PL184612B1

PL184612B1 - Sposób wytwarzania modyfikowanych P chiralnych analogów nukleotydów

Info

Publication number: PL184612B1
Application number: PL97319677A
Authority: PL
Inventors: Stec@Wojciech@J; Woźniak@Lucyna@A; Chworoś@Arkadiusz; Pyzowski@Jarosław
Original assignee: Pan
Priority date: 1997-04-25
Filing date: 1997-04-25
Publication date: 2002-11-29
Also published as: EP0977769A2; US6407223B1; AU6934398A; ES2224373T3; WO1998049179A2; DE69824843D1; PL319677A1; DE69824843T2; WO1998049179A3; ATE270301T1; EP0977769B1

Abstract

1. Sposób wytwarzania modyfikowanych P-chiralnych analogów nukleotydów o wzorze ogólnym 1, w którym: R 1 oznacza grupe protekcyjna, korzystnie grupe 4,4'-dimetoksytrytylowa (DMT), 9-fenyloksanten-9-ylowa (Px) lub grupe trialkilosililowa, R2 oznacza niezaleznie wodór, zablokowana grupe hydroksylowa, halogen, chloroalkil, grupe nitrylowa, azydowa, zablokowana grupe aminowa, grupe perfluoro- a lk iio w a (1-4 atomów wegla), perfluoroalkoksylowa (1-4 atomów wegla i 1-9 atomów fluoru lub chloru), alkoksy- alkilowa, winylowa, etynylowa, O Q 1 , SQ 1 , N H Q 1 gdzie Q 1 jest alkilem (1-4 atomy wegla) arylem (6-12 atomów wegla), alkenylem (3-12 atomów wegla) lub alkynylem (3-12 atomów wegla), B jest niezaleznie wybrana, opcjonalnie N-zablokowana zasada purynowa lub pirymidynowa, Z jest niezaleznie wybrana sposród Q1 lub grup: winy- lowej, etynylowej, aminometylowej lub aminoetylowej, X oznacza tlen, siarke lub selen, Rx jest grupa protekcyjna, korzystnie grupa aro- ilowa, acylowa, alkoksykarbonylowa, benzenesulfonowa, grupa alkilowa, trialkilosililowa lub kolejna grupa wydlu- zajacego sie lancucha, znam ienny tym, ze poddaje sie reakcji zwiazek o ogólnym wzorze 2, w którym R 1 i R2 oraz B maja podane wyzej znaczenie, Y oznacza wybrane niezaleznie XR3, gdzie X oznacza tlen lub siarke lub selen, R3 oznacza grupe,.......... wzór 1 PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania modyfikowanych P-chiralnych analogów nukleotydów· o ogólnym wzorze 1, w którym R, oznacza grupę protekcyjną, korzystnie grupę 4,4'-dimetoksytrytylową (DMT), 9-fenyloksanten-9-ylową (Px) lub grupę trialkilosililową, R2 oznacza niezależnie wodór, zablokowaną grupę hydroksylową, halogen, chloroalkil, grupę nitrylową, azydową, zablokowaną grupę aminową, grupę perfluoroalkilową (1-4 atomów węgla), perfluoroalkoksylową (1-4 atomów węgla i 1-9 atomów fluoru lub chloru), alkoksyalkilową, winylową, etynylową, OQ1, SQ1, NHQ1, gdzie Q1 jest alkilem (1-4 atomy węgla) arylem (6-12 atomów węgla), alkenylem (3-12 atomów węgla) lub alkynylem (3-12 atomów węgla), B jest niezależnie wybraną, opcjonalnie N-zablokowaną zasadą purynową lub pirymidynową, Z jest niezależnie wybrany spośród Q1 lub grup: winylowej, etynylowej, aminometylowej lub aminoetylowej, X oznacza tlen, siarkę lub selen, Rx jest grupą protekcyjną, korzystnie grupą aroilową, acylową, alkoksykarbonylową, benzenesulfonową, grupą alkilową, trialkilosililową lub kolejną grupą wydłużającego się łańcucha nukleotydowego.

Stany chorobowe w organizmach żywych będące następstwem iniekcji bakteryjnej, wirusowej lub rozwojem komórek obcych (rakowych), wywoływane są przede wszystkim produkcją „niechcianych”, szkodliwych białek. Przyczyną chorób wirusowych jest inkorporacja informacji genetycznej wirusa do zasobów genowych człowieka i wytwarzanie przez gospodarza białek specyficznych dla wirusa, a szkodliwych dla organizmu gospodarza.

Aberracjami, (powodowanymi wieloma różnymi czynnikami) protoonkogenów i powstawaniem onkogenów odpowiedzialnych za produkcję obcych białek tłumaczy się niekorzystny dla organizmu rozwój procesów nowotworowych.

Konsekwencją rozwoju wiedzy w zakresie biologii molekularnej i poznania molekularnych podstaw wielu chorób takich jak AIDS, inne choroby wirusowe, nowotworowe czy choroby układu krążenia, jest poszukiwanie selektywnych metod leczenia, hamujących ekspresję genów i wytwarzanie niechcianych białek oraz ingerencja w celach terapeutycznych w procesy odpowiedzialne za poziom ekspresji białek regulatorowych.

Jedną z nowych strategii terapeutycznych jest tzw. strategia antysensowych oligonukleotydów (ANTISENSE mRNA) (C.A.Stein, Cancer Res, 1988, 48, 2659) oraz ANTIGENE (strategia antygenowa) (N.T.Thuong et al., Angew Chem.Int.Ed.Engl, 1993, 32, 666), wykorzystująca wiedzę o procesie oddziaływania molekuł typu DNA/DNA oraz DNA/RNA. U podstaw tej strategii leży założenie, że wprowadzenie do zainfekowanej komórki krótkiego syntetycznego DNA, powoduje wytworzenie dupleksu pomiędzy oligonukleotydem egzogen8

184 612 nym, a fragmentem RNA do niego komplementarnym, hamując w ten sposób proces translacji (E.Wickstrom, ed. Wiley-Liss, New York N.Y. 1993 „Prospects for Antisense Nucleic Acid Therapy for Cancer and AIDS”) czyli biosyntezy białek.

Jednym z najważniejszych czynników decydujących o skuteczności in vivo analogów oligonukleolydowych DNA jest ich odporność na działanie enzymów nukleolitycznych, znajdujących się zarówno w komórkach jak i w środowisku zewnątrzkomórkowym, powodujących szybką degradację hydrolityczną egzogennych fragmentów DNA.

W związku z powyższym poszukiwania idą w kierunku analogów o podwyższonej trwałości nukleolitycznej.

Modyfikacje mające na celu zwiększenie odporności nukleolitycznej dotyczą przede wszystkim ligandów związanych z atomem fosforu intemukleotydowego wiązania fosforanowego (fosfodiestrowego).

Do modyfikacji, które w różnym stopniu wypełniają postulat podwyższonej lub pełnej odporności hydrolitycznej w warunkach hydrolizy enzymatycznej, należą między innymi analogi tiofosforanowe, metanofosfonianowe, amidofosforanowe oraz triestrowe. Wprowadzenie tych modyfikacji wiąże się jednak zazwyczaj z obniżeniem właściwości hybrydyzacyjnych w stosunku do komplementarnych nici DNa lub RNA (J.S.Cohen, ed. Oligonucleotides: Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Inc., Boca Raton, FL, 1989).

Kolejnym czynnikiem decydującym o przydatności antysensowych oligonukleotydów jako potencjalnych leków jest możliwość transportu tych analogów przez błony komórkowe w celu osiągnięcia odpowiedniego stężenia w środowisku wybranej sekwencji docelowej (np. mRNA znajdujący się w cytoplazmie). Błony komórkowe, zbudowane z warstw białkowo-lipidowych są przepuszczalne dla małych, niejonowych związków lipofilowych, stanowią barierę do większości naturalnych metabolitów i wielu terapeutyków (D.B.Wilson, Ann.Rev.Biochem, 1978, 47, 933).

Aktywność przeciwwirusowa i przeciwnowotworowa naturalnych i modyfikowanych oligonukleotydów o sekwencji komplementarnej do fragmentów sekwencji wirusowego DNA(RNA) w hodowanych liniach komórkowych (in vivo) jest szeroko opisana w literaturze. Wskazuje to, że czynniki te są w stanie przenikać przez błony komórkowe i osiągać docelowe sekwencje. Badania, prowadzone na wielu liniach komórkowych, w tym ludzkich (np. HL-60), fibroplastach chomika syryjskiego, U 937, L 929, CV-1, oraz na komórkach ATH 8, dotyczyły szeregu nukleolitycznie odpornych analogów DNA, takich jak triestry alkilowe (P.S.Miller, Biochemistry, 1977, 16, 1988) i metanofosfoniany (C.H.Marcus-Sekura et al., Nucleic Acids Res., 1987, 15, 5749, 1987; P.S.Miller et al., Biochemistry, 1988, 141, 1988; S.K.Loke et al., Top.Microbiol.Immunol, 141, 282, 1988; A.M.Tari et al, J.Biol.Med, 1996, 74, 623; S.Agrawal et al, Clin.Pharmacokinet, 1995, 28, 7). Transport dokomórkowy modyfikowanych oligonukleotydów jest mało efektywny. Wpływa to m.in. na obniżenie faktycznej aktywności in vivo w stosunku do aktywności spodziewanej na podstawie badań in vitro.

Badane dotychczas modyfikowane analogi DNA mają w większości gorsze właściwości hybrydyzacyjne w stosunku do komórkowego RNA i nie powodują oczekiwanie wysokiej inhibicji procesów transkrypcji i translacji powodujących inhibicję procesów biosyntezy białek. Istnieje wiele przyczyn tego zjawiska m.in. skomplikowana struktura trzeciorzędowa RNA, ograniczona dostępność jego poszczególnych fragmentów, bądź oddziaływania DNA/RNA z białkami.

Podejmowane są liczne badania mające na celu wyeliminowanie przedstawionych powyżej problemów, Jedną z możliwości jest zastąpienie internukleotydowego wiązania fosfodiestrowego przez inne nie zawierające fosforu ugrupowania np. przez grupy metylenowe (M.Matteuci, Tetrahedron Lett, 1990, 31, 2385) dialkilosililowe (R.Stirczak, J.Org.Chem, 1987, 52, 202), sulfonowe (S.Benner, J.Org.Chem, 1995, 61, 7620), ale prace nad wdrożeniem tych analogów jako terapeutyków sąjeszcze w początkowym stadium, przede wszystkim ze względu na własności fizykochemiczne otrzymanych analogów (rozpuszczalność, własności hybrydyzacyjne, niska trwałość chemiczna). Analogi estrowe ulegają degradacji pod wpływem esteraz, co czyni je nieużytecznymi z punktu widzenia strategii ANTISENSE (Goodrick et al, Bioconj.Chem, 1990,1, 165).

184 612

W przypadku modyfikowanych analogów DNA, takich jak tiofosforany i metanofosfoniany, posiadających centrum chiralne na atomie fosforu, dodatkowym problemem związanym z syntezą oligonukleotydów o n wiązaniach intemukleotydowych jest występowanie produktów w postaci 2 izomerów, jeżeli synteza jest prowadzona w sposób niestereospecyficzny.

Stwierdzono, że w przypadku homochiralnych łańcuchów o konfiguracji [Rp] lub [Sp] na wszystkich atomach fosforu w oligonukleozydo(3',5')metanofosfonianach, oraz ich analogów o mieszanej konfiguracji (randomalnej) na centrach fosfonowych, właściwości hybrydyzacyjne w stosunku do komplementarnych DNA lub RNA zależą w sposób znaczący od konfiguracji na atomach fosforu (P.S.Miller et al., .J.Biol.Chem., 1980, 255, 9659; Biochemistry, 1982, 21, 2507; Nucleic Acids Res, 1990,18, 2109).

Również w przypadku tiofosforanowych analogów DNA stwierdzono wpływ konfiguracji absolutnej na atomach fosforu na właściwości tych analogów, m.in. stereoselektywną podatność na degradację enzymatyczną przez niektóre enzymy nukleolityczne (Potter et al, Biochemistry, 1983, 22, 1369; Bryant et al, Biochemistry, 1979,18, 2825).

Leśnikowski et al. (Nucleic Acids Res., 1990, 18, 2109) zaobserwował, że otrzymany w wyniku stereospecyficznej syntezy oktamer, w którym sześć spośród siedmiu intemukleotydowych wiązań metanofosfonianowych ma konfigurację [Rp], wykazuje znacznie silniejsze powinowactwo do matrycy pentadekadeoksyadenylowej niż analog zawierający wiązania [Sp] oraz analog otrzymany na drodze syntezy niestereospecyficznej. Stereoregulamy oligomer uzyskano w wyniku niestereospecyficznej kondensacji dwóch tetramerów otrzymanych w roztworze, w reakcji diastereomerycznie czystych diastereomerów estrów 5'-O-MMT-tymidylo 3'-O-(O-p-nitrofenylometanofosfonianowych) z 3'-O-acetylotymidyną, aktywowanych za pomocą odczynnika Grignarda (Leśnikowski et al, Nucleic Acids Res., 1990, 18, 2109; ibid, 1988,16, 11675; Leśnikowski et al, Nucleosides & Nucleotides, 1991,10, 773).

Inne przykłady prac nad otrzymaniem diastereomerycznie czystych (lub silnie wzbogaconych w diastereomer [Rp]) metanofosfonianowych analogów DNA obejmują reakcje metylodichlorofosfiny z odpowiednio zablokowanymi w pozycjach 5' (l etap) i 3' (ll etap) nukleozydami, prowadzone w niskich temperaturach (-80°C), w obecności amin (w tym również amin chiralnych). Maksymalne wzbogacenie w izomer [R_P] wynosiło 8:1 (Loschner et al., Tetrahedron Lett., 1989, 30, 5587; Engels et al, Nucleosides & Nucleotides, 1991, 10, 347). Metoda ta pozwala syntetyzować diastereoselektywnie dinukleozydometanofosfoniany.

Inną, metodą stereoselektywnego zawiązania metanofosfonianowego wiązania internukleotydowego jest wykorzystanie jako substratów rozdzielonych na diastereomery 5'-O-DMT-N-blokowanych 3'-O-(Se-alkilometanoselenofosfonianów), które w reakcji z odpowiednim 3'-(N-blokowanym) nukleozydem, przebiegającej w obecności DBU i chlorku litu tworzą produkt w sposób stereospecyficzny (Woźniak et al, J.Org.Chem, 1994, 58, 5843).

Prowadzone w ostatnich latach prace zwracają uwagę na celowe wykorzystanie jako potencjalnych leków związków oligomerowych o charakterze chimer, składających się z tiofosforanów lub fosforanów, które na 3'- i 5'-końcu łańcucha mają umieszczone fragmenty metanofosfonianowe o strukturze [Rp], Struktury chimeryczne łączą zalety tiofosforanowych analogów oligonukleotydów, nad którymi obecnie prace są najbardziej zaawansowane, ze względu na podwyższoną odporność na hydrolizę wynikającą z wprowadzenia całkowicie odpornych na hydrolizę fragmentów metanofosfonianowych. Wykorzystanie do tych syntez jedynie dimerów metanofosfonianowych o konfiguracji [Rp] powoduje dodatkowo wzrost właściwości hybrydyzacyjnych tych związków z komplementarnymi nićmi DNA i RNA (M.Reynolds et al, Nucleic Acids Res., 1996, 24, 4584).

Sposób wytwarzania modyfikowanych P-chiralnych analogów nukleotydów o ogólnym wzorze 1, w którym:

R1 oznacza grupę protekcyjną, korzystnie grupę 4,4'-dimetoksytrytylową (DMT), 9-fenyloksanten-9-ylową (Px) lub grupę trialkilosililową,

R2 oznacza niezależnie wodór, zablokowaną grupę hydroksylową, halogen, chloroalkil, grupę nitrylową, azydową, zablokowaną grupę aminową, grupę perfluoroalkilową (1 -4 atomów węgla), perfluoroalkoksylową (1-4 atomów węgla i 1-9 atomów fluoru lub chloru), alkoksyalkilową, winylową, etynylową, OQ1, SQ1, NHQ_b gdzie Qj jest alkilem (1-4 atomy wę10

184 612 gla) arylem (6-12 atomów węgla), alkenylem (3-12 atomów węgla) lub alkynylem (3-12 atomów węgla),

B jest niezależnie wybraną, ewentualnie N-zablokowaną zasadą purynową lub pirymidynową,

Z jest niezależnie wybrany spośród Qt lub grup: winylowej, etynylowej, aminometylowej lub aminoetylowej,

R_x jest grupą protekcyjną, korzystnie grupą aroilową, acylową, alkoksykarbonylowa, benzenesulfonową, grupą alkilową, trialkilosililową lub kolejną grupą wydłużającego się łańcucha nukleotydowego, a

X oznacza tlen, siarkę lub selen według wynalazku polega na tym, że poddaje się reakcji związek wzorze ogólnym 2, w którym R1, R2 oraz B i Z mają podane wyżej znaczenie, a

Y oznacza wybrane niezależnie XR3, gdzie X oznacza tlen lub siarkę lub selen, a R3 oznacza grupę karbonylową o wzorze COR4. w której R4 oznacza grupy alkilowe (1-6 atomów węgla), perfluoroalkilowe (1-4 atomów węgla), grupy aroilowe (6-15 atomów węgla), korzystnie mono-[(C6H₄R5)], di-[(CeH3(R5)2)] lub tri-^Cć^Rsb)] podstawione grupy aromatyczne, w których R 5 oznacza wodór, metyl lub halogen lub inny podstawnik aktywujący pierścień aromatyczny, ze związkiem o ogólnym wzorze 6, w którym B, R2 i R_x mają wyżej podane znaczenie, w środowisku bezwodnym, w nieprotonowym rozpuszczalniku organicznym, w obecności odczynnika aktywującego, otrzymany związek o ogólnym wzorze 1, wyodrębnia się, i ewentualnie, gdy X oznacza S albo Se, poddaje reakcji utleniania za pomocą znanych odczynników utleniających, korzystnie mieszaniny jod/pirydyna, natlenku wodoru, hydroksynadtlenków alkilowych korzystnie hydroksynadtlenku t-butylowego lub najkorzystniej za pomocą peroksymonosiarczanu potasowego, a wytworzony produkt 1, gdzie X oznacza tlen, a R|, B, Z, R2 i Rx mają podane wyżej znaczenie, wyodrębnia się znanymi metodami.

Sposób według wynalazku, prowadzi się korzystnie w tetrahydrofuranie lub acetonitrylu.

Jako aktywator procesu pomiędzy związkiem o wzorze 2 i związkiem 6 stosuje się zasady organiczne, korzystnie aminy, a najkorzystniej 1,8-diazabicyklo-[5.4.0]-undek-7-en (DBU) lub diazabicyklo[4.3.0]non-5-en (DBN).

W sposobie według wynalazku, korzystnie stosuje się dodatkowy aktywator procesu wybrany z grupy obejmującej sole litu, korzystnie halogenki litu.

Odmiana sposobu wytwarzania modyfikowanych P-chiralnych analogów nukleotydów, w postaci jednego, dowolnie wybranego diastereomeru o ogólnym wzorze 1, w którym: R1, R2, B, Z, X i Rx mają wyżej podane znaczenie, według wynalazku polega na tym, że jeden z diastereomerów związku o ogólnym wzorze 2 o wybranej konfiguracji absolutnej na atomie fosforu takiej samej jak wymagana konfiguracja absolutna produktu, w którym R1, R2, X oraz B mają podane wyżej znaczenie, a

Y oznacza wybrane niezależnie XR3, gdzie X oznacza tlen lub siarkę lub selen, R3, oznacza grupę karbonylową (COR4), w której R oznacza grupy alkilowe (1-6 atomów węgla), perfluoroalkilowe (1-4 atomów węgla), grupy aroilowe (6-15 atomów węgla), w tym: mono-[(C6H4R5)], di-[(C6H3(R5)2)] lub tri-[(C6H2(Rs)3)] podstawione grupy aromatyczne, w których R 5 oznacza wodór, metyl lub halogen lub inny podstawnik aktywujący pierścień aromatyczny, poddaje się reakcji ze związkiem o wzorze ogólnym 6, w którym Rx i R2 oraz B mają podane wyżej znaczenie, w warunkach bezwodnych, w nieprotonowym rozpuszczalniku organicznym, w obecności odczynnika aktywującego, a otrzymany związek o ogólnym wzorze 1, wyodrębnia się lub ewentualnie, gdy X oznacza siarkę lub selen, poddaje reakcji utleniania za pomocą znanych odczynników utleniających, korzystnie mieszaniny jod/pirydyna, natlenku wodoru, hydroksynadtlenków alkilowych korzystnie hydroksynadtlenku t-butylowego lub najkorzystniej za pomocą peroksymonosiarczanu potasowego, a wytworzony produkt 1, gdzie X oznacza tlen, a R1, B, Z, R2 i Rx mają podane wyżej znaczenie, wyodrębnia się znanymi metodami.

184 612

W sposobie według wynalazku jako nieprotonowy rozpuszczalnik organiczny stosuje się tetrahydrofuran lub acetonitryl, jako aktywator procesu pomiędzy związkiem o wzorze 2 i związkiem 6 stosuje się zasady organiczne, korzystnie aminy, a najkorzystniej 1,8-diazabicyklo-[5.4.0]-undek-7-en (DBU) lub diazabicyklo[4.3.0]non-5-en (DBN), a jako dodatkowy aktywator procesu stosuje się sole litu, korzystnie halogenki litu.

Trzecia odmiana sposobu wytwarzania modyfikowanych P-chiralnych analogów nukleotydów, w postaci jednego, dowolnie wybranego diastereomeru o ogólnym wzorze 1, w którym Rj, R₂, B, Z, X i Rx mają wyżej podane znaczenie, według wynalazku polega na tym, że jeden z diastereonierów związku o ogólnym wzorze 2 o wybranej konfiguracji absolutnej na atomie fosforu odwrotnej do konfiguracji wymaganej dla produktu 1, w którym to wzorze 2 R1, R2, B, Z, X i Y mają podane wyżej znaczenie, poddaje się reakcji hydrolizy, w obecności aktywatora zmieniającego konfigurację absolutną na atomie fosforu, a otrzymany produkt o wzorze ogólnym 2, gdzie R1, R2 oraz B mają podane wyżej znaczenie, X oznacza siarkę lub selen, a Y oznacza tlen, poddaje się reakcji ze związkiem o wzorze ogólnym 7, gdzie R4 oznacza grupy alkilowe (1-6 atomów węgla), perfluoroalkilowe (1-4 atomów węgla), grupy aroilowe (6-15 atomów węgla), w tym: mono-[(C₆H4R₅)], di-[(C6^^5)2)] lub tri-[(C6^(^5)3)] podstawione grupy aromatyczne, w których R5 oznacza wodór, metyl lub halogen lub inny dowolnie wybrany podstawnik organiczny, a W oznacza chlor, brom lub jod, następnie otrzymany w ten sposób związek o ogólnym wzorze 2, gdzie R1, R2, Z oraz B mają podane wyżej znaczenie, X oznacza siarkę lub selen, a Y oznacza R4C(O)O-, w którym R4 ma podane wyżej znaczenie, mający konfigurację absolutną odwrotną do związku wyjściowego, a zgodną obecnie z wymaganą dla produktu 1, ewentualnie po połączeniu z drugim, uzyskanym z wcześniejszego rozdziału diastereomerem związku o ogólnym wzorze 2 i konfiguracji absolutnej na atomie fosforu takiej samej jak wymagana dla produktu, poddaje się reakcji ze związkiem o ogólnym wzorze 6, w którym R_x i R2 oraz B mają podane wyżej znaczenie, w warunkach bezwodnych, w nieprotonowym rozpuszczalniku organicznym, w obecności odczynnika aktywującego, a otrzymany produkt o ogólnym wzorze 1 i pożądanej konfiguracji, wyodrębnia się lub ewentualnie gdy X oznacza siarkę lub selen, poddaje się reakcji utleniania za pomocą znanych odczynników utleniających, korzystnie mieszaniny jod/pirydyna, natlenku wodoru, hydroksynadtlenków alkilowych korzystnie hydroksynadtlenku t-butylowego lub najkorzystniej za pomocą peroksymonosiarczanu potasowego, a wytworzony produkt 1, gdzie X oznacza tlen, a R2, B, Z, R1 i R_xmają podane wyżej znaczenie wyodrębnia się znanymi metodami.

Czwarta odmiana sposobu wytwarzania modyfikowanych P-chiralnych analogów nukleotydów, w postaci jednego, dowolnie wybranego diastereomeru o ogólnym wzorze 1, w którym: R1, R2, B, Z i R_x mają wyżej podane znaczenie, według wynalazku polega na tym, że jeden z diastereomerów związku o ogólnym wzorze 2 i wybranej konfiguracji absolutnej na atomie fosforu odwrotnej do konfiguracji dla produktu 1, w którym to wzorze 2 R1, R2, B, Z, X i Y mają podane wyżej znaczenie, poddaje się reakcji z alkoholem, korzystnie metanolem, ewentualnie w obecności aktywatora, a otrzymany produkt o wzorze ogólnym 2, gdzie R1, R2, Z i B mają podane wyżej znaczenie, X oznacza S lub Se, a Y oznacza grupę alkoksylową, korzystnie MeO-, poddaje się następnie reakcji dealkilacji za pomocą amin, korzystnie Me 3N, lub t-Bu3N, po czym otrzymany przejściowo produkt o ogólnym wzorze 2, gdzie R1, R2, Z i B mają podane wyżej znaczenie, X oznacza S lub Se, Y oznacza tlen, poddaje się reakcji ze związkiem o wzorze ogólnym 7, gdzie R4 i W mają podane wyżej znaczenie, po czym otrzymany w ten sposób związek o ogólnym wzorze 2, w którym R1, R2, Z oraz B mają podane wyżej znaczenie, X oznacza siarkę lub selen, a Y oznacza R4C(O)O-, mający konfigurację absolutną odwrotną do związku wyjściowego, a zgodną obecnie z wymaganą dla produktu 1, ewentualnie po połączeniu z drugim diastereomerem związku o wzorze 2 i konfiguracji ab12

184 612 solutnej na atomie fosforu takiej samej jak wymagana dla produktu, poddaje się reakcji ze związkiem o wzorze 6, w którym Rx, R2 iB mają podane wyżej znaczenie, w warunkach bezwodnych, w nieprotonowym rozpuszczalniku organicznym, w obecności odczynnika aktywującego, otrzymany produkt o ogólnym wzorze 1 i pożądanej konfiguracji, wyodrębnia się, lub ewentualnie, gdy X oznacza S lub Se, poddaje reakcji utleniania za pomocą znanych odczynników utleniających, korzystnie mieszaniny jod/pirydyna, natlenku wodoru, hydroksynadtlenków alkilowych korzystnie hydroksynadtlenku t-butylowego lub za pomocą peroksymonosiarczanu potasowego, a wytworzony produkt 1, gdzie X oznacza tlen, a R1, R2, B, Z, i Rx mają podane wyżej znaczenie wyodrębnia się w znany sposób.

W sposobie według wynalazku jako nieprotonowy rozpuszczalnik organiczny stosuje się tetrahydrofuran lub acetonitryl, jako aktywatory procesu solwolizy oraz procesu pomiędzy związkiem o wzorze 2 i związkiem 6 stosuje się zasady organiczne, korzystnie aminy, a najkorzystniej l,8-diazabicyklo-[5.4.0]-undek-7-en (DBU) lub diazabicyklo[4.3.0]non-5-en (DBN), a jako dodatkowy aktywator procesu pomiędzy związkiem o wzorze 2 i związkiem 6 stosuje się sole litu, korzystnie halogenki litu.

W sposobie według wynalazku korzystnie stosuje się związki o wzorze 2 otrzymane w wyniku procesu fosforylowania odpowiednich związków wyjściowych o wzorze ogólnym 3, w którym R1, R2 i B mają podane wyżej znaczenie, za pomocą związków o wzorze ogólnym 4, w którym Z i X mają podane wyżej znaczenie, a W oznacza chlorowiec, korzystnie chlor, które następnie bez wydzielania produktu pośredniego o wzorze ogólnym 5, poddawane są reakcji hydrolizy i wyodrębniane w postaci związków o wzorze 2, w którym R1, R2, B, X i Z mają podane wyżej znaczenia, a Y oznacza tlen.

Wykorzystując wariant pierwszy sposobu według wynalazku, z mieszaniny diastereomerycznej substratów 2, rozdzielonych na diastereomery i przeprowadzonych oddzielnie w związek 1 otrzymuje się dwa przeciwne diastereomery produktu 1.

Jeden z korzystniejszych wariantów sposobu według wynalazku, polega na tym, że poddaje się reakcji związek 3, w którym R1 i B mają podane wyżej znaczenie ze związkiem 4, w którym X oznacza siarkę lub selen, a Z ma podane wyżej znaczenie, a otrzymany związek 5, w którym X oznacza tlen, siarkę lub selen, bez wyodrębniania, poddaje się reakcji hydrolizy, do związku o wzorze ogólnym 2, w którym R_b R2, Z i X mają podane wyżej znaczenie, a Y oznacza tlen, który następnie rozdziela się na diastereomery metodami chromatograficznymi i poddaje się reakcji z odpowiednimi związkami o wzorze 7, w których R4 oznacza grupy alkilowe (1-6 atomów węgla), perfluoroalkilowe (1-4 atomów węgla), grupy aroilowe (6-15 atomów węgla), w tym: mono-[(C6HtR5)], di-[(C6H₃(Rs)2)] lub tri-[(C6H2(R5>3)] podstawione grupy aromatyczne, w których R 5 oznacza wodór, metyl, halogen lub inny podstawnik aktywujący pierścień aromatyczny, a W oznacza halogen, korzystnie chlor.

Jeden izomer poddaje się stereospecyficznej reakcji ze związkiem 6, która prowadzi do związku 2, w którym Y oznacza R4COO-, gdzie R4 ma podane wyżej znaczenie. Ten izomer 2, w reakcji ze związkiem 6, w którym R2, Rx i B mają podane wyżej znaczenie, w obecności aktywatora, którym jest zasada organiczna korzystnie amina trzeciorzędowa, a najkorzystniej 1,3-diazabicyklo[5.4.0]undeken (DBU), tworzy produkt 1.

Diastereomerycznie czysty produkt 1 wyodrębnia się znanymi metodami.

W sposobie według wynalazku produkt 1, poddaje się reakcji utleniania za pomocą znanych odczynników utleniających, korzystnie mieszaniny jod/woda/pirydyna, natlenku wodoru, hydroksynadtlenków alkilowych, korzystnie hydroksynadtlenku t-butylowego, lub najkorzystniej peroksymonosiarczanem potasowym, otrzymując produkt 1, gdzie X oznacza tlen, a R1, B, Z, R2 i Rx mają podane wyżej znaczenie.

W omawianym wariancie drugi diastereomer 2 (Y=R4C(O)O-) poddaje się reakcji z prostym alkoholem, korzystnie metanolem, a następnie bez oczyszczania tworzącego się przejściowo produktu 2, w którym R1, B, Rz i Z mają podane wyżej znaczenie, X oznacza siarkę lub selen, a Y oznacza grupę alkoksylową, korzystnie metoksylową. W reakcji z silną zasadą korzystnie zasadą organiczną a najkorzystniej aminą przeprowadza się reakcję dealkilacji. Diastereomer ten ma konfigurację przeciwną do konfiguracji absolutnej substratu

184 612

2-SLOW, czyli w trakcie procesu opisanego w wariancie wynalazku następuje zmiana konfiguracji na centrum fosforowym związku 2.

Opisany wariant wynalazku pozwala w dwuetapowym procesie, przebiegającym bez wyodrębniania produktu generowanego przejściowo (Z-OMe, X=S,Se) otrzymać związek 2 (Z=0, X-S,Se), w którym konfiguracja absolutna na atomie fosforu jest w 100% odwrócona. Opisany powyżej wariant pozwala na wykorzystanie rozdzielonych na diastereomery substratów 2 (X=S,Se, Y=0) w związku 2, w którym X oznacza siarkę lub selen, a Y oznacza podstawnik R4C(O )O do syntezy jednego dowolnego diastereomeru 2 (X=S,Se; Y=OC(O)R4).

Kolejny wariant wynalazku polega na wykorzystaniu rozdzielonych na diastereomery związków 2 (X=S,Se; Y=O) w taki sposób, że jeden z diastereomerów o wzorze ogólnym 2 i konfiguracji absolutnej zgodnej z oczekiwaną dla produktu 1, w którym to wzorze 2 X oznacza siarkę lub selen, a Y oznacza atom tlenu, poddaje się reakcji alkilowania za pomocą znanych odczynników alkilujących korzystnie halogenków alkilowych 8 o wzorze ogólnym !R,W, gdzie R6 oznacza metyl, cyjanometyl, halogenokarbonyl, benzyl lub benzyl podstawiony w pierścieniu aromatycznym, a W oznacza chlor, brom lub jod.

Otrzymany związek o wzorze 2, w którym (a) R1 oznacza grupę protekcyjną, korzystnie grupę 4,4'-dimetoksytrytylową (DMT) 9-fenyloksanten-9-ylową (Px) lub grupę trialkilosililową.

(b) R2 oznacza niezależnie wodór, zablokowaną grupę hydroksylową, halogen, chloroalkil, grupę nitrylową, azydową, zablokowaną grupę aminową, grupę perfluoroalkilową (1-4 atomów węgla), perfluoroalkoksylową (1-4 atomów węgla i 1-9 atomów fluoru lub chloru), alkoksyalkilową, winylową, etynylową, OQ1, SQ1, NHQ1, gdzie Q1 jest alkilem (1-4 atomy węgla) arylem (6-12 atomów węgla), alkenylem (3-12 atomów węgla) lub alkynylem (3-12 atomów węgla).

(c) B jest niezależnie wybraną, opcjonalnie zablokowaną zasadą purynową lub pirymidynową.

(d) Z jest niezależnie wybraną spośród Q1 lub grup: winylowej, etynylowej, aminometylowej lub aminoetylowej.

X oznacza tlen, a Y oznacza SR^, lub SeRć, w którym R6 ma podane wyżej znaczenie, poddaje się reakcji kondensacji ze związkiem 6, w którym B oznacza niezależnie wybraną, opcjonalnie zablokowaną zasadę purynową lub pirymidynową, a Rx oznacza grupę protekcyjną, korzystnie grupę aroilową, acylową, alkoksykarbonylową lub kolejną grupę wydłużającego się łańcucha nukleotydowego. Katalizatorami tej reakcji są silne zasady, korzystnie zasady organiczne, a najkorzystniej DBU (1,8-diazabicyklo[5.4.0]-undeken).

Dodatkowym aktywatorem tego procesu są sole litu, korzystnie halogenki litu, a najkorzystniej chlorek litu.

Otrzymany produkt 1, w którym X oznacza tlen, a pozostałe podstawniki mają podane wyżej znaczenie wyodrębnia się znanymi metodami. Otrzymany produkt 1 według opisanego wariantu ma konfigurację absolutną na atomie fosforu taką samą jak produkt 1 otrzymany w wyniku utlenienia produktu 1, gdzie X oznacza siarkę lub selen.

Drugi diastereomer 2 (X=S,Se, Y=O) poddaje się reakcji acylowania za pomocą związku 7, a następnie reakcji kondensacji ze związkiem o wzorze ogólnym 6 jak w wariancie drugim.

Otrzymany produkt 1, w którym X oznacza siarkę lub selen wyodrębnia się znanymi metodami, poddaje się reakcji utleniania za pomocą znanych odczynników utleniających, korzystnie mieszaniny jod/pirydyna, natlenku wodoru, hydroksynadtlenków alkilowych korzystnie hydroksynadtlenku t-butylowego lub najkorzystniej za pomocą peroksymonosiarczanu potasowego, otrzymując produkt 1, gdzie X oznacza tlen, a R2, B, Z, Rz i Rx mają podane wyżej znaczenie.

Oznacza to, że wykorzystując powyższy wariant wynalazku, z mieszaniny diastereomerycznej substratów 2 (X=S,Se; Y=O) rozdzielonych na diastereomery i przeprowadzonych oddzielnie w związek 1 na dwóch niezależnych drogach o podanym powyżej znaczeniu, otrzymuje się jeden pożądany produkt 1, gdzie X oznacza tlen a pozostałe podstawniki mają podane wyżej znaczenie.

Poniżej przedstawiono przykłady wykonania wynalazku nie ograniczające jego zakresu.

184 612

Przykłady 1-8

Metoda ogólna syntezy związków o wzorze 2 (Z=Me, X=S,Se; Y=0)

Do roztworu związku o wzorze ogólnym 3 (1 mmol) w pirydynie dodano związek o wzorze ogólnym 4 (Z=Me, X=S,Se) i mieszano przez 15 min, a następnie dodano wodę i kontynuowano mieszanie przez 10 min. Po zatężeniu reagentów pod zmniejszonym ciśnieniem pozostałość rozpuszczono w chloroformie, roztwór organiczny przemyto 2 razy NaHCO3. Po osuszeniu roztworu za pomocą znanych środków suszących (np. MgSO4) i zatężeniu pod zmniejszonym ciśnieniem, surowy produkt oczyszczono i/lub rozdzielono na diastereomery na drodze chromatografii kolumno wej.

Po zatężeniu odpowiednich frakcji związku 2 (Z=Me, X=S lub Se, Y=0) otrzymano w postaci bezbarwnej piany: wytrącono z układu chloroform (chlorek metylenu) i eter naftowy.

Dane dotyczące przykładów 1-8 zamieszczono w tabeli 1.

Tabela 1

Przykłady Nr	B	r₂	³¹P NMR* 5 (ppm)	Wydajność (%)
1	T	h	77.67; 77.34	92
2	A^bz	h	78.33; 78.77	90
3	_cBz	h	76.41; 77.00	93
4	_Glbu	h	78.28; 78.97	85
5	U	OMe	78.24; 77.96	90
6	Abz	OMe	78.24; 78.39	83
7	CBz	OMe	78.83; 79.54	85
8	_Gibu	OMe	79.03; 79.15	80

* w CDCl₃, jako sole pirydyniowe Przykłady 9-17

Metoda ogólna syntezy związków o wzorze 2 [Z=Me, X=S,Se; Y-OC(O)R4]

Do roztworu związku o wzorze 2 (X=S, Y=O) (1 mmol) w pirydynie (5 ml) dodano związek o wzorze 7 (2-3 mmole) i mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej do całkowitego zaniku substratu (TLC). Po zatężeniu mieszaniny reakcyjnej pod zmniejszonym ciśnieniem oleistą pozostałość rozpuszczono w chloroformie i oczyszczono na drodze chromatografii kolumnowej lub wytrącenia w układzie chloroform-eter naftowy.

Dane dotyczące przykładów 9-17 zamieszczono w tabeli 2.

Tabela 2

Nr	B	R2	R4	X	^3IP NMR: δ (ppm)	Wydajność
9	T	h	2,4,6-trimetylfenyl	S	91.6	+98
10	A^Bz	h	55	S	91.3	+98
11	CBz	h		s	91.8; 91.3	+98
12	Gibu	h	n	s	91.8; 92.3	96
13	U	OMe		s		+95
14	ABz	h	55	Se	92.04**; 91.79	+98
15	CBz	h	1”	Se	92.11***; 91.73	+98
16	T	h	2,4,6-trichlorofenyl	S	93.03; 93.12	+98
17	T	h	fenyl	s	92.12; 92.25	+98

* Wydajność oznaczona na podstawie widma³1 P NMR ** Jp.Se = 916 Hz *** Jp-Se = 912 Hz

184 612

Metoda syntezy związków o wzorze 2 [Z=Me, X=S,Se; Y=O, O-alkil(metyl, etyl)]

Do roztworu związków o wzorze ogólnym 2 (Z=Me, X=S,Se; Y=OC(O)R4) (1 mmol) w suchym acetonitrylu dodano DBU (5 mmoli) i alkohol (10-20 mmoli).

Po zakończeniu reakcji mieszaninę reakcyjną zatężono do 1/3 objętości pod zmniejszonym ciśnieniem, rozcieńczono chloroformem i przemyto wodą i NaHCO3. Po osuszeniu frakcji organicznej i zatężeniu rozpuszczalników pod zmniejszonym ciśnieniem surową mieszaninę oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym.

Przykład 18

Substrat 2: [R’=DMT, B=Thy, R2=H, Z=Me, X=S, Y=OC(O)C 6%(CH3)3];

FAST-[Sp]:3'p NMR 91.6 ppm.

Produkt 2: [R’=DMT, B=Thy, R2=H, Z=Me, X=S, Y=OMe] [Sp]: 31p nMR 100.3 ppm; czyst.diast. +99%; wyd. 92%

Przykład 19

Substrat 2: [R,=DMT, B=Thy, R₂=H, Z=Me, X=S, Y=O C(O)C 6H₂(CH3)3)];

SLOW-[Rp], P NMR 91.3 ppm.

Produkt 2: [R,=DMT, B=Thy, R2=H, Z=Me, X=S, Y=OMe] [Rp]: ³¹P NmR 99.6 ppm; czyst.diast. +99%o; wyd. 92%

Przykład 20

Substrat 2: [R’=DMT, B=Thy, R2=H, Z=Me, X=S, Y=OC(O)C₆H₂(CH3)3];

FAST-[Sp]: 3*P NMR 91.6ppm.

Produkt 2: [Y=OEt] [Sp]: 3*p NMR 101.3 ppm; czyst.diast. 92%; wyd.95%

Przykład 21

Substrat 2: [R’=DMT, B=Thy, R2=H, Z=Me, X=S, Y=OC(O)C6¾^¾¼]

FAST-[Sp]: ³¹P NMR 91.6 ppm ; alkohol: NCCH2CH2OH

Produkt 2: [Y=0] [Sp]: 3'p NmR 75.7 ppm; czyst.diast. 95%; wyd. 99%

Przykład 22

Substrat 2: [R,=DMT, B=Thy, R2=H, Z=Me, X=S, Y=OC(0)C 6¾^¾^

FAST-[Sp];31p NMR 91.6 ppm; reakcja z wodą, warunki j.w.

Produkt 2: [Y=O] [Sp]: 3’p NMR 74.3 ppm; czyst.diast. 100%; wyd. 99%

Przykład 23

Substrat 2: [R.=DMT, B=Thy, R₂=H, Z=Me, X=S, Y=OC(O)C6H₂(CH3)3];

SLOW-[Rp]; 31P NMR 91.3 ppm; reakcja z wodą, warunki j.w.

Produkt 2: [Y=O] [Rp]: 3’p NmR 74.65 ppm; czyst.diast. 100%; wyd. 99%

Synteza związków o wzorze 1 (Z=Me, X=S,Se) ze związków o wzorze 2 [Z=Me; X=S,Se; Y=OC(O)R4]

Mieszaninę reakcyjną składającą się ze związku 2 [Z=Me, X=S,Se, Y=OC(O)Rt] (1 mol) i związku o wzorze 6 (5 mmoli) oraz DBU (20 mmoli) w bezwodnym acetonitrylu mieszano w temp. pokojowej w atmosferze gazu obojętnego przez 24 godz. Po tym czasie roztwór reakcyjny zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem, dodano chloroform i przeprowadzono ekstrakcję za pomocą 0.05 M kwasu cytrynowego (2x). Fazę organiczną osuszono za pomocą MgSO₄, zatężono, a surowy produkt oczyszczono za pomocą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym.

Przykład 24

Wykorzystując substrat o wzorze 2 [R’=DMT; R₂=H, B=Thy, Y=OC(O)C6H₂(CH3)3] SLOW-[Rp] (3’P NMR 91.3 ppm, czyst.diast. +99%) i związek o wzorze 7 (Rx=t-BuMe₂Si, R2=H, B=Thy), otrzymano produkt o wzorze 1 [Z=Me, X=S]

FAST-[Rp]; 3’p NMR 99.3 ppm, czyst.diast. 91%; wydajność 80%.

Przykład 25

Wykorzystując substrat o wzorze 2 [R1=DMT, R2=H, B=Thy, Y=OC(O)CgH2(CH3)3]-FAST-[Sp] (1p NMR 91.6 ppm) i związek o wzorze 6 (B=Thy, R2=H, R_x=t-BuMe2§i),

184 612 otrzymano produkt o wzorze 1 [Z=Me. X=S]-SLOW-[Sp]; ^3IP NMR 100.2 ppm; czyst.diast. 90%, wydajność 82%.

Ogólna metoda odwrócenia konfiguracji absolutnej na atomie fosforu w związkach o wzorze 2 [Z=Me, X=S,Se; Y=OC(O)R^]

Substrat o wzorze 2 [RmDMt, X=S,Se; Y=OC(O)R4H^;’AST-|Sp]] rozpuszczony w acetonitrylu i metanolu (3:1 v/v) mieszano w temperaturze pokojowej w obecności DBU (20 krotny nadmiar) przez 4 godziny. Otrzymany produkt o wzorze 2 (RmDMT, X=S,Se; Y=OMe) po ekstrakcji i suszeniu poddany został reakcji ze związkiem o wzorze 7-R4C(O)W, a otrzymany produkt 2 [RmDMT, X=S,Se; Y=OC(O)R4]-SLOW-[Rp] wyodrębniono i oczyszczono jak w przykładach 9-17.

Przykład 26

Stosując substrat o wzorze 2 [RmDMT, B=Thy, X=S, Y=OC(O)C6H2(CH3)3]-FAST[Sp] (³Ή NMR 91.6 ppm) otrzymano produkt o wzorze 2 [RyDMT', B=Thy, X=S, Y=OC(O)C6H2(CH3)3]-SLOW-[Rp] (³¹P NMR 91.3 ppm) z wydajnoścćącałkowitą^P NMR) 86%.

Przykład 27

Stosując substrat o wzorze 2 [Rp=DMT, B=Thy, X=S, Y=OC(O)C6H2(CH3)3]-SLOW-[Rp] (31P NMR 91.3 ppm) otrzymano produkt o wzorze 2 [RmDMT, B=Thy, X=S, Y=OC(O)C6H₂(CH3)3|^^AST-[Sp] (ⁿP NMR 91.6 ppm) z wydajnością całkowitą (^P NMR) 80%.

184 612

wzór 1

wzór 3 χ

II

ZPW₂ wzór 4

184 612

R-jO^-1 O B

HO-i O B x R₂

0R_x R₂wzór 6

Z Cl wzór 5 o

I r₄cw wzór 7 r₆w wzór 8

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 60 egz.

Cena 4,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób wytwarzania modyfikowanych P-chiralnych analogów nukleotydów o wzorze ogólnym 1, w którym:

R1 oznacza grupę protekcyjną, korzystnie grupę 4,4'-dimetoksytrytylową (DMT), 9-fenyloksanten-9-ylową (Px) lub grupę trialkilosililową,

R2 oznacza niezależnie' wodór, zablokowaną grupę hydroksylową, halogen, chloroalkil, grupę nitrylową, azydową, zablokowaną grupę aminową, grupę perfluoroalkilową (1-4 atomów węgla), perfluoroalkoksylową (1-4 atomów węgla i 1-9 atomów fluoru lub chloru), alkoksyalkilową, winylową, etynylową, OQt, SQi, NHQi, gdzie Qi jest alkilem (1-4 atomy węgla) arylem (6-12 atomów węgla), alkenylem (3-12 atomów węgla) lub alkynylem (3-12 atomów węgla),

B jest niezależnie wybraną, opcjonalnie N-zablokowaną zasadą purynową lub pirymidynową,

Z jest niezależnie wybraną spośród Q] lub grup: winylowej, etynylowej, aminometylowej lub aminoetylowej,

X oznacza tlen, siarkę lub selen,

R_x jest grupą protekcyjną, korzystnie grupą aroilową, acylową, alkoksykarbonylową, benzenesulfonową, grupą alkilową, trialkilosililową lub kolejną grupą wydłużającego się łańcucha, znamienny tym, że poddaje się reakcji związek o ogólnym wzorze 2, w którym R1 i R2 oraz B mają podane wyżej znaczenie,

Y oznacza wybrane niezależnie XR₃, gdzie X oznacza tlen lub siarkę lub selen, R₃ oznacza grupę karbonylową (COR4), w której R4 oznacza grupy alkilowe (1-6 atomów węgla), perfluoroalkilowe (1-4 atomów węgla), grupy aroilowe (6-15 atomów węgla), w tym: mono-[(C6H4R5)], lub di-[(C6H3(R5)₂)] lub tn-^CUTOU).·',)] podstawione grupy aromatyczne, w których R 5 oznacza wodór, metyl lub halogen lub inny podstawnik aktywujący pierścień aromatyczny, ze związkiem o wzorze ogólnym 6, w którym Rx i R2 oraz B mają podane wyżej znaczenie, w warunkach bezwodnych, w nieprotonowym rozpuszczalniku organicznym, w obecności jednego lub kilku czynników aktywujących, a otrzymany produkt o ogólnym wzorze 1, wyodrębnia się, i ewentualnie, gdy X oznacza S albo Se, poddaje reakcji utleniania za pomocą znanych odczynników utleniających, korzystnie mieszaniny jod/pirydyna, natlenku wodoru, hydroksynadtlenków alkilowych korzystnie hydroksynadtlenku t-butylowego lub najkorzystniej za pomocą peroksymonosiarczanu potasowego, a wytworzony produkt 1, gdzie X oznacza tlen, a R1, B, Z, R2 i Rx mają podane wyżej znaczenie, wyodrębnia się w znany sposób.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako związki o wzorze 2 stosuje się związki otrzymane w wyniku procesu fosforylowania odpowiednich związków wyjściowych o wzorze ogólnym 3, w którym R1 R2 i B mają podane wyżej znaczenie, za pomocą związków o wzorze ogólnym 4, w którym Z i X mają podane wyżej znaczenie, a W oznacza chlorowiec, korzystnie chlor, które następnie bez wydzielania produktu pośredniego o wzorze ogólnym 5, poddawane są reakcji hydrolizy i wyodrębniane w postaci związków o wzorze 2, w którym R_b R2, B, X i Z mają podane wyżej znaczenia, a Y oznacza tlen.
3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że jako nieprotonowy rozpuszczalnik organiczny stosuje się tetrahydrofuran lub acetonitryl.
4. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że jako aktywator procesu pomiędzy związkiem o wzorze 2 i związkiem 6 stosuje się zasady organiczne, korzystnie aminy, a najkorzystniej l,8-diazabicyklo-[5.4.0]-undek-7-en (DBU) lub diazabicyklo[4.3.0.]non-5-en (DBN).
5. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że jako dodatkowy aktywator procesu stosuje się sole litu, korzystnie halogenki litu.

184 612
6. Sposób wytwarzania modyfikowanych P-chiralnych analogów nukleotydów, w postaci jednego, dowolnie wybranego diastereomeru o ogólnym wzorze 1, w którym:

Rj oznacza grupę protekcyjną, korzystnie grupę 4,4'-dirnetoksytrytylową (DMT), 9-fenyloksanten-9-ylową (Px) lub grupę trialkilosililową,

R2 oznacza niezależnie wodór, zablokowaną grupę hydroksylową, halogen, chloroalkil, grupę nitrylową, ązydową, zablokowaną grupę aminową, grupę perfluoroalkilową (1-4 atomów węgla), perfluoroalkoksylową (1-4 atomów węgla i 1-9 atomów fluoru lub chloru), alkoksyalkilową, winylową, etynylową, OQj, SQj, NHQi, gdzie Qi jest alkilem (1-4 atomy węgla) arylem (6-12 atomów węgla), alkenylem (3-12 atomów węgla) lub alkynylem (3-12 atomów węgla),

B jest niezależnie wybraną, opcjonalnie N-zablokowaną. zasadą purynową lub pirymidynową,

Z jest niezależnie wybraną spośród Q] lub grup: winylowej, etynylowej, aminometylowej lub aminoetylowej,

X oznacza tlen, siarkę lub selen,

Rx jest grupą protekcyjną, korzystnie grupą, aroilową, acylową, alkoksykarbonylową, benzenesulfonową, grupą alkilową, trialkilosililową lub kolejną grupą, wydłużającego się łańcucha, znamienny tym, że jeden z diastereomerów związku o ogólnym wzorze 2 o wybranej konfiguracji absolutnej na atomie fosforu takiej samej jak wymagana konfiguracja absolutna produktu, w którym to ogólnym wzorze 2 R1, R2 oraz B mają podane wyżej znaczenie, a

Y oznacza wybrane niezależnie XR3, gdzie X oznacza tlen lub siarkę lub selen, R3 oznacza grupę karbonylową (COR4), w której R4 oznacza grupy alkilowe (1-6 atomów węgla), perfluoroalkilowe (1-4 atomów węgla), grupy aroilowe (6-15 atomów węgla), w tym: mono-[(C6H4R5)],' di-[(C6^^5)2)] lub tri-[(CóH2(^.5)3)] podstawione grupy aromatyczne, w których R5 oznacza wodór, metyl lub halogen lub inny podstawnik aktywujący pierścień aromatyczny, poddaje się reakcji ze związkiem o wzorze ogólnym 6, w którym R_x i R2 oraz B mają podane wyżej znaczenie, w warunkach bezwodnych, w nieprotonowym rozpuszczalniku organicznym, w obecności odczynnika aktywującego, a otrzymany produkt o ogólnym wzorze 1, wyodrębnia się i ewentualnie, gdy X oznacza S albo Se, poddaje reakcji utleniania za pomocą znanych odczynników utleniających, korzystnie mieszaniny jod/pirydyna, natlenku wodoru, hydroksynadtlenków alkilowych korzystnie hydroksynadtlenku t-butylowego lub najkorzystniej za pomocą peroksymonosiarczanu potasowego, a wytworzony produkt 1, gdzie X oznacza tlen, a R1, B, Z, R2 i R_x mają podane wyżej znaczenie, wyodrębnia się w znany sposób.
7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że jako związki o wzorze 2 stosuje się związki otrzymane w wyniku procesu fosforylowania odpowiednich związków wyjściowych o wzorze ogólnym 3, w którym R_f, R2 i B mają podane wyżej znaczenie, za pomocą związków o wzorze ogólnym 4, w którym Z i X mają podane wyżej znaczenie, a W oznacza chlorowiec, korzystnie chlor, które następnie bez wydzielania produktu pośredniego o wzorze ogólnym 5, poddawane są reakcji hydrolizy i wyodrębniane w postaci związków o wzorze 2, w którym R_b R2, B, X i Z mąjąpodane wyżej znaczenia, a Y oznacza tlen.
8. Sposób według zastrz. 6 albo 7, znamienny tym, że jako nieprotonowy rozpuszczalnik organiczny stosuje się tetrahydrofuran lub acetonitryl.
9. Sposób według zastrz. 6 albo 7, znamienny tym, że jako aktywator procesu pomiędzy związkiem o wzorze 2 i związkiem 6 stosuje się zasady organiczne, korzystnie aminy, a najkorzystniej 1,8-diazabicyklo-[5.4.0]-undek-7-en (DBU) lub diazabicyklo[4.3.0.]non-5-en (DBN).
10. Sposób według zastrz. 6 albo 7, znamienny tym, że jako dodatkowy aktywator procesu stosuje się sole litu, korzystnie halogenki litu.
11. Sposób wytwarzania modyfikowanych P-chiralnych analogów nukleotydów, w postaci jednego, dowolnie wybranego diastereomeru o ogólnym wzorze 1, w którym:

R1 oznacza grupę protekcyjną, korzystnie grupę 4,4'-dimetoksytrytylową (DMT), 9-fenyloksanten-9-ylową (Px) lub grupę trialkilosililową,

R2 oznacza niezależnie wodór, zablokowaną grupę hydroksylową, halogen, chloroalkil, grupę nitrylową, azydową, zablokowaną grupę aminową, grupę perfluoroalkilową (1-4 ato4

184 612 mów węgla), perfluoroalkoksylową (1-4 atomów węgla i 1-9 atomów fluoru lub chloru), alkoksyalkilową, winylową, etynylową, OQ), SQ], NHQt, gdzie Q1jest alkilem (1-4 atomy węgla) arylem (6-12 atomów węgla), alkenylem (3-12 atomów węgla) lub alkynylem (3-12 atomów węgla),

B jest niezależnie wybraną, opcjonalnie N-zablokowaną zasadą purynową lub pirymidynową,

Z jest niezależnie wybraną spośród Q1 lub grup: winylowej, etynylowej, aminometylowej lub aminoetylowej,

R_x jest grupą protekcyjną, korzystnie grupą aroilową, acylową, alkoksykarbonylową, benzenesulfonową, grupą alkilową. trialkilosililową lub kolejną grupą wydłużającego się łańcucha, znamienny tym, że diastereomer związku o ogólnym wzorze 2 i konfiguracji absolutnej na atomie fosforu odwrotnej do konfiguracji wymaganej dla produktu 1, w którym to wzorze 2 R1, R₂, B, Z, X i Y mają podane wyżej znaczenie, poddaje się reakcji hydrolizy, w obecności aktywatora zmieniającego konfigurację absolutną na atomie fosforu, a otrzymany produkt o wzorze ogólnym 2, gdzie R1, R2 oraz B mają podane wyżej znaczenie,

X oznacza siarkę lub selen, a

Y oznacza tlen, poddaje się reakcji ze związkiem o wzorze ogólnym 7, gdzie

R4 oznacza grupy alkilowe (1-6 atomów węgla), perfluoroalkilowe (1-4 atomów węgla), grupy aroilowe (6-15 atomów węgla), w tym: mono-KCóRRs)], di-[(C6H3(Rs)₂)] lub tri-[(C6H2(R5)3)] podstawione grupy aromatyczne, w których R5 oznacza wodór, metyl lub halogen lub inny podstawnik aktywujący pierścień aromatyczny, a

W oznacza chlor, brom lub jod, następnie otrzymany w ten sposób związek o ogólnym wzorze 2, gdzie R1, R2, Z oraz B mają podane wyżej znaczenie, X oznacza siarkę lub selen, a Y oznacza R4C(O)O-, w którym R4 ma podane wyżej znaczenie, mający konfigurację absolutną odwrotną do związku wyjściowego, a zgodną obecnie z wymaganą dla produktu 1, ewentualnie po połączeniu z drugim, uzyskanym z wcześniejszego rozdziału diastereomerem związku o ogólnym wzorze 2 i konfiguracji absolutnej na atomie fosforu takiej samej jak wymagana dla produktu, poddaje się reakcji ze związkiem o ogólnym wzorze 6, w którym Rx i R2 oraz B mają podane wyżej znaczenie, w warunkach bezwodnych, w nieprotonowym rozpuszczalniku organicznym, w obecności odczynnika aktywującego, a otrzymany produkt o ogólnym wzorze 1 i pożądanej konfiguracji, wyodrębnia się i ewentualnie, jeżeli X oznacza S albo Se, poddaje reakcji utleniania za pomocą znanych odczynników utleniających, korzystnie mieszaniny jod/pirydyna, natlenku wodoru, hydroksynadtlenków alkilowych korzystnie hydroksynadtlenku t-butylowego lub najkorzystniej za pomocą peroksymonosiarczanu potasowego, a wytworzony produkt 1, gdzie X oznacza tlen, a R1, B, Z, R2 i Rx mają podane wyżej znaczenie, wyodrębnia się w znany sposób.
12. Sposób według zastrz. 11, znamienny tym, że jako związki o wzorze 2 stosuje się związki otrzymane w wyniku procesu fosforylowania odpowiednich związków wyjściowych o wzorze ogólnym 3, w którym R1, R2 i B mają podane wyżej znaczenie, za pomocą związków o wzorze ogólnym 4, w którym Z i X mają podane wyżej znaczenie, a W oznacza chlorowiec, korzystnie chlor, które następnie bez wydzielania produktu pośredniego o wzorze ogólnym 5, poddawane są reakcji hydrolizy i wyodrębniane w postaci związków o wzorze 2, w którym R1, B, X i Z mają podane wyżej znaczenia, a Y oznacza tlen.
13. Sposób według zastrz. 11 albo 12, znamienny tym, że poddaje się reakcji związek 3, w którym R1 i B mają podane wyżej znaczenie ze związkiem 4, w którym X oznacza siarkę lub selen, a Z ma podane wyżej znaczenie, otrzymany związek 5, w którym X. oznacza tlen, siarkę lub selen, bez wyodrębniania, poddaje się reakcji hydrolizy, do związku o wzorze ogólnym 2, w którym R_b R, Z i X mają podane wyżej znaczenie, a Y oznacza tlen, który następnie rozdziela się na diastereomery metodami chromatograficznymi i poddaje się reakcji z odpowiednimi związkami o wzorze 7, w których R4 oznacza grupy alkilowe (1-6 atomów węgla), perfluoroalkilowe (1-4 atomów węgla), grupy aroilowe (6-15 atomów węgla), w tym: mono-[(C6H4R5)], di-[(C6H3(Rs)2)] lub tri-[(C6H2(Rs)3)] podstawione grupy aromatyczne,

184 612 w których R5 oznacza wodór, metyl, halogen lub inny podstawnik aktywujący pierścień aromatyczny, a W oznacza halogen, korzystnie chlor.
14. Sposób według zastrz. 11 albo 12, znamienny tym, że jako aktywatory procesu hydrolizy oraz procesu pomiędzy związkiem o wzorze 2 i związkiem 6 stosuje się zasady organiczne, korzystnie aminy, a najkorzystniej 1,8-diazabicyklo-[5.4.0]-undek-7-en (DBU) lub diazabicyklo[4.3.0.]non-5-en (DBN).
15. Sposób według zastrz. 11 albo 12, znamienny tym, że jako nieprotonowy rozpuszczalnik organiczny stosuje się tetrahydrofuran lub acetonitryl.
16. Sposób według zastrz. 11 albo 12, znamienny tym, że jako dodatkowy aktywator procesu pomiędzy związkiem o wzorze 2 i związkiem 6 stosuje się sole litu, korzystnie halogenki litu..
17. Sposób wytwarzania modyfikowanych P-chiralnych analogów nukleotydów, w postaci jednego, dowolnie wybranego diastereomeru o ogólnym wzorze 1, w którym:

R1 oznacza grupę protekcyjną, korzystnie grupę 4,4'-dimetoksytrytylową (DMT), 9-fenyloksanten-9-ylową (Px) lub grupę trialkilosililową,

R2 oznacza niezależnie wodór, zablokowaną grupę hydroksylową, halogen, chloroalkil, grupę nitrylową, azydową, zablokowaną grupę aminową, grupę perfluoroalkilową (1-4 atomów węgla), perfluoroalkoksylową (1-4 atomów węgla i 1-9 atomów fluoru lub chloru), alkoksyalkilową, winylową, etynylową, OQ1, SQ1, NHQ1, gdzie Q1 jest alkilem (1-4 atomy węgla) arylem (6-12 atomów węgla), alkenylem (3-12 atomów węgla) lub alkynylem (3-12 atomów węgla),

B jest niezależnie wybraną, opcjonalnie N-zablokowaną zasadą purynową lub pirymidynową,

Z jest niezależnie wybraną spośród Qj lub grup: winylowej, etynylowej, aminometylowej lub aminoetylowej,

X oznacza tlen, siarkę lub selen,

R_x jest grupą protekcyjną, korzystnie grupą aroilową, acylową, alkoksykarbonylową, benzenesulfonową, grupą alkilową, trialkilosililową lub kolejną grupą wydłużającego się łańcucha, znamienny tym, że diastereomer związku o ogólnym wzorze 2 o konfiguracji absolutnej na atomie fosforu odwrotnej do wymaganej konfiguracji absolutnej produktu, w którym to wzorze 2 Rj, R2, B, Z, X i Y mają podane wyżej znaczenie, poddaje się reakcji z alkoholem, korzystnie metanolem, a otrzymany produkt o wzorze ogólnym 2, gdzie R1, R2 oraz B mają podane wyżej znaczenie, X oznacza siarkę lub selen, a Y oznacza grupę alkoksylową, korzystnie MeO-, poddaje się następnie reakcji dealkilacji za pomocą amin, korzystnie MejN, lub t-BujN, a otrzymany przejściowo produkt o ogólnym wzorze 2, gdzie R1, R2, Z i B mają podane wyżej znaczenie, X oznacza siarkę lub selen, a Y oznacza tlen, poddaje się reakcji ze związkiem o wzorze ogólnym 7, gdzie R4 i W mają podane wyżej znaczenie, po czym otrzymany w ten sposób związek o ogólnym wzorze 2, w którym R1, R2, Z oraz B mają podane wyżej znaczenie, X oznacza siarkę lub selen, Y oznacza R4C(O)O-, mający konfigurację absolutną odwrotną do związku wyjściowego, a zgodną w tym momencie z wymaganą dla produktu 1, ewentualnie po połączeniu z drugim diastereomerem związku o wzorze 2 i konfiguracji absolutnej na atomie fosforu takiej samej jak wymagana dla produktu, poddaje się następnie reakcji ze związkiem o ogólnym wzorze 6, w którym R_x i R2 oraz B mają podane wyżej znaczenie, w warunkach bezwodnych, w nieprotonowym rozpuszczalniku organicznym, w obecności odczynnika aktywującego, a otrzymany produkt o ogólnym wzorze 1 i pożądanej konfiguracji, wyodrębnia się i ewentualnie, gdy X oznacza S albo Se, poddaje reakcji utleniania za pomocą znanych odczynników utleniających, korzystnie mieszaniny jod/piiydyna, natlenku wodoru, hydroksynadtlenków alkilowych korzystnie hydroksynadtlenku t-butylowego lub najkorzystniej za pomocą peroksymonosiarczanu potasowego, a wytworzony produkt 1, gdzie X oznacza tlen, a R1 B, Z, R2 i Rx mają podane wyżej znaczenie, wyodrębnia się w znany sposób.
18. Sposób według zastrz. 16, znamienny tym, że jako związki o wzorze 2 stosuje się związki otrzymane w wyniku procesu fosforylowania odpowiednich związków wyjściowych o wzorze ogólnym 3, w którym R_b R2 i B mają podane wyżej znaczenie, za pomocą związ6

184 612 ków o wzorze ogólnym 4, w którym Z i X mają podane wyżej znaczenie, a W oznacza chlorowiec, korzystnie chlor, które następnie bez wydzielania produktu pośredniego o wzorze ogólnym 5, poddawane są reakcji hydrolizy i wyodrębniane w postaci związków o wzorze 2, w którym R|, R2, B, X i Z mają podane wyżej znaczenia, a Y oznacza tlen.
19. Sposób według zastrz. 17, znamienny tym, że jako aktywatory procesu solwolizy oraz procesu pomiędzy związkiem o wzorze 2 i związkiem 6 stosuje się zasady organiczne, korzystnie aminy, a najkorzystniej l,8-diazabicyklo-[5.4.0]-undek-7-en (DBU) lub diazabicyklo[4.3.0.]non-5-en (DBN).
20. Sposób według zastrz. 17, znamienny tym, że jako nieprotonowy rozpuszczalnik organiczny stosuje się tetrahydrofuran lub acetonitryl.
21. Sposób według zastrz. 17, znamienny tym, że jako dodatkowy aktywator procesu pomiędzy związkiem o wzorze 2 i związkiem 6 stosuje się sole litu, korzystnie halogenki litu.
22. Sposób wytwarzania modyfikowanych P-chiralnych analogów nukleotydów, w postaci jednego, dowolnie wybranego diastereomeru o ogólnym wzorze 1, w którym:

R1 oznacza grupę protekcyjną, korzystnie grupę 4,4'-dimetoksytrytylową (DMT), 9-fenyloksanten-9-ylową (Px) lub grupę trialkilosililową,

R2 oznacza niezależnie wodór, zablokowaną grupę hydroksylową, halogen, chloroalkil, grupę nitrylową, azydową, zablokowaną grupę aminową, grupę perfluoroalkilową (1-4 atomów węgla), perfluoroalkoksylową (1-4 atomów węgla i 1-9 atomów fluoru lub chloru), alkoksyalkilową, winylową, etynylową, OQ1, SQ1, NHQh gdzie Q1 jest alkilem (1-4 atomy węgla) arylem (6-12 atomów węgla), alkenylem (3-12 atomów węgla) lub alkynylem (3-12 atomów węgla),

B jest niezależnie wybraną, opcjonalnie N-zablokowaną zasadą purynową lub pirymidynową,

Z jest niezależnie wybraną spośród Q1 lub grup: winylowej, etynylowej, aminometylowej lub aminoetylowej,

X oznacza tlen, siarkę lub selen,

Rx jest grupą protekcyjną, korzystnie grupą aroilową, acylową, alkoksykarbonylową, benzenesulfonową, grupą alkilową, trialkilosililową lub kolejną grupą wydłużającego się łańcucha, znamienny tym, że jeden z diastereomerów o wzorze ogólnym 2 i konfiguracji absolutnej zgodnej z oczekiwaną dla produktu 1, w którym to wzorze 2 X oznacza siarkę lub selen, a Y oznacza atom tlenu, poddaje się reakcji alkilowania za pomocą znanych odczynników alkilujących korzystnie halogenków alkilowych 8 o wzorze ogólnym R,W, gdzie R6 oznacza metyl, cyjanometyl, halogenokarbonyl, benzyl lub benzyl podstawiony w pierścieniu aromatycznym, a W oznacza chlor, brom lub jod, a otrzymany związek o wzorze 2, w którym R_bR2, B, Z, X oznacza tlen, a Y oznacza SR, lub SeRf,, w którym R, ma podane wyżej znaczenie, poddaje się reakcji kondensacji ze związkiem 6, w którym B i R_x mają wyżej podane znaczenia, w warunkach bezwodnych, w nieprotonowym rozpuszczalniku organicznym, w obecności odczynnika aktywującego, a otrzymany produkt o ogólnym wzorze 1 i pożądanej konfiguracji, gdzie X oznacza tlen, a R_b B, Z, R2 i Rx mają podane wyżej znaczenie, wyodrębnia się w znany sposób.
23. Sposób według zastrz. 22, znamienny tym, że związek o ogólnym wzorze 2, w którym R1, R2, Z oraz B mają podane wyżej znaczenie, X oznacza siarkę lub selen, Y oznacza R4C(O)O-, mający konfigurację absolutną odwrotną do związku wyjściowego, a zgodną z wymaganą dla produktu 1, ewentualnie po połączeniu z drugim diastereomerem związku o wzorze 2 i konfiguracji absolutnej na atomie fosforu takiej samej jak wymagana dla produktu, poddaje się następnie reakcji ze związkiem o ogólnym wzorze 6, w którym Rx i R2 oraz B mają podane wyżej znaczenie, w warunkach bezwodnych, w nieprotonowym rozpuszczalniku organicznym, w obecności odczynnika aktywującego, a otrzymany produkt o ogólnym wzorze 1 i pożądanej konfiguracji, wyodrębnia się i ewentualnie, gdy X oznacza S albo Se, poddaje reakcji utleniania za pomocą znanych odczynników utleniających, korzystnie mieszaniny jod/pirydyna, natlenku wodoru, hydroksynadtlenków alkilowych korzystnie hydroksynadtlenku t-butylowego lub najkorzystniej za pomocą peroksymonosiarczanu potasowego, a wytwo184 612 rzony produkt 1, gdzie X oznacza tlen, a Ri, B, Z, R2 i Rx mają podane wyżej znaczenie, wyodrębnia się w znany sposób.
24. Sposób wedłUg zastrz. 22, znamienny tym, że jako związki o wzorze 2 stosuje się związki otrzymane w wyniku procesu fosforylowania odpowiednich związków wyjściowych o wzorze ogólnym 3, w którym Ri, R2 i B mają podane wyżej znaczenie, za pomocą związków o wzorze ogólnym 4, w którym Z i X mają podane wyżej znaczenie, a W oznacza chlorowiec, korzystnie chlor, które następnie bez wydzielania produktu pośredniego o wzorze ogólnym 5, poddawane są reakcji hydrolizy i wyodrębniane w postaci związków o wzorze 2, w którym R,, R2, B, X i Z mają podane wyżej znaczenia, a Y oznacza tlen.
25. Sposób według zastrz. 22 albo 23, albo 24, znamienny tym, że jako aktywatory procesu pomiędzy związkiem o wzorze 2 i związkiem 6 stosuje się zasady organiczne, korzystnie aminy, a najkorzystniej l,8-diazabicyklo-[5.4.0]-undek-7-en (DBU) lub diazabicyklo[4.3.0.]non-5-en (DBN).
26. Sposób według zastrz. 22 albo 23, albo 24, znamienny tym, że jako nieprotonowy rozpuszczalnik organiczny stosuje się tetrahydrofuran lub acetonitryl.
27. Sposób według zastrz. 22 albo 23, albo 24, znamienny tym, że jako dodatkowy aktywator procesu pomiędzy związkiem o wzorze 2 i związkiem 6 stosuje się sole litu, korzystnie halogenki litu.