KR101281836B1 - 포스포라미다이트 화합물 및 올리고 ｒｎａ의 제조 방법 - Google Patents

포스포라미다이트 화합물 및 올리고 ｒｎａ의 제조 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명의 목적은 올리고 RNA의 합성에 있어서 유용한 신규 포스포라미다이트 화합물을 제공하는 것이다. 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 포스포라미다이트 화합물을 제공한다.
화학식 1
Figure 112007023106609-pct00062
[식 중, BX는 보호기를 갖고 있어도 좋은 핵산 염기를 나타낸다. R1은 하기 화학식 2로 표시되는 치환기를 나타낸다.
화학식 2
Figure 112007023106609-pct00063
(식 중, R11, R12, R13은 동일하거나 또는 상이하며, 수소 또는 알콕시를 나타낸다.)
R2a, R2b는 동일하거나 또는 상이하며, 알킬을 나타내거나 또는 R2a, R2b가 인접하는 질소 원자와 함께 형성하는 5∼6원의 포화 아미노환 기를 나타낸다. 이러한 포화 아미노환 기는 질소 원자 외에 환 구성 원자로서 산소 원자 또는 황 원자를 1개 갖고 있어도 좋다. WG1, WG2는 동일하거나 또는 상이하며, 전자 흡인성 기를 나타낸다.]

Description

포스포라미다이트 화합물 및 올리고 ＲＮＡ의 제조 방법{PHOSPHORAMIDITE COMPOUND AND METHOD FOR PRODUCING OLIGO-RNA}
본 발명은 2' 위치의 수산기에 신규 보호기를 도입한 신규 포스포라미다이트 화합물 및 상기 보호기의 도입 시약에 관한 것이다.
올리고 리보핵산(올리고 RNA)은 유전자 해석의 RNA 프로브, RNA 의약품 소재(안티센스 RNA, 리보자임, RNAi를 이용한 유전자 발현 제어), 인공 효소, 앱타머로서 유용하다.
올리고 RNA의 고상 합성법이 확립된 것은 1980년대 후반이다. 최초에 보고된 것은 2' 위치 수산기의 보호기로서, tert-부틸디메틸실릴(TBDMS)기, 트리이소프로필실릴(TIPS)기를 이용한 포스포라미다이트 화합물을 사용하는 RNA의 고상 합성법이었다(비특허 문헌 1).
올리고 RNA의 화학 합성은 디옥시리보핵산(DNA)만으로 이루어지는 올리고 디옥시리보핵산(올리고 DNA)의 경우와 비교하여 주의해야하는 문제점이 많다.
우선, 2' 위치의 수산기의 보호기로서 TBDMS기를 이용하는 경우, 예컨대 3' 위치의 수산기를 포스포라미다이트화할 때에, 2' 위치의 수산기를 보호하고 있었던 TBDMS기가 3' 위치에 전위하는 부반응이 일어나는 경우가 있다.
또한, 2' 위치의 수산기의 보호기로서 TBDMS기와 같이 입체 장해가 큰 치환기를 사용하면, 3' 위치에 결합하는 인 원자 주위의 입체가 섞이기 때문에, 인터뉴클레오티드 결합을 생성하는 축합 반응의 속도가 저하되거나, 또한 올리고머화된 후, 2' 위치의 수산기의 보호기를 제거할 때에, 인터뉴클레오티드 결합의 절단이나 전위 반응이 일어날 수 있다.
상기와 같은 문제점을 극복하기 위해, 현재 보다 효율적인 올리고 RNA 합성을 행하기 위한 연구가 행해지고 있다.
2' 위치의 수산기의 보호기로서, 1-(2-시아노에톡시)에틸(CEE)기는 3' 위치와 5' 위치를 보호하는 비스규소 보호기를 탈리하는 조건(중성 조건)에 있어서, 비스규소 보호기와 동시에 탈리하는 기로서 알려져 있다(비특허 문헌 2). 이 지견으로부터, Wada는 중성 조건에 있어서 탈보호 가능한 CEE기를 2' 위치의 수산기에 도입한 포스포라미다이트 화합물을 올리고 RNA를 제조하기 위한 화합물로서 발견하였다(비특허 문헌 3, 비특허 문헌 4).
그러나, 2' 위치의 수산기에 CEE기를 도입함으로써, 새롭게 비대칭 중심이 생기기 때문에, 2' 위치의 수산기가 보호된 올리고 RNA는 부분 입체 이성체 혼합물이 된다. 따라서, 올리고 RNA 제조 과정에 있어서의 정제나 단리의 조작이 복잡해진다. 또한, 2' 위치의 산소 원자에 결합하는 탄소상에 메틸이 치환되어 있기 때문에, 3' 위치의 수산기에 결합하는 인 원자의 주위에 있어서의 입체 장해를 생각할 수 있어, 축합 효율의 저하 및 축합 반응 속도의 저하가 우려된다.
비특허 문헌 1: N. A. Usman et al., Journal American Chemical Society, Vol. 109, 7845(1987)
비특허 문헌 2: Wolfgang Pfleiderer et al., Helvetica Chimica Acta, Vol. 81, 1545(1998)
비특허 문헌 3: Takeshi Wada, BIO INDUSTRY, Vol. 21, No. 1, 17(2004)
비특허 문헌 4: T. Umemoto et al., Tetrahedron Letters, Vol. 45, 9529(2004)
발명의 개시
발명이 해결하고자 하는 과제
본 발명의 목적은, 주로 간단하며 고수율의 올리고 RNA의 합성법을 목표로 하여, 유용한 신규 포스포라미다이트 화합물을 제공하는 것에 있다. 또한, 2' 위치의 수산기에 중성 조건하에 있어서 용이하게 탈리 가능한 보호기를 도입할 수 있는 신규 에테르 화합물을 제공하는 것에 있다.
과제를 해결하기 위한 수단
본 발명자들은 예의 연구를 거듭한 결과, 상기 목적을 달성할 수 있는 화합물을 발견하여 본 발명을 완성하는 데에 이르렀다.
I. 본 발명에 따른 포스포라미다이트 화합물
본 발명으로서, 하기 화학식 1로 표시되는 포스포라미다이트 화합물(이하, 「본 발명 포스포라미다이트 화합물」이라고 함)을 들 수 있다.
화학식 1
Figure 112007023106609-pct00001
[식 중, BX는 보호기를 갖고 있어도 좋은 핵산 염기를 나타낸다.
R1은 하기 화학식 2로 표시되는 치환기를 나타낸다.
화학식 2
Figure 112007023106609-pct00002
(식 중, R11, R12, R13은 동일하거나 또는 상이하며, 수소 또는 알콕시를 나타낸다.)
R2a, R2b는 동일하거나 또는 상이하며, 알킬을 나타내거나 또는 R2a, R2b가 인접하는 질소 원자와 함께 형성하는 5∼6원의 포화 아미노환 기를 나타낸다. 이러한 포화 아미노환 기는 질소 원자 외에 환 구성 원자로서 산소 원자 또는 황 원자를 1개 갖고 있어도 좋다. WG1, WG2는 동일하거나 또는 상이하며, 전자 흡인성 기를 나타낸다.]
BX에 따른 「핵산 염기」로서는 핵산의 합성에 사용되는 것이면 특별히 제한되지 않지만, 예컨대 아데닌, 구아닌, 시토신, 우라실 또는 이들의 변형체를 들 수 있다.
핵산 염기의 「변형체」란, 핵산 염기가 임의의 치환기로 치환되어 있는 화합물을 말한다.
BX의 「변형체」에 따른 치환기로서는, 예컨대 할로겐, 아실, 알킬, 아릴알킬, 알콕시, 알콕시알킬, 히드록시, 아미노, 모노알킬아미노, 디알킬아미노, 카르복시, 시아노, 니트로를 들 수 있으며, 이들이 1∼3개 치환되어 있다.
BX에 따른 「핵산 염기」는 보호되어 있어도 좋고, 그 중에서도 아미노기를 갖는 핵산 염기, 예컨대 아데닌, 구아닌, 시토신은 아미노기가 보호되어 있는 것이 바람직하다. 이러한 「아미노기의 보호기」로서는 핵산의 보호기로서 사용되는 것이면 특별히 제한되지 않고, 구체적으로는, 예컨대 벤조일, 4-메톡시벤조일, 아세틸, 프로피오닐, 부티릴, 이소부티릴, 페닐아세틸, 페녹시아세틸, 4-tert-부틸페녹시아세틸, 4-이소프로필페녹시아세틸, (디메틸아미노)메틸렌을 들 수 있다.
R2에 따른 「포화 아미노환 기」로서는, 예컨대 피롤리딘-1-일, 피페리딘-1-일, 모르폴린-1-일 또는 티오모르폴린-1-일을 들 수 있다.
WG1, WG2에 따른 「전자 흡인성 기」로서는, 예컨대 시아노, 니트로, 알킬설포닐, 할로겐을 들 수 있다. 그 중에서도 시아노가 바람직하다.
본 발명 포스포라미다이트 화합물에 있어서의 「할로겐」으로서는, 예컨대 불소, 염소, 브롬, 요오드를 들 수 있다.
본 발명 포스포라미다이트 화합물에 있어서의 「아실」로서는, 예컨대 직쇄형 또는 분지쇄형의 탄소수 1∼6의 알카노일, 탄소수 7∼13의 아로일을 들 수 있다. 구체적으로는, 예컨대 포르밀, 아세틸, n-프로피오닐, 이소프로피오닐, n-부티릴, 이소부티릴, tert-부티릴, 발레릴, 헥사노일, 벤조일, 나프토일, 레불리닐을 들 수 있다.
본 발명 포스포라미다이트 화합물에 있어서의 「알킬」로서는, 예컨대 직쇄형 또는 분지쇄형의 탄소수 1∼5의 알킬을 들 수 있다. 구체적으로는, 예컨대 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, sec-부틸, tert-부틸, n-펜틸, 이소펜틸, 네오펜틸, tert-펜틸을 들 수 있다. 상기 알킬은 치환되어 있어도 좋고, 이러한 치환기로서는, 예컨대 할로겐, 알킬, 알콕시, 시아노, 니트로를 들 수 있으며, 이들이 1∼3개 치환되어 있다.
본 발명 포스포라미다이트 화합물에 있어서의 「아릴알킬」, 「알콕시알킬」, 「모노알킬아미노」, 「디알킬아미노」 및 「알킬설포닐」의 「알킬」 부분은 상기한 「알킬」과 동일한 것을 들 수 있다.
본 발명 포스포라미다이트 화합물에 있어서의 「알콕시」로서는, 예컨대 직쇄형 또는 분지쇄형의 탄소수 1∼4의 알콕시를 들 수 있다. 구체적으로는, 예컨대 메톡시, 에톡시, n-프로폭시, 이소프로폭시, n-부톡시, 이소부톡시, sec-부톡시, tert-부톡시를 들 수 있다. 그 중에서도 탄소수 1∼3인 것이 바람직하고, 특히 메톡시가 바람직하다.
본 발명 포스포라미다이트 화합물에 있어서의 「알콕시알킬」의 「알콕시」 부분은 상기한 「알콕시」와 동일한 것을 들 수 있다.
본 발명 포스포라미다이트 화합물에 있어서의 「아릴알킬」의 「아릴」로서는, 예컨대 탄소수 6∼12의 아릴을 들 수 있다. 구체적으로는, 예컨대 페닐, 1-나프틸, 2-나프틸, 비페닐을 들 수 있다. 상기 아릴은 치환되어 있어도 좋고, 이러한 치환기로서는, 예컨대 할로겐, 알킬, 알콕시, 시아노, 니트로를 들 수 있으며, 이들이 1∼3개 치환되어 있다.
본 발명 포스포라미다이트 화합물에 있어서의 「알킬」, 「아릴」의 치환기 인 「할로겐」, 「알킬」 및 「알콕시」로서는, 각각 상기와 동일한 것을 들 수 있다.
본 발명 포스포라미다이트 화합물은 올리고 RNA를 제조하기 위한 시약으로서 사용할 수 있다.
또한, 본 발명 포스포라미다이트 화합물은 2' 위치의 수산기에 중성 조건하에 있어서 탈리 가능한 에테르형 보호기를 갖는 포스포라미다이트 화합물이다. 또한, 2' 위치의 수산기에 도입된 기가 직선 형상의 치환기이며, 3' 위치의 수산기에 결합하는 인 원자의 주위에 있어서의 입체가 섞여 있지 않기 때문에, 종래로부터 사용되고 있는 포스포라미다이트 화합물과 비교하여, 올리고 RNA를 합성할 때, 매우 단시간에 축합 반응이 진행되어, 축합 수율이 좋다는 특징을 갖는다. 본 발명 포스포라미다이트 화합물을 사용함으로써, 올리고 DNA의 제조와 거의 동일한 수법을 이용하여 고순도 올리고 RNA의 제조가 가능해졌다.
본 발명에 있어서 「올리고 DNA」란, 디옥시리보핵산(DNA)만으로 이루어지는 올리고핵산을 말한다. 또한, 본 발명에 있어서 「올리고 RNA」란, 리보핵산(RNA) 및 디옥시리보핵산(DNA)만으로 이루어지는 올리고핵산이며, 적어도 하나는 리보핵산(RNA)를 함유하는 올리고핵산을 말한다.
본 발명 포스포라미다이트 화합물의 구체예로서는, 다음 1∼5의 화합물을 들 수 있다.
1. N6-아세틸-5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-2'-O-(2-시아노에톡시메틸)아데노신 3'-O-(2-시아노에틸 N,N-디이소프로필포스포라미다이트)
2. N2-아세틸-5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-2'-O-(2-시아노에톡시메틸)구아노신 3'-O-(2-시아노에틸 N,N-디이소프로필포스포라미다이트)
3. N2-페녹시아세틸-5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-2'-O-(2-시아노에톡시메틸)구아노신 3'-O-(2-시아노에틸 N,N-디이소프로필포스포라미다이트)
4. N4-아세틸-5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-2'-O-(2-시아노에톡시메틸)시티딘3'-O-(2-시아노에틸 N,N-디이소프로필포스포라미다이트)
5. 5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-2'-O-(2-시아노에톡시메틸)우리딘 3'-O-(2-시아노에틸 N,N-디이소프로필포스포라미다이트)
도 1은 역상 HPLC 분석에 의해 얻어진 크로마토그램을 나타낸다. 도면 중, 종축은 시간(분)을 나타내고, 횡축은 흡수 강도를 나타낸다.
발명을 실시하기 위한 최선의 형태
Ⅱ. 본 발명 포스포라미다이트 화합물의 제조 방법
본 발명 포스포라미다이트 화합물은 다음과 같이 하여 제조할 수 있다.
이하에 나타내는 제조 방법에 있어서, 원료가 반응에 영향을 미치는 치환기(예컨대 히드록시, 아미노, 카르복시)를 갖는 경우는 원료를 미리 공지의 방법에 따라 적당한 보호기로 보호한 후에 반응을 행하는 것이 일반적이다. 보호기는 반응 후에 접촉 환원, 알칼리 처리, 산 처리 등의 공지의 방법에 따라 보호기를 탈리할 수 있다.
본 발명 포스포라미다이트 화합물은 공지 화합물 또는 용이하게 제조 가능한 중간체로부터, 예컨대 다음 단계 a∼단계 h의 조작을 실시함으로써 제조할 수 있다.
이하, 상세히 설명한다.
(1) 단계 a:
하기 화학식 14로 표시되는 뉴클레오시드 유도체에 알킬화 시약을 작용시킴으로써, 중성 조건하에 있어서 탈리하는 에테르형 보호기를 2' 위치의 수산기에 도입하는, 하기 화학식 15, 15'로 표시되는 뉴클레오시드 유도체를 제조하는 단계.
Figure 112007023106609-pct00003
[식 중, BX, R1, WG1은 상기와 동일한 의미이다.]
「알킬화 시약」으로서, 예컨대 하기 화학식 13으로 표시되는 에테르 화합물을 들 수 있다.
화학식 13
Figure 112007023106609-pct00004
[식 중, L은 할로겐, 아릴티오기, 알킬설폭시드기 또는 알킬티오기를 나타낸다. WG1은 상기와 동일한 의미이다.]
L에 따른 「할로겐」, 「아릴티오기」의 「아릴」, 「알킬설폭시드기」 및 「알킬티오기」의 「알킬」로서는, 본 발명 포스포라미다이트 화합물에 있어서의 「할로겐」, 「아릴」, 「알킬」과 동일한 것을 들 수 있다.
에테르 화합물(13)의 구체예로서는 다음 1∼2의 화합물을 들 수 있다.
1. 클로로메틸 2-시아노에틸에테르
2. 2-시아노에틸 메틸티오메틸에테르
에테르 화합물(13)은 중성 조건하에 있어서 탈리 가능한 에테르형 치환기를 2' 위치의 수산기에 염기성 조건하에 있어서 도입할 수 있는 신규 알킬화 시약이며, 본 발명 포스포라미다이트 화합물을 제조하기 위한 시약으로서 유용하다.
에테르 화합물(13)은 다음에 나타내는 단계 1∼단계 4를 실시함으로써 제조할 수 있다.
단계 1:
하기 화학식 20으로 표시되는 알콜 화합물을 알킬티오메틸화하여, 하기 화학식 24로 표시되는 화합물을 제조하는 단계.
Figure 112007023106609-pct00005
[식 중, WG1은 상기와 동일한 의미이다. R3은 알킬 또는 아릴을 나타낸다.]
화합물(24)은 L이 알킬티오기인 에테르 화합물(13)이다.
R3에 따른 「알킬」로서는, 본 발명 포스포라미다이트 화합물에 있어서의 「알킬」과 동일한 것을 들 수 있다.
R3이 메틸인 경우, 알킬티오메틸화 시약으로서는, 예컨대 디메틸설폭시드, 무수 아세트산 및 아세트산의 혼합 용액을 들 수 있다. 「디메틸설폭시드」의 사용량은 화합물(20)에 대하여, 10∼200배 몰량이 적당하며, 20∼100배 몰량이 바람직하다. 「아세트산」의 사용량은 화합물(20)에 대하여, 10∼150배 몰량이 적당하며, 20∼100배 몰량이 바람직하다. 「무수 아세트산」의 사용량은 화합물(20)에 대하여 10∼150배 몰량이 적당하며, 20∼100배 몰량이 바람직하다. 반응 온도는 0℃∼100℃가 적당하다. 반응 시간은 사용하는 원료의 종류, 반응 온도 등에 따라 다르지만, 통상 1∼48시간이 적당하다.
단계 2:
화합물(24)을 할로겐화하여, 하기 화학식 25로 표시되는 화합물을 제조하는 단계.
Figure 112007023106609-pct00006
[식 중, WG1, R3은 상기와 동일한 의미이다. X2는 할로겐을 나타낸다.]
화합물(25)은 에테르 화합물(13)에 있어서의 L이 할로겐인 화합물이다.
X2에 따른 「할로겐」으로서는 본 발명 포스포라미다이트 화합물에 있어서의 「할로겐」과 동일한 것을 들 수 있다.
본 단계는 공지의 방법[예컨대 T. Benneche et al., Synthesis 762(1983)]에 의해 실시할 수 있다. 사용하는 용매는 반응에 관여하지 않으면 특별히 한정되지 않지만, 예컨대 디클로로메탄, 클로로포름, 사염화탄소, 1,2-디클로로에탄 등의 할로겐계 탄화수소를 들 수 있다. 할로겐화 시약으로서는, 예컨대 염화설푸릴, 옥시염화인을 들 수 있다. 「할로겐화 시약」의 사용량은 화합물(24)에 대하여 1∼20배 몰량이 적당하며, 1∼10배 몰량이 바람직하다. 반응 온도는 0℃∼100℃가 적당하다. 반응 시간은 사용하는 원료의 종류, 반응 온도 등에 따라 다르지만, 통상 30분∼24시간이 적당하다.
단계 3:
화합물(25)을 아릴티오화하여, 하기 화학식 25a로 표시되는 화합물을 제조하는 단계.
Figure 112007023106609-pct00007
[식 중, WG1, X2는 상기와 동일한 의미이다. R3a는 아릴을 나타낸다.]
화합물(25a)은 에테르 화합물(13)에 있어서의 L이 아릴티오기인 화합물이다.
R3a에 따른 「아릴」로서는, 본 발명 포스포라미다이트 화합물에 있어서의 「아릴」과 동일한 것을 들 수 있다.
본 단계는 공지의 방법에 의해 실시할 수 있다. 사용하는 용매는 반응에 관여하지 않으면 특별히 한정되지 않지만, 예컨대 디클로로메탄, 아세토니트릴을 들 수 있다. 아릴티오화 시약으로서는, 예컨대 티오페놀, 4-메틸벤젠티올을 들 수 있다. 「아릴티오화 시약」의 사용량은 화합물(25)에 대하여 1∼20배 몰량이 적당하며, 1∼5배 몰량이 바람직하다. 반응 온도는 0℃∼100℃가 적당하다. 반응 시간은 사용하는 원료의 종류, 반응 온도 등에 따라 다르지만, 통상 1∼48시간이 적당하다.
단계 4:
화합물(24)을 산화하여, 하기 화학식 24a로 표시되는 화합물을 제조하는 단계.
Figure 112007023106609-pct00008
[식 중, WG1, R3은 상기와 동일한 의미이다.]
화합물(24a)은 에테르 화합물(13)에 있어서의 L이 알킬설폭시드기인 화합물이다.
R3에 따른 「알킬」로서는, 본 발명 포스포라미다이트 화합물에 있어서의 「알킬」과 동일한 것을 들 수 있다.
본 단계는 공지의 방법에 의해 실시할 수 있다. 사용하는 용매는 반응에 관여하지 않으면 특별히 한정되지 않지만, 예컨대 디클로로메탄, 클로로포름, 메탄올을 들 수 있다. 산화제로서는, 예컨대 메타클로로과벤조산, 메타과요오드산염, 과산화수소를 들 수 있다. 「산화제」의 사용량은 화합물(24)에 대하여 1∼10배 몰량이 적당하며, 1∼2배 몰량이 바람직하다. 반응 온도는 0℃t∼100℃가 적당하다. 반응 시간은 사용하는 원료의 종류, 반응 온도 등에 따라 다르지만, 통상 1∼48시간이 적당하다.
「알킬화 시약」으로서, 화합물(25)을 사용하는 경우, 이하와 같이 실시할 수 있다.
본 단계는 공지의 방법에 따라 시판품으로서 입수 가능하거나 또는 문헌에 기재된 방법에 따라 합성 가능한 화합물(14)에 알킬화 시약과 염기를 작용시킴으로써 실시할 수 있다. 사용하는 용매는 반응에 관여하지 않으면 특별히 한정되지 않지만, 예컨대 디클로로메탄, 클로로포름, 사염화탄소, 1,2-디클로로에탄 등의 할로겐계 탄화수소를 들 수 있다. 「알킬화 시약」의 사용량은 화합물(14)에 대하여 1∼20배 몰량이 적당하며, 1∼10배 몰량이 바람직하다. 본 단계에 있어서, 필요에 따라 화합물(14)에 금속 시약과 염기를 작용시켜 제조되는 중간체를 경유한 후, 알킬화 시약을 작용시킬 수도 있다. 이러한 「금속 시약」으로서, 예컨대 이염화디부틸주석을 들 수 있다. 「금속 시약」의 사용량은 화합물(14)에 대하여 1∼20배 몰량이 적당하며, 1∼10배 몰량이 바람직하다. 「염기」로서는, 피리딘, 2,6-디메틸피리딘, 2,4,6-트리메틸피리딘, N-메틸이미다졸, 트리에틸아민, 트리부틸아민, N, N-디이소프로필에틸아민, 1,8-디아자비시클로[5.4.0]-7-운데센 등의 유기 염기를 들 수 있다. 「염기」의 사용량은 화합물(14)에 대하여 1∼20배 몰량이 적당하며, 1∼10배 몰량이 바람직하다. 반응 온도는 0℃∼120℃가 적당하다. 반응 시간은 사용하는 원료의 종류, 반응 온도 등에 따라 다르지만, 통상 30분∼24시간이 적당하다.
「알킬화 시약」으로서, 화합물(24) 또는 화합물(25a)을 사용하는 경우, 이하와 같이 실시할 수 있다.
본 단계는 공지의 방법[예컨대 M. Matteucci, Tetrahedron Letters, Vol. 31, 2385(1990)]에 따라 시판품으로서 입수 가능하거나 또는 문헌에 기재된 방법에 따라 합성 가능한 화합물(14)에, 알킬화 시약과 산과 황 원자에 대한 할로겐화제를 작용시킴으로써 실시할 수 있다. 「알킬화 시약」의 사용량은 화합물(14)에 대하여 1∼5배 몰량이 적당하며, 1.05∼3배 몰량이 바람직하다. 「산」으로서는, 예컨대 트리플루오로메탄설폰산, 트리플루오로메탄설폰산은, 트리메틸실릴트리플루오로메탄설포네이트를 들 수 있다. 「산」의 사용량은 화합물(14)에 대하여 0.01∼20배 몰량이 적당하며, 0.02∼10배 몰량이 바람직하다. 사용하는 용매는 반응에 관여하 지 않으면 특별히 한정되지 않지만, 예컨대 디클로로메탄, 클로로포름, 사염화탄소, 1,2-디클로로에탄, 벤젠, 톨루엔, 크실렌, 테트라히드로푸란, 아세토니트릴 또는 이들의 혼합 용매를 들 수 있다. 본 단계에 있어서 사용하는 「황 원자에 대한 할로겐화제」로서, 예컨대 N-브로모숙신이미드(NBS), N-요오드숙신이미드(NIS)를 들 수 있다. 「황 원자에 대한 할로겐화제」의 사용량은, 화합물(14)에 대하여 1∼10배 몰량이 적당하며, 1.05∼5배 몰량이 바람직하다. 반응 온도는 -78℃∼30℃가 적당하다. 반응 시간은 사용하는 원료의 종류, 반응 온도 등에 따라 다르지만, 통상 5분∼5시간이 적당하다.
「알킬화 시약」으로서, 화합물(24a)을 사용하는 경우, 이하와 같이 실시할 수 있다.
본 단계는 공지의 방법에 따라 시판품으로서 입수 가능하거나 또는 문헌에 기재된 방법에 따라 합성 가능한 화합물(14)에, 알킬화 시약과 산 무수물과 염기를 작용시킴으로써 실시할 수 있다. 「알킬화 시약」의 사용량은, 화합물(14)에 대하여 1∼5배 몰량이 적당하며, 1.05∼3배 몰량이 바람직하다. 「산 무수물」로서는, 예컨대 트리플루오로메탄설폰산 무수물, 무수 아세트산을 들 수 있다. 「산 무수물」의 사용량은 화합물(14)에 대하여 0.01∼20배 몰량이 적당하며, 0.02∼10배 몰량이 바람직하다. 염기로서는, 예컨대 테트라메틸우레아, 콜리딘을 들 수 있다. 「염기」의 사용량은 화합물(14)에 대하여 0.01∼20배 몰량이 적당하며, 0.02∼10배 몰량이 바람직하다. 사용하는 용매는 반응에 관여하지 않으면 특별히 한정되지 않지만, 예컨대 디클로로메탄, 클로로포름, 사염화탄소, 1,2-디클로로에탄 또는 이들의 혼합 용매를 들 수 있다. 반응 온도는 -78℃∼30℃가 적당하다. 반응 시간은 사용하는 원료의 종류, 반응 온도 등에 따라 다르지만, 통상 5분∼24시간이 적당하다.
(2) 단계 b:
단계 a에 있어서 제조되는 뉴클레오시드 유도체(15)를 단리 정제하는 단계.
본 단계는 단계 a에 있어서 제조되는 혼합물로부터 통상의 분리 정제 수단, 예컨대 박층 크로마토그래피, 실리카겔 크로마토그래피 등의 수단을 이용함으로써 단리 정제할 수 있다.
(3) 단계 c:
단계 b와는 별도로, 하기 화학식 16으로 표시되는 리보핵산 화합물에 알킬화 시약을 작용시킴으로써, 중성 조건하에 있어서, 탈리하는 에테르형 보호기를 2' 위치의 수산기에 도입한, 하기 화학식 17로 표시되는 리보핵산 화합물을 제조하는 단계.
Figure 112007023106609-pct00009
[식 중, BX, WG1은 상기와 동일한 의미이다.
A는 하기 화학식 18a 또는 화학식 18b로 표시되는 규소 치환기를 나타낸다.
화학식 18a
Figure 112007023106609-pct00010
화학식 18b
Figure 112007023106609-pct00011
(식 중, R6은 알킬을 나타낸다.)]
R6에 따른 「알킬」로서는, 본 발명 포스포라미다이트 화합물에 있어서의 「알킬」과 동일한 것을 들 수 있다.
「알킬화 시약」으로서는 상기와 동일한 것을 들 수 있다.
「알킬화 시약」으로서, 화합물(25)을 사용하는 경우, 이하와 같이 실시할 수 있다.
본 단계는 공지의 방법에 따라 시판품으로서 입수 가능하거나 또는 문헌에 기재된 방법에 따라 합성 가능한 화합물(16)에 알킬화 시약과 염기를 작용시킴으로써 실시할 수 있다. 사용하는 용매는 반응에 관여하지 않으면 특별히 한정되지 않지만, 예컨대 디클로로메탄, 클로로포름, 사염화탄소, 1,2-디클로로에탄 등의 할로겐계 탄화수소를 들 수 있다. 「알킬화 시약」의 사용량은 화합물(14)에 대하여 1∼20배 몰량이 적당하며, 1∼10배 몰량이 바람직하다. 본 단계에 있어서, 필요에 따라 화합물(16)에 금속 시약과 염기를 작용시켜 제조되는 중간체를 경유한 후, 알킬화 시약을 작용시킬 수도 있다. 이러한 「금속 시약」으로서, 예컨대 이염화디부틸주석, t-부틸마그네슘클로라이드를 들 수 있다. 「금속 시약」의 사용량은 화합물(16)에 대하여, 1∼20배 몰량이 적당하며 1∼10배 몰량이 바람직하다. 「염기」 로서는, 피리딘, 2,6-디메틸피리딘, 2,4,6-트리메틸피리딘, N-메틸이미다졸, 트리에틸아민, 트리부틸아민, N,N-디이소프로필에틸아민, 1,8-디아자비시클로[5.4.0]-7-운데센 등의 유기 염기를 들 수 있다. 「염기」의 사용량은 화합물(16)에 대하여 1∼20배 몰량이 적당하며, 1∼10배 몰량이 바람직하다. 반응 온도는 0℃∼120℃가 적당하다. 반응 시간은 사용하는 원료의 종류, 반응 온도 등에 따라 다르지만, 통상 30분∼24시간이 적당하다.
「알킬화 시약」으로서, 화합물(24) 또는 화합물(25a)을 사용하는 경우, 이하와 같이 실시할 수 있다.
본 단계는 공지의 방법[예컨대 M. Matteucci, Tetrahedron Letters, Vol. 31, 2385(1990)]에 따라 시판품으로서 입수 가능하거나 또는 문헌에 기재된 방법에 따라 합성 가능한 화합물(16)에 알킬화 시약과 산과 황 원자에 대한 할로겐화제를 작용시킴으로써 실시할 수 있다. 「알킬화 시약」의 사용량은 화합물(16)에 대하여 1∼5배 몰량이 적당하며, 1.05∼3배 몰량이 바람직하다. 「산」으로서는, 예컨대 트리플루오로메탄설폰산, 트리플루오로메탄설폰산은, 트리메틸실릴트리플루오로메탄설포네이트를 들 수 있다. 「산」의 사용량은 화합물(16)에 대하여 0.01∼20배 몰량이 적당하며, 0.02∼10배 몰량이 바람직하다. 사용하는 용매는 반응에 관여하지 않으면 특별히 한정되지 않지만, 예컨대 디클로로메탄, 클로로포름, 사염화탄소, 1,2-디클로로에탄, 벤젠, 톨루엔, 크실렌, 테트라히드로푸란, 아세토니트릴 또는 이들의 혼합 용매를 들 수 있다. 본 단계에 있어서 사용하는 「황 원자에 대한 할로겐화제」로서, 예컨대 N-브로모숙신이미드(NBS), N-요오드숙신이미드(NIS)를 들 수 있다. 「황 원자에 대한 할로겐화제」의 사용량은 화합물(16)에 대하여 1∼10배 몰량이 적당하며, 1.05∼5배 몰량이 바람직하다. 반응 온도는 -78℃∼30℃가 적당하다. 반응 시간은 사용하는 원료의 종류, 반응 온도 등에 따라 다르지만, 통상 5분∼5시간이 적당하다.
「알킬화 시약」으로서, 화합물(24a)을 사용하는 경우, 이하와 같이 실시할 수 있다.
본 단계는 공지의 방법에 따라 시판품으로서 입수 가능하거나 또는 문헌에 기재된 방법에 따라 합성 가능한 화합물(16)에, 알킬화 시약과 산 무수물과 염기를 작용시킴으로써 실시할 수 있다. 「알킬화 시약」의 사용량은 화합물(16)에 대하여 1∼5배 몰량이 적당하며, 1.05∼3배 몰량이 바람직하다. 「산 무수물」로서는, 예컨대 트리플루오로메탄설폰산 무수물, 무수 아세트산을 들 수 있다. 「산 무수물」의 사용량은 화합물(16)에 대하여 0.01∼20배 몰량이 적당하며, 0.02∼10배 몰량이 바람직하다. 염기로서는, 예컨대 테트라메틸우레아, 콜리딘을 들 수 있다. 「염기」의 사용량은 화합물(16)에 대하여 0.01∼20배 몰량이 적당하며, 0.02∼10배 몰량이 바람직하다. 사용하는 용매는 반응에 관여하지 않으면 특별히 한정되지 않지만, 예컨대 디클로로메탄, 클로로포름, 사염화탄소, 1,2-디클로로에탄 또는 이들의 혼합 용매를 들 수 있다. 반응 온도는 -78℃∼30℃가 적당하다. 반응 시간은 사용하는 원료의 종류, 반응 온도 등에 따라 다르지만, 통상 5분∼24시간이 적당하다.
(4) 단계 d:
단계 a∼단계 c와는 별도로, 리보핵산 화합물(16)에 디메틸설폭시드와 아세 트산과 무수 아세트산을 작용시킴으로써, 하기 화학식 19로 표시되는 리보핵산 화합물을 제조하는 단계.
Figure 112007023106609-pct00012
[식 중, A, BX는 상기와 동일한 의미이다.]
본 단계는 공지의 방법에 따라 시판품으로서 입수 가능하거나 또는 문헌에 기재된 방법에 따라 합성 가능한 리보핵산 화합물(16)에 디메틸설폭시드와 아세트산과 무수 아세트산을 작용시킴으로써 실시할 수 있다.
「디메틸설폭시드」의 사용량은 화합물(16)에 대하여 10∼200배 몰량이 적당하며, 20∼100배 몰량이 바람직하다. 「아세트산」의 사용량은 화합물(16)에 대하여 10∼150배 몰량이 적당하며, 20∼100배 몰량이 바람직하다. 「무수 아세트산」의 사용량은 화합물(16)에 대하여 10∼150배 몰량이 적당하며, 20∼100배 몰량이 바람직하다. 반응 온도는 10℃∼50℃가 적당하다. 반응 시간은 사용하는 원료의 종류, 반응 온도 등에 따라 다르지만, 통상 30분∼24시간이 적당하다.
(5) 단계 e:
단계 d에 있어서 제조되는 뉴클레오시드 유도체(19)에 하기 화학식 20으로 표시되는 알콜 화합물과 산과 황 원자에 대한 할로겐화제를 작용시킴으로써, 중성 조건하에 있어서 탈리하는 에테르형 보호기를 2' 위치의 수산기에 도입한, 하기 화학식 17로 표시되는 리보핵산 화합물을 제조하는 단계.
Figure 112007023106609-pct00013
[식 중, A, BX, WG1은 상기와 동일한 의미이다.]
본 단계는 공지의 방법에 따라 리보핵산 화합물(19)에 알콜화합물(20)과 산과 황 원자에 대한 할로겐화제를 작용시킴으로써 실시할 수 있다.
사용하는 용매는 반응에 관여하지 않으면 특별히 한정되지 않지만, 예컨대 디클로로메탄, 클로로포름, 사염화탄소, 1,2-디클로로에탄, 벤젠, 톨루엔, 크실렌, 테트라히드로푸란, 아세토니트릴 또는 이들의 혼합 용매를 들 수 있다. 「알콜 화합물(20)」의 사용량은 화합물(19)에 대하여 1∼20배 몰량이 적당하며, 1∼10배 몰량이 바람직하다. 「산」으로서는, 예컨대 트리플루오로메탄설폰산, 트리플루오로메탄설폰산은, 트리메틸실릴트리플루오로메탄설포네이트를 들 수 있다. 「황 원자에 대한 할로겐화제」로서는, 예컨대 N-브로모숙신이미드(NBS), N-요오드숙신이미드(NIS)를 들 수 있다. 「황 원자에 대한 할로겐화제」의 사용량은 화합물(19)에 대하여 0.1∼20배 몰량이 적당하며, 0.2∼10배 몰량이 바람직하다. 반응 온도는 -100℃∼20℃가 적당하다. 반응 시간은 사용하는 원료의 종류, 반응 온도 등에 따라 다르지만, 통상 5분∼12시간이 적당하다.
(6) 단계 f:
단계 c 또는 단계 e에 있어서 제조되는 리보핵산 화합물(17)의 3' 위치와 5' 위치의 수산기의 보호기를 탈리하는 반응을 행함으로써, 하기 화학식 21로 표시되 는 리보핵산 화합물을 제조하는 단계.
Figure 112007023106609-pct00014
[식 중, A, BX, WG1은 상기와 동일한 의미이다.]
본 단계는 화합물(17)을 유기 용매에 용해하고, 불소화제와 산을 임의의 혼합비의 혼합 시약으로서 반응시킴으로써 실시할 수 있다. 본 단계에 사용할 수 있는 「불소화제」로서는, 예컨대 불화암모늄, 테트라n-부틸암모늄플루오리드(TBAF), 트리에틸아민트리하이드로플루오리드, 불화수소피리딘을 들 수 있다. 「불소화제」의 사용량으로서는, 화합물(17)에 대하여 0.1∼20배 몰량이 적당하며, 0.2∼10배 몰량이 바람직하다. 반응 온도는 0℃∼120℃가 적당하다. 반응 시간은 사용하는 원료의 종류, 반응 온도 등에 따라 다르지만, 통상 30분∼24시간이 적당하다.
(7) 단계 g:
단계 f에 있어서 제조되는 리보핵산 화합물(21)의 5' 위치의 수산기에 산성 조건하에 있어서 탈리하는 보호기(R1)를 도입하는, 리보핵산 화합물(15)을 제조하는 단계.
Figure 112007023106609-pct00015
[식 중, A, BX, R1, WG1은 상기와 동일한 의미이다. X3은 할로겐을 나타낸다.]
X3에 따른 「할로겐」으로서는, 본 발명 포스포라미다이트 화합물에 있어서의 「할로겐」과 동일한 것을 들 수 있다.
본 단계는 공지의 방법에 따라 화합물(21)에 R1X3을 작용시킴으로써 실시할 수 있다. R1X3의 사용량은 화합물(21)에 대하여 1∼20배 몰량이 적당하며, 1∼10배 몰량이 바람직하다. 사용하는 용매는 반응에 관여하지 않으면 특별히 한정되지 않지만, 예컨대 아세토니트릴, 테트라히드로푸란을 들 수 있다. 「염기」로서는, 피리딘, 2,6-디메틸피리딘, 2,4,6-트리메틸피리딘, N-메틸이미다졸, 트리에틸아민, 트리부틸아민, N,N-디이소프로필에틸아민, 1,8-디아자비시클로[5.4.0]-7-운데센 등의 유기 염기를 들 수 있다. 「염기」의 사용량은 화합물(21)에 대하여 1∼20배 몰량이 적당하며, 1∼10배 몰량이 바람직하다. 반응 온도는 0℃∼120℃가 적당하다. 반응 시간은 사용하는 원료의 종류, 반응 온도 등에 따라 다르지만, 통상 30분∼24시간이 적당하다.
(8) 단계 h:
단계 b 또는 단계 f에 있어서 제조되는 뉴클레오시드 유도체(15)에 포스포라미다이트화 시약과, 필요에 따라 활성화제를 작용시킴으로써, 3' 위치의 수산기가 포스포라미다이트화된 본 발명 포스포라미다이트 화합물을 제조하는 단계.
Figure 112007023106609-pct00016
[식 중, BX, R1, R2a, R2b, WG1, WG2는 상기와 동일한 의미이다.]
「포스포라미다이트화 시약」으로서는, 예컨대 하기 화학식 22, 23으로 표시되는 화합물을 들 수 있다.
화학식 22
Figure 112007023106609-pct00017
화학식 23
Figure 112007023106609-pct00018
[식 중, R2a, R2b, WG2는 상기와 동일한 의미이다. X1은 할로겐을 나타낸다.]
X1에 따른 「할로겐」으로서는, 본 발명 포스포라미다이트 화합물에 있어서의 「할로겐」과 동일한 것을 들 수 있다.
본 단계는 화합물(15)에 포스포라미다이트 시약을 작용시켜, 3' 위치의 수산기를 포스포라미다이트화하는 반응이며, 공지의 방법에 따라 실시할 수 있다. 필요에 따라 활성화제를 사용할 수도 있다. 사용하는 용매는 반응에 관여하지 않으면 특별히 한정되지 않지만, 예컨대 아세토니트릴, 테트라히드로푸란을 들 수 있다.
「포스포라미다이트화 시약」의 사용량은 화합물(15)에 대하여 1∼20배 몰량이 적당하며, 1∼10배 몰량이 바람직하다. 「활성화제」로서는, 예컨대 1H-테트라졸, 5-에틸티오테트라졸, 4,5-디클로로이미다졸, 4,5-디시아노이미다졸, 벤조트리아졸트리플레이트, 이미다졸트리플레이트, 피리디늄트리플레이트, N,N-디이소프로필에틸아민, 2,4,6-콜리딘/N-메틸이미다졸을 들 수 있다. 「활성화제」의 사용량은 화합물(15)에 대하여 1∼20배 몰량이 적당하며, 1∼10배 몰량이 바람직하다. 반응 온도는 0℃∼120℃가 적당하다. 반응 시간은 사용하는 원료의 종류, 반응 온도 등에 따라 다르지만, 통상 30분∼24시간이 적당하다.
이와 같이 하여 제조되는 본 발명 포스포라미다이트 화합물은 그 자체 공지의 수단, 예컨대 농축, 액성 변환, 용해 분리, 용매 추출, 결정화, 재결정, 분별 증류, 크로마토그래피 등에 의해 분리 정제할 수 있다.
Ⅲ. 올리고 RNA의 제조 방법
본 발명으로서, 본 발명 포스포라미다이트 화합물을 이용하는 것을 특징으로하는, 하기 화학식 3으로 표시되는 올리고 RNA의 제조 방법을 들 수 있다.
이하에 상세하게 설명한다.
화학식 3
Figure 112007023106609-pct00019
[식 중, 각 B는 독립적으로, 아데닌, 구아닌, 시토신, 우라실, 티민 또는 이들의 변형체를 나타낸다. 각 R은 각각 독립적으로, H 또는 수산기를 나타내지만, 적어도 하나는 수산기를 나타낸다. Z는 H 또는 인산기를 나타낸다. n은 1∼100의 범위 내에 있는 정수를 나타낸다.]
n은 10∼50의 범위 내에 있는 정수가 바람직하고, 또한, 보다 바람직하게는 15∼30의 범위 내에 있는 정수이다.
B의 변형체에 따른 치환기로서는, 예컨대 할로겐, 아실, 알킬, 아릴알킬, 알콕시, 히드록시, 아미노, 모노알킬아미노, 디알킬아미노, 카르복시, 시아노, 니트로를 들 수 있고, 이들이 1∼3개 치환되어 있다.
B의 변형체에 따른 「할로겐」, 「아실」, 「알킬」, 「아릴알킬」, 「알콕시」, 「알콕시알킬」, 「아미노」, 「모노알킬아미노」, 「디알킬아미노」로서는 각각 본 발명 포스포라미다이트 화합물과 동일한 것을 들 수 있다.
본 발명 포스포라미다이트 화합물을 이용하는 올리고 RNA(3)의 제조 방법은 공지의 방법에 따라 행할 수 있지만, 예컨대 다음에 나타내는 단계 A∼단계 G의 조작을 실시함으로써, 단계적으로 3'에서 5'의 방향으로 핵산 단량체 화합물을 축합함으로써 행할 수 있다.
하기 단계에 사용되고 있는 화합물 및 시약 중, 본 발명 포스포라미다이트 화합물 이외에 대해서는 올리고 RNA 또는 올리고 DNA의 합성에 일반적으로 사용되고 있는 것이면 특별히 한정되지 않는다. 또한, 기존의 핵산 합성 시약을 이용한 경우와 동일하게, 모든 단계를 매뉴얼 또는 시판되는 DNA 자동 합성기를 이용하여 제조할 수 있다. 자동 합성기에 의한 조작법의 간편화, 또한 합성 정확성의 관점으로부터 자동 합성기를 이용하는 방법이 바람직하다. 또한, 하기 단계 A∼단계 G에 기재되어 있는 화합물 및 시약 중 핵산 단량체 화합물 이외에 대해서는, 올리고 DNA 또는 올리고 RNA의 합성에 일반적으로 사용되고 있는 것이면 특별히 한정되지 않는다.
(1) 단계 A:
하기 화학식 4로 표시되는 화합물에 산을 작용시킴으로써, 5' 위치의 수산기의 보호기를 탈리하여, 하기 화학식 5로 표시되는 화합물을 제조하는 단계.
Figure 112007023106609-pct00020
[식 중, n, R1, WG2는 상기와 동일한 의미이다. 각 BX는 각각 독립적으로, 아데닌, 구아닌, 시토신, 우라실, 티민 또는 이들의 변형체를 나타낸다. 각 R4는 각각 독립적으로, H, 아실옥시 또는 하기 화학식 6으로 표시되는 치환기를 나타낸다.
화학식 6
Figure 112007023106609-pct00021
(식 중, WG1은 상기와 동일한 의미이다.)
E는 아실 또는 하기 화학식 7로 표시되는 치환기를 나타낸다.
화학식 7
(식 중, Q는 단결합 또는 하기 화학식 8로 표시되는 치환기를 나타낸다.
화학식 8
Figure 112007023106609-pct00023
(식 중, WG2는 상기와 동일한 의미이다.))
T는 H, 아실옥시, 상기 화학식 6 또는 화학식 7로 표시되는 치환기를 나타낸다.
단, E 또는 T 중 어느 한쪽은 치환기(7)를 나타낸다.]
본 단계는 고상 담체에 담지된 하기 화학식 26a, 26b로 표시되는 화합물[n＝1인 화합물(4)] 또는 단계 A∼단계 D의 조작을 행함으로써 제조되는 고상 담체에 담지된 올리고 RNA 또는 올리고 DNA[n＝2∼100인 화합물(4)](이하, 「고상 담체에 담지된 화합물」이라고 함)에 산을 작용시킴으로써 실시할 수 있다.
화학식 26a
Figure 112007023106609-pct00024
화학식 26b
Figure 112007023106609-pct00025
[식 중, BX, R1은 상기와 동일한 의미이다. R2L, R4L은 치환기(7)를 나타낸다. R2는 아실옥시를 나타낸다. R4는 H, 아실옥시 또는 치환기(6)를 나타낸다.]
R2, R4의 「아실옥시」에 따른 「아실」로서는, 예컨대 아세틸, 프로피오닐, 부티릴, 이소부티릴, 벤조일, 4-메톡시벤조일, 페닐아세틸, 페녹시아세틸, 4-tert-부틸페녹시아세틸, 4-이소프로필페녹시아세틸을 들 수 있다.
「고상 담체」로서는, 예컨대 정공 유리(controlled pore glass; CPG), 옥사릴화-정공 유리[예컨대 Alul et al., Nucleic Acids Research, Vol. 19, 1527(1991)을 참조], TentaGel 지지체-아미노폴리에틸렌글리콜 유도체화 지지체[예컨대 Wright et al., Tetrahedron Letters, Vol. 34, 3373(1993)을 참조], Poros-폴리스티렌/디비닐벤젠의 공중합체를 들 수 있다.
「링커」로서는, 예컨대 3-아미노프로필, 숙시닐, 2,2'-디에탄올설포닐, 장 쇄 알킬아미노(LCAA)를 들 수 있다.
화합물(26a), 화합물(26b)은 공지의 방법에 따라 제조되거나 또는 시판품으로서 입수할 수 있는 고상 담체에 담지된 화합물이며, 바람직한 양태로서는, 예컨대 하기 화학식 27, 28로 표시되는 화합물을 들 수 있다.
화학식 27
Figure 112007023106609-pct00026
화학식 28
Figure 112007023106609-pct00027
[식 중, BX, R1, R4, WG2는 상기와 동일한 의미이다.]
R4가 치환기(6)인 화합물(27), (28)은 본 발명 포스포라미다이트 화합물로부터 공지의 방법 따라 제조할 수 있다.
본 단계에 사용할 수 있는 「산」으로서는, 예컨대 트리플루오로아세트산, 디클로로아세트산, 트리클로로아세트산을 들 수 있다. 본 단계에 사용할 수 있는 산은 1∼5%의 농도가 되도록 적당한 용매로 희석하여 사용할 수도 있다. 용매로서는, 반응에 관여하지 않으면 특별히 한정되지 않지만, 디클로로메탄, 아세토니트 릴, 물 또는 이들의 혼합 용매를 들 수 있다. 상기 반응에 있어서의 반응 온도는 20℃∼50℃가 바람직하다. 반응 시간은 사용하는 산의 종류, 반응 온도에 따라 다르지만, 통상 1분∼1시간이 적당하다. 사용하는 시약의 양은 고상 담체에 담지되어 있는 화합물에 대하여 1∼100배 몰량이 좋고, 보다 바람직하게는 1∼10배 몰량이다.
(2) 단계 B:
단계 A에 있어서 제조되는 화합물(5)에 활성화제를 이용하여 핵산 단량체 화합물을 축합시켜, 하기 화학식 9로 표시되는 화합물을 제조하는 단계.
Figure 112007023106609-pct00028
[식 중, BX, E, n, R1, R4, T, WG2는 상기와 동일한 의미이다.]
본 단계는 고상 담체에 담지된 화합물에 핵산 단량체 화합물과 활성화제를 작용시킴으로써 실시할 수 있다.
「핵산 단량체 화합물」로서는, 본 발명 포스포라미다이트 화합물 또는 시판품으로서 입수 가능한 하기 화학식 29로 표시되는 화합물을 들 수 있다.
화학식 29
Figure 112007023106609-pct00029
[식 중, R1, R2a, R2b, WG2는 상기와 동일한 의미이다. BY는 보호기를 갖고 있어도 좋은 Y 핵산 염기를 나타낸다.]
BY에 따른 「핵산 염기」로서는, 핵산의 합성에 사용되는 것이면 특별히 제한되지 않으며, 예컨대 아데닌, 구아닌, 시토신, 티민 또는 이들의 변형체를 들 수 있다.
상기 「변형체」는 상기 BX와 동일한 의미이다.
BY의 변형체에 따른 치환기로서는, 예컨대 할로겐, 알킬, 아릴알킬, 알콕시, 히드록시, 아미노, 모노알킬아미노, 디알킬아미노, 카르복시, 시아노, 니트로를 들 수 있고, 이들이 1∼3개 치환되어 있다.
BY의 변형체에 따른 「할로겐」, 「아실」, 「알킬」, 「아릴알킬」, 「알콕시」, 「알콕시알킬」, 「아미노」, 「모노알킬아미노」, 「디알킬아미노」로서는 각각 본 발명 포스포라미다이트 화합물과 동일한 것을 들 수 있다.
BY에 따른 「핵산 염기」는 보호되어 있어도 좋고, 그 중에서도 아미노기를 갖는 핵산 염기, 예컨대 아데닌, 구아닌, 시토신은 아미노기가 보호되어 있는 것이 바람직하다. 이러한 BY의 「아미노기의 보호기」로서는 상기 BX와 동일한 것을 들 수 있다.
「활성화제」로서는 상기와 동일한 것을 들 수 있다.
반응 용매로서는 반응에 관여하지 않으면 특별히 한정되지 않지만, 예컨대 아세토니트릴, 테트라히드로푸란을 들 수 있다. 상기 반응에 있어서의 반응 온도는 20℃∼50℃가 바람직하다. 반응 시간은 사용하는 활성화제의 종류, 반응 온도에 따라 다르지만, 통상 1분∼1시간이 적당하다. 사용하는 시약의 양은 고상 담체에 담지되어 있는 화합물에 대하여 1∼100배 몰량이 좋고, 보다 바람직하게는 1∼10배 몰량이다.
(3) 단계 C:
단계 B에 있어서 미반응인 화합물(5)의 5' 위치의 수산기를 캡핑하는 단계.
Figure 112007023106609-pct00030
[식 중, BX, E, n, R4, T, WG2는 상기와 동일한 의미이다. R5는 메틸, 페녹시메틸을 나타낸다.]
본 단계는 단계 B에 있어서, 미반응이었던 5' 위치의 수산기를 보호하는 반 응이며, 고상 담체에 담지된 화합물에 캡화제(capping agent)를 작용시킴으로써 실시할 수 있다.
「캡화제」로서는, 예컨대 무수 아세트산 또는 페녹시아세트산 무수물을 들 수 있다. 캡화제는 0.05∼1 M의 농도가 되도록 적당한 용매로 희석하여 사용할 수도 있다. 용매로서는 반응에 관여하지 않으면 특별히 한정되지 않지만, 피리딘, 디클로로메탄, 아세토니트릴, 테트라히드로푸란 또는 이들의 혼합 용매를 들 수 있다. 또한, 본 단계에서 필요에 따라 「반응 촉진제」로서, 예컨대 4-디메틸아미노피리딘, N-메틸이미다졸을 사용할 수 있다. 상기 반응에 있어서의 반응 온도는 20℃∼50℃가 바람직하다. 반응 시간은 사용하는 캡화제의 종류, 반응 온도에 따라 다르지만, 통상 1분∼30분이 적당하다. 사용하는 시약의 양은 고상 담체에 담지되어 있는 화합물에 대하여 1∼100배 몰량이 좋고, 보다 바람직하게는 1∼10배 몰량이다.
(4) 단계 D:
단계 B에 있어서 제조되는 화합물(9)에 산화제를 작용시킴으로써 아인산기를 인산기로 변환하는 단계.
Figure 112007023106609-pct00031
[식 중, BX, E, n, R1, R4, T, WG2는 상기와 동일한 의미이다.]
본 단계는 3가의 인으로부터 5가의 인에 산화제를 사용하여 변환하는 반응이며, 고상 담체에 담지된 화합물에 산화제를 작용시킴으로써 실시할 수 있다.
「산화제」로서는, 예컨대 요오드, tert-부틸하이드로퍼옥사이드를 들 수 있다. 또한, 본 단계에 사용하는 산화제는 0.05∼2 M의 농도가 되도록 적당한 용매로 희석하여 사용할 수도 있다. 용매로서는 반응에 관여하지 않으면 특별히 한정되지 않지만, 피리딘, 테트라히드로푸란, 물 또는 이들의 혼합 용매를 들 수 있다. 예컨대 요오드/물/피리딘-테트라히드로푸란 또는 요오드/피리딘-아세트산이나 과산화제(t-부틸하이드로퍼옥사이드/메틸렌클로라이드 등)를 이용할 수 있다. 반응 온도는 20℃∼50℃가 바람직하다. 반응 시간은 사용하는 산화제의 종류, 반응 온도에 따라 다르지만, 통상 1분∼30분이 적당하다. 사용하는 시약의 양은 고상 담체에 담지되어 있는 화합물에 대하여 1∼100배 몰량이 좋고, 보다 바람직하게는 10∼50배 몰량이다.
(5) 단계 E:
단계 D에 있어서 제조되는 화합물(11)을 고상 담체로부터 분할하고, 각 핵산 염기부 및 각 2' 위치의 수산기의 보호기를 탈리하는 단계.
Figure 112007023106609-pct00032
[식 중, B, BX, E, R, R1, R4, n, T, WG2, Z는 상기와 동일한 의미이다.]
분할 단계는 소망의 쇄 길이의 올리고 RNA를 분할제에 의해, 고상 담체 및 링커로부터 떼어내는 반응이며, 소망의 쇄 길이의 올리고 RNA가 담지된 고체 담체에 분할제를 첨가함으로써 실시할 수 있다. 본 단계에 있어서, 핵산 염기부의 보호기를 탈리할 수 있다.
「분할제」로서는, 예컨대 농암모니아수, 메틸아민을 들 수 있다. 본 단계에 사용할 수 있는 「분할제」는, 예컨대 물, 메탄올, 에탄올, 이소프로필알콜, 아세토니트릴, 테트라히드로푸란 또는 이들의 혼합 용매로 희석하여 사용할 수도 있다. 그 중에서도 에탄올이 바람직하다.
반응 온도는 15℃∼75℃가 적당하며, 15℃∼30℃가 바람직하고, 18℃∼25℃가 보다 바람직하다. 탈보호 반응 시간은 1∼30시간이 적당하고, 1∼24시간이 바람직하며, 1∼4시간이 보다 바람직하다. 탈보호에 사용되는 용액 중 수산화암모늄의 농도는 20∼30 중량%가 적당하고, 25∼30 중량%가 바람직하며, 28∼30 중량%가 보다 바람직하다. 사용하는 시약의 양은 고상 담체에 담지되어 있는 화합물에 대하여 1∼100배 몰량이 적당하고, 10∼50배 몰량이 바람직하다.
2' 위치의 수산기의 보호기를 탈리하는 단계는 「2' 위치의 수산기의 보호기를 탈리하는 시약」으로서, 예컨대 테트라부틸암모늄플루오리드, 삼불화수소·트리에틸아민염을 작용시킴으로써 행할 수 있다. 사용하는 용매로서는 반응에 관여하지 않으면 특별히 한정되지 않지만, 예컨대 테트라히드로푸란, N-메틸피롤리돈, 피리딘, 디메틸설폭시드 또는 이들의 혼합 용매를 들 수 있다. 필요하면, 본 단계에 있어서의 부생성물인 아크릴로니트릴을 보충하는 화합물로서, 예컨대 알킬아민, 아미딘, 티올, 티올 유도체 또는 이들의 혼합물을 첨가할 수 있다. 「알킬아민」으로서는, 예컨대 직쇄형의 탄소수 1∼6의 알킬아민을 들 수 있다. 구체적으로는, 예컨대 메틸아민, 에틸아민, n-프로필아민, n-부틸아민, n-펜틸아민, n-헥실아민을 들 수 있다. 「아미딘」으로서는, 예컨대 벤즈아미딘, 포름아미딘을 들 수 있다. 「티올」로서는, 예컨대 직쇄형의 탄소수 1∼6의 티올을 들 수 있다. 구체적으로는, 예컨대 메탄티올, 에탄티올, 1-프로판티올, 1-부탄티올, 1-펜탄티올, 1-헥산티올을 들 수 있다. 「티올 유도체」로서는, 예컨대 동일하거나 또는 상이한 직쇄형의 탄소수 1∼6의 알킬티올기를 갖는 알콜 또는 에테르를 들 수 있다. 구체적으로는, 예컨대 2-머캅토에탄올, 4-머캅토-1-부탄올, 6-머캅토-1-헥사놀, 머캅토메틸에테르, 2-머캅토에틸에테르, 3-머캅토프로필에테르, 4-머캅토부틸에테르, 5-머캅토펜틸에테르, 6-머캅토헥실에테르를 들 수 있다. 반응 온도는 20℃∼80℃가 바람직하다. 반응 시간은 사용하는 탈보호제의 종류, 반응 온도에 따라 다르지만, 통상 1시간∼100시간이 적당하다. 사용하는 시약의 양은 제거되는 보호기에 대하여 50∼500배 몰량이 좋고, 보다 바람직하게는 50∼100배 몰량이다.
상기 반응 혼합물로부터 통상의 분리 정제 수단, 예컨대 추출, 농축, 중화, 여과, 원심 분리, 재결정, 실리카겔 컬럼 크로마토그래피, 박층 크로마토그래피, 역층 ODS 컬럼 크로마토그래피, 이온 교환 컬럼 크로마토그래피, 겔 여과 컬럼 크로마토그래피, 투석, 한계 여과 등의 수단을 이용함으로써, 5' 위치가 보호된 올리고 RNA를 단리 정제할 수 있다.
(6) 단계 F:
단계 E에 있어서 제조되는 화합물(12)의 5' 위치의 수산기를 탈리하는 단계.
Figure 112007023106609-pct00033
[식 중, B, n, R, R1, Z는 상기와 동일한 의미이다.]
본 단계는 최종적으로 올리고 RNA의 5' 위치의 수산기의 보호기를 탈리하는 반응이며, 고체 담체로부터 분할된 올리고 RNA에 산을 작용시킴으로써 실시할 수 있다.
본 단계에 있어서 사용할 수 있는 「산」으로서는, 예컨대 트리클로로아세트산, 디클로로아세트산, 아세트산 등을 들 수 있다. 본 단계에 사용할 수 있는 산은 적당한 용매로 희석하여 사용할 수도 있다. 용매로서는, 반응에 관여하지 않으면 특별히 한정되지 않지만, 디클로로메탄, 아세토니트릴, 물, pH가 2∼5인 완충액 또는 이들의 혼합 용매를 들 수 있다. 완충액으로서는, 예컨대 아세트산 완충액을 들 수 있다. 상기반응에 있어서의 반응 온도는 20℃∼50℃가 바람직하다. 반응 시간은 사용하는 산의 종류, 반응 온도에 따라 다르지만, 통상 1분∼1시간이 적당하다. 사용하는 시약의 양은 고상 담체에 담지되어 있는 화합물에 대하여 1∼100배 몰량이 좋고, 보다 바람직하게는 1∼10배 몰량이다.
(7) 단계 G:
단계 F에 있어서 제조되는 화합물(3)을 분리 정제하는 단계.
「분리 정제 단계」이란, 상기 반응 혼합물로부터 통상의 분리 정제 수단, 예컨대 추출, 농축, 중화, 여과, 원심 분리, 재결정, C8 내지 C18의 역상 컬럼 크로마토그래피, C8 내지 C18 역상 카트리지 컬럼, 양이온 교환 컬럼 크로마토그래피, 음이온 교환 컬럼 크로마토그래피, 겔 여과 컬럼 크로마토그래피, 고속 액체 크로마토그래피, 투석, 한계 여과 등의 수단을 단독 또는 조합하여 이용함으로써, 소망의 올리고 RNA를 단리 정제하는 단계이다.
「용출 용매」로서는, 예컨대 아세토니트릴, 메탄올, 에탄올, 이소프로필알콜, 물의 단독 용매 또는 임의의 비율의 혼합 용매를 들 수 있다. 이 경우 첨가물로서, 예컨대 인산나트륨, 인산칼륨, 염화나트륨, 염화칼륨, 아세트산암모늄, 아세트산트리에틸암모늄, 아세트산나트륨, 아세트산칼륨, 트리스염산, 에틸렌디아민사아세트산을 1 mM∼2 M의 농도로 첨가하여, 용액의 pH를 1∼9의 범위로 조정할 수도 있다.
단계 A∼단계 D의 조작을 반복함으로써, 소망의 쇄 길이의 올리고 RNA(3)를 제조할 수 있다. 또한, 본 제조 방법에 있어서 올리고 RNA(3)를 제조하기 위한 출발 원료로서, R4가 치환기(6)인 화합물(26a), R4가 H 또는 아실옥시인 화합물(26a) 또는 R2가 알킬옥시인 화합물(26b) 등을 사용할 수 있다. 단, 출발 원료로서, R4가 H 또는 아실옥시인 화합물(26a) 또는 R2가 알킬옥시인 화합물(26b)을 사용한 경우, 핵산 단량체 화합물로서, 적어도 하나는 본 발명 포스포라미다이트 화합물을 사용할 필요가 있다.
또한, 본 제조 방법에 있어서, 단계 E의 조작을 행하기 전에 단계 F의 조작을 행하고, 그 후 단계 E의 조작을 행하며, 계속해서 단계 G의 조작을 행함으로써 올리고 RNA를 단리 정제할 수도 있다.
이하에 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이들에만 한정되지 않는다.
실시예 1 클로로메틸 2- 시아노에틸에테르
단계 1 메틸티오메틸 2- 시아노에틸에테르의 제조
3-히드록시프로피오니트릴 32 g(450 mmol)을 디메틸설폭시드 450 ml에 용해하고, 무수 아세트산 324 ml, 아세트산 231 ml를 첨가하여 실온에서 24시간 교반하였다. 탄산수소나트륨 990 g을 물 4.5 l에 용해한 것을 조제하고, 이것에 반응액을 1시간에 걸쳐 적하하였다. 그대로 1시간 교반하고, 반응액을 아세트산에틸로 추출하며, 무수 황산마그네슘으로 건조하고, 용매 증류 제거하여 얻어진 유상물을 실리 카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 무색 유상물의 메틸티오메틸 2-시아노에틸에테르를 41 g 얻었다(수율 70%).
1H-NMR(CDCl3): 2.18(s, 3H); 2.66(t, 2H, J＝6.3 Hz); 3.77(t, 2H, J＝6.3 Hz); 4.69(s, 2H)
단계 2 클로로메틸 2- 시아노에틸에테르의 제조
단계 1에서 얻어진 메틸티오메틸 2-시아노에틸에테르 3.3 g(25 mmol)을 70 ml의 염화메틸렌에 용해시키고, 빙냉하에서 2 ml(25 mmol)의 염화설푸릴을 적하하며, 또한, 실온에서 1시간 반응시켰다. 반응 후, 용매를 증류 제거하여 진공 중에서 증류하여, 목적 화합물을 무색 유상물로서 2.5 g 얻었다(수율 85%).
비점: 84-85℃(0.3 Torr)
1H-NMR(CDCl3): 2.72(t, 2H, J＝6.3 Hz); 3.92(t, 2H, J＝6.3 Hz); 552(s, 2H)
실시예 2 5'-O-(4,4'- 디메톡시트리틸 )-2'-O-2-( 시아노에톡시메틸 ) 우리딘 3'-O-2-시 아노 에틸 N,N- 디이소프로필포스포라미다이트 )
단계 1 5'-O-(4,4'- 디메톡시트리틸 )-2'-O-2-( 시아노에톡시메틸 ) 우리딘의 제조
5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)우리딘 546 mg(1 mmol)을 1,2-디클로로에탄 4 ml에 용해하고, 디이소프로필에틸아민 452 mg(3.5 mmol)을 첨가하고, 이어서 365 mg(1.2 mmol)의 이염화디부틸주석을 첨가한 후, 실온에서 1시간 반응시켰다. 그 후 80℃로 클로로메틸 2-시아노에틸에테르 155.4 mg(1.3 mmol)을 적하하고, 그대로 30분간 교반하였다. 반응 종료 후, 포화 탄산수소나트륨 수용액에 반응액을 첨가하여 염화메틸렌으로 추출을 행하고, 무수 황산마그네슘으로 건조하고, 용매 증류 제거하여 얻어진 혼합물을 30 g의 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-2'-O-(2-시아노에톡시메틸)우리딘을 얻었다(197 mg; 수율 34%).
1H-NMR(CDCl3): 2.47(d, 1H, J＝7.8 Hz); 2.69(t, 2H, J＝6.3 Hz); 3.55(dd, 1H, 11.3, 2.2Hz); 3.62(dd, 1H, 11.3, 2.2Hz); 3.83(s, 6H); 3.87(t, 2H, J＝6.3 Hz); 4.07-4.08(m, 1H); 4.32(dd, 1H, J＝5.3, 1.9 Hz); 4.54(q, 1H, J＝5.3 Hz); 4.94, 5.11(2d, 2H, J＝6.9 Hz); 5.32(d, 1H, J＝8.2Hz); 6.00(d, 1H, J＝1.9 Hz); 6.85-6.88(m, 4H); 7.29-7.41(m, 9H); 8.02(d, 1H, J＝8.2Hz); 8.53(br.s, 1H)
ESI-Mass:652[M＋Na]＋
단계 2 5'-O-(4,4'- 디메톡시트리틸 )-2'-O-(2- 시아노에톡시메틸 ) 우리딘 3'-O-(2-시 아노에 틸 N,N- 디이소프로필포스포라미다이트 )의 제조
단계 1에서 얻어진 5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-2'-O-(2-시아노에톡시메틸)우리딘 209 mg(0.332 mmol), 테트라졸 23 mg(0.332 mmol)을 아세토니트릴 2 ml에 용해하고, 150 mg의 (0.498 mmol)의 2-시아노에틸 N,N,N',N'-테트라이소프로필포스포라미다이트를 적하하고, 45℃에서 1.5시간 반응시켰다. 반응 후, 포화 탄산수소 나트륨 수용액을 첨가하여 아세트산에틸로 추출하고, 무수 황산마그네슘으로 건조하고, 용매 증류 제거하여 얻어진 혼합물을 20 g의 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 목적 화합물을 얻었다(200 mg; 수율 73%).
ESI-Mass:852[M＋Na]＋
실시예 3 2'-O-2-( 시아노에톡시메틸 ) 우리딘
단계 1 3'5'-O-( 테트라이소프로필디실록산 -3- 디일 )-2'-O-(2- 시아노에톡시메 틸) 우리딘의 제조
3',5'-O-(테트라이소프로필디실록산-1,3-디일)우리딘 150 mg(0.3 mmol)을 아르곤 분위기하에서 테트라히드로푸란 7 ml에 용해하고, 메틸티오메틸 2-시아노에틸에테르 54 mg(0.4 mmol), 분자체 4A 100 mg을 첨가하여 10분 교반하였다. 0℃로 하고 트리플루오로메탄설폰산 10 mg(0.06 mmol)의 테트라히드로푸란 2 ml 용액을 첨가하여 교반한 후, N-요오드숙신이미드 92 mg(0.4 mmol)을 첨가하여 1시간 교반하였다. 반응액을 셀라이트 여과하고, 염화메틸렌으로 세정한 후, 유기상을 1 M의 티오황산수소나트륨 수용액으로 세정하고, 포화 탄산수소나트륨 수용액으로 세정하여 무수 황산마그네슘으로 건조하고, 용매 증류 제거하였다. 얻어진 잔류물을 박층 크로마토그래피로 정제하여 3',5'-O-(테트라이소프로필디실록산-1,3-디일)-2'-O-(2-시아노에톡시메틸)우리딘을 얻었다(150 mg; 수율 85%).
1H-NMR(CDCl3): 0.97-1.12(m, 28H); 2.68-2.73(m, 2H); 3.78-3.86(m, 1H); 3.96-4.05(m, 2H); 4.12-4.30(m, 4H); 5.0-5.04(m, 2H); 5.70(d, 1H, J＝8.2Hz); 5.75(s, 1H); 7.90(d, 1H, J＝8.2Hz); 9.62(br.s, 1H)
ESI-Mass:570[M＋H]＋
단계 2 2'-O-(2- 시아노에톡시메틸 ) 우리딘의 제조
단계 1에서 얻어진 3',5'-O-(테트라이소프로필디실록산-1,3-디일)-2'-O-(2-시아노에톡시메틸)우리딘 200 mg(0.35 mmol)을 메탄올 2 ml에 용해하고, 불화암모늄 65 mg(1.76 mmol)을 첨가하여 50℃에서 5시간 가열 교반하였다. 방냉 후 아세토니트릴을 첨가하여 교반하고, 여과 농축하였다. 얻어진 잔류물를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 목적 화합물을 얻었다(108 mg; 수율 94%).
1H-NMR(CD3OD): 2.72-2.76(t, 2H, J＝6.2Hz); 3.68-3.92(m, 4H); 4.00-4.03(m, 1H); 4.26-4.32(m, 2H); 4.81-4.95(m, 2H); 5.71(d, 1H, J＝8.1Hz); 6.00(d, 1H, J＝3.3 Hz); 8.10(d, 1H, J＝8.1Hz)
ESI-Mass: 350[M＋Na]＋
실시예 4 5'-O-(4,4'- 디메톡시트리틸 )-2'-O-(2- 시아노에톡시메틸 ) 우리딘의 제조
2'-O-(2-시아노에톡시메틸)우리딘 14 g(43 mmol)을 피리딘으로 공비(共沸)하고, 진공 펌프로 30분 건조하였다. 테트라히드로푸란 300 ml에 용해하고, 아르곤 분위기하에서 피리딘 68 g(856 mmol), 분자체 4A 20 g을 첨가하여 10분 교반하였다. 이것에 4,4'-디메톡시트리틸클로라이드 19.6 g(57.8 mmol)을 3회에 나누어 1시 간마다 첨가하고, 추가로 1시간 교반하였다. 메탄올 10 ml를 첨가하여 2분 교반한 후, 셀라이트 여과하여 아세트산에틸로 세정하였다. 여액을 농축한 후, 잔류물을 아세트산에틸에 용해하여, 포화 탄산수소나트륨 수용액으로 분액하였다. 유기상을 포화 염화나트륨 수용액으로 세정하고, 무수 황산마그네슘으로 건조한 후 용매 증류 제거하였다. 얻어진 잔류물을 실리카겔 크로마토그래피로 정제하여 목적 화합물을 얻었다(26.5 g; 수율 98%).
실시예 5 N 4 -아세틸-5'-O-(4,4'- 디메톡시트리틸 )-2'-O-(2- 시아노에톡시메틸 )시티딘 3'-O-(2- 시아노에틸 N,N- 디이소프로필포스포라미다이트 )
단계 1 N 4 -아세틸-5'-O-(4,4'- 디메톡시트리틸 )-2'-O-(2- 시아노에톡시메틸 ) 시 티딘의 제조
N4-아세틸-5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)시티딘 588 mg(1 mmol)을 1,2-디클로로에탄 4 ml에 용해하고, 디이소프로필에틸아민 452 mg(3.5 mmol)을 첨가하고, 이어서 365 mg(1.2 mmol)의 이염화디부틸주석을 첨가한 후, 실온에서 1시간 반응시켰다. 그 후 80℃로 하여 클로로메틸 2-시아노에틸에테르 155.4 mg(1.3 mmol)을 적하하고, 그대로 60분간 교반하였다. 반응 종료 후, 포화 탄산수소나트륨 수용액에 반응액을 첨가하고, 염화메틸렌으로 추출을 행하여 무수 황산마그네슘으로 건조하고, 용매 증류 제거하여 얻어진 혼합물을 30 g의 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 N4-아세틸-5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-2'-O-(2-시아노에톡시메틸)시티딘을 얻 었다(219 mg; 수율 35%).
1H-NMR(CDCl3): 2.19(s, 3H); 2.56(d, 1H, J＝8.8 Hz); 2.65(t, 2H, J＝6.2Hz); 3.55(dd, 1H, 10.5, 2.5 Hz); 3.63(dd, 1H, 10.5, 2.5 Hz); 3.82(s, 6H); 3.86(t, 2H, J＝6.2Hz); 4.09-4.14(m, 1H); 4.28(d, 1H, J＝5.1Hz); 4.44-4.49(m, 1H); 4.97, 5.24(2d, 2H, J＝6.9 Hz); 5.96(s, 1H); 6.86-6.88(m, 4H); 7.09(d, 1H, J＝6.9 Hz); 7.26-7.42(m, 9 H); 8.48(d, 1H, J＝6.9 Hz); 8.59(br.s, 1H)
ESI-Mass:693[M＋Na]＋
단계 2 N 4 -아세틸-5'-O-(4,4'- 디메톡시트리틸 )-2'-O-(2- 시아노에톡시메틸 ) 시티딘 3'-O-(2- 시아노에틸 N,N- 디이소프로필포스포라미다이트 )의 제조
단계 1에서 얻어진 N4-아세틸-5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-2'-O-(2-시아노에톡시메틸)시티딘 205 mg(0.306 mmol)을 염화메틸렌 2 ml에 용해하고, 디이소프로필에틸아민 105 mg(0.812 mmol)을 첨가하여 2-시아노에틸 N,N-디이소프로필클로로포스포라미다이트 116 mg(0.49 mmol)을 적하하고, 실온에서 1시간 반응시켰다. 반응 후, 용매를 증류 제거하여 얻어진 혼합물을 20 g의 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 목적 화합물을 얻었다(242 mg; 수율 91%).
ESI-Mass: 871[M＋H]＋
실시예 6 N 4 -아세틸-2'-O-(2- 시아노에톡시메틸 ) 시티딘
단계 1 N 4 -아세틸-3'5'-O- 테트라이소프로필디실록산 -1,3- 디일 -2'-O-(2- 시아 노에톡시메틸) 시티딘의 제조
N4-아세틸-3',5'-O-(테트라이소프로필디실록산-1,3-디일)시티딘 1.00 g(1.89 mmol)과 메틸티오메틸 2-시아노에틸에테르 500 mg(3.79 mmol)을 혼합하고, 톨루엔 10 ml와 테트라히드로푸란 10 ml의 혼합 용매에 용해하였다. 이어서 트리플루오로메탄설폰산은 975 mg(3.79 mmol)을 첨가하고, 분자체 4A를 첨가하여 건조하였다. 빙냉하에서 N-브로모숙신이미드 370 mg(2.08 mmol)을 첨가하고, 반응 용기를 차광하여 10분간 교반하였다. 또한, N-브로모숙신이미드 70 mg(0.39 mmol)을 추가하여, 25분간 교반하였다. 반응 종료 후, 염화메틸렌을 첨가하여 희석하고, 포화 탄산수소나트륨 수용액으로 세정을 행하며, 무수 황산나트륨으로 건조하여, 용매 증류 제거하여 얻어진 혼합물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 N4-아세틸-3',5'-O-(테트라이소프로필디실록산-1,3-디일)-2'-O-(2-시아노에톡시메틸)시티딘을 얻었다(936 mg; 수율 81%).
1H-NMR(CDCl3): 0.90-1.11(m, 28H); 2.28(s, 3H); 2.62-2.79(m, 2H); 3.78-3.89(m, 1H); 3.96-4.04(m, 2H); 4.19-4.23(m, 3H); 4.30(d, 1H, J＝13.6Hz); 5.00(d, 1H, J＝6.8 Hz); 5.09(d, 1H, J＝6.8 Hz); 5.77(s, 1H); 7.44(d, 1H, J＝7.5 Hz); 8.30(d, 1H, J＝7.5 Hz); 10.13(s, 1H)
ESI-Mass:611[M＋H]＋
단계 2 N 4 -아세틸-2'-O-(2- 시아노에톡시메틸 ) 시티딘의 제조
단계 1에서 얻어진 N4-아세틸-3',5'-O-(테트라이소프로필디실록산-1,3-디일)-2'-O-(2-시아노에톡시메틸)시티딘 500 mg(0.819 mmol)을 테트라히드로푸란 2.5 ml와 메탄올 2.5 ml의 혼합 용매에 용해하고, 불화암모늄 150 mg(4.10 mmol)을 첨가하여 50℃에서 4시간 반응시켰다. 반응 종료 후, 아세토니트릴로 희석하고, 여과하며, 용매를 증류 제거하여 얻어진 혼합물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 목적 화합물을 얻었다(210 mg; 수율 70%).
1H-NMR(D2O):2.13(s, 3H); 2.66-2.71(m, 2H); 3.72-3.78(m, 3H); 3.90(dd, 1H, 13.0, 2.6Hz); 4.06-4.11(m, 1H); 4.20(dd, 1H, J＝7.1, 5.2Hz); 4.29(dd, 1H, J＝5.1, 2.9 Hz); 4.83(d, 1H, J＝7.2Hz); 4.94(d, 1H, J＝7.2Hz); 5.95(d, 1H, J＝2.9 Hz); 7.25(d, 1H, J＝7.6Hz); 8.25(d, 1H, J＝7.6Hz)
ESI-Mass: 391[M＋Na]＋
실시예 7 N 4 -아세틸-5'-O-(4,4'- 디메톡시트리틸 )-2'-O-(2- 시아노에톡시메틸 )시티딘의 제조
2'-O-(2-시아노에톡시메틸)시티딘 9.9 g(26.8 mmol)을 피리딘으로 공비하고, 진공 펌프로 30분 건조하였다. 테트라히드로푸란 190 ml에 용해하고, 아르곤 분위기하에서 피리딘 43 g(538 mmol), 분자체 4A 20 g을 첨가하여 10분 교반하였다. 이것에 4,4'-디메톡시트리틸클로라이드 11.8 g(34.9 mmol)을 3회에 나누어 1시간마다 첨가하고, 추가로 1시간 교반하였다. 메탄올 2 ml를 첨가하여 2분 교반한 후, 셀라이트 여과하여 아세트산에틸로 세정하였다. 여액을 증발기로 농축한 후 잔류물을 아세트산에틸에 용해하고, 포화 탄산수소나트륨 수용액으로 분액하였다. 유기상을 포화 염화나트륨 수용액으로 세정하고, 무수 황산마그네슘으로 건조한 후 용매 증류 제거하였다. 얻어진 잔류물을 실리카겔 크로마토그래피로 정제하여 목적 화합물을 얻었다(15 g; 수율 83%).
실시예 8 N 2 -아세틸-5'-O-(4,4'- 디메톡시트리틸 )-2'-O-(2- 시아노에톡시메틸 )구아노신 3'-O-(2- 시아노에틸 N,N- 디이소프로필포스포라미다이트 )
단계 1 N 2 -아세틸-5'-O-(4,4'- 디메톡시트리틸 )-2'-O-(2- 시아노에톡시메틸 ) 구 마노신의 제조
N2-아세틸-5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)구아노신 627 mg(1 mmol)을 1,2-디클로로에탄 4 ml에 용해하고, 디이소프로필에틸아민 452 mg(3.5 mmol)을 첨가하고, 이어서 365 mg(1.2 mmol)의 이염화디부틸주석을 첨가한 후, 실온에서 1시간 반응시켰다. 그 후 80℃로 하여 클로로메틸 2-시아노에틸에테르 155.4 mg(1.3 mmol)을 적하하고, 그대로 60분간 교반하였다. 반응 종료 후, 포화 탄산수소나트륨 수용액에 반응액을 첨가하고, 염화메틸렌으로 추출을 행하여 무수 황산마그네슘으로 건조하고, 용매 증류 제거하여 얻어진 혼합물을 30 g의 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 N2-아세틸-5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-2'-O-(2-시아노에톡시메틸)구아노 신을 얻었다(450 mg; 수율 63%).
1H-NMR(CDCl3): 1.92(s, 3H); 2.47-2.51(m, 2H); 2.68(br.s, 1H); 3.30(dd, 1H, 10.7, 3.8 Hz); 3.47(dd, 1H, 10.7, 3.8 Hz); 3.55-3.60(m, 1H); 3.65-3.70(m, 1H); 3.74, 3.75(2s, 6H); 4.22-4.23(m, 1H); 4.55-4.58(m, 1H); 4.78, 4.83(2d, 2H, J＝7.0 Hz); 5.01(t, 1H, J＝5.1Hz); 5.99(d, 1H, J＝5.1Hz); 6.76-6.79(m, 4H); 7.17-7.44(m, 9H); 7.88(s, 1H); 8.36(br.s, 1H); 12.06(br.s, 1H)
단계 2 N 2 -아세틸-5'-O-(4,4'- 디메톡시트리틸 )-2'-O-(2- 시아노에톡시메틸 ) 구 아노신 3'-O-(2- 시아노에틸 N,N- 디이소프로필포스포라미다이트 )의 제조
단계 1에서 얻어진 N2-아세틸-5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-2'-O-(2-시아노에톡시메틸)구아노신 400 mg(0.563 mmol)을 염화메틸렌 2 ml에 용해하고, 디이소프로필에틸아민 181 mg(1.4 mmol)을 첨가하여 2-시아노에틸 N,N-디이소프로필클로로포스포라미다이트 161 mg(0.68 mmol)을 적하하고, 실온에서 1시간 반응시켰다. 반응 후, 용매를 증류 제거하여 얻어진 혼합물을 20 g의 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 목적 화합물을 얻었다(471 mg; 수율 92%).
실시예 9 N 6 -아세틸-5'-O-(4,4'- 디메톡시트리틸 )-2'-O-(2- 시아노에톡시메틸 )아데노신 3'-O-(2- 시아노에틸 N,N- 디이소프로필포스포라미다이트 )
단계 1 N 6 -아세틸-5'-O-(4,4'- 디메톡시트리틸 )-2'-O-(2- 시아노에톡시메틸 )아데노신의 제조
N6-아세틸-5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)아데노신 22.0 g(36.0 mmol)을 1,2-디클로로에탄 170 ml에 용해하고, 디이소프로필에틸아민 16.3 g(126 mmol)을 첨가하고, 이어서 12.1 g(39.7 mmol)의 이염화디부틸주석을 첨가한 후, 실온에서 1시간 반응시켰다. 그 후 80℃로 하여 15분간 교반한 후, 클로로메틸 2-시아노에틸에테르4.30 g(36.0 mmol)을 적하하고, 그대로 30분간 교반하였다. 반응 종료 후, 포화 탄산수소나트륨 수용액에 반응액을 첨가하여 염화메틸렌으로 추출을 행하고 무수 황산마그네슘으로 건조하고, 용매 증류 제거하여 얻어진 혼합물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 N6-아세틸-5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-2'-O-(2-시아노에톡시메틸)아데노신을 얻었다(7.47 g; 수율 33%).
1H-NMR(CDCl3): 2.51(t, 2H, J＝6.2Hz); 2.58(d, 1H, J＝5.5 Hz); 2.61(s, 3H); 3.45(dd, 1H, J＝10.7,4.0 Hz); 3.54(dd, 1H, J＝10.7, 3.2Hz); 3.62-3.79(m, 2H); 3.79(s, 6H); 4.25(br.q, 1H, J∼4.6Hz); 4.59(q, 1H, J＝5.2Hz); 4.87-4.94(m, 3H); 6.23(d, 1H, J＝4.4Hz); 6.80-6.83(m, 4H); 7.22-7.32(m, 7H); 7.40-7.43(m, 2H); 8.20(s, 1H); 8.61(br.s, 1H); 8.62(s, 1H)
ESI-Mass: 695[M＋H]＋
단계 2 N 6 -아세틸-5'-O-(4,4'- 디메톡시트리틸 )-2'-O-(2- 시아노에톡시메틸 )아데노신 3'-O-2- 시아노에틸 N,N- 디이소프로필포스포라미다이트 )의 제조
단계 1에서 얻어진 N6-아세틸-5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-2'-O-(2-시아노에톡시메틸)아데노신 10.0 g(14.4 mmol)을 염화메틸렌 75 ml에 용해하고, 디이소프로필에틸아민 4.7 g(36 mmol)을 첨가하여 2-시아노에틸 N,N-디이소프로필클로로포스포라미다이트 4.82 g(20.3 mmol)을 적하하고, 실온에서 1시간 반응시켰다. 반응 후, 용매를 30 ml 정도 남겨 증류 제거하여 얻어진 반응 혼합물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 목적 화합물을 얻었다(12.0 g; 수율 93%).
ESI-Mass: 895[M＋H]＋
실시예 10 N 6 -아세틸-2'-O-(2- 시아노에톡시메틸 )아데노신
단계 1 N 6 -아세틸-3',5'-O-( 테트라이소프로필디실록산 -1,3- 디일 )-2'-O-(2- 시 아노에톡시메틸)아데노신의 제조
N-요오드숙신이미드 245 mg(1.09 mmol)과 트리플루오로메탄설폰산은 280 mg(1.09 mmol)을 염화메틸렌 8 ml에 현탁시키고, 분자체 4A를 첨가하여 건조하였다. 여기에, N6-아세틸-3',5'-O-(테트라이소프로필디실록산-1,3-디일)아데노신 400 mg(0.73 mmol)과 메틸티오메틸 2-시아노에틸에테르 145 mg(1.11 mmol)을 염화메틸렌 4 ml에 용해하여 빙냉하에서 첨가하였다. 그대로 3시간 교반하였다. 반응 종료 후, 염화메틸렌을 첨가하여 희석하고, 티오황산나트륨 수용액과 포화 탄산수소나트륨 수용액으로 세정을 행하여, 무수 황산마그네슘으로 건조하고, 용매 증류 제거하 여 얻어진 혼합물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 N6-아세틸-3',5'-O-(테트라이소프로필디실록산-1,3-디일)-2'-O-(2-시아노에톡시메틸)아데노신을 얻었다(201 mg; 수율 45%).
1H-NMR(CDCl3): 0.98-1.11(m, 28H); 2.62(s, 3H); 2.69(td, 2H, 6.5, J＝1.5 Hz); 3.81-3.89(m, 1H); 4.02-4.09(m, 2H); 4.17(d, 1H, J＝9.4Hz); 4.28(d, 1H, J＝13.4Hz); 4.50(d, 1H, J＝4.5 Hz); 4.67(dd, 1H, J＝8.8, 4.5 Hz); 5.02(d, 1H, J＝7.0 Hz); 5.08(d, 1H, J＝7.0 Hz); 6.10(s, 1H); 8.34(s, 1H); 8.66(s, 1H); 8.67(s, 1H)
ESI-Mass: 636[M＋H]＋
단계 2 N 6 -아세틸-2'-O-(2- 시아노에톡시메틸 )아데노신의 제조
단계 1에서 얻어진 N6-아세틸-3',5'-O-(테트라이소프로필디실록산-1,3-디일)-2'-O-(2-시아노에톡시메틸)아데노신 300 mg(0.47 mmol)을 아세트산 0.1 ml와 0.5 M 테트라부틸암모늄플루오리드의 테트라히드로푸란 용액 2 ml의 혼합 용액에 용해하고, 실온에서 2시간 교반하였다. 반응 종료 후, 얻어진 반응 혼합물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 목적 화합물을 얻었다(160 mg; 수율 86%).
1H-NMR(DMSO-d6): 2.25(s, 3H); 2.53-2.68(m, 2H); 3.41-3.46(m, 1H); 3.56-3.64(m, 2H); 3.69-3.73(m, 1H); 4.00-4.01(m, 1H); 4.36-4.37(m, 1H); 4.72- 4.78(m, 3H); 5.20(bt, 2H); 5.41(d, 1H, J＝5.2Hz); 6.17(d, 1H, J＝5.7 Hz); 8.66(s, 1H); 8.72(s, 1H); 10.72(s, 1H)
ESI-Mass: 415[M＋Na]＋
실시예 11 N 6 -아세틸-5'-O-(4,4'- 디메톡시트리틸 )-2'-O-(2- 시아노에톡시메 틸)아데노신의 제조
N6-아세틸-2'-O-(2-시아노에톡시메틸)아데노신 9.50 g(24.2 mmol)을 탈수 피리딘 100 ml에 용해하고, 농축하여 건조한 후, 아르곤 분위기하에서 탈수 피리딘 100 ml에 용해하였다. 빙냉하에서 4,4'-디메톡시트리틸클로리드 10.7 g(31.2 mmol)을 첨가하고, 실온에서 1시간 20분 반응시켰다. 반응 종료 후, 염화메틸렌으로 희석하고, 물로 세정을 행하며, 무수 황산나트륨으로 건조하고, 용매 증류 제거하여 얻어진 혼합물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 목적 화합물을 얻었다(13.8 g; 수율 82%).
실시예 12 N 2 - 페녹시아세틸 -5'-O-(4,4'- 디메톡시트리틸 )-2'-O-(2- 시아노에톡 시메틸) 구아노신 3'-O-(2- 시아노에틸 N,N- 디이소프로필포스포라미다이트 )
단계 1 N 2 - 페녹시아세틸 -5'-O-(4,4'- 디메톡시트리틸 )-2'-O-(2- 시아노에톡시메틸 ) 구아노신의 제조
N2-페녹시아세틸-5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)구아노신 720 mg(1 mmol)을 1,2-디클로로에탄 4 ml에 용해하고, 디이소프로필에틸아민 452 mg(3.5 mmol)을 첨가하고, 이어서 365 mg(1.2 mmol)의 이염화디부틸주석을 첨가한 후, 실온에서 1시간 반응시켰다. 그 후 80℃에서 클로로메틸 2-시아노에틸에테르 155.4 mg(1.3 mmol)을 적하하고, 그대로 60분간 교반하였다. 반응 종료 후, 포화 탄산수소나트륨 수용액에 반응액을 첨가하고, 염화메틸렌으로 추출을 행하여 무수 황산마그네슘으로 건조하고, 용매 증류 제거하여 얻어진 혼합물을 30 g의 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 N2-페녹시아세틸-5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-2'-O-(2-시아노에톡시메틸)구아노신을 얻었다(384 mg; 수율 48%).
1H-NMR(CDCl3): 2.47-2.51(m, 2H); 2.58(br.s, 1H); 3.42(dd, 1H, 10.1, 3.8 Hz); 3.46(dd, 1H, 10.1, 3.8 Hz); 3.53-3.57(m, 1H); 3.69-3.73(m, 1H); 3.77(s, 6H); 4.24-4.26(m, 1H); 4.48-4.50(m, 1H); 4.61-4.65(m, 2H); 4.83,4.87(2d, 2H, J＝7.0 Hz); 4.88(t, 1H, J＝5.7 Hz); 6.05(d, 1H, J＝5.7 Hz); 6.80-6.82(m, 4H); 6.92-6.96(m, 3H); 7.07-7.11(m, 2H); 7.20-7.42(m, 9 H); 7.84(s, 1H); 8.99(s, 1H); 11.81(br.s, 1H)
ESI-Mass: 825[M＋Na]＋
단계 2 N 2 - 페녹시아세틸 -5'-O-(4,4'- 디메톡시트리틸 )-2'-O-(2- 시아노에톡시 메틸) 구아노신 3'-O-(2- 시아노에틸 N,N- 디이소프로필포스포라미다이트의 제조
단계 1에서 얻어진 N2-페녹시아세틸-5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-2'-O-(2-시 아노에톡시메틸)구아노신 320 mg(0.399 mmol)을 염화메틸렌 4 ml에 용해하고, 디이소프로필에틸아민 128.8 mg(0.996 mmol)을 첨가하여 2-시아노에틸 N,N-디이소프로필클로로포스포라미다이트 141.5 mg(0.598 mmol)을 적하하고, 실온에서 1시간 반응시켰다. 반응 후, 용매를 증류 제거하여 얻어진 혼합물을 30 g의 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 목적 화합물을 얻었다(316 mg; 수율 79%).
ESI-Mass: 1003[M＋H]＋
실시예 13 N 2 - 페녹시아세틸 -2'-O-(2- 시아노에톡시메틸 ) 구아노신
단계 1 N 2 - 페녹시아세틸 -3',5'-O-( 테트라이소프로필디실록산 -1,3- 디일 )-2'-O-(2-시 아노에톡시 메틸) 구아노신의 제조
N2-페녹시아세틸-3',5'-O-(테트라이소프로필디실록산-1,3-디일)구아노신 2.0 g(3.0 mmol)을 테트라히드로푸란 16 ml에 용해하고, 메틸티오메틸 2-시아노에틸에테르 0.99 g(7.6 mmol), 분자체 4A 1.0 g을 첨가하여 아르곤 분위기하에서 145℃에서 10분간 교반하였다. 트리플루오로메탄설폰산 0.68 g(4.5 mmol)의 테트라히드로푸란 5 ml 용액을 첨가하여 교반한 후, N-요오드숙신이미드 1.02 g(4.5 mmol)을 첨가하여 15분간 교반하였다. 반응액에 포화 탄산수소나트륨 수용액을 첨가하고, 여과 후 아세트산에틸로 추출하며, 유기상을 1 M의 티오황산수소나트륨 수용액으로 세정하고, 물, 계속해서 포화 염화나트륨 수용액으로 세정하며, 무수 황산마그네슘으로 건조하고, 용매 증류 제거하였다. 얻어진 잔류물을 실리카겔 크로마토그래피 로 정제하여 N2-페녹시아세틸-3',5'-O-(테트라이소프로필디실록산-1,3-디일)-2'-O-(2-시아노에톡시메틸)구아노신을 얻었다(2.0 g; 수율 89%).
1H-NMR(CDCl3): 0.99-1.11(m, 28H); 2.59-2.77(m, 2H); 3.82-4.05(m, 3H); 4.15(d, 1H, J＝9.3 Hz); 4.25-4.35(m, 2H); 4.52-4.56(dd, 1H, J＝9.3, 4.3 Hz); 5.00, 5.07(2d, 2H, J＝7.2Hz); 5.95(s, 1H)6.99-7.12(m, 3H); 7.35-7.40(m, 2H); 8.09(s, 1H); 9.38(br.s, 1H); 11.85(br.s, 1H)
ESI-Mass: 766[M＋Na]＋
단계 2 N 2 - 페녹시아세틸 -2'-O-(2- 시아노에톡시메틸 ) 구아노신의 제조
1 M 테트라부틸암모늄플루오리드/테트라히드로푸란 용액 2.83 ml(2.83 mmol)에 아세트산 0.14 ml(0.14 mmol)을 첨가한 용액을 조정한다. 단계 1에서 얻어진 N2-페녹시아세틸-3',5'-O-(테트라이소프로필디실록산-1,3-디일)-2'-O-(2-시아노에톡시메틸)구아노신 1.0 g(1.35 mmol)을 테트라히드로푸란 2.83 ml에 용해하고, 위에서 조정한 용액을 첨가하여 아르곤 분위기하에서 실온에서 1시간 교반하였다. 반응액을 감압하에서 농축한 후, 염화메틸렌에 용해하고, 실리카겔 크로마토그래피로 정제하여 목적 화합물을 얻었다(0.67 g; 수율99%).
1H-NMR(DMSO-d6): 2.59-2.66(m, 2H); 3.41-3.63(m, 4H); 3.98(m, 1H); 4.32(m, 1H); 4.58-4.62(t, 1H, J＝5.3 Hz); 4.71-4.78(dd, 2H, J＝13.1, 6.8 Hz); 4.87(s, 2H); 5.12(s, 1H)5.37(s, 1H); 5.97(d, 1H, J＝6.1Hz)6.96-6.99(m, 3H); 7.28-7.34(m, 2H); 8.30(s, 1H); 11.78(br.s, 2H)
ESI-Mass: 500[M-H]－
실시예 14 N 2 - 페녹시아세틸 -5'-O-(4,4'- 디메톡시트리틸 )-2'-O-(2- 시아노에톡 시메틸) 구아노신의 제조
N2-페녹시아세틸-2'-O-(2-시아노에톡시메틸)구아노신 660 mg(1.32 mmol)을 피리딘으로 공비하고, 진공 펌프로 30분 건조하였다. 테트라히드로푸란 9 ml에 용해하고, 아르곤 분위기하에서 피리딘 2.1 g(26.4 mmol), 분자체 4A 600 mg을 첨가하여 10분 교반하였다. 이것에 4,4'-디메톡시트리틸클로라이드 540 mg(1.58 mmol)을 3회에 나누어 1시간마다 첨가하고, 추가로 1시간 교반하였다. 메탄올 2 ml를 첨가하여 2분 교반한 후, 셀라이트 여과하여 아세트산에틸로 세정하였다. 여액을 증발기로 농축한 후 잔류물을 아세트산에틸에 용해하고, 포화 탄산수소나트륨 수용액으로 분액하였다. 유기상을 포화 염화나트륨 수용액으로 세정하고, 무수 황산마그네슘으로 건조 후 용매 증류 제거하였다. 얻어진 잔류물을 실리카겔 크로마토그래피로 정제하여 목적 화합물을 얻었다(800 mg; 수율 75%).
실시예 15 N 6 -아세틸-3',5'-O-( 테트라이소프로필디실록산 -1,3- 디일 )-2'-O-(2-시 아노에톡시메 틸)아데노신
단계 1 N 6 -아세틸-3',5'-O-( 테트라이소프로필디실록산 -1,3- 디일 )-2'-O- 메틸 티오메틸아데노신의 제조
N6-아세틸-3',5'-O-(테트라이소프로필디실록산-1,3-디일)아데노신 2.00 g(3.62 mmol)을 디메틸설폭시드 25 ml에 용해하고, 무수 아세트산 17.5 ml, 아세트산 12.5 ml를 첨가하여 실온에서 14시간 교반하였다. 반응 종료 후, 물 200 ml에 반응액을 첨가하여, 아세트산에틸로 추출을 행하고, 포화 탄산수소나트륨 수용액으로 세정을 행하여, 무수 황산나트륨으로 건조하고, 용매 증류 제거하여 얻어진 혼합물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 N6-아세틸-3',5'-O-(테트라이소프로필디실록산-1,3-디일)-2'-O-메틸티오메틸아데노신을 얻었다(1.36 g; 수율 61%)
1H-NMR(CDCl3): 0.96-1.11(m, 28H); 2.20(s, 3H); 2.61(s, 3H); 4.03(dd, 1H, J＝13.4, 2.4Hz); 4.18(d, 1H, J＝9.1Hz); 4.27(d, 1H, J＝13.4Hz); 4.63-4.71(m, 2H); 5.00(d, 1H, J＝11.5 Hz); 5.07(d, 1H, J＝11.5 Hz); 6.09(s, 1H); 8.31(s, 1H); 8.65(s, 1H); 8.69(s, 1H)
ESI-Mass: 635[M＋Na]＋
단계 2 N 6 -아세틸-3',5'-O-( 테트라이소프로필디실록산 -1,3- 디일 )-2'-O-(2- 시 아노에톡시메틸)아데노신의 제조
단계 1에서 얻어진 N6-아세틸-3',5'-O-(테트라이소프로필디실록산-1,3-디일)-2'-O-메틸티오메틸아데노신 1.00 g(1.63 mmol)을 테트라히드로푸란 25 ml에 용 해하였다. 3-히드록시프로피오니트릴 5.88 g(82.7 mmol)을 첨가하고, 분자체 4A를 첨가하여 건조하고, -45℃로 냉각하였다. N-요오드숙신이미드 440 mg(1.96 mmol)을 첨가하고, 이어서 트리플루오로메탄설폰산 490 mg(3.26 mmol)을 첨가한 후, -45℃에서 15분간 교반하였다. 반응 종료 후, 냉각한 상태로 트리에틸아민을 첨가하여 중화하고, 염화메틸렌으로 희석하고, 티오황산나트륨 수용액과 포화 탄산수소나트륨 수용액으로 세정을 행하며, 무수 황산나트륨으로 건조하고, 용매 증류 제거하여 얻어진 혼합물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 목적 화합물을 얻었다(722 mg; 수율 71%).
실시예 16 우리딜일 -[3'→5']- 우리딜일 -[3'→5']- 우리딜일 -[3'→5']- 우리딜일 -[3'→5']- 우리딜일 -[3'→5']- 우리딜일 -[3'→5']- 우리딜일 -[3'→5']- 우리딜일 -[3'→5']-우리딜일-[3'→5']-우리딜일-[3'→5']-우리딜일-[3'→5']-우리딜일-[3'→5']-우리딜일-[3'→5']-우리딜일-[3'→5']-우리딜일-[3'→5']-우리딜일-[3'→5']-우리딜일-[3'→5']- 우리딜일 -[3'→5']- 우리딜일 -[3'→5']- 우리딜일 -[3'→5']- 우리딘
시판되는 2'/3'-O-벤조일-5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)우리딘을 담지한 CPG 고상 담체(37 mg, 1 μmo1)를 유리 필터가 부착된 컬럼에 넣고, 핵산 자동 합성기(ExpediteTM: 어플라이드 바이오시스템사)를 사용하여, 표기 화합물의 올리고 RNA의 합성을 행하였다.
핵산 단량체 화합물로서, 5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-2'-O-(2-시아노에톡시 메틸)우리딘 3'-O-(2-시아노에틸 N,N-디이소프로필포스포라미다이트)를 축합 촉매로서 테트라졸을, 산화제로서 요오드 용액을, 캡핑 용액으로서 무수 아세트산과 N-메틸이미다졸 용액을 사용하였다. 핵산 단량체 화합물을 20회 축합시킨 후, 분할제로서 10 M의 메틸아민의 에탄올 수용액을 이용하여, 실온 중 1∼2시간에 걸쳐 CPG 고상 담체로부터의 분할 및 각 인산 부위의 보호기 탈리 반응을 행하였다. 반응 혼합물을 감압하에서 농축한 후, 역상 컬럼(ODS)으로 불필요한 피크를 제거한 후, 용출 용매(아세토니트릴-50 mM 트리에틸아민-아세트산 완충액)를 이용하여 정제하였다. 잔류물을 감압하에서 농축한 후, 1 M의 테트라부틸암모늄플루오리드의 THF 용액을 이용하여 실온에서 1시간 반응시키고, 2' 위치의 수산기의 보호기를 탈리하였다. 용액을 탈염 처리한 후, 80% 아세트산으로 5' 말단의 보호기를 제거하였다(실온하 10분). 감압하에서 농축한 후, 수층을 에테르 세정하여, 정제를 하지 않고 고순도 목적 화합물을 얻었다.
MALDI-TOF-MS: 계산치 6367.52[M＋H]＋
실측치 6366.50[M＋H]＋
고순도인 것은 도 1의 역상 HPLC 분석의 결과로부터 명백하다. 측정 조건은 아래와 같다.
측정 조건:
HPLC 장치
송액 유닛: LC-6A(시마즈세이사쿠쇼사제)
검출기: SPD-6A(시마즈세이사쿠쇼사제)
역상 HPLC 컬럼
Mightysil RP-18 GP＜4.6 mm Φx 15 cm＞(간토가가쿠사제)
컬럼 온도: 35℃
이동상
구배: 선형 구배 20분(B액: 0%-70%)
A액: 5% 아세토니트릴을 함유하는 50 mM 트리에틸아민-아세트산 완충액
B액: 90% 아세토니트릴을 함유하는 50 mM 트래에틸아민-아세트산 완충액
이동상의 유량: 1 ml/분
자외선 가시 분광기 검출 파장: 260 nm
실시예 17 시티딜일 -[3'→5']- 우리딜일 -[3'→5']- 우리딜일 -[3'→5']- 아데닐일 -[3'→5']- 시티딜일 -[3'→5']- 구아닐일 -[3'→5']- 시티딜일 -[3'→5']- 우리딜일 -[3'→5']-구아닐일-[3'→5']-아데닐일-[3'→5']-구아닐일-[3'→5']-우리딜일-[3'→5']-아 데 닐일-[3'→5']- 시티딜일 -[3'→5']- 우리딜일 -[3'→5']- 우리딜일 -[3'→5']-시티딜일-[3'→5']- 구아닐일 -[3'→5']- 아데닐일 -[3'→5']- 우리딘
시판되는 2'/3'-O-벤조일-5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)우리딘을 담지한 CPG 고상 담체(37 mg, 1 μmol)를 유리 필터가 부착된 컬럼에 넣고, 핵산 자동 합성 기(ExpediteTM: 어플라이드 바이오시스템사)를 사용하여 표기 화합물의 올리고 RNA의 합성을 행하였다.
핵산 단량체 화합물로서, 5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-2'-O-(2-시아노에톡시메틸)우리딘 3'-O-(2-시아노에틸 N,N-디이소프로필포스포라미다이트), N4-아세틸-5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-2'-O-(2-시아노에톡시메틸)시티딘 3'-O-(2-시아노에틸 N,N-디이소프로필포스포라미다이트), N6-아세틸-5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-2'-O-(2-시아노에톡시메틸)아데노신 3'-O-(2-시아노에틸 N,N-디이소프로필포스포라미다이트), N2-페녹시아세틸-5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-2'-O-(2-시아노에톡시메틸)구아노신 3'-O-(2-시아노에틸 N,N-디이소프로필포스포라미다이트)를 축합 촉매로서 5-에틸티오테트라졸을, 산화제로서 요오드 용액을, 캡핑 용액으로서 페녹시아세트산 무수물과 N-메틸이미다졸 용액을 사용하였다. 핵산 단량체 화합물을 19회 축합시킨 후, 고상상에서 5' 말단의 수산기의 보호기의 제거를 행한 후, 분할제로서, 농암모니아수-에탄올 혼합액(3:1)을 이용하여 40℃에서 4시간에 걸쳐 CPG 고상 담체로부터의 분할 및 각 인산 부위 보호기의 탈리 반응 및 염기 보호기의 제거를 행하였다. 반응 혼합물을 감압하에서 농축한 후 10%의 n-프로필아민, 0.6%의 2-머캅토에틸에테르를 함유하는 1 M의 테트라부틸암모늄플루오리드의 THF 용액을 이용하여 실온에서 1시간 반응시켜, 2' 위치의 수산기의 보호기를 탈리하였다. 용액을 탈염 처리한 후, DEAE-이온 교환 수지(TOYOPEARL DEAE-650)로 정제하여 고순도의 목 적 화합물을 얻었다(1120D260; 수율 58%).
여기서, 목적 화합물의 수득량으로서, 파장 260 nm의 자외선 흡광도(OD260)를 이용하였다. 이하, 동일하게 흡광도(OD260)를 목적 화합물의 수득량으로 하였다.
MALDI-TOF-MS: 계산치 6305.9 [M＋H]＋
실측치 6304.8 [M＋H]＋
실시예 18 아데닐일 -[3'→5']- 시티딜일 -[3'→5']- 아데닐일 -[3'→5']- 우리딜일 -[3'→5']- 시티딜일 -[3'→5']- 아데닐일 -[3'→5']- 시티딜일 -[3'→5']- 우리딜일 -[3'→5']-우리딜일-[3'→5']-아데닐일-[3'→5']-시티딜일-[3'→5']-구아닐일-[3'→5']-시 티 딜일-[3'→5']- 우리딜일 -[3'→5']- 구아닐일 -[3'→5']- 아데닐일 -[3'→5']-구아닐일-[3'→5']- 우리딜일 -[3'→5']- 아데닐일 -[3'→5']- 시티딜일 -[3'→5']- 우리딜일 -[3'→5']- 우리딜일 -[3'→5']- 시티딜일 -[3'→5']- 구아닐일 -[3'→5']- 아데닐일 -[3'→5']- 아데닐일 -[3'→5']- 아데닐일 -[3'→5']- 우리딜일 -[3'→5']- 구아닐일 -[3'→5']-우리딘
실시예 17과 동일하게 하여 목적 화합물을 얻었다(92OD260; 수율 31%).
MALDI-TOF-MS: 계산치 9519.8 [M＋H]＋
실측치 9520.4 [M＋H]＋
실시예 19 우리딜일 -[3'→5']- 우리딜일 -[3'→5']- 우리딜일 -[3'→5']- 우리딜 일 -[3'→5']- 우리딜일 -[3'→5']- 우리딜일 -[3'→5']- 우리딜일 -[3'→5']- 우리딜일 -[3'→5']-우리딜일-[3'→5']-우리딜일-[3'→5']-우리딜일-[3'→5']-우리딜일-[3'→5']-우리딜일-[3'→5']-우리딜일-[3'→5']-우리딜일-[3'→5']-우리딜일-[3'→5']-우리딜일-[3'→5']-우리딜일-[3'→5']-우리딜일-[3'→5']-우리딜일-[3'→5']-우리딜일-[3'→5']-우리딜일-[3'→5']-우리딜일-[3'→5']-우리딜일-[3'→5']-우리딜일-[3'→5']-우리딜일-[3'→5']-우리딜일-[3'→5']-우리딜일-[3'→5']-우리딜일-[3'→5']-우리딜일-[3'→5']-우리딜일-[3'→5']-우리딜일-[3'→5']-우리딜일-[3'→5']-우리딜일-[3'→5']- 우리딜일 -[3'→5']- 우리딜일 -[3'→5']- 우리딜일 -[3'→5']- 우리딜일 -[3'→5']- 우리딜일 -[3'→5']- 우리딘
실시예 17과 동일하게 하여 목적 화합물을 얻었다(254OD260; 수율 65%).
MALDI-TOF-MS: 계산치 12185.8 [M＋H]＋
실측치 12183.3 [M＋H]＋
실시예 20 아데닐일 -[3'→5']- 아데닐일 -[3'→5']- 우리딜일 -[3'→5']- 시티딜일 -[3'→5']- 아데닐일 -[3'→5']- 시티딜일 -[3'→5']- 아데닐일 -[3'→5']- 구아닐일 -[3'→5']-아데닐일-[3'→5']-아데닐일-[3'→5']-우리딜일-[3'→5']-시티딜일-[3'→5']-구아닐일-[3'→5']-우리딜일-[3'→5']-시티딜일-[3'→5']-구아닐일-[3'→5']-우리딜일-[3'→5']-아데닐일-[3'→5']-우리딜일-[3'→5']-구아닐일-[3'→5']-시티딜일-[3'→5']-아데닐일-[3'→5']-구아닐일-[3'→5']-우리딜일-[3'→5']-구아닐일-[3'→5']-아데닐일-[3'→5']-아데닐일-[3'→5']-아데닐일-[3'→5']-아데닐일-[3'→ 5']-시티딜일-[3'→5']-우리딜일-[3'→5']-시티딜일-[3'→5']-우리딜일-[3'→5']-시티딜일-[3'→5']- 우리딜일 -[3'→5']- 우리딜일 -[3'→5']- 시티딜일 -[3'→5']- 아데닐일 -[3'→5']- 아데닐일 -[3'→5']- 티미딘
실시예 17과 동일하게 하여 목적 화합물을 얻었다(75OD260; 수율 19%).
MALDI-TOF-MS: 계산치 12731.8 [M＋H]＋
실측치 12731.7 [M＋H]＋
실시예 21 우리딜일 -[3'→5']- 구아닐일 -[3'→5']- 아데닐일 -[3'→5']- 아데닐일 -[3'→5']- 우리딜일 -[3'→5']- 아데닐일 -[3'→5']- 시티딜일 -[3'→5']- 아데닐일 -[3'→5']- 아데닐일 -[3'→5']- 아데닐일 -[3'→5']- 우리딜일 -[3'→5']- 시티딜일 -[3'→5']-아 데 닐일-[3'→5']- 시티딜일 -[3'→5']- 아데닐일 -[3'→5']- 구아닐일 -[3'→5']-아데닐일-[3'→5']- 아데닐일 -[3'→5']- 우리딜일 -[3'→5']- 시티딜일 -[3'→5']- 구아닐일 -[3'→5']- 우리딜일 -[3'→5']- 시티딜일 -[3'→5']- 구아닐일 -[3'→5']- 우리딜일 -[3'→5']-아데닐일-[3'→5']-우리딜일-[3'→5']-구아닐일-[3'→5']-시티딜일-[3'→5']-아 데 닐일-[3'→5']- 구아닐일 -[3'→5']- 우리딜일 -[3'→5']- 구아닐일 -[3'→5']-아데닐일-[3'→5']- 아데닐일 -[3'→5']- 아데닐일 -[3'→5']- 아데닐일 -[3'→5']- 시티딜일 -[3'→5']- 우리딜일 -[3'→5']- 시티딜일 -[3'→5']- 우리딜일 -[3'→5']- 시티딜일 -[3'→5']-우리딜일-[3'→5']-우리딜일-[3'→5']-시티딜일-[3'→5']-아데닐일-[3'→5']-아 데 닐일-[3'→5']- 우리딜일 -[3'→5']- 우리딜일 -[3'→5']- 시티딜일 -[3'→5']-우리딜일-[3'→5']- 우리딜일 -[3'→5']- 우리딜일 -[3'→5']- 아데닐일 -[3'→5']- 티미 딘
실시예 17과 동일하게 하여 목적 화합물을 얻었다(83OD260; 수율 15%).
MALDI-TOF-MS: 계산치 17476.6 [M＋H]＋
실측치 17474.6 [M＋H]＋
본 발명 포스포라미다이트 화합물은 2' 위치의 수산기에 도입된 에테르형 보호기가 직선형의 치환기이고, 3' 위치의 수산기에 결합하는 인 원자의 주위에서의 입체가 섞여 있지 않기 때문에, 종래로부터 사용되고 있는 포스포라미다이트 화합물과 비교하여, 올리고 RNA를 합성할 때, 매우 단시간에 축합 반응이 진행되어 축합 수율이 좋다.
따라서, 본 발명 포스포라미다이트 화합물을 사용함으로써, 올리고 DNA의 제조와 거의 동일한 수법을 이용하여, 고순도 올리고 RNA의 제조가 가능해졌다.

Claims (19)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 포스포라미다이트 화합물.
    화학식 1
    Figure 112012099348730-pct00071
    [식 중, BX는 보호기를 갖고 있어도 좋은 핵산 염기를 나타낸다. R1은 하기 화학식 2로 표시되는 치환기를 나타낸다.
    화학식 2
    Figure 112012099348730-pct00072
    (식 중, R11, R12, R13은 동일하거나 또는 상이하며, 수소 또는 알콕시를 나타낸다.)
    R2a, R2b는 동일하거나 또는 상이하며, 알킬을 나타내거나 또는 R2a, R2b가 인접하는 질소 원자와 함께 형성하는 5∼6원의 포화 아미노환 기를 나타낸다. 이러한 포화 아미노환 기는 질소 원자 외에 환 구성 원자로서 산소 원자 또는 황 원자를 1개 갖고 있어도 좋다. WG1, WG2는 동일하거나 또는 상이하며, 시아노, 니트로, C1-C5 알킬설포닐 또는 할로겐을 나타낸다.]
  2. 제1항에 있어서, WG1이 시아노인 것인 포스포라미다이트 화합물.
  3. 제1항 또는 제2항의 포스포라미다이트 화합물을 이용하는 것을 특징으로 하는, 하기 화학식 3으로 표시되는 올리고 RNA의 제조 방법.
    화학식 3
    Figure 112007023106609-pct00036
    [식 중, 각 B는 각각 독립적으로, 아데닌, 구아닌, 시토신, 우라실, 티민 또는 이들의 변형체를 나타낸다. 각 R은 각각 독립적으로, H 또는 수산기를 나타내지만, 적어도 하나는 수산기를 나타낸다. Z는 H 또는 인산기를 나타낸다. n은 1∼100의 범위 내에 있는 정수를 나타낸다.]
  4. 제3항에 있어서, 하기 단계 A∼G를 포함하는 것인 올리고 RNA의 제조 방법.
    단계 A:
    하기 화학식 4로 표시되는 화합물에 산을 작용시킴으로써, 5' 위치의 수산기의 보호기를 탈리하여, 하기 화학식 5로 표시되는 화합물을 제조하는 단계,
    Figure 112012099348730-pct00037
    [식 중, n은 상기와 동일한 의미이다. 각 BX는 각각 독립적으로, 보호기를 갖고 있어도 좋은 핵산 염기를 나타낸다. R1은 하기 화학식 2로 표시되는 치환기를 나타낸다.
    화학식 2
    Figure 112012099348730-pct00038
    (식 중, R11, R12, R13은 동일하거나 또는 상이하며, 수소 또는 알콕시를 나타낸다.)
    각 WG2는 시아노, 니트로, C1-C5 알킬설포닐 또는 할로겐을 나타낸다. 각 R4는 각각 독립적으로, H, 아실옥시 또는 하기 화학식 6으로 표시되는 치환기를 나타낸다.
    화학식 6
    Figure 112012099348730-pct00039
    (식 중, WG1은 시아노, 니트로, C1-C5 알킬설포닐 또는 할로겐을 나타낸다.)
    E는 아실 또는 하기 화학식 7로 표시되는 치환기를 나타낸다.
    화학식 7
    Figure 112012099348730-pct00040
    (식 중, Q는 단결합 또는 하기 화학식 8로 표시되는 치환기를 나타낸다.
    화학식 8
    Figure 112012099348730-pct00041
    (식 중, WG2는 상기와 동일한 의미이다.))
    T는 H, 아실옥시, 상기 화학식 6으로 표시되는 치환기를 나타낸다.
    단, E 또는 T 중 어느 한쪽은 치환기(7)이다.]
    단계 B:
    단계 A에 있어서 제조되는 화합물(5)에 활성화제를 이용하여 핵산 단량체 화합물을 축합시켜, 하기 화학식 9로 표시되는 화합물을 제조하는 단계,
    Figure 112012099348730-pct00042
    [식 중, BX, E, n, R1, R4, T, WG2는 상기와 동일한 의미이다.]
    단계 C:
    단계 B에 있어서 미반응인 화합물(5)의 5' 위치의 수산기를 캡핑하는 단계,
    Figure 112012099348730-pct00043
    [식 중, BX, E, n, R4, T, WG2는 상기와 동일한 의미이다. R5는 메틸, 페녹시메틸을 나타낸다.]
    단계 D:
    단계 B에 있어서 제조되는 화합물(9)에 산화제를 작용시킴으로써 아인산기를 인산기로 변환하는 단계,
    Figure 112012099348730-pct00044
    [식 중, BX, E, n, R1, R4, T, WG2는 상기와 동일한 의미이다.]
    단계 E:
    단계 D에 있어서 제조되는 화합물(11)을 고상 담체로부터 분할하고, 각 핵산 염기부 및 각 2' 위치의 수산기의 보호기를 탈리하는 단계,
    Figure 112012099348730-pct00045
    [식 중, B, BX, E, n, R, R1, R4, T, WG2, Z는 상기와 동일한 의미이다.]
    단계 F:
    단계 E에 있어서 제조되는 화합물(12)의 5' 위치의 수산기를 탈리하는 단계,
    Figure 112012099348730-pct00046
    [식 중, B, n, R, R1, Z는 상기와 동일한 의미이다.]
    단계 G:
    단계 F에 있어서 제조되는 올리고 RNA(3)를 분리 정제하는 단계.
  5. 제4항에 있어서, 단계 A∼D를 반복함으로써 소망의 쇄 길이의 올리고 RNA(3)를 제조하는 것인 올리고 RNA의 제조 방법.
  6. 제4항에 있어서, 단계 E에 있어서, 알킬아민, 아미딘, 티올, 티올 유도체 또는 이들의 혼합물을 첨가하는 것을 특징으로 하는 올리고 RNA의 제조 방법.
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 하기 단계 a∼h를 포함하는, 하기 화학식 1로 표시되는 포스포라미다이트 화합물의 제조 방법.
    화학식 1
    Figure 112012099348730-pct00048
    [식 중, BX는 보호기를 갖고 있어도 좋은 핵산 염기를 나타낸다. R1은 하기 화학식 2로 표시되는 치환기를 나타낸다.
    화학식 2
    Figure 112012099348730-pct00049
    (식 중, R11, R12, R13은 동일하거나 또는 상이하며, 수소 또는 알콕시를 나타낸다.)
    R2a, R2b는 동일하거나 또는 상이하며, 알킬을 나타내거나 또는 R2a, R2b가 인접하는 질소 원자와 함께 형성하는 5∼6원의 포화 아미노환 기를 나타낸다. 이러한 포화 아미노환 기는 질소 원자 외에 환 구성 원자로서 산소 원자 또는 황 원자를 1개 갖고 있어도 좋다. WG1, WG2는 동일하거나 또는 상이하며, 시아노, 니트로, C1-C5 알킬설포닐 또는 할로겐을 나타낸다.]
    단계 a:
    하기 화학식 14로 표시되는 뉴클레오시드 유도체에 알킬화 시약을 작용시킴으로써, 중성 조건하에 있어서 탈리하는 에테르형 보호기를 2' 위치의 수산기에 도입하는, 하기 화학식 15, 15'로 표시되는 뉴클레오시드 유도체를 제조하는 단계,
    Figure 112012099348730-pct00050
    [식 중, BX는 보호기를 갖고 있어도 좋은 핵산 염기를 나타낸다. R1, WG1은 상기와 동일한 의미이다.]
    단계 b:
    단계 a에 있어서 제조되는 뉴클레오시드 유도체(15)를 단리 정제하는 단계,
    단계 c:
    단계 b와는 별도로, 하기 화학식 16으로 표시되는 리보핵산 화합물에 알킬화 시약을 작용시킴으로써, 중성 조건하에 있어서 탈리하는 에테르형 보호기를 2' 위치의 수산기에 도입한, 하기 화학식 17로 표시되는 리보핵산 화합물을 제조하는 단계,
    Figure 112012099348730-pct00051
    [식 중, BX, WG1은 상기와 동일한 의미이다. A는 하기 화학식 18a 또는 화학식 18b로 표시되는 규소 치환기를 나타낸다.
    화학식 18a
    Figure 112012099348730-pct00052
    화학식 18b
    Figure 112012099348730-pct00053
    [식 중, R6은 알킬을 나타낸다.]
    단계 d:
    단계 a∼c와는 별도로, 리보핵산 화합물(16)에 디메틸설폭시드와 아세트산과 무수 아세트산을 작용시킴으로써, 하기 화학식 19로 표시되는 리보핵산 화합물을 제조하는 단계,
    Figure 112012099348730-pct00054
    [식 중, A, BX는 상기와 동일한 의미이다.]
    단계 e:
    단계 d에 있어서 제조되는 뉴클레오시드 유도체(19)에 하기 화학식 20으로 표시되는 알콜 화합물과 산과 황 원자에 대한 할로겐화제를 작용시킴으로써, 중성 조건하에 있어서 탈리하는 에테르형 보호기를 2' 위치의 수산기에 도입한, 하기 화학식 17로 표시되는 리보핵산 화합물을 제조하는 단계,
    Figure 112012099348730-pct00055
    [식 중, A, BX, WG1은 상기와 동일한 의미이다.]
    단계 f:
    단계 c 또는 단계 e에 있어서 제조되는 리보핵산 화합물(17)의 3' 위치와 5' 위치의 수산기의 보호기를 탈리하는 반응을 행함으로써, 하기 화학식 21로 표시되는 리보핵산 화합물을 제조하는 단계,
    Figure 112012099348730-pct00056
    [식 중, A, BX, WG1은 상기와 동일한 의미이다.]
    단계 g:
    단계 f에 있어서 제조되는 리보핵산 화합물(21)의 5' 위치의 수산기에 산성 조건하에 있어서 탈리하는 보호기(R1)를 도입하는, 리보핵산 화합물(15)을 제조하는 단계,
    Figure 112012099348730-pct00057
    [식 중, BX, R1, WG1은 상기와 동일한 의미이다. X3은 할로겐을 나타낸다.]
    단계 h:
    단계 b 또는 단계 g에 있어서 제조되는 뉴클레오시드 유도체(15)에 포스포라미다이트화 시약, 또는 포스포라미다이트화 시약과 활성화제를 작용시킴으로써, 3' 위치의 수산기가 포스포라미다이트화된, 하기 화학식 1로 표시되는 포스포라미다이트 화합물을 제조하는 단계.
    Figure 112012099348730-pct00058
    [식 중, BX, R1, WG1은 상기와 동일한 의미이다. R2a, R2b는 동일하거나 또는 상이하며, 알킬을 나타내거나 또는 R2a, R2b가 인접하는 질소 원자와 함께 형성하는 5∼6원의 포화 아미노환 기를 나타낸다. 이러한 포화 아미노환 기는 질소 원자 외에 환 구성 원자로서 산소 원자 또는 황 원자를 1개 갖고 있어도 좋다. WG2는 시아노, 니트로, C1-C5 알킬설포닐 또는 할로겐을 나타낸다.]
  10. 제9항에 있어서, 알킬화 시약이, 하기 화학식 13으로 표시되는 에테르 화합물인 것인 포스포라미다이트 화합물의 제조 방법.
    화학식 13
    Figure 112012099348730-pct00059
    [식 중, L은 할로겐, 아릴티오기, 알킬설폭시드기 또는 알킬티오기를 나타내고, WG1은 시아노, 니트로, C1-C5 알킬설포닐 또는 할로겐을 나타낸다.]
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서, WG1이 시아노인 것인 포스포라미다이트 화합물의 제조 방법.
  12. 제9항 또는 제10항에 있어서, 포스포라미다이트화 시약이, 하기 화학식 22 또는 화학식 23으로 표시되는 화합물인 것인 포스포라미다이트 화합물의 제조 방법.
    화학식 22
    Figure 112012099348730-pct00060
    화학식 23
    Figure 112012099348730-pct00061
    [식 중, R2a, R2b는 동일하거나 또는 상이하며, 알킬을 나타내거나 또는 R2a, R2b가 인접하는 질소 원자와 함께 형성하는 5∼6원의 포화 아미노환 기를 나타낸다. 이러한 포화 아미노환 기는 질소 원자 외에 환 구성 원자로서 산소 원자 또는 황 원자를 1개 갖고 있어도 좋다. WG2는 시아노, 니트로, C1-C5 알킬설포닐 또는 할로겐을 나타낸다. X1은 할로겐을 나타낸다.]
  13. 제9항 또는 제10항에 있어서, 활성화제가 1H-테트라졸, 5-에틸티오테트라졸, 5-벤질머캅토-1H-테트라졸, 4,5-디클로로이미다졸, 4,5-디시아노이미다졸, 벤조트리아졸트리플레이트, 이미다졸트리플레이트, 피리디늄트리플레이트, N,N-디이소프로필에틸아민 또는 2,4,6-콜리딘/N-메틸이미다졸인 것인 포스포라미다이트 화합물의 제조 방법.
  14. 하기 화학식 21로 표시되는 리보핵산 화합물.
    화학식 21
    Figure 112012099348730-pct00065
    [식 중, BX는 보호기를 갖고 있어도 좋은 핵산 염기를 나타낸다. WG1은 시아노, 니트로, C1-C5 알킬설포닐 또는 할로겐을 나타낸다.]
  15. 제14항에 있어서, WG1은 시아노인 것인 리보핵산 화합물.
  16. 하기 화학식 15로 표시되는 리보핵산 화합물.
    화학식 15
    Figure 112012099348730-pct00066
    [식 중, BX는 보호기를 갖고 있어도 좋은 핵산 염기를 나타낸다. R1은 하기 화학식 2로 표시되는 치환기를 나타낸다.
    화학식 2
    Figure 112012099348730-pct00067
    (식 중, R11, R12, R13은 동일하거나 또는 상이하며, 수소 또는 알콕시를 나타낸다.)
    WG1은 시아노, 니트로, C1-C5 알킬설포닐 또는 할로겐을 나타낸다.]
  17. 제16항에 있어서, WG1은 시아노인 것인 리보핵산 화합물.
  18. 하기 화학식 17로 표시되는 리보핵산 화합물.
    화학식 17
    Figure 112012099348730-pct00068
    [식 중, BX는 보호기를 갖고 있어도 좋은 핵산 염기를 나타낸다. A는 하기 화학식 18a 또는 화학식 18b로 표시되는 규소 치환기를 나타낸다.
    화학식 18a
    Figure 112012099348730-pct00069
    화학식 18b
    Figure 112012099348730-pct00070
    (식 중, R6은 알킬을 나타낸다.)
    WG1은 시아노, 니트로, C1-C5 알킬설포닐 또는 할로겐을 나타낸다.]
  19. 제18항에 있어서, WG1은 시아노인 것인 리보핵산 화합물.
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