PL175332B1

PL175332B1 - Sposób wytwarzania oligo(nukleozydometanofosfonianów)

Info

Publication number: PL175332B1
Application number: PL94303317A
Authority: PL
Inventors: Lucyna Woźniak; Wojciech J. Stec
Original assignee: Pan
Priority date: 1994-05-04
Filing date: 1994-05-04
Publication date: 1998-12-31
Also published as: PL303317A1

Abstract

1. Sposób wytwarzania oligo(nukleozydometanofosfonianów) o ogólnym wzorze 1, w którym R i R’ są takie same lub różne i oznaczają grupy alkoksylowe nukleozydów, korzystnie w pozycjach 5’ i 3’ z grupami egzoaminowymi zasad purynowych lub pirymidynowych zablokowanymi za pomocą grup zasadolabilnych, korzystnie benzoilowej, izobutyrylowej lub piwaloilowej, a A oznacza grupę alkilową, korzystnie metylową, znamienny tym, że poddaje się reakcji diastereomerycznie czysty ester selenometylowy o ogólnym wzorze 2, w którym A i R mają wyżej podane znaczenie, z alkoholem pierwszorzędowym o ogólnym wzorze 3, w którym R’ oznacza grupę 5’ alkoksylową nukleozydu, w obecności odczynnika aktywującego, korzystnie wybranego z grupy obejmującej aminy i sole litu, po czym wyodrębnia się produkt w znany sposób.

Description

Przedmiotem wynalazku jest stereokontrolowana metoda syntezy oligo(nukleozydometanofosfonianów) o ogólnym wzorze 1.

Modyfikowane oligonukleotydy, w tym niejonowe metanofosfoniany nukleozydów, wykazują własności przeciwwirusowe i przeciwnowotworowe (in vitro) i stanowią interesującą grupę potencjalnych chemioterapeutyków nowej generacji, opartych na koncepcji antisense (anticode). [P.O.P.Ts’o, L. Aurelian, E. Chang, P.S. Miller, Antisense Strategies, Annals of the New York Academy of Sciences, 660, (1993), 159].

Modyfikowane oligonukleotydy, w których wiązanie internukleotydowe jest P-chiralne (tiofosforany, metanofosfoniany) różniące się jedynie konfiguracją na atomie fosforu, wykazują szereg różnic we własnościach fizycznych, chemicznych i biologicznych, takich jak np. zróżnicowaną reaktywność w stosunku do nukleaz (tiofosforany) [B.V.L. Polter, B.A. Connolly, F. Eckstein, Biochemistry 22, (1983), 1369; F.R. Bryant, SJ. Benkovic, Biochemistry, 18. (1979). 2825].

Metanofosfoniany nukleozydów są całkowicie odporne na działanie enzymów. Wykazano, że stereoregulame oligo(nukleozydometanofosfoniany) o tej samej sekwencji i przeciwnych konfiguracjach na atomie fosforu mają różne temperatury mnięknięcia (Tm), świadczące o różnej zdolności do tworzenia dupleksów z nicią komplementarną DNA [Z.J. Leśnikowski, M. Jaworska, W.J. Stec, Nucl. Acids Res, 18, (1990). 2109].

Oligonukleotydy zawierające n-chiralnych funkcji internukleotydowych występują w postaci 2 izomerów. Metody chromatograficzne pozwalają jedynie na rozdział izomerów krótkich fragmentów.

Istotną rzeczą jest opracowanie nowych stereokontrolowanych metod syntezy dłuższych łańcuchów, pozwalających na syntezę oligomerów o z góry zdefiniowanym sensie chiralności na wszelkich atomach fosforu.

Istnieją liczne sposoby zawiązywania wiązania internukleotydowego, prowadzące do modyfikowanych P-chiralnych nukleotydów, w tym szczególnie metanofosfonianowych analogów oligonukleotydów, ale w literaturze podano tylko następujące przykłady reakcji przebiegających stereoselektywnie.

175 332

1. Metoda polegająca na reakcji grupy 5’-hydroksylowej nukleozydu, aktywowanej za pomocą odczynnika Grignarda, chlorku t-butylomagnezowego, z rozdzielonymi na diastereoizomery estrami p-nitrofenylowymi metanofosfonianów nuldeozydów: [ZJ. Leśnikowski, M. Jaworska, W.J. Stec, Nucl. Acids Res, 16. (1988). 11670].

2. Synteza metanofosfonianów dinukleozydów z wykorzystaniem metylodichlorofosfiny jako odczynnika fosfitylującego w niskich temperaturach, w reakcji z grupą 3’-hydroksylową nukleozydu w pierwszym etapie reakcji i grupą 5’-hydroksylową w drugim etapie reakcji. Metoda ta prowadzi do preferencyjnego (w stopniu zależnym od użytych nukleozydów i warunków) powstania izomeru Rp [T Loschner, J. Engels, Tetrahedron Lett., 30. (1989) 5587; J. W. Engels, T. Loschner, A. Frauendorf, Nucleosides & Nucleotides, 10^(1991) 347].

3. Synteza 5’-tiono(5’-seleno)5’-deoksy pochodnych, metanotio(seleno)fosfonianów i tio(seleno)fosforanów nukleozydów, z wykorzystaniem rozdzielonych na diastereoizomery odpowiednio tio- i selenokwasów, alkilowanych przy użyciu 5’-chlorowco-5’-deoksynukleozydów [A.V. Lebedev, J.P. Rife, H.W. Seligsohn, G.R. Wenzinger, E. Wickstrom, Tetrahedron Lett., 31. (1990) 855; L. Woźniak, W.J. Stec, International Conference NAMA, Cancun, 1993; L. Woźniak, W.J. Stec, M. Sochacki, H. Mitsuya, S. Kagcyama, Bioorg. & Medical Chem. Letters, 4. (1994) 1033].

Sposób wytwarzania estrów o wzorze ogólnym 1, w którym R i R’ są takie same lub różne i oznaczają grupy alkoksylowe nukleozydów w pozycjach 5’ i 3’, z grupami egzoaminowymi zasad purynowych lub pirymidynowych zablokowanymi za pomocą grup zasadolabilnych, korzystnie benzoilowej, izobutyrylowej lub piwaloilowej, a A oznacza grupę alkilową, korzystnie metylową, polega według wynalazku na tym, że poddaje się reakcji diastereomerycznie czysty ester selenometylowy o ogólnym wzorze 2, w którym A i R mają wyżej dane znaczenie, z alkoholem pierwszorzędowym o ogólnym wzorze 3, w którym R’ oznacza grupę 5’ alkoksylową nukleozydu, w obecności odczynnika aktywującego, korzystnie wybranego z grupy obejmującej aminy i sole litu, po czym wyodrębnia się produkt w znany sposób.

Sposób według wynalazku prowadzi się w warunkach bezwodnych, w nieprotonowym rozpuszczalniku organicznym, korzystnie w pirydynie lub acetonitrylu.

W sposobie według wynalazku jako odczynnik aktywujący, korzystnie stosuje się

1,8-diazabicyklo[5.4.0]undek-7-en (DBU), diizopropyloetyloaminę, chlorek litowy lub bromek litowy.

W sposobie według wynalazku jako diattereomerycznie czysty ester selenometylowy o ogólnym wzorze 2, w którym A i R mają wyżej podane znaczenie, a Me oznacza metyl, stosuje się ester otrzymany w reakcji alkilowania za pomocą jodku metylu odpowiednich soli sodowych kwasów metanoselenofosfonowych zablokowanych nukleozydów.

Synteza stosowanych w sposobie według wynalazku monomerów wzorze ogólnym 2 przebiega z dużą wydajnością. Również rozdzielanie tych monomerów na czyste P-enancjomery, metodami chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym przebiega z dużą łatwością. Są one monomerami trwałymi chemicznie i stereochemicznie. Proces zawiązywania wiązania estrowego jest katalizowany w celu uzyskania produktu o wzorze 1.

Wykorzystanie rozdzielonych na diastereoizomery substratów o ogólnym wzorze 2 umożliwia otrzymanie diasterec^izomeiycznie czystych produktów o wzorze 1 z dużą wydajnością.

Sposób według wynalazku opiera się na reakcji podstawienia nukleofilowego przy atomie fosforu w metyloselenofotfonianach nukleozydów o ogólnym 2, za pomocą grupy 5’-hydroksylowej nukleozydu alkoholu o ogólnym wzorze 3, w obecności aktywatora wybranego z grupy obejmującej aminy, korzystnie 1,8-diazabicyklo[5.4.0]undek-7-en (DBU)

175 332 lub diizopropyloetyloamina oraz chlorek litowy lub bromek litowy. Produkty reakcji wyodrębnia się w znany sposób.

Poniżej podano przykłady wykonania wynalazku nie ograniczające jego zakresu.

Przykład I. Synteza (Rp)-3’-metanofosfonianu 5’-0-DMT-tymidylo(3’,5’)3 ’-0-acetylotymidyny

Do roztworu 5’-0-DMT-tymidylo-3’-0-[Se-metylometanoselenofosfonianu] (wolniej wymywany diastereoizomer SLOW¹,0.350 g, 0.5 mmol, ³¹P NMR: 49.76 ppm, Jp-s_e = 430 Hz; MS FAB'[m/z]'698,700,701) i 3’-0-acetylotymidyny (0.71 g, 0.25 mmol) w suchej pirydynie, dodano nasycony roztwór chlorku litu w pirydynie (2.5 ml) oraz roztwór DBU w pirydynie (3:7 v/v, 1 ml). Po pół godzinie roztwór reakcyjny rozcieńczono chloroformem i otrzymaną mieszaninę ekstrahowano 2 razy za pomocą buforu fosforanowego (pH 7). Warstwę organiczną suszono za pomocą MgSOą. Po zatężeniu rozpuszczalników pod zmniejszonym ciśnieniem produkt oczyszczano metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym, stosując gradient chloroform-etanol (0-3%) jako eluent.

Wydajność: 92%, ³¹ P NMR: 33.00 ppm.,

Ή NMR (CDCh: 1.61 ppm, 1.54 ppm (3H, d, P-CH₃),

J²p._H = 17.64 Hz.

Produkt poddano deproteksji i w pełni odblokowany porównano z wzorcem otrzymanym na drodze niezależnej.

Przykład II. Synteza (Sp)-3’-metanofosfonianu 5’-0-DMT-tymidylo(3’,5’)-3’0-acetylotymidyny

Wykonano analogicznie jak w przykładzie I.

Substraty: (FAST) 5'-O-DMT-tymidylo-3'-O-[Se-metylo- metanoselenofosfonian] (Mp NMR : 49.72 ppm, Jp.§_e=428Hz) i 3'-O-acetylotymidyna

Wydajność: 88%31pNMR :33.14 ppm (CDC1₃);

MS FAB-[m/z]-887, ^łH NMR : 1.60 ppm, 1.54 ppm (3H,d,P-CH₃),

J²P.H=17.59Hz.

Przykład III. Synteza (Rp)-3’-metanofosfonianu bf-benzoiloS^O-DMT-O2 ’-deoksyadenozylo (3’, 5 f-y-benzoiloS ’-0-acetylo-2 ’-deoksyadenozyny

Wykonano analogicznie jak w przykładzie I.

Substraty: (SLOW) N6-benzoilo-5'-O-DMT-deoksyadenoiio

3'-O-[Se-metylo- metanoselenofosfonian] (31 p NMR :

50.24 ppm, Jp-Se⁼ 432Hz, MS FAB-[m/z]-809,812,813) i N⁶-benzoiIo-3’-0-acetylo-L’-deoksyadenozyna

Wydajność: 40% ³ lp NMR :32.57 ppm (CDC1₃); ’H NMR (DMSO-d₆) : 11.32(2H,s,NH), 6.63, 6.65(2H,m,l-H), 3.79 (6H,d,OCH₃), 2.17(3H,s,CH₃CO), 1.62,1.57 (3H,s,P-CH₃,JpcH⁼17.53 Hz).

FAB-MS [M-Hj: 1014.

1715332

Przykład IV. Synteza (Sp)-3’-metanofosfonianu N⁶-benzoilo-5’-0-DMT-02 ’-deoksyadenozylo (3’,5’) -N⁶-benzoilo-3’-ac^etylo-2 ’-deoksyadenozyny

Wykonano analogicznie jak w przykładzie I.

Substraty: (FAST) N6-benzoilo-5'-O-DMT-deoksyadenoilo 3'-O-[Semetylometanoselenofosfonian] (31p NMR:49.79 ppm,

JP-Se= 430Hz, MS FAB-[m/z]-809,812,813) i N⁶-benzoilo3 ’-O-acetylo-2 'deoksyadenozyna

Wydajność: 45% 31p NMR : 32.71 ppm (CDCI3); 1h NMR (DMSO-d₆) : 11.32 (2H,s,NH), 6.65, 6.47 (2H,m,1'-H), 3.79 (6H,d,OCH3), 2.18 (3H,s,CH3CO), 1.65, 1.6(6 (3H,s,P-CH3,JpcH=17.61 Hz).

FAB-MS [M-H]: 1014.

Przykład V. Synteza (Sp)-3’-metanofosfonianu 5’-DMT-0-tymidylo(3’,5’)-N⁴izobutyrylo-3 ’-0-acetylo-2 -deoksyguanozyny

Wykonano analogicznie jak w przykładzie I.

Substraty: (FAST) 5'-O-DMT-O-tymidylo-3'-[Se-metylometanoselenofosfonian] (31p NMR : 49.72 ppm, Jp-Se = 428Hz,

MSFAB-[m/z]-647,699,700) i

N4-izobutyrylo-3'-O-acetylo-2'-deoksyguanozyna.

Wydajność: 93% 31p NMR : 33.02 ppm (CDO3); ’H NMR (DMSO-d₆) : 11.73, 11.5 (2H,2s,NH), 6.32-6.27 (2H,1'-H),

3.82 (6H,s,OCH3), 2.16 (3H,s,CH3CO), 1.66, 1.60 (3H,P-CH3,Jpch= 17.61 Hz).

MS FAB- [M-H]: 983,984.

175 332 wzór 1

R O \ //

P ✓ \

Se Me wzór 2

R'OH wzór 3

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz. Cena 2,00 zł

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób wytwarzania oligo(nukleozydometanofosfonianów) o ogólnym wzorze 1, w którym R i R’ są takie same lub różne i oznaczają grupy alkoksylowe nukleozydów, korzystnie w pozycjach 5’ i 3’ z grupami egzoaminowymi zasad purynowych lub pirymidynowych zablokowanymi za pomocą grup zasadolabilnych, korzystnie benzoilowej, izobu^rylowej lub piwaloilowej, a A oznacza grupę alkilową, korzystnie metylową, znamienny tym, że, poddaje się reakcji diastereomeyycznie czysty ester selenometylowy o ogólnym wzorze ' 2, w którym A i R mają wyżej podane znaczenie, z alkoholem pierwszorzędowym o ogólnym wzorze 3, w którym R’ oznacza grupę 5’ alkoksylową nukleozydu, w obecności odczynnika aktywującego, korzystnie wybranego z grupy obejmującej aminy i sole litu, po czym wyodrębnia się produkt w znany sposób.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako odczynnik aktywujący stosuje się

1,8-diazabicyklo[5.4.0]undek-7-en (DBU) lub diizopropyloetyloaminę oraz chlorek litowy lub bromek litowy. .