JP5795072B2 - Ｒｎａ干渉を誘導する核酸分子及びその用途 - Google Patents
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Description
本発明は、新規構造のＲＮＡｉを誘導する核酸分子及びその用途に関し、より詳細には標的核酸（target nucleic acid）と相補的な一部領域を含む２４〜１２１ｎｔの長さの第１鎖と、前記第１鎖の標的核酸と相補的な一部領域と相補的結合を形成する領域を持つ１３〜２１ｎｔの長さの第２鎖で構成される構造を持つようにして、標的遺伝子の発現抑制効率を増加させた新しい構造の核酸分子及びこれを利用した標的遺伝子の発現抑制方法に関するものである。
ＲＮＡ干渉（RNA interference：ＲＮＡｉ）は、非常に特異的で、効率よく遺伝子発現を抑制できるメカニズムであり、これは標的遺伝子のｍＲＮＡと相同である配列を持つセンス鎖とこれと相補的な配列を持つアンチセンス鎖で構成される二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を細胞等に導入して、標的遺伝子ｍＲＮＡの分解を誘導することで標的遺伝子の発現を抑制する。
既に用いられているｓｉＲＮＡは、多くはアンチセンス鎖（antisense strand）の長さが、１９−２３ヌクレオチド（nucleotide、ｎｔ）に制限されている。これは研究者等が使っているｓｉＲＮＡの構造が、細胞内で長いｄｓＲＮＡがＤｉｃｅｒによって切られた産物の構造を模倣しているためである（Elbashir et al. Nature2001, 411:494-498）。また、初期Ｘ線結晶（X-ray crystallography）の研究結果からＲＩＳＣ（RNA-induced silencing complex）の核心要素であるアルゴノートー２（Argonaute-2：Ａｇｏ２）に導入されたｓｉＲＮＡアンチセンス鎖の５'と３'末端が各々Ｍｉｄドメイン（Mid domain）とＰＡＺドメイン（PAZ domain）の結合ポケット（binding pocket）に結合しているモデルが提示されたが（Song et al. Nat. Struct. Biol. 2003, 10: 1026-1032）、以後、研究を通じてアンチセンス鎖の１６番目塩基以後３'末端の部分は、ＰＡＺドメインと結合しないことが明らかになった（Wang et al. Nature 2009, 461: 754-761）。これは、ｓｉＲＮＡアンチセンス鎖の３'側の部分の配列及び長さに柔軟性（flexibility）のある可能性があることを意味する。
一方、ｓｉＲＮＡに対する追加研究の一環として、ｓｉＲＮＡのサンプル内での検出のために、ＰＣＲのためのプライマーとして作用できる一本鎖ＤＮＡ分子を結合した変形ｓｉＲＮＡ−ＤＮＡ構造体が報告されたが（ＵＳ２００９／００１２０２２Ａ１）、これはただ定量化するための道具を追加しただけで、標的遺伝子の抑制効率には肯定的な影響を与えなかった。
そこで、本発明者らは、標的遺伝子抑制効率を増加させた新しい構造のＲＮＡｉを誘導する核酸分子を提供しようと鋭意努力した結果、標的核酸と相補的な一部領域を含む２４〜１２１ｎｔの長さの第１鎖と、前記第１鎖の標的核酸と相補的な一部領域と相補的結合を形成する領域を持つ１３〜２１ｎｔの長さの第２鎖で構成される構造を持つ核酸分子を考案し、第１鎖の３'末端側の一本鎖領域に含まれる核酸オリゴヌクレオチドが、他の標的遺伝子を標的とするか本核酸分子を標的遺伝子に誘導すると予想した。また、本発明者等が発明したオフ−ターゲット効果を最小化してＲＮＡｉ機構を飽和させないｓｉＲＮＡ構造体（大韓民国公開特許１０−２００９−００６５８８０）を利用して第１鎖の３'末端に長い一本鎖領域を持つ核酸分子構造を作れば、オフ−ターゲットを最小化しながらも第１鎖の３'末端側一本鎖領域に含まれる核酸オリゴヌクレオチドが他の標的遺伝子を標的とするか５'末端のｓｉＲＮＡを標的遺伝子に誘導する効果を示すことができると予想し、本発明を完成することになった。
本背景技術の部分に記載された前記情報は、ただ本発明の背景に対する理解を向上させるためのものであって、そこに本発明が属する技術分野において通常の知識を有する者にとって既知の先行技術を形成する情報を含まないことがある。
本発明の目的は、遺伝子発現抑制効果が向上した新しい構造のＲＮＡｉを誘導する核酸分子を提供することにある。
前記目的を達成するために、本発明は標的核酸と相補的な一部領域を含む２４〜１２１ｎｔの長さの第１鎖と、前記第１鎖の標的核酸と相補的な一部領域と相補的結合を形成する領域を持つ１３〜２１ｎｔの長さの第２鎖で構成されるＲＮＡｉを誘導する核酸分子を提供する。
また、本発明は、前記ＲＮＡｉを誘導する核酸分子に細胞伝達体が結合している核酸複合体を提供する。
また、本発明は、前記核酸複合体を細胞内に導入させることを特徴とするＲＮＡｉを誘導する核酸分子の細胞内伝達方法を提供する。
また、本発明は、前記ＲＮＡｉを誘導する核酸分子を含有する遺伝子発現抑制用組成物を提供する。
また、本発明は、前記ＲＮＡｉを誘導する核酸分子を含有する遺伝子発現抑制用キットを提供する。
また、本発明は、前記ＲＮＡｉを誘導する核酸分子を細胞内に導入させる工程を含む遺伝子発現抑制方法を提供する。
また、本発明は、前記ＲＮＡｉを誘導する核酸分子を細胞内で発現させる工程を含む細胞内標的遺伝子の発現を抑制させる方法を提供する。
また、本発明は、前記構造を持つ前記ＲＮＡｉを誘導する核酸分子を含有する抗癌組成物を提供する。
また、本発明は、前記ＲＮＡｉを誘導する核酸分子を利用することを特徴とする癌の予防または、治療方法を提供する。
本発明の他の特徴及び具現例は、以下の詳細な説明及び添付された特許請求範囲からより一層明白になる。
他の方式で定義されない限り、本明細書において使用されたあらゆる技術的・科学的用語は、本発明が属する技術分野に熟練した専門家によって通常理解されるものと同じ意味を有する。通常、本明細書において使用された命名法及び以下で詳述する実験方法は、本技術分野において周知であり、しかも汎用されるものである。
本発明の詳細な説明などにおいて使用される主な用語の定義は、下記の通りである。
本願において「ＲＮＡｉ」とは、標的遺伝子のｍＲＮＡと相同である配列を持つ鎖とこれと相補的な配列を持つ鎖で構成される二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を細胞等に導入して、標的遺伝子ｍＲＮＡの分解を誘導することで標的遺伝子の発現を抑制するメカニズムを意味する。
本願において「ｓｉＲＮＡ（small interfering RNA）」とは、配列特異的に効率的な遺伝子発現抑制（gene silencing）を媒介する短い二本鎖のＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を意味する。
本願において「アンチセンス鎖」とは、関心がある標的核酸に実質的に、または１００％相補的なポリヌクレオチドであり、例えば、ｍＲＮＡ（messenger RNA）、ｍＲＮＡでないＲＮＡ配列（ｅ．ｇ．，ｍｉｃｒｏＲＮＡ、ｐｉｗｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ及びｈｎＲＮＡ）または、コードまたは、非コードＤＮＡ配列と全体として、または一部として相補的であってもよい。本願において、アンチセンス鎖及びガイド鎖は、区別しないで用いられる。
本願において「センス鎖（sense strand）」とは、標的核酸と同じ核酸配列を持つポリヌクレオチドであり、ｍＲＮＡ、ｍＲＮＡでないＲＮＡ配列（ｅ．ｇ．，ｍｉｃｒｏＲＮＡ、ｐｉｗｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ及びｈｎＲＮＡ）または、コードまたは、非コードＤＮＡ配列と全体として、または一部として同じポリヌクレオチドをいう。
本願において「遺伝子」とは、最広義の意味と見なされるべきであり、構造蛋白質または調節蛋白質を暗号化することができる。この時、調節蛋白質は転写因子、熱ショック蛋白質またはＤＮＡ／ＲＮＡ複製、転写及び／または翻訳に係る蛋白質を含む。また、本発明において、発現抑制の対象になる目的遺伝子は、ウイルスゲノムに内在するもので、動物遺伝子で統合されたり染色体外の構成要素として存在することができる。例えば、目的遺伝子はＨＩＶゲノム上の遺伝子であってもよい。この場合、ｓｉＲＮＡ分子はほ乳動物細胞内ＨＩＶ遺伝子の翻訳を不活性化させるのに有用である。
一観点において、本発明は、標的核酸と相補的な一部領域を含む２４〜１２１ｎｔの長さの第１鎖と、前記第１鎖の標的核酸と相補的な一部領域と相補的結合を形成する領域を持つ１３〜２１ｎｔの長さの第２鎖で構成されるＲＮＡｉを誘導する核酸分子に関する（図１）。
本発明において、前記標的核酸は、これに限定されるのではないか、ｍＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ（piwi-interacting RNA）、コードＤＮＡ配列及び非コードＤＮＡ配列等であってもよい。
本発明において、前記第１鎖の標的核酸と相補的な一部領域の長さは、１９〜２１ｎｔであることを特徴とする。従って、前記第１鎖は第２鎖と結合しない一本鎖領域を含み、好ましくは、第１鎖は一本鎖領域にアンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム及びＤＮＡザイム（DNAzyme）からなる群から選択される核酸オリゴヌクレオチドをさらに含むことを特徴とする。
本発明において、前記第１鎖のうちの第２鎖と相補的結合を形成しない一本鎖領域は、直接または、リンカーによって前記第２鎖と相補的結合を形成する領域に連結され、この時、リンカーは、化学的リンカー（chemical linker）であってもよい。この時、前記化学的リンカーは、これに制限されるのではないが、核酸（nucleic acid moiety）、ＰＮＡ（PNA moiety）、ペプチド（peptide moiety）、ジスルフィド結合（disulfide bond）または、ポリエチレングリコール（polyethylene glycol moiety）であることを特徴とする。
また、本発明において、前記第１鎖は、一本鎖領域に前記標的核酸と相補的な配列を追加で含有するか、相補的でない配列を含有することを特徴とし、相補的な場合において、本発明に係る核酸分子の二本鎖領域、即ちｓｉＲＮＡの標的核酸に相補的な領域と連続的に位置してもよく、遠く離れて位置してもよい。同様に、ｓｉＲＮＡが標的する配列と前記一本鎖領域のリボザイムやＤＮＡザイムが標的する配列は、連続的に位置してもよく、遠く離れて位置してもよい。また、前記第１鎖の一本鎖領域が前記ｓｉＲＮＡの標的遺伝子と相補的な配列を持つ場合において、一本鎖領域に含まれる配列がアンチセンスＤＮＡまたは、アンチセンスＲＮＡならば、その配列とｓｉＲＮＡの標的遺伝子の配列が、約７０−８０％以上、好ましくは約８０−９０％以上、さらに好ましくは約９５−９９％以上相補的であることを特徴とし、一本鎖領域がリボザイムまたはＤＮＡザイムならば、その配列とｓｉＲＮＡの標的遺伝子の配列が、約５０−６０％以上相補的であることを特徴とする。
また、前記一本鎖領域は、５乃至１００ｎｔであってもよい。５ｎｔ以下であれば、遺伝子発現抑制効率の増加効果が足りなく、１００ｎｔ以上の場合、ＲＮＡ分子の合成効率が低下する。また、前記一本鎖領域は、好ましくは９乃至１００ｎｔであり、または、５０ｎｔ以下の長さを持つことを特徴とし、さらに好ましくは１０乃至１５ｎｔの長さを持つことを特徴とする。
本発明において、前記第１鎖で前記一本鎖領域を構成する塩基中少なくとも一つ以上が巨大（bulky）塩基類似体（base analog）を含むことを特徴とする。フェニル基を持つデオキシアデノシン（deoxyadenosine）誘導体のような巨大塩基類似体が拡張配列に含まれていれば、この拡張配列と相補的に結合するｍＲＮＡ鎖は巨大塩基類似体の位置で開裂（cleavage）が起きることになる。このような開裂を誘導する巨大塩基類似体であれば制限なしに本発明に含まれてもよい。
本発明では、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖を標的ｍＲＮＡ配列と相補的に長く伸ばした核酸構造体の場合、５'末端の部分は、ＲＮＡｉ機序として作用し、同時に３'末端の部分は、アンチセンスメカニズムとして作用するか５'末端ｓｉＲＮＡ部分を標的ｍＲＮＡに誘導する作用をすると予想した。この時、アンチセンス３'末端のｍＲＮＡに相補的な配列がＤＮＡの場合には、ＲＮａｓｅ Ｈ依存的ｍＲＮＡ切断を誘導することができる。また、アンチセンス３'末端の一本鎖領域を構成する塩基中少なくとも一つ以上が巨大塩基類似体を含むか、一本鎖領域がｍＲＮＡと結合してバルジ（bulge）構造を形成する場合であっても開裂を誘導できると予想した。また、第１鎖の一本鎖領域にリボザイムやＤＮＡザイムを導入した核酸分子の場合には相乗的開裂（synergistic cleavage）を誘導できると予想した。
１９−２１ｎｔの長さのアンチセンス鎖及び１３−１６ｎｔの長さのセンス鎖で構成されたｓｉＲＮＡ分子として、アンチセンス鎖の５'末端が平滑末端（blunt end）であるｓｉＲＮＡ構造体は、ｓｉＲＮＡのセンス鎖によるオフ−ターゲット効果の発生や他のＲＮＡｉ機序を阻害することなく優秀な標的遺伝子発現抑制効率を提供するもので（大韓民国公開特許１０−２００９−００６５８８０）、このようなｓｉＲＮＡに本発明に係る構造を適用させる場合、オフ−ターゲット効果を最小化しながら第１鎖の一本鎖領域に含まれる核酸オリゴヌクレオチドによる前記のような効果を同時に示すことができる。本願において「オフ−ターゲット効果（Off-target effect）」とは、本来ｓｉＲＮＡは、アンチセンス鎖と相補的な配列を持つｍＲＮＡの分解を誘導して、該当ｍＲＮＡの遺伝子発現を抑制する効果を得るために用いられるものであるにもかかわらず、ｓｉＲＮＡのセンス鎖によって他のｍＲＮＡの分解が発生する場合、センス鎖によって発生するこのような予想できない他のｍＲＮＡの分解乃至当該遺伝子の発現抑制効果、及びｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖が誤ったターゲットとペアリングして他のｍＲＮＡの分解が発生するアンチセンス鎖による他のｍＲＮＡの分解が発生する当該遺伝子の発現抑制効果を全て含む。
本発明の核酸分子は、一般に合成されたものであるが、これに限定されない。即ち、本発明において、前記核酸分子は、化学的または、酵素学的に合成されたものであってもよい。本発明のｓｉＲＮＡ分子は、標準組換え技法によって自然発生的遺伝子から誘導することができるが、この場合、発現を変化させる標的遺伝子のｍＲＮＡの少なくとも一部分とヌクレオチド配列レベルで実質的に相補的であることを特徴とする。
そこで、本発明に係る核酸分子は、化学的変形を含むことを特徴とする。前記化学的変形は、前記核酸分子に含まれる少なくとも１種のヌクレオチドのリボースの２'位置のヒドロキシル基が、水素原子、フッ素原子、−Ｏ−アルキル基、−Ｏ−アシル基、及びアミノ基のいずれか一つに置き換えられることを特徴とするが、これに制限されることなく核酸分子の伝達能を高めるなら、−Ｂｒ、−Ｃｌ、−Ｒ、−Ｒ'ＯＲ、−ＳＨ、−ＳＲ、−Ｎ３及びＣＮ（Ｒ＝ａｌｋｙｌ、ａｒｙｌ、ａｌｋｙｌｅｎｅ）のいずれか一つに置き換えられてもよい。また、前記化学的変形は、少なくとも１種のヌクレオチドのホスフェートバックボーンがホスホロチオエート型（phosphorothioate form）、ホスホロジチオエート型（phosphorodithioate form）、アルキルホスホネート型（alkylphosphonate form）、ホスホラミデート型（phosphoramidate form）及びボラノホスフェート型（boranophosphate form）のいずれか一つに置き換えられてもよい。また、前記化学的変形は、前記核酸分子に含まれる少なくとも１種のヌクレオチドがＬＮＡ（locked nucleic acid）、ＵＮＡ（unlocked nucleic acid）、モルホリノ（Morpholino）、ＰＮＡ（peptide nucleic acid）のいずれか一つに置き換えられることを特徴とし、前記化学的変形は、前記核酸分子が、脂質、細胞透過性ペプチド（cell penetrating peptide）及び細胞標的リガンドからなる群から選択される一つ以上と結合することを特徴とする。
さらに、本発明に係る核酸分子は、細胞伝達体に結合して細胞内に導入されることができる。従って、他の観点において、本発明は、前記ＲＮＡｉを誘導する核酸分子に細胞伝達体が結合している核酸複合体に関する。
本発明において、前記細胞伝達体はカチオン性ポリマー、脂質、細胞透過性ペプチド及び細胞標的リガンドからなる群から選択されることを特徴とし、カチオン性ポリマー、カチオン性脂質のようなカチオン性細胞伝達体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏのいずれの状態でも核酸、即ちｓｉＲＮＡを細胞内に伝達するために用いられるものであり、陽性に電荷された伝達のための試薬である。カチオン性細胞伝達体は、本発明の核酸分子と強く相互作用をして、複合体を形成することによって、ＲＮＡｉを誘導する核酸分子が効果的に細胞内導入されるようにする。ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）のようなカチオン性ポリマー、またはリポフェクトアミン（Lipofectamine）２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のようなリポソームが用いられるが、これに制限されることなく陽性で電荷された伝達のための試薬の場合、本発明に係る複合体を提供するために使用できることは、本発明が属する技術分野において通常の知識を有する者には自明である。また、コレステロールのような脂質は、核酸分子に直接的に連結されたり、他の細胞伝達体に結合した後、核酸分子と結合することによって間接的に連結されたりする。
さらに、本発明の実施例は、本発明に係るＲＮＡｉを誘導する核酸分子が、効率的に標的遺伝子発現抑制効果をもたらすことを示す。従って、また他の観点において、本発明は、前記ＲＮＡｉを誘導する核酸分子を含有する遺伝子発現抑制用組成物に関する。この時、前記核酸分子は、前記細胞伝達体が結合した核酸複合体の形態で含まれてもよい。
本発明の実施例では、標的遺伝子として、ＫＲＡＳだけでなく、ＣＴＮＮＢ１−２を標的とするｓｉＲＮＡに対しても同様に本発明に係る核酸構造適用時標的遺伝子発現抑制効率が顕著に増加してその効能も長く持続させる可能性があることを確認しており、本発明に係る核酸分子構造は、その他の標的遺伝子をターゲットにする核酸分子を提供した場合にも同様の結果が得られることは、本発明が属する技術分野において通常の知識を有する者には自明である。
一方、前記遺伝子発現抑制用組成物は遺伝子発現抑制用キット（kit）の形態で提供できる。遺伝子発現抑制用キットは瓶、筒（tub）、小袋（sachet）、封筒（envelope）、チューブ、アンプル（ampoule）等のような形態であってもよく、これらは部分的にまたは全体的にプラスチック、ガラス、紙、ホイール、ワックスなどから形成される。容器は、最初は容器の一部であるか、または機械的、接着性、またはその他の手段によって、容器に付着できる、完全にまたは部分的に分離可能な栓を取り付けることができる。容器はまた注射針によって内容物に接近できる、ストッパーが取り付けられる。前記キットは外部パッケージを有することができ、外部パッケージは構成要素の使用に関する使用説明書を含んでもよい。
また他の観点において、本発明は、前記ＲＮＡｉを誘導する核酸分子を利用して細胞内標的遺伝子の発現を抑制させる方法に関する。即ち、前記ＲＮＡｉを誘導する核酸分子を細胞内に導入させる工程を含む細胞内標的遺伝子の発現抑制方法に関する。
本発明において、前記ＲＮＡｉを誘導する核酸分子の第１鎖は、標的遺伝子のｍＲＮＡ配列に相補的であることを特徴とする。
本発明において、前記標的遺伝子は内因性（endogeneous）遺伝子であるか導入遺伝子（transgene）であってもよい。
この時、本発明に係る核酸分子は、必ずしも合成ｓｉＲＮＡに制限されなく、細胞内で発現ベクター等を利用して発現するｓｉＲＮＡやｓｈＲＮＡにも適用可能な長所がある。即ち、本発明に係る核酸分子は、細胞内で発現させることによって標的遺伝子の発現を抑制させることができる。従って、また他の観点において、本発明は、前記ＲＮＡｉを誘導する核酸分子を細胞内で発現させる工程を含む細胞内標的遺伝子の発現抑制方法に関する。
一方、本発明に係るＲＮＡｉを誘導する核酸分子は、過発現によって癌を発生させたり、成長させたりする遺伝子、即ち腫瘍関連遺伝子を標的遺伝子として前記標的遺伝子の発現を抑制させるために利用されることができるため、抗癌組成物として有用である。この時、腫瘍関連遺伝子は、これに制限されないか、ＫＲａｓ、Ｗｎｔ−１、Ｈｅｃ１、サバイビン（Survivin）、Ｌｉｖｉｎ、Ｂｃｌ−２、ＸＩＡＰ、Ｍｄｍ２、ＥＧＦ、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ、Ｍｃｌ−１、ＩＧＦ１Ｒ、Ａｋｔ１、Ｇｒｐ７８、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ５ａ、β−カテニン（β-catenin）、ＷＩＳＰ１及びｃ−ｍｙｃいずれか一つであることを特徴とする。本発明の一実施例では、本発明に係る構造のｓｉＲＮＡ分子を細胞内導入することによって、癌細胞の成長に関与する遺伝子であるＫＲＡＳの発現を抑制して、β−カテニンを標的遺伝子とするｓｉＲＮＡ分子を作製して癌細胞株が死滅することを確認した。
本発明に係る抗癌組成物は、前記ＲＮＡｉを誘導する核酸分子、または前記核酸分子と細胞伝達体が結合した複合体を単独で含んだり一つ以上の薬学的許容される担体、賦形剤または希釈剤を含んで薬学組成物で提供でき、前記複合体は疾患及びこれの重症程度、患者の年令、体重、健康状態、性別、投与経路及び治療期間等により適切な薬学的に有効な量で薬学組成物に含まれる。
前記において「薬学的に許容される組成物」とは、生理学的に許容され、ヒトに投与される時、通常胃腸障害、めまいのようなアレルギー反応またはこれと類似する反応を起こさない組成物のことをいう。前記担体、賦形剤及び希釈剤としては、例えば、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、澱粉、アカシアゴム、アルジネート、ゼラチン、燐酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、水、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、マグネシウムステアレート及び鉱物油が挙げられる。
前記薬学組成物は、充填剤、抗凝集剤、潤滑剤、湿潤剤、香料、乳化剤及び防腐剤等をさらに含んでもよい。また、本発明の薬学組成物は、ほ乳動物に投与された後、活性成分の迅速、持続または遅延放出を提供できるように当業界に公示された方法を使って、剤形化される。剤形は滅菌注射溶液などの形態でありうる。
前記薬学組成物は、充填剤、抗凝集剤、潤滑剤、湿潤剤、香料、乳化剤及び防腐剤等をさらに含んでもよい。また、本発明の薬学組成物は、ほ乳動物に投与された後、活性成分の迅速、持続または遅延放出を提供できるように当業界に公示された方法を使って、剤形化される。剤形は滅菌注射溶液などの形態でありうる。
一方、本発明に係るＲＮＡｉを誘導する核酸分子、または本核酸分子と細胞伝達体が結合した複合体は、従来公知の抗癌化学療法剤を追加的に含むことによって、併用効果が期待できる。例えば、シスプラチン（cisplatin）、カルボプラチン（carboplatin）、オキサリプラチン（oxaliplatin）、ドキソルビシン（doxorubicin）、ダウノルビシン（daunorubicin）、エピルビシン（epirubicin）、イダルビシン（idarubicin）、ミトキサントロン（mitoxantrone）、バルルビシン（valrubicin）、クルクミン（curcumin）、ゲフィチニブ（gefitinib）、エルロチニブ（erlotinib）、イリノテカン（irinotecan）、トポテカン（topotecan）、ビンブラスチン（vinblastine）、ビンクリスチン（vincristine）、ドセタキセル（docetaxel）、パクリタキセル（paclitaxel）等が用いられる。
以下、本発明を実施例を挙げて詳述する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に制限されないことは当業者において通常の知識を有する者にとって自明である。
実施例１：ロング・アンチセンス・ガイディッド（long-antisense-guided）ｓｉＲＮＡの作製：製造例１
第２鎖の長さは、２１ｎｔと短く維持し、第１鎖で第２鎖と二本鎖を形成する領域を１９ｎｔにして、第１鎖の３'末端を標的ｍＲＮＡと相補的な配列で１７ｎｔの長さの一本鎖領域を持つように作製した。作製された長いアンチセンス鎖を持つｓｉＲＮＡをロング・アンチセンス（long-antisense）ｓｉＲＮＡ（ｌｓｉＲＮＡ）と命名した。拡張配列に含まれる核酸オリゴヌクレオチドによってｓｉＲＮＡが標的ｍＲＮＡに誘導されるか典型的なアンチセンス機構（antisense mechanism）として作用する（図２）。
第２鎖の長さは、２１ｎｔと短く維持し、第１鎖で第２鎖と二本鎖を形成する領域を１９ｎｔにして、第１鎖の３'末端を標的ｍＲＮＡと相補的な配列で１７ｎｔの長さの一本鎖領域を持つように作製した。作製された長いアンチセンス鎖を持つｓｉＲＮＡをロング・アンチセンス（long-antisense）ｓｉＲＮＡ（ｌｓｉＲＮＡ）と命名した。拡張配列に含まれる核酸オリゴヌクレオチドによってｓｉＲＮＡが標的ｍＲＮＡに誘導されるか典型的なアンチセンス機構（antisense mechanism）として作用する（図２）。
実施例２：ロング・アンチセンス（long-antisense）ａｓｉＲＮＡの作製：製造例２
第２鎖の長さを、１５ｎｔと短く維持し、第１鎖で第２鎖と二本鎖を形成する領域を１９ｎｔにして、第１鎖の３'末端を標的ｍＲＮＡと相補的な配列で１７ｎｔの長さの拡張配列を持ち５'末端は平滑末端を持つように作製した。作製された長いアンチセンス鎖を持つｓｉＲＮＡは、ロング・アンチセンスａｓｉＲＮＡ（ｌａｓｉＲＮＡ）と命名した。拡張配列に含まれる核酸オリゴヌクレオチドによってｓｉＲＮＡが標的ｍＲＮＡに誘導されるか典型的なアンチセンス機構として作用する（図３）。
第２鎖の長さを、１５ｎｔと短く維持し、第１鎖で第２鎖と二本鎖を形成する領域を１９ｎｔにして、第１鎖の３'末端を標的ｍＲＮＡと相補的な配列で１７ｎｔの長さの拡張配列を持ち５'末端は平滑末端を持つように作製した。作製された長いアンチセンス鎖を持つｓｉＲＮＡは、ロング・アンチセンスａｓｉＲＮＡ（ｌａｓｉＲＮＡ）と命名した。拡張配列に含まれる核酸オリゴヌクレオチドによってｓｉＲＮＡが標的ｍＲＮＡに誘導されるか典型的なアンチセンス機構として作用する（図３）。
実施例３：ＤＮＡザイム（または、リボザイム）−ｇｕｉｄｅｄ ｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＺＮＡ）の作製：製造例３
ＣＴＮＮＢ１−２ｓｉＲＮＡ及びＤｚ３３９ ＤＮＡザイムを利用して、センス鎖の長さを２１ｎｔと短く維持し、１９ｎｔの長さのアンチセンス鎖の３'末端にＤＮＡザイムを持つように長いアンチセンス鎖を持つ構造を作製した。作製された構造体をＤＮＡザイム−ｇｕｉｄｅｄ ｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＺＮＡ）と命名した（図４）。
ＣＴＮＮＢ１−２ｓｉＲＮＡ及びＤｚ３３９ ＤＮＡザイムを利用して、センス鎖の長さを２１ｎｔと短く維持し、１９ｎｔの長さのアンチセンス鎖の３'末端にＤＮＡザイムを持つように長いアンチセンス鎖を持つ構造を作製した。作製された構造体をＤＮＡザイム−ｇｕｉｄｅｄ ｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＺＮＡ）と命名した（図４）。
実施例４：ＫＲＡＳ遺伝子の発現を阻害するｌｓｉＲＮＡ作製及びＫＲＡＳ遺伝子発現抑制能確認
癌細胞の成長に関与する遺伝子であるＫＲＡＳの発現を阻害するｓｉＲＮＡをデザインした。また、既存ｓｉＲＮＡ構造（１９＋２）のアンチセンス鎖の３'末端に各５、１０、１５ｎｔが加わったロング・アンチセンスｓｉＲＮＡ（ｌｓｉＲＮＡ）を作製した。この時、下記の通り標的ｍＲＮＡと相補的な配列のＤＮＡに拡張された構造（２１Ｓ＋５ｄ、１０ｄ、１５ｄ）と、対照群として標的ｍＲＮＡと相補的でない配列のＤＮＡに拡張された構造（２１Ｓ＋５ｃ、１０ｃ、１５ｃ）を作製して、標的遺伝子発現抑制効率を比較した（図５）。またｌｓｉＲＮＡのシード配列（seed sequence）を変異させた構造（２１＋１５ｄ−ｍｕｔ）を作製して、ｌｓｉＲＮＡの遺伝子抑制力がｓｉＲＮＡと共にシード配列依存的であるかをテストした。各ｓｉＲＮＡ及びｌｓｉＲＮＡは、１０ｎＭ濃度でリポフェクトアミン２０００（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を利用してＡＧＳ ｃｅｌｌ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １７３９、Ｇａｓｔｒｉｃ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ、ｈｕｍａｎ）にトランスフェクションした。ｍＲＮＡ測定のためのＲｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲに用いられたプライマーは下記の通りである。
ＫＲＡＳ
フォワード配列 ５’−ＧＡＧＴＧＣＣＴＴＧＡＣＧＡＴＡＣＡＧＣ−３’（配列番号１５）
リバース配列 ５’−ＣＣＣＴＣＡＴＴＧＣＡＣＴＧＴＡＣＴＣＣ−３’（配列番号１６）
癌細胞の成長に関与する遺伝子であるＫＲＡＳの発現を阻害するｓｉＲＮＡをデザインした。また、既存ｓｉＲＮＡ構造（１９＋２）のアンチセンス鎖の３'末端に各５、１０、１５ｎｔが加わったロング・アンチセンスｓｉＲＮＡ（ｌｓｉＲＮＡ）を作製した。この時、下記の通り標的ｍＲＮＡと相補的な配列のＤＮＡに拡張された構造（２１Ｓ＋５ｄ、１０ｄ、１５ｄ）と、対照群として標的ｍＲＮＡと相補的でない配列のＤＮＡに拡張された構造（２１Ｓ＋５ｃ、１０ｃ、１５ｃ）を作製して、標的遺伝子発現抑制効率を比較した（図５）。またｌｓｉＲＮＡのシード配列（seed sequence）を変異させた構造（２１＋１５ｄ−ｍｕｔ）を作製して、ｌｓｉＲＮＡの遺伝子抑制力がｓｉＲＮＡと共にシード配列依存的であるかをテストした。各ｓｉＲＮＡ及びｌｓｉＲＮＡは、１０ｎＭ濃度でリポフェクトアミン２０００（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を利用してＡＧＳ ｃｅｌｌ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １７３９、Ｇａｓｔｒｉｃ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ、ｈｕｍａｎ）にトランスフェクションした。ｍＲＮＡ測定のためのＲｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲに用いられたプライマーは下記の通りである。
ＫＲＡＳ
フォワード配列 ５’−ＧＡＧＴＧＣＣＴＴＧＡＣＧＡＴＡＣＡＧＣ−３’（配列番号１５）
リバース配列 ５’−ＣＣＣＴＣＡＴＴＧＣＡＣＴＧＴＡＣＴＣＣ−３’（配列番号１６）
その結果、図６に示された通り、標的ｍＲＮＡに相補的な一本鎖領域を持つｌｓｉＲＮＡの場合、既存ｓｉＲＮＡ構造に比べて向上した標的遺伝子抑制力を見せることを確認しており、この傾向は前記一本鎖領域の長さに比例することが分かった。それに対して、標的ｍＲＮＡに相補的でない一本鎖領域を持つｌｓｉＲＮＡ対照群の場合、このような向上した遺伝子発現抑制は観察できなかった。また、シード配列変異（seed sequence mutation）を持つｌｓｉＲＮＡの場合には、標的遺伝子抑制力が略消えたことを確認した。これは、ｌｓｉＲＮＡが既存ｓｉＲＮＡと共にシード配列依存的なＲＮＡｉメカニズムで標的遺伝子を抑制して、変形された構造による非特異的遺伝子抑制現象が起きないことを示している。
次に、ｌｓｉＲＮＡがｓｉＲＮＡに比べて細胞内導入後、標的遺伝子抑制力をよりよく維持するかを調べた。既存ｓｉＲＮＡ構造の場合、細胞導入１日後遺伝子発現抑制力が最高に達しており、２日、３日になるにつれて抑制力が減少することを確認した（図７）。それに対して、ｌｓｉＲＮＡの場合、細胞内導入後３日までにも標的遺伝子発現抑制力が維持されることが分かった。また、標的ｍＲＮＡに相補的でない一本鎖領域を持つｌｓｉＲＮＡ対照群の場合、このような向上した遺伝子発現抑制を観察できなかった。この結果は、標的遺伝子のｍＲＮＡに相補的な一本鎖領域を持つｌｓｉＲＮＡの場合、既存ｓｉＲＮＡ構造に比べてさらに高い効率の遺伝子発現抑制力を示すだけでなく、その効能もより長く維持されることを示している。
実施例５：ＫＲＡＳ遺伝子発現を阻害するｌａｓｉＲＮＡ作製及びＫＲＡＳ遺伝子発現抑制能確認
実施例４に追加して、本発明に係る核酸分子構造がアシンメトリック・ショーター・デュプレックス（asymmetric shorter duplex）ｓｉＲＮＡ（ａｓｉＲＮＡ）に適用時、これの標的遺伝子発現抑制力を向上させることができるか調べた。
実施例４同様に既存ａｓｉＲＮＡ構造のアンチセンス鎖の３'末端に標的ｍＲＮＡと相補的な配列のＤＮＡに拡張された構造（１６Ｓ＋５ｄ、１０ｄ、１５ｄ）及び相補的でない配列のＤＮＡに拡張された対照群（１６Ｓ＋５ｃ、１０ｃ、１５ｃ）ロング・アンチセンスａｓｉＲＮＡ（ｌａｓｉＲＮＡ）を作製してＡＧＳ細胞にトランスフェクションした後、癌細胞成長阻害力を比較した（図８）。これらのＲＮＡをＡＧＳ細胞にトランスフェクションした後、実施例４と同様の方法でｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲを行って、標的遺伝子であるＫＲＡＳ発現抑制効率を検証した（図９）。各ａｓｉＲＮＡ及びｌａｓｉＲＮＡは、１０ｎＭ濃度でリポフェクトアミン２０００（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を利用して、ＡＧＳ ｃｅｌｌ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １７３９，Ｇａｓｔｒｉｃ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ，ｈｕｍａｎ）にトランスフェクションした。
実施例４に追加して、本発明に係る核酸分子構造がアシンメトリック・ショーター・デュプレックス（asymmetric shorter duplex）ｓｉＲＮＡ（ａｓｉＲＮＡ）に適用時、これの標的遺伝子発現抑制力を向上させることができるか調べた。
実施例４同様に既存ａｓｉＲＮＡ構造のアンチセンス鎖の３'末端に標的ｍＲＮＡと相補的な配列のＤＮＡに拡張された構造（１６Ｓ＋５ｄ、１０ｄ、１５ｄ）及び相補的でない配列のＤＮＡに拡張された対照群（１６Ｓ＋５ｃ、１０ｃ、１５ｃ）ロング・アンチセンスａｓｉＲＮＡ（ｌａｓｉＲＮＡ）を作製してＡＧＳ細胞にトランスフェクションした後、癌細胞成長阻害力を比較した（図８）。これらのＲＮＡをＡＧＳ細胞にトランスフェクションした後、実施例４と同様の方法でｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲを行って、標的遺伝子であるＫＲＡＳ発現抑制効率を検証した（図９）。各ａｓｉＲＮＡ及びｌａｓｉＲＮＡは、１０ｎＭ濃度でリポフェクトアミン２０００（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を利用して、ＡＧＳ ｃｅｌｌ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １７３９，Ｇａｓｔｒｉｃ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ，ｈｕｍａｎ）にトランスフェクションした。
その結果、ｌｓｉＲＮＡに似てｌａｓｉＲＮＡの場合にも標的ｍＲＮＡに相補的な一本鎖拡張配列を持つｌａｓｉＲＮＡは拡張配列の長さに比例して標的ｍＲＮＡ抑制力が増加することを確認した。それに対して、拡張配列が標的ｍＲＮＡに相補的でない場合にはこのような効果は観察できなかった。
実施例６：ＫＲＡＳ遺伝子発現を阻害するｌａｓｉＲＮＡ及びｌａｓｉＲＮＡによるＡＧＳ癌細胞成長抑制能確認
次に、ｓｉＲＮＡ及びａｓｉＲＮＡ対応各々向上した標的遺伝子抑制力を示すＫＲＡＳ標的ｌｓｉＲＮＡ及びｌａｓｉＲＮＡ構造がＡＧＳ癌細胞の成長抑制力も増加させるかを確認した。これのために、１０ｎＭのＲＮＡを９６ウェルプレートに播種されたＡＧＳ細胞にリポフェクトアミン２０００でトランスフェクションしてから５日後の細胞の生存率を顕微鏡観察で直接細胞の個数を目でカウントして測定した。
次に、ｓｉＲＮＡ及びａｓｉＲＮＡ対応各々向上した標的遺伝子抑制力を示すＫＲＡＳ標的ｌｓｉＲＮＡ及びｌａｓｉＲＮＡ構造がＡＧＳ癌細胞の成長抑制力も増加させるかを確認した。これのために、１０ｎＭのＲＮＡを９６ウェルプレートに播種されたＡＧＳ細胞にリポフェクトアミン２０００でトランスフェクションしてから５日後の細胞の生存率を顕微鏡観察で直接細胞の個数を目でカウントして測定した。
その結果、ＫＲＡＳ ｍＲＮＡ発現抑制能と癌細胞成長抑制力が高い相関を持つことを確認した。即ち、ｓｉＲＮＡに比べて１５個の拡張配列を持つｌｓｉＲＮＡ（２１Ｓ＋１５ｄ）は、さらに強力な癌細胞成長抑制力を見せることを確認し、ａｓｉＲＮＡに比べてｌａｓｉＲＮＡ（１６Ｓ＋１５ｄ）の癌細胞成長抑制力も増加したことを確認した（図１０）。一方、シード配列に突然変異を導入したｌｓｉＲＮＡの場合（ＬＡＳｍｕｔ）、癌細胞成長阻害を誘導できないことを確認することによって、長い拡張配列構造による非特異的細胞毒性が現れないことを検証することができた。このような結果は、ｓｉＲＮＡ及びａｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖３'−末端に標的ｍＲＮＡに相補的な一本鎖領域を導入することによって、遺伝子抑制力及びそれに伴う細胞内表現型発現を増加させることができることを示している。
実施例７：拡張配列がＲＮＡであるｌｓｉＲＮＡ及びｌａｓｉＲＮＡによるＫＲＡＳ遺伝子発現抑制能確認
次に、ｌｓｉＲＮＡ及びｌａｓｉＲＮＡの拡張配列がＤＮＡでないＲＮＡの場合にも、各々相応するｓｉＲＮＡ及びａｓｉＲＮＡに比べて標的遺伝子発現抑制力が増加するかを調べた。
図１１のように１０個のｍＲＮＡ相補的拡張配列を持つｌｓｉＲＮＡ（２１Ｓ＋１０ｒ）及びｌａｓｉＲＮＡ（１６Ｓ＋１０ｒ）を作製し、対照群としてｍＲＮＡに相補的でない拡張配列を持つ構造（２１Ｓ＋１０ｒｃ、１６Ｓ＋１０ｒｃ）も共に作製した。これらをＡＧＳ細胞にトランスフェクションした後、実施例４と同様の方法でＫＲＡＳ ｍＲＮＡ発現抑制効率を調べた。
次に、ｌｓｉＲＮＡ及びｌａｓｉＲＮＡの拡張配列がＤＮＡでないＲＮＡの場合にも、各々相応するｓｉＲＮＡ及びａｓｉＲＮＡに比べて標的遺伝子発現抑制力が増加するかを調べた。
図１１のように１０個のｍＲＮＡ相補的拡張配列を持つｌｓｉＲＮＡ（２１Ｓ＋１０ｒ）及びｌａｓｉＲＮＡ（１６Ｓ＋１０ｒ）を作製し、対照群としてｍＲＮＡに相補的でない拡張配列を持つ構造（２１Ｓ＋１０ｒｃ、１６Ｓ＋１０ｒｃ）も共に作製した。これらをＡＧＳ細胞にトランスフェクションした後、実施例４と同様の方法でＫＲＡＳ ｍＲＮＡ発現抑制効率を調べた。
その結果、図１２に示されたように、ＲＮＡ拡張配列を持つ場合にも、ｌｓｉＲＮＡとｌａｓｉＲＮＡは、各々相応するｓｉＲＮＡとａｓｉＲＮＡに比べてさらに高い標的遺伝子抑制能を示し、特にＲＮＡ拡張配列を持つｌａｓｉＲＮＡはＤＮＡ拡張配列を持つｌａｓｉＲＮＡに比べてさらに増加した抑制能を示すことを確認した。これは、ロング・アンチセンス拡張配列がＤＮＡだけでなくＲＮＡの場合にも目標とする遺伝子発現抑制能を達成できることを示している。
実施例８：ＣＴＮＮＢ１遺伝子発現を阻害するｌａｓｉＲＮＡ作製及びＣＴＮＮＢ１遺伝子発現抑制能確認
８−１：ＣＴＮＮＢ１ ｍＲＮＡ発現レベル測定
次に、本発明に係る核酸分子構造が異なる遺伝子を標的遺伝子とするａｓｉＲＮＡの活性増加を誘導できるか確認するために、β−カテニン（ＣＴＮＮＢ１）を標的にするａｓｉＲＮＡに対応するｌａｓｉＲＮＡ構造を作製した（図１３）。その次に、Ｈｅｐ３Ｂ細胞（ＡＴＣＣ ＨＢ ８０６４）にリポフェクトアミン２０００で１０ｎＭの濃度でトランスフェクションした後、リアルタイムＰＣＲで標的遺伝子の発現抑制力を調べた。
ＣＴＮＮＢ１
フォワード配列 ５’−ＡＴＧＴＣＣＡＧＣＧＴＴＴＧＧＣＴＧＡＡ−３’（配列番号３２）
リバース配列 ５’−ＴＧＧＴＣＣＴＣＧＴＣＡＴＴＴＡＧＣＡＧＴＴ−３’（配列番号３３）
８−１：ＣＴＮＮＢ１ ｍＲＮＡ発現レベル測定
次に、本発明に係る核酸分子構造が異なる遺伝子を標的遺伝子とするａｓｉＲＮＡの活性増加を誘導できるか確認するために、β−カテニン（ＣＴＮＮＢ１）を標的にするａｓｉＲＮＡに対応するｌａｓｉＲＮＡ構造を作製した（図１３）。その次に、Ｈｅｐ３Ｂ細胞（ＡＴＣＣ ＨＢ ８０６４）にリポフェクトアミン２０００で１０ｎＭの濃度でトランスフェクションした後、リアルタイムＰＣＲで標的遺伝子の発現抑制力を調べた。
ＣＴＮＮＢ１
フォワード配列 ５’−ＡＴＧＴＣＣＡＧＣＧＴＴＴＧＧＣＴＧＡＡ−３’（配列番号３２）
リバース配列 ５’−ＴＧＧＴＣＣＴＣＧＴＣＡＴＴＴＡＧＣＡＧＴＴ−３’（配列番号３３）
その結果、図１４に示したように、既存ｓｉＲＮＡ構造に比べてａｓｉＲＮＡの場合、標的遺伝子発現抑制力が減少したが、１５ｎｔのｍＲＮＡ配列に相補的なＤＮＡをアンチセンス３'末端に持つｌａｓｉＲＮＡ（１６Ｓ＋１５ｄ）の場合、ｓｉＲＮＡと類似する程度で標的遺伝子抑制力が増加することを確認した。それに対して、拡張ＤＮＡ配列が標的遺伝子と相補的でない場合（１６Ｓ＋１５ｃ）には、ａｓｉＲＮＡに比べて標的遺伝子抑制力の減少が大きくなかった。従って、ｌａｓｉＲＮＡ構造の場合、ａｓｉＲＮＡ配列と関係なくｌａｓｉＲＮＡ構造依存的に標的遺伝子抑制力を増加させることを確認した。
８−２：Ｈｅｐ３Ｂ癌細胞成長阻害力測定
このようなｌａｓｉＲＮＡ構造による標的遺伝子抑制力増加は、Ｈｅｐ３Ｂ癌細胞成長阻害力測定を介して再検証された。即ち、１０ｎＭのｓｉＲＮＡ、ａｓｉＲＮＡ、ｌａｓｉＲＮＡをＨｅｐ３Ｂ細胞に導入してから５日後、細胞成長程度を、細胞数測定を介して調べた。細胞の生存率は、顕微鏡観察を介して直接細胞の個数を目で測定して調べた。簡単に説明すると、９６ウェルプレートに播種されたＡＧＳ細胞に１０ｎＭのｓｉＲＮＡ、ａｓｉＲＮＡ、ｌａｓｉＲＮＡをトランスフェクションさせてから５日後、生き残った細胞の数を直接目でカウントして測定した。
このようなｌａｓｉＲＮＡ構造による標的遺伝子抑制力増加は、Ｈｅｐ３Ｂ癌細胞成長阻害力測定を介して再検証された。即ち、１０ｎＭのｓｉＲＮＡ、ａｓｉＲＮＡ、ｌａｓｉＲＮＡをＨｅｐ３Ｂ細胞に導入してから５日後、細胞成長程度を、細胞数測定を介して調べた。細胞の生存率は、顕微鏡観察を介して直接細胞の個数を目で測定して調べた。簡単に説明すると、９６ウェルプレートに播種されたＡＧＳ細胞に１０ｎＭのｓｉＲＮＡ、ａｓｉＲＮＡ、ｌａｓｉＲＮＡをトランスフェクションさせてから５日後、生き残った細胞の数を直接目でカウントして測定した。
その結果、図１５に示したように、ｓｉＲＮＡに比べてａｓｉＲＮＡの癌細胞死滅力は、多少減少したが、標的遺伝子相補的拡張配列を持つｌａｓｉＲＮＡの場合、ｓｉＲＮＡと類似する程度の細胞死滅力を示しており、一方標的遺伝子と相補的でない拡張配列を持つｌａｓｉＲＮＡは、細胞死滅力がａｓｉＲＮＡに比べて増加しないことを確認することができた。これは、アンチセンス鎖の３'末端に標的遺伝子と相補的な配列を含有する拡張配列を持つｓｉＲＮＡ分子は、標的遺伝子発現抑制力が増加することを示す。
実施例９：遺伝子発現抑制機序の分析
本発明に係る核酸分子が、従来の１９＋２ ｓｉＲＮＡやａｓｉＲＮＡと同じＲＮＡｉ機序によって遺伝子発現を抑制させるか確認するために、下記の実験を行った。即ち、標的ｍＲＮＡに対する切断部位を分析するために、５’ＲＡＣＥ分析を行った。
先ず、実施例４及び５で作製したｓｉＫＲＡＳ、ａｓｉＫＲＡＳ、ＬａｉＫＲＡＳ、ＬａｓｉＫＲＡＳをＰＥＩを利用してＨｅＬａ細胞に導入してから１８時間後にトリ・リージェント・キット（Tri-reagent kit）（Ａｍｂｉｏｎ）で全ＲＮＡを抽出した。全ＲＮＡ（３μｇ）は、前処理なしに０.２５μｇのＧｅｎｅＲａｃｅｒ ＲＮＡ ｏｌｉｇｏをライゲーション（ligation）させた後、ＧｅｎｅＲａｃｅｒ ＲＮＡ ｏｌｉｇｏ−ライゲーションされた全ＲＮＡをＧｅｎｅＲａｃｅｒ ｏｌｉｇｏ ｄＴ及びＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商品名）ＩＩＩ ＲＴ ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を利用して逆転写させた。ＲＮＡオリゴライゲーションされたｍＲＮＡは、遺伝子特異的なプライマーを利用して増幅した。その次に、ＰＣＲ産物は、Ｔ＆Ａ ｖｅｃｔｏｒ（ＲＢＣ）でクローンした後、Ｍ１３ フォワードプライマーでシーケンスした。
ＫＲＡＳ Ｇｅｎｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｐｒｉｍｅｒ:
５'−ＣＴＧＣＡＴＧＣＡＣＣＡＡＡＡＡＣＣＣＣＡＡＧＡＣＡ−３'（配列番号３４）
ＫＲＡＳ Ｇｅｎｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｐｒｉｍｅｒ Ｎｅｓｔｅｄ:
５'−ＣＡＣＡＡＡＧＡＡＡＧＣＣＣＴＣＣＣＣＡＧＴＣＣＴＣＡ−３'（配列番号３５）
本発明に係る核酸分子が、従来の１９＋２ ｓｉＲＮＡやａｓｉＲＮＡと同じＲＮＡｉ機序によって遺伝子発現を抑制させるか確認するために、下記の実験を行った。即ち、標的ｍＲＮＡに対する切断部位を分析するために、５’ＲＡＣＥ分析を行った。
先ず、実施例４及び５で作製したｓｉＫＲＡＳ、ａｓｉＫＲＡＳ、ＬａｉＫＲＡＳ、ＬａｓｉＫＲＡＳをＰＥＩを利用してＨｅＬａ細胞に導入してから１８時間後にトリ・リージェント・キット（Tri-reagent kit）（Ａｍｂｉｏｎ）で全ＲＮＡを抽出した。全ＲＮＡ（３μｇ）は、前処理なしに０.２５μｇのＧｅｎｅＲａｃｅｒ ＲＮＡ ｏｌｉｇｏをライゲーション（ligation）させた後、ＧｅｎｅＲａｃｅｒ ＲＮＡ ｏｌｉｇｏ−ライゲーションされた全ＲＮＡをＧｅｎｅＲａｃｅｒ ｏｌｉｇｏ ｄＴ及びＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商品名）ＩＩＩ ＲＴ ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を利用して逆転写させた。ＲＮＡオリゴライゲーションされたｍＲＮＡは、遺伝子特異的なプライマーを利用して増幅した。その次に、ＰＣＲ産物は、Ｔ＆Ａ ｖｅｃｔｏｒ（ＲＢＣ）でクローンした後、Ｍ１３ フォワードプライマーでシーケンスした。
ＫＲＡＳ Ｇｅｎｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｐｒｉｍｅｒ:
５'−ＣＴＧＣＡＴＧＣＡＣＣＡＡＡＡＡＣＣＣＣＡＡＧＡＣＡ−３'（配列番号３４）
ＫＲＡＳ Ｇｅｎｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｐｒｉｍｅｒ Ｎｅｓｔｅｄ:
５'−ＣＡＣＡＡＡＧＡＡＡＧＣＣＣＴＣＣＣＣＡＧＴＣＣＴＣＡ−３'（配列番号３５）
その結果、図１６に示したように、ｓｉＫＲＡＳ、ａｓｉＫＲＡＳを処理した場合と、ＬｓｉＫＲＡＳ、ＬａｓｉＫＲＡＳを処理した場合共に同じ大きさのＲＡＣＥ産物を得ることができた。また、これらＲＡＣＥ産物をＴ−ｖｅｃｔｏｒ（ＲＢＣ）にクローニングした後、シーケンスを介して塩基配列上正確な切断位置を確認した結果、ｓｉＫＲＡＳ、ａｓｉＫＲＡＳ、ＬｓｉＫＲＡＳ、ＬａｓｉＫＲＡＳ共にアンチセンス鎖の５'末端から１０番目と１１番目の塩基との間に該当するｍＲＮＡの位置が切断されたことを確認した。
以上説明したように、本発明に係る核酸分子構造は、第１鎖の３'末端の一本鎖領域に含まれる核酸オリゴヌクレオチドにより、第１鎖の一部領域と相補的な標的遺伝子をターゲッティングすることで、ｓｉＲＮＡを標的遺伝子に誘導して、遺伝子抑制効率を増加させるか、またはアンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、ＤＮＡザイムの導入によって、ｓｉＲＮＡと共に同一標的遺伝子に対する結合力向上、または相乗的開裂が起きる効果があって、標的遺伝子抑制効率を増加させることができる。さらに、本発明に係る核酸分子を用いることによって、遺伝子抑制効率の持続期間を延ばすことができる。従って、本発明に係るＲＮＡｉを誘導する核酸分子は、従来のｓｉＲＮＡ分子の代わりに、ｓｉＲＮＡを利用した癌やウイルス感染治療等に活用できて有用である。
以上、本発明の内容の特定の部分を詳述したが、当業界における通常の知識を持った者にとって、このような具体的な記述は単なる好適な実施態様に過ぎず、これにより本発明の範囲が制限されることはないという点は明らかである。よって、本発明の実質的な範囲は特許請求の範囲とこれらの等価物により定義されると言える。
Claims (28)
- 第１鎖と第２鎖を含む、ＲＮＡｉを誘導する核酸分子であって、
前記第１鎖が２４〜１２１ｎｔの長さであり、そして標的核酸と相補的な一部領域、５'末端の０乃至３ｎｔの突出部、及び直接又はリンカーによって標的核酸と相補的に結合する前記一部領域に連結し前記の標的核酸に相補的な１５乃至１００ｎｔの３'末端の一本鎖領域を含み、そして
前記第２鎖が１３〜２１ｎｔの長さであり、そして標的核酸と相補的な第１鎖の前記一部領域と相補的結合を形成する領域を持つ、
前記核酸分子。 - 前記第１鎖は、５'末端に１乃至３ｎｔの突出部を持つことを特徴とする請求項１に記載のＲＮＡｉを誘導する核酸分子。
- 前記第１鎖の５'末端が平滑末端であることを特徴とする請求項１に記載のＲＮＡｉを誘導する核酸分子。
- 前記第１鎖と相補的な第２鎖の長さは、１３〜１６ｎｔであることを特徴とする請求項３に記載のＲＮＡｉを誘導する核酸分子。
- 前記第１鎖の標的核酸と相補的な一部領域の長さは、１９〜２１ｎｔであることを特徴とする請求項１に記載のＲＮＡｉを誘導する核酸分子。
- 前記標的核酸は、ｍＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、コードＤＮＡ配列及び非コードＤＮＡ配列のいずれか一つであることを特徴とする請求項１に記載のＲＮＡｉを誘導する核酸分子。
- 前記第１鎖の第２鎖と相補的結合を形成しない一本鎖領域は、リンカーによって前記第２鎖と相補的結合を形成する領域に連結されることを特徴とする請求項１に記載のＲＮＡｉを誘導する核酸分子。
- 前記リンカーは、化学的リンカーであることを特徴とする請求項７に記載のＲＮＡｉを誘導する核酸分子。
- 前記化学的リンカーは、核酸、ＰＮＡ、ペプチド、ジスルフィド結合または、ポリエチレングリコールであることを特徴とする請求項８に記載のＲＮＡｉを誘導する核酸分子。
- 前記第１鎖の一本鎖領域が、アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム及びＤＮＡザイムで構成された群から選択される核酸オリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項１に記載のＲＮＡｉを誘導する核酸分子。
- 前記核酸分子は、化学的変形を含むことを特徴とする請求項１に記載のＲＮＡｉを誘導する核酸分子。
- 前記化学的変形は、前記核酸分子に含まれる少なくとも１種のヌクレオチドのリボースの２'位置のヒドロキシル基が、水素原子、フッ素原子、−Ｏ−アルキル基、−Ｏ−アシル基、及びアミノ基のいずれか一つに置き換えられることによって得られる請求項１１に記載のＲＮＡｉを誘導する核酸分子。
- 前記化学的変形は、前記核酸分子に含まれる少なくとも１種のヌクレオチドのホスフェートバックボーンがホスホロチオエート型（phosphorothioate form）、ホスホロジチオエート型（phosphorodithioate form）、アルキルホスホネート型（alkylphosphonate form）、ホスホラミデート型（phosphoramidate form）及びボラノホスフェート型（boranophosphate form）のいずれか一つに置き換えられることによって得られる請求項１１に記載のＲＮＡｉを誘導する核酸分子。
- 前記化学的変形は、前記核酸分子に含まれる少なくとも１種のヌクレオチドがＬＮＡ（locked nucleic acid）、ＵＮＡ（unlocked nucleic acid）、モルホリノ（Morpholino）及びＰＮＡ（peptide nucleic acid）のいずれか一つに置き換えられることによって得られる請求項１１に記載のＲＮＡｉを誘導する核酸分子。
- 前記化学的変形は、前記核酸分子が、脂質、細胞透過性ペプチド及び細胞標的リガンドからなる群から選択される一つ以上と結合することによって得られる請求項１１に記載のＲＮＡｉを誘導する核酸分子。
- 前記第１鎖で前記一本鎖領域を構成する塩基の少なくとも一つ以上が巨大（bulky）塩基類似体（base analog）を含むことを特徴とする請求項１に記載のＲＮＡｉを誘導する核酸分子。
- 請求項１〜１６のいずれか一項に記載のＲＮＡｉを誘導する核酸分子に細胞伝達体が結合している核酸複合体。
- 前記細胞伝達体はカチオン性ポリマー、脂質、細胞透過性ペプチド及び細胞標的リガンドからなる群から選択されることを特徴とする請求項１７に記載の核酸複合体。
- 請求項１７に記載の核酸複合体をインビトロの細胞内に導入させることを特徴とするＲＮＡｉを誘導する核酸分子の細胞内伝達方法。
- 請求項１〜１６のいずれか一項に記載のＲＮＡｉを誘導する核酸分子を含有する遺伝子発現抑制用組成物。
- 前記核酸分子に細胞伝達体をさらに結合させたことを特徴とする請求項２０に記載の遺伝子発現抑制用組成物。
- 請求項１〜１６のいずれか一項に記載のＲＮＡｉを誘導する核酸分子をインビトロの細胞内に導入させる工程を含む細胞内標的遺伝子の発現抑制方法。
- 前記核酸分子に細胞伝達体を追加的に結合させたことを特徴とする請求項２２に記載の細胞内標的遺伝子の発現抑制方法。
- 請求項１〜１６のいずれか一項に記載のＲＮＡｉを誘導する核酸分子をインビトロの細胞内で発現させる工程を含む細胞内標的遺伝子の発現抑制方法。
- 請求項１〜１６のいずれか一項に記載の構造を持つＲＮＡｉを誘導する核酸分子を含有する抗癌組成物。
- 前記核酸分子に細胞伝達体を追加的に結合させたことを特徴とする請求項２５に記載の抗癌組成物。
- 前記核酸分子は、腫瘍関連遺伝子を標的遺伝子とすることを特徴とする請求項２５に記載の抗癌組成物。
- 前記腫瘍関連遺伝子は、ＫＲａｓ、Ｗｎｔ−１、Ｈｅｃ１、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ、Ｌｉｖｉｎ、Ｂｃｌ−２、ＸＩＡＰ、Ｍｄｍ２、ＥＧＦ、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ、Ｍｃｌ−１、ＩＧＦ１Ｒ、Ａｋｔ１、Ｇｒｐ７８、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ５ａ、β−ｃａｔｅｎｉｎ、ＷＩＳＰ１及びｃ−ｍｙｃのいずれか一つであることを特徴とする請求項２７に記載の抗癌組成物。
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