CN102918052A - 硫代磷酸核糖核苷的制造方法 - Google Patents

硫代磷酸核糖核苷的制造方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及硫代磷酸核糖核苷的制造方法，其为基于噁唑磷烷法的硫代磷酸RNA的制造方法，其特征在于，作为RNA的2'-羟基的保护基，使用氰基乙氧基甲基来代替叔丁基二甲基甲硅烷基。

Description

硫代磷酸核糖核苷的制造方法
技术领域
本发明涉及立体选择性地制造硫代磷酸核糖核苷(リボヌクレオシドホスホロチオエート，ribonucleoside phosphorothioate)的方法。
背景技术
硫代磷酸RNA为磷酸二酯键的一个非交联氧原子被硫原子所取代的RNA类似物。与天然型RNA相比，可期待硫代磷酸RNA具有较高的核酸酶抗性和细胞膜透过性，因而作为RNA型核酸药物目前其是最有前途的(Mol.Ce11.,6,pp.1077-1087,2000；Biochemistry，42,pp.7967-7975,2003；Nucleic Acids Res.,31,pp.589-595,2003等)。
硫代磷酸RNA中在磷原子上具有手性中心，因而存在二种空间异构体(Rp和Sp体)，已知这些空间异构体分别具有不同的生物化学性质和物理学性质(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,75,pp.4798-4800,1978；Biochemistry，22,pp.1369-1377,1983)。因而，在硫代磷酸RNA的制造时，希望选择性地制造具有所期望的立体构型的化合物。但是，难以在制造硫代磷酸RNA的同时进行磷原子的立体控制，期待提供能够有效地进行立体选择性合成的方法。
作为硫代磷酸RNA的合成方法，已知有酶法(Nucleic Acids Res.,10,pp.4145-4162,1987)、H-膦酸酯法(J.Org.Chem.,57,pp.6163-6169,1992)、H-膦酸酯法与酶反应组合而成的方法(Nucleic Aicds Res.,24,pp.3811-3820,1996)、氧杂硫代膦杂环戊烷(オキサチアホスホラン)法(J.Org.Chem.,61,pp.6713-6716,1996)，但均不能说是满足了立体选择性等方面的方法。
作为硫代磷酸DNA的合成方法，已知有下述方法：将由光学活性1,2-氨基醇衍生的光学纯核苷3'-噁唑磷烷(オキサザホスホリジン，Oxazaphospholidine，氧氮磷杂环戊烷)衍生物作为单体单元，使用亲核性小的弱酸性活化剂N-(氰基甲基)吡咯烷鎓·三氟甲磺酸盐(CMPT)进行缩合(噁唑磷烷法：J.Am.Chem.Soc.,130,pp.16031-16037,2008)。在该方法中，通过使用二环式的噁唑磷烷，在磷原子上的亲核取代反应中在非对映体间明显出现活化能量的差异，得到了较高的非对映立体选择性。
另外，该方法中含有下述工序，并通过对应于目标碱基序列而反复进行各步骤，从而能够合成长链硫代磷酸DNA；所述工序为：使单体单元与承载在可控孔度玻璃(controlled pore glass：CPG)等固相载体上的核苷衍生物进行缩合，之后进行未反应的5'-羟基和手性辅助基团仲胺的帽化、亚磷酸酯的硫化、5'-末端的4,4'-二甲氧基三苯甲基(DMTr)的脱保护。上述出版物中报告了立体化学纯硫代磷酸胸苷酸10聚体的合成。
有文献报告了通过将上述噁唑磷烷法应用于硫代磷酸RNA的合成中来立体选择性地合成硫代磷酸的方法(Org.Lett.,11,pp.967-970,2009)。在该方法中，作为RNA的2'-羟基的保护基使用了叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)，该基团在链增长反应条件下稳定、且在中性条件下可容易地由四丁基氟化铵(TBAF)进行脱保护；使用CMPT作为活化剂；该方法成功地进行了四聚体以上的合成，立体选择地进行了all-(Rp)-[Ups]9U和all-(Sp)-[Ups]9U的合成。
但是，该方法具有反应性低、在长链低聚物的合成中缩合效率不充分这样的问题。根据本发明人的研究，若使用苯并咪唑鎓·三氟甲磺酸盐(BIT)或N-苯基咪唑鎓·三氟甲磺酸盐(PhIMT)作为亲核性高于CMPT的活化剂，则可改善缩合效率、可立体选择性地进行硫代磷酸尿嘧啶核苷酸10聚体的合成；但通过使用亲核性高的活化剂，会产生差向异构化进行而使非对映立体选择性降低这样的问题。
另一方面，作为低聚核糖核酸等核酸衍生物的制造中所用的2'-位羟基的保护基，已知有氰基乙氧基甲基(-CH2-O-CH2-CH2-CN:CEM，Org.Lett.,7,pp.3477-3480,2005；国际公开WO2006/22323)。在中性条件下，该保护基通过使氟离子发挥作用而可被去除；在对由TBDMS保护的单体进行偶联的情况下，平均缩合收率为97%(Tetrahedron Letters,43,pp.795-797,2002，第795页左栏8～11行)，与此相对，在同样的缩合反应中，经上述保护的单体获得了99%以上的平均缩合收率(Org.Lett.,7,pp.3477-3480,2005，第3479页右栏下数第5～3行)。需要说明的是，在公开了噁唑磷烷法的专利文献(WO2005/92909)中，示出了2-(氰基乙氧基)乙基(CEE)作为2'-位羟基的保护基，但并未提及氰基乙氧基甲基。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：Mol.Cell.,6,pp.1077-1087,2000
非专利文献2：Biochemistry，42,pp.7967-7975,2003；
非专利文献3：Nucleic Acids Res.,31,pp.589-595,2003
非专利文献4：Proc.Natl.Acad.Sci.USA,75,pp.4798-4800,1978
非专利文献5：Biochemistry，22,pp.1369-1377,1983
非专利文献6：Nucleic Acids Res.,10,pp.4145-4162,1987
非专利文献7：J.Org.Chem.,57,pp.6163-6169,1992
非专利文献8：Nucleic Aicds Res.,24,pp.3811-3820,1996
非专利文献9：J.Org.Chem.,61,pp.6713-6716,1996
非专利文献10：J.Am.Chem.Soc.,130,pp.16031-16037,2008
非专利文献11：Org.Lett.,11,pp.967-970,2009
非专利文献12：Tetrahedron Letters,43,pp.795-797,2002
非专利文献13：Org.Lett.,7,pp.3477-3480,2005
专利文献
专利文献1：国际公开WO2006/22323
专利文献2：WO2005/92909
发明内容
发明所要解决的课题
本发明的课题在于提供立体选择性地且有效地合成寡聚硫代磷酸核糖核苷的方法。
用于解决课题的手段
本发明人为了对基于Org.Lett.,11,pp.967-970,2009所述的噁唑磷烷法的硫代磷酸RNA的合成方法进行改良而进行了深入研究，结果发现，在不使用叔丁基二甲基甲硅烷基而使用氰基乙氧基甲基作为RNA的2'-羟基的保护基时，可以达成极高的缩合效率；并且发现，在使用作为亲核性小的活化剂的N-(氰基甲基)吡咯烷鎓·三氟甲磺酸盐的情况下，也可无损于非对映立体选择性地得到能够充分适用于长链寡聚硫代磷酸核糖核苷的合成的高缩合效率。并且发现，即使使用作为亲核性高的活化剂的N-苯基咪唑鎓·三氟甲磺酸盐(PhIMT)时，也可得到高立体选择性、可得到能够充分适用于包括4种核酸碱基的长链寡聚硫代磷酸核糖核苷的合成的高缩合效率。本发明是基于上述见解而完成的。
即，根据本发明，提供了一种硫代磷酸核糖核苷或其盐的制造方法，其为下述通式(I)所表示的硫代磷酸核糖核苷或其盐的制造方法，其中，该方法包括使下述通式(IVa)或(IVb)所表示的噁唑磷烷核糖核苷缩合在下述通式(III)所表示的化合物上之后进行硫化的工序：
Figure BDA00002096220300041
〔式中，R1表示氢原子或羟基的保护基，Bs表示具有或不具有保护基的核酸碱基，n表示0或1以上的整数，n个X各自独立地表示下述通式(II-Sp)或(II-Rp)所示的二价基团：
(式(II-Sp)和式(II-Rp)中，Bs与上述含义相同，R2表示氢原子或氰基乙氧基甲基)〕；
Figure BDA00002096220300043
(式(III)中，Bs、X以及n与上述含义相同，R3和R4各自独立地表示羟基的保护基，其任意一方可以表示根据需要藉由连接基团(リンカー)而结合的固相载体)；
Figure BDA00002096220300044
(式(IVa)和式(IVb)中，Bs与上述含义相同，CEM表示氰基乙氧基甲基，R5表示羟基的保护基，R6表示具有或不具有取代基的芳基)。
根据上述方法的优选方式，可以提供：R6为苯基的上述方法；R5为4,4'-二甲氧基三苯甲基的上述方法；在活化剂的存在下进行缩合的上述方法；使用N-(氰基甲基)吡咯烷鎓·三氟甲磺酸盐(CMPT)或N-苯基咪唑鎓·三氟甲磺酸盐(PhIMT)作为活化剂的上述方法；使用二硫化二甲基秋兰姆(DTD)作为硫化剂的上述方法；通过固相法来进行反应的上述方法；n+1个X全部为以(II-Sp)表示的二价基团、或者全部为以(II-Rp)表示的二价基团的上述方法。
从另一方面出发，根据本发明，提供了一种硫代磷酸核糖核苷或其盐，其以上述通式(I)(式中，R1、Bs、n以及X与上述含义相同，但R2表示氰基乙氧基甲基)来表示。
另外，根据本发明，提供了一种噁唑磷烷核糖核苷，其以上述通式(IVa)或(IVb)(式中，Bs、CEM、R5、和R6与上述含义相同)来表示。
发明效果
利用本发明的方法可以立体选择性地且有效地合成寡聚硫代磷酸核糖核苷。根据本发明的方法，可以立体选择性地达成极高的缩合效率，因而可通过适用于固相法来高收率地进行长链寡聚硫代磷酸核糖核苷的制造。
附图说明
图1为示出了例6中得到的硫代磷酸RNA 4聚体的HPLC色谱图(HPLC profile)的图。
图2为示出了例6中得到的硫代磷酸RNA 2聚体的HPLC色谱图的图。
图3为示出了例7中得到的硫代磷酸RNA 12聚体的HPLC色谱图的图。
图4为示出了对硫代磷酸RNA 12聚体的酶耐性进行调查的结果的图。
图5为示出了All-(Rp)和(Sp)-(CpsApsGpsU)3-r(ApoCpoUpoG)3的熔解曲线的图。
图6为示出了例12中得到的硫代磷酸RNA 12聚体的HPLC色谱图的图。
具体实施方式
通式(I)中的R1表示氢原子或羟基的保护基。对于羟基保护基的种类没有特别限定，通常可以使用下述适宜的保护基：乙酰基、苯氧基乙酰基(Pac)等乙酰基保护基；苄基、4-甲氧基苄基等苄基保护基；苯甲酰基、新戊酰基、4,4'-二甲氧基三苯甲基(DMTr)等三苯甲基保护基；三甲基甲硅烷基(TMS)、叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)等甲硅烷基保护基；2-(氰基乙氧基)乙基(CEE)、氰基乙氧基甲基(CEM)等醚保护基等。关于羟基的保护基，可以参照Green等人的Protective Groups in Organic Synthesis,3rdEdition,1999,John Wiley & Sons,Inc.等成书。R1表示保护基的情况下，优选R1的保护基与其它保护基为不同的保护基，以使得在合成过程中可选择性地进行该保护基或其它保护基的脱离。作为R1的保护基，例如优选使用三苯甲基保护基，更优选使用4,4'-二甲氧基三苯甲基。
Bs表示具有或不具有保护基的核酸碱基。作为核酸碱基，可以使用选自由腺嘌呤、尿嘧啶、胸腺嘧啶、鸟嘌呤以及胞嘧啶组成的组中的核酸碱基，除此之外，还可以使用胸腺嘧啶核糖核苷或5-甲基尿嘧啶核苷等任意的修饰碱基。优选可以使用选自由作为RNA的构成碱基的腺嘌呤、尿嘧啶、鸟嘌呤以及胞嘧啶组成的组中的核酸碱基。核酸碱基可为残基，以通常的键合部位与核糖结合。在其它通式中，Bs也与上述相同。
核酸碱基具有保护基的情况下，对于保护基的种类没有特别限定，在使用具有氨基的核酸碱基的情况下，可以对氨基进行保护。例如，有时优选对作为具有氨基的核酸碱基的腺嘌呤、鸟嘌呤以及胞嘧啶的氨基进行保护，作为保护基，可以使用例如苯甲酰基、4-甲氧基苯甲酰基、乙酰基、丙酰基、丁酰基、异丁酰基、苯基乙酰基、苯氧基乙酰基、4-叔丁基苯氧基乙酰基、4-异丙基苯氧基乙酰基、(二甲氨基)亚甲基等。在其它通式中，Bs也与上述相同。通式(I)所表示的硫代磷酸核糖核苷或其盐所具有的n+2个Bs分别可以相同或不同。
n表示0或1以上的整数，n优选为100以下的整数、更优选为50以下的整数、进一步优选为40以下的整数。通式(I)中，n个X各自独立地表示以上述通式(II-Sp)或(II-Rp)表示的二价基团，与上述说明同样地，n个X所含有的n个Bs分别可以相同或不同。R2表示氢原子或氰基乙氧基甲基，但对于R2为氢原子的化合物来说，可以通过在利用本发明的合成方法制造了R2为氰基乙氧基甲基的硫代磷酸核糖核苷之后进行氰基乙氧基甲基的脱离而制造得到。
通式(I)所表示的硫代磷酸核糖核苷的盐的种类没有特别限定，例如可以优选使用铵盐、有机胺的盐、以及钠盐、钾盐、镁盐等金属盐等，更优选可以使用例如铵盐、三乙胺盐等烷基叔胺化合物的盐、钠盐等。通式(I)所表示的硫代磷酸核糖核苷或其盐可以为水合物或溶剂合物的形态。通式(I)所表示的硫代磷酸核糖核苷中的立体标记表示的是绝对构型，但利用本发明的方法也可以制造出通式(I)所表示的硫代磷酸核糖核苷的光学对映体。
对于通式(I)所表示的硫代磷酸核糖核苷，可以通过使上述通式(IVa)或(IVb)所表示的噁唑磷烷核糖核苷缩合在上述通式(III)所表示的化合物上后进行硫化来进行制造。通式(III)中的R3和R4各自独立地表示羟基的保护基。羟基的保护基如上述所说明，可以根据目的选择适宜的保护基，R3和R4所示的保护基可以相同也可以不同。并且，在进行固相法的情况下，根据需要，R3和R4之中的任意一方可以为藉由连接基团而结合的固相载体。这种情况下，余下的一方中可以使用通常的羟基保护基。
对于固相载体的种类没有特别限定，只要能够在核酸衍生物的合成中作为固相载体使用，就可以使用任意的固相载体。对于连接基团的种类、长度亦无特别限制，本领域技术人员可以适宜选择。例如作为固相载体，可以举出可控孔度玻璃(controlledpore glass：CPG)、草酰化-可控孔度玻璃(Nucleic Acids Res.,19,1527,1991等)、TentaGel支载体-氨基聚乙二醇衍生物化支载体(Tetrahedron Letters,34,3373,1993等)、Poros-聚苯乙烯/二乙烯基苯共聚物等，作为特别优选的固相载体，可以使用高交联氨甲基聚苯乙烯(highly cross-linked polystyrene:HCP，Tetrahedron Letters,32,4096,1991)等。作为连接基团，可以举出例如3-氨基丙基、琥珀酰基、2,2'-二乙醇磺酰基、长链烷基氨基(LCAA)等。
通式(IVa)或(IVb)所表示的噁唑磷烷核糖核苷中，R5表示羟基的保护基，羟基的保护基如上述所说明，可以根据目的选择适宜的保护基。例如优选使用三苯甲基保护基、更优选使用4,4'-二甲氧基三苯甲基。R6表示具有或不具有取代基的芳基。作为芳基可以使用单环性或稠合多环性的芳基，优选可以使用苯基。苯基中可以存在有1个或2个以上的烷基、烷氧基、卤原子等取代基。优选可以使用无取代苯基作为R6。
上述的缩合反应和硫化反应可以参照J.Am.Chem.Soc.,130,pp.16031-16037,2008、Org.Lett.,11,pp.967-970,2009以及WO2005/92909所述的条件来进行。上述专利文献(WO2005/92909)公开的全部内容以参考的形式包含在本说明书的公开内容中。为了提高缩合反应的效率，可以在活化剂的存在下进行缩合反应。对于活化剂的种类没有特别限定，由于本发明方法的反应性极高，因而即使使用例如亲核性低的N-(氰基甲基)吡咯烷鎓·三氟甲磺酸盐(CMPT)等，也可以在无损于立体选择性的情况下达成缩合效率的大幅改善。并且，即使使用作为亲核性高的活化剂的N-苯基咪唑鎓·三氟甲磺酸盐(PhIMT)也可得到高立体选择性，可得到能够充分适用于包括4种核酸碱基的长链寡聚硫代磷酸核糖核苷的合成的高缩合效率。对于硫化剂也没有特别限定，例如可使用二硫化二甲基秋兰姆(DTD)等。
在上述方法中，作为n+1个X，可以将(II-Sp)所表示的二价基团或(II-Rp)所表示的二价基团以任意个数进行组合，但优选制造通式(I)中的n+1个X全部为以(II-Sp)表示的二价基团、或者全部为以(II-Rp)表示的二价基团的硫代磷酸核糖核苷。
通过在使上述通式(IVa)或(IVb)所表示的噁唑磷烷核糖核苷相对于上述通式(III)所表示的化合物进行缩合，之后进行硫化，由此来制造通式(I)所表示的硫代磷酸核糖核苷，其后使用所得到的硫代磷酸核糖核苷作为起始原料来进行上述通式(IVa)或(IVb)所表示的噁唑磷烷核糖核苷的缩合，之后进行硫化，由此可以制造硫代磷酸核糖核苷单元(X)增加了一个的化合物，进一步使用所得到的化合物作为起始原料来进行上述通式(IVa)或(IVb)所表示的噁唑磷烷核糖核苷的缩合，之后进行硫化，由此可以使硫代磷酸核糖核苷单元(X)再增加一个。通过反复进行该反应，可以制造具有所期望的n+1个硫代磷酸核糖核苷单元(X)的通式(I)所表示的硫代磷酸核糖核苷。
基于上述反复进行的硫代磷酸核糖核苷的制造可优选通过固相法来进行。也可以应用基于固相法的寡聚核酸合成法，使用自动合成机来进行合成。关于固相法可以利用各种文献，本领域技术人员可以容易地选择出适宜的条件。例如，在进行固相法时，进行帽化及从固相载体分离的条件也可由本领域技术人员适宜选择。
氰基乙氧基甲基的脱保护可以利用四丁基氟化铵(TBAF)来选择性地进行(Nucleic Acids Res.,35,pp.3287-3296,2007)。为了抑制脱保护时副生成的丙烯腈加成在核酸碱基上，可以通过少量(例如0.5%左右)加入作为丙烯腈捕捉剂的硝基甲烷来抑制副反应，从而以高收率地进行脱保护。
实施例
下面通过实施例进一步具体说明本发明，但本发明的范围并不限于下述的实施例。需要说明的是，只要没有特别说明，“h”表示“小时”，“min”表示“分钟”，“equiv”表示“当量”，“rt”表示“室温”，“sec”表示“秒”。
例1
(a)O6-氰基乙基-N2-苯氧基乙酰基-3',5'-O-(二叔丁基硅烷二基)-2'-O-(2-氰基乙氧基甲基)鸟嘌呤核苷
Figure BDA00002096220300091
利用甲苯、二氯甲烷反复进行共沸来进行干燥，将N2-苯氧基乙酰基-3',5'-O-(四异丙基二硅氧烷-1,3-二基)-2'-O-(2-氰基乙氧基甲基)鸟嘌呤核苷(11.175g,14.9mmol)制成二氯甲烷溶液(100ml)。加入N,N-二甲氨基吡啶(DMAP，0.092g,0.75mmol)、三乙胺(8.3ml,59.6mmol)和三甲苯磺酰基氯(3.920g,17.9mmol)，在室温下进行30分钟搅拌。利用饱和碳酸氢钠水溶液(30ml×3)对反应混合物进行清洗，利用二氯甲烷(30ml×2)对收集的清洗液进行提取。利用无水硫酸钠对有机层进行干燥，之后进行过滤，在减压下浓缩。利用甲苯、二氯甲烷反复共沸来进行干燥，将残渣制成二氯甲烷溶液(100ml)。将其冷却至0℃，加入N-甲基吗啉(15.9ml,149mmol)，保持在0℃的状态下进行20分钟搅拌。向其中加入2-氰基乙醇(10.1ml,149mmol)、1,8-二氮杂双环[5,4,0]十一碳-7-烯(BDU,3.3ml,22.1mmol)，在0℃进行25分钟搅拌后，加入1MKH2PO4水溶液(50ml)。分离有机层后，利用1M KH2PO4水溶液(50ml×2)进行清洗，利用二氯甲烷(30ml×2)对收集的清洗液进行提取。利用无水硫酸钠对有机层进行干燥，之后进行过滤，在减压下浓缩。利用硅胶柱色谱法[200g硅胶,乙酸乙酯-己烷(50:50,v/v→100:0,v/v)]对残渣进行提纯。利用饱和碳酸氢钠水溶液(30ml×3)对其进行清洗，利用二氯甲烷(30ml×2)对收集的清洗液进行提取。利用无水硫酸钠对有机层进行干燥，之后进行过滤，在减压下浓缩，从而得到目标物(6.200g,52%)。为无色非晶态。
1H NMR(300MHz,CDCl3)δ8.92(H,br.s,2-NH),8.31(H,s,8-H),7.38-7.40(2H,m,Pac的m),6.98-7.11(3H,m,o,Pac的p),6.16(H,s,1'-H),5.10,5.20(H,2d,3J=7.2Hz,CEM的-OCH2),4.77-4.85(3H,m,2'-H,Ce的-OCH2),4.69(2H,s,Pac的-CH2),4.53(H,dd,3J=4.2,9.3Hz,3'-H),4.29-4.35(2H,m,CEM的-OCH2O),4.01-4.08(2H,m,5'-H),3.81-3.92(H,m,4'-H),3.02(2H,t,3J=6.8Hz,Ce的-CH2CN),2.61-2.66(2H,m,CEM的-CH2CN),0.95-1.12(32H,m,t-Bu)
(b)O6-氰基乙基-N2-苯氧基乙酰基-2'-O-(2-氰基乙氧基甲基)鸟嘌呤核苷
Figure BDA00002096220300101
利用甲苯、四氢呋喃反复共沸来进行干燥，将O6-氰基乙基-N2-苯氧基乙酰基-3',5'-O-(二叔丁基硅烷二基)-2'-O-(2-氰基乙氧基甲基)鸟嘌呤核苷(5.280g,6.6mmol)制成四氢呋喃溶液(35ml)。将其加热至35℃，小心地滴加三乙胺·3HF(1.3ml,8.0mmol)，在35℃的状态下进行4.5小时搅拌。冷却至0℃后，加入水5ml，在0℃的状态下对反应混合物进行1小时搅拌。减压蒸馏除去反应混合物中的四氢呋喃后，加入二乙醚7.5ml，在室温下进行1小时搅拌。通过抽滤回收所生成的沉淀物，利用二乙醚(3ml×3)进行清洗后，在减压下蒸馏除去溶剂。利用甲醇(40ml)使其再结晶，之后利用二乙醚(3ml×3)对所得物进行清洗，在减压下蒸馏除去溶剂，从而得到目标物(2.105g,57%)。为无色非晶态。
1H NMR(300MHz,氘代DMSO)δ8.57(H,s,8-H),7.28-7.33(2H,m,Pac的m),6.93-6.96(3H,m,Pac的o.p),6.09(H,d,3J=6.0Hz,1'-H),5.39-5.41(H,m,2'-H),5.11(2H,t,3J=5.3Hz,Pac的-CH2),5.05(H,br.s,3'-OH),4.67-4.78(3H,m,5'-OH,CEM的-OCH2O),4.36(1H,ddd,3J=3.6,3.6,4.7Hz,3'-H),3.98(H,d,3J=3.6Hz,4'-H),3.57-3.72(3H,m,5'-H,Ce的-OCH2),3.32-3.48(2H,m,CEM的-OCH2),3.16-3.22(2H,m,Ce的-CH2CN),2.50-2.66(2H,m,CEM的-CH2CN)
(c)O6-氰基乙基-N2-苯氧基乙酰基-5'-O-(4,4'-二甲氧基三苯甲基)-2'-O-(2-氰基乙氧基甲基)鸟嘌呤核苷
利用吡啶反复共沸来进行干燥，将O6-氰基乙基-N2-苯氧基乙酰基-2'-O-(2-氰基乙氧基甲基)鸟嘌呤核苷(1.633g,3.0mmol)制成吡啶溶剂(10ml)。将其冷却至0℃，加入4,4'-二甲氧基三苯甲基(DMTr)氯(1.197g,3.5mmol)。在恢复到室温的情况下进行2小时搅拌，之后加入甲醇(5ml)，减压下蒸馏除去溶剂，制成氯仿溶液(50ml)。利用饱和碳酸氢钠水溶液(30ml×3)对其进行清洗，利用氯仿(20ml×3)对收集的清洗液进行提取。利用无水硫酸钠对有机层进行干燥，之后进行过滤，在减压下浓缩。利用硅胶柱色谱法[55g硅胶,乙酸乙酯-己烷-吡啶(25:75:0.5,v/v/v→100:0:0.5,v/v/v)]对残渣进行提纯，得到目标物(2.467g,98%)。为无色非晶态。
1H NMR(300MHz,CDCl3)δ8.88(H,s,2-NH),8.10(H,s,8-H),6.99-7.42(14H,m,Ph,DMTr的m至OMe,Pac的Ph),6.79(4H,d,3J=8.1Hz,DMTr的o至OMe),6.24(H,d,3J=3.9Hz,1'-H),5.01(H,d,3J=7.2Hz,CEM的-OCH2),4.95(H,d,3J=6.9Hz,CEM的-OCH2),4.79-4.90(3H,m,2'-H,Ce的-OCH2),4.65(2H,br.s,Pac的-CH2),4.26(H,d,3J=3.3Hz,3'-H),3.65-3.78(9H,m,DMTr的-OMe,CEM的-OCH2O,4'-H),3.49(2H,s,5'-H),3.36(H,br.s,3'-OH),3.02(2H,t,3J=6.6Hz,Ce的-CH2CN),2.50(2H,t,3J=6.2Hz,CEM的-CH2CN)
例2
Figure BDA00002096220300111
(a)5'-O-(4,4'-二甲氧基三苯甲基)-3′-O-[(2R,4S,5R)-5-苯基-四氢-1H,3H-吡咯[1,2-c]-1,3,2-噁唑磷烷-2-基]-2'-O-(2-氰基乙氧基甲基)尿嘧啶核苷[(Rp)]
与吡啶、甲苯反复进行共沸来进行干燥，将5'-O-(4,4'-二甲氧基三苯甲基)-2'-O-(2-氰基乙氧基甲基)尿嘧啶核苷(0.630g,1.0mmol)制成四氢呋喃溶液(5ml)。向其中加入三乙胺(1.0ml,7.1mmol)，冷却至-78℃后，在保持-78℃的状态下，小心地滴加(4S,5R)噁唑磷烷氯化物的0.5M四氢呋喃溶液(6ml，3.0mmol)。一边恢复到室温一边进行1.5小时搅拌，之后利用氯仿(400ml)稀释，加入饱和碳酸氢钠水溶液(100ml)。分离有机层后，利用饱和碳酸氢钠水溶液(100ml×2)清洗，利用氯仿(30ml×2)对收集的清洗液进行提取。利用无水硫酸钠对有机层进行干燥，之后进行过滤，在减压下浓缩。利用硅胶色谱法[15g NH硅胶,甲苯-乙酸乙酯-三乙胺(60:40:0.1,v/v/v)]对残渣进行提纯。收集含有目标物的级分，利用饱和碳酸氢钠水溶液(100ml)进行清洗，之后利用无水硫酸钠对有机层进行干燥、过滤，在减压下浓缩，从而得到目标物(0.520g,62%)。为无色非晶态。
1H NMR(300MHz,CDCl3)δ8.07(H,d,3J=8.1,6-H)7.24-7.28(14H,m,5″-Ph,DMTr的m至OMe,DMTr的Ph),6.76-6.82(4H,m,DMTr的o至OMe),5.95(H,d,3J=1.2Hz,1'-H),5.75(H,d,3J=6.6Hz,5″-H),5.16(H,d,3J=8.1Hz,5-H),4.96,5.01(2H,2d,3J=7.2Hz,CEM的-OCH2),4.89(H,ddd,3J=6.9,6.9,8.4Hz,3'-H),4.35(H,dd,3J=1.2,4.8Hz,2'-H),4.21(H,d,3J=8.1Hz,4'-H),3.87-3.94(3H,m,4″-H,CEM的-OCH2O),3.74,3.77(6H,2s,DMTr的-OMe),3.52-3.60(3H,m,5'-H,6″-H),3.07-3.13(H,m,6″-H),2.67(2H,ddd,3J=2.7,6.5,6.5Hz,CEM的-CH2CN),1.56-1.62(2H,m,7″-H),0.94-1.28(2H,m,8″-H)
31P NMR(121MHz,CDCl3)δ158.2
(b)N6-乙酰基-5'-O-(4,4'-二甲氧基三苯甲基)-3'-O-[(2R,4S,5R)-5-苯基-四氢-1H,3H-吡咯[1,2-c]-1,3,2-噁唑磷烷-2-基]-2'-O-(2-氰基乙氧基甲基)腺嘌呤核苷[(Rp)].
向N6-乙酰基-5'-O-(4,4'-二甲氧基三苯甲基)-2'-O-(2-氰基乙氧基甲基)腺嘌呤核苷(0.695g,1.0mmol)中加入三乙胺(1.0ml,7.1mmol)、(4S,5R)-噁唑磷烷氯化物的0.5M四氢呋喃溶液(6ml,3.0mmol)，在室温进行2小时搅拌。利用硅胶色谱法[25g NH硅胶,甲苯-乙酸乙酯-三乙胺(20:10:0.03,v/v/v)]对残渣进行精制，从而得到目标物(0.443g,49%)。为无色非晶态。
1H NMR(300MHz,CDCl3)δ8.77(H,br.s,6-NH),8.61(H,s,2-H),8.26(H,s,8-H),7.20-7.45(14H,m,5″-Ph,DMTr的m至OMe,DMTr的Ph),6.80(4H,d,3J=9.0Hz,DMTr的o至OMe),6.24(H,d,3J=4.8Hz,1'-H),5.77(H,d,3J=6.3Hz,5″-H),4.95-5.06(2H,m,2'-H,3'-H),4.73,4.83(2H,2d,3J=7.2Hz,CEM的-OCH2),4.40(H,dd,3J=3.0,6.0Hz,4'-H),3.83-3.92(H,m,4″-H),3.78(6H,s,DMTr的-OMe),3.38-3.65(3H,m,6'-H,CEM的-OCH2O),3.41(H,dd,3J=3.3,10.5Hz,5'-H),3.06-3.18(H,m,6″-H),2.60(3H,s,Ac),2.36(2H,m,CEM的-CH2CN),1.59-1.69(2H,m,7″-H),0.88-1.28(2H,.m,8″-H)
31P NMR(121MHz,CDCl3)δ157.0
(c)N4-乙酰基-5'-O-(4,4'-二甲氧基三苯甲基)-3'-O-[(2R,4S,5R)-5-苯基-四氢-1H,3H-吡咯[1,2-c]-1,3,2-噁唑磷烷-2-基]-2'-O-(2-氰基乙氧基甲基)胞嘧啶核苷[(Rp)].
向N4-乙酰基-5'-O-(4,4'-二甲氧基三苯甲基)-2'-O-(2-氰基乙氧基甲基)胞嘧啶核苷(1.010g,1.5mmol)中加入三乙胺(1.5ml,10.5mmol)、(4S,5R)-噁唑磷烷氯化物的0.5M四氢呋喃溶液(9.0ml,4.5mmol)，在室温下进行1.5小时搅拌。利用硅胶色谱法[粗生成物0.30g,3.0g NH硅胶、己烷-乙酸乙酯-三乙胺(20:10:0.03,v/v/v→10:30:0.04,v/v/v)]、[粗生成物0.30g,3.0g NH硅胶,己烷-乙酸乙酯-三乙胺(20:10:0.03,v/v/v→10:20:0.03,v/v/v)]和[粗生成物1.23g,12.3g NH硅胶,己烷-乙酸乙酯-三乙胺(20:10:0.03,v/v/v→10:20:0.03,v/v/v)]对残渣进行提纯，从而得到目标物(0.693g,53%)。为黄色非晶态。
1H NMR(300MHz,CDCl3)δ9.68(H,b r.s,4-NH),8.54(H,d,3J=7.5Hz,6-H),7.22-7.42(14H,m,5″-Ph,DMTr的m至OMe,DMTr的Ph),6.88(H,d,3J=7.5Hz,5-H),6.77-6.84(4H,m,DMTr的o至OMe),5.94(H,s,1'-H),5.72(H,d,3J=6.3Hz,5″-H),4.98,5.15(2H,2d,3J=6.9Hz,CEM 的-OCH2),4.84(H,ddd,3J=4.8,9.3,9.3Hz,3'-H),,4.26-4.33(2H,m,2'-H,4'-H),3.86-3.96(3H,m,4″-H,CEM的-OCH2O),3.75,3.78(6H,2s,DMTr的-OMe),3.50-3.69(3H,m,5'-H,6″-H),3.04-3.15(H,m,6″-H),2.59-2.78(2H,m,CEM的-CH2CN),2.24(3H,s,Ac),1.51-1.67(2H,m,7″-H),0.86-1.28(2H,m,8″-H)
31P NMR(121MHz,CDCl3)δ158.0
(d)O6-氰基乙基-N2-苯氧基乙酰基-5'-O-(4,4'-二甲氧基三苯甲基)-3'-O-[(2S,4R,5S)-5-苯基-四氢-1H,3H-吡咯[1,2-c]-1,3,2-噁唑磷烷-2-基]2'-O-(2-氰基乙氧基甲基)鸟嘌呤核苷[(Rp)].
向O6-氰基乙基-N2-苯氧基乙酰基-5'-O-(4,4'-二甲氧基三苯甲基)-2'-O-(2-氰基乙氧基甲基)鸟嘌呤核苷(0.856g,1.0mmol)中加入三乙胺(1.0ml,7.1mmol)、(4S,5R)-噁唑磷烷氯化物的0.5M四氢呋喃溶液(6.0ml,3.0mmol)，在室温下进行2小时搅拌。利用硅胶色谱法[20g NH硅胶,甲苯-乙酸乙酯-三乙胺(80:20:0.1,v/v/v)]对残渣进行提纯，从而得到目标物(0.447g,42%)。为无色非晶态。
1H NMR(300MHz,CDCl3)δ8.79(H,br.s,2-NH),8.10(H,s,8-H),7.00-7.42(19H,m,5″-Ph,DMTr的m至OMe,DMTr的Ph,Pac的Ph),6.76(2H,d,3J=6.6Hz,DMTr的o至OMe),6.23(H,d,3J=5.1Hz,1'-H),5.74(H,d,3J=6.3Hz,5″-H),4.82-5.01(6H,m,2'-H,3'-H,CEM的-OCH2,Ce的-OCH2),4.63(2H,s,Pac的-CH2),4.35(H,d,3J=2.7Hz,4'-H),3.44-3.90(12H,m,5'-H,4″-H,6″-H,CEM的-OCH2O,DMTr的OMe),3.04-3.19(3H,m,6″-H,Ce的-CH2CN),2.48(2H,t,3J=6.3Hz,CEM的-CH2CN),1.59-1.66(2H,m,7″-H),0.88-1.29(2H,m,8″-H)
31P NMR(121MHz,CDCl3)δ156.8
例3
与例2同样地使用4R,5S-噁唑磷烷氯化物来合成以下化合物。
(a)5'-O-(4,4'-二甲氧基三苯甲基)-3′-O-[(2S,4R,5S)-5-苯基-四氢-1H,3H-吡咯[1,2-c]-1,3,2-噁唑磷烷-2-基]-2'-O-(2-氰基乙氧基甲基)尿嘧啶核苷[(Sp)].
向5'-O-(4,4'-二甲氧基三苯甲基)-2'-O-(2-氰基乙氧基甲基)尿嘧啶核苷(0.944g,1.5mmol)中加入三乙胺(1.5ml,10.5mmol)、4R,5S-噁唑磷烷氯化物的0.5M四氢呋喃溶液(9.3ml,4.7mmol)，在室温下进行1.5小时搅拌。利用硅胶色谱法[粗生成物0.30g,3g NH硅胶,己烷-乙酸乙酯-三乙胺(20:10:0.03,v/v/v→10:10:0.02,v/v/v)]、[粗生成物1.40g,5.5×27cm,3.0g NH硅胶,己烷-乙酸乙酯-三乙胺(20:10:0.03,v/v/v→10:20:0.03,v/v/v)]对残渣进行提纯，从而得到目标物(0.900g,71%)。为无色非晶态。
1H NMR(300MHz,CDCl3)δ9.24(H,br.s,3-NH),8.11(H,d,6-H),7.24-7.41(14H,m,5″-Ph,DMTr的m至OMe,DMTr的Ph),6.85(4H,dd,3J=2.1,9.0Hz,DMTr的o至OMe),5.98(H,d,3J=1.5Hz,1'-H),5.79(H,d,3J=6.3Hz,5″-H),5.20(2H,d,3J=8.4Hz,5-H),δ4.81-4.89(3H,m,3′-H,CEM的-OCH2O),4.25-4.32(2H,m,2'-H,4'-H),3.68-3.87(9H,m,4″-H,CEM的-OCH2,DMTr的-OMe),3.41-3.54(3H,m,5'-H,6″-H),3.03-3.14(H,m,6″-H),2.46-2.51(2H,ddd,3J=1.8,6.0,6.0Hz,CEM的-CH2CN),1.59-1.68(2H,m,7″-H),0.88-1.28(2H,m,8″-H)
31P NMR(121MHz,CDCl3)δ159.4
(b)N6-乙酰基-5'-O-(4,4'-二甲氧基三苯甲基)-3'-O-[(2S,4R,5S)-5-苯基-四氢-1H,3H-吡咯[1,2-c]-1,3,2-噁唑磷烷-2-基]-2'-O-(2-氰基乙氧基甲基)腺嘌呤核苷[(Sp)]
向N6-乙酰基-5'-O-(4,4'-二甲氧基三苯甲基)-2'-O-(2-氰基乙氧基甲基)腺嘌呤核苷(0.698g,1.0mmol)中加入三乙胺(1.0ml,7.1mmol)、(4R,5S)-噁唑磷烷氯化物的0.5M四氢呋喃溶液(6.0ml,3.0mmol)，在室温下进行2小时搅拌。利用硅胶色谱法[13g NH硅胶,甲苯-乙酸乙酯-三乙胺(50:50:0.1,v/v/v)]对残渣进行提纯，从而得到目标物(0.462g,51%)。为无色非晶态。
1H NMR(300MHz,CDCl3)δ8.77(H,br.s,6-NH),8.61(H,s,2-H),8.21(H,s,8-H),7.16-7.42(14H,m,5″-Ph,DMTr的m至OMe,DMTr的Ph),6.76(4H,d,3J=6.9Hz,DMTr的o至OMe),6.22(H,d,3J=5.1Hz,1'-H),5.79(H,d,3J=6.6Hz,5″-H),5.07(H,dd,3J=5.1,5.1Hz,2'-H),4.98(H,ddd,3J=4.5,4.5,9.6Hz,3′-H),4.85,4.89(2H,2d,3J=7.2Hz,CEM的-OCH2),4.36(H,dd,3J=3.9,8.1Hz,4'-H),3.49-3.94(9H,m,4″-H,6″-H,CEM的-OCH2O,DMTr的-OMe),3.03-3.15(H,m,6″-H),2.61(3H,s,Ac),2.48(2H,t，3J=6.3Hz,CEM的-CH2CN),1.56-1.66(2H,m,7″-H),0.89-1.28(2H,.m,8″-H)
31P NMR(121MHz,CDCl3)δ156.1
(c)N6-乙酰基-5'-O-(4,4'-二甲氧基三苯甲基)-3'-O-[(2R,4S,5R)-5-苯基-四氢-1H,3H-吡咯[1,2-c]-1,3,2-噁唑磷烷-2-基]-2'-O-(2-氰基乙氧基甲基)胞嘧啶核苷[(Sp)].
向N4-乙酰基-5'-O-(4,4'-二甲氧基三苯甲基)-2'-O-(2-氰基乙氧基甲基)胞嘧啶核苷(0.671g,1.0mmol)中加入三乙胺(1.0ml,7.1mmol)、(4R,5S)-噁唑磷烷氯化物的0.5M四氢呋喃溶液(6.0ml,3.0mmol)，在室温下进行1.5小时搅拌。利用硅胶色谱法[14g NH硅胶,甲苯-乙酸乙酯-三乙胺(10:20:0.03,v/v/v)]对残渣进行提纯，从而得到目标物(0.655g,75%)。为黄色非晶态。
1H NMR(300MHz,CDCl3)δ9.58(H,br.s,4-NH),8.61(H,d,3J=7.2Hz,6-H),7.22-7.44(14H,m,5″-Ph,DMTr的m至OMe,DMTr的Ph),6.99(H,d,3J=7.8Hz,5-H),6.86(4H,dd,3J=1.8,8.7Hz,DMTr的o至OMe),5.98(H,s,1'-H),5.78(H,d,3J=6.3Hz,5″-H),4.95,5.04(2H,2d,3J=6.9Hz,CEM的-CH2O),4.78(H,ddd,3J=4.8,9.3,9.3Hz,3'-H),4.27-4.34(H,m,2'-H,4'-H),3.73-3.88(9H,m,4″-H,CEM的-OCH2O,DMTr的-OMe),3.39-3.56(3H,m,5'-H,6″-H),3.00-3.12(H,m,6″-H),2.49(2H,t,3J=6.9Hz,CEM的-CH2CN),2.24(3H,s,Ac),1.58-1.67(2H,m,7″-H),0.86-1.28(2H,m,8″-H)
31P NMR(121MHz,CDCl3)δ159.0
(d)O6-氰基乙基-N2-苯氧基乙酰基-5'-O-(4,4'-二甲氧基三苯甲基)-3'-O-[(2R,4S,5R)-5-苯基-四氢-1H,3H-吡咯[1,2-c]-1,3,2-噁唑磷烷-2-基]2'-O-(2-氰基乙氧基甲基)鸟嘌呤核苷[(Sp)].
向O6-氰基乙基-N2-苯氧基乙酰基-5'-O-(4,4'-二甲氧基三苯甲基)-2'-O-(2-氰基乙氧基甲基)鸟嘌呤核苷(1.280g,1.5mmol)中加入三乙胺(1.5ml,10.5mmol)、4R,5S-噁唑磷烷氯化物的0.5M四氢呋喃溶液(9.0ml,4.5mmol)，在室温下进行1.5小时搅拌。利用硅胶色谱法[粗生成物0.30g,3.0g NH硅胶,己烷-乙酸乙酯-三乙胺(30:10:0.04,v/v/v→10:20:0.03,v/v/v)]、[粗生成物1.5g,15g NH硅胶,己烷-乙酸乙酯-三乙胺(30:10:0.04,v/v/v→10:20:0.03,v/v/v)]对残渣进行提纯，从而得到目标物(0.865g,54%)。为无色非晶态。
1H NMR(300MHz,CDCl3)δ8.77(H,br.s,2-NH),8.13(H,s,8-H),6.98-7.45(19H,m,5″-Ph,DMTr的m至OMe,DMTr的Ph,Pac的Ph),6.76(2H,d,3J=6.6Hz,DMTr的o至OMe),7.80(H,d,3J=4.8Hz,1'-H),5.76(H,d,3J=6.6Hz,5″-H),4.75-4.99(6H,m,2'-H,3'-H,CEM的-OCH2,Ce的-OCH2),4.62(2H,s,Pac的-CH2),4.39(H,d,3J=3.3Hz,4'-H),3.77-3.90(7H,m,4″-H,DMTr的OMe),3.42-3.62(6H,m,5'-H,6″-H,CEM的-OCH2O)3.03-3.19(3H,m,6″-H,Ce的-CH2CN),2.34(2H,t,3J=6.3Hz,CEM的-CH2CN),1.59-1.75(2H,m,7″-H),0.88-1.28(2H,m,8″-H)
31P NMR(121MHz,CDCl3)δ156.8
在例2和3的反应中，均以较高的非对映立体选择性得到了目标物核糖核苷噁唑磷烷。
[表1]
Figure BDA00002096220300161
例4
(a)使用(Rp)-或(Sp)-核糖核苷噁唑磷烷作为单体单元，立体选择性地进行硫代磷酸RNA2聚体的固相合成。反应工序如下所示。
Figure BDA00002096220300162
使用CPG作为固相载体、使用琥珀酰基连接基团作为连接基团，利用作为亲核性小的活化剂的CMPT进行固相载体上的尿嘧啶核苷的5'-羟基与单体单元的缩合，之后利用DTD对所生成的亚磷酸酯进行硫化，利用浓氨-乙醇(3:1,v/v)进行处理，从固相载体中分离出，通过进行手性辅助基团与核酸碱基部位的保护基的脱保护，从而立体选择性地进行2聚体的合成。为了使二聚物的定量容易进行，在残留有CEM基的状态下利用RP-HPLC进行分析，计算出缩合效率和非对映立体选择性。其结果确认到，缩合反应以能够充分应用于低聚物合成的高缩合效率且高非对映立体选择性地进行。另外，本反应中的缩合反应在5分钟左右得以完成，而在使用TBDMS基的现有反应中，二聚物的缩合需要15分钟，与之相比，本反应中确认到了极高的反应性。
[表2]
Figure BDA00002096220300171
a利用RP-HPLC来测定
(b)与上述(a)同样地进行硫代磷酸RNA 4聚体(All-(Rp)-[Ups]3U、All-(Sp)-[Ups]3U、All-(Rp)-ApsGpsCpsU以及All-(Sp)-ApsGpsCpsU)的合成。反应工序如下所示。
[化9]
Figure BDA00002096220300172
使用活化剂CMPT进行缩合后，使用三氟乙酰基咪唑(CF3CO-Im)分别对未反应的5'-羟基、手性辅助基团的氨基进行帽化。进行帽化的目的在于：抑制目标序列以外的合成；同时通过对手性辅助基团的氨基进行酰基化而使碱性降低，保持反应体系中的酸性度。接下来，进行基于DTD的亚磷酸酯的硫化、5'-末端DMTr基的去除(3%DCA)，进一步进行单体单元的缩合。通过反复进行一系列的链增长循环来合成具有目标碱基序列的硫代磷酸4聚体。最后在浓氨-乙醇(3:1,v/v)的碱性条件下从固相载体将其分离，进行保护基的去除。结果列于下表3。为进行比较，按现有方法，以2'-羟基的保护基作为TBDMS基，同样地使用CMPT进行All-(Rp)-ApsGpsCpsU的合成，该情况下的平均缩合效率为77%。
[表3]
4聚体的收率及非对映立体选择性
a对于项目1、3、5，通过RP-HPLC来测定平均偶联收率；对于项目2、4，通过DMTr+来测定平均偶联收率。
b通过RP-HPLC来测定。
(c)与上述同样地进行作为硫代磷酸RNA 12聚体的All-(Rp),(Sp)-[Ups]11U的合成。反应过程如下所示。
Figure BDA00002096220300182
合成后，对于由DMTr定量计算出的平均缩合收率，在Rp体、Sp体中均为99%。即使使用亲核性小的CMPT进行RNA低聚物的合成，也得到了良好的平均缩合效率。利用浓氨-EtOH(3:1,v/v)进行4小时处理将低聚物由固相载体分离出之后，通过过滤除去固相载体，再次进行氨处理，使保护基脱保护。其后，将反应液的溶剂蒸馏除去至2ml的程度，之后在残留有CEM基和DMTr基的状态下通过RP-HPLC进行分析。对被认为是目标物的主峰(メインピーク)进行分取提纯，利用无菌水反复进行3次冷冻干燥使其脱盐，之后利用加入了0.5%硝基甲烷的0.5M TBAF溶液进行5小时处理，使CEM基脱保护。通过Sep-Pak提纯去除TBAF，通过冷冻干燥蒸馏除去溶剂。其后，利用80%乙酸溶液进行1小时处理，使DMTr基脱保护。利用Sep-Pak提纯进行脱盐，通过RP-HPLC对被认为是目标物的主峰进行分取提纯，利用无菌水反复进行3次冷冻干燥使其脱盐，得到目标物。利用MALDI-TOF-MAS进行鉴定，确认为目标物。
All-(Rp)-(Ups)11U 12mer
分离收率为12%。(收率使用吸光系数ε260=120320(/M/cm)来计算出)
MALDI-TOF MAS：m/z计算值C108H131N24O83P11S11 -1[(M-H)-]3785.09,实测值3788.62
All-(Sp)-(Ups)11U 12mer
分离收率为14%。(收率使用吸光系数ε260=120320(/M/cm)来计算出)
MALDI-TOF MAS：m/z计算值C108H131N24O83P11S11 -1[(M-H)-]3785.09,实测值3789.25
[表4]
Figure BDA00002096220300191
a通过DMTr+检验来测定。
b通过RP-HPLC来测定。
例5
进行包括4种核酸碱基的All-(Rp),(Sp)-(CpsApsGpsU)3的合成。通过DMTr定量计算出平均缩合效率，结果Rp体的平均缩合效率为90%、Sp体的平均缩合效率为93%。通过RP-HPLC对主峰进行分取提纯后，利用TBAF除去CEM基，通过MALDI-TOF-MAS确认为目标物。
All-(Sp)-[CpsApsGpsU]3分离收率1%(使用吸光系数ε260=124000(/M/cm)来计算出)
MALDI-TOF-MASS:m/z计算值C114H141N45O71P11S11 -1[(M-H)-]3968.29,实测值3970.75.
关于与All-(Sp)-[Ups]11U的制造相比分离收率降低的理由，推测是由于胞嘧啶核苷单体的反应性低，因而在使用胞嘧啶核苷单体通过反复进行2次缩合反应来同样地合成All-(Rp)-(CpsApsGpsU)3时(对于胞嘧啶核苷单体进行双偶联，15min×2)，与胞嘧啶核苷单体的缩合效率分别提高10%的程度，由DMTr+定量计算出的12聚体的平均缩合收率改善至92%。利用RP-HPLC对主峰进行分取提纯后，利用TBAF去除CEM基，通过MALDI-TOF-MAS确认为目标物。
All-(Rp)-[CpsApsGpsU]3分离收率1%(使用吸光系数ε260=124000(/M/cm)来计算出)
MALDI-TOF-MASS:m/z计算值C114H141N45O71P11S11 -1[(M-H)-]3968.29,实测值3969.15.
例6：活化剂的研究
在出于将硫代磷酸RNA作为RNAi医药来应用的目的而意图利用核酸自动合成机进行大量合成的情况下，双偶联并不能说是实用的方法，并且所得到的缩合效率在RNA低聚物合成中也不充分，必须要进一步改善胞嘧啶核苷单体的反应性。为了提高胞嘧啶核苷单体单元的缩合反应效率，对用于缩合反应的活化剂进行了研究。活化剂的研究中，在向2'-羟基导入TBDMS基的现有研究中，是通过采用作为可实现高缩合反应效率的酸·唑配合物的N-苯基咪唑鎓三氟甲磺酸盐(PhIMT)作为活化剂来合成模型序列All-(Rp)-CpsCpsCpsU 4聚体来进行的。
Figure BDA00002096220300201
[表5]
Figure BDA00002096220300211
a通过DMTr+检验来测定。
以亲核性高的PhIMT作为活化剂来进行4聚体的合成。HPLC色谱图示于图1。4聚体合成后，由DMTr定量计算出的平均缩合效率为89%，与亲核性小的CMPT相比缩合反应效率大幅提高，显示出了能够充分适于低聚物合成的良好的反应性(项目2)。但是由于PhIMT为亲核性高的活化剂，因而具有进行差向异构化的可能性。因此，接下来以PhIMT作为活化剂来进行UpsU2聚体的合成，判断各非对映体的立体选择性。2聚体的HPLC色谱图示于图2。
Figure BDA00002096220300212
(05μmol规模)
[表6]
Figure BDA00002096220300213
a通过RP-HPLC来测定。
通过以PhIMT作为活化剂来进行(Rp),(Sp)-UpsU 2聚体的合成，从而计算出缩合反应时的立体选择性。对于立体选择性，由利用RP-HPLC进行分析时的保持时间来鉴定非对映体，从而对立体选择性进行评价。其结果，对于由HPLC色谱图的面积值求得的立体选择性，Rp体中为98.0%、Sp体中为99.7%。可知即使在(项目1-2)以CEM基为保护基的该合成条件下，也表现出了良好的立体选择性。
由以上的条件研究可知，通过使用PhIMT作为活化剂，可提高缩合反应效率、表现出良好的立体选择性。可认为该结果对于适用于RNA低聚物的合成是充分的，下面以PhIMT为活化剂，进行包括4种核酸碱基的RNA低聚物的合成。
例7：以PhIMT为活化剂的All-(Rp),(Sp)-(CpsApsGpsU)312聚体的合成
对缩合反应中的活化剂进行研究，其结果为，在使用作为亲核性高的活化剂的PhIMT时，胞嘧啶核苷单体单元的反应性大幅提高，表现出了可充分适于RNA低聚物合成的缩合效率、立体选择性。因此，将活化剂由CMPT变更为PhIMT，也能够进行包括4种核酸碱基的硫代磷酸RNA低聚物合成。
[化13]
Figure BDA00002096220300221
[表7]
Figure BDA00002096220300222
a通过DMTr+检验来测定。
b通过RP-HPLC来测定。
c利用双偶联来进行胞嘧啶核苷的偶联。
以PhIMT为活化剂，进行All-(Rp),(Sp)-(CpsApsGpsU)312聚体的固相合成。所得到的12聚体的HPLC色谱图示于图3。其结果，对于Rp体、Sp体，胞嘧啶核苷导入工序中的缩合反应效率均成功提高了10%左右(表7：项目2、5)。接下来，通过RP-HPLC对被认为是目标物的峰进行分取提纯，之后利用无菌水反复进行3次冷冻干燥。至此，在使用作为亲核性高的活化剂的PhIMT的情况下，显示出了胞嘧啶核苷单体的反应性大幅提高，并能够以非常良好的缩合效率进行硫代磷酸RNA低聚物的立体选择性合成。
[表8]
Figure BDA00002096220300231
a通过DMTr+检验来测定。
在以亲核性高的PhIMT作为活化剂的包括4种核酸碱基的硫代磷酸RNA的低聚物合成中，在使用立体性小的CEM基作为2'-羟基的保护基的情况下，得到了比使用属于立体障碍大的保护基的TBDMS基的现有方法高10%左右的缩合效率。(项目1-2)
由此可知，胞嘧啶核苷单体单元的反应性不仅随着碱基部位的碱性度而大幅变化、而且还会随着2'-羟基的立体环境而大幅变化。这表示，为了在硫代磷酸RNA低聚物合成中获得充分的缩合反应效率，在使用亲核性高的活化剂的同时使用立体性小的CEM基作为2'-羟基的保护基是极为重要的。
例8：硫代磷酸RNA 12聚体合成后的脱保护
进行作为硫代磷酸RNA 12聚体的All-(Rp),(Sp)-(CpsApsGpsU)312聚体的合成。合成后，由DMTr定量计算出平均缩合收率，Rp体为94%、Sp体为97%。通过使用作为亲核性高的活化剂的PhIMT进行RNA低聚物的合成，得到了良好的平均缩合效率。利用浓氨-EtOH(3:1,v/v)进行4小时处理由固相载体中分离出低聚物后，通过过滤除去固相载体，再次进行氨处理使保护基脱保护。其后将反应液的溶剂蒸馏除去至2ml左右，然后在残留有CEM基和DMTr基的状态下利用RP-HPLC进行分析。对被认为是目标物的主峰进行分取提纯，利用无菌水反复进行3次冷冻干燥来进行脱盐，之后利用加入有0.5%硝基甲烷的0.5M TBAF溶液进行5小时处理，使CEM基脱保护。通过Sep-Pak提纯去除TBAF，通过冷冻干燥蒸馏除去溶剂。其后利用80%乙酸溶液进行1小时处理，使DMTr基脱保护。通过Sep-Pak提纯进行脱盐，通过RP-HPLC对对被认为是目标物的主峰进行分取提纯，利用无菌水反复进行3次冷冻干燥使其脱盐，得到目的物。利用MALDI-TOF MAS进行鉴定，确认为目标物。
All-(Rp)-(CpsApsGpsU)312mer
分离收率为5%。(收率是使用吸光系数ε260=124000(/M/cm)计算得出的)
MALDI-TOF MAS：m/z计算值C108H131N24O83P11S11 -1[(M-H)-]3968.29,实测值3971.19
All-(Sp)-(CpsApsGpsU)312mer
分离收率为10%。(收率使用吸光系数ε260=124000(/M/cm)计算出)
MALDI-TOF MAS：m/z计算值C108H131N24O83P11S11 -1[(M-H)-]3968.29,实测值3972.53
上述反应中的固相合成是通过反复进行以下工序(i)-(viii)来进行的。
(i)3%二氯乙酸(DCA)/二氯甲烷；15s×4
(ii)清洗(二氯甲烷之后为乙腈)和干燥
(iii)缩合(0.13M单体和无水乙腈中1M CMPT和1M PhIMT)；5-15min(1次或2次)
(iv)清洗(CH3CN)和干燥
(v)帽化(0.5MCF3CO-Im和无水四氢呋喃中1M 1,8-双(二甲氨基)萘(DMAN))；30s
(vi)清洗(四氢呋喃)和干燥
(vii)硫化(无水乙腈中0.3M二硫化二甲基秋兰姆(DTD))；10min
(viii)清洗(CH3CN)和干燥
对于缩合时间，在2聚体中为5min、在4聚体之中[Ups]3U为10min、在ApsGpsCpsU中为15min、在12聚体中为15min。在4聚体、12聚体的合成中进行了帽化。通过反复进行各步骤使链增长之后，在5'-O-DMTr基残留或去除的状态下进行氨处理。5'-O-DMTr基的去除通过3%DCA/二氯甲烷(15s×4)处理来进行，利用二氯甲烷进行清洗。接着加入浓氨-乙醇(3:1,v/v)(6ml)，塞上塞子，之后进行氨处理，该氨处理对于2聚体进行3小时、对于4聚体进行8小时或12小时、对于12聚体进行48小时。
关于2聚体、4聚体，在蒸馏除去氨之后向冷冻干燥物中加入无菌水，进行过滤，通过RP-HPLC(Senshu-Pak C18；2聚体条件A；4聚体条件B)进行分析。关于12聚体，在将溶液减压蒸馏除去至2ml左右之后，通过RP-HPLC(Senshu-Pak C18或Waters C18；12聚体条件C或条件D)进行分析。关于4聚体、12聚体，通过RP-HPLC进行分取提纯，对于残渣使用无菌水反复进行3次冷冻干燥来进行脱盐，之后，关于4聚体，在加入有0.5%CH3NO2的0.5M TBAF/DMSO(1.0ml)溶液中在室温下进行4小时搅拌，关于12聚体，在加入有0.5%CH3NO2的0.5M TBAF/DMSO(400μl)溶液中在室温下进行5小时搅拌。添加0.1M TEAA缓冲液(pH 7)(40ml)使反应停止，关于4聚体，通过RP-HPLC(Senshu-Pak C18；条件B)进行分析，关于12聚体，通过RP-HPLC(Senshu-Pak C18或Waters C18；条件D)进行分析。
反相HPLC(RP-HPLC)中，使用PEGASIL ODS 5μm柱(
Figure BDA00002096220300251
4.0mm×150mm)(Senshu Pak)或μBondasphere C18 5μm柱(
Figure BDA00002096220300252
3.9mm×150mm)(Waters)作为柱。作为洗脱条件，使用条件A(0-20%乙腈/0.1M三乙基铵乙酸酯(TEAA)缓冲液(pH 7.0)、30℃、60min、0.5mL/min)；条件B(0-30%乙腈/0.1M三乙基铵乙酸酯(TEAA)缓冲液(pH 7.0)、30℃、90min、0.5mL/min)；条件C(0-25%乙腈/0.1M TEAA缓冲液(pH 7.0)、30℃、75min、0.5mL/min；条件D(0-75%乙腈/0.1M TEAA缓冲液(pH 7.0)、30℃、75min、0.5mL/min)；以及条件E(0-30%乙腈/0.1M TEAA缓冲液(pH 7.0)、30℃、60min、0.5mL/min)。
关于12聚体，通过使用Sep-Pak(注册商标)tC18、并利用80%乙腈水溶液洗脱，从而进行脱盐。对含有所得到的12聚体的溶液进行冷冻干燥，之后在80%乙酸溶液中于室温下进行1小时搅拌。加入2M TEAA缓冲液(pH 7)(20ml)使反应停止，通过使用Sep-Pak(注册商标)tC18、并利用40%乙腈水溶液洗脱，从而进行脱盐。减压蒸馏除去所得溶液中的乙腈后，通过RP-HPLC(Senshu-Pak C18或Waters C18；条件D)进行分析。通过RP-HPLC进行12聚体的分取提纯，利用无菌水反复进行三次冷冻干燥使其脱盐后，得到目标物RNA低聚物。所得到的RNA低聚物经MALDI-TOF-MASS鉴定为目标物。
例9
对CEM基的脱保护条件进行了研究。
Figure BDA00002096220300253
尽管可利用TBAF来选择性去除CEM基，但在利用TBAF进行脱保护反应时，有时会观测到硫代磷酸有数个百分点(数%)的脱硫。其理由可认为是由于手性辅助基团的残渣作为催化剂发挥作用，促进了脱硫反应。通过利用RP-HPLC进行分取提纯，可大幅抑制脱硫，因而在进行4聚体的分取提纯后附以脱保护反应。按照文献(NucleicAcids Res.,35,pp.3287-3296,2007)记载的方法，利用0.5M TBAF进行处理来进行CEM基的脱保护。此时，为了抑制脱CEM化反应时的副产物丙烯腈加成在核酸碱基部位，添加0.5%的硝基甲烷。在脱保护反应后利用RP-HPLC进行分析，结果脱保护反应定量进行，未观察到核酸碱基部位的修饰、脱硫等副反应。
例10：硫代磷酸RNA的酶耐性
关于基于nP1的酶分解，将含有分离提纯后的(CpsApsGpsU)312聚体(1.0nmol)、nP1(1单位)、50mM CH3COONa、1mM ZnCl2的水溶液(20μl、pH 7.2)在37℃恒温放置16h。加入0.1M TEAA缓冲液(pH 7)(80μl)之后，在100℃恒温放置1分钟使酶失活。对残渣进行过滤后，通过RP-HPLC(Senshu-Pak C18或Waters C18；条件E)进行分析。
关于基于SVPDE的酶分解，将含有分离提纯后的(CpsApsGpsU)312聚体(1.0nmol)、SVPDE(0.1×10-3单位)、100mM Tris-HCl、15mM MgCl2的水溶液(20μl、pH 8.5)在37℃恒温放置16小时。加入0.1M TEAA缓冲液(pH 7)(80μl)后，在100℃恒温放置1分钟使酶失活。对残渣进行过滤后，通过RP-HPLC(Senshu-Pak C18或Waters C18；条件E)进行分析。
所用的Snake venom磷酸二酯酶由Sigma购入、核酸酶P1由Yamasa购入。
通过对所合成的各硫代磷酸RNA 12聚体的酶耐性进行确认，由此来确定磷原子的绝对立体构型。立体确定中使用的酶为3'-外切核酸酶SVPDE与内切核酸酶nP1这2种。已知SVPDE为选择性水解Rp体的硫代磷酸二酯键的酶、nP1为选择性水解Sp体的酶。如上述实验方法所示，将各低聚物在37℃恒温放置16小时来进行酶反应。其后使酶失活，之后通过RP-HPLC进行分析。
其结果，在All-(Rp)-(Ups)11U 12聚体和All-(Rp)-(CpsApsGpsU)312聚体中，低聚物全部被SVPDE进行了酶分解；并且在All-(Sp)-(Ups)11U 12聚体和All-(Sp)-(CpsApsGpsU)312聚体中，低聚物全部被nP1进行了酶分解。结果示于图4。由该结果显示出，所合成的RNA低聚物的绝对立体构型分别为Rp体、Sp体。
例11：包括四种核酸碱基的硫代磷酸RNA的双链熔解温度(Tm)的解析
r(CAGU)3-r(ACUG)3双链熔解温度的测定方法
将分离提纯的All-(Rp)-(CpsApsGpsU)3或All-(Sp)-(CpsApsGpsU)3或立体-无规(CpsApsGpsU)3或(CpoApoGpoU)3与(ApoCpoUpoG)3各0.45nmol溶解在含有10mM磷酸、100mM NaCl以及0.1mM EDTA的水溶液(200μl、pH 7)中。将低聚物溶液在减压下进行10分钟脱气后，向8连孔中加入165μl，在以5℃/分钟的速度从室温上升至90℃后，在90℃的状态保持10分钟，以-2℃/分钟的速度使温度下降至0℃，进行退火。将低聚物溶液在0℃静置90分钟后，氮气流下、在以0.5℃/分钟的速度将温度提高到90℃的同时，以0.5℃的间隔测定260nm下的吸光度。
对于通过本合成法合成的All-(Rp),(Sp)-(CpsApsGpsU)312聚体在具有互补序列的天然型RNA 12聚体间形成的双链的熔解温度(Tm)进行测定。为了详细分析磷原子的绝对立体构型对于双链形成能力的影响，对于天然型RNA 12聚体与未进行磷原子的立体控制的(CpsApsGpsU)3RNA 12聚体也进行了双链形成能力的评价。双链熔解温度在更接近生理条件的10mM磷酸缓冲液、100mM NaCl缓冲液中进行测定。结果示于图5和表9中。
[表9]
  No.   双链序列   计算方法   Tm值   △Tm值
  1   ntRNA-ntRNA   中线法(中線法)   61.65   0
  2   无规ps-RNA-ntRNA   中线法   57.48   -4.17
  3   All-(Rp)-ps-RNA-ntRNA   中线法   65.38   3.73
  4   All-(Sp)-ps-RNA-ntRNA   中线法   50.94   -10.71
All-(Rp)-(CpsApsGpsU)312聚体所形成的双链的Tm值为65.38℃，比天然型RNA所形成的双链高3.7℃，可知与天然型RNA相比，包括4种核酸碱基的Rp体形成了更为稳定的双链。另外可知，All-(Sp)-(CpsApsGpsU)312聚体所形成的双链的Tm值为50.94℃，比天然型RNA所形成的双链低10.71℃，呈不稳定化。并且，未进行立体控制的硫代磷酸RNA双链的Tm值为57.48℃，与天然型RNA相比稍有不稳定，但具有Rp体与Sp体正中间的双链形成能力。若对上述各绝对立体构型间的硫代磷酸RNA的双链形成能力进行概括，则如下所示。
双链稳定性
All-(Rp)-PS-RNA>天然型RNA>无规PS-RNA>All-(Sp)-PS-RNA
例12：基于核酸自动固相合成机的硫代磷酸RNA 12聚体的合成
使用噁唑磷烷单体单元，利用自动固相合成机进行立体控制的硫代磷酸RNA低聚物合成。根据立体选择性合成的硫代磷酸RHA在RNAi医药中的应用，确立能够简便地利用再现性高的自动固相合成机进行RNA低聚物的大量合成的工序是非常重要的。因此，利用自动固相合成机来进行以前通过手动固相合成来进行研究的含有4种核酸碱基的硫代磷酸RNA 12聚体的合成。自动固相合成机使用Applied Biosystems社制造的Expedite 8909 Nucleic Acid Synthesis System。
[表10]
Figure BDA00002096220300281
Figure BDA00002096220300291
Figure BDA00002096220300292
在自动固相合成中，使用藉由琥珀酰基连接基团承载于HCP上的5'-O-(DMTr)尿嘧啶核苷(0.25μmol)。缩合时间为15分钟。通过反复进行各步骤来进行链增长。接着，在残留有DMTr基的状态下向柱中加入浓氨-EtOH(3:1,v/v)(4ml)，在25℃由固相载体中进行4h的分离后，一边用浓氨-EtOH(3:1,v/v)(5ml)进行清洗一边移至15ml的Falcon管中，在25℃恒温放置44小时。接着进行氨的溶剂蒸馏除去直至溶液为2ml左右，其后通过RP-HPLC(Senshu-Pak C18或Waters C18；12聚体条件D)进行分析。其结果在主峰得到了目标物，可知即使利用自动固相合成机也可以没有问题地在各步骤中以良好的缩合效率进行缩合反应。其后通过RP-HPLC进行分取提纯，通过使用无菌水对残渣反复进行3次冷冻干燥来进行脱盐。所得到的12聚体的HPLC色谱图见图6。
工业实用性
根据本发明的方法，可以立体选择性地且有效地进行寡聚硫代磷酸核糖核苷的合成。利用本发明的方法可以立体选择性地达成极高的缩合效率，因而通过适用于固相法，可高效率地制造出长链的寡聚硫代磷酸核糖核苷。

Claims (12)

1.一种硫代磷酸核糖核苷或其盐的制造方法，其为下述通式(I)所表示的硫代磷酸核糖核苷或其盐的制造方法，其中，该方法包括使下述通式(IVa)或(IVb)所表示的噁唑磷烷核糖核苷缩合在下述通式(III)所表示的化合物上之后进行硫化的工序；
Figure FDA00002096220200011
式(I)中，R1表示氢原子或羟基的保护基，Bs表示具有或不具有保护基的核酸碱基，n表示0或1以上的整数，n个X各自独立地表示下述通式(II-Sp)或(II-Rp)所示的二价基团；
Figure FDA00002096220200012
式(II-Sp)、(II-Rp)中，Bs与上述含义相同，R2表示氢原子或氰基乙氧基甲基；
式(III)中，Bs、X以及n与上述含义相同；R3和R4各自独立地表示羟基的保护基，其任意一方可以表示根据需要藉由连接基团而结合的固相载体；
Figure FDA00002096220200014
式(IVa)、(IVb)中，Bs与上述含义相同，CEM表示氰基乙氧基甲基，R5表示羟基的保护基，R6表示具有或不具有取代基的芳基。
2.如权利要求1所述的方法，其中，R6为苯基。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中，R5为4,4'-二甲氧基三苯甲基。
4.如权利要求1至3的任一项所述的方法，其中，在活化剂的存在下进行缩合。
5.如权利要求4所述的方法，其中，使用N-(氰基甲基)吡咯烷鎓·三氟甲磺酸盐或N-苯基咪唑鎓·三氟甲磺酸盐作为活化剂。
6.如权利要求1至5的任一项所述的方法，其中，作为硫化剂使用二硫化二甲基秋兰姆。
7.如权利要求1至6的任一项所述的方法，其中，该方法包括使用通式(III)中的n为0的化合物作为起始原料并n+1次反复进行所述工序的工序。
8.如权利要求1至6的任一项所述的方法，其中，通过固相法来进行反应。
9.如权利要求8所述的方法，其中，根据需要藉由连接基团与固相载体结合的通式(III)使用n为0的化合物。
10.如权利要求1至9的任一项所述的方法，其中，n+1个X全部为以(II-Sp)表示的二价基团、或者全部为以(II-Rp)表示的二价基团。
11.一种硫代磷酸核糖核苷或其盐，其以权利要求1中所述的通式(I)来表示，通式(I)中，R1、Bs、n以及X与上述含义相同，但R2表示氰基乙氧基甲基。
12.一种噁唑磷烷核糖核苷，其以权利要求1中所述的通式(IVa)或(IVb)来表示，通式(IVa)、(IVb)中，Bs、CEM、R5、和R6与上述含义相同。
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