralmente puro de fórmula (6b)

50

R_{1} es un grupo de protección;

R_{2} es H o una fracción alcoxi de 1 a 10 átomos de carbono;

B es un nucleósido base N-protegido;

comprende las etapas de:

(a): reaccionar un nucleósido de fórmula (10a)

51

52

(c): reaccionar el nucleósido transiente con un agente alquilante de fórmula R_{8}W, en la que R_{8} es CH_{2}C_{6}H_{4}R_{7}, en la que R_{7} es H, Cl o NO_{2}, y W es Cl, Br o I, para formar un nucleósido alquilato intermediario de fórmula (11b)

53

54

: en presencia de un activador y una sal de litio en un disolvente orgánico aprótico para formar el nucleósido quiralmente puro de fórmula (6b).

El disolvente orgánico aprótico es, preferiblemente, acetonitrilo y el activador es, preferiblemente, 1,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 describe la estructura química de un derivado de mononucleósido organofosforado de fórmula (5).

La figura 2 describe las estructuras químicas de derivados de dinucleósidos organofosforados diastereoméricos de fórmulas (6a) y (6b).

La figura 3 describe las estructuras químicas de derivados de dinucleósidos organofosforados diastereoméricos de fórmulas (7a) y (7b).

La figura 4 describe las estructuras químicas de derivados de dinucleósidos organofosforados diastereoméricos de fórmulas (8a) y (8b).

La figura 5 describe las estructuras químicas de derivados de dinucleósidos organofosforados diastereoméricos de fórmulas (9a) y (9b).

La figura 6 describe las estructuras químicas de derivados de dinucleósidos organofosforados diastereoméricos de fórmulas (10a) y (10b).

La figura 7 describe las estructuras químicas de derivados de dinucleósidos organofosforados diastereoméricos de fórmulas (11a) y (11b).

La figura 8 describe la estructura química de un derivado de dinucleósido organofosforado de fórmula (12).

La figura 9 describe la estructura química de un derivado de dinucleósido organofosforado de fórmula (13).

La figura 10 describe un esquema de reacción de un método para la síntesis de un dinucleótido organofosforado de fórmula (6a) a partir de los derivados diastereoméricos organofosforados (8a) y (8b).

La figura 11 describe un esquema de reacción de un método para la síntesis de un dinucleótido organofosforado de fórmula (6b) a partir de los derivados diastereoméricos organofosforados (8a) y (8b).

La figura 12 describe un esquema de reacción de un método para la síntesis de un dinucleótido organofosforado de fórmula (6a) a partir de los derivados diastereoméricos organofosforados (10a) y (10b).

La figura 13 describe un esquema de reacción de un método para la síntesis de un dinucleótido organofosforado de fórmula (6b) a partir de los derivados diastereoméricos organofosforados (10a) y (10b).

Descripción detallada

Antes de describir la invención, puede ser útil para su comprensión definir en primer lugar algunos términos que se utilizarán en la presente invención. Estos términos tienen el siguiente significado, excepto si está indicado lo contrario.

El término "alquilo" se refiere a grupos alifáticos saturados que incluyen cadenas lineales, cadenas ramificadas y grupos cíclicos. Grupos alquilo adecuados incluyen ciclohexilo y ciclohexilmetilo. Los "alquilos pequeños" se refieren a los grupos alquilo de 1 a 6 átomos de carbono.

El término "arilo" se refiere a grupos aromáticos que tienen, por lo menos, un anillo que tiene un sistema de electrón pi conjugado y que incluye un arilo carbocíclico, un arilo heterocíclico y grupos biarilo, opcionalmente todos pueden ser sustituidos.

El término "arilo carbocíclico" se refiere a grupos aromáticos en los cuales los átomos del anillo aromático son átomos de carbono. Los grupos arilo carbocíclico incluyen grupos arilo carbocíclico monocíclico y grupos naftilo, opcionalmente todos pueden ser sustituidos. Adecuados grupos arilo carbocíclicos incluyen fenilo y naftilo.

El término "heterociclo aromático" se refiere a grupos aromáticos que tienen de 1 a 3 heteroátomos como átomos del anillo en el anillo aromático y el resto de los átomos del anillo son átomos de carbono. Adecuados heteroátomos incluyen oxígeno, azufre y nitrógeno; y adecuados arilos heterocíclicos incluyen furanilo, tienilo, poiridilo, pirroililo, pirimidilo, pirazinilo, imidazolilo y similares.

El término "biarilo" se refiere a fenilo substituido por un arilo carbocíclico o un arilo heterocíclico en posición orto, meta o para en el punto de enlace al anillo fenilo, ventajosamente para.

El término "pequeño" se refiere a una conexión con compuestos o radicales orgánicos con hasta 6 inclusive, preferiblemente hasta 4 inclusive, y más preferiblemente con uno o dos átomos de carbono. Semejantes grupos pueden ser cadena lineal o cadena ramificada.

El término "alcoxi" se refiere a -OR en el que R es un alquilo.

El término "aralquilo" se refiere a un grupo alquilo sustituido por un grupo arilo. Adecuados grupos aralquilo incluyen bencilo, picolilo y similares, opcionalmente todos ellos pueden ser sustituidos.

El término "cicloalquilo" se refiere a un grupo alquilo cíclico. Adecuados grupos cicloalquilo incluyen ciclohexilo.

El término "alquelino" se refiere a un grupo alifático insaturado que tiene por lo menos un doble enlace.

El término "alquileno" se refiere a una cadena lineal divalente o cadena ramificada saturada con un radical alifático.

El término "nucloeósido base" se refiere a adenina, guanina, citosina, timidina, uracilo y también a los análogos y a las formas modificadas de las bases naturalmente producidas, incluyendo los análogos pirimidina como pseudoisocitosina y pseudouracilo, y otras bases modificadas como las purinas 8-sustituidas.

El término "Z-sustituido" se refiere a un reactivo o un reactante que contiene el sustituto Z, en el que Z está definido como una fracción aralquilo, medio halolquilo, medio alquenilo, medio alquinilo o una fracción alcarilo de 1 a 20 átomos de carbono, un aminometilo o un aminoetilo; y el reactivo o el reactante es el que está especificado, por ejemplo, diclorofosfina, ácido fosfonotióico, ácido fosfonoselenóico, fosfonoanilidoselenoato o fosfonoanilidotioato.

El término "nucleósido" utilizado en los términos "mononucleósido", "dinucleósido" y oligonucleósido se refiere a una subunidad de un ácido nucleico que comprende una base de nitrógeno y de azúcar de 5 átomos de carbono. El término incluye no solamente aquellas unidades nucleosídicas que tienen adenina, guanina, citosina, timidina y uracilo, y también sus bases, sino que también análogos y formas modificadas de las bases naturales, incluyendo los análogos pirimidinas como pseudoisocitosina y pseudouracilo y otras bases modificadas como purinas 8-sustituidas. En ARN, el azúcar de 5 átomos de carbono es ribosa, en ADN el azúcar de 5 átomos de carbono es desoxiribosa. El termino nucleósido también incluye otros análogos de dichas subunidades incluyendo aquéllos que han modificado los azúcares como por ejemplo ribosa 2'-O-alquilo. El prefijo "mono", "di" y "oligo" se refiere al número de nucleósidos presentes. "Mono" significa uno y se refiere a un solo nucleósido, "di" significa dos y se refiere a un compuesto que comprende dos nucleósidos y "oligo" significa mucho y se refiere a un compuesto con múltiples nucleósidos.

Las limitaciones de los métodos disponibles para la modificación y la síntesis de los derivados organofosforados han llevado a una necesidad continua para otras modificaciones que proporcionan resistencia a las nucleasas y también propiedades de hibridización satisfactorias para diagnósticos, terapéuticos e investigación de oligonucleótido antisentido. En la presente invención se incorporan todas las referencias citadas anteriormente como referencia.

Se pueden utilizar los derivados organofosforados de esta invención en la preparación de oligonucleótidos útiles para diagnósticos, terapeúticos así como para investigación de reactivos y para el uso en equipos.

Se pueden utilizar los derivados organofosforados quiralmente puros en la síntesis de oligonucleósidos de los preseleccionados quiralmente, tanto los enriquecidos con la con la figuración Rp, como los enriquecidos con la conLa figuración Sp o la mezcla de los mismos.

En particular, se pueden acoplar conjuntamente los derivados de dinucleósidos organofosforados de la presente invención de una quiralidad definida en el fosfonato utilizando un sintetizador de ADN automatizado. Los síntonos dímeros tienen grupos de acoplamiento que les permiten acoplarse conjuntamente para tener un oligómero fosfonato enriquecido quiralmente (ver ejemplos 5 a 13). De los derivados de dinucleósidos organofosforados preparados, se pueden sintetizar los oligonucleósidos de cualquier secuencia base de un nucleósido por enlazado conjunto con dinucleósidos apropiados. Se añaden los dinucleósidos a la cadena creciente del oligonucleósido hasta la obtención de un oligonucleósido que tiene el número deseado de nucleósidos. El oligonucleósido resultante tiene una quiralidad definida en cada otro enlazamiento.

Dado que los oligonucleótidos así producidos pueden formar complejos helicoidales dobles o triples o bien otras formas de una asociación estable con regiones transcritas de los ácidos nucleicos; se pueden utilizar para interferir, inhibir o alterar la expresión de un gen particular o una secuencia diana en una célula viva, permitiendo una inactivación selectiva, inhibición o alteración de expresión. La secuencia diana puede ser ARN, como por ejemplo un pre-mARN, mARN o ADN.

Muchas enfermedades y otros estados se caracterízan por la presencia de un ADN o ARN no deseado que puede ser en algunos casos de hebra simple y en otros casos, de hebra doble. Se pueden tratar estas enfermedades y condiciones utilizando los principios de la terapia antisentido generalmente conocida en el estado de la técnica.

De acuerdo con las realizaciones preferentes, esta invención está destinada a métodos para la síntesis de derivados de mononucleósidos y dinucleósidos organofosforados.

Se proporcionan varios métodos para la síntesis de mezclas diastereoméricas de dinucleótidos P-quirales. Un método de síntesis para la preparación de los dinucleótidos de fórmulas (6a) y (6b) comprende las etapas;

(a): reaccionar nucleósidos de fórmulas (8a) y (8b) con hidruro sódico o 1,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno y dióxido de carbono para formar los nucleósidos transientes ácidos 3'-O-(Z-sustituido)fosfonotióico,

(b): reaccionar los nucleósidos transientes de la etapa (a) con un agente alquilante de fórmula R_{8}W, en la que R_{8} es CH_{2}C_{6}H_{4}R_{7}, en la que R_{7} es H, Cl o NO_{2} y W es Cl, Br o I, para formar nucleósidos intermediarios de fórmulas (7a) y (7b),

(c): reaccionar los nucleósidos intermediarios con un nucleósido de fórmula (5) en presencia de un activador y una sal de litio en un disolvente orgánico aprótico para formar la mezcla diastereomérica de dinucleósidos P-quirales.

Otro método para la síntesis de mezclas diastereoméricas de dinucleótidos P-quirales para la preparación de dinucleótidos de fórmulas (6a) y (6b) comprende las etapas;

(a): reaccionar nucleósidos de fórmulas (10a) y (10b) con hidruro sódico o 1,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno y dióxido de carbono para formar los nucleósidos transientes ácidos 3'-O-(Z-sustituido)fosfonoselenóico,

(b): reaccionar los nucleósidos transientes con un agente alquilante de fórmula R_{8}W, en la que R_{8} es CH_{2}C_{6}H_{4}R_{7}, en la R_{7} es H, Cl o NO_{2} y W es Cl, Br o I, para formar nucleósidos intermediarios de fórmulas (11a) y (11b),

(b): reaccionar los nucleósidos transientes con un agente alquilante de la fórmula R_{8}W, en la que R_{8} es CH_{2}C_{6}H_{4}R_{7}, en la R_{7} es H, Cl o NO_{2} y W es Cl, Br o I, para formar nucleósidos intermediarios de fórmulas (11a) y (11b),

Otro método para la síntesis de dinucleótidos de fórmulas (6a) y (6b) comprende las etapas;

Otro método para la síntesis de dinucleótidos de fórmulas (6a) y (6b), en el que R_{1} es un grupo de protección; R_{2} es H, OH, o una fracción alcoxi de 1 a 10 átomos de carbono, R_{9} un grupo acilo de protección, un grupo de acoplamiento o un grupo sililo de protección; Z es una fracción alquilo, una fracción aralquilo, una fracción haloalquilo, una fracción alquenilo, una fracción alquinilo, un aminometilo o un aminoetilo; y B es un nucleósido base N-protegido que comprende las etapas:

(a): reaccionar nucleósidos de fórmulas (8a) y (8b) con peroximonosulfato potásico o peróxido de hidrógeno para formar nucleósidos intermediarios de fórmulas (9a) y (9b),

(b): reaccionar los nucleósidos intermediarios con hidruro sódico o DBU y disulfuro de carbono para formar los nucleósidos transientes ácidos 3'-O-(Z-sustituido)fosfonotióico,

(c): reaccionar los nucleósidos transientes con un agente alquilante de la fórmula R_{8}W, en la que R_{8} es CH_{2}C_{6}H_{4}R_{7}, en la R_{7} es H, Cl o NO_{2} y W es Cl, Br o I, para formar nucleósidos intermediarios de fórmulas (7a) y (7b),

(d): reaccionar los nucleósidos intermediarios de la etapa (a) con un nucleósido de fórmula (5) en presencia de un activador y una sal de litio en un disolvente orgánico aprótico para formar la mezcla diastereomérica de dinucleósidos P-quirales.

Otro método para la síntesis de dinucleósidos P-quirales de fórmulas (6a) y (6b), en las que R_{1} es un grupo de protección; R_{2} es H, OH, o una fracción alcoxi de 1 a 10 átomos de carbono; R_{9} es un grupo acilo de protección, un grupo de acoplamiento o un grupo sililo de protección; Z es una fracción alquilo, una fracción aralquilo, una fracción haloalquilo, una fracción alquenilo, una fracción alquinilo, una fracción alcarilo o una fracción arilo de 1 a 20 átomos de carbono, un aminometilo o un aminoetilo; y B es un nucleósido base N-protegido, comprende las etapas;

(a): reaccionar nucleósidos de fórmulas (10a) y (10b) con peroximonosulfato potásico o peróxido de hidrógeno para formar nucleósidos intermediarios de fórmulas (9a) y (9b),

(b): reaccionar los nucleósidos intermediarios con hidruro sódico o DBU y diselenuro de carbono para formar los nucleósidos transientes ácidos 3'-O-(Z-sustituido)fosfonoselenóico,

(c): reaccionar los nucleósidos transientes con un agente alquilante de fórmula R_{8}W, en la que R_{8} es CH_{2}C_{6}H_{4}R_{7}, en la R_{7} es H, Cl o NO_{2} y W es Cl, Br o I, para formar nucleósidos intermediarios de fórmulas (11a) y (11b),

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(d): reaccionar los nucleósidos intermediarios con un nucleósido de fórmula (5) en presencia de un activador y una sal de litio en un disolvente orgánico aprótico para formar la mezcla diastereomérica de dinucleósidos P-quirales.

Se proporciona una variedad de métodos de síntesis para la síntesis de dinucleósidos quiralmente puros. Un método para la síntesis de un dinucleótido quiralmente puro (6a), en el que R_{1} es un grupo de protección; R_{2} es H, OH, o una fracción alcoxi de 1 a aproximadamente 10 átomos de carbono; R_{9} es un grupo acilo de protección, un grupo de acoplamiento o un grupo sililo de protección; Z es una fracción alquilo, una fracción aralquilo, una fracción haloalquilo, una fracción alquenilo, una fracción alquinilo, una fracción alcarilo o una fracción arilo de 1 a aproximadamente 20 átomos de carbono, un aminometilo o un aminoetilo; y B es un nucleósido base N-protegido, comprende las etapas:

(a): reaccionar un nucleósido de fórmula (8a) con hidruro sódico o 1,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno y dióxido de carbono para formar un nucleósido transiente ácido 3'-O-(Z-sustituido)fosfonotióico,

(b): reaccionar el nucleósido transiente de la etapa (a) con un agente alquilante de fórmula R_{8}W, en la que R_{8} es CH_{2}C_{6}H_{4}R_{7}, en la R_{7} es H, Cl o NO_{2} y W es Cl, Br o I, para formar un nucleósido intermediario de fórmula (7a),

(c): reaccionar el nucleósido intermediario de la etapa (b) con un nucleósido de fórmula (5) en presencia de un activador y una sal de litio en un disolvente orgánico aprótico para formar un dinucleósido quiralmente puro.

Otro método para la síntesis de un dinucleósido quiralmente puro (6a), en el que R_{1} es un grupo de protección; R_{2} es H, OH, o una fracción alcoxi de 1 a aproximadamente 10 átomos de carbono; R_{9} es un grupo acilo de protección, un grupo de acoplamiento o un grupo sililo de protección; Z es una fracción alquilo, una fracción aralquilo, una fracción haloalquilo, una fracción alquenilo, una fracción alquinilo, una fracción alcarilo o una fracción arilo de 1 a 20 átomos de carbono, un aminometilo o un aminoetilo; y B es un nucleósido base N-protegido, comprende las etapas:

(a): reaccionar un nucleósido de fórmula (10a) con hidruro sódico o 1,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno y dióxido de carbono para formar el nucleósido transiente ácido 3'-O-(Z-sustituido)fosfonoselenóico,

(b): reaccionar el nucleósido transiente de la etapa (a) con un agente alquilante de fórmula R_{8}W, en la que R_{8} es CH_{2}C_{6}H_{4}R_{7}, en la R_{7} es H, Cl o NO_{2} y W es Cl, Br o I, para formar un nucleósido intermediario de fórmula (11a),

Otro método para la síntesis de un dinucleótido quiralmente puro (6a), en el que R_{1} es un grupo de protección; R_{2} es H o una fracción alcoxi de 1 a aproximadamente 10 átomos de carbono; R_{9} es un grupo acilo de protección, un grupo de acoplamiento o un grupo sililo de protección; Z es una fracción alquilo, una fracción aralquilo, una fracción haloalquilo, una fracción alquenilo, una fracción alquinilo, una fracción alcarilo o una fracción arilo de 1 a aproximadamente 20 átomos de carbono, un aminometilo o un aminoetilo; y B es un nucleósido base N-protegido, comprende las etapas:

(a): reaccionar un nucleósido de fórmula (8b) con peroximonosulfato potásico o peróxido de hidrógeno para formar un nucleósido intermediario de fórmula (9b),

(b): reaccionar el nucleósido intermediario de la etapa (a) con hidruro sódico o DBU y disulfuro de carbono para formar un nucleósido transiente ácido 3'-O-(Z-sustituido)fosfonotióico,

(c): reaccionar el nucleósido transiente de la etapa (b) con un agente alquilante de fórmula R_{8}W, en la que R_{8} es CH_{2}C_{6}H_{4}R_{7}, en la R_{7} es H, Cl o NO_{2} y W es Cl, Br o I, para formar un nucleósido alquilato de fórmula (7a),

(d): reaccionar el nucleósido alquilato de la etapa (c) con un nucleósido de fórmula (5) en presencia de un activador y una sal de litio en un disolvente orgánico aprótico para formar un dinucleósido quiralmente puro.

(a): reaccionar un nucleósido de fórmula (10b) con peroximonosulfato potásico o peróxido de hidrógeno para formar un nucleósido intermediario de fórmula (9b),

(b): reaccionar el nucleósido intermediario de la etapa (a) con hidruro sódico o DBU y diselenuro de carbono para formar un nucleósido transiente ácido 3'-O-(Z-sustituido)fosfonoselenóico,

(c): reaccionar el nucleósido transiente de la etapa (b) con un agente alquilante de fórmula R_{8}W, en la que R_{8} es CH_{2}C_{6}H_{4}R_{7}, en la que R_{7} es H, Cl o NO_{2} y W es Cl, Br o I, para formar un nucleósido de fórmula (11a),

Un método para la síntesis de un dinucleótido quiralmente puro (6b), en el que R_{1} es un grupo de protección; R_{2} es H o una fracción alcoxi de 1 a aproximadamente 10 átomos de carbono; R_{9} es un grupo acilo de protección, un grupo de acoplamiento o un grupo sililo de protección; Z es una fracción alquilo, una fracción aralquilo, una fracción haloalquilo, una fracción alquenilo, una fracción alquinilo, una fracción alcarilo o una fracción arilo de 1 a aproximadamente 20 átomos de carbono, un aminometilo o un aminoetilo; y B es un nucleósido base N-protegido, comprende las etapas:

(a): reaccionar un nucleósido de fórmula (8b) con hidruro sódico o DBU y dióxido de carbono para formar un nucleósido transiente ácido 3'-O-(Z-sustituido)fosfonotióico,

(b): reaccionar el nucleósido transiente de la etapa (a) con un agente alquilante de fórmula R_{8}W, en la que R_{8} es CH_{2}C_{6}H_{4}R_{7}, en la que R_{7} es H, Cl o NO_{2} y W es Cl, Br o I, para formar un nucleósido de fórmula (7b),

(c): reaccionar el nucleósido alquilato de la etapa (b) con un nucleósido de fórmula (5) en presencia de un activador y una sal de litio en un disolvente orgánico aprótico para formar un dinucleósido quiralmente puro.

Otro método para la síntesis de un dinucleótido quiralmente puro (6b), en el que R_{1} es un grupo de protección; R_{2} es H o una fracción alcoxi de 1 a aproximadamente 10 átomos de carbono; R_{9} es un grupo acilo de protección, un grupo de acoplamiento o un grupo sililo de protección; Z es una fracción alquilo, una fracción aralquilo, una fracción haloalquilo, una fracción alquenilo, una fracción alquinilo, una fracción alcarilo o una fracción arilo de 1 a aproximadamente 20 átomos de carbono, un aminometilo o un aminoetilo; y B es un nucleósido base N-protegido, comprende las etapas:

(a): reaccionar un nucleósido de fórmula (10b) con hidruro sódico o DBU y dióxido de carbono para formar el nucleósido transiente ácido 3'-O-(Z-sustituido)fosfonoselenóico,

(b): reaccionar el nucleósido transiente de la etapa (a) con un agente alquilante de fórmula R_{8}W, en la que R_{8} es CH_{2}C_{6}H_{4}R_{7}, en la que R_{7} es H, Cl o NO_{2} y W es Cl, Br o I, para formar un nucleósido alquilato de fórmula (11b),

(a): reaccionar un nucleósido de fórmula (8a) con peroximonosulfato potásico o peróxido de hidrógeno para formar un nucleósido intermediario de fórmula (9a),

(b): reaccionar el nucleósido intermediario de la etapa (a) con hidruro sódico o DBU y disulfuro de carbono para formar el nucleósido transiente ácido 3'-O-(Z-sustituido)fosfonotióico,

(c): reaccionar el nucleósido transiente de la etapa (b) con un agente alquilante de fórmula R_{8}W, en la que R_{8} es CH_{2}C_{6}H_{4}R_{7}, en la que R_{7} es H, Cl o NO_{2} y W es Cl, Br o I, para formar un nucleósido intermediario de fórmula (7b),

(d): reaccionar el nucleósido alquilato intermediario de la etapa (c) con un nucleósido de fórmula (5) en presencia de un activador y una sal de litio en un disolvente orgánico aprótico para formar el dinucleósido quiralmente puro.

Otro método para la síntesis de un dinucleótido quiralmente puro (6b), en el que R_{1} es un grupo de protección; R_{2} es H, OH, o una fracción alcoxi de 1 a aproximadamente 10 átomos de carbono; R_{9} es un grupo acilo de protección, un grupo de acoplamiento o un grupo sililo de protección; Z es una fracción alquilo, una fracción aralquilo, una fracción haloalquilo, una fracción alquenilo, una fracción alquinilo, una fracción alcarilo o una fracción arilo de 1 a aproximadamente 20 átomos de carbono, un aminometilo o un aminoetilo; y B es un nucleósido base N-protegido, comprende las etapas:

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(a): reaccionar un nucleósido de fórmula (10a) con peroximonosulfato potásico o peróxido de hidrógeno para formar un nucleósido intermediario de fórmula (9a),

(b): reaccionar el nucleósido intermediario con hidruro sódico o DBU y diselenuro de carbono para formar el nucleósido transiente ácido 3'-O-(Z-sustituido)fosfonoselenóico,

(c): reaccionar el nucleósido transiente con un agente alquilante de fórmula R_{8}W, en la que R_{8} es CH_{2}C_{6}H_{4}R_{7}, en la que R_{7} es H, Cl o NO_{2} y W es Cl, Br o I, para formar un nucleósido intermediario de fórmula (11b),

En los métodos de síntesis, es preferible utilizar acetonitrilo como disolvente aprótico y 1,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno como activador.

Para una ilustración de la presente invención, se incluyen los siguientes ejemplos que describen los resultados de una serie de experimentos. Obviamente, los siguientes ejemplos de la invención no deben ser considerados específicamente limitantes a la invención, y dicha variación de la invención, no conocida o posteriormente desarrollada, que debería estar dentro del alcance de un experto en la materia, está considerada introducida en el campo de la invención tal como está descrita a continuación y reivindicada más adelante.

Los siguientes ejemplos están presentados a modo de ilustración y sin limitación de las mismas.

Ejemplos Ejemplo 1 Procedimiento general para la síntesis de la fórmula 8 (Z = CH_{3})

Se añade lentamente una solución del nucleósido apropiadamente protegido (1,0 mol) en THF (10 ml) a una solución enfriada a -40ºC de metildiclorofosfina (0,29 g, 2,5 mmol) y trietilamina (0,55 g, 5,5 mmol) en THF. 30 minutos más tarde se lleva la mezcla de reacción a temperatura ambiente y se le añade gota a gota anilina (0,28 g, 3,0 mmol) seguido por un análisis elemental de azufre. Se controla la reacción mediante tlc y cuando se completa este control, se diluye la mezcla de reacción con cloroformo y se extrae con una solución acuosa de NaHCO_{3}. Se secan los extractos mediante Na_{2}SO_{4} anhidro y se concentran bajo presión reducida para así proporcionar un producto crudo que se purifica mediante cromatografía flash en columna de sílice gel (230-400 mesh) utilizando una mezcla de heptano (10-20%) en cloroformo. Se combinan las fracciones apropiadas y se concentran bajo presión reducida obteniendo una mezcla de diastereómeros como producto deseado.

Ejemplo 2 [Rp, Sp]-5'-O-DMT-Timidina 3'-O-(metilfosfonoanilidotioato)

Se prepara la mezcla del compuesto titulado a partir de 5'-O-DMT-timidina (0,540 g, 1 mmol) siguiendo el procedimiento general descrito en el ejemplo 1 y se obtiene un sólido de color blanco en forma de espuma. Rendimiento: 0,66 g (93%). ^{31}p-RMN (CDCl_{3}) \delta: 79,44, 79,58; MS (FAB^{-}) m/e: 712,4 [(M-H)^{-}].

Ejemplo 3 [Rp, Sp]-5'-O-DMT-N^{4}-Benzoil-2'-Deoxicitidina 3'-O-(metilfosfonoanilidotioato)

Se prepara la mezcla del compuesto titulado a partir de 5'-O-DMT-N^{4}-benzoil-2'-deoxicitidina (1 mmol) siguiendo el procedimiento general descrito en el ejemplo 1 y se obtiene una espuma incolora. Rendimiento: (70%). ^{31}p-RMN (CDCl_{3}/C_{6}D_{6}) \delta: 79,38, 79,74.

Ejemplo 4 [Rp, Sp]-5'-O-DMT-N^{6}-Benzoil-2'-Deoxiadenosina 3'-O-(metilfosfonoanilidotioato)

Se prepara la mezcla del compuesto titulado a partir de 5'-O-DMT-N^{6}-2'-Deoxiadenosina (0,657 g, 1 mmol) siguiendo el procedimiento general descrito en el ejemplo 1 y se obtiene una espuma incolora. Rendimiento: 75%. ^{31}p-RMN (CDCl_{3}) \delta: 79,21, 79,60.

Ejemplo 5 [Rp, Sp]-5'-O-DMT-N^{2}-Isobutiril-2'-Deoxiguanosina 3'-O-(metilfosfonoanilidotioato)

Se prepara la mezcla del compuesto titulado a partir de 5'-O-DMT-N^{2}-isobutiril-2'-Deoxiguanosina (0,640 g, 1 mmol) siguiendo el procedimiento general descrito en el ejemplo 1 y se obtiene una espuma de color blanco. Rendimiento: 0,71 (98%). ^{31}p-RMN (CDCl_{3}) \delta: 79,65, 79,72.

Ejemplo 6 Uridina de [Rp, Sp]-5'-O-DMT-2'-O-Metilo 3'-O-(metilfosfonoanilidotioato)

Se prepara la mezcla del compuesto titulado a partir de uridina de 5'-O-DMT-2'-O-metilo (0,560 g, 1 mmol) siguiendo el procedimiento general descrito en el ejemplo 1 y se obtiene una espuma incolora. Rendimiento: 0,68 g (85%). ^{31}p-RMN (CDCl_{3}) \delta: 81,96, 81,38.

Ejemplo 7 Separación de diastereómeros de fórmula 8

Se lleva a cabo la separación de los diastereómeros Rp y Sp de la fórmula 8 descritos en los ejemplos 2 a 6 mediante cromatografía flash en columna de sílice gel utilizando como eluyente una mezcla de heptano (10 - 20%) en cloroformo.

TABLA 1

Ejemplo/8	Diastereómero*	^{31}p-RMN (\delta)
II; B = Timina	RÁPIDO	79,44
	LENTO	79,58
III; B = Citosina	RÁPIDO	79,38
	LENTO	79,74
IV; B = Adenina	RÁPIDO	79,21
	LENTO	79,60
V; B = Guanina	RÁPIDO	79,65
	LENTO	79,72
VI; B = Uracilo	RÁPIDO	81,38
	LENTO	81,96
* Movilidad en sílice gel (Kieselgel 60, malla 240-400); eluyente CHCl_{3}/MeOH (95:5 v/v)

Ejemplo 8 Procedimiento general para la síntesis de 5'-O-DMT-(N-protegido) Nucleósido 3'-O-(S-Bencilmetilfosfonotioatos) (fórmulas 7a y 7b, Z =CH_{3})

Se añade NaH (1,2 molar equivalentes) en varias porciones a una solución agitada del nucleósido correspondiente 3'-O-(metilfosfonoanilidotioato) 8 (1 mmol) en DMF seco (10 ml). Se deja la solución agitándose hasta que se termine la evolución del hidrógeno. Se introduce un flujo de gas CO_{2} seco al lecho resultante. Se controla el progreso de la reacción mediante TLC. Se añade bromuro de bencilo (5 mmol) a la mezcla de reacción. Cuando se completa la reacción, se eliminan los disolventes y el exceso de bromuro de bencilo mediante el rotavapor. Se disuelve el residuo sólido en CHCl_{3} y se lava con solución acuosa saturada de NaHCO_{3}, se seca y se concentra. Se purifica el producto crudo por cromatografía flash en columna de sílice gel utilizando como eluyente 0-5% de etanol en cloroformo. Cuando el sustrato 8 reacciona como una mezcla de diastereómeros, se combina el proceso de purificación con el proceso de separación para así proporcionar diastereómeros puros de 7a (LENTO) y 7b (RÁPIDO).

Ejemplo 9 5'-O-DMT-timidina 3'-O-(S-Bencilmetilfosfonotioato)

Se prepara el compuesto titulado a partir de 8 (B = Timina, Z = CH_{3}) (0,712 g, 1 mmol) siguiendo el procedimiento general descrito en el ejemplo 8. Rendimiento: 0,55 g (86%). ^{31}p-RMN (CDCl_{3}) \delta: 56,44, 55,94.

Ejemplo 10 5'-O-DMT-N^{4}-Benzoil-2'-Deoxicitidina 3'-O-(S-Bencilmetilfosfonotioato)

Se prepara el compuesto titulado a partir de 8 (B = Citosina, Z = CH_{3}) (1 mmol) siguiendo el procedimiento general descrito en el ejemplo 8. Rendimiento: 82%. {31}p-RMN (CDCl_{3}) \delta: 55,41, 55,21.

Ejemplo 11 5'-O-DMT-N^{6}-Benzoil-2'-Deoxiadenosina 3'-O-(S-Bencilmetilfosfonotioato)

Se prepara el compuesto titulado a partir de 8 (B = Adenina, Z = CH_{3}) (1 mmol) siguiendo el procedimiento general descrito en el ejemplo 8. Rendimiento: 75%. ^{31}p-RMN (CH_{2}Cl_{2}/C_{6}D_{6}) \delta: 55,80, 55,21 ppm.

Ejemplo 12 5'-O-DMT-N^{4}-Isobutiril-2'-Deoxiguanosina 3'-O-(S-Bencilmetilfosfonotioato)

Se prepara el compuesto titulado a partir de 8 (B = guanina, Z = CH_{3}) (1 mmol) siguiendo el procedimiento general descrito en el ejemplo 8. Rendimiento: 75%. ^{31}p-RMN (CDCl_{3}) \delta: 56,01, 55,85.

Ejemplo 13 Oxidación de (RÁPIDO) 5'-O-DMT-timidina 3'-O-(Metilfosfonoanilidato) 8a a (RÁPIDO) 5'-O-DMT-timidina 3'-O-(Metanofosfonotioanilidato) 9a utilizando peroximonosulfato potásico.

Se añade una solución acuosa de peroximonosulfato de potasio (pH 6,7-7; 2 mmol) a una solución del compuesto 8a (RÁPIDO) (0,072 g, 1 mmol) en una mezcla de MeOH y THF. Después de 10 minutos se añade a esta mezcla una solución acuosa de Na_{2}S_{2}O_{3} al 10% y se extrae la mezcla con cloroformo. Se secan los extractos mediante Na_{2}SO_{4} anhidro y se concentran. Se purifica el producto crudo mediante cromatografía flash en columna de Sílice gel utilizando como eluyente una mezcla de heptano 10-20% en cloroformo, obteniéndose 0,047 g (73%) de 9a (RÁPIDO) diastereoméricamente puro. ^{31}p-RMN (CDCl_{3}) \delta: 30,1. MS (FAB^{-}) m/e: 696,4 [(M-H)^{-}].

Ejemplo 14 Oxidación de (LENTO) 5'-O-DMT-timidina 3'-O-(Metilfosfonotioanilidato) 8b a (LENTO) 5'-O-DMT-timidina 3'-O-(Metanofosfonoanilidato) utilizando peroximonosulfato potásico

Se lleva a cabo la conversión de 8b (LENTO) a 9b (LENTO) utilizando los procedimientos análogos a los descritos en el ejemplo 13. Rendimiento 70%; ^{31}P-RMN (CDCl_{3}) \delta: 29,89.

Ejemplo 15 Conversión de 5'-O-DMT-timidina 3'-O-Metanofosfonoanilidato 9 a 5'-O-DMT-timidina 3'-O-(S-Bencil Metanofosfonotioato) 7

Previa a la reacción, se secan los compuestos 9 (Rápido o Lento) y se disuelven en THF (2 ml). A esta solución se añade 1,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno (DBU) (0,02 ml) y se agita la mezcla de reacción a temperatura ambiente durante 45 minutos, seguido por la adición de CS_{2} (1 ml). Después de 20 minutos, se añade bromuro de bencilo (5 equivalentes) y se controla el progreso de la reacción mediante tlc. Cuando se completa la reacción, se diluye la mezcla con agua y se extrae con cloroformo. Se secan los extractos mediante Na_{2}SO_{4} anhidro y se concentran. Se purifica el producto crudo mediante cromatografía flash en columna de sílice gel utilizando como eluyente 0-5% de etanol en cloroformo.

Del compuesto 9a (RÁPIDO) se obtiene el producto 7b (RÁPIDO) con un rendimiento de 65%. ^{31}p-RMN (CDCl_{3}) \delta: 56,85. Se convierte el compuesto 9b (LENTO) a 7a (LENTO) con un rendimiento de 70%. ^{31}p-RMN (CDCl_{3}) \delta: 55,38.

Ejemplo 16 Procedimiento general para la síntesis de los dinucleósidos (3',5')metilfosfonatos (RÁPIDO)-6a o (LENTO)-6b (Z = CH_{3})

Previa a la reacción, se secan los correspondientes compuestos diastereoméricamente puros 7 (LENTO o RÁPIDO) (0,3 mmol) y el 3'-O-acetilo (N-protegido)-2'-deoxinucleósido 5 (0,1 mmol) y luego se disuelven en piridina seca (5 ml). A esta solución, se le añade cloruro de litio (0,125 g, 3 mmol), seguido por la adición en una sola porción de una solución de DBU (0,456 g, 3 mmol) en piridina (1,5 ml). Se agita la reacción a temperatura ambiente y se controla el progreso de esta reacción mediante tlc. Después de que se complete la reacción, se evapora el disolvente, se disuelve el residuo aceitoso en cloroformo y se extrae con fosfato tampón. Se secan los extractos orgánicos mediante Na_{2}SO_{4} anhidro y se concentran. Se purifica el producto crudo mediante cromatografía flash en de Sílice gel utilizando como eluyente una mezcla de 0-3% de etanol en cloroformo.

Ejemplo 17 Síntesis de (RÁPIDO)-5'-O-DMT-2'-Desoxitimidililo-(3'D5')-3'-O-acetil-2'-Desoxitimidina 3'-metilfosfonato.

Se prepara el compuesto titulado a partir del compuesto correspondiente (LENTO)-7a siguiendo el procedimiento general descrito en el ejemplo 16. Rendimiento: 85% ^{31}p-RMN (CDCl_{3}) \delta:33,00. ^{1}h-RMN (CDCl_{3})\delta:1,58 (d, J_{P-H} = 17,64 Hz, 3H, P-CH_{3}), MS (FAB^{-}) m/e: 887 [(M-H)^{-}].

Ejemplo 18 (RÁPIDO)-N^{4}-Benzoil-5'-O-DMT-2'-Desoxicitidilil-(3'D, 5')-N^{4}-Benzoil-3'-O-acetil-2'-Desoxicitidina 3'-metilfosfonato.

Se prepara el compuesto titulado a partir del compuesto correspondiente (LENTO)-7a siguiendo el procedimiento general descrito en el ejemplo 16. Rendimiento: 73%. ^{31}p-RMN (CDCl_{3}) \delta:33,08. ^{1}h-RMN (CDCl_{3})\delta:1,6 (d, J_{P-H} = 17,5 Hz, 3H, P-CH_{3}), MS (FAB^{-}) m/e: 1067 [(M-H)^{-}].

Claims

1. Método para la síntesis de una mezcla diastereomérica de dinucleósidos P-quirales de fórmulas (6a) y (6b)

55

R^{1} es un grupo de protección;

R^{2} es H o una fracción alcoxi de 1 a 10 átomos de carbono;

R^{9} es un grupo acilo de protección, un grupo de acoplamiento o un grupo sililo de protección;

B es un nucleósido base N-protegido;

que comprende las etapas de:

(a): reaccionar nucleósidos de fórmulas (8a) y (8b)

56

: con hidruro sódico o 1,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno y dióxido de carbono para formar nucleósidos transientes ácidos 3'-O-(Z-sustituido)fosfonotióico;

(b): reaccionar los nucleósidos transientes con un agente alquilante de fórmula R_{8}W, en la que R_{8} es CH_{2}C_{6}H_{4} R_{7}, en la que R_{7} es H, Cl o NO_{2} y W es Cl, Br o I, para formar nucleósidos intermediarios alquilatos de fórmulas (7a) y (7b)

57

(c): reaccionar los nucleósidos intermediarios alquilatos con un nucleósido de fórmula (5)

58

: en presencia de un activador y una sal de litio en un disolvente orgánico aprótico para formar la mezcla diastereomérica de dinucleósidos P-quirales de fórmulas (6a) y (6b).

2. Método para la síntesis de una mezcla diastereomérica de dinucleósidos P-quirales de fórmulas (6a) y (6b)

59

R_{1} es un grupo de protección;

R_{2} es H o una fracción alcoxi de 1 a 10 átomos de carbono;

B es un nucleósido base N-protegido;

que comprende las etapas de:

(a): reaccionar nucleósidos de fórmulas (10a) y (10b)

60

(b): reaccionar los nucleósidos transientes con un agente alquilante de fórmula R_{8}W, en la que R_{8} es CH_{2}C_{6}H_{4} R_{7}, en la que R_{7} es H, Cl o NO_{2} y W es Cl, Br o I, para formar nucleósidos intermediarios alquilatos de fórmulas (11a) y (11b)

61

62

3. Método para la síntesis de una mezcla diastereomérica de dinucleósidos P-quirales de fórmulas (6a) y (6b)

63

R_{1} es un grupo de protección;

R_{2} es H, OH o una fracción alcoxi de 1 a 10 átomos de carbono;

B es un nucleósido base N-protegido;

que comprende las etapas de:

(a): reaccionar nucleósidos de fórmulas (8a) y (8b)

64

65

(c): reaccionar los nucleósidos transientes con un agente alquilante de fórmula R_{8}W, en la que R_{8} es CH_{2}C_{6}H_{4} R_{7}, en la que R_{7} es H, Cl o NO_{2} y W es Cl, Br o I, para formar nucleósidos intermediarios alquilatos de fórmulas (7a) y (7b)

66

\newpage

(d): reaccionar los nucleósidos intermediarios alquilatos con un nucleósido de fórmula (5)

67

4. Método para la síntesis de una mezcla diastereomérica de dinucleósidos P-quirales de fórmulas (6a) y (6b)

68

R^{1} es un grupo de protección;

R^{2} es H, OH o una fracción alcoxi de 1 a 10 átomos de carbono;

B es un nucleósido base N-protegido;

que comprende las etapas de:

(a): reaccionar nucleósidos de fórmulas (10a) y (10b)

69

70

(c): reaccionar los nucleósidos transientes con un agente alquilante de fórmula R_{8}W, en la que R_{8} es CH_{2}C_{6}H_{4} R_{7}, en la que R_{7} es H, Cl o NO_{2} y W es Cl, Br o I, para formar nucleósidos intermediarios alquilatos de fórmulas (11a) y (11b)

71

72

5. Método para la síntesis de un dinucleósido quiralmente puro de fórmula (6a)

73

R_{1} es un grupo de protección;

R_{2} es H, OH o una fracción alcoxi de 1 a 10 átomos de carbono;

B es un nucleósido base N-protegido;

que comprende las etapas de:

(a): reaccionar un nucleósido de fórmula (8a)

74

: con hidruro de sodio o 1,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno y dióxido de carbono para formar un nucleósido transiente ácido 3'-O-(Z-sustituido)fosfonotióico;

(b): reaccionar el nucleósido transiente con un agente alquilante de fórmula R_{8}W, en la que R_{8} es CH_{2}C_{6}H_{4}R_{7}, en la que R_{7} es H, Cl o NO_{2} y W es Cl, Br o I, para formar un nucleósido intermediario alquilato de fórmula (7a)

75

(c): reaccionar el nucleósido intermediario alquilato con un nucleósido de fórmula (5)

76

6. Método para la síntesis de un dinucleósido quiralmente puro de fórmula (6a)

77

R_{1} es un grupo de protección;

R_{2} es H, OH o una fracción alcoxi de 1 a 10 átomos de carbono;

B es un nucleósido base N-protegido;

que comprende las etapas de:

(a): reaccionar un nucleósido de fórmula (10a)

78

: con hidruro de sodio o 1,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno y dióxido de carbono para formar un nucleósido transiente ácido 3'-O-(Z-sustituido)fosfonoselenóico;

(b): reaccionar el nucleósido transiente con un agente alquilante de fórmula R_{8}W, en la que R_{8} es CH_{2}C_{6}H_{4}R_{7}, en la que R_{7} es H, Cl o NO_{2} y W es Cl, Br o I, para formar un nucleósido intermediario alquilato de fórmula (11a)

79

80

7. Método para la síntesis de un dinucleósido quiralmente puro de fórmula (6a)

81

R_{1} es un grupo de protección;

R_{2} es H o una fracción alcoxi de 1 a 10 átomos de carbono;

B es un nucleósido base N-protegido;

que comprende las etapas de:

(a): reaccionar un nucleósido de fórmula (8b)

82

83

(b): reaccionar el nucleósido intermediario con hidruro de sodio o DBU y disulfuro de carbono para formar un nucleósido transiente ácido 3'-O-(Z-sustituido)fosfonotióico;

(c): reaccionar el nucleósido transiente con un agente alquilante de fórmula R_{8}W, en la que R_{8} es CH_{2}C_{6}H_{4}R_{7}, en la que R_{7} es H, Cl o NO_{2} y W es Cl, Br o I, para formar nucleósidos intermediarios alquilatos de fórmula (7a)

84

(d): reaccionar el nucleósido intermediario alquilato con un nucleósido de fórmula (5)

85

: en presencia de un activador y una sal de litio en un disolvente orgánico aprótico para formar un dinucleósido quiralmente puro de fórmula (6a).

8. Método para la síntesis de un dinucleósido quiralmente puro de fórmula (6a)

86

R_{1} es un grupo de protección;

R_{2} es H o una fracción alcoxi de 1 a 10 átomos de carbono;

B es un nucleósido base N-protegido;

que comprende las etapas de:

(a): reaccionar un nucleósido de fórmula (10b)

87

88

(b): reaccionar el nucleósido intermediario con hidruro de sodio o 1,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno y diselenuro de carbono para formar un nucleósido transiente ácido 3'-O-(Z-sustituido)fosfonoselenóico;

(c): reaccionar el nucleósido transiente con un agente alquilante de fórmula R_{8}W, en la que R_{8} es CH_{2}C_{6}H_{4}R_{7}, en la que R_{7} es H, Cl o NO_{2} y W es Cl, Br o I, para formar un nucleósido intermediario alquilato de fórmula (11a)

89

90

9. Método para la síntesis de un dinucleósido quiralmente puro de fórmula (6b)

91

R_{1} es un grupo de protección;

R_{2} es H o una fracción alcoxi de 1 a 10 átomos de carbono;

B es un nucleósido base N-protegido;

que comprende las etapas de:

(a): reaccionar un nucleósido de fórmula (8b)

92

(b): reaccionar el nucleósido transiente con un agente alquilante de fórmula R_{8}W, en la que R_{8} es CH_{2}C_{6}H_{4}R_{7}, en la que R_{7} es H, Cl o NO_{2} y W es Cl, Br o I, para formar el nucleósido intermediario alquilato de fórmula (7b)

93

94

: en presencia de un activador y una sal de litio en un disolvente orgánico aprótico para formar un dinucleósido quiralmente puro de fórmula (6b).

10. Método para la síntesis de un dinucleósido quiralmente puro de fórmula (6b)

95

R_{1} es un grupo de protección;

R_{2} es H o una fracción alcoxi de 1 a 10 átomos de carbono;

B es un nucleósido base N-protegido;

que comprende las etapas de:

(a): reaccionar un nucleósido de fórmula (10b)

96

(b): reaccionar el nucleósido transiente con un agente alquilante de fórmula R_{8}W, en la que R_{8} es CH_{2}C_{6}H_{4}R_{7}, en la que R_{7} es H, Cl o NO_{2} y W es Cl, Br o I, para formar el nucleósido intermediario alquilato de fórmula (11b)

97

98

11. Método para la síntesis de un dinucleósido quiralmente puro de fórmula (6b)

99

R_{1} es un grupo de protección;

R_{2} es H o una fracción alcoxi de 1 a 10 átomos de carbono;

B es un nucleósido base N-protegido;

que comprende las etapas de:

(a): reaccionar un nucleósido de fórmula (8a)

100

101

(c): reaccionar el nucleósido transiente con un agente alquilante de fórmula R_{8}W, en la que R_{8} es CH_{2}C_{6}H_{4}R_{7}, en la que R_{7} es H, Cl o NO_{2} y W es Cl, Br o I, para formar nucleósidos intermediarios alquilatos de fórmula (7b)

102

103

12. Método para la síntesis de un dinucleósido quiralmente puro de fórmula (6b)

104

R_{1} es un grupo de protección;

R_{2} es H o una fracción alcoxi de 1 a 10 átomos de carbono;

B es un nucleósido base N-protegido;

que comprende las etapas de:

(a): reaccionar un nucleósido de fórmula (10a)

105

\newpage

106

(c): reaccionar el nucleósido transiente con un agente alquilante de fórmula R_{8}W, en la que R_{8} es CH_{2}C_{6}H_{4}R_{7}, en la que R_{7} es H, Cl o NO_{2} y W es Cl, Br o I, para formar un nucleósido intermediario alquilato de fórmula (11b)

107

108

: en presencia de un activador y una sal de litio en un disolvente orgánico aprótico para formar un nucleósido quiralmente puro de fórmula (6b).

13. Método, según cualquiera de las reivindicaciones de 3 a 12, en el que el disolvente aprótico es acetonitrilo.

14. Método, según cualquiera de las reivindicaciones de 3 a 12, en el que el activador es 1,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno.