WO2011090052A1 - リン酸化試薬 - Google Patents

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WO2011090052A1
WO2011090052A1 PCT/JP2011/050822 JP2011050822W WO2011090052A1 WO 2011090052 A1 WO2011090052 A1 WO 2011090052A1 JP 2011050822 W JP2011050822 W JP 2011050822W WO 2011090052 A1 WO2011090052 A1 WO 2011090052A1
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WO
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general formula
following general
cyano
same
compound
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PCT/JP2011/050822
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French (fr)
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猛 和田
征吾 永田
弘一 植竹
Original Assignee
国立大学法人 東京大学
日本新薬株式会社
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/547—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom
    • C07F9/6515—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom having three nitrogen atoms as the only ring hetero atoms
    • C07F9/6518—Five-membered rings
    • C07F9/65188—Five-membered rings condensed with carbocyclic rings or carbocyclic ring systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids

Definitions

  • the present invention relates to a novel phosphorylating reagent.
  • a diphosphorylated nucleic acid must be synthesized by synthesizing a nucleic acid having a desired chain length on a solid phase carrier, monophosphorylating the 5′-terminal hydroxyl group of the nucleic acid, and further phosphorylating the nucleic acid.
  • phosphoramidite compounds are used for phosphorylation of nucleic acids to hydroxyl groups (monophosphorylation reaction).
  • the phosphorylation reaction with respect to the monophosphorylated substance using a phosphoramidite compound has a low yield.
  • a reagent for phosphorylating a monophosphorylated nucleic acid a compound having a phosphodiester structure and represented by the following chemical formula has been reported (see Non-patent Document 1). No compound having a triester structure has been reported.
  • An object of the present invention is mainly to provide a novel phosphorylation reagent.
  • the present inventors have found that a compound represented by the following general formula (A) is useful as a phosphorylating reagent, and completed the present invention.
  • Examples of the present invention include the following 1 to 5.
  • WG 1 and WG 2 are the same or different and are cyano, nitro, halogen, alkylsulfonyl or halogen optionally substituted with hydroxy protected by the group represented by the following general formula (1),
  • X 1 , X 2 , X 3 and X 4 are the same or different and represent CR or N.
  • R represents H, methyl, halogen, trifluoromethyl, cyano, nitro, alkoxycarbonyl, carbamoyl, monoalkylcarbamoyl, dialkylcarbamoyl, sulfamoyl, monoalkylsulfamoyl, dialkylsulfamoyl or alkylsulfonyl.
  • R 3 , R 4 , and R 5 are the same or different and each represents hydrogen or alkoxy.
  • WG 1 , WG 2 , X 1 , X 2 , X 3 , and X 4 are as defined above.
  • R 1 and R 2 are the same or different and each represents alkyl. 4).
  • E represents a solid phase carrier.
  • Z P represents a nucleic acid that may be protected.
  • WG 1 , WG 2 , X 1 , X 2 , X 3 and X 4 have the same meanings as described above. 5.
  • Z represents a nucleic acid.
  • Step 1 A step of producing a compound represented by the following general formula (5) by allowing a compound represented by the following general formula (A) to act on the compound represented by the following general formula (4) ;
  • E, WG 1 , WG 2 , X 1 , X 2 , X 3 , X 4 and Z P are as defined above.
  • Step 2 A step of producing a compound represented by the following general formula (7) by reacting the compound (5) with a silylating agent represented by the following general formula (6) and a base;
  • E, WG 1 , WG 2 and Z p are as defined above.
  • R 6 , R 7 and R 8 are the same or different and each represents alkyl, phenyl or naphthyl.
  • Y represents halogen, trifluoromethanesulfonyloxy, or a group represented by the following general formula (8).
  • R 6 , R 7 and R 8 are as defined above.
  • R 9 represents alkyl.
  • Step 3 A step of producing compound (9) by removing all protecting groups from compound (7).
  • E, R 6 , R 7 , R 8 , and Z P are as defined above.
  • Z is a nucleic acid.
  • solid phase carrier any material that can be used for solid phase synthesis of nucleic acids, peptides, peptide nucleic acids, sugars and the like can be used without any particular problem.
  • controlled pore glass can be used.
  • CPG CPG
  • oxalylated-constant pore glass see, eg, Allu et al., Nucleic Acids Research, Vol. 19, 1527 (1991)
  • TentaGel support as aminopolyethylene glycol derivatized support (eg, Wright et al., Tetrahedron Letters, Vol.
  • Z as a "nucleic acid" according to the Z p, for example, 2 to 200 nucleoside is at the 3 'position and 5' position of adjacent nucleoside, phosphorus bonds (e.g., phosphate binding, phosphorothioate bonds, phosphorodithioate And an phosphonate bond, an phosphonate bond, a boranophosphate bond, or a phosphoramidate bond).
  • phosphorus bonds e.g., phosphate binding, phosphorothioate bonds, phosphorodithioate And an phosphonate bond, an phosphonate bond, a boranophosphate bond, or a phosphoramidate bond.
  • nucleoside examples include deoxyribonucleoside, ribonucleoside, and modified nucleoside represented by the following general formula (10) or (11).
  • B A and B B each independently represents an optionally substituted nucleobase.
  • T represents alkyl, alkoxy, alkoxyalkyl, halogen, nitro, cyano.
  • D represents a single bond, methylene, ethylene, —N (CH 3 ) —, or —OCH 2 — (eg, Singhetal., Chem. Commun., 1998, 4: 455-456; Koshkin et al., Tetrahedron, 1998).
  • nucleobase is not particularly limited as long as it is used for nucleic acid synthesis, and examples thereof include pyrimidine bases such as cytosine, uracil, and thymine, and purine bases such as adenine, guanine, and hypoxanthine. .
  • the “nucleobase” may be substituted at any substitutable position. Examples of such substituents include halogen, acyl, alkyl, arylalkyl, alkoxy, hydroxy, amino, monoalkylamino, dialkylamino, carboxy, cyano, nitro, and 1 to 3 of these are substituted.
  • Nucleic acid according to the Z p are nucleoside (nucleobase, a sugar moiety), phosphorus binding moiety (e.g., a phosphate binding, phosphorothioate bonds, phosphorodithioate bonds, alkylphosphonate bond, boranophosphate bonds, or phosphoramidate linkages) May be protected, and the amino group of adenine, guanine, or cytosine, which is a “nucleobase”, may be protected.
  • the amino-protecting group is not particularly limited as long as it is used as a nucleobase protecting group.
  • the protecting group for the amino group of guanine is preferably phenoxyacetyl, 4-tert-butylphenoxyacetyl, or 4-isopropylphenoxyacetyl.
  • the 2′-hydroxyl group of ribose may be protected.
  • Examples of the protecting group for the 2′-hydroxyl group of ribose include acyl, 3-substituted silyl, 3-substituted silyloxymethyl, Examples include 2-cyanoethoxymethyl, 2-nitroethoxymethyl, 2-halogenoethoxyethyl, 2- (arylsulfonyl) ethoxyethyl, 2- (alkylsulfonyl) ethoxyethyl, or 2-cyanoethoxy-2-ethyl. it can. Further, the “phosphorus binding moiety” may be protected, and examples of the protecting group for the phosphate binding moiety include cyanoethyl.
  • alkyl examples include linear or branched alkyl having 1 to 5 carbon atoms. Specific examples include methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, sec-butyl, tert-butyl, n-pentyl, isopentyl, neopentyl and tert-pentyl.
  • Examples of the “alkoxy” part of “alkoxyalkyl” and “alkoxycarbonyl” include the same as the above-mentioned “alkoxy”.
  • Examples of “halogen” include fluorine, chlorine, bromine and iodine.
  • Examples of the “halogeno” moiety of “2-halogenoethoxyethyl” include the same as the above “halogen”.
  • aryl examples include aryl having 6 to 12 carbon atoms. Specific examples include phenyl, 1-naphthyl, 2-naphthyl and biphenyl.
  • the aryl may be substituted, and examples of the substituent include halogen, alkyl, alkoxy, cyano, and nitro, and 1 to 3 of them may be substituted at any position.
  • acyl examples include linear or branched alkanoyl having 1 to 6 carbon atoms and aroyl having 7 to 13 carbon atoms.
  • Specific examples include formyl, acetyl, n-propionyl, isopropionyl, n-butyryl, isobutyryl, tert-butyryl, valeryl, hexanoyl, benzoyl, naphthoyl, levulinyl and the like.
  • trisubstituted silyl examples include trimethylsilyl, triethylsilyl, tri-n-propylsilyl, triisopropylsilyl, tri-n-butylsilyl, triisobutylsilyl, tri-t-butylsilyl, triphenylsilyl, tribenzylsilyl, tri-p- Examples include xylylsilyl, t-butyldimethylsilyl, t-butyldiethylsilyl, t-butyldiphenylsilyl, dimethylisopropylsilyl, diethylisopropylsilyl, dimethylsexylsilyl, and diphenylmethylsilyl. Examples of the “3-substituted silyl” moiety related to “3-substituted silyloxymethyl” include the same “3-substituted silyl”.
  • Embodiments of the present invention will be described.
  • the reaction is performed after protecting the raw material with an appropriate protecting group in accordance with a known method in advance. Is appropriate.
  • a protecting group can be finally removed according to a known method such as catalytic reduction, alkali treatment, acid treatment or the like.
  • WG 1 , WG 2 , X 1 , X 2 , X 3 , and X 4 are as defined above.
  • Preferable embodiments of compound (A) include, for example, compounds in which WG 1 and WG 2 are the same or different and are cyano or 2- (4,4′-dimethoxytrityloxy) ethylsulfonyl.
  • X 1 , X 2 , X 3 and X 4 are CH, X 1 , X 3 and X 4 are CH, X 2 is CR, A compound in which R is trifluoromethyl, a compound in which X 1 is N, and X 2 , X 3 , and X 4 are CH can be exemplified.
  • the compound (A) is useful, for example, as a reagent (phosphorylating agent) for introducing a phosphate group (—OP ( ⁇ O) (OH) 2 ) into a compound having a hydroxyl group or an amino group.
  • a reagent phosphorylating agent
  • a phosphate group —OP ( ⁇ O) (OH) 2
  • a compound having a hydroxyl group or an amino group for example, Peptide nucleic acids, morpholino nucleic acids, peptides (see, for example, ORGANIC LETTERS, VOL.4, No. 17, pages 2865 to 2868) and monophosphoric acids such as saccharides thereof. It can also be applied to the synthesis of oxidants.
  • Compound A can be produced by the following reaction.
  • This reaction can be carried out by reacting compound (3) with compound (2).
  • the amount of compound (3) used is suitably in the range of 2 to 20 times the molar amount of the compound (2), preferably 4 to 10 times the molar amount.
  • Examples of the solvent that can be used in this reaction include acetonitrile, tetrahydrofuran (THF), a mixed solvent of acetonitrile and 1-methyl-2-pyrrolidone, and a mixed solvent of THF and 1-methyl-2-pyrrolidone.
  • the reaction temperature is suitably in the range of 0 ° C. to 60 ° C., for example.
  • the reaction time varies depending on the type of raw material used, reaction temperature, etc., but is usually in the range of 5 minutes to 2 hours.
  • the production compound (9) of a diphosphorylated compound can be produced through the following Step 1 to Step 3.
  • Z has the same meaning as described above.
  • Process 1 A step of producing compound (5) by reacting compound (4) with compound (A).
  • E, WG 1 , WG 2 , X 1 , X 2 , X 3 , X 4 , Z p are as defined above.
  • This step can be carried out by acting compound (A) on monophosphorylated compound (4).
  • the amount of the compound (A) used is suitably in the range of 10-fold molar amount to 1000-fold molar amount, preferably in the range of 40-fold molar amount to 160-fold molar amount, relative to the molar amount of the compound (4). Is within.
  • the solvent that can be used in this reaction include acetonitrile, THF, a mixed solvent of acetonitrile and 1-methyl-2-pyrrolidone, and a mixed solvent of THF and 1-methyl-2-pyrrolidone.
  • the reaction temperature is suitably in the range of 0 ° C. to 60 ° C., for example.
  • the reaction time varies depending on the type of raw materials used, the reaction temperature, etc., but is usually in the range of 1 minute to 1 hour.
  • Compound (4) which is a raw material compound, was synthesized by a known method and a nucleic acid whose 5 ′ end was deprotected (for example, Nucleic Acids Res., 35 (10): 3287-3296 (2007), Helv. Chim. Acta., 84: 3775-3795 (2001), J. Am.Chem.Soc., 120: 11820-11821 (1998), Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 85: 5764 (1988), Singheral. , Chem.
  • Process 2 A step of producing compound (7) by reacting compound (5) with a silylating agent represented by the following general formula (6) and a base.
  • a silylating agent represented by the following general formula (6) represented by the following general formula (6) and a base.
  • E, R 6 , R 7 , R 8 , WG 1 , WG 2 , Y, Z p are as defined above.
  • This step can be performed by reacting compound (5) with a base and a silylating agent.
  • the amount of the silylating agent (6) used is suitably in the range of 100-fold molar amount to 10,000-fold molar amount, preferably 500-fold molar amount to 2000-fold molar amount, relative to the molar amount of the compound (5). Is within the range.
  • any base known to those skilled in the art can be used, but 1,8-diazabicyclo [5.4.0] undec-7-ene (DBU), 1,4-diazabicyclo [ 2.2.2]
  • DBU 1,8-diazabicyclo [5.4.0] undec-7-ene
  • DBU 1,4-diazabicyclo [ 2.2.2]
  • One selected from octane (DABCO) or a combination of benzylthiol and triethylamine is preferred.
  • the amount of the base used is suitably in the range of 100-fold molar amount to 10,000-fold molar amount, preferably in the range of 1000-fold molar amount to 3000-fold molar amount, relative to the molar amount of compound (5).
  • the solvent that can be used in this step include pyridine.
  • the reaction temperature is suitably in the range of 0 ° C. to 60 ° C., for example.
  • the reaction time varies depending on the type of raw materials used, the
  • Process 3 The process of manufacturing a compound (9) from a compound (7).
  • E, R 6 , R 7 , R 8 , Z p and Z are as defined above.
  • This step is a step of cleaving the solid phase carrier from the compound (7) and removing the protecting group, and a method known per se (when Z is a nucleic acid: for example, Nucleic Acids Res., 35 (10) 3287-3296 (2007), Helv. Chim. Acta., 84: 3775-3795 (2001), J. Am. Chem. Soc., 120: 11820-11821 (1998), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 5764 (1988), Singh et al., Chem. Commun., 1998, 4: 455-456; follow the same Can.
  • FIG. 1 shows a chromatogram obtained by HPLC analysis.
  • the vertical axis represents the absorption intensity
  • the horizontal axis represents the retention time (minutes).
  • FIG. 2 shows a spectrum obtained by MALDI-TOF-MS measurement.
  • the vertical axis represents ionic strength
  • the horizontal axis represents molecular weight (m / z).
  • FIG. 3 shows a chromatogram obtained by HPLC analysis. In the figure, the vertical axis represents the absorption intensity, and the horizontal axis represents the retention time (minutes).
  • HPLC measurement conditions used in Reference Examples, Examples and Comparative Examples are as follows. Measurement condition: HPLC device Liquid feeding unit: LC-20AD (manufactured by Shimadzu Corporation) Detector: SPD-20A (manufactured by Shimadzu Corporation) Autosampler: SIL-20AC (manufactured by Shimadzu Corporation) Column oven: CTO-20AC (manufactured by Shimadzu Corporation) Ion exchange HPLC column DNAPac (registered trademark) PA-100 (4 mm x 250 mm) (manufactured by DIONEX) Column temperature: 50 ° C Mobile phase Gradient: Linear gradient 20 minutes (Liquid B: 0% -10%) Solution A: 25 mM Tris-HCl buffer containing 10% acetonitrile Solution B: 25 mM Tris-HCl buffer containing 10% acetonitrile and 700
  • the obtained CPG solid phase carrier (621 mg, 8.0 ⁇ mol) was put in a polypropylene column with a filter (Libra Tube: manufactured by Hypep Laboratories), washed with dehydrated acetonitrile (5 mL ⁇ 3) in an argon atmosphere, and then for 1 hour with a vacuum pump. After drying, 5-benzylmercapto-1H-tetrazole (246 mg, 1.28 mmol), 0.1 M bis (2-cyanoethoxy) -N, N-diisopropylaminophosphine in acetonitrile (3.2 mL, 320 ⁇ mol) were added. In addition, the mixture was reacted at room temperature for 10 minutes.
  • the obtained carrier was washed with dehydrated pyridine (5 mL ⁇ 3) and dehydrated dichloromethane (5 mL ⁇ 3) in this order, and then dried with a vacuum pump for 15 minutes. Triethylamine-methanol mixed solution (1: 9 (v / v), 5.0 mL) was added, and the mixture was reacted at room temperature for 3 hours.
  • the obtained carrier was washed with dehydrated acetonitrile (5 mL ⁇ 3) and then dried with a vacuum pump for 3 hours to obtain 614 mg of a CPG solid phase carrier.
  • a small amount of CPG solid phase carrier (15.3 mg, 0.2 ⁇ mol) was used for post-treatment.
  • reaction mixture was cleaved from the CPG solid phase carrier at 40 ° C. for 1 hour, and the base protecting group was eliminated.
  • the reaction mixture was filtered, and the filtrate was concentrated under reduced pressure.
  • a 0.67 M tetrabutylammonium fluoride DMSO solution (0.75 mL) containing 0.67% nitromethane was added to the residue, and the mixture was reacted at room temperature for 3 hours to remove the hydroxyl protecting group at the 2 ′ position.
  • Example 1 6-Trifluoromethylbenzotriazol-1-yl bis (2-cyanoethyl) phosphate 1-hydroxy-6-trifluoromethylbenzotriazole (32.5 mg, 160 ⁇ mol) was dried with a vacuum pump for 1 hour. Under an argon atmosphere, 0.1 M bis (2-cyanoethoxy) -N, N-diisopropylaminophosphine in acetonitrile (320 ⁇ L, 32 ⁇ mol) was added and stirred at room temperature for 1 hour to prepare the target compound. 31 P-NMR (CDCl 3 ) ⁇ (ppm): ⁇ 1.23
  • Example 2 Production of 5′-terminal diphosphorylated 3mer (AUA) (SEQ ID NO: 1) CPG solid phase before excision of 5mer terminal monophosphorylated 3mer (AUA) (SEQ ID NO: 1) prepared in Reference Example 1
  • the carrier (30.7 mg, 0.4 ⁇ mol) was placed in a polypropylene column with a filter (Libra Tube: manufactured by Hypep Laboratories) and placed in an argon atmosphere.
  • the acetonitrile solution of the compound produced in Example 1 was added to the carrier in Libra Tube, 1-methyl-2-pyrrolidone (36 ⁇ L) was added, and the mixture was reacted at room temperature for 10 minutes.
  • the reaction was cleaved from the CPG solid phase carrier at 40 ° C. for 1 hour and the base protecting group was removed.
  • the reaction mixture was filtered, and the filtrate was concentrated under reduced pressure.
  • 0.67M tetrabutylammonium fluoride in DMSO (0.75 mL) containing 0.67% nitromethane, and the mixture was reacted at room temperature for 2 hours to remove the hydroxyl protecting group at the 2 ′ position.
  • Example 3 Benzotriazol-1-yl bis (2-cyanoethyl) phosphate 1-hydroxybenzotriazole (21.6 mg, 160 ⁇ mol) was dried with a vacuum pump for 2 hours. Under an argon atmosphere, 0.1 M bis (2-cyanoethoxy) -N, N-diisopropylaminophosphine in acetonitrile (320 ⁇ L, 32 ⁇ mol) was added and stirred at room temperature for 1 hour to prepare the target compound.
  • Example 4 3mer (AUA) (SEQ ID NO: 1) 5'-terminal diphosphorylation CPG solid phase carrier before excision of 3mer (AUA) (SEQ ID NO: 1) 5'-terminal monophosphorylated product prepared in Reference Example 1 30.7 mg, 0.4 ⁇ mol) was placed in a polypropylene column with a filter (Libra Tube: manufactured by Hypep Laboratories) and placed in an argon atmosphere. The acetonitrile solution of the compound produced in Example 3 was added to the carrier in Libra Tube, 1-methyl-2-pyrrolidone (36 ⁇ L) was added, and the mixture was reacted at room temperature for 10 minutes. Post-processing was performed in the same manner as in Example 2.
  • the purity of the 5′-terminal diphosphorylated product was 55.5%.
  • the purity of the 5′-terminal diphosphorylated substance was divided by the purity of the 5′-terminal monophosphorylated substance and multiplied by 100, the yield was 61%.
  • Example 5 7- Azabenzotriazol-1 -yl bis (2-cyanoethyl) phosphate 1-hydroxy-7-azabenzotriazole (21.8 mg, 160 ⁇ mol) was dried with a vacuum pump for 2 hours. Under an argon atmosphere, 0.1 M bis (2-cyanoethoxy) -N, N-diisopropylaminophosphine in acetonitrile (320 ⁇ L, 32 ⁇ mol) was added and stirred at room temperature for 1 hour to prepare the target compound.
  • Example 6 Production of 3mer (AUA) 5′-terminal diphosphorylated CPG solid phase carrier (30.7 mg) before excision of 3mer (AUA) (SEQ ID NO: 1) 5′-terminal monophosphorylated compound produced in Reference Example 1 , 0.4 ⁇ mol) was placed in a polypropylene column with a filter (Libra Tube: manufactured by Hypep Laboratories) and placed in an argon atmosphere. The acetonitrile solution of the compound prepared in Example 5 was added to the carrier in Libra Tube, 1-methyl-2-pyrrolidone (36 ⁇ L) was added, and the mixture was reacted at room temperature for 10 minutes. Post-processing was performed in the same manner as in Example 2.
  • the purity of the 5 ′ terminal diphosphorylated product was 71.3%.
  • the purity of the 5′-terminal diphosphorylated substance was divided by the purity of the 5′-terminal monophosphorylated substance and multiplied by 100, the yield was 78%.
  • Example 7 6-Trifluoromethylbenzotriazol-1-yl (2-cyanoethyl) -2- [2′-O- (4,4′-dimethoxytrityloxy) ethylsulfonyl] ethyl phosphate 1-hydroxy-6-tri Fluoromethylbenzotriazole (32.5 mg, 160 ⁇ mol) was dried with a vacuum pump for 1 hour.
  • Example 8 Production of 5′-terminal diphosphorylated product of 3mer (AUA) (AUA) (SEQ ID NO: 1) Before excision of 5′-terminal monophosphorylated product of 3mer (AUA) (SEQ ID NO: 1) produced in Reference Example 1 CPG solid phase support (30.7 mg, 0.4 ⁇ mol) was placed in a polypropylene column with a filter (Libra Tube: manufactured by Hypep Laboratories) and placed in an argon atmosphere. The acetonitrile solution of the compound prepared in Example 7 was added to the carrier in Libra Tube, 1-methyl-2-pyrrolidone (36 ⁇ L) was added, and the mixture was reacted at room temperature for 30 minutes. Post-processing was performed in the same manner as in Example 2. The purity of the 5 ′ terminal diphosphorylated product was 65.0%. When the purity of the 5′-terminal diphosphorylated substance was divided by the purity of the 5′-terminal monophosphorylated substance and multiplied by 100, the yield was 72%.
  • Example 9 Preparation of 5'- terminal diphosphorylated 122mer nucleic acid Process 1
  • CPG solid phase carrier 330.7 g, 4.3 ⁇ mol
  • AKTA oligopilot plus 10 manufactured by GE Healthcare
  • N 6 -acetyl-5′-O- (4,4′-dimethoxytrityl) -2′-O- (2-cyano) produced according to the method described in International Publication No. 2008/050670 was used.
  • the obtained CPG solid phase support (403 mg, 3.1 ⁇ mol) was placed in a polypropylene column with a filter (Libra Tube: manufactured by Hypep Laboratories), washed with dehydrated dichloromethane (3 mL ⁇ 2) under an argon atmosphere, and N, O-bis. After pretreatment with a (trimethylsilyl) acetamide-pyridine mixed solution (1: 1 (v / v), 3.6 mL) for 20 minutes, 1,8-diazabicyclo [5.4.0] -7-undecene (720 ⁇ L) ) And reacted for 10 minutes.
  • the obtained carrier was washed with dehydrated pyridine (3 mL ⁇ 3) and dehydrated dichloromethane (3 mL ⁇ 3) in this order, and then dried with a vacuum pump for 15 minutes.
  • a triethylamine-methanol mixed solution (1: 9 (v / v), 4.0 mL) was added, and the mixture was reacted at room temperature for 3 hours.
  • the obtained CPG solid phase carrier was washed with dehydrated acetonitrile (4 mL ⁇ 3) and then dried with a vacuum pump for 3 hours. 397 mg of CPG solid phase carrier was obtained.
  • a small amount of CPG solid phase carrier (25.6 mg, 0.2 ⁇ mol) was used for post-treatment.
  • the resulting precipitate was dissolved in water (2 mL) and a 17-mer nucleic acid (5′-GCCGCCGCCCACCAUGGG-3 ′ (SEQ ID NO: 5)) was prepared using MazF (manufactured by Takara Bio Inc.), an enzyme that selectively cleaves the ACA sequence.
  • the molecular weight of the 5'-terminal monophosphorylated product of the 17-mer nucleic acid obtained was measured by MALDI-TOF-MS.
  • MALDI-TOF-MS calculated value 5557.33 Actual value 5558.22 Process 2 1-hydroxybenzotriazole (21.6 mg, 160 ⁇ mol) was dried with a vacuum pump for 30 minutes.
  • acetonitrile solution of benzotriazol-1-yl bis (2-cyanoethyl) phosphate prepared in step 2 is added to the support in Libra Tube, 1-methyl-2-pyrrolidone (36 ⁇ L) is added, and 10 minutes at room temperature. Reacted. This was washed with dehydrated pyridine (1 mL ⁇ 3) and dehydrated dichloromethane (1 mL ⁇ 3) in this order, and pretreated with a mixed solution of N, O-bis (trimethylsilyl) acetamide-pyridine (1: 1 (v / v), 360 ⁇ L) for 20 minutes.
  • the molecular weight of the 5'-terminal diphosphorylated product of the obtained 17-mer nucleic acid was measured by MALDI-TOF-MS.
  • a spectrum obtained by MALDI-TOF-MS measurement is shown in FIG. MALDI-TOF-MS: calculated value 5537.30 Found 563.12
  • This reaction solution was added to 2- ⁇ 2- (4,4′-dimethoxytrityl) ethylsulfonyl ⁇ ethanol (1.00 g, 2.19 mmol) contained in a separately prepared eggplant flask and stirred at room temperature for 2 hours. After completion of the reaction, water was added to the reaction mixture, and the mixture was partitioned with ethyl acetate. The organic layer was washed with water and then with saturated brine. The organic layer was dried over anhydrous sodium sulfate and filtered, and then the solvent was distilled off.
  • step 2 Hypep Laboratories, washed with dehydrated acetonitrile (5 mL ⁇ 2) under an argon atmosphere, and dried with a vacuum pump for 10 minutes.
  • the solution prepared in step 2 was added to the carrier in Libra Tube and allowed to react for 10 minutes at room temperature. This was washed with dehydrated pyridine (1 mL ⁇ 3) and dehydrated dichloromethane (1 mL ⁇ 3) in this order, and the 4,4′-dimethoxytrityl group was removed with a 3% dichloroacetic acid toluene solution (1 mL ⁇ 3).

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Abstract

本発明の目的は、新規なリン酸化試薬を提供することにある。 次の一般式（Ａ）で表される化合物。式中、ＷＧ１，ＷＧ２は、それぞれ同一または異なって、シアノ、ニトロ、ハロゲン、アルキルスルホニル、アリールスルホニルを表し、Ｘ１，Ｘ２，Ｘ３，Ｘ４は、それぞれ同一または異なって、ＣＲまたはＮを表す。ＲはＨ、メチル、ハロゲン、トリフルオロメチル、シアノ、ニトロ、アルコキシカルボニル、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、スルファモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイルまたはアルキルスルホニルを表す。

Description

リン酸化試薬
　本発明は、新規なリン酸化試薬に関するものである。
　核酸のジリン酸化体は、固相担体上で所望の鎖長の核酸を合成し、該核酸の５’末端水酸基に対してモノリン酸化した後、さらにリン酸化することにより合成する必要がある。一般に、核酸の水酸基へのリン酸化（モノリン酸化反応）には、ホスホロアミダイト化合物が使用される。しかしながら、ホスホロアミダイト化合物を用いたモノリン酸化体に対するリン酸化反応は、低収率なものである。
　従来、核酸のモノリン酸化体をリン酸化するための試薬として、リン酸ジエステル構造を有する、次の化学式で表される化合物が報告されているが（非特許文献１参照）、これまでにリン酸トリエステル構造を有する化合物は報告されていない。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
関根ら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ.，２００１年,４２巻,８８５３頁－８８５６頁
　本発明の目的は、主として、新規なリン酸化試薬を提供することにある。
 
　本発明者らは、次の一般式（Ａ）で表される化合物がリン酸化試薬として有用であることを見出し、本発明を完成した。本発明として、例えば、下記１～５を挙げることができる。
１．次の一般式（Ａ）で表される化合物。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
 　式中、ＷＧ１，ＷＧ２は、同一または異なって、シアノ、ニトロ、ハロゲン、次の一般式（１）で表される基で保護されたヒドロキシで置換されていてもよいアルキルスルホニルまたはハロゲン、アルキル、アルコキシ、シアノ、およびニトロからなる群から選択される１個～３個の基で置換されていてもよいアリールスルホニルを表す。Ｘ１，Ｘ２，Ｘ３，Ｘ４は、同一または異なって、ＣＲまたはＮを表す。ＲはＨ、メチル、ハロゲン、トリフルオロメチル、シアノ、ニトロ、アルコキシカルボニル、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、スルファモイル、モノアルキルスルファモイル、ジアルキルスルファモイルまたはアルキルスルホニルを表す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
 　式中、Ｒ３，Ｒ４，Ｒ５は、同一または異なって、水素またはアルコキシを表す。
 
２．上記１に記載の化合物を含有するリン酸化剤。
 
３．次の一般式（２）で表される化合物と次の一般式（３）で表される化合物とを作用させることを特徴とする、次の一般式（Ａ）で表される化合物の製造方法。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
 　式中、ＷＧ１，ＷＧ２，Ｘ１，Ｘ２，Ｘ３，Ｘ４は、前記と同義である。Ｒ１，Ｒ２は、同一または異なって、アルキルを表す。
 
４．次の一般式（４）で表される化合物に次の一般式（Ａ）で表される化合物を作用させることを特徴とする、次の一般式（５）で表される化合物の製造方法。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
 　式中、Ｅは固相担体を表す。ＺＰは、保護されていてもよい核酸を表す。ＷＧ１，ＷＧ２，Ｘ１，Ｘ２，Ｘ３，Ｘ４は、前記と同義である。
 
５．次の工程１～工程３を有する、次の一般式（９）で表される化合物の製造方法。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
 　式中、Ｚは核酸を表す。
（工程１）次の一般式（４）で表される化合物に次の一般式（Ａ）で表される化合物を作用させて、次の一般式（５）で表される化合物を製造する工程；
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
 　式中、Ｅ，ＷＧ１，ＷＧ２，Ｘ１，Ｘ２，Ｘ３，Ｘ４，ＺＰは、前記と同義である。
 
（工程２）化合物（５）に次の一般式（６）で表されるシリル化剤と塩基を作用させて、次の一般式（７）で表される化合物を製造する工程；
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
 　式中、Ｅ，ＷＧ１，ＷＧ２，Ｚｐは前記と同義である。Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８は、同一または異なって、アルキル、フェニル、またはナフチルを表す。Ｙはハロゲン、トリフルオロメタンスルホニルオキシ、または、次の一般式（８）で表される基を表す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
 　式中、Ｒ６，Ｒ７，Ｒ８は、前記と同義である。Ｒ９はアルキルを表す。
 
（工程３）化合物（７）が有する保護基を全て脱離して、化合物（９）を製造する工程。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
 　式中、Ｅ，Ｒ６，Ｒ７，Ｒ８，ＺＰは、前記と同義である。Ｚは核酸である。
 
　以下に、本明細書で記載している用語について詳述する。
　「固相担体」としては、一般的に、核酸、ペプチド、ペプチド核酸、糖などの固相合成に使用しうるものであれば、特に問題はなく使用でき、例えば、定孔ガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　ｐｏｒｅ　ｇｌａｓｓ；ＣＰＧ）、オキサリル化－定孔ガラス（例えば、Ａｌｕｌら，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．１９，１５２７（１９９１）を参照）、ＴｅｎｔａＧｅｌ支持体－アミノポリエチレングリコール誘導体化支持体（例えば、Ｗｒｉｇｈｔら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ，Ｖｏｌ．３４，３３７３（１９９３）を参照）、Ｐｏｒｏｓ－ポリスチレン／ジビニルベンゼンのコポリマー、ポリスチレン系樹脂、ポリアクリルアミド系樹脂を挙げることができる。
　Ｚ、Ｚｐに係る「核酸」としては、例えば、２個～２００個のヌクレオシドが、隣り合うヌクレオシドの３’位と５’位において、リン結合（例えば、ホスフェート結合、ホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合、アルキルホスホネート結合、ボラノホスフェート結合、またはホスホロアミデート結合）によって結合されたポリヌクレオチドを挙げることができる。
　「ヌクレオシド」としては、例えば、デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシド、次の一般式（１０）または（１１）で表される修飾ヌクレオシドを挙げることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
 　式中、ＢＡ、ＢＢは、それぞれ独立して、置換されていてもよい核酸塩基を表す。Ｔは、アルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、ハロゲン、ニトロ、シアノを表す。Ｄは、単結合、メチレン、エチレン、－Ｎ（ＣＨ３）－、または－ＯＣＨ２－を表す（例えば、Ｓｉｎｇｈｅｔａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９９８，４：４５５－４５６；Ｋｏｓｈｋｉｎｅｔａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，１９９８，５４：３６０７－３６３０、ＷＯ０３／０６８７９５、ＷＯ２００５／０２１５７０を参照。）。
　「核酸塩基」としては、核酸の合成に使用されるものであれば特に制限されず、例えば、シトシン、ウラシル、チミン等のピリミジン塩基、アデニン、グアニン、ヒポキサンチン等のプリン塩基を挙げることができる。「核酸塩基」は置換可能な任意の位置で置換されていてもよい。かかる置換基としては、例えば、ハロゲン、アシル、アルキル、アリールアルキル、アルコキシ、ヒドロキシ、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、カルボキシ、シアノ、ニトロを挙げることができ、これらが１～３個置換されていてもよい。
　Ｚｐに係る核酸は、ヌクレオシド（核酸塩基、糖部分）、リン結合部分（例えば、ホスフェート結合、ホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合、アルキルホスホネート結合、ボラノホスフェート結合、またはホスホロアミデート結合）が保護されていてもよく、「核酸塩基」である、アデニン、グアニン、またはシトシンのアミノ基は保護されていてもよい。かかるアミノ基の保護基としては、核酸塩基の保護基として使用されるものであれば特に制限されず、例えば、ベンゾイル、４－メトキシベンゾイル、アセチル、プロピオニル、ブチリル、イソブチリル、フェニルアセチル、フェノキシアセチル、４－ｔｅｒｔ－ブチルフェノキシアセチル、４－イソプロピルフェノキシアセチル、（ジメチルアミノ）メチレンを挙げることができる。とりわけ、グアニンのアミノ基の保護基としては、フェノキシアセチル、４－ｔｅｒｔ－ブチルフェノキシアセチル、４－イソプロピルフェノキシアセチルが好ましい。また、「糖部分」においては、例えば、リボースの２’位水酸基が保護されていてもよく、かかるリボースの２’位水酸基の保護基としては、アシル、３置換シリル、３置換シリルオキシメチル、２－シアノエトキシメチル、２－ニトロエトキシメチル、２－ハロゲノエトキシエチル、２－（アリールスルホニル）エトキシエチル、２－（アルキルスルホニル）エトキシエチル、または、２－シアノエトキシ－２－エチルを挙げることができる。また、「リン結合部分」も保護されていてもよく、かかるリン酸結合部分の保護基としては、例えば、シアノエチルを挙げることができる。
　「アルキル」としては、例えば、直鎖状または分枝鎖状の炭素数１～５のアルキルを挙げることができる。具体的には、例えば、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ｎ－ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｔｅｒｔ－ペンチルを挙げることができる。
　「モノアルキルカルバモイル」、「ジアルキルカルバモイル」、「モノアルキルスルファモイル」、「ジアルキルスルファモイル」、「アルキルスルホニル」、「２－（アルキルスルホニル）エトキシエチル」、「アリールアルキル」、「モノアルキルアミノ」および「ジアルキルアミノ」の「アルキル」部分としては、前記「アルキル」と同じものを挙げることができる。
　「アルコキシ」としては、例えば、直鎖状または分枝鎖状の炭素数１～４のアルコキシを挙げることができる。具体的には、例えば、メトキシ、エトキシ、ｎ－プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ－ブトキシ、イソブトキシ、ｓｅｃ－ブトキシ、ｔｅｒｔ－ブトキシ等を挙げることができる。なかでも炭素数１～３のものが好ましく、とりわけメトキシが好ましい。
　「アルコキシアルキル」、「アルコキシカルボニル」の「アルコキシ」部分としては、上記の「アルコキシ」と同じものを挙げることができる。
　「ハロゲン」としては、例えば、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素を挙げることができる。
　「２－ハロゲノエトキシエチル」の「ハロゲノ」部分としては、前記「ハロゲン」と同じものを挙げることができる。
　「アリールアルキル」、「アリールスルホニル」、「２－（アリールスルホニル）エトキシエチル」の「アリール」部分としては、例えば、炭素数６～１２のアリールを挙げることができる。具体的には、例えば、フェニル、１－ナフチル、２－ナフチル、ビフェニルを挙げることができる。当該アリールは置換されていてもよく、かかる置換基としては、例えば、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、シアノ、ニトロを挙げることができ、これらが任意の位置に１～３個置換されていてもよい。
　「アシル」としては、例えば、直鎖状または分枝鎖状の炭素数１～６のアルカノイル、炭素数７～１３のアロイルを挙げることができる。具体的には、例えば、ホルミル、アセチル、ｎ－プロピオニル、イソプロピオニル、ｎ－ブチリル、イソブチリル、ｔｅｒｔ－ブチリル、バレリル、ヘキサノイル、ベンゾイル、ナフトイル、レブリニル等を挙げることができる。
　「３置換シリル」としては、例えば、トリメチルシリル、トリエチルシリル、トリｎ－プロピルシリル、トリイソプロピルシリル、トリｎ－ブチルシリル、トリイソブチルシリル、トリｔ－ブチルシリル、トリフェニルシリル、トリベンジルシリル、トリｐ－キシリルシリル、ｔ－ブチルジメチルシリル、ｔ－ブチルジエチルシリル、ｔ－ブチルジフェニルシリル、ジメチルイソプロピルシリル、ジエチルイソプロピルシリル、ジメチルセキシルシリル、ジフェニルメチルシリルを挙げることができる。
　「３置換シリルオキシメチル」に係る「３置換シリル」部分としては、前記「３置換シリル」と同じものを挙げることができる。
 
　本発明の実施の形態について説明する。
　以下に示す製造方法において、原料が反応に影響を及ぼす置換基（例えば、ヒドロキシ、アミノ、カルボキシ）を有する場合は、原料をあらかじめ公知の方法に従い、適当な保護基で保護した後に反応を行うのが適当である。かかる保護基は、最終的に、接触還元、アルカリ処理、酸処理などの公知の方法に従い脱離することができる。
 
Ｉ．化合物（Ａ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
 　式中、ＷＧ１，ＷＧ２，Ｘ１，Ｘ２，Ｘ３，Ｘ４は、前記と同義である。
 
　化合物（Ａ）の好ましい態様としては、例えば、ＷＧ１，ＷＧ２が、同一または異なって、シアノまたは２－（４，４’－ジメトキシトリチルオキシ）エチルスルホニルである化合物を挙げることができる。
　また、化合物（Ａ）の好ましい態様としては、Ｘ１，Ｘ２，Ｘ３，Ｘ４がＣＨである化合物、Ｘ１，Ｘ３，Ｘ４がＣＨであり、Ｘ２がＣＲであって、Ｒがトリフルオロメチルである化合物、Ｘ１がＮであり、Ｘ２，Ｘ３，Ｘ４がＣＨである化合物を挙げることができる。
 
　化合物（Ａ）は、例えば、水酸基、アミノ基を有する化合物にリン酸基（－ＯＰ（＝Ｏ）（ＯＨ）２）を導入するための試薬（リン酸化剤）として有用である。
　また、化合物（Ａ）を含有するリン酸化剤は、核酸の５’末端モノリン酸化体に作用させることにより、核酸の５’末端ジリン酸化体を効率的に合成することができることに加え、例えば、ペプチド核酸、モルホリノ核酸、ペプチド（ペプチドのモノリン酸化体の製造に関する文献：例えば、ＯＲＧＡＮＩＣ　ＬＥＴＴＥＲＳ，ＶＯＬ．４，Ｎｏ．１７，２８６５頁－２８６８頁参照。）及び糖類などのモノリン酸化体からそれらのジリン酸化体の合成にも適応しうる。
 
ＩＩ．化合物Ａの製造
　化合物Ａは、次の反応により製造することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
 　式中、ＷＧ１，ＷＧ２，Ｒ１，Ｒ２，Ｘ１，Ｘ２，Ｘ３，Ｘ４は前記と同義である。
 
　本反応は、化合物（２）に化合物（３）を作用させることにより実施することができる。
　化合物（３）の使用量は、化合物（２）のモル量に対して、２倍モル量～２０倍モル量の範囲内が適当であり、好ましくは４倍モル量～１０倍モル量である。本反応に使用しうる溶媒としては、例えば、アセトニトリル、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、アセトニトリルと１－メチル－２－ピロリドンの混合溶媒、ＴＨＦと１－メチル－２－ピロリドンの混合溶媒を挙げることができる。反応温度としては、例えば、０℃～６０℃の範囲内が適当である。反応時間は、使用する原料の種類、反応温度等によって異なるが、通常５分間～２時間の範囲内が適当である。
 
ＩＩＩ．ジリン酸化体の製造
　化合物（９）は、次の工程１ないし工程３を経由することにより製造することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000026
 　式中、Ｚは前記と同義である。
 
工程１
　化合物（４）に化合物（Ａ）を作用させて、化合物（５）を製造する工程。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000027
 　式中、Ｅ，ＷＧ１，ＷＧ２，Ｘ１，Ｘ２，Ｘ３，Ｘ４，Ｚｐは前記と同義である。
　本工程は、モノリン酸化された化合物（４）に化合物（Ａ）を作用することにより実施することができる。
 
　化合物（Ａ）の使用量は、化合物（４）のモル量に対して、１０倍モル量～１０００倍モル量の範囲内が適当であり、好ましくは４０倍モル量～１６０倍モル量の範囲内である。本反応に使用しうる溶媒としては、例えば、アセトニトリル、ＴＨＦ、アセトニトリルと１－メチル－２－ピロリドンの混合溶媒、ＴＨＦと１－メチル－２－ピロリドンの混合溶媒を挙げることができる。反応温度としては、例えば、０℃～６０℃の範囲内が適当である。反応時間は、使用する原料の種類、反応温度等によって異なるが、通常１分間～１時間の範囲内が適当である。
　なお、原料化合物である化合物（４）は、公知の方法により合成した、５’末端が脱保護された核酸（例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，３５（１０）：３２８７－３２９６（２００７）、Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ．，８４：３７７５－３７９５（２００１）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２０：１１８２０－１１８２１（１９９８）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：５７６４（１９８８）、Ｓｉｎｇｈｅｔａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９９８，４：４５５－４５６；Ｋｏｓｈｋｉｎｅｔａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，１９９８，５４：３６０７－３６３０、ＷＯ０３／０６８７９５、ＷＯ２００５／０２１５７０を参照。）を公知の方法（Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，２０（３）：１９７－２１２（２００１））に準じて、モノリン酸化することにより製造することができる。
 
工程２
　化合物（５）に次の一般式（６）で表されるシリル化剤と塩基を作用させ、化合物（７）を製造する工程。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000028
 　式中、Ｅ，Ｒ６，Ｒ７，Ｒ８，ＷＧ１，ＷＧ２，Ｙ，Ｚｐは前記と同義である。
　　　　　　　　　　　　　　　　　 
　本工程は、化合物（５）に塩基とシリル化剤を作用させることにより実施することができる。
　シリル化剤（６）の使用量は、化合物（５）のモル量に対して、１００倍モル量～１００００倍モル量の範囲内が適当であり、好ましくは５００倍モル量～２０００倍モル量の範囲内である。
　本工程に使用しうる塩基としては、当業者に公知の任意のものを使用できるが、１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ－７－エン（ＤＢＵ）、１，４－ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン（ＤＡＢＣＯ）、または、ベンジルチオールとトリエチルアミンとの組み合わせから選択されるものが好ましい。
　塩基の使用量は、化合物（５）のモル量に対して、１００倍モル量～１００００倍モル量の範囲内が適当であり、好ましくは１０００倍モル量～３０００倍モル量の範囲内である。
　本工程に使用しうる溶媒としては、例えば、ピリジンを挙げることができる。反応温度としては、例えば、０℃～６０℃の範囲内が適当である。反応時間は、使用する原料の種類、反応温度等によって異なるが、通常１分間～１時間の範囲内が適当である。
 
工程３
　化合物（７）から化合物（９）を製造する工程。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000029
 　式中、Ｅ，Ｒ６，Ｒ７，Ｒ８，Ｚｐ，Ｚは前記と同義である。
　本工程は、化合物（７）から固相担体を切り出し、また保護基を脱保離する工程であり、それ自体公知の方法（Ｚが核酸の場合：例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，３５（１０）：３２８７－３２９６（２００７）、Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ．，８４：３７７５－３７９５（２００１）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２０：１１８２０－１１８２１（１９９８）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：５７６４（１９８８）、Ｓｉｎｇｈｅｔａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９９８，４：４５５－４５６；Ｋｏｓｈｋｉｎｅｔａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，１９９８，５４：３６０７－３６３０、ＷＯ０３／０６８７９５、ＷＯ２００５／０２１５７０を参照。）に準じて実施することができる。
 
図１は、ＨＰＬＣ分析により得られたクロマトグラムを示す。図中、縦軸は、吸収強度を表し、横軸は、保持時間（分）を表す。 図２は、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ測定により得られたスペクトラムを示す。図中、縦軸は、イオン強度を表し、横軸は、分子量（ｍ／ｚ）を表す。 図３は、ＨＰＬＣ分析により得られたクロマトグラムを示す。図中、縦軸は、吸収強度を表し、横軸は、保持時間（分）を表す。
　以下に参考例、実施例、比較例を揚げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれらのみに限定されない。なお、参考例、実施例、比較例において使用したＨＰＬＣ測定条件は、以下の通りである。
　測定条件：
　ＨＰＬＣ装置
　　送液ユニット：ＬＣ－２０ＡＤ（島津製作所社製）
　　検出器：ＳＰＤ－２０Ａ（島津製作所社製）
　　オートサンプラー：ＳＩＬ－２０ＡＣ（島津製作所社製）
　　カラムオーブン：ＣＴＯ－２０ＡＣ（島津製作所社製）
　イオン交換ＨＰＬＣカラム
　　ＤＮＡＰａｃ（登録商標）　ＰＡ－１００（４ｍｍｘ２５０ｍｍ）（ＤＩＯＮＥＸ社製）
　　カラム温度　：５０℃
　移動相
　　グラジエント：リニアグラジエント２０分（Ｂ液：０％－１０％）
　　Ａ液：１０％アセトニトリルを含む２５ｍＭトリス塩酸緩衝液
　　Ｂ液：１０％アセトニトリルと７００ｍＭ過塩素酸ナトリウムを含む２５ｍＭトリス塩酸緩衝液
　　移動相の流量：１．５ｍｌ／分
　　検出波長：２６０ｎｍ
 
参考例１　３ｍｅｒ（ＡＵＡ）（配列番号１）の５’末端モノリン酸化体の製造
　市販のＮ６－ベンゾイル－５’－Ｏ－（４，４’－ジメトキシトリチル）－２’－Ｏ－（ｔ－ブチルジメチルシリル）アデノシンを担持したＣＰＧ固相担体（１．７７ｇ，２３．０μｍｏｌ）をステンレスカラムに入れ、核酸自動合成機（ＡＫＴＡｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ　ｐｌｕｓ　１０：ＧＥヘルスケア社製）を使用して、標記核酸の配列のとおり合成した後、５’末端の保護基を脱保護し、ステンレスカラムごと真空ポンプで５時間乾燥し、１．７９ｇのＣＰＧ固相担体を得た。
　なお、核酸モノマー化合物として、国際公開２００８／０５０６７０号に記載された方法に従って製造したＮ６－アセチル－５’－Ｏ－（４，４’－ジメトキシトリチル）－２’－Ｏ－（２－シアノエトキシメチル）アデノシン　３’－Ｏ－（２－シアノエチル　Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルホスホロアミダイト）、および５’－Ｏ－（４，４’－ジメトキシトリチル）－２’－Ｏ－（２－シアノエトキシメチル）ウリジン　３’－Ｏ－（２－シアノエチル　Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルホスホロアミダイト）を使用した。縮合触媒として５－ベンジルメルカプト－１Ｈ－テトラゾールを、酸化剤としてヨウ素溶液を、キャッピング溶液としてフェノキシ酢酸無水物とＮ－メチルイミダゾール／２，６－ルチジン溶液を使用した。
　得られたＣＰＧ固相担体（６２１ｍｇ，８．０μｍｏｌ）をフィルター付きポリプロピレン製カラム（Ｌｉｂｒａ　Ｔｕｂｅ：ハイペップ研究所製）に入れ、アルゴン雰囲気下、脱水アセトニトリル（５ｍＬｘ３）で洗浄し、真空ポンプで１時間乾燥した後、５－ベンジルメルカプト－１Ｈ－テトラゾール（２４６ｍｇ，１．２８ｍｍｏｌ）、０．１Ｍのビス（２－シアノエトキシ）－Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルアミノホスフィンのアセトニトリル溶液（３．２ｍＬ，３２０μｍｏｌ）を加え、室温で１０分間反応した。反応液を除去した後、再び５－ベンジルメルカプト－１Ｈ－テトラゾール（２４６ｍｇ，１．２８ｍｍｏｌ）、０．１Ｍのビス（２－シアノエトキシ）－Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルアミノホスフィンのアセトニトリル溶液（３．２ｍＬ，３２０μｍｏｌ）を加え、室温で１０分間反応した。脱水ピリジン（５ｍＬｘ３）で担体を洗浄し、０．０５Ｍ　ヨウ素のピリジン溶液（１０％　Ｈ２Ｏ含有、３ｍＬ）で酸化を行い、脱水ピリジン（５ｍＬｘ３）、脱水ジクロロメタン（５ｍＬｘ３）の順で洗浄後、０．２Ｍ　フェノキシ酢酸無水物のアセトニトリル溶液（０．５ｍL）と２０％　Ｎ－メチルイミダゾール／３０％　２，６－ルチジンのアセトニトリル溶液（０．５ｍＬ）でキャッピングを行った。脱水ジクロロメタン（５ｍＬｘ３）で洗浄し、Ｎ，Ｏ－ビス（トリメチルシリル）アセトアミド－ピリジン混合溶液（１：１（ｖ／ｖ），４．０ｍＬ）で２０分間前処理を行った後、１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン（８００μＬ）を加え、１０分間反応した。得られた担体を脱水ピリジン（５ｍＬｘ３）、脱水ジクロロメタン（５ｍＬｘ３）の順で洗浄後、真空ポンプで１５分間乾燥した。トリエチルアミン－メタノール混合溶液（１：９（ｖ／ｖ），５．０ｍＬ）を加え、室温で３時間反応した。得られた担体を脱水アセトニトリル（５ｍＬｘ３）で洗浄後、真空ポンプで３時間乾燥し、６１４ｍｇのＣＰＧ固相担体を得た。
　サンプルの同定を行うため、少量のＣＰＧ固相担体（１５．３ｍｇ，０．２μｍｏｌ）を用いて後処理を行った。切り出し剤として濃アンモニア水－エタノール混合液を用いて、４０℃で１時間かけてＣＰＧ固相担体から切り出し、および塩基の保護基の脱離反応を行った。反応混合物をろ過後、ろ液を減圧下にて濃縮した。残渣に０．６７％のニトロメタンを含む０．６７ＭのテトラブチルアンモニウムフルオリドのＤＭＳＯ溶液（０．７５ｍＬ）を加えて室温で３時間反応し、２’位の水酸基の保護基を脱離した。反応液に１Ｍ　トリス塩酸緩衝液（０．５ｍＬ）を氷冷下加え、この溶液をエタノール（１２ｍＬ）に滴下し、生じた沈殿をＨＰＬＣ（イオン交換カラム）にて純度を測定した。５’末端モノリン酸化体の純度は９０．９％であった。また、得られた５’末端モノリン酸化体の分子量をＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳにより測定した。
 
ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ：計算値　９８２．６０
　　　　　　　　　　　　　実測値　９８３．３８
 
実施例１　６－トリフルオロメチルベンゾトリアゾール－１－イル　ビス（２－シアノエチル）　ホスフェート
　１－ヒドロキシ－６－トリフルオロメチルベンゾトリアゾール（３２．５ｍｇ,１６０μｍｏｌ）を、真空ポンプで１時間乾燥した。アルゴン雰囲気下、０．１Ｍのビス（２－シアノエトキシ）－Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルアミノホスフィンのアセトニトリル溶液（３２０μＬ，３２μｍｏｌ）を加え、室温で１時間撹拌し、目的化合物を製造した。
３１Ｐ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：　－１．２３
 
実施例２　３ｍｅｒ（ＡＵＡ）（配列番号１）の５’末端ジリン酸化体の製造
　参考例１で製造した３ｍｅｒ（ＡＵＡ）（配列番号１）の５’末端モノリン酸化体の切り出し前のＣＰＧ固相担体（３０．７ｍｇ，０．４μｍｏｌ）をフィルター付きポリプロピレン製カラム（Ｌｉｂｒａ　Ｔｕｂｅ：ハイペップ研究所製）に入れ、アルゴン雰囲気下とした。実施例１で製造した化合物のアセトニトリル溶液をＬｉｂｒａ　Ｔｕｂｅに入っている担体に加え、１－メチル－２－ピロリドン（３６μＬ）を加えて、室温で１０分間反応した。脱水ピリジン（１ｍＬｘ３）、脱水ジクロロメタン（１ｍＬｘ３）の順で洗浄し、Ｎ，Ｏ－ビス（トリメチルシリル）アセトアミド－ピリジン混合溶液（１：１（ｖ／ｖ），３６０μＬ）で２０分間前処理を行った後、１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン（７２μＬ）を加え、１０分間反応した。得られた担体を脱水ピリジン（１ｍＬｘ３）、脱水ジクロロメタン（１ｍＬｘ３）の順で洗浄後、真空ポンプで１５分間乾燥した。３０．２ｍｇのＣＰＧ固相担体を得た。
　切り出し剤として濃アンモニア水－エタノール混合液を用いて、４０℃で１時間かけてＣＰＧ固相担体から切り出しおよび塩基の保護基の脱離反応を行った。反応混合物をろ過後、ろ液を減圧下にて濃縮した。残渣に０．６７％のニトロメタンを含む０．６７ＭのテトラブチルアンモニウムフルオリドのＤＭＳＯ溶液（０．７５ｍＬ）を加えて室温で２時間反応し、２’位の水酸基の保護基を脱離した。反応液に１Ｍ　トリス塩酸緩衝液（０．５ｍＬ）を氷冷下加え、この溶液をエタノール（１２ｍＬ）に滴下し、生じた沈殿をＨＰＬＣ（イオン交換カラム）にて純度を測定した。５’末端ジリン酸化体の純度は７６．０％であった。５’末端ジリン酸化体の純度を５’末端モノリン酸化体の純度で割り、１００を掛けた値を収率とすると、収率は８４％であった。また、得られた５’末端ジリン酸化体の分子量をＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳにより測定した。ＨＰＬＣ分析により得られたクロマトグラムを図１に示す。
 
ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ：計算値　１０６２．５７
　　　　　　　　　　　　　実測値　１０６３．４６
 
実施例３　ベンゾトリアゾール－１－イル　ビス（２－シアノエチル）　ホスフェート
　１－ヒドロキシベンゾトリアゾール（２１．６ｍｇ,１６０μｍｏｌ）を、真空ポンプで２時間乾燥した。アルゴン雰囲気下、０．１Ｍのビス（２－シアノエトキシ）－Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルアミノホスフィンのアセトニトリル溶液（３２０μＬ，３２μｍｏｌ）を加え、室温で１時間撹拌し、目的化合物を製造した。
 
実施例４　３ｍｅｒ（ＡＵＡ）（配列番号１）の５’末端ジリン酸化反応
　参考例１で製造した３ｍｅｒ（ＡＵＡ）（配列番号１）の５’末端モノリン酸化体の切り出し前のＣＰＧ固相担体（３０．７ｍｇ，０．４μｍｏｌ）をフィルター付きポリプロピレン製カラム（Ｌｉｂｒａ　Ｔｕｂｅ：ハイペップ研究所製）に入れ、アルゴン雰囲気下とした。実施例３で製造した化合物のアセトニトリル溶液をＬｉｂｒａ　Ｔｕｂｅに入っている担体に加え、１－メチル－２－ピロリドン（３６μＬ）を加えて、室温で１０分間反応した。後処理は、実施例２と同様の方法で行った。５’末端ジリン酸化体の純度は５５．５％であった。５’末端ジリン酸化体の純度を５’末端モノリン酸化体の純度で割り、１００を掛けた値を収率とすると、収率は６１％であった。
 
実施例５　７－アザベンゾトリアゾール－１－イル　ビス（２－シアノエチル）　ホスフェート
　１－ヒドロキシ－７－アザベンゾトリアゾール（２１．８ｍｇ,１６０μｍｏｌ）を、真空ポンプで２時間乾燥した。アルゴン雰囲気下、０．１Ｍのビス（２－シアノエトキシ）－Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルアミノホスフィンのアセトニトリル溶液（３２０μＬ，３２μｍｏｌ）を加え、室温で１時間撹拌し、目的化合物を製造した。
 
実施例６　３ｍｅｒ（ＡＵＡ）の５’末端ジリン酸化体の製造
　参考例１で製造した３ｍｅｒ（ＡＵＡ）（配列番号１）の５’末端モノリン酸化体の切り出し前のＣＰＧ固相担体（３０．７ｍｇ，０．４μｍｏｌ）をフィルター付きポリプロピレン製カラム（Ｌｉｂｒａ　Ｔｕｂｅ：ハイペップ研究所製）に入れ、アルゴン雰囲気下とした。実施例５で製造した化合物のアセトニトリル溶液をＬｉｂｒａ　Ｔｕｂｅに入っている担体に加え、１－メチル－２－ピロリドン（３６μＬ）を加えて、室温で１０分間反応した。後処理は、実施例２と同様の方法で行った。５’末端ジリン酸化体の純度は７１．３％であった。５’末端ジリン酸化体の純度を５’末端モノリン酸化体の純度で割り、１００を掛けた値を収率とすると、収率は７８％であった。
 
実施例７　６－トリフルオロメチルベンゾトリアゾール－１－イル　（２－シアノエチル）－２－［２’－Ｏ－（４，４’－ジメトキシトリチルオキシ）エチルスルホニル］エチル　　　ホスフェート
　１－ヒドロキシ－６－トリフルオロメチルベンゾトリアゾール（３２．５ｍｇ,１６０μｍｏｌ）を、真空ポンプで１時間乾燥した。アルゴン雰囲気下、０．１Ｍの（２－シアノエトキシ）－２－［２’－Ｏ－（４，４’－ジメトキシトリチルオキシ）エチルスルホニル］エトキシ－Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルアミノホスフィンのアセトニトリル溶液（３２０μＬ，３２μｍｏｌ）を加え、室温で２時間撹拌した。
 
実施例８　３ｍｅｒ（ＡＵＡ）（ＡＵＡ）（配列番号１）の５’末端ジリン酸化体の製造
　参考例１で製造した３ｍｅｒ（ＡＵＡ）（配列番号１）の５’末端モノリン酸化体の切り出し前のＣＰＧ固相担体（３０．７ｍｇ，０．４μｍｏｌ）をフィルター付きポリプロピレン製カラム（Ｌｉｂｒａ　Ｔｕｂｅ：ハイペップ研究所製）に入れ、アルゴン雰囲気下とした。実施例７で製造した化合物のアセトニトリル溶液をＬｉｂｒａ　Ｔｕｂｅに入っている担体に加え、１－メチル－２－ピロリドン（３６μＬ）を加えて、室温で３０分間反応した。後処理は、実施例２と同様の方法で行った。５’末端ジリン酸化体の純度は６５．０％であった。５’末端ジリン酸化体の純度を５’末端モノリン酸化体の純度で割り、１００を掛けた値を収率とすると、収率は７２％であった。
 
実施例９　１２２ｍｅｒの核酸の５’末端ジリン酸化体の製造
１２２ｍｅｒの核酸：５’－ＧＣＣＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＵＧＧＧＡＣＡＵＧＣＵＧＡＡＧＧＧＡＣＡＵＵＵＡＣＣＡＧＵＧＡＵＧＵＡＡＧＵＵＣＵＵＡＵＵＵＧＧＡＡＧＧＣＣＡＡＧＣＵＧＣＣＡＡＧＧＡＡＵＵＣＡＵＵＧＣＵＵＧＧＣＵＧＧＵＧＡＡＡＧＧＣＣＧＡＧＧＡＵＡＡＣＵＡＵＡＵＣＡ－３’（配列番号２）
工程１　
　市販のＮ６－ベンゾイル－５’－Ｏ－（４，４’－ジメトキシトリチル）－２’－Ｏ－（ｔ－ブチルジメチルシリル）アデノシンを担持したＣＰＧ固相担体（３３０．７ｇ，４．３μｍｏｌ）をステンレスカラムに入れ、核酸自動合成機（ＡＫＴＡｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ　ｐｌｕｓ　１０：ＧＥヘルスケア社製）を使用して、標記核酸の配列のとおり合成した後、リン酸化試薬を１回縮合させた。５’末端の保護基を脱保護し、ステンレスカラムごと真空ポンプで５時間乾燥した。５６２ｍｇのＣＰＧ固相担体を得た。
　なお、核酸モノマー化合物として、国際公開２００８／０５０６７０号に記載された方法に従って製造したＮ６－アセチル－５’－Ｏ－（４，４’－ジメトキシトリチル）－２’－Ｏ－（２－シアノエトキシメチル）アデノシン　３’－Ｏ－（２－シアノエチル　Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルホスホロアミダイト）、Ｎ２－フェノキシアセチル－５’－Ｏ－（４，４’－ジメトキシトリチル）－２’－Ｏ－（２－シアノエトキシメチル）グアノシン　３’－Ｏ－（２－シアノエチル　Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルホスホロアミダイト）、Ｎ４－アセチル－５’－Ｏ－（４，４’－ジメトキシトリチル）－２’－Ｏ－（２－シアノエトキシメチル）シチジン　３’－Ｏ－（２－シアノエチル　Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルホスホロアミダイト）、５’－Ｏ－（４，４’－ジメトキシトリチル）－２’－Ｏ－（２－シアノエトキシメチル）ウリジン　３’－Ｏ－（２－シアノエチル　Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルホスホロアミダイト）を使用した。リン酸化試薬として、（２－シアノエトキシ）－２－（２’－Ｏ－４，４’－ジメトキシトリチルオキシエチルスルホニル）エトキシ－Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルアミノホスフィンを使用した。縮合触媒として、５－ベンジルメルカプト－１Ｈ－テトラゾールを、酸化剤としてヨウ素溶液を、キャッピング溶液としてフェノキシ酢酸無水物とＮ－メチルイミダゾール／２，６－ルチジン溶液を使用した。
　得られたＣＰＧ固相担体（４０３ｍｇ，３．１μｍｏｌ）をフィルター付きポリプロピレン製カラム（Ｌｉｂｒａ　Ｔｕｂｅ：ハイペップ研究所製）に入れ、アルゴン雰囲気下、脱水ジクロロメタン（３ｍＬｘ２）で洗浄し、Ｎ，Ｏ－ビス（トリメチルシリル）アセトアミド－ピリジン混合溶液（１：１（ｖ／ｖ），３．６ｍＬ）で２０分間前処理を行った後、１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン（７２０μＬ）を加え、１０分間反応した。得られた担体を脱水ピリジン（３ｍＬｘ３）、脱水ジクロロメタン（３ｍＬｘ３）の順で洗浄後、真空ポンプで１５分間乾燥した。トリエチルアミン－メタノール混合溶液（１：９（ｖ／ｖ），４．０ｍＬ）を加え、室温で３時間反応した。得られたＣＰＧ固相担体を脱水アセトニトリル（４ｍＬｘ３）で洗浄後、真空ポンプで３時間乾燥した。３９７ｍｇのＣＰＧ固相担体を得た。
　サンプルの同定を行うため、少量のＣＰＧ固相担体（２５．６ｍｇ，０．２μｍｏｌ）を用いて後処理を行った。切り出し剤として濃アンモニア水－エタノール混合液を用いて、３５℃で１５時間かけてＣＰＧ固相担体から切り出しおよび塩基の保護基の脱離反応を行った。反応混合物をろ過後、ろ液を減圧下にて濃縮した。残渣に０．６７％のニトロメタンを含む０．６７ＭのテトラブチルアンモニウムフルオリドのＤＭＳＯ溶液（１．５ｍＬ）を加えて室温で５時間３０分反応し、２’位の水酸基の保護基を脱離した。反応液に１Ｍ　トリス塩酸緩衝液（１．０ｍＬ）を氷冷下加え、この溶液をエタノール（４０ｍＬ）に滴下した。生じた沈殿を水（２ｍＬ）に溶解し、ＡＣＡ配列を選択的に切断する酵素であるＭａｚＦ（タカラバイオ社製）用いて５’末端の１７ｍｅｒの核酸（５’－ＧＣＣＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＵＧＧＧ－３’（配列番号３）を切り出した。得られた１７ｍｅｒの核酸の５’末端モノリン酸化体の分子量をＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳにより測定した。
 
ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ：計算値　５５５７．３３
　　　　　　　　　　　　　実測値　５５５８．２２
 
工程２
　１－ヒドロキシベンゾトリアゾール（２１．６ｍｇ,１６０μｍｏｌ）を、真空ポンプで３０分間乾燥した。アルゴン雰囲気下、０．１Ｍのビス（２－シアノエトキシ）－Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルアミノホスフィンのアセトニトリル溶液（３２０μＬ，３２μｍｏｌ）を加え、室温で１時間撹拌し、ベンゾトリアゾール－１－イル　ビス（２－シアノエチル）　ホスフェートを製造した。
 
工程３
　１２２ｍｅｒの核酸の５’末端モノリン酸化体の切り出し前のＣＰＧ固相担体（２５．７ｍｇ，０．２μｍｏｌ）をフィルター付きポリプロピレン製カラム（Ｌｉｂｒａ　Ｔｕｂｅ：ハイペップ研究所製）に入れ、アルゴン雰囲気下とした。工程２で製造したベンゾトリアゾール－１－イル　ビス（２－シアノエチル）　ホスフェートのアセトニトリル溶液をＬｉｂｒａ　Ｔｕｂｅに入っている担体に加え、１－メチル－２－ピロリドン（３６μＬ）を加えて、室温で１０分間反応した。脱水ピリジン（１ｍＬｘ３）、脱水ジクロロメタン（１ｍＬｘ３）の順で洗浄し、Ｎ，Ｏ－ビス（トリメチルシリル）アセトアミド－ピリジン混合溶液（１：１（ｖ／ｖ），３６０μＬ）で２０分間前処理を行った後、１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン（７２μＬ）を加え、１０分間反応した。得られた担体を脱水ピリジン（１ｍＬｘ３）、脱水ジクロロメタン（１ｍＬｘ３）の順で洗浄後、真空ポンプで１５分間乾燥した。２３．０ｍｇのＣＰＧ固相担体を得た。
　切り出し剤として濃アンモニア水－エタノール混合液を用いて、３５℃で１５時間かけてＣＰＧ固相担体から切り出しおよび塩基の保護基の脱離反応を行った。反応混合物をろ過後、ろ液を減圧下にて濃縮した。残渣に０．６７％のニトロメタンを含む０．６７ＭのテトラブチルアンモニウムフルオリドのＤＭＳＯ溶液（１．５ｍＬ）を加えて室温で５時間反応し、２’位の水酸基の保護基を脱離した。反応液に１Ｍ　トリス塩酸緩衝液（１．０ｍＬ）を氷冷下加え、この溶液をエタノール（４０ｍＬ）に滴下し、沈殿物を得た。生じた沈殿を水（２ｍＬ）に溶解し、ＡＣＡ配列を選択的に切断する酵素であるＭａｚＦ（タカラバイオ社製）用いて５’末端の１７ｍｅｒの核酸を切り出した。得られた１７ｍｅｒの核酸の５’末端ジリン酸化体の分子量をＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳにより測定した。ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ測定により得られたスペクトラムを図２に示す。
 
ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ：計算値　５６３７．３０
　　　　　　　　　　　　　実測値　５６３９．１２
 
比較例１　３ｍｅｒ（ＡＵＡ）（配列番号１）の５’末端ジリン酸化体の製造
工程１　
　アルゴン雰囲気下、Ｓ，Ｓ－ジフェニル　ホスホロジチオエート　シクロヘキシルアンモニウム塩（１．２５ｇ、３．２９ｍｍｏｌ）に脱水ピリジン（１５ｍＬ）を加えて溶解させ、溶媒を留去した。この共沸操作を再度行い、真空ポンプで３０分間乾燥した。アルゴン雰囲気下、残渣に脱水ピリジン（２０ｍＬ）を加えて溶解し、メシチレンジスルホニル　ジクロライド（１．３９ｇ、４．３８ｍｍｏｌ）を加えて室温で５０分間撹拌した。
　この反応液を別に用意したナスフラスコに入っている２－{２－（４，４’－ジメトキシトリチル）エチルスルホニル}エタノール（１．００ｇ、２．１９ｍｍｏｌ）に加え、室温で２時間撹拌した。反応終了後、反応液に水を加え、酢酸エチルで分液し、有機層を水で洗浄後、飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムにて乾燥し、ろ過後、溶媒を留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し（溶出溶媒：ヘキサン、酢酸エチル）、２－（２’－Ｏ－４，４’－ジメトキシトリチルオキシエチルスルホニル）エチル　Ｓ，Ｓ－ジフェニル　ホスホロジチオエートを得た（１．２１ｇ，７７％）。
 
１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：　３．０８（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ）；３．４９（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．０Ｈｚ）；３．６０（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ）；３．７８（ｓ，６Ｈ）；４．６５（ｄｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，８．７Ｈｚ）；６．８２－６．８６（ｍ，４Ｈ）；７．２０－７．４４（ｍ，１５Ｈ）；７．５２－７．５６（ｍ，４Ｈ）
３１Ｐ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：　５３．１
 
　アルゴン雰囲気下、５Ｍの次亜リン酸（１０．９ｇ、５２．６ｍｍｏｌ）に脱水ピリジン（１５ｍＬ）を加えて溶解し、溶媒を留去した。この共沸操作をさらに３回行い、真空ポンプで４０分間乾燥した。アルゴン雰囲気下、残渣に脱水ピリジン（１３ｍＬ）を加えて溶解し、トリエチルアミン（６．０１ｍＬ、４３．１ｍｍｏｌ、モレキュラーシーブス５Ａで乾燥済）を加えて室温で数分間撹拌した。この反応液を別に用意したナスフラスコに入っている２－（２’－Ｏ－４，４’－ジメトキシトリチルオキシエチルスルホニル）エチル　Ｓ，Ｓ－ジフェニル　ホスホロジチオエート（１．１５ｇ、１．６０ｍｍｏｌ、脱水ピリジンによる共沸済）に加え、３５℃で１時間撹拌した。反応終了後、反応液にピリジン－氷水（１：１（ｖ／ｖ）、１５０ｍＬ）を加え、水（１００ｍＬ）を追加して、ヘキサンで分液した。水層をヘキサンで２回洗浄後、水層をジクロロメタンで３回抽出操作を行った。有機層を無水硫酸ナトリウムにて乾燥し、ろ過後、溶媒を留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて２回精製した（溶出溶媒：ジクロロメタン、メタノール）。残渣をジクロロメタンに溶解し、１Ｍの重炭酸トリエチルアンモニウム水溶液で２回分液した。有機層を無水硫酸ナトリウムにて乾燥し、ろ過後、溶媒を留去し、Ｓ－フェニル　（２’－Ｏ－４，４’－ジメトキシトリチルオキシエチルスルホニル）エチル　２－ホスホロチオエート　トリエチルアンモニウム塩を得た（５６７ｍｇ，４９％）。
 
１Ｈ－ＮＭＲ（Ｐｙｒｉｄｉｎｅ－ｄ５）δ（ｐｐｍ）：　１．１０（ｔ，９Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ）；２．８６（ｑ，６Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ）；３．６６（ｓ，６Ｈ）；３．７０（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．２Ｈｚ）；３．７９（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．２Ｈｚ）；３．８８（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．８Ｈｚ）；４．８８（ｄｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，８．５Ｈｚ）；５．４２（ｂｓ，１Ｈ）；６．９５－８．０６（ｍ，１８Ｈ）
３１Ｐ－ＮＭＲ（Ｐｙｒｉｄｉｎｅ－ｄ５）δ（ｐｐｍ）：　１４．９
 
工程２
　Ｓ－フェニル　（２’－Ｏ－４，４’－ジメトキシトリチルオキシエチルスルホニル）エチル　２－ホスホロチオエート　トリエチルアンモニウム塩（２３．４ｍｇ、３２μｍｏｌ）を入れ、脱水ピリジン（２ｍＬ）を加えて溶解させ、溶媒を留去した。この共沸操作を再度行い、真空ポンプで３０分間乾燥した。アルゴン雰囲気下、残渣に脱水ピリジン（０．８ｍＬ）を加えて溶解させ、１－ヒドロキシ－４－ニトロ－６－トリフルオロメチルベンゾトリアゾール（２３．８ｍｇ、９６μｍｏｌ）を加え、次にヨウ素（２４．４ｍｇ、９６μｍｏｌ）を加えて、室温で１０分間撹拌した。
 
工程３
　参考例１で製造した３ｍｅｒの核酸（ＡＵＡ）（配列番号１）の５’末端モノリン酸化体の切り出し前のＣＰＧ固相担体（３０．７ｍｇ、０．４μｍｏｌ）をフィルター付きポリプロピレン製カラム（Ｌｉｂｒａ　Ｔｕｂｅ：ハイペップ研究所製）に入れ、アルゴン雰囲気下、脱水アセトニトリル（５ｍＬｘ２）で洗浄し、真空ポンプで１０分間乾燥した。工程２で調製した溶液をＬｉｂｒａ　Ｔｕｂｅに入っている担体に加えて、室温で１０分間反応した。脱水ピリジン（１ｍＬｘ３）、脱水ジクロロメタン（１ｍＬｘ３）の順で洗浄し、３％のジクロロ酢酸のトルエン溶液（１ｍＬｘ３）で４，４’－ジメトキシトリチル基を除去した。脱水ジクロロメタン（１ｍＬｘ３）で洗浄し、Ｎ，Ｏ－ビス（トリメチルシリル）アセトアミド－ピリジン混合溶液（１：１（ｖ／ｖ）、３６０μＬ）で２０分間前処理を行った後、１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン（７２μＬ）を加え、１０分間反応した。得られた担体を脱水ピリジン（１ｍＬｘ３）、脱水ジクロロメタン（１ｍＬｘ３）の順で洗浄後、真空ポンプで１５分間乾燥した。３０．２ｍｇのＣＰＧ固相担体を得た。
　切り出し剤として濃アンモニア水－エタノール混合液を用いて、４０℃で１時間かけてＣＰＧ固相担体から切り出しおよび塩基の保護基の脱離反応を行った。反応混合物をろ過後、ろ液を減圧下にて濃縮した。残渣に０．６７％のニトロメタンを含む０．６７ＭのテトラブチルアンモニウムフルオリドのＤＭＳＯ溶液（０．７５ｍＬ）を加えて室温で２．５時間反応し、２’位の水酸基の保護基を脱離した。反応液に１Ｍ　トリス塩酸緩衝液（０．５ｍＬ）を氷冷下加え、この溶液をエタノール（１２ｍＬ）に滴下し、生じた沈殿をＨＰＬＣ（イオン交換カラム）にて純度を測定した。５’末端ジリン酸化体の純度は２０．７％であった。５’末端ジリン酸化体の純度を５’末端モノリン酸化体の純度で割り、１００を掛けた値を収率とすると、収率は２３％であった。ＨＰＬＣ分析により得られたクロマトグラムを図３に示す。
 

Claims (21)

  1. 次の一般式（Ａ）で表される化合物。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     式中、ＷＧ１，ＷＧ２は、同一または異なって、シアノ、ニトロ、ハロゲン、次の一般式（１）で表される基で保護されたヒドロキシで置換されていてもよいアルキルスルホニルまたはハロゲン、アルキル、アルコキシ、シアノ、およびニトロからなる群から選択される１個～３個の基で置換されていてもよいアリールスルホニルを表す。Ｘ１，Ｘ２，Ｘ３，Ｘ４は、同一または異なって、ＣＲまたはＮを表す。ＲはＨ、メチル、ハロゲン、トリフルオロメチル、シアノ、ニトロ、アルコキシカルボニル、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、スルファモイル、モノアルキルスルファモイル、ジアルキルスルファモイルまたはアルキルスルホニルを表す。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     式中、Ｒ３，Ｒ４，Ｒ５は、同一または異なって、水素またはアルコキシを表す。
  2. ＷＧ１，ＷＧ２が、同一または異なって、シアノ、または２－（４，４’－ジメトキシトリチルオキシ）エチルスルホニルである、請求項１記載の化合物。
  3. Ｘ１，Ｘ２，Ｘ３，Ｘ４がＣＨである、請求項１または２のいずれかに記載の化合物。
  4. Ｘ１，Ｘ３，Ｘ４がＣＨであり、Ｘ２がＣＲであって、Ｒがトリフルオロメチルである、請求項１または２のいずれかに記載の化合物。
  5. Ｘ１がＮであり、Ｘ２，Ｘ３，Ｘ４がＣＨである、請求項１または２のいずれかに記載の化合物。
  6. 請求項１～５のいずれかに記載の化合物を含有することを特徴とするリン酸化剤。
  7. 次の一般式（２）で表される化合物と次の一般式（３）で表される化合物とを作用させることを特徴とする、次の一般式（Ａ）で表される化合物の製造方法。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     式中、ＷＧ１，ＷＧ２は、同一または異なって、シアノ、ニトロ、ハロゲン、次の一般式（１）で表される基で保護されたヒドロキシで置換されていてもよいアルキルスルホニルまたはハロゲン、アルキル、アルコキシ、シアノ、およびニトロからなる群から選択される１個～３個の基で置換されていてもよいアリールスルホニルを表す。Ｒ１，Ｒ２は、同一または異なって、アルキルを表す。Ｘ１，Ｘ２，Ｘ３，Ｘ４は、同一または異なって、ＣＲまたはＮを表す。ＲはＨ、メチル、ハロゲン、トリフルオロメチル、シアノ、ニトロ、アルコキシカルボニル、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、スルファモイル、モノアルキルスルファモイル、ジアルキルスルファモイルまたはアルキルスルホニルを表す。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
     式中、Ｒ３，Ｒ４，Ｒ５は、同一または異なって、水素またはアルコキシを表す。
  8. ＷＧ１，ＷＧ２が、同一または異なって、シアノまたは２－（４，４’－ジメトキシトリチルオキシ）エチルスルホニルである、請求項７記載の製造方法。
  9. Ｘ１，Ｘ２，Ｘ３，Ｘ４がＣＨである、請求項７または８のいずれかに記載の製造方法。
  10. Ｘ１，Ｘ３，Ｘ４がＣＨであり、Ｘ２がＣＲであって、Ｒがトリフルオロメチルである、請求項７または８のいずれかに記載の製造方法。
  11. Ｘ１がＮであり、Ｘ２，Ｘ３，Ｘ４がＣＨである、請求項７または８のいずれかに記載の製造方法。
  12. 次の一般式（４）で表される化合物に次の一般式（Ａ）で表される化合物を作用させることを特徴とする、次の一般式（５）で表される化合物の製造方法。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
     式中、Ｅは固相担体を表す。ＺＰは、保護されていてもよい核酸を表す。ＷＧ１，ＷＧ２は、同一または異なって、シアノ、ニトロ、ハロゲン、次の一般式（１）で表される基で保護されたヒドロキシで置換されていてもよいアルキルスルホニルまたはハロゲン、アルキル、アルコキシ、シアノ、およびニトロからなる群から選択される１個～３個の基で置換されていてもよいアリールスルホニルを表す。Ｘ１，Ｘ２，Ｘ３，Ｘ４は、同一または異なって、ＣＲまたはＮを表す。ＲはＨ、メチル、ハロゲン、トリフルオロメチル、シアノ、ニトロ、アルコキシカルボニル、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、スルファモイル、モノアルキルスルファモイル、ジアルキルスルファモイルまたはアルキルスルホニルを表す。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
     式中、Ｒ３，Ｒ４，Ｒ５は、同一または異なって、水素またはアルコキシを表す。
  13. ＷＧ１，ＷＧ２が、同一または異なって、シアノまたは２－（４，４’－ジメトキシトリチルオキシ）エチルスルホニルである、請求項１２記載の製造方法。
  14. Ｘ１，Ｘ２，Ｘ３，Ｘ４がＣＨである、請求項１２または１３のいずれかに記載の製造方法。
  15. Ｘ１，Ｘ３，Ｘ４がＣＨであり、Ｘ２がＣＲであって、Ｒがトリフルオロメチルである、請求項１２または１３のいずれかに記載の製造方法。
  16. Ｘ１がＮであり、Ｘ２，Ｘ３，Ｘ４がＣＨである、請求項１２または１３のいずれかに記載の製造方法。
  17. 次の工程１～工程３を含む、次の一般式（９）で表される化合物の製造方法。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
     式中、Ｚは核酸を表す。
    （工程１）次の一般式（４）で表される化合物に次の一般式（Ａ）で表される化合物を作用させて、次の一般式（５）で表される化合物を製造する工程；
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
     式中、Ｅは固相担体を表す。ＺＰは、保護されていてもよい核酸を表す。ＷＧ１，ＷＧ２は、同一または異なって、シアノ、ニトロ、ハロゲン、次の一般式（９）で表される基で保護されたヒドロキシで置換されていてもよいアルキルスルホニルまたはハロゲン、アルキル、アルコキシ、シアノ、およびニトロからなる群から選択される１個～３個の基で置換されていてもよいアリールスルホニルを表す。Ｘ１，Ｘ２，Ｘ３，Ｘ４は、同一または異なって、ＣＲまたはＮを表す。ＲはＨ、メチル、ハロゲン、トリフルオロメチル、シアノ、ニトロ、アルコキシカルボニル、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、スルファモイル、モノアルキルスルファモイル、ジアルキルスルファモイルまたはアルキルスルホニルを表す。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
     式中、Ｒ３，Ｒ４，Ｒ５は、同一または異なって、水素またはアルコキシを表す。
    （工程２）化合物（５）に次の一般式（６）で表されるシリル化剤と塩基を作用させて、次の一般式（７）で表される化合物を製造する工程；
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
     式中、ＷＧ１，ＷＧ２，Ｅ，ＺＰは、前記と同義である。Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８は、同一または異なって、アルキル、フェニル、またはナフチルを表す。Ｙはハロゲン、トリフルオロメタンスルホニルオキシ、または、次の一般式（８）で表される基を表す。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
     式中、Ｒ６，Ｒ７，Ｒ８は、前記と同義である。Ｒ９はアルキルを表す。
    （工程３）化合物（７）が有する保護基を全て脱離して、化合物（９）を製造する工程。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
     式中、Ｅ，Ｒ６，Ｒ７，Ｒ８，ＺＰは、前記と同義である。Ｚは核酸を表す。
  18. ＷＧ１、ＷＧ２が、同一または異なって、シアノまたは２－（４，４’－ジメトキシトリチルオキシ）エチルスルホニルである、請求項１７記載の製造方法。
  19. Ｘ１，Ｘ２，Ｘ３，Ｘ４がＣＨである、請求項１７または１８のいずれかに記載の製造方法。
  20. Ｘ１，Ｘ３，Ｘ４がＣＨであり、Ｘ２がＣＲであって、Ｒがトリフルオロメチルである、請求項１７または１８のいずれかに記載の製造方法。
  21. Ｘ１がＮであり、Ｘ２，Ｘ３，Ｘ４がＣＨである、請求項１７または１８のいずれかに記載の製造方法。
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