CN106459133A - 用于“z核苷酸”的保护基团及其方法 - Google Patents

用于“z核苷酸”的保护基团及其方法 Download PDF

Info

Publication number
CN106459133A
CN106459133A CN201580030951.6A CN201580030951A CN106459133A CN 106459133 A CN106459133 A CN 106459133A CN 201580030951 A CN201580030951 A CN 201580030951A CN 106459133 A CN106459133 A CN 106459133A
Authority
CN
China
Prior art keywords
methyl
oligonucleotide
compound
group
aryl
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201580030951.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN106459133B (zh
Inventor
B·D·伦斯塔德
D·J·德林杰
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Agilent Technologies Inc
Original Assignee
Agilent Technologies Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Agilent Technologies Inc filed Critical Agilent Technologies Inc
Publication of CN106459133A publication Critical patent/CN106459133A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN106459133B publication Critical patent/CN106459133B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H23/00—Compounds containing boron, silicon, or a metal, e.g. chelates, vitamin B12
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D211/00—Heterocyclic compounds containing hydrogenated pyridine rings, not condensed with other rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H7/00—Compounds containing non-saccharide radicals linked to saccharide radicals by a carbon-to-carbon bond
    • C07H7/06—Heterocyclic radicals
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本公开提供了能够以简单、洁净和位点特异性方式以高产率合成具有Z核苷酸的寡核苷酸的独特方法学和保护基团。具体而言，所述方法对寡核苷酸产物几乎没有或不产生损伤，并且不修饰Z核苷酸本身。本发明提供了用于有效合成其中掺入Z核苷酸的长寡核苷酸的可行保护策略。

Description

用于“Z核苷酸”的保护基团及其方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2014年6月10日提交的美国临时申请62/010,402的权益，通过引用的方式将该申请整体并入本文。
政府权利
根据DARPA授予的资助/合同号N66001-12-C-4211，美国政府享有本发明的某些权利。
技术领域
本发明大体涉及核酸的合成。更具体地，本发明涉及用于合成具有掺入其序列中的一个或多个“Z核苷酸”的DNA和RNA的新的保护基团和相关化合物及其方法。
背景技术
核酸是所有已知形式的生命所必需的生物分子。核酸包括DNA(脱氧核糖核酸)和RNA(核糖核酸)，其由核苷酸组成。核酸在编码、传递和表达遗传信息中起作用。核酸的研究是现代生物和医学研究的关键部分，其形成基因组学以及生物技术和制药工业的基础。
感受到由标准核酸中非常有限数目的天然存在的核苷酸带来的约束，科学家多年来一直试图引入非天然碱基对系统以致力于扩展遗传密码。一个这样的非天然碱基对是由Steven Benner和合作者开发的所谓的“Z-P”系统，其中合成的核苷酸Z可通过3个氢键与合成性核苷酸P配对。(Kim,et al.2014J.Org.Chem.79(7)3194-3199；Yang,et al.2013Anal.Chem.85(9)4705–4712,Kim,et al.2012 J.Org.Chem.77(7)3664-3669；Yang,etal.2011 J.Am.Chem.Soc.133(38)15105-15112；Chen,et al.2011 Nucleic AcidsResearch 39(9)3949-3961；Yang,et al.2010 Angewandte Chemie,InternationalEdition 49(1)177-180,S177/1-S177/16；Yang,et al.2007 Nucleic Acids Research 35(13)4238-4249；Yang,et al.2006 Nucleic Acids Research 34(21)6095-6101；Hutter,et al.2003 J.Org.Chem.68(25)9839-9842；WO 2009/154733 A2；US 8,389,703 B1；US 8,586,303 B1.)。
在针对作为扩展遗传密码的组分的所提出的非天然碱基对而言的重要要求中，其必须允许通过常规化学DNA和RNA合成将非天然核苷酸简单、洁净地掺入DNA和RNA分子中。具有确定化学性质的期望长度和序列的寡核苷酸合成是实验室研究及分子生物学和医学中应用的基本标准。
在寡核苷酸合成期间，为了防止不期望的副反应，选择核苷中存在的官能团必须通过附接保护基团而变得不起反应或“经保护”。在特定合成步骤完成时或寡核苷酸装配(assembly)后，移去保护基团以产生期望的寡核苷酸。
当制备掺入Z核苷酸的合成性DNA(或RNA)时，用于Z核苷酸碱基的少数报道的保护基团之一是对硝基苯基乙基(NPE)保护基团(US 8,389,703B2)。然而，制备含有用NPE保护的Z核苷酸的RNA的实验已经显示该保护基团很不理想。事实上，在脱保护过程中发生对寡核苷酸产物的显著损伤以及对Z核苷酸本身的不期望的修饰。因此，目前没有有效合成掺入Z核苷酸的寡核苷酸的可行保护策略，这严重限制了Z-P非天然碱基对的有效性。
因此，迫切需要开发新的保护基团和方法学，以使非天然核苷酸具体是Z核苷酸能够简单地化学掺入到合成的长寡核苷酸中。
发明内容
本公开提供了能够以简单、洁净和位点特异性方式以高产率合成具有Z核苷酸的寡核苷酸的独特方法学和保护基团。具体而言，所述方法对寡核苷酸产物几乎没有或不产生损伤，并且不修饰Z核苷酸本身。本发明提供了用于有效合成其中掺入Z核苷酸的长寡核苷酸的可行保护策略。
在一方面，本发明大体涉及具有结构式(I)的化合物：
其中
R1为NO2、CN、F或C1-C4全氟烷基；
A为O或S；
R2为H、O-甲基、氟或OR2’，其中R2’为第一保护基团；
R3为第二保护基团；
R5为第三保护基团；
R为式N＝C(R)NR2或N(R)COR或N(COR)2的经保护的氨基：
其中每个R独立地选自H、直链的、支链的、饱和的或不饱和的烷基、芳基、烷芳基或芳烷基；且其中R为式N＝C(R)NR2的经保护的氨基，NR2可连接形成5-8元环，其中所述环可含有选自O或S的杂原子；且
X、Y和Z中的每一个独立地为H、卤素或C1-C3烷基，其中X、Y和Z中的两个或更多个可一起形成5-8元饱和的、不饱和的或芳基环。
在另一方面，本发明大体涉及寡核苷酸，其中至少一个核苷酸具有以下结构式：
其中
R1为NO2、CN、F或C1-C4全氟烷基，
A为O或S；
R2为1,1-二氧代-硫吗啉-4-硫代羧酸酯(TC)、叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)、三异丙基甲硅烷基氧基甲基(TOM)、二(2-乙酰氧基乙氧基)甲基(ACE)、特戊酰基氧基甲基(PivOM)、1-(2-氰基乙氧基)乙基(CEE)、2-氰基乙氧基甲基(CEM)、-CO-R”、-CH2-CH＝CH2、-CH2-O-CH2-苯基-NO2、-CH2-O-CH2-CH2-SO2-芳基、CH2-S-S-R1、-Si(R”)3；其中R”独立地选自直链的、支链的、饱和的或不饱和的烷基、芳基、烷芳基和芳烷基；
R为式N＝C(R’)NR’2或N(R’)COR’或N(COR’)2的经保护的氨基，其中每个R’独立地选自H、直链的、支链的、饱和的或不饱和的烷基、芳基、烷芳基和芳烷基；或其中R式N＝CR’NR’2的经保护的氨基，其中NR’2连接形成5-8元环，其中所述环可含有选自O或S的杂原子；且
X、Y和Z中的每一个独立地为H、卤素或C1-C3烷基，其中X、Y和Z中的两个或更多个可一起形成5-8元饱和的、不饱和的或芳基环。
在另一方面，本发明大体涉及使用本文公开的化合物合成寡核苷酸的方法。合成的寡核苷酸可为DNA、RNA或包括一个或多个非天然核苷酸的DNA和RNA的混合序列。
在另一方面，本发明大体涉及用于合成寡核苷酸的方法。所述方法包括：用乙酰基-氧基-甲基保护非天然核苷酸，将经保护的非天然核苷酸掺入寡核苷酸序列；并从掺入寡核苷酸序列中的非天然核苷酸中移去乙酰基-氧基-甲基。掺入寡核苷酸序列中的经保护的非天然核苷酸具有结构式(V)，
其中
R1为NO2、CN、F或C1-C4全氟烷基，
A为O或S，
R2为1,1-二氧代-硫吗啉-4-硫代羧酸酯(TC)、叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)、三异丙基甲硅烷基氧基甲基(TOM)、二(2-乙酰氧基乙氧基)甲基(ACE)、特戊酰基氧基甲基(PivOM)、1-(2-氰基乙氧基)乙基(CEE)、2-氰基乙氧基甲基(CEM)、-CO-R”、-CH2-CH＝CH2、-CH2-O-CH2-苯基-NO2、-CH2-O-CH2-CH2-SO2-芳基、CH2-S-S-R1或-Si(R”)3；其中R”独立地选自直链的、支链的、饱和的或不饱和的烷基、芳基、烷芳基和芳烷基；
R为式N＝C(R’)NR’2或N(R’)COR’或N(COR)2的经保护的氨基，其中每个R’独立地选自H、直链的、支链的、饱和的或不饱和的烷基、芳基、烷芳基和芳烷基；或其中R为式N＝CRNR2的经保护的氨基，其中NR2连接形成5-8元环其中所述环可含有选自O或S的杂原子；且
X、Y和Z中的每一个独立地为H、卤素或C1-C3烷基，其中X、Y和Z中的两个或更多个可一起形成5-8元饱和的、不饱和的或芳基环。
在另一方面，本发明大体涉及用于合成寡核苷酸的方法。所述方法包括：用乙酰基-氧基-甲基保护核苷酸，
其中每个X独立地为H或卤素；将经保护的核苷酸化学掺入寡核苷酸序列；并从掺入核苷酸序列中的核苷酸中移去乙酰基-氧基-甲基。
附图简述
图1：电喷雾质谱图(ESI扫描)显示了21-聚物RNA合成结果，其使用对硝基苯基乙基(NPE)作为rZ保护基团以及使用1M(15％)DBU、随后EDA进行脱保护和从载体上裂解。上图：使用标准5小时EDA脱保护方法(无DBU)的RNA合成的ESI扫描。中间图和下图：使用两步脱保护方案，使用1M(15％)DBU、随后EDA完成脱保护和从载体上裂解，进行RNA合成的ESI扫描。中间图显示2小时过程，而下图显示20小时过程。期望的产物峰表示为“产物”以及EDA取代的产物(标记为“EDA sub.”)和某些降解产物(-G和-94)。(-G＝缺少G核苷酸的预期RNA物种；-94＝分子量比期望的RNA产物小94道尔顿的预期RNA产物)。
图2：电喷雾质谱图(ESI扫描)显示了RNA合成结果，其使用对硝基苯基乙基(NPE)作为rZ保护基团以及使用不同浓度的DBU、随后EDA进行脱保护和从载体上裂解。第一图：1.5％BDU，18小时；第二图：3％BDU，18小时；第三图：6％BDU，18小时；第四图：12％BDU，18小时。产率显示在每图的左侧。EDA取代的峰表示为“EDA sub”。
图3：电喷雾质谱图(ESI扫描)显示了含有单个rZ(NPE)修饰的93-聚物RNA的合成结果，其使用不同浓度的DBU、随后EDA进行脱保护和从载体上裂解。第一图：无DBU，18小时；第二图：1.5％DBU，18小时；第三图：0.75％DBU，18小时；第四图：1.5％DBU/甲苯，18小时；第五图：比较图，其显示针对不含有rZ但含有rP碱基的标准82-聚物RNA的结果，其仅使用EDA进行脱保护和裂解。产物峰在第一图中指示。
图4：电喷雾质谱图(ESI扫描)显示了含有单个rZ核苷酸(如图1所示)但用不同的羰基氧基甲基保护的相同21-聚物RNA的合成结果。3个不同图分别对应于含有rZ的RNA的ibuOM(上图)、AcOM(中间图)和PivOM(下图)的5小时EDA脱保护。产物峰显示在上图中，作为EDA取代的物种(EDA sub.)。PivOM保护产生最多的EDA取代，iBuOM保护允许较少的取代，而AcOM实现完全的脱保护且没有可检测的取代。
图5：电喷雾质谱图(ESI扫描)显示了含有一个用乙酰基氧基甲基(AcOM)和2'-O-硫代氨基甲酸酯保护的rZ亚酰胺(amidite)(6b)的93-聚物RNA的寡核苷酸合成结果，如在EDA中脱保护5小时后的其它TC RNA亚酰胺。
定义
在本说明书和所附权利要求中，除非上下文另有明确规定，否则单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数引用。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的相同的含义。尽管与本文所述的那些类似或等同的任何方法和材料也可用于本公开的实践或测试，但是现在描述优选的方法和材料。除了所公开的特定顺序之外，本文所述的方法可以逻辑上可能的任何顺序进行。
下面更详细地描述特定官能团和化学术语的定义。有机化学的一般原理以及特定的官能部分和反应性述于“Organic Chemistry”,Thomas Sorrell,University ScienceBooks,Sausalito:1999中。
本发明的某些化合物可以特定的几何或立体异构形式存在。本发明意欲涵盖所有这些化合物，包括顺式-和反式-异构体、R-和S-对映异构体、非对映异构体、(D)-异构体、(L)-异构体、它们的外消旋混合物，其落入本发明的范围内。另外的不对称碳原子可存在于取代基诸如烷基中。所有这些异构体及其混合物都包括在本发明中。
根据本发明，可使用含有各种异构体比率的异构体混合物。例如，当只有两种异构体组合时，本发明尤其意欲涵盖含有50:50、60:40、70:30、80:20、90:10、95:5、96:4、97:3、98:2、99:1或100:0异构体比率的混合物。本领域普通技术人员将简单地理解，对于更复杂的异构体混合物意欲涵盖类似的比率。
例如，如果需要本发明化合物的特定对映异构体，则其可通过不对称合成或通过用手性助剂衍生来制备，其中将所得非对映异构体混合物分离，并且将辅助基团裂解以提供纯的期望的对映异构体。可选择地，当分子含有碱性官能团(诸如氨基)或酸性官能团(诸如羧基)时，用合适的光学活性酸或碱形成非对映异构的盐，随后通过本领域公知的分级结晶或色谱法拆分由此形成的非对映异构体，然后回收纯的对映异构体。
鉴于本公开内容的益处，本领域普通技术人员将理解如本文所述的合成方法可利用多种保护基团。本文所用的术语“保护基团”意指暂时封闭特定的官能部分例如O、S或N，使得反应可选择性地在多官能化合物中的另一个反应位点进行。在优选的实施方案中，保护基团以良好产率选择性反应，得到对预计的反应稳定的经保护的底物；保护基团应通过优选易于获得的不进攻其它官能团的无毒试剂以良好产率可选择性地除去；保护基团形成易于分离的衍生物(更优选不产生新的立体异构(stereogenic)中心)；并且保护基团具有最小的额外官能性以避免其它反应位点。可使用氧、硫、氮和碳保护基团。各种保护基团的实例可参见Protective Groups in Organic Synthesis,Third Ed. Greene,T.W.andWuts,P.G.,Eds.,John Wiley&Sons,New York:1999。
本文使用的核酸化学、生物化学、遗传学和分子生物学的术语和符号遵循本领域的标准论文和教科书，例如，Kornberg and Baker,DNA Replication,Second Edition(W.H.Freeman,New York,1992)；Lehninger,Biochemistry,Second Edition(WorthPublishers,New York,1975)；Strachan and Read,Human Molecular Genetics,SecondEdition(Wiley-Liss,New York,1999)；Eckstein,editor,Oligonucleotides andAnalogs:A Practical Approach(Oxford University Press,New York,1991)；Gait,editor,Oligonucleotide Synthesis:A Practical Approach(IRL Press,Oxford,1984)；Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2nd Edition(Cold SpringHarbor Laboratory,1989)等。但是，为了清楚和便于参考，下文定义了某些术语。
应当理解，如本文所述的化合物可被任何数目的取代基或官能部分取代。
本文所用的术语“烷基”是指饱和的直链、支链或环状烃基(例如具有1至24个，通常1至12个)碳原子，诸如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊基、环戊基、异戊基、新戊基、己基、异己基、环己基、3-甲基戊基、2,2-二甲基丁基或2,3-二甲基丁基。烷基包括“环烷基”，其是指环状烷基，诸如环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基或环辛基。
术语“烷氧基”意指与氧连接的烷基，并且可由式：R-O-表示，其中R表示烷基。一个实例是甲氧基CH3O-。
术语“芳基”是指可以包括0至4个杂原子的5-、6-和7-元单环或多环芳族基团，例如苯、吡咯、呋喃、噻吩、咪唑、噁唑、噻唑、三唑、吡唑、吡啶、吡嗪、哒嗪或嘧啶等。在环结构中具有杂原子的那些芳基也可称为“芳基杂环基”或“杂芳族基团”。术语“芳基”还包括具有两个或更多个环的多环环系，其中两个或更多个碳是两个相邻环共有的(所述环是“稠合环”)，其中至少一个环是芳族的(例如，其它环可为环烷基、环烯基、环炔基、芳基和/或杂环基)。稠环芳基的实例是萘。“低级芳基”含有至多18个碳，诸如至多14、12、10、8或6个碳。
芳环可在一个或多个环位置取代有针对经取代的烃基而言如上文所述的取代基，例如卤素、叠氮基、烷基、芳烷基、烯基、炔基、环烷基、羟基、烷氧基、氨基、硝基、巯基、亚氨基、酰氨基、膦酸酯基、次膦酸酯基、羰基、羧基、甲硅烷基、醚基、烷基硫基、磺酰基、亚磺酰氨基、酮基、醛基、酯基、杂环基、芳族或杂芳族部分、-CF3或-CN等。
本文所用的术语“核苷酸”是指核酸(无论是DNA或RNA或其类似物)的亚单位，其包括磷酸酯基团、糖基团和杂环碱基，以及上述亚单位的类似物。其它基团(例如，保护基团)可附接至核苷酸的任何组分。
本文所用的术语“烷基芳基”是指具有烷基取代基的芳基。本文所用的术语“芳烷基”或“芳基烷基”是指具有芳基取代基的烷基。
本文所用的术语“核苷”是指包括糖基和杂环碱基的核酸亚单位，以及上述亚单位的类似物。其它基团(例如，保护基团)可附接至核苷的任何组分。
术语“核苷酸”和“核苷”旨在包括不但含有已知的嘌呤和嘧啶碱基(例如，腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)或尿嘧啶(U))，而且含有其它已被修饰的杂环碱基的那些部分。这种修饰包括甲基化嘌呤或嘧啶、烷基化嘌呤或嘧啶、酰基化嘌呤或嘧啶、卤化嘌呤或嘧啶、脱氮嘌呤、烷基化核糖或其它杂环。这种修饰包括例如二氨基嘌呤及其衍生物、肌苷及其衍生物、烷基化嘌呤或嘧啶、酰基化嘌呤或嘧啶、硫醇化嘌呤或嘧啶等，或添加保护基团诸如乙酰基、二氟乙酰基、三氟乙酰基、异丁酰基、苯甲酰基、9-芴基甲氧基羰基、苯氧基乙酰基和经取代的苯氧基乙酰基、二甲基甲脒、二丁基甲脒、吡咯烷子基脒、吗啉代脒及其它脒衍生物，或N,N-二苯基氨基甲酸酯等。嘌呤或嘧啶碱基也可为前述的类似物；合适的类似物将是本领域技术人员已知的并且述于相关文本和文献中。常见类似物包括但不限于7-脱氮腺嘌呤、1-甲基腺嘌呤、2-甲基腺嘌呤、N6-甲基腺嘌呤、N6-异戊基腺嘌呤、2-甲基硫基-N6-异戊基腺嘌呤、N,N-二甲基腺嘌呤、8-溴腺嘌呤、2-硫胞嘧啶、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-乙基胞嘧啶、4-乙酰基胞嘧啶、1-甲基鸟嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、2,2-二甲基鸟嘌呤、8-溴鸟嘌呤、8-氯鸟嘌呤、8-氨基鸟嘌呤、8-甲基鸟嘌呤、8-硫鸟嘌呤、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、5-乙基尿嘧啶、5-丙基尿嘧啶、5-甲氧尿嘧啶、5-羟基甲基尿嘧啶、5-(羧基羟基甲基)尿嘧啶、5-(甲基氨基甲基)尿嘧啶、5-(羧基甲基氨基甲基)-尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、5-(2-溴乙烯基)尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧基乙酸、尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯、假尿嘧啶、1-甲基假尿嘧啶、Q核苷(queosine)、肌苷、1-甲基肌苷、次黄嘌呤、黄嘌呤、2-氨基嘌呤、6-羟基氨基嘌呤、6-硫嘌呤和2,6-二氨基嘌呤。
此外，术语“核苷”和“核苷酸”包括不仅含有常规核糖和脱氧核糖，而且含有其它糖的那些部分。经修饰的核苷或核苷酸还包括糖部分上的修饰，例如，其中一个或多个羟基被卤素原子或脂族基团替代，包括锁核酸(称为LNA)和解锁的核酸(UNA)，2'-氟、2'-O-烷基或2'-O-乙氧基甲氧基，或被官能化为醚或胺等。
本文所用的术语“Z核苷酸”和“P核苷酸”是指可形成碱基对的两种非天然核苷酸，如下所示。
本文所用的术语“类似物”是指具有在文献中被认为是模拟物、衍生物的结构特征的分子、具有类似结构的分子，或其它类似术语，并且包括例如掺入非天然(不是通常在自然界中存在的)核苷酸的多核苷酸、非天然核苷酸模拟物诸如2'-经修饰的核苷、肽核酸、寡核苷酸膦酸酯，以及已经添加了取代基(诸如保护基团或连接基团)的任何多核苷酸。
本文所用的术语“寡核苷酸”是指具有约2至约500个核苷酸的核苷酸的单链多聚体。寡核苷酸可为合成的或可酶促制备，并且在一些实施方案中，长度为10至50个核苷酸。寡核苷酸可含有核糖核苷酸单体(即可为寡核糖核苷酸)或脱氧核糖核苷酸单体或两者，并且可任选地包括核苷酸类似物。寡核苷酸长度可为，尤其是10至20、21至30、31至40、41至50、51至60、61至70、71至80、80至100、100至150、150至500或大于500个核苷酸。
本文所用的术语“核酸”是指任何长度(例如，尤其是大于约2个碱基，大于约10个碱基，大于约100个碱基，大于约500个碱基，大于约1,000个碱基，至多约10,000个或更多个碱基)的聚合物，其由核苷酸(例如，脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或两者，并且可包括一个或多个非天然核苷酸)组成，其可酶促或合成产生，并且可以序列特异性方式以与两种天然存在的核苷酸(例如，可参与Watson-Crick碱基配对相互作用)类似的方式与互补核苷酸杂交。天然存在的核苷酸包括鸟苷和2'-脱氧鸟苷、胞苷和2'-脱氧胞苷、腺苷和2'-脱氧腺苷、胸苷和尿苷(分别为G、dG、C、dC、A、dA和T、U)。非天然核苷酸包括Z和P核苷酸。
核酸可以单链或双链形式存在。双链核酸具有核酸的两条互补链(在本文中可称为“第一”链和“第二”链或某些其它任意命名)。第一和第二链是不同的分子，并且作为第一或第二链的链的分配是任意的，并且不暗示任何特定的取向、功能或结构。几个示例性哺乳动物染色体区域(例如，BAC、装配体、染色体等)的第一链的核苷酸序列以及许多病原体是已知的，并且可在例如NCBI的Genbank数据库中找到。区域的第二链与该区域互补。
本文使用的术语“脱氧核糖核酸”和“DNA”是指主要或仅由脱氧核糖核苷酸组成的核酸，并且可包括非天然核苷酸(包括Z和P核苷酸)。
本文使用的术语“核糖核酸”和“RNA”是指主要或仅由核糖核苷酸组成的核酸，并且可包括非天然核苷酸(包括Z和P核苷酸)。
“TC化学”或“TC RNA”或“TC亚酰胺”是指使用通过硫羰氨基甲酸酯保护基团在2'-羟基部分上经保护的RNA单体核苷酸前体来合成未经修饰的RNA或经修饰的RNA(包含一种或多种经修饰的核苷酸)的组合物和方法，并述于Dellinger et al.,J.Am.Chem.Soc.2011,133,11540；美国专利8,202,983；和美国专利申请US 13/485,592，通过引用的方式将其内容整体并入本文。
“核苷酸间键”或“核苷酸键”是指两个核苷部分之间的化学键，诸如在自然界中发现的核酸中的磷酸二酯键连接或从核酸和核酸类似物合成领域公知的连接。核苷酸间键可包括磷基或亚磷酸酯基，并且可包括其中磷基或亚磷酸酯基的一个或多个氧原子被取代基或保护基团修饰或被另一个原子(例如硫原子，或单烷基氨基或二烷基氨基的氮原子)替代的连接。
本文所用的短语“保护基团”是指防止分子的一部分经历特定化学反应，但在该反应完成后可从分子中除去的物种。“保护基团”以常规化学意义用作在期望反应的某些条件下可逆地赋予非反应性官能团的基团，如在例如Greene,et al.,"Protective Groups inOrganic Synthesis,"John Wiley and Sons,Second Edition,1991中所教导。在期望反应之后，可除去保护基团以使经保护的官能团脱保护。在一般实践中，保护基团应当在不降解相当大比例的被合成分子的条件下是可除去的(因此是不稳定的)。与保护基团相反，“封端基团”永久地结合分子的区段以防止该区段的任何进一步的化学转化。应当注意，由保护基团保护的官能基可为或可不为所谓的保护基团的一部分。
本文所用的术语“卤素”是指氟、氯、溴或碘。
本文所用的术语“连接”是指与两个其它部分键合的第一部分，其中两个其它部分通过第一部分连接。典型的连接包括醚(-O-)、氧代(-C(O)-)、氨基(-NH-)、酰氨基(-N-C(O)-)、硫基(-S-)、磷基(-P-)、酯(-O-C(O)-)。
本文所用的术语“官能化”是指这样一种方法：由此材料被修饰为具有与材料结合的特定部分，例如分子或底物被修饰以具有特定部分；已被如此修饰的材料(例如分子或载体)被称为官能化材料(例如官能化分子或官能化载体)。
用于描述化学结构、基团或部分的术语“经取代的”是指包含一个或多个取代基的结构、基团或部分。如本文所用，在第一基团“取代有”第二基团的情况下，第二基团附接至第一基团，由此第一基团的部分(通常为氢)被第二基团替代。例如，当烷基具有“R”基团且R为氢时，认为烷基在标记位置是未经取代的，而当氢被卤素替代时，认为其在该位置被卤素取代。
本文所用的术语“取代基”是指取代化学结构中的另一个基团的基团。典型的取代基包括非氢原子(例如卤素)、官能团(诸如但不限于氨基、巯基、羰基、羟基、烷氧基、羧基、甲硅烷基、甲硅烷基氧基、磷酸酯基等)、烃基和取代有一个或多个杂原子的烃基。取代基的实例包括烷基、低级烷基、芳基、芳烷基、低级烷氧基、硫代烷基、羟基、硫基、巯基、氨基、亚氨基、卤素、氰基、硝基、亚硝基、叠氮基、羧基、硫醚、砜、亚砜(sulfoxy)、磷酰基、甲硅烷基、甲硅烷氧基、硼酰基和经修饰的低级烷基。
“任选的”或“任选地”意指随后描述的情况可发生或可不发生，使得描述包括该情况发生的情形和该情况不发生的情形。例如，短语“任选取代的”意指非氢取代基可存在或可不存在，因此，描述包括其中存在非氢取代基的结构和其中不存在非氢取代基的结构。在本文的各个点，部分可被描述为存在零或更多次：这等同于所述部分是任选的，并且包括其中所述部分存在的实施方案和所述部分不存在的实施方案。如果任选的部分不存在(在结构中存在0次)，则被描述为通过任选的部分连接的相邻基团彼此直接连接。类似地，部分可被描述为(1)连接两个相邻基团的基团，或(2)连接两个相邻基团的键：这等同于所述部分是任选的，并且包括其中所述部分存在的实施方案和其中所述部分不存在的实施方案。如果任选的部分不存在(在结构中存在0次)，则被描述为通过任选的部分连接的相邻基团彼此直接连接。
“分离的”或“纯化的”通常是指分离物质(化合物、多核苷酸、蛋白质、多肽、多肽、染色体等)，使得物质是其所在的样品的主要部分(不包括溶剂)，即大于通常在其天然或未分离状态下发现的物质。通常，当物质占样品的至少约1％、至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约50％、至少约50％、优选至少约80％或更优选至少约90％(不包括溶剂)，物质为样品的主要部分。例如，分离的RNA的样品通常包括至少约5％的总RNA，其中在本文中将百分比计算为样品中总RNA的质量(例如，以微克计)除以样品中总RNA+其它成分(不包括溶剂)的总和的质量(例如，以微克计)。纯化感兴趣的多核苷酸和多肽的技术是本领域公知的，并且包括例如凝胶电泳、离子交换色谱、亲和色谱、流式分选和根据密度沉降。在典型的实施方案中，一种或多种核苷酸组合物呈分离的形式；更典型地，所有三种核苷酸组合物在用于本发明方法之前以分离的形式获得。
如本文所用，(Cx-Cy)通常是指具有x至y个(包括在内)碳原子的基团。因此，例如，C1-C6是指具有1、2、3、4、5或6个碳原子的基团，其包括C1-C2、C1-C3、C1-C4、C1-C5、C2-C3、C2-C4、C2-C5、C2-C6和所有类似的组合。(C1-C20)等类似地包括1至20个(包括在内)碳原子的各种组合，诸如(C1-C6)、(C1-C12)和(C3-C12)。
术语“吸电子基团”是指具有吸引来自相邻原子的价电子的趋势的部分(即，取代基相对于相邻原子是电负性的)。吸电子能力的水平的定量通过Hammettσ常数给出。这种众所周知的常数述于许多参考文献中，例如March,Advanced Organic Chemistry,pages251-59,McGraw Hill Book Company,New York,(1977)。吸电子基团包括硝基、酰基、甲酰基、磺酰基、三氟甲基、氰基、氯化物等。
术语“给电子基团”是指具有排斥来自相邻原子的价电子的趋势的部分(即，取代基相对于相邻原子具有较小的电负性)。给电子基团包括氨基、甲氧基、烷基(包括可具有直链或支链结构的C1-6烷基)，C4-9环烷基等。
本文所用的术语“共价的”或“共价地”是指原子之间的化学成键相互作用的性质。共价键是涉及在原子之间共享电子对的化学键。当它们共享电子时，原子之间的吸引力和排斥力的稳定平衡被称为共价键。电子的共享允许每个原子获得对应于稳定电子构型的完全外层的等价物。共价键包括各种相互作用，例如σ-键、π-键、金属-金属键、抓氢相互作用(agnostic interaction)和三中心双电子键。
本文所用的术语“非共价的”或“非共价地”是指原子之间的化学成键相互作用的性质。非共价键是一类不涉及电子对共享，而涉及电磁相互作用的更分散的变化的化学键。有四种通常提到的非共价相互作用类型：氢键、离子键、范德华力和疏水相互作用。
本文所用的术语“纯化的”或“纯化”是指从样品中除去组分(例如，污染物)。
“1H NMR”和“31P NMR”分别是指本领域已知的质子(H)核磁共振和磷(P)核磁共振。
具体实施方式
本文所述的实施方案详述了能够以简单、洁净和位点特异性方式以高产率合成具有一个或多个Z核苷酸的寡核苷酸的独特方法学和保护基团。具体而言，所述方法对寡核苷酸产物几乎没有或不产生损伤，并且不修饰Z核苷酸本身。本发明提供了用于有效合成其中掺入至少一个Z核苷酸的长寡核苷酸的可行保护策略。
为了扩展遗传密码并克服由标准核酸中有限数目的天然存在的核苷酸设定的限制，开发了“Z-P”系统，其中Z核苷酸可通过3个氢键与合成性核苷酸P配对。为了使所提出的非天然碱基对用作扩展的遗传密码的组分，允许将非天然核苷酸简单、洁净和位点特异性掺入DNA和RNA分子的方法学是必需的。
具有确定化学性质的期望长度和序列的寡核苷酸合成是实验室研究和分子生物学和医学中的应用的基本标准。寡核苷酸的化学合成提供了对期望序列的定制寡核苷酸的快速和便宜的获取。为了防止不期望的副反应，选择核苷中存在的官能团必须通过附接保护基团而变得不起反应或“经保护”。然后在特定合成步骤完成时或在寡核苷酸链装配结束时除去保护基团以产生期望的寡核苷酸。
寡核苷酸的化学合成通常使用氨代亚磷酸酯(phosphoramidite)方法和衍生自经保护的2'-脱氧核苷(dA、dC、dG和T)、核糖核苷(A、C、G和U)或化学修饰的核苷(例如2'-O-甲基、2'-F、2'-MOE(甲氧基乙氧基)、LNA、UNA等)的氨代亚磷酸酯构造块作为固相合成在3'至5'方向上进行。为了合成寡核苷酸，构造块以期望的顺序与生长的寡核苷酸链偶联。一旦链装配完成，产物从固相释放到溶液中，脱保护并收集(美国专利4,415,732；McBride,etal.1983 Tetrahedron Letters 24:245-248；Sinha,et al.1984 Nuc.Acids Res.12:4539-4557.)。
例如，3'位可被R3保护，例如(β-氰基乙基)-N,N-二异丙基氨代亚磷酸酯或甲基-N,N-二异丙基氨代亚磷酸酯。3'位置的羟基可通过以下通式的氨代亚磷酸酯官能化：R3:P(NQ2)-OR6
其中Q是直链的、支链的、饱和的或不饱和的烷基或芳基，优选异丙基。可选择地，NQ2可形成任选地取代有烷基R基团的吡咯烷环，R6为甲基或β-氰基乙基。优选地，R3为(β-氰基乙基)-N,N-二异丙基氨代亚磷酸酯。
5'位可被R5保护基保护，诸如4,4'-二甲氧基三苯甲基(DMT)、单甲氧基三苯甲基(MMT)、三甲氧基三苯甲基(TMT)、三苯甲基(Tr)或其经取代的衍生物或9-苯基呫吨基(Px)。可选择地，在需要以相反方向上合成寡核苷酸的情况下，5'OH可用R3官能化且3'OH用R5保护。当合成含有一个或多个Z核糖核苷酸的寡核苷酸时，2'位的羟基可被R2保护，诸如OR2，例如叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)；硫代氨基甲酸酯基团，诸如-1,1-二氧代-硫吗啉-4-硫代羧酸酯(TC)；原酸酯基团，诸如二(2-乙酰氧基乙氧基)甲基(ACE)、三异丙基甲硅烷基氧基甲基(TOM)、特戊酰基氧基甲基(PivOM)、1-(2-氰基乙氧基)乙基(CEE)或2-氰基乙氧基甲基(CEM)；酯基-CO-R；或CH2-CH═CH2、-CH2-O-CH2-苯基-NO2、-CH2-O-CH2-CH2-SO2-芳基、-CH2-S-S-X或-SiR3，其中R独立地选自直链的、支链的、饱和的、不饱和的、经取代的或未经取代的：烷基、芳基、烷芳基或芳烷基。R2还可为经取代的或未经取代的：烷基、烷氧基(例如，CH2-CH2-O-CH3)、芳基、烷芳基或芳烷基。可选择地，R2可替代OR2并且可为H、OCH3或卤素。
在寡核苷酸合成中用于Z核苷酸碱基(在吡啶酮杂环的2位)的几个报道的保护基之一是对硝基苯基乙基(NPE)保护基，如下面的结构所示。
然而，广泛的实验表明，该对硝基苯基乙基保护基引起许多缺点。根据用于含有Z核苷酸的DNA的脱保护的报道的方案(Z.Yang,et al.,Nucleic Acids Research,2006,Vol.34,No.21,pages 6095–6101)，脱保护/裂解以在1M(15％)1,8-二氮杂二环[5,4,0]十一碳-7-烯(DBU)中在室温过夜除去NPE保护基起始。然后，为了将其它保护基团从寡核苷酸脱保护，将粗样品在乙二胺(EDA)中进行5小时处理以完成脱保护。NPE去除是必要的，以防止NPE的EDA取代。Yang等人发现DBU处理引起RNA序列的快速降解。
因此，报道的保护策略产生显著受损的寡核苷酸产物，这又导致非常低的期望寡核苷酸的产率。此外，产物中的Z核苷酸经常由于EDA取代而被修饰。
简言之，目前没有用于有效合成掺入Z核苷酸的寡核苷酸的可行保护策略，其严重限制Z-P非天然碱基对的效用。
本文描述的实施方案提供了用于可靠合成长度大于由常规技术产生的核酸分子的核酸分子的新颖保护基团和方法学，同时实现可接受的纯度和产率。
如本文所述，保护基“AcOM”(即，乙酰基-氧基-甲基，如下所示)产生意想不到的非常高的寡核苷酸合成的产率以及非常洁净的脱保护反应，导致没有RNA的降解或Z碱基上的碱基取代。AcOM能够合成长的寡核苷酸，特别是DNA和RNA(包括Z核苷酸)，特别是合成的长RNA。
其中R表示经保护的核苷酸分子的其余部分。
尽管AcOM在含有Z核苷酸的寡核苷酸的合成中对于保护6-氨基-3-β-D-呋喃核糖基-5-硝基-2(1H)-吡啶酮最有效，但是如本文所述，异丁酰氧基基甲基(iBuOM)也有效，虽然有一定程度的EDA取代。可选择的保护基团或官能团也可用于将乙酰基置于吡啶杂环上的6-氨基上。例如，可使用其它吸电子基团替代硝基，如下文一般结构所示：
其中
R1为吸电子基团，包括但不限于硝基NO2和氰基CN、F、C1-C4全氟烷基；
A为O或S；
R为式N＝C(R’)NR’2或N(R’)COR’或N(COR’)2的经保护的伯氨基或仲氨基，其中每个R’独立地选自H，直链的、支链的、饱和的或不饱和的烷基、芳基、烷芳基和芳烷基；或者其中R为式N＝CR’NR’2的经保护的氨基，其中NR’2连接形成5-8元环其中所述环可含有选自O或S的杂原子；且
X、Y和Z中的每一个独立地为H、卤素或C1-C3烷基，其中X、Y和Z中的两个或更多个可一起形成5-8元饱和的、不饱和的或芳基环，例如，如以下示例性结构(r)至(u)中所示的苯基：
其中，例如，R可为式N＝C(R’)NR’2的经保护的氨基，或者如以下示例性结构(v)至(z)所示，R可为式N(R’)COR’或N(COR’)2的经保护的氨基。
所公开的方法学的实施方案的另一个优点是脱保护为在寡核苷酸合成结束时进行的一步法，以从固体载体裂解寡核苷酸并除去所有保护基团。与其中脱保护是两步方法(例如，如上文Yang等人所述，通过DBU处理初步除去NPE，随后用EDA进行脱保护)的程序相比，本文所述的方法的实施方案在单一步骤中进行脱保护，例如当R2为H、OCH3、F、TC或特戊酰氧基甲基(PivOM)时的单一碱基处理。
一方面，本发明大体涉及具有结构式(I)的化合物：
其中
R1为NO2、CN、F或C1-C4全氟烷基；
A为O或S；
R2为H、卤素、O-甲基或OR2’，其中R2’为第一保护基团；
R3为第二保护基团或氨代亚磷酸酯；
R5为第三保护基团；且
R式N＝C(R’)NR’2或N(R’)COR’或N(COR’)2的经保护的伯氨基或仲氨基，其中每个R’独立地选自H，直链的、支链的、饱和的或不饱和的烷基、芳基、烷芳基和芳烷基；或者其中R为式N＝CR’NR’2的经保护的氨基，其中NR’2可连接形成5-8元环，其中所述环可含有选自O或S的杂原子。
在某些实施方案中，R2为H。
在某些实施方案中，R2为OR2’。在某些实施方案中，R2’为1,1-二氧代-硫吗啉-4-硫代羧酸酯(TC)。在某些实施方案中，R2’为叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)、三异丙基甲硅烷基氧基甲基(TOM)、二(2-乙酰氧基乙氧基)甲基(ACE)、特戊酰基氧基甲基(PivOM)、1-(2-氰基乙氧基)乙基(CEE)、2-氰基乙氧基甲基(CEM)、-CO-R”、CH2-CH＝CH2、CH2-O-CH2-苯基-NO2、CH2-S-S-R1或Si(R”)3；其中R”独立地选自直链的、支链的、饱和的或不饱和的烷基、芳基、烷芳基或芳烷基。
在某些实施方案中，R3为(β-氰基乙基)-N,N-二异丙基氨代亚磷酸酯。在某些实施方案中，R3为甲基-N,N-二异丙基氨代亚磷酸酯或(β-氰基乙基)-N-吡咯烷子基氨代亚磷酸酯。
在某些实施方案中，R5为4,4'-二甲氧基三苯甲基(DMT).在某些实施方案中，R5为单甲氧基三苯甲基(MMT)、三甲氧基三苯甲基(TMT)或9-苯基呫吨基(Px)。
在某些优选的实施方案中，R3为(β-氰基乙基)-N,N-二异丙基氨代亚磷酸酯，并且R5为DMT。
在某些优选的实施方案中，R为乙酰基，R1为NO2，A为O，R2为1,1-二氧代-硫吗啉-4-硫代羧酸酯(TC)，R3为(β-氰基乙基)-N,N-二异丙基氨代亚磷酸酯，R5为DMT，并且X、Y和Z中的每一个为H。
在某些优选的实施方案中，R为乙酰基，R1为CN，A为O，R2为1,1-二氧代-硫吗啉-4-硫代羧酸酯(TC)，R3为(β-氰基乙基)-N,N-二异丙基氨代亚磷酸酯，R5为DMT，并且X、Y和Z中的每一个为H。
在某些优选的实施方案中，R为乙酰基，R1为NO2，A为O，R2为1,1-二氧代-硫吗啉-4-硫代羧酸酯(TC)，R3为(β-氰基乙基)-N,N-二异丙基氨代亚磷酸酯，R5为DMT，X和Y中每一个为甲基，并且Z为H。
在某些优选的实施方案中，R为乙酰基，R1为CN，A为O，R2为1,1-二氧代-硫吗啉-4-硫代羧酸酯(TC)，R3为(β-氰基乙基)-N,N-二异丙基氨代亚磷酸酯，R5为DMT，X和Y中每一个为甲基，并且Z为H。
在某些优选的实施方案中，所述化合物具有以下结构式(II)或(III)：
其中R1、R2、R3、R4和R如上述针对式(I)化合物所定义。
在式(II)和(III)的化合物的某些优选实施方案中，R2为OR2’，其中R2’为具有下式的1,1-二氧代-硫吗啉-4-硫代羧酸酯(TC)保护基团：
在式(II)和(III)的化合物的某些优选实施方案中，R5为二甲氧基三苯甲基(DMT)且R3为如-P(NQ2)-OR6所定义的氨代亚磷酸酯
其中Q为直链的、支链的、饱和的或不饱和的烷基或芳基，优选异丙基。可选择地，NQ2可形成任选取代有烷基R基团的吡咯烷环。R6为甲基或β-氰基乙基。优选R3为(β-氰基乙基)-N,N-二异丙基氨代亚磷酸酯。
在某些优选的实施方案中，所述化合物具有如下所示的式(IV)：
在另一方面，本发明大体涉及寡核苷酸，其中至少一个核苷酸具有以下结构式(V)：
其中
R1为吸电子基团；
A为O或S；且
R2为1,1-二氧代-硫吗啉-4-硫代羧酸酯(TC)、叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)、三异丙基甲硅烷基氧基甲基(TOM)、二(2-乙酰氧基乙氧基)甲基(ACE)、特戊酰基氧基甲基(PivOM)、1-(2-氰基乙氧基)乙基(CEE)、2-氰基乙氧基甲基(CEM)、-CO-R”、-CH2-CH＝CH2、-CH2-O-CH2-苯基-NO2、-CH2-O-CH2-CH2-SO2-芳基、CH2-S-S-R1或-Si(R”)3；其中R”独立地选自直链的、支链的、饱和的或不饱和的烷基、芳基、烷芳基和芳烷基；
R为式N＝C(R’)NR’2或N(R’)COR’或N(COR’)2的经保护的氨基，其中每个R’独立地选自H，直链的、支链的、饱和的或不饱和的烷基、芳基、烷芳基和芳烷基；或者其中R为式N＝CR’NR’2的经保护的氨基，NR’2可连接形成5-8元环，其中所述环可含有选自O或S的杂原子；且
X、Y和Z中的每一个独立地为H、卤素或C1-C3烷基，其中X、Y和Z中的两个或更多个可一起形成5-8元饱和的、不饱和的或芳基环。
在某些实施方案中，R2为1,1-二氧代-硫吗啉-4-硫代羧酸酯(TC)。在某些实施方案中，R2为PivOM。在某些实施方案中，R2为H、OCH3或F。
在某些实施方案中，R1为NO2，R为CH3，并且X、Y和Z中的每一个为H。在某些实施方案中，R2为1,1-二氧代-硫吗啉-4-硫代羧酸酯(TC)。
在某些实施方案中，寡核苷酸中的两个或更多个(例如，2、3、4、5、10、20、50或更多个)核苷酸具有结构式(IV)。
本公开的方面包括使用一种或多种上述式I至IV的化合物合成寡核苷酸的方法。合成的寡核苷酸可为DNA、RNA或包括一个或多个非天然核苷酸的DNA和RNA的混合序列。合成的寡核苷酸的长度为约3-聚物至约1,000-聚物(例如，尤其是约5-聚物至约1,000-聚物、约10-聚物至约1,000-聚物、约20-聚物至约1,000-聚物、约3-聚物至约300-聚物、约5-聚物至约300-聚物、约10-聚物至约300-聚物、约20-聚物至约300-聚物、约3-聚物至约100-聚物、约5-聚物至约100-聚物、约10-聚物至约100-聚物、约20-聚物至约100-聚物、约3-聚物至约50-聚物、约5-聚物至约50-聚物、约10-聚物至约50-聚物、约3-聚物至约30-聚物、约10-聚物至约30-聚物)。
在另一方面，提供了用于合成寡核苷酸的方法的实施方案。所述方法包括：用乙酰基-氧基-甲基保护非天然核苷酸，将经保护的非天然核苷酸掺入核苷酸序列中；和
从掺入核苷酸序列中的非天然核苷酸中除去乙酰基-氧基-甲基。经保护的非天然核苷酸具有结构式(V)，
其中
R1为吸电子基团，
A为O或S，
R2为1,1-二氧代-硫吗啉-4-硫代羧酸酯(TC)、叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)、三异丙基甲硅烷基氧基甲基(TOM)、二(2-乙酰氧基乙氧基)甲基(ACE)、特戊酰基氧基甲基(PivOM)、1-(2-氰基乙氧基)乙基(CEE)、2-氰基乙氧基甲基(CEM)、-CO-R”、-CH2-CH＝CH2、-CH2-O-CH2-苯基-NO2、-CH2-O-CH2-CH2-SO2-芳基、CH2-S-S-R1或-Si(R”)3；其中R”独立地选自直链的、支链的、饱和的或不饱和的烷基、芳基、烷芳基和芳烷基；
R为式N＝C(R’)NR’2或N(R’)COR’或N(COR’)2的经保护的氨基，其中每个R’独立地选自H，直链的、支链的、饱和的或不饱和的烷基、芳基、烷芳基和芳烷基；或者其中R为式N＝CR’NR’2的经保护的氨基，其中NR’2连接形成5-8元环，其中所述环可含有选自O或S的杂原子；且
X、Y和Z中的每一个独立地为H、卤素或C1-C3烷基，其中X、Y和Z中的两个或更多个可一起形成5-8元饱和的、不饱和的或芳基环。
在某些实施方案中，R2为1,1-二氧代-硫吗啉-4-硫代羧酸酯(TC)。在某些实施方案中，R2为PivOM。
在某些实施方案中，R1为NO2，R为CH3，X、Y和Z中的每一个为H，并且R2为1,1-二氧代-硫吗啉-4-硫代羧酸酯(TC)。
所述寡核苷酸可为DNA、RNA或DNA和RNA的混合序列。
在某些实施方案中，除去乙酰基-氧基-甲基是与碱以一步反应完成的。在某些实施方案中，所述碱选自包含乙二胺的试剂或包含氨或甲胺或其组合的试剂。在某些实施方案中，从包括乙酰基-氧基-甲基或异丁酰基-氧基-甲基的寡核苷酸除去所有保护基团并从固体载体上裂解寡核苷酸是在与碱的一步反应中完成的。当R2为TC、H、O-甲基或F时，用于使包括乙酰基-氧基-甲基或异丁酰基-氧基-甲基的寡核苷酸脱保护并从固体载体上裂解寡核苷酸的试剂包含乙二胺。当R2为PivOM、H、O-甲基或F时，用于使包括乙酰基-氧基-甲基或异丁酰基-氧基-甲基的寡核苷酸脱保护并从固体载体上裂解寡核苷酸的试剂包含氨或甲胺。
合成的寡核苷酸的长度为约3-聚物至约1,000-聚物(例如，约5-聚物至约1,000-聚物、约10-聚物至约1,000-聚物、约20-聚物至约1,000-聚物、约3-聚物至约300-聚物、约5-聚物至约300-聚物、约10-聚物至约300-聚物、约20-聚物至约300-聚物、约3-聚物至约100-聚物、约5-聚物至约100-聚物、约10-聚物至约100-聚物、约20-聚物至约100-聚物、约3-聚物至约50-聚物、约5-聚物至约50-聚物、约10-聚物至约50-聚物、约3-聚物至约30-聚物、约10-聚物至约30-聚物)。
在另一方面，本发明大体涉及用于合成寡核苷酸的方法。所述方法包括：用具有下式的乙酰基-氧基-甲基保护核苷酸：
其中每个X独立地为H或卤素；将经保护的核苷酸化学掺入核苷酸序列中；并从掺入核苷酸序列的核苷酸中除去乙酰基-氧基-甲基。
实施例
本文公开的代表性实施例旨在帮助说明本发明，并且不旨在，也不应解释为限制本发明的范围。实际上，除了本文显示和描述的那些之外，本发明的各种修改和它们的许多进一步的实施方案，对于本领域技术人员而言，从本文件的全部内容(包括以下实施例和参考本文所引用的科学及专利文献)将变得显而易见。以下实施例含有可在其各种实施方案及其等同物中适用于本发明的实践的重要的附加信息、示例说明和指导。
制备经保护的rZ氨代亚磷酸酯的方法及其在用于核酸合成中的适用性描述于下文实施例中。在实施例1中，描述了代表性经保护的rZ核苷酸的制备。在实施例2和3中，分别测试保护基团对硝基苯基乙基(NPE)和乙酰基氧基甲基(AcOM)。实施例4描述了具有掺入的rZ核苷酸的寡核苷酸的合成，其中在合成期间使用的rZ亚酰胺具有乙酰基氧基甲基(AcOM)保护基团。
实施例1经保护的rZ氨代亚磷酸酯的制备
下面的流程图显示了化合物1至6的产生途径，其产生方法在下文描述。注意，R包括各化合物的结构a、b、c、d或e。即，例如，化合物2a具有R＝结构a，化合物2b具有R-结构b等。
化合物1：3',5'-O-(1,1,3,3-四异丙基-1,3-二硅氧烷二基)-1'-[6-乙酰氨基-5-硝基-吡啶酮]-β-D-呋喃核糖
3',5'-O-(1,1,3,3-四异丙基-1,3-二硅氧烷二基)-1'-[6-乙酰氨基-5-硝基-2-(4-硝基苯乙氧基)-吡啶酮]-β-D-呋喃核糖(经TIPDS、Ac、NPE保护的rZ)购自FirebirdBiomolecular Sciences(4g,5.66mmol)并溶于含有DBU(8.45mL,56.6mmol)的乙腈(110mL)中。将混合物搅拌过夜并通过TLC(3％MeOH:DCM)监测。当完成时，将反应混合物用无水乙酸中和，蒸发至20mL，溶于DCM中，用盐水洗涤，并用DCM反萃取。将产物干燥，溶于最小量的DCM中，上样于硅胶柱上，并使用1-2％MeOH/DCM的梯度洗脱。将产物蒸发成黄色泡沫状物，得到2.8g，88％产率化合物1。
化合物2a：3',5'-O-(1,1,3,3-四异丙基-1,3-二硅氧烷二基)-1'-[6-乙酰氨基-5-硝基-2-(特戊酰基氧基甲基)-吡啶酮]-β-D-呋喃核糖
化合物1(1.25g,2.19mmol)溶于含有二异丙基乙基胺(4.57mL,26.2mmol)的ACN(27mL)中。慢慢添加特戊酸氯甲酯(3.78mL,26.2mmol)并反应过夜。将反应混合物用10mLDCM稀释，用盐水洗涤，并用DCM反萃取两次。将产物溶于1:1己烷:二氯甲烷中，上样于硅胶柱上，并使用15-25％的乙酸乙酯/己烷梯度洗脱。将产物蒸发成澄清的油状物，得到1.2g，80％产率的化合物2a。1H NMR(CDCl3)δ:10.51(s,1H,NH),8.71(d,1H,C4),6.26,6.11(dd,2H,氧基甲基),5.00(m,1H,1’),4.24(m,1H,3’),4.1(m,2H,5’),4.0(m,1H,4’),3.94(m,1H,2’),2.57(s,3H,Ac),1.23(s,9H,Piv),1.05(m,28H,TIPDS)
化合物3a：2’-O-(1,1-二氧代-硫吗啉-4-硫代羧酸酯)-3',5'-O-(1,1,3,3-四异丙基-1,3-二硅氧烷二基)-1'-[6-乙酰氨基-5-硝基-2-(特戊酰基氧基甲基)-吡啶酮]-β-D-呋喃核糖
化合物2a(1.2g,1.75mmol)溶于10mL DCM中。向反应混合物中添加1,1’-硫代羰基二咪唑(0.374g,2.10mmol)和催化量的DMAP并搅拌过夜。反应后在C18柱上使用50-100％乙腈的梯度进行RP-HPLC 10分钟。当反应完成时，添加硫吗啉-1,1-二氧化物(0.31g,2.29mmol)并搅拌过夜。将反应混合物蒸发至干，溶于1:1DCM:己烷中，上样于硅胶柱上，并使用10-40％乙酸乙酯/己烷梯度洗脱。将产物蒸发至干，得到1.37g，91％产率的化合物3a。
化合物4a：2’-O-(1,1-二氧代-硫吗啉-4-硫代羧酸酯)-1'-[6-乙酰氨基-5-硝基-2-(特戊酰基氧基甲基)-吡啶酮]-β-D-呋喃核糖
化合物3a(1.37g,1.59mmol)溶于16mL 2-MeTHF和吡啶(1.53mL,19.1mmol)中。在冰上慢慢添加HF(70％于吡啶中,1.53mL,19.1mmol)，反应1小时，并继续在室温过夜。将反应混合物用水洗涤两次，用2-Me-THF反萃取两次，并干燥过夜，得到0.97g，97％产率的化合物4a。
化合物5a：2’-O-(1,1-二氧代-硫吗啉-4-硫代羧酸酯)-5’-O-DMTr-1'-[6-乙酰氨基-5-硝基-2-(特戊酰基氧基甲基)-吡啶酮]-β-D-呋喃核糖
化合物4a(0.97g,1.55mmol)溶于含有N-甲基吗啉(0.19mL,1.71mmol)的15mL DCM中。先后以0.7当量和0.1当量添加DMT-Cl(总计0.53g,1.55mmol)直至如通过在C18柱上使用0-100％乙腈的梯度进行RP-HPLC 10分钟监测反应完成。将反应在水中洗涤，用DCM反萃取。将产物蒸发至干，得到1.15g，80％产率的化合物5a。
化合物6a：2’-O-(1,1-二氧代-硫吗啉-4-硫代羧酸酯)-5’-O-DMTr-1'-[6-乙酰氨基-5-硝基-2-(特戊酰基氧基甲基)-吡啶酮]-3'-[(2-氰基乙基)-(N,N-二异丙基)]-氨代亚磷酸酯-β-D-呋喃核糖
化合物5a(1.15g,1.25mmol)溶于12mL DCM中。添加N-甲基吗啉(0.22mL,1.99mmol)和(2-氰基乙基)-N,N’-二异丙基氯氨代亚磷酸酯(0.41mL,1.97mmol)并搅拌1小时。将反应混合物先后用碳酸氢盐(bicarb)和盐水洗涤，用硫酸钠干燥，然后浓缩成黄色泡沫状物。产物通过用10％丙酮/己烷预平衡并用1％TEA中和的硅胶色谱纯化；用1倍柱体积的10％丙酮/己烷除去过量的TEA。将产物在最小量的DCM中添加到柱中，使用80:10:10至60:10:30己烷:丙酮:乙酸乙酯的梯度洗脱，并蒸发成淡黄色泡沫状物。1.2g，85％产率的化合物6a。31P NMR(ACN-d3)δ(PPM):149.88,148.52(非对映异构体)。1H NMR(CDCl3)δ:9.90(s,1H,NH),8.71(m,1H,C4),6.85-7.56(m,13H,DMT),6.21,6.19(m,2H,氧基甲基),5.23(m,1H,1’),4.6,4.3(m,4H,硫吗啉),4.24(m,1H,3’),4.1(m,2H,5’),4.0(m,1H,4’),3.94(m,1H,2’),4.2,3.8(m,2H,CE),3.81(s,6H,DMT),3.5(m,2H,iPr),3.2(m,4H,硫吗啉),2.7(m,2H,CE),2.57(m,3H,Ac),1.3(m,12H,iPr),1.23(m,9H,Piv)。
化合物2b：3',5'-O-(1,1,3,3-四异丙基-1,3-二硅氧烷二基)-1'-[6-乙酰氨基-5-硝基-2-(乙酰基氧基甲基)-吡啶酮]-β-D-呋喃核糖
化合物1(1g,1.75mmol)溶于含有二异丙基乙基胺(0.61mL,3.5mmol)的ACN(20mL)中。慢慢添加乙酸溴甲酯(0.34mL,3.5mmol)并反应过夜。将反应混合物用10mL DCM稀释，用盐水洗涤，并用DCM反萃取两次。将产物溶于1:1己烷:二氯甲烷中，上样于硅胶柱上，并使用10-30％乙酸乙酯/己烷梯度洗脱。将产物蒸发成澄清的油状物，得到1.1g，97％产率的化合物2b。1H NMR(CDCl3)δ:10.51(s,1H,NH),8.72(s,1H,C4),6.20,6.15(dd,2H,氧基甲基),5.02(m,1H,1’),4.26(m,1H,3’),4.2(m,2H,5’),4.0(m,1H,4’),3.96(m,1H,2’),2.52(s,3H,AcN),2.14(s,3H,AcO),1.05(m,28H,TIPDS)。
化合物3b：2’-O-(1,1-二氧代-硫吗啉-4-硫代羧酸酯)-3',5'-O-(1,1,3,3-四异丙基-1,3-二硅氧烷二基)-1'-[6-乙酰氨基-5-硝基-2-(乙酰基氧基甲基)-吡啶酮]-β-D-呋喃核糖
化合物2b(1.1g,1.71mmol)溶于10mL DCM中。向反应混合物中添加1,1’-硫代羰基二咪唑(0.365g,2.05mmol)和催化量的DMAP并搅拌过夜。反应后在C18柱上使用50-100％乙腈的梯度进行RP-HPLC 10分钟。当反应完成时，添加硫吗啉-1,1-二氧化物(0.30g,2.23mmol)并搅拌过夜。将反应混合物蒸发至干，溶于1:1DCM:己烷中，上样于硅胶柱上，并使用10-40％乙酸乙酯/己烷的梯度洗脱。将产物蒸发至干，得到1.37g，74％产率的化合物3b。
化合物4b：2’-O-(1,1-二氧代-硫吗啉-4-硫代羧酸酯)-1'-[6-乙酰氨基-5-硝基-2-(乙酰基氧基甲基)-吡啶酮]-β-D-呋喃核糖
化合物3b(1.02g,1.24mmol)溶于12mL 2-MeTHF和吡啶(1.2mL,14.9mmol)中。在冰上缓慢添加HF(70％于吡啶中,0.37mL,14.9mmol)，反应15分钟，并在室温继续6小时。反应混合物用水洗涤两次，用2-Me-THF反萃取两次，干燥过夜，得到0.7g，98％产率的化合物4b。
化合物5b：2’-O-(1,1-二氧代-硫吗啉-4-硫代羧酸酯)-5’-O-DMTr-1'-[6-乙酰氨基-5-硝基-2-(乙酰基氧基甲基)-吡啶酮]-β-D-呋喃核糖
化合物4b(0.7g,1.2mmol)溶于含有N-甲基吗啉(0.15mL,1.33mmol)的12mL DCM中。以0.7当量添加DMT-Cl(0.41g,总计1.2mmol)，然后以0.1当量添加直到反应完成，如通过RP-HPLC在C18柱上使用0-100％乙腈的梯度在10分钟内所监测。将反应混合物在水中洗涤，用DCM反萃取。将粗产物在含有1％NMM的己烷中平衡并用2倍柱体积的己烷洗涤的硅胶柱上纯化。使用10-40％乙酸乙酯/己烷的梯度洗脱产物，并干燥过夜，得到1.1g，95％产率的化合物5b。
化合物6b(2’-O-(1,1-二氧代-硫吗啉-4-硫代羧酸酯)-5’-O-DMTr-1'-[6-乙酰氨基-5-硝基-2-(乙酰基氧基甲基)-吡啶酮]-3'-[(2-氰基乙基)-(N,N-二异丙基)]-氨代亚磷酸酯-β-D-呋喃核糖)
化合物5b(1.1g,1.15mmol)溶于11mL DCM中。添加N-甲基吗啉(0.20mL,1.84mmol)和(2-氰基乙基)-N,N'-二异丙基氯氨代亚磷酸酯(0.38mL,1.72mmol)并搅拌1小时。反应混合物先后用碳酸氢盐和盐水洗涤，经硫酸钠干燥，然后浓缩成黄色泡沫状物。产物通过用10％丙酮/己烷预平衡并用1％TEA中和的硅胶色谱纯化；用1倍柱体积的10％丙酮/己烷除去过量的TEA。将产物在最小量的DCM中添加到柱中，并使用80:10:10至60:10:30己烷:丙酮:乙酸乙酯的梯度洗脱，并蒸发成淡黄色泡沫状物。0.82g，66％产率的化合物6b。31P NMR(ACN-d3)δ(PPM):149.86,148.48.1H NMR(CDCl3)δ:9.91(s,1H,NH),8.69(m,1H,C4),6.89-7.54(m,13H,DMT),6.18,5.98(dd,2H,氧基甲基),5.28(m,1H,1’)。
化合物2c：3',5'-O-(1,1,3,3-四异丙基-1,3-二硅氧烷二基)-1'-[6-乙酰氨基-5-硝基-2-(异丁酰基氧基甲基)-吡啶酮]-β-D-呋喃核糖
化合物1(1g,1.75mmol)溶于含有二异丙基乙基胺(3.66mL,21mmol)的ACN(20mL)中。慢慢添加异丁酸氯甲酯(2.65mL,21mmol)并反应过夜。将反应混合物用10mL DCM稀释，用盐水洗涤，并用DCM反萃取两次。将产物溶于1:1己烷:二氯甲烷中，上样于硅胶柱上，并使用20-30％乙酸乙酯/己烷梯度洗脱。将产物蒸发至澄清的油状物，得到0.73g，62％产率的化合物2c。1H NMR(CDCl3)δ:10.51(s,1H,NH),8.71(s,1H,C4),6.25,6.13(dd,2H,氧基甲基),5.01(m,1H,1’),4.26(m,1H,3’),4.2(m,2H,5’),4.0(m,1H,4’),3.96(m,1H,2’),2.63(m,1H,iBu),2.55(s,3H,AcN),1.2(m,6H,iBu),1.05(m,28H,TIPDS).
化合物3c：2’-O-(1,1-二氧代-硫吗啉-4-硫代羧酸酯)-3',5'-O-(1,1,3,3-四异丙基-1,3-二硅氧烷二基)-1'-[6-乙酰氨基-5-硝基-2-(异丁酰基氧基甲基)-吡啶酮]-β-D-呋喃核糖
化合物2c(0.73g,1.09mmol)溶于10mL DCM中。将1,1'-硫代羰基二咪唑(0.233g,1.3mmol)和催化量的DMAP添加至反应混合物中并搅拌48小时。反应后在C18柱上使用50-100％乙腈的梯度进行RP-HPLC 10分钟。当反应完成时，添加硫吗啉-1,1-二氧化物(0.20g,1.5mmol)并搅拌过夜。将反应混合物蒸发至干，溶解于1:1DCM:己烷中，上样于硅胶柱上，并使用10-40％乙酸乙酯/己烷梯度洗脱。将产物蒸发至干，得到0.78g，84％产率的化合物3c。
化合物4c：2’-O-(1,1-二氧代-硫吗啉-4-硫代羧酸酯)-1'-[6-乙酰氨基-5-硝基-2-(异丁酰基氧基甲基)-吡啶酮]-β-D-呋喃核糖
化合物3c(0.78g,0.92mmol)溶于9mL 2-MeTHF和吡啶(0.89mL,11.0mmol)中。在冰上慢慢添加HF(70％于吡啶中,0.28mL,11.0mmol)，反应15分钟，并在室温继续6小时。将反应混合物用水洗涤两次，用2-Me-THF反萃取两次，干燥过夜，得到0.57g，98％产率的化合物4c。
化合物5c：2’-O-(1,1-二氧代-硫吗啉-4-硫代羧酸酯)-5’-O-DMTr-1'-[6-乙酰氨基-5-硝基-2-(异丁酰基氧基甲基)-吡啶酮]-β-D-呋喃核糖
化合物4c(0.57g,0.92mmol)溶于含有N-甲基吗啉(0.11mL,1.01mmol)的9mL DCM中。以0.7当量添加DMT-Cl(0.31g,总计0.92mmol)，然后以0.1当量部分添加，直到反应完成，如通过RP-HPLC在C18柱上使用0-100％乙腈的梯度在10分钟内所监测。将反应混合物在水中洗涤，并用DCM反萃取。将粗产物在含有1％NMM的己烷中平衡并用2倍柱体积的己烷洗涤的硅胶柱上纯化。使用10-40％乙酸乙酯/己烷的梯度洗脱产物并干燥过夜，得到0.8g，87％产率的化合物5c。
化合物6c：2’-O-(1,1-二氧代-硫吗啉-4-硫代羧酸酯)-5’-O-DMTr-1'-[6-乙酰氨基-5-硝基-2-(异丁酰基氧基甲基)-吡啶酮]-3'-[(2-氰基乙基)-(N,N-二异丙基)]-氨代亚磷酸酯-β-D-呋喃核糖。
化合物5c(0.8g,0.88mmol)溶于9mL DCM中。添加N-甲基吗啉(0.16mL,1.41mmol)和(2-氰基乙基)-N,N’-二异丙基氯氨代亚磷酸酯(0.29mL,1.32mmol)并搅拌1小时。反应混合物先后用碳酸氢盐和盐水洗涤，经硫酸钠干燥，然后浓缩成黄色泡沫状物。产物通过用10％丙酮/己烷预平衡并用1％TEA中和的硅胶色谱纯化。用1倍柱体积的10％丙酮/己烷除去过量的TEA。将产物在最小量的DCM中添加到柱中，并使用80:10:10至50:10:40己烷:丙酮:乙酸乙酯的梯度洗脱，并蒸发成淡黄色泡沫状物。0.44g，40％产率化合物6c。31P NMR(ACN-d3)δ(PPM):149.79,148.42。
化合物2d：3',5'-O-(1,1,3,3-四异丙基-1,3-二硅氧烷二基)-1'-[6-乙酰氨基-5-硝基-2-(丁酰基氧基甲基)-吡啶酮]-β-D-呋喃核糖
化合物1(0.155g,0.20mmol)溶于含有二异丙基乙基胺(0.42mL,2.4mmol)的ACN(5mL)中。慢慢添加丁酸氯甲酯(0.31mL,2.4mmol)并反应过夜。将反应混合物用5mL DCM稀释，用盐水洗涤，并用DCM反萃取两次。将产物溶于1:1己烷:二氯甲烷中，上样于硅胶柱上，并使用10-30％乙酸乙酯/己烷梯度洗脱。将产物蒸发，得到0.12g，89％产率的化合物2d。1HNMR显示含有未被表征的40％污染物的两种类似产物。
化合物2e：3',5'-O-(1,1,3,3-四异丙基-1,3-二硅氧烷二基)-1'-[6-乙酰氨基-5-硝基-2-(苯甲酰基氧基甲基)-吡啶酮]-β-D-呋喃核糖
化合物1(0.07g,0.12mmol)溶于含有二异丙基乙基胺(0.38mL,2.2mmol)的ACN(5mL)中。慢慢添加苯甲酸氯甲酯(0.31mL,2.2mmol)并反应过夜。将反应混合物用10mL DCM稀释，用盐水洗涤，并用DCM反萃取两次。将产物溶于1:1己烷:二氯甲烷中，上样于硅胶柱上，并使用0-30％乙酸乙酯/己烷梯度洗脱。将产物蒸发成澄清的油状物，得到0.04g，47％产率的化合物2e。1H NMR显示两种类似的产品，包括30％具有不同未知产品的污染物。
实施例2测试作为rZ保护基团的对硝基苯基乙基(NPE)
2’-O-(1,1-二氧代-硫吗啉-4-硫代羧酸酯)-5’-O-DMTr-1'-[6-乙酰氨基-5-硝基-2-(4-硝基苯乙氧基)-吡啶酮]-3'-[(2-氰基乙基)-(N,N-二异丙基)]-氨代亚磷酸酯用于使用ABI 394合成仪在固体载体上合成RNA寡核苷酸。使用标准TC RNA合成循环和G、C、U、A制备包含5个G残基、4个C残基、7个U残基、4个A残基和在10位的单个rZ核苷酸的具有21个核苷酸的RNA测试序列。“TC”亚酰胺购自Sigma-Aldrich。需要除去NPE保护基团以防止形成如下所示的取代产物。
如图1上图所示，该取代产物，显示为在7038.04处标记为EDA sub.的峰(即，比期望的产物峰高约42质量单位)，是当仅使用标准的5小时EDA脱保护时的主要RNA产物。然后尝试两步方案(1M(15％)DBU，随后是EDA以完成脱保护和从固体载体上裂解)以将寡核苷酸完全脱保护。如图2下方两个图所示，该方案防止取代产物形成(不存在EDA sub.峰)，但引起RNA的快速降解，如在预期的RNA分子量减去核苷酸的显著峰所证实的(其为缺少G核苷酸的RNA产物的预期大小)和-94(其比预期产物小94个单位)。
测试了较低量的DBU(1.5％、3％、6％和12％)，但是没有发现在不损伤RNA的情况下完全脱保护NPE基团的浓度和暴露时间。此外，DBU引起RNA从固体载体上裂解并溶解部分经保护的寡核苷酸，导致产率显著下降。如图2所示，1.5％DBU处理18小时具有最好的脱保护，但是40％的产物在洗涤中损失，并且EDA取代仍然存在。
在含有单一rZ(NPE)修饰的93聚物RNA上测试MeCN中的较低DBU浓度(0％、0.75％和1.5％)。这导致不可行的RNA的降解，并且不能确定潜在的EDA取代(参见图3，前三图)。使用甲苯作为含有1.5％DBU的溶剂(图3，第四图)帮助保留更多的RNA，但是没有发现rZ(NPE)的脱保护的方案。
实施例3测试针对rZ的不同碱基保护基团。
分别用异丁酰基氧基甲基(iBuOM)、乙酰基氧基甲基(AcOM)和特戊酰基氧基甲基(PivOM)保护基团替代NPE合成rZ酰胺化合物(化合物6c、6b、6a)并用于合成在10位具有单个rZ核苷酸(如上所述)的21个核苷酸的RNA测试序列。图4所示的是含有iBuOM(上图)、AcOM(中间图)和PivOM(下图)的21聚物RNA的5小时EDA脱保护。产物和EDA取代产物(EDA sub.)的位置在上图中指出。PivOM保护产生最多的EDA取代，iBuOM保护允许较少，而AcOM实现完全脱保护，没有可检测的取代。
实施例4使用乙酰基氧基甲基(AcOM)作为针对rZ核苷酸的保护基团合成寡核苷酸
合成含有32个G残基、27个C残基、15个U残基、18个A残基和一个在36位的经AcOM保护的rZ碱基(化合物6b)的93聚物RNA。“TC RNA氨代亚磷酸酯”G、C、U和A购自Sigma-Aldrich。使用的合成和脱保护方案与Dellinger et al.,J.Am.Chem.Soc.(2011),133,p11540中所述相同。rZ亚酰胺如其它TC RNA亚酰胺偶联。如图5所示，在EDA中脱保护5小时后获得预期的寡核苷酸产率(参见在26490.37的产物峰)。后部峰为产物的钠和三乙胺加合物。未观察到可检测的EDA取代。
计算质量＝26491.2 实测质量＝26490.37
通过引用的方式并入
在本公开中已经参考和引用了其它文献，诸如专利、专利申请、专利公开、期刊、书籍、论文、网络内容。针对所有目的通过引用的方式将其整体并入本文。认为通过引用并入本文中但与本文中明确阐述的现有定义、陈述或其它公开材料相冲突的任何材料或其部分仅以在所并入的材料与本公开材料之间不出现冲突的程度而被并入。在冲突的情况下，冲突以有利于作为优选公开的本公开来解决。

Claims (37)

1.化合物，其具有结构式(I)：
其中
R1为NO2、CN、F或C1-C4全氟烷基；
A为O或S；
R2为H、卤素、O-甲基或OR2’，其中R2’为第一保护基团；
R3为第二保护基团或氨代亚磷酸酯；
R5为第三保护基团；
R为式N＝C(R’)NR’2或N(R’)COR’或N(COR’)2的经保护的氨基，其中每个R’独立地选自H、直链的、支链的、饱和的或不饱和的烷基、芳基、烷芳基和芳烷基；或者其中R为式N＝C(R’)NR’2的经保护的氨基，其中NR’2连接形成5-8元环，其中所述环可含有选自O或S的杂原子；且
X、Y和Z中的每一个独立地为H、卤素或C1-C3烷基，其中X、Y和Z中的两个或更多个可一起形成5-8元饱和的、不饱和的或芳基环。
2.权利要求1的化合物，其中R2为H。
3.权利要求1的化合物，其中R2为OR2’。
4.权利要求1的化合物，其中R2’为1,1-二氧代-硫吗啉-4-硫代羧酸酯(TC)。
5.权利要求3的化合物，其中R2’为叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)、三异丙基甲硅烷基氧基甲基(TOM)、二(2-乙酰氧基乙氧基)甲基(ACE)、特戊酰基氧基甲基(PivOM)、1-(2-氰基乙氧基)乙基(CEE)、2-氰基乙氧基甲基(CEM)、-CO-R”、CH2-CH＝CH2、CH2-O-CH2-苯基-NO2、CH2-O-CH2-CH2-SO2-芳基、CH2-S-S-R1、Si(R”)3；其中R”独立地选自直链的、支链的、饱和的或不饱和的烷基、芳基、烷芳基和芳烷基。
6.权利要求1的化合物，其中R3为(β-氰基乙基)-N,N-二异丙基氨代亚磷酸酯。
7.权利要求1的化合物，其中R3为甲基-N,N-二异丙基氨代亚磷酸酯或(β-氰基乙基)-N-吡咯烷子基氨代亚磷酸酯。
8.权利要求1的化合物，其中R5为4,4'-二甲氧基三苯甲基(DMT)。
9.权利要求1的化合物，其中R5为单甲氧基三苯甲基(MMT)、三甲氧基三苯甲基(TMT)或9-苯基呫吨基(Px)。
10.权利要求4的化合物，其中R3为(β-氰基乙基)-N,N-二异丙基氨代亚磷酸酯，并且R5为DMT。
11.权利要求1的化合物，其中R为甲基，R1为NO2，R2为1,1-二氧代-硫吗啉-4-硫代羧酸酯(TC)，R3为(β-氰基乙基)-N,N-二异丙基氨代亚磷酸酯，R5为DMT，A为O，并且X、Y和Z中的每一个为H。
12.权利要求1的化合物，其中R为甲基，R1为CN，R2为1,1-二氧代-硫吗啉-4-硫代羧酸酯(TC)，R3为(β-氰基乙基)-N,N-二异丙基氨代亚磷酸酯，R5为DMT，A为O，并且X、Y和Z中的每一个为H。
13.权利要求1的化合物，其中R为甲基，R1为NO2，R2为1,1-二氧代-硫吗啉-4-硫代羧酸酯(TC)，R3为(β-氰基乙基)-N,N-二异丙基氨代亚磷酸酯，R5为DMT，A为O，X和Y中每一个为甲基，并且Z为H。
14.权利要求1的化合物，其中R为甲基，R1为CN，R2为1,1-二氧代-硫吗啉-4-硫代羧酸酯(TC)，R3为(β-氰基乙基)-N,N-二异丙基氨代亚磷酸酯，R5为DMT，A为O，X和Y中每一个为甲基，并且Z为H。
15.寡核苷酸，其中至少一个核苷酸具有以下结构式：
其中
R1为吸电子基团；
A为O或S；
R2为1,1-二氧代-硫吗啉-4-硫代羧酸酯(TC)、叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)、三异丙基甲硅烷基氧基甲基(TOM)、二(2-乙酰氧基乙氧基)甲基(ACE)、特戊酰基氧基甲基(PivOM)、1-(2-氰基乙氧基)乙基(CEE)、2-氰基乙氧基甲基(CEM)、-CO-R”、-CH2-CH＝CH2、-CH2-O-CH2-苯基-NO2、-CH2-O-CH2-CH2-SO2-芳基、CH2-S-S-R1或-Si(R”)3，其中R”独立地选自直链的、支链的、饱和的或不饱和的烷基、芳基、烷芳基和芳烷基；
R为式N＝C(R’)NR’2或N(R’)COR’或N(COR’)2的经保护的氨基，其中每个R’独立地选自H、直链的、支链的、饱和的或不饱和的烷基、芳基、烷芳基和芳烷基；或者其中R为式N＝C(R’)NR’2的经保护的氨基，其中NR’2连接形成5-8元环，其中所述环可含有选自O或S的杂原子；且
X、Y和Z中的每一个独立地为H、卤素或C1-C3烷基，其中X、Y和Z中的两个或更多个可一起形成5-8元饱和的、不饱和的或芳基环。
16.权利要求15的寡核苷酸，其中R2为1,1-二氧代-硫吗啉-4-硫代羧酸酯(TC)。
17.权利要求15的寡核苷酸，其中R2为特戊酰基氧基甲基(PivOM)。
18.权利要求15的寡核苷酸，其中R1为NO2，R为CH3，A为O，并且X、Y和Z中的每一个为H。
19.权利要求18的寡核苷酸，其中R2为1,1-二氧代-硫吗啉-4-硫代羧酸酯(TC)。
20.使用权利要求1-14中任一项的化合物合成寡核苷酸的方法。
21.权利要求20的方法，其中所述寡核苷酸为DNA。
22.权利要求20的方法，其中所述寡核苷酸为RNA。
23.权利要求20的方法，其中所述寡核苷酸为DNA和RNA的混合序列。
24.权利要求20的方法，其中所述合成的寡核苷酸的长度为约3-聚物至约1,000-聚物。
25.权利要求24的方法，其中所述合成的寡核苷酸的长度为约100-聚物至约300-聚物。
26.用于合成寡核苷酸的方法，所述方法包括：
用乙酰基-氧基-甲基保护非天然核苷酸；
在固体载体上将经保护的非天然核苷酸掺入核苷酸序列中；和
从掺入核苷酸序列中的非天然核苷酸中移去乙酰基-氧基-甲基，
其中所述经保护的非天然核苷酸具有结构式(V)，
其中
R1为吸电子基团；
A为O或S；
R2为1,1-二氧代-硫吗啉-4-硫代羧酸酯(TC)、叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)、三异丙基甲硅烷基氧基甲基(TOM)、二(2-乙酰氧基乙氧基)甲基(ACE)、特戊酰基氧基甲基(PivOM)、1-(2-氰基乙氧基)乙基(CEE)、2-氰基乙氧基甲基(CEM)、-CO-R”、-CH2-CH＝CH2、-CH2-O-CH2-苯基-NO2、-CH2-O-CH2-CH2-SO2-芳基、CH2-S-S-R1或-Si(R”)3，其中R”独立地选自直链的、支链的、饱和的或不饱和的烷基、芳基、烷芳基和芳烷基；且
R为式N＝C(R’)NR’2或N(R’)COR’或N(COR’)2的经保护的氨基，其中每个R’独立地选自H、直链的、支链的、饱和的或不饱和的烷基、芳基、烷芳基和芳烷基，或者其中R为式N＝CR’NR’2的经保护的氨基，NR’2连接形成5-8元环，其中所述环可含有选自O或S的杂原子；
X、Y和Z中的每一个独立地为H、卤素或C1-C3烷基，其中X、Y和Z中的两个或更多个可一起形成5-8元饱和的、不饱和的或芳基环。
27.权利要求26的方法，其中R2为1,1-二氧代-硫吗啉-4-硫代羧酸酯(TC)。
28.权利要求26的方法，其中R2为特戊酰基氧基甲基(PivOM)。
29.权利要求26的方法，其中R1为NO2，R为CH3，A为O，并且X、Y和Z中的每一个为H。
30.权利要求29的方法，其中R2为1,1-二氧代-硫吗啉-4-硫代羧酸酯(TC)。
31.权利要求26的方法，其中所述寡核苷酸为DNA。
32.权利要求26的方法，其中所述寡核苷酸为RNA。
33.权利要求26的方法，其中所述合成的寡核苷酸的长度为约3-聚物至约1,000-聚物。
34.权利要求26的方法，其中移去乙酰基-氧基-甲基是与碱以一步反应完成的。
35.权利要求34的方法，其中所述碱选自乙二胺和氨。
36.权利要求34的方法，其中R2为TC、H、F或O-甲基且其中使用包含乙二胺的试剂以单一步骤将所述寡核苷酸脱保护并从载体上裂解。
37.权利要求34的方法，其中R2为特戊酰基氧基甲基(PivOM)、H、F或O-甲基且其中使用包含氨的试剂以单一步骤将所述寡核苷酸脱保护并从载体上裂解。
CN201580030951.6A 2014-06-10 2015-05-28 用于“z核苷酸”的保护基团及其方法 Active CN106459133B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201462010402P 2014-06-10 2014-06-10
US62/010,402 2014-06-10
PCT/US2015/033032 WO2015191303A2 (en) 2014-06-10 2015-05-28 Protecting groups for "z nucleotide" and methods thereof

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN106459133A true CN106459133A (zh) 2017-02-22
CN106459133B CN106459133B (zh) 2019-12-06

Family

ID=54769045

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201580030951.6A Active CN106459133B (zh) 2014-06-10 2015-05-28 用于“z核苷酸”的保护基团及其方法

Country Status (4)

Country Link
US (1) US9802975B2 (zh)
EP (1) EP3154996B1 (zh)
CN (1) CN106459133B (zh)
WO (1) WO2015191303A2 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115038790A (zh) * 2019-11-27 2022-09-09 阿尔尼拉姆医药品有限公司 3’-rna寡核苷酸的合成

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SG10201911357VA (en) 2016-03-14 2020-01-30 Somalogic Inc Compounds and methods for the synthesis of 5-(n-protected-tryptaminocarboxyamide)-2'-deoxyuridine phosphoramidate for incorporation into a nucleic sequence

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1498221A (zh) * 2001-01-22 2004-05-19 作为依赖于rna的rna病毒聚合酶的抑制剂的核苷衍生物
EP1027364B1 (en) * 1997-11-07 2004-12-08 Isis Pharmaceuticals, Inc. Pyrimidine derivatives for labeled binding partners
CN1678326A (zh) * 2002-06-28 2005-10-05 埃迪尼克斯(开曼)有限公司 用于治疗黄病毒感染的2'－c－甲基－3'－o－l－缬氨酸酯核糖呋喃基胞苷
US8389703B1 (en) * 2004-08-28 2013-03-05 Steven A. Benner Ribonucleoside analogs with novel hydrogen bonding patterns

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4415732A (en) 1981-03-27 1983-11-15 University Patents, Inc. Phosphoramidite compounds and processes
US6028183A (en) 1997-11-07 2000-02-22 Gilead Sciences, Inc. Pyrimidine derivatives and oligonucleotides containing same
US7105499B2 (en) * 2001-01-22 2006-09-12 Merck & Co., Inc. Nucleoside derivatives as inhibitors of RNA-dependent RNA viral polymerase
CA2509687C (en) * 2002-12-12 2012-08-14 Idenix (Cayman) Limited Process for the production of 2'-branched nucleosides
US8586303B1 (en) 2007-01-22 2013-11-19 Steven Albert Benner In vitro selection with expanded genetic alphabets
US8202983B2 (en) 2007-05-10 2012-06-19 Agilent Technologies, Inc. Thiocarbon-protecting groups for RNA synthesis
WO2009154733A2 (en) 2008-06-17 2009-12-23 Steven Albert Benner Polymerase incorporation of non-standard nucleotides
CA2879683C (en) 2012-08-03 2023-02-14 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Modified rnai agents

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1027364B1 (en) * 1997-11-07 2004-12-08 Isis Pharmaceuticals, Inc. Pyrimidine derivatives for labeled binding partners
CN1498221A (zh) * 2001-01-22 2004-05-19 作为依赖于rna的rna病毒聚合酶的抑制剂的核苷衍生物
CN1678326A (zh) * 2002-06-28 2005-10-05 埃迪尼克斯(开曼)有限公司 用于治疗黄病毒感染的2'－c－甲基－3'－o－l－缬氨酸酯核糖呋喃基胞苷
US8389703B1 (en) * 2004-08-28 2013-03-05 Steven A. Benner Ribonucleoside analogs with novel hydrogen bonding patterns

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHUNG-SHAN YU，等: "Syntheses of 5-Fluoro and (E)-5-(2-Fluorovinyl) Arabinosyl Uridine Analogues as Potential Probes for the HSV-1 Thymidine Kinase Gene", 《SYNTHESIS》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115038790A (zh) * 2019-11-27 2022-09-09 阿尔尼拉姆医药品有限公司 3’-rna寡核苷酸的合成

Also Published As

Publication number Publication date
US20150353594A1 (en) 2015-12-10
EP3154996B1 (en) 2020-03-11
EP3154996A2 (en) 2017-04-19
EP3154996A4 (en) 2017-12-27
WO2015191303A3 (en) 2016-02-04
US9802975B2 (en) 2017-10-31
CN106459133B (zh) 2019-12-06
WO2015191303A2 (en) 2015-12-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102639552B (zh) 含有O-缩醛乙酰丙酸酯基团(O-acetal levulinyl ester)的RNA单体及其在RNA微阵列中的应用
US10131908B2 (en) 5′ phosphate mimics
Yang et al. Artificially expanded genetic information system: a new base pair with an alternative hydrogen bonding pattern
KR101995521B1 (ko) 역방향 합성 ｒｎａ를 위한 포스포아미디트
EP2694524B1 (en) 2'-o-aminooxymethyl nucleoside derivatives for use in the synthesis and modification of nucleosides, nucleotides and oligonucleotides
EP2277886B1 (en) The use of n-alkyl imidazole for sulfurization of oligonucleotides with an acetyl disulfide
Mayer The chemical biology of nucleic acids
KR102375480B1 (ko) 인 보호기 및 이의 제조 방법 및 용도
WO2010110775A1 (en) Reagents for reversibly terminating primer extension
EP1409497A2 (en) Method for preparation of lna phosphoramidites
KR102190852B1 (ko) 변형된 커플링 프로토콜을 이용하는 올리고머 화합물의 제조 방법
AU716391B2 (en) Solid phase synthesis of oligonucleotides
Horiba et al. Synthesis of scpBNA-mC,-A, and-G monomers and evaluation of the binding affinities of scpBNA-modified oligonucleotides toward complementary ssRNA and ssDNA
CN106459133A (zh) 用于“z核苷酸”的保护基团及其方法
Puffer et al. 2′-Methylseleno-modified oligoribonucleotides for X-ray crystallography synthesized by the ACE RNA solid-phase approach
US20220275019A1 (en) Hydrocinnamoyl protected riboguanosine phosphoramidites for decreasing depyrimidination from alkyl amine exposure during final deprotection
WO1995031470A2 (en) Antisense inhibitors of gene expression
CA2078256A1 (en) Synthesis of sulfide-linked di-or oligonucleotide analogs and incorporation into antisense dna or rna
Repkova et al. Oligoribonucleotides containing an aminoalkyl group at the N (4) atom of cytosine as precursors of new reagents for site-specific modifications of biopolymers
Dong DNA complexes containing novel aromatic residues
AU2007323809A1 (en) Methods for RNA desilylation
Roost Synthesis of a C-Deoxyribonucleoside modelled on diaminopyrimidine: Evaluation of its compatibility with the modern DNA alphabet

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant