JP2022528487A - Ｃ９ｏｒｆ７２のオリゴヌクレオチドベースの調節 - Google Patents

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Abstract

Figure 2022528487000001
本開示は、新規のC9ORF72標的配列に関する。神経変性疾患を処置するための新規のオリゴヌクレオチドも提供される。

Description

(関連出願の相互参照)
本出願は、2019年3月29日出願の米国仮特許出願62/826,589、2019年7月21日出願の米国仮特許出願62/864,789および2019年10月4日出願の米国仮特許出願62/910,842の優先権を主張し、これらの各々の全内容は引用により本明細書に包含される。
(連邦政府支援の研究または開発に関する声明)
本出願は、米国国立衛生研究所(National Institutes of health)によって認められた許可No.NS104022、HD086111、OD020012、およびGM108803の下の政府支援を受けて行われたものである。政府は本発明について一定の権利を有している。
(本出願の分野)
本開示は、新規のC9orf72標的配列、新規のオリゴヌクレオチド、および筋萎縮性側索硬化症および前頭側頭骨性認知症などの疾患における神経変性を処置および予防する新規の方法に関する。
筋萎縮性側索硬化症(ALS)は、脳および脊髄の両方の運動神経に影響を及ぼし、その結果として疾患の後期には随意筋の麻痺をもたらす、進行の早い致死的な神経変性疾患である。ALSは10万人あたり約6人に影響を及ぼし、一般的には、症状の発症後3～5年以内に死亡するが、治療法はまだない。米国食品医薬品局(FDA)は、1995年にALSの治療にリルゾールを承認した。しかし、リルゾールは、臨床状態を改善することも、疾患の進行を止めることもなく、散発性または遺伝性(家族性)形態の疾患の患者の人工呼吸器離脱(ventilation-free)生存を2～3ヶ月延長する。最近では、FDAはエダラボンによる処置を承認した。残念ながら、エダラボンは大多数のALS患者に治療効果がなく、疾患の進行を遅らせることを経験したのは特定の一部分の患者だけであった。このように、明らかにアンメット・メディカル・ニーズを満たす治療薬を開発することは、ALS患者の生存だけでなく、クオリティ・オブ・ライフを変えるための鍵となる。
SOD1およびC9orf72の変異は、ALSの遺伝性症例(家族性ALS、fALS)の大部分を占めており、異なるメカニズムで上部および下部の運動神経の死を引き起こす。SOD1は歴史的な標的として確立されているが、この遺伝子における突然変異は、疾患の症例の10％未満しか占めていないと推定されている。一方、最近同定されたC9は、fALS患者の40％以上、および前頭側頭型認知症(FTD)患者に関連している。C9遺伝子のイントロン1内のG4C2ヘキサヌクレオチドの拡張は、核および細胞質のRNA病巣を形成するだけでなく、細胞質内に毒性の反復関連非ATG(RAN)ジペプチドを生じさせる。変異型C9ヘキサヌクレオチドの発現は、センス方向およびアンチセンス方向の両方で発生し、すべてのC9 mRNA転写産物バリアントに含まれているわけではない。したがって、C9は、治療用遺伝子サイレンシング技術によって潜在的に調節できる有望で明確な遺伝子標的として浮上している。
単性疾患は、オリゴヌクレオチド治療的介入、例えば、RNA干渉(RNAi)の理想的な標的である。RNAiは、短い二本鎖RNA断片が関与する基本的なメカニズムであり、必要に応じて細胞メカニズムを再プログラム化する、サイレンシングし、標的mRNAを分解するのに使用できる。この技術は臨床的にも優れており、ヒト機能遺伝学の分野に革命を起こした。mRNAのノックダウンについて、治療薬および機能研究のツールの両方として、短いヘアピンRNA(shRNA)、アンチセンスオリゴヌクレオチド(ASO)、およびネイキッドまたはわずかに修飾されたsiRNAのウイルスベースの送達を含むさまざまな技術が検討されてきた。
未修飾siRNA(「ネイキッドsiRNA」)は、これまでは、より高い感受性細胞株やインビボでの組織への送達が困難であった。リポフェクタミンのようなトランスフェクション試薬を使用することもできるが、有効で毒性のない範囲は非常に狭く、異なるバッチのニューロンに対して独立して最適化し、同等のレベルのサイレンシングに必要なsiRNAと脂質の比率を決定しなければならない。(Bell, H., Kimber, W. L., Li, M. & Whittle, I. R. Liposomal transfection efficiency and toxicity on glioma cell lines: in vitro and in vivo studies. NeuroReport 9, 793-798 (1998); Dass, C. R. Cytotoxicity issues pertinent to lipoplex-mediated gene therapy in-vivo. Journal of Pharmacy and Pharmacology 1-9 (2010); Masotti, A. et al. Comparison of different commercially available cationic liposome-DNA lipoplexes: Parameters influencing toxicity and transfection efficiency. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces 68, 136-144 (2009); Zou, L. L. et al. Liposome-mediated NGF gene transfection following neuronal injury: potential therapeutic applications. Gene Ther 6, 994-1005 (1999)).
疎水性修飾siRNAは、細胞や脳への送達の代替手段としても用いられており(Sah, Supra; Soutschek, J. et al. Therapeutic silencing of an endogenous gene by systemic administration of modified siRNAs. Nature 432, 173-178 (2004); Cheng, K., Ye, Z., Guntaka, R. V. & Mahato, R. I. Enhanced hepatic uptake and bioactivity of type alpha1(I) collagen gene promoter-specific triplex-forming oligonucleotides after conjugation with cholesterol. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics 317, 797-805 (2006); Byrne, M. et al. Novel Hydrophobically Modified Asymmetric RNAi Compounds (sd-rxRNA) Demonstrate Robust Efficacy in the Eye. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics 29, 855-864 (2013))、これらの化合物のいくつかは臨床応用されている。
一態様において、本開示は、第一の標的配列5' AAGAAAAGACCUGAUAAAGAUUAACCAGAAGAAAACAAGGAGGGA 3'、または5' AAGAAAAGACCUGAUAAAGAUUAACCAGAAGAAAACAAGGAGGGA 3'における10～30個の連続するヌクレオチドの長さを有するその一部、例えば、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30個の連続するヌクレオチドの長さを有するその一部(例えば、15～25個の連続するヌクレオチドの長さを有するその一部、例えば、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、または25個の連続するヌクレオチドの長さを有するその一部)と実質的に相補的な相補性領域を含むRNA分子(例えば、8～80ヌクレオチド長、例えば、15～35塩基長である)を提供する。
いくつかの実施態様において、RNA分子は、8ヌクレオチド～80ヌクレオチド長(例えば、8ヌクレオチド長、9ヌクレオチド長、10ヌクレオチド長、11ヌクレオチド長、12ヌクレオチド長、13ヌクレオチド長、14ヌクレオチド長、15ヌクレオチド長、16ヌクレオチド長、17ヌクレオチド長、18ヌクレオチド長、19ヌクレオチド長、20ヌクレオチド長、21ヌクレオチド長、22ヌクレオチド長、23ヌクレオチド長、24ヌクレオチド長、25ヌクレオチド長、26ヌクレオチド長、27ヌクレオチド長、28ヌクレオチド長、29ヌクレオチド長、30ヌクレオチド長、31ヌクレオチド長、32ヌクレオチド長、33ヌクレオチド長、34ヌクレオチド長、35ヌクレオチド長、36ヌクレオチド長、37ヌクレオチド長、38ヌクレオチド長、39ヌクレオチド長、40ヌクレオチド長、41ヌクレオチド長、42ヌクレオチド長、43ヌクレオチド長、44ヌクレオチド長、45ヌクレオチド長、46ヌクレオチド長、47ヌクレオチド長、48ヌクレオチド長、49ヌクレオチド長、50ヌクレオチド長、51ヌクレオチド長、52ヌクレオチド長、53ヌクレオチド長、54ヌクレオチド長、55ヌクレオチド長、56ヌクレオチド長、57ヌクレオチド長、58ヌクレオチド長、59ヌクレオチド長、60ヌクレオチド長、61ヌクレオチド長、62ヌクレオチド長、63ヌクレオチド長、64ヌクレオチド長、65ヌクレオチド長、66ヌクレオチド長、67ヌクレオチド長、68ヌクレオチド長、69ヌクレオチド長、70ヌクレオチド長、71ヌクレオチド長、72ヌクレオチド長、73ヌクレオチド長、74ヌクレオチド長、75ヌクレオチド長、76ヌクレオチド長、77ヌクレオチド長、78ヌクレオチド長、79ヌクレオチド長、または80ヌクレオチド長)である。
いくつかの実施態様において、RNA分子は、10～50ヌクレオチド長(例えば、10ヌクレオチド長、11ヌクレオチド長、12ヌクレオチド長、13ヌクレオチド長、14ヌクレオチド長、15ヌクレオチド長、16ヌクレオチド長、17ヌクレオチド長、18ヌクレオチド長、19ヌクレオチド長、20ヌクレオチド長、21ヌクレオチド長、22ヌクレオチド長、23ヌクレオチド長、24ヌクレオチド長、25ヌクレオチド長、26ヌクレオチド長、27ヌクレオチド長、28ヌクレオチド長、29ヌクレオチド長、30ヌクレオチド長、31ヌクレオチド長、32ヌクレオチド長、33ヌクレオチド長、34ヌクレオチド長、35ヌクレオチド長、36ヌクレオチド長、37ヌクレオチド長、38ヌクレオチド長、39ヌクレオチド長、40ヌクレオチド長、41ヌクレオチド長、42ヌクレオチド長、43ヌクレオチド長、44ヌクレオチド長、45ヌクレオチド長、46ヌクレオチド長、47ヌクレオチド長、48ヌクレオチド長、49ヌクレオチド長、または50ヌクレオチド長)である。
いくつかの実施態様において、RNA分子は、15～25塩基長である。
いくつかの実施態様において、RNA分子は、15～25ヌクレオチド長(例えば、15ヌクレオチド長、16ヌクレオチド長、17ヌクレオチド長、18ヌクレオチド長、19ヌクレオチド長、20ヌクレオチド長、21ヌクレオチド長、22ヌクレオチド長、23ヌクレオチド長、24ヌクレオチド長、または25ヌクレオチド長)である。
[014] いくつかの実施態様において、RNA分子は、AUAAAGAUUAACCAGAAGAAと実質的に相補的な相補性領域を含む。
いくつかの実施態様において、RNA分子は、一本鎖(ss)RNAまたは二本鎖(ds)RNAである。
いくつかの実施態様において、dsRNAは、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、ここで、アンチセンス鎖は5' AAGAAAAGACCUGAUAAAGAUUAACCAGAAGAAAACAAGGAGGGA 3'と実質的に相補的な相補性領域を含む。
いくつかの実施態様において、相補性領域は、5' AAGAAAAGACCUGAUAAAGAUUAACCAGAAGAAAACAAGGAGGGA 3'の少なくとも10、11、12または13個の連続するヌクレオチドと相補的である。いくつかの実施態様において、相補性領域は、5' AAGAAAAGACCUGAUAAAGAUUAACCAGAAGAAAACAAGGAGGGA 3'の10～35個の連続するヌクレオチドと相補的である。いくつかの実施態様において、相補性領域は、5' AAGAAAAGACCUGAUAAAGAUUAACCAGAAGAAAACAAGGAGGGA 3'の11～35個の連続するヌクレオチドと相補的である。いくつかの実施態様において、相補性領域は、5' AAGAAAAGACCUGAUAAAGAUUAACCAGAAGAAAACAAGGAGGGA 3'の12～35個の連続するヌクレオチドと相補的である。いくつかの実施態様において、相補性領域は、5' AAGAAAAGACCUGAUAAAGAUUAACCAGAAGAAAACAAGGAGGGA 3'の13～35個の連続するヌクレオチドと相補的である。いくつかの実施態様において、相補性領域は、5' AAGAAAAGACCUGAUAAAGAUUAACCAGAAGAAAACAAGGAGGGA 3'の14～35個の連続するヌクレオチドと相補的である。いくつかの実施態様において、相補性領域は、5' AAGAAAAGACCUGAUAAAGAUUAACCAGAAGAAAACAAGGAGGGA 3'の15～35個の連続するヌクレオチドと相補的である。いくつかの実施態様において、相補性領域は、5' AAGAAAAGACCUGAUAAAGAUUAACCAGAAGAAAACAAGGAGGGA 3'の16～35個の連続するヌクレオチドと相補的である。いくつかの実施態様において、相補性領域は、5' AAGAAAAGACCUGAUAAAGAUUAACCAGAAGAAAACAAGGAGGGA 3'の17～35個の連続するヌクレオチドと相補的である。いくつかの実施態様において、相補性領域は、5' AAGAAAAGACCUGAUAAAGAUUAACCAGAAGAAAACAAGGAGGGA 3'の18～35個の連続するヌクレオチドと相補的である。いくつかの実施態様において、相補性領域は、5' AAGAAAAGACCUGAUAAAGAUUAACCAGAAGAAAACAAGGAGGGA 3'の19～35個の連続するヌクレオチドと相補的である。いくつかの実施態様において、相補性領域は、5' AAGAAAAGACCUGAUAAAGAUUAACCAGAAGAAAACAAGGAGGGA 3'の20～35個の連続するヌクレオチドと相補的である。いくつかの実施態様において、相補性領域は、5' AAGAAAAGACCUGAUAAAGAUUAACCAGAAGAAAACAAGGAGGGA 3'の21～35個の連続するヌクレオチドと相補的である。いくつかの実施態様において、相補性領域は、5' AAGAAAAGACCUGAUAAAGAUUAACCAGAAGAAAACAAGGAGGGA 3'の22～35個の連続するヌクレオチドと相補的である。いくつかの実施態様において、相補性領域は、5' AAGAAAAGACCUGAUAAAGAUUAACCAGAAGAAAACAAGGAGGGA 3'の23～35個の連続するヌクレオチドと相補的である。いくつかの実施態様において、相補性領域は、5' AAGAAAAGACCUGAUAAAGAUUAACCAGAAGAAAACAAGGAGGGA 3'の24～35個の連続するヌクレオチドと相補的である。いくつかの実施態様において、相補性領域は、5' AAGAAAAGACCUGAUAAAGAUUAACCAGAAGAAAACAAGGAGGGA 3'の25～35個の連続するヌクレオチドと相補的である。
いくつかの実施態様において、相補性領域は、5' AAGAAAAGACCUGAUAAAGAUUAACCAGAAGAAAACAAGGAGGGA 3'とのミスマッチを3個以下で含む。
いくつかの実施態様において、相補性領域は、5' AAGAAAAGACCUGAUAAAGAUUAACCAGAAGAAAACAAGGAGGGA 3'と完全に相補的である。
いくつかの実施態様において、dsRNAは平滑末端である。いくつかの実施態様において、dsRNAは、少なくとも1つの一本鎖ヌクレオチド突出部を含む。
いくつかの実施態様において、dsRNAは、天然に存在するヌクレオチドを含む。
いくつかの実施態様において、dsRNAは、少なくとも1つの修飾ヌクレオチドを含む。
いくつかの実施態様において、修飾ヌクレオチドは、2'-O-メチル修飾ヌクレオチド、5'-ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、およびコレステリル誘導体もしくはドデカン酸ビスデシルアミド基に結合された末端ヌクレオチドからなる群から選択される。
いくつかの実施態様において、修飾ヌクレオチドは、2'-デオキシ-2'-フルオロ修飾ヌクレオチド、2'-デオキシ-修飾ヌクレオチド、ロックされたヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、2'-アミノ-修飾ヌクレオチド、2'-アルキル-修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホルアミデート(phosphoramidate)および非天然塩基を含むヌクレオチドからなる群から選択される。
いくつかの実施態様において、dsRNAは、2'-O-メチル修飾ヌクレオチドを少なくとも1つ、および5'ホスホロチオエート基を含むヌクレオチドを少なくとも1つ含む。
いくつかの実施態様において、dsRNAは、少なくとも80％が化学的に修飾されている。
いくつかの実施態様において、dsRNAは、完全に化学的に修飾されている。
いくつかの実施態様において、dsRNAは、コレステロール部分を含む。
いくつかの実施態様において、RNA分子は、5'末端および3'末端を含み、標的に対して相補性を有し、ここで、(1)RNA分子は、2'-メトキシ-リボヌクレオチドおよび2'-フルオロ-リボヌクレオチドを交互に含み;(2)5'末端から2位および14位のヌクレオチドは、2'-メトキシ-リボヌクレオチドではなく;(3)ヌクレオチドは、ホスホジエステルまたはホスホロチオエート結合を介して結合され;そして、(4)3'末端から1～2位～1～7位のヌクレオチドは、ホスホロチオエート結合を介して隣接するヌクレオチドに結合されている。
いくつかの実施態様において、dsRNAは、5'末端および3'末端を有し、標的に対して相補性を有し、そして第一のオリゴヌクレオチドおよび第二のオリゴヌクレオチドを含み、ここで、(1)第一のオリゴヌクレオチドは、5' AAGAAAAGACCUGAUAAAGAUUAACCAGAAGAAAACAAGGAGGGA 3'と実質的に相補的な配列を含み;(2)第一のオリゴヌクレオチドの一部は、第二のオリゴヌクレオチドの一部と相補的であり;(3)第二のオリゴヌクレオチドは、2'-メトキシ-リボヌクレオチドおよび2'-フルオロ-リボヌクレオチドを交互に含み;(4)第二のオリゴヌクレオチドの3'末端から2位および14位のヌクレオチドは、2'-メトキシ-リボヌクレオチドであり;そして、(5)第二のオリゴヌクレオチドのヌクレオチドは、ホスホジエステルまたはホスホロチオエート結合を介して結合されている。
いくつかの実施態様において、RNA分子は、5'末端および3'末端を含み、標的に対して相補性を有し、ここで、(1)RNA分子は、3つの連続する2'-フルオロ-リボヌクレオチドの領域を含み;(2)5'末端から2位および14位のヌクレオチドは、2'-メトキシ-リボヌクレオチドではなく;(3)ヌクレオチドは、ホスホジエステルまたはホスホロチオエート結合を介して結合され;(4)3'末端から1～2位から1～7位のヌクレオチドは、ホスホロチオエート結合を介して隣接するヌクレオチドに結合され;そして、(5)5'末端から1～2位のヌクレオチドは、ホスホロチオエート結合を介して互いに結合されている。
いくつかの実施態様において、dsRNAは、5'末端および3'末端を有し、標的に対して相補性を有し、そして第一のオリゴヌクレオチドおよび第二のオリゴヌクレオチドを含み、ここで、(1)第一のオリゴヌクレオチドは、5' AAGAAAAGACCUGAUAAAGAUUAACCAGAAGAAAACAAGGAGGGA 3'と実質的に相補的な配列を含み;(2)第一のオリゴヌクレオチドの一部は、第二のオリゴヌクレオチドの一部と相補的であり;(3)第二のオリゴヌクレオチドは、3つの連続する2'-メトキシ-リボヌクレオチドの領域を含み;(4)第二のオリゴヌクレオチドの3'末端から2位および14位のヌクレオチドは、2'-メトキシ-リボヌクレオチドであり;そして、(5)第二のオリゴヌクレオチドのヌクレオチドは、ホスホジエステルまたはホスホロチオエート結合を介して結合されている。
いくつかの実施態様において、第一のオリゴヌクレオチドは、20ヌクレオチド長であり、第二のオリゴヌクレオチドは、15ヌクレオチド長または16ヌクレオチド長である。
いくつかの実施態様において、第一のオリゴヌクレオチドは、21ヌクレオチド長であり、第二のオリゴヌクレオチドは、15ヌクレオチド長または16ヌクレオチド長である。
いくつかの実施態様において、第一のオリゴヌクレオチドは、20ヌクレオチド長または21ヌクレオチド長であり、第二のオリゴヌクレオチドは、15ヌクレオチド長である。
いくつかの実施態様において、第一のオリゴヌクレオチドは、20ヌクレオチド長または21ヌクレオチド長であり、第二のオリゴヌクレオチドは、16ヌクレオチド長である。
いくつかの実施態様において、第一のオリゴヌクレオチドは、20ヌクレオチド長であり、第二のオリゴヌクレオチドは、15ヌクレオチド長である。
いくつかの実施態様において、第一のオリゴヌクレオチドは、21ヌクレオチド長であり、第二のオリゴヌクレオチドは、16ヌクレオチド長である。
いくつかの実施態様において、dsRNAは、少なくとも80％の化学修飾ヌクレオチド(例えば、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％の化学修飾ヌクレオチド)を含む。いくつかの実施態様において、dsRNAは、完全に化学的に修飾されている。
いくつかの実施態様において、dsRNAは、少なくとも70％の2'-O-メチルヌクレオチド修飾(例えば、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％の2'-O-メチル修飾)を含む。
いくつかの実施態様において、dsRNAは、約80％～約90％の2'-O-メチルヌクレオチド修飾(例えば、約80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、または90％の2'-O-メチルヌクレオチド修飾)を含む。いくつかの実施態様において、dsRNAは、約83％～約86％の2'-O-メチル修飾(例えば、約83％、84％、85％、または86％の2'-O-メチル修飾)を含む。
いくつかの実施態様において、dsRNAは、約70％～約80％の2'-O-メチルヌクレオチド修飾(例えば、約70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、または80％の2'-O-メチルヌクレオチド修飾)を含む。いくつかの実施態様において、dsRNAは、約75％～約78％の2'-O-メチル修飾(例えば、約75％、76％、77％、または78％の2'-O-メチル修飾)を含む。
いくつかの実施態様において、第一のオリゴヌクレオチドは、少なくとも80％の化学修飾ヌクレオチド(例えば、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％の化学修飾ヌクレオチド)を含む。いくつかの実施態様において、第一のオリゴヌクレオチドは、完全に化学的に修飾されている。
いくつかの実施態様において、第一のオリゴヌクレオチドは、少なくとも70％の2'-O-メチルヌクレオチド修飾(例えば、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％の2'-O-メチル修飾)を含む。
いくつかの実施態様において、第一のオリゴヌクレオチドは、約70％～90％の2'-O-メチルヌクレオチド修飾(例えば、約70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、または90％の2'-O-メチル修飾)を含む。いくつかの実施態様において、第一のオリゴヌクレオチドは、約85％～約90％の2'-O-メチル修飾(例えば、約85％、86％、87％、88％、89％、または90％の2'-O-メチル修飾)を含む。
いくつかの実施態様において、第一のオリゴヌクレオチドは、約75％～85％の2'-O-メチルヌクレオチド修飾(例えば、約75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、または85％の2'-O-メチル修飾)を含む。いくつかの実施態様において、第一のオリゴヌクレオチドは、約76％～約80％の2'-O-メチル修飾(例えば、約76％、77％、78％、79％、または80％の2'-O-メチル修飾)を含む。
いくつかの実施態様において、第二のオリゴヌクレオチドは、少なくとも80％の化学修飾ヌクレオチド(例えば、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％の化学修飾ヌクレオチド)を含む。いくつかの実施態様において、第二のオリゴヌクレオチドは、完全に化学的に修飾されている。
いくつかの実施態様において、第二のオリゴヌクレオチドは、少なくとも65％の2'-O-メチルヌクレオチド修飾(例えば、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％の2'-O-メチル修飾)を含む。いくつかの実施態様において、第二のオリゴヌクレオチドは、100％の2'-O-メチルヌクレオチド修飾を含む。
いくつかの実施態様において、第二のオリゴヌクレオチドは、約70％～約85％の2'-O-メチルヌクレオチド修飾(例えば、約70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、または85％の2'-O-メチルヌクレオチド修飾)を含む。いくつかの実施態様において、第二のオリゴヌクレオチドは、約75％～約80％の2'-O-メチルヌクレオチド修飾(例えば、約75％、76％、77％、78％、79％、または80％の2'-O-メチルヌクレオチド修飾)を含む。
いくつかの実施態様において、第二のオリゴヌクレオチドは、約65％～約75％の2'-O-メチルヌクレオチド修飾(例えば、約65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、または75％の2'-O-メチルヌクレオチド修飾)を含む。いくつかの実施態様において、第二のオリゴヌクレオチドは、約67％～約73％の2'-O-メチルヌクレオチド修飾(例えば、約67％、68％、69％、70％、71％、72％、または73％の2'-O-メチルヌクレオチド修飾)を含む。
いくつかの実施態様において、第二のオリゴヌクレオチドは、その3'末端に疎水性分子が結合されている。
いくつかの実施態様において、第二のオリゴヌクレオチドは、その3'末端に親水性分子が結合されている。親水性部分の代表的な例は、アプタマー、炭水化物、およびヒドロ可溶性ビタミンを含む。
いくつかの実施態様において、第二のオリゴヌクレオチドおよび疎水性分子の間の結合は、ポリエチレングリコールまたはトリエチレングリコールを含む。
いくつかの実施態様において、第二のオリゴヌクレオチドの3'末端から1位および2位のヌクレオチドは、ホスホロチオエート結合を介して隣接するヌクレオチドに結合されている。
いくつかの実施態様において、第二のオリゴヌクレオチドの3'末端から1位および2位のヌクレオチド、および第二のオリゴヌクレオチドの5'末端から1位および2位のヌクレオチドは、ホスホロチオエート結合を介して隣接するリボヌクレオチドに結合されている。
一態様において、本開示は、本明細書に記載のdsRNAおよび薬学的に許容できる担体を含む、生物においてC9ORF72遺伝子の発現を阻害するための医薬組成物を提供する。
いくつかの実施態様において、dsRNAは、該C9ORF72遺伝子の発現を少なくとも50％阻害する。
いくつかの実施態様において、dsRNAは、該C9ORF72遺伝子の発現を少なくとも90％阻害する。
一態様において、細胞内でのC9ORF72遺伝子の発現を阻害する方法であって、
(a)本明細書に記載の二本鎖リボ核酸(dsRNA)を細胞中に導入すること
(b)工程(a)で作製された細胞を、C9ORF72遺伝子のmRNA転写産物の分解を得るのに十分な時間維持することを含み、それによって細胞内でのC9ORF72遺伝子の発現を阻害する方法を提供する。
一態様において、本開示は、神経変性疾患を処置または管理する方法であって、そのような処置または管理を必要とする患者に、上記の該dsRNAの治療有効量を投与することを含む方法を提供する。
いくつかの実施態様において、dsRNAは、患者の脳に投与される。
いくつかの実施態様において、dsRNAは、脳室内(ICV)または髄腔内(IT)注射によって投与される。
いくつかの実施態様において、dsRNAの投与により、脳におけるC9ORF72遺伝子mRNAの低減を引き起こす。
いくつかの実施態様において、dsRNAの投与により、脊髄においてC9ORF72遺伝子mRNAの低減を引き起こす。
いくつかの実施態様において、dsRNAは、該C9ORF72遺伝子の発現を少なくとも50％阻害する。
いくつかの実施態様において、dsRNAは、該C9ORF72遺伝子の発現を少なくとも90％阻害する。
一態様において、本開示は、細胞内でのC9ORF72遺伝子の発現を阻害するためのベクターであって、5' AAGAAAAGACCUGAUAAAGAUUAACCAGAAGAAAACAAGGAGGGA 3'と実質的に相補的なRNA分子をコードするヌクレオチド配列に操作可能に結合された調節配列を含み、ここで、該RNA分子は10～35塩基長であり、該RNA分子は、該C9ORF72遺伝子を発現する細胞と接触すると、該C9ORF72遺伝子の発現を少なくとも50％阻害するベクターを提供する。
いくつかの実施態様において、RNA分子は、該C9ORF72遺伝子の発現を少なくとも90％阻害する。
いくつかの実施態様において、RNA分子は、ssRNAまたはdsRNAである。
いくつかの実施態様において、dsRNAは、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、ここで、アンチセンス鎖は5' AAGAAAAGACCUGAUAAAGAUUAACCAGAAGAAAACAAGGAGGGA 3'と実質的に相補的な相補性領域を含む。
一態様において、本開示は、上記のベクターを含む細胞を提供する。
一態様において、本開示は、5' AAGAAAAGACCUGAUAAAGAUUAACCAGAAGAAAACAAGGAGGGA 3'と実質的に相補的な相補性領域を含む、15～35塩基長のRNA分子であって、C9ORF72遺伝子mRNAのイントロンを標的とする、該RNA分子を提供する。
いくつかの実施態様において、RNA分子は、ssRNAまたはdsRNAである。
いくつかの実施態様において、dsRNAは、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、ここで、アンチセンス鎖は5' AAGAAAAGACCUGAUAAAGAUUAACCAGAAGAAAACAAGGAGGGA 3'と実質的に相補的な相補性領域を含む。
一態様において、C9ORF72 mRNAと実質的に相補的な相補性領域を含む、15～35塩基長の2つのRNA分子を含むジ分岐状RNA化合物であって、該2つのRNA分子は、リンカー、スペーサーおよび分岐点から独立して選択される1つまたはそれ以上の部分によって互いに結合されているジ分岐RNA化合物を提供する。
いくつかの実施態様において、RNA分子は、5' AAGAAAAGACCUGAUAAAGAUUAACCAGAAGAAAACAAGGAGGGA 3'と実質的に相補的な相補性領域を含む。
いくつかの実施態様において、RNA分子は、AUAAAGAUUAACCAGAAGAAと実質的に相補的な相補性領域を含む。
いくつかの実施態様において、RNA分子は、ssRNAまたはdsRNAである。
いくつかの実施態様において、RNA分子は、アンチセンス分子またはギャップマー分子である。
いくつかの実施態様において、アンチセンス分子は、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。
いくつかの実施態様において、アンチセンス分子は、相補性領域の分解を向上させる。
いくつかの実施態様において、分解は、ヌクレアーゼ分解である。
いくつかの実施態様において、ヌクレアーゼ分解は、RNase Hによって媒介される。
一態様において、本開示は、15～35塩基長であるRNA分子であって、表1、表2、表3、表4、または表5に記載のC9ORF72遺伝子における遺伝子領域と実質的に相補的な相補性領域を含むRNA分子を提供する。
いくつかの実施態様において、RNA分子は、一本鎖(ss)RNAまたは二本鎖(ds)RNAである。
一態様において、本開示は、2つまたはそれ以上の核酸を含む分岐状オリゴヌクレオチド化合物であって、各核酸は、独立して、15～35塩基長であり、各核酸は、独立して、5' AAGAAAAGACCUGAUAAAGAUUAACCAGAAGAAAACAAGGAGGGA 3'と実質的に相補的な相補性領域を含み、該2つまたはそれ以上の核酸は、リンカー、スペーサーおよび分岐点から選択される1つまたはそれ以上の部分によって結合されている分岐状オリゴヌクレオチド化合物を提供する。
いくつかの実施態様において、各核酸は、独立して、15～25塩基長である。
いくつかの実施態様において、少なくとも1つの相補性領域は、5' AUAAAGAUUAACCAGAAGAA 3'と実質的に相補的である。
いくつかの実施態様において、核酸は二本鎖(ds)RNAであり、各核酸はセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、各アンチセンス鎖は、5' AAGAAAAGACCUGAUAAAGAUUAACCAGAAGAAAACAAGGAGGGA 3'と実質的に相補的な相補性領域を含む。
いくつかの実施態様において、各相補性領域は、5' AAGAAAAGACCUGAUAAAGAUUAACCAGAAGAAAACAAGGAGGGA 3'の少なくとも10、11、12または13個の連続するヌクレオチドと相補的である。
いくつかの実施態様において、各相補性領域は、5' AAGAAAAGACCUGAUAAAGAUUAACCAGAAGAAAACAAGGAGGGA 3'とのミスマッチを3個以下で含む。
いくつかの実施態様において、各相補性領域は、5' AAGAAAAGACCUGAUAAAGAUUAACCAGAAGAAAACAAGGAGGGA 3'と完全に相補的である。
いくつかの実施態様において、少なくとも1つの核酸のdsRNAは、少なくとも1つの修飾ヌクレオチドを含む。修飾ヌクレオチドは、2'-O-メチル修飾ヌクレオチド、5'-ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、2'-デオキシ-2'-フルオロ修飾ヌクレオチド、2'-デオキシ修飾ヌクレオチド、ロックされたヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、2'-アミノ-修飾ヌクレオチド、2'-アルキル-修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホルアミデート、非天然塩基を含むヌクレオチド、およびコレステリル誘導体もしくはドデカン酸ビスデシルアミド基に結合された末端ヌクレオチドからなる群から選択される。
いくつかの実施態様において、少なくとも1つの核酸のdsRNAは、少なくとも80％が化学的に修飾されている。
いくつかの実施態様において、少なくとも1つの核酸のdsRNAは、完全に化学的に修飾されている。
いくつかの実施態様において、各核酸は、5'末端および3'末端を含み、標的に対して相補性を有し、ここで、(1)核酸は、2'-メトキシ-リボヌクレオチドおよび2'-フルオロ-リボヌクレオチドを交互に含み;(2)5'末端から2位および14位のヌクレオチドは、2'-メトキシ-リボヌクレオチドではなく;(3)ヌクレオチドは、ホスホジエステルまたはホスホロチオエート結合を介して結合され;そして、(4)3'末端から1～2位～1～7位のヌクレオチドは、ホスホロチオエート結合を介して隣接するヌクレオチドに結合されている。
いくつかの実施態様において、分岐状オリゴヌクレオチド化合物は、2、3、4、6、または8の核酸を含む。
いくつかの実施態様において、分岐状オリゴヌクレオチド化合物の核酸は二本鎖(ds)RNAであり、各ds核酸は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、各dsRNAは、独立して、センス鎖またはアンチセンス鎖の3'末端または5'末端でリンカー、スペーサーまたは分岐点に結合されている。
いくつかの実施態様において、分岐状オリゴヌクレオチド化合物の各リンカーは、独立して、エチレングリコール鎖、アルキル鎖、ペプチド、RNA、DNA、ホスフェート、ホスホネート、ホスホルアミデート、エステル、アミド、トリアゾール、およびこれらの組み合わせからなる群から選択され;ここで、リンカーのいずれかの炭素または酸素原子は、窒素原子によって置き換えられていてよく、ヒドロキシル置換基を有するか、オキソ置換基を有する。
一態様において、本開示は、式(I)
Figure 2022528487000002
 ［式(I)中、Lは、エチレングリコール鎖、アルキル鎖、ペプチド、RNA、DNA、ホスフェート、ホスホネート、ホスホルアミデート、エステル、アミド、トリアゾール、およびこれらの組み合わせから選択され、ここで、式(I)は、1つまたはそれ以上の分岐点B、および1つまたはそれ以上のスペーサーSをさらに含んでいてよく（ここで、Bは、出現するごとに独立して、多価有機種またはその誘導体であり;Sは、出現するごとに独立して、エチレングリコール鎖、アルキル鎖、ペプチド、RNA、DNA、ホスフェート、ホスホネート、ホスホルアミデート、エステル、アミド、トリアゾール、およびこれらの組み合わせから選択される);Nは、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む15～35塩基長の二本鎖核酸であり、ここで、アンチセンス鎖は、5' AAGAAAAGACCUGAUAAAGAUUAACCAGAAGAAAACAAGGAGGGA 3'と実質的に相補的な相補性領域を含み、センス鎖およびアンチセンス鎖は、それぞれ独立して、1つまたはそれ以上の化学修飾を含み;そして、nは、2、3、4、5、6、7または8である］で示される化合物を提供する。
いくつかの実施態様において、式(I)で示される化合物は、式(I-1)～(I-9):
Figure 2022528487000003
 から選択される構造を有する。
いくつかの実施態様において、式(I)で示される化合物のアンチセンス鎖は、
Figure 2022528487000004
 からなる群から選択される5'末端基Rを含む。
いくつかの実施態様において、式(I)で示される化合物は、式(II):
Figure 2022528487000005
 ［式中、Xは、出現するごとに独立して、アデノシン、グアノシン、ウリジン、シチジン、およびそれらの化学修飾誘導体から選択され;Yは、出現するごとに独立して、アデノシン、グアノシン、ウリジン、シチジン、およびそれらの化学修飾誘導体から選択され;-は、ホスホジエステルヌクレオシド間結合を示し;=は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合を示し;そして、---は、出現するごとに単独に、塩基対合相互作用またはミスマッチを示す］の構造を有する。
いくつかの実施態様において、式(II)で示される化合物は、式(III):
Figure 2022528487000006
 ［式中、Xは、出現するごとに独立して、2'-デオキシ-2'-フルオロ修飾を含むヌクレオチドであり;Xは、出現するごとに独立して、2'-O-メチル修飾を含むヌクレオチドであり;Yは、出現するごとに独立して、2'-デオキシ-2'-フルオロ修飾を含むヌクレオチドであり;そして、Yは、出現するごとに独立して、2'-O-メチル修飾を含むヌクレオチドである］の構造を有する。
いくつかの実施態様において、式(I)で示される化合物は、式(IV):
Figure 2022528487000007
 ［式中、Xは、出現するごとに独立して、アデノシン、グアノシン、ウリジン、シチジン、およびそれらの化学修飾誘導体から選択され;Yは、出現するごとに独立して、アデノシン、グアノシン、ウリジン、シチジン、およびそれらの化学修飾誘導体から選択され;-は、ホスホジエステルヌクレオシド間結合を示し;=は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合を示し;そして、---は、出現するごとに単独に、塩基対合相互作用またはミスマッチを示す］の構造を有する。
いくつかの実施態様において、式(IV)で示される化合物は、式(V):
Figure 2022528487000008
 ［式中、Xは、出現するごとに独立して、2'-デオキシ-2'-フルオロ修飾を含むヌクレオチドであり;Xは、出現するごとに独立して、2'-O-メチル修飾を含むヌクレオチドであり;Yは、出現するごとに独立して、2'-デオキシ-2'-フルオロ修飾を含むヌクレオチドであり;そして、Yは、出現するごとに独立して、2'-O-メチル修飾を含むヌクレオチドである］の構造を有する。
いくつかの実施態様において、Lは、構造L1:
Figure 2022528487000009
 である。
Lが構造L1である場合、RはR3であり得て、nは2であり得る。
いくつかの実施態様において、Lは、構造L2:
Figure 2022528487000010
 である。
Lが構造L2である場合、RはR3であり得て、nは2であり得る。
一態様において、本開示は、式(VI):
Figure 2022528487000011
 [式(VI)中、Lは、エチレングリコール鎖、アルキル鎖、ペプチド、RNA、DNA、ホスフェート、ホスホネート、ホスホルアミデート、エステル、アミド、トリアゾール、およびこれらの組み合わせから選択され、ここで、式(VI)は、1つまたはそれ以上の分岐点 B、および1つまたはそれ以上のスペーサーSをさらに含んでいてよく(ここで、Bは、出現するごとに独立して、多価有機種またはその誘導体であり;Sは、出現するごとに独立して、エチレングリコール鎖、アルキル鎖、ペプチド、RNA、DNA、ホスフェート、ホスホネート、ホスホルアミデート、エステル、アミド、トリアゾール、およびこれらの組み合わせから選択される);各cNA、独立して、1つまたはそれ以上の化学修飾を含む担体核酸であり;各cNAは、独立して、5' AAGAAAAGACCUGAUAAAGAUUAACCAGAAGAAAACAAGGAGGGA 3'の少なくとも15個の連続するヌクレオチドを含み;そして、nは、2、3、4、5、6、7または8である］の構造を有する、治療的核酸のための送達システムを提供する。
一実施態様において、送達システムは、式(VI-1)～(VI-9):
Figure 2022528487000012
 から選択される構造を有する。
いくつかの実施態様において、送達システムの各cNAは、独立して、化学修飾ヌクレオチドからなる。
代表的な実施態様において、送達システムは、「n」個の治療的核酸(NA)をさらに含み、ここで、各NAは、少なくとも1つのcNAにハイブリダイズしている。
いくつかの実施態様において、各NAは、独立して、少なくとも16個の連続するヌクレオチドを含む。
いくつかの実施態様において、各NAは、独立して、16～20個の連続するヌクレオチドを含む。
いくつかの実施態様において、各NAは、独立して、少なくとも2のヌクレオチドの不対突出部を含む。突出部のヌクレオチドは、ホスホロチオエート結合を介して結合され得る。
いくつかの実施態様において、各NAは、独立して、DNA、siRNA、アンタゴmiR、miRNA、ギャップマー、ミックスマー、またはガイドRNAからなる群から選択される。「ギャップマー」は、RNase Hによる切断を誘発するのに十分な長さのデオキシヌクレオチドモノマーの中央ブロックを含むキメラアンチセンスオリゴヌクレオチドである。「ミックスマー」は、LNAおよびDNAの交互の短いストレッチからなるオリゴマーである。
一態様において、本開示は、生物においてC9ORF72遺伝子に発現を阻害するための医薬組成物であって、上記のいずれかの分岐状オリゴヌクレオチド化合物または上記のいずれかの送達システム、および薬学的に許容できる担体を含む医薬組成物を提供する。
いくつかの実施態様において、医薬組成物の分岐状オリゴヌクレオチド化合物または送達システムは、該C9ORF72遺伝子の発現を少なくとも50％阻害する。
いくつかの実施態様において、医薬組成物の分岐状オリゴヌクレオチド化合物または送達システムは、該C9ORF72遺伝子の発現を少なくとも90％阻害する。
一態様において、本開示は、細胞内でのC9ORF72遺伝子の発現を阻害する方法であって、(a)上記のいずれかの分岐状オリゴヌクレオチド化合物または上記のいずれかの送達システムを細胞に導入すること;および(b)工程(a)で作製された細胞を、C9ORF72遺伝子のmRNA転写産物の分解を得るのに十分な時間維持することを含み、それによって細胞内でのC9ORF72遺伝子の発現を阻害する方法を提供する。
一態様において、本開示は、神経変性疾患を処置または管理する方法であって、そのような処置または管理を必要とする患者に、治療有効量の上記のいずれかの分岐状オリゴヌクレオチド化合物または上記のいずれかの送達システムを投与することを含む方法を提供する。
いくつかの実施態様において、分岐状オリゴヌクレオチド化合物または送達システムは、患者の脳に投与される。
いくつかの実施態様において、分岐状オリゴヌクレオチド化合物または送達システムは、脳室内(ICV)または髄腔内(IT)注射によって投与される。
いくつかの実施態様において、分岐状オリゴヌクレオチド化合物または送達システムの投与により、脳においてC9ORF72遺伝子mRNAの低減を引き起こす。
いくつかの実施態様において、分岐状オリゴヌクレオチド化合物または送達システムの投与により、脊髄においてC9ORF72遺伝子mRNAの低減を引き起こす。
いくつかの実施態様において、分岐状オリゴヌクレオチド化合物または送達システムは、C9ORF72遺伝子の発現を少なくとも50％阻害する。
いくつかの実施態様において、分岐状オリゴヌクレオチド化合物または送達システムは、C9ORF72遺伝子の発現を少なくとも90％阻害する。
一態様において、本開示は、それぞれ独立して15～35塩基長の2つの核酸を含む分岐状オリゴヌクレオチド化合物であって、各核酸は、C9ORF72 mRNAと実質的に相補的な相補性領域を含み、ここで、該2つの核酸は、リンカー、スペーサーおよび分岐点から独立して選択される1つまたはそれ以上の部分によって互いに結合されている。
いくつかの実施態様において、各核酸は、独立して、表1、表2、表3、表4、または表5に記載のC9ORF72遺伝子における遺伝子領域と実質的に相補的な相補性領域を含む。
いくつかの実施態様において、各核酸は、独立して、一本鎖(ss)RNAまたは二本鎖(ds)RNAである。
一態様において、本開示は、第一のガイド鎖、第二のガイド鎖、第一のパッセンジャー鎖、第二のパッセンジャー鎖、およびリンカーを含むジ分岐状オリゴヌクレオチド化合物を提供する。第一のガイド鎖および第二のガイド鎖は、それぞれ独立して、5' GAUUAACCAGAAGAA 3'と実質的に相補的な相補性領域を含む。第一のパッセンジャー鎖および第二のパッセンジャー鎖は、リンカーを介して結合されている。
いくつかの実施態様において、第一のガイド鎖および第二のガイド鎖は、それぞれ独立して、5'VP(mU)#(fU)#(mC)(fU)(fU)(fC)(mU)(fG)(mG)(fU)(mU)(fA)(mA)#(fU)#(mC)#(mU)#(mU)#(mU)#(mA)#(fU) 3'を含む。されなる実施態様において、第一のパッセンジャー鎖および第二のパッセンジャー鎖はそれぞれ、5' (mG)#(mA)#(fU)(mU)(fA)(mA)(fC)(mC)(fA)(mG)(mA)(mA)(fG)#(mA)#(mA) 3'を含む。
リンカーは、エチレングリコール鎖、アルキル鎖、ペプチド、RNAオリゴヌクレオチド、DNAオリゴヌクレオチド、ホスフェート、ホスホネート、ホスホルアミデート、エステル、アミド、トリアゾール、およびこれらの組み合わせからなる群から選択されてもよく、ここで、リンカーのいずれかの炭素または酸素原子は、窒素原子によって置き換えられていてよく、ヒドロキシル置換基を有していてよく、またはオキソ置換基を有していてよい。非限定的な実施態様において、リンカーは、グリセロールまたは、式-O-(CH2)o-CH(OH)-(CH2)p-O-［式中、oおよびpは、独立して、1～約6の整数である］のグリセロールホモログ鎖、および式-O-(CH2)m-C(O)NH-CH2-CH(OH)-CH2-NHC(O)-(CH2)m-O-［式中、mは0～約10の整数］を有する1,3-ジアミノ-2-ヒドロキシプロパンの誘導体からなる群から選択される。さらに非限定的な実施態様において、第一のパッセンジャー鎖の3'末端は、リンカーを介して第二のパッセンジャー鎖の3'末端に結合されている。
別の態様において、本開示は、神経変性疾患を処置または管理する方法を提供する。本発明の方法は、そのような処置または管理を必要とする患者に、前の態様に示されている第一のガイド鎖、第二のガイド鎖、第一のパッセンジャー鎖、第二のパッセンジャー鎖、およびリンカーを含む治療有効量のジ分岐状オリゴヌクレオチド化合物を投与することを含む。いくつかの実施態様において、ジ分岐状オリゴヌクレオチド化合物は、患者の脳に、例えば、脳室内(ICV)または髄腔内(IT)注射によって投与される。非限定的な実施態様において、ジ分岐状オリゴヌクレオチド化合物の投与により、脳におけるC9ORF72疾患アイソフォーム遺伝子mRNAの低減を引き起こす。別の非限定的な実施態様において、ジ分岐状オリゴヌクレオチド化合物または送達システムの投与により、脊髄におけるC9ORF72疾患アイソフォーム遺伝子mRNAの低減を引き起こす。例の実施態様において、ジ分岐状オリゴヌクレオチド化合物は、C9ORF72疾患アイソフォーム遺伝子の発現を少なくとも50％阻害する。別の例の実施態様において、ジ分岐状オリゴヌクレオチド化合物は、C9ORF72疾患アイソフォーム遺伝子の発現を少なくとも90％阻害する。
上記に概説されている態様は、第一の標的配列5' AAGAAAAGACCUGAUAAAGAUUAACCAGAAGAAAACAAGGAGGGAと実質的に相補的なRNA分子に基づいたものである。別の実施態様において、RNA分子は、第二の標的配列5' UGCUCUCACAGUACUCGCUGAGGGUGAACAAGAAAAGACCUGAUA 3'と実質的に相補的であり、例えば、RNA分子は、5' CGCUGAGGGUGAACAAGAAA 3'と実質的に相補的な相補性領域を含む。さらなる実施態様において、RNA分子が5'AGUUCCGCCCACGUAAAAGA 3'と実質的に相補的な相補性領域を含む場合など、RNA分子は、第三の標的配列 5' CGUCAAACAGCGACAAGUUCCGCCCACGUAAAAGAUGACGCUUGG 3'と実質的に相補的である。RNA分子が5' GGUCUAGCAAGAGCAGGUGUGGGUUUAGGAGGUGUGUGUUUUUGT 3'と実質的に相補的である実施態様、例えば、RNA分子が5' GGUGUGGGUUUAGGAGGUGU 3'と実質的に相補的な相補性領域を含む場合も考慮される。
本出願の上記および他の特徴および利点は、添付の図面と併せて取られた例示的な実施態様の以下の詳細な説明からより完全に理解されるであろう。特許または出願ファイルは、カラーで実行される少なくとも1つの図面を含む。カラーの図面を含むこの特許または特許出願公開のコピーは、要求および必要な手数料の支払いに応じて国内で提供される。
1A～1Dは、Haeuslerら(Nature Reviews Neuroscience volume 17, pages 383-395 (2016))から引用した概略図であり、C9orf72遺伝子ならびに、センスおよびアンチセンス製品で非選択的または選択的に標的とされる領域を示す。(A)C9ORF72遺伝子およびイントロンヘキサヌクレオチド反復領域の概略図。(B)非病理学的センス鎖とエキソン2内のsiRNA標的領域の概略図。(C)病理学的ヘキサヌクレオチド反復を含むセンス鎖、エキソン2内のsiRNA非選択的標的領域ならびにエキソン1aおよびイントロン1の領域からなる選択的siRNA標的領域の概略図。(D)病理学的ヘキサヌクレオチド反復を含むアンチセンス鎖、ならびにexan1aおよびイントロン1の領域からなる選択的siRNA標的領域の概略図。
図2は、HeLa細胞において、psiCHECK2システムを用いて72時間にわたって行ったC9orf72センス鎖標的siRNA(1.5μM)分子の系統的スクリーンの結果のグラフィカル表示である。エキソン1/イントロン1にまたがる選択的標的領域、およびエキソン2の非選択的領域に対する候補を試験した。ノックダウンは、細胞内でルシフェラーゼレポーターの蛍光検出によって、未処理の対照細胞と比較して測定した。エキソン1には3つの候補、エキソン1とイントロン1の接合部には1つの候補、イントロン1には4つの候補、エキソン2には3つの候補で強力なノックダウンが観察された。
図3は、HeLa細胞において、psiCHECK2システムを用いて、72時間行ったC9orf72アンチセンス鎖標的siRNA(1.5μM)分子の系統的スクリーンの結果のグラフィカル表示である。エキソン1/イントロン1にまたがる選択的標的領域、およびエキソン2の非選択的領域に対する候補を試験した。ノックダウンは、細胞内でルシフェラーゼレポーターの蛍光検出によって、未処理の対照細胞と比較して測定した。エキソン1には3つの候補、イントロン1には9つの候補、エキソン2には4つの候補で強力なノックダウンが観察された。
図4は、エキソン2の非選択領域内のC9orf72センス鎖標的siRNA(1.5μM)分子の系統的スクリーンの結果のグラフィカル表示である。ノックダウンは、細胞内でルシフェラーゼレポーターの蛍光検出によって、未処理の対照細胞と比較して測定した。
図5は、7つの候補の非選択的C9orf72センス標的siRNA分子のルシフェラーゼレポーターアッセイの結果を示す。結果は、DualGloアッセイを用いて、HeLa細胞においてsiRNAのさまざまな濃度で、psiCHECK2システムを用いて得た。ノックダウンは、細胞内でルシフェラーゼレポーターの蛍光検出によって、未処理の対照細胞と比較して測定した。
図6は、IC50阻害値を決定するための3つの候補siRNA分子に対するルシフェラーゼレポーターアッセイの結果を示す。結果は、DualGloアッセイを用いて、HeLa細胞においてsiRNAのさまざまな濃度で、psiCHECK2システムを用いて得た。ノックダウンは、細胞内でルシフェラーゼレポーターの蛍光検出によって、未処理の対照細胞と比較して測定した。
図7は、C9orf72のエキソン2内の領域を標的とする候補siRNA分子を用いて、U87MG神経膠芽腫細胞における系統的スクリーンの結果を示す。結果は、qPCRによってC9orf72 mRNAのレベルを測定し、発現を未処理の対照細胞の発現レベルと比較することによって得た。
図8は、候補siRNA分子で処理したU87MG神経膠芽腫細胞におけるC9orf72のmRNAレベルを示す。結果は、qPCRを用いて得た。mRNAレベルは、未処理の対照細胞のパーセンテージとして示した。
図9は、2人の患者からの培養線維芽細胞におけるC9orf72のmRNAレベルを示す。mRNAレベルは、qPCRを用いて定量し、未処理の対照レベルと比較した。C9.2およびC9.3患者の線維芽細胞は、選択されたすべての候補において、C9orf72発現のノックダウンを示した。
図10は、C9orf72エキソン2の候補領域を標的とするC9ALSマウスモデルの培養神経細胞からのmRNAレベルを示す。mRNAレベルは、qPCRを用いて定量し、未処理の対照レベルと比較した。
図11A-Bは、siRNAノックダウン分子で処理した後の筋萎縮性側索硬化症のマウスモデルにおけるC9orf72のmRNAレベルを、未処理の対照と比較して示す。複数の候補で強力なノックダウンが観察された。
図12A-Dは、2つの代表的な候補の培養患者線維芽細胞における核および細胞質の病巣の低減を、対照の未処理細胞と比較して視覚的に示したものである。(A)は、C9.2患者線維芽細胞において、未処理の対照細胞間の核内病巣を有する細胞のパーセンテージが低減し、これらの細胞で核内病巣を有しない細胞のパーセンテージが増加したことをグラフで示したものである。(B)は、siRNA候補で処理したC9.2患者線維芽細胞において、未処理の患者線維芽細胞と比較して、細胞質の病巣を有する細胞のパーセンテージが低減し、細胞質の病巣を有しない細胞のパーセンテージが増加したことをグラフで示したものである。(C)は、C9.3患者線維芽細胞における未処理の対照細胞とsiRNA候補で処理したC9.3患者線維芽細胞との間で、核内病巣を有する細胞のパーセンテージが低減し、これらの細胞で核内病巣を有しない細胞のパーセンテージが増加したことをグラフで示したものである。(D)は、siRNA候補で処理したC9.3患者線維芽細胞において、未処理の患者線維芽細胞と比較して、細胞質の病巣を有する細胞のパーセンテージが低減し、細胞質の病巣を有しない細胞のパーセンテージが増加したことをグラフで示したものである。
図13A-Bは、C9.3患者線維芽細胞の代表的な画像である。(A)は、核染色された未処理のC9.3患者線維芽細胞の代表的な画像であり、DAPIは青で、病巣は赤で核染色されている。(B)は、siRNA候補で処理したC9.3患者線維芽細胞の代表的な画像であり、DAPIは青で、RNAの病巣は赤で核染色されている。スケールバー＝10μm。
図14は、候補siRNA分子で24時間、48時間、および72時間処理した患者C9.3線維芽細胞における、拡張を含むアイソフォームのRNAレベルの倍数変化を示したものである。RNAレベルをqPCRで測定し、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼで正規化し、未処理の対照細胞と比較した。
図15は、ガイド鎖の5位および18位、ならびにパッセンジャー鎖の5'末端から1位および11位を除いたすべての位置で、2'O-メチル修飾および2'-フルオロ-リボヌクレオチド修飾を交互に有し、パッセンジャー鎖の3'末端の末端ヌクレオチドにコレステロール部分が結合されている、センス鎖を選別するためのdsRNA分子を示す。
図16は、C9orf72のエキソン1aおよびイントロン1内の候補選択的C9orf72センス鎖標的siRNA分子(1.5μM)のルシフェラーゼレポーターアッセイの結果を示す。ノックダウンは、細胞内でルシフェラーゼレポーターの蛍光検出によって、未処理の対照細胞と比較して測定した。
図17は、C9orf72のセンス鎖のヌクレオチド238と249の間の個々の領域を標的とする「センスウォーク」実験の結果を示す。ノックダウンは、細胞内でルシフェラーゼレポーターの蛍光検出によって、未処理の対照細胞と比較して測定した。
図18A-Cは、siRNA処理後の2つのC9ALS患者培養線維芽細胞からのmRNA発現レベルを示す。(A)は、患者C9.2線維芽細胞においてsiRNA処理後qPCRによって測定したC9orf72 mRNAの発現レベルを未処理の対照細胞と比較してを示したものである。(B)C9.3線維芽細胞においてsiRNA処理後qPCRによって測定したC9orf72 mRNAの発現レベルを未処理の対照細胞と比較して示したものである。(C)は、未処理の対照細胞に対するC9患者線維芽細胞の両方の平均的な発現を示す。
図19は、C9orf72筋萎縮性側索硬化症マウスモデルの選択領域にsiRNAを処理した培養神経細胞におけるC9orf72 mRNAの発現レベルを示す。mRNAのレベルを定量化し、qPCRで未処理の対照神経細胞と比較した。
図20は、パッセンジャー鎖の5'末端から1位および15位を除くすべての位置で2'O-メチル修飾および2'-フルオロ-リボヌクレオチド修飾を交互に有し、パッセンジャー鎖の3'末端のヌクレオチドにコレステロール部位が結合した、アンチセンス鎖をスクリーニングするためのdsRNA分子を示す。
図21は、HeLa細胞において、psiCHECK2システムを用いて、72時間行ったC9orf72センス鎖標的siRNA(1.5μM)分子の系統的スクリーンの結果のグラフィカル表示である。エキソン1/イントロン1にまたがる選択的標的領域に対する候補を試験した。ノックダウンは、細胞内でルシフェラーゼレポーターの蛍光検出によって、未処理の対照細胞と比較して測定した。複数の候補で強力なノックダウンが観察された。
図22は、センス方向およびアンチセンス方向の両方におけるC9orf72標的siRNAの共通の生産的なサイレンシング領域を示す。結果は、HeLa細胞においてpsiCHECK2システムを用いて72時間にわたって得た。ノックダウンは、細胞内でルシフェラーゼレポーターの蛍光検出によって、未処理の対照細胞と比較して測定した。
図23は、ジ-siRNA分子の概略図である。黒色-2'-O-メチル、灰色-2'-フルオロ、赤色ダッシュ-ホスホロチオエート結合、各パッセンジャー鎖の3'末端の末端ヌクレオチド結合されたリンカー。交互のヌクレオチド修飾のモチーフは、5'末端からのセンス標的鎖の1位、11位、および15位、ならびに5'末端からの相補的な結合鎖の5位、16位、および18位で異なる。
図24は、ジ-hsiRNAの構造を示す。黒色-2'-O-メチル、灰色-2'-フルオロ、赤色ダッシュ-ホスホロチオエート結合、トリエチレングリコール(TEG)由来のリンカーを含むリンカー。ジ-hsiRNAは、センス鎖の3'末端にリンカーを介して結合された2つの非対称siRNAである。より長いアンチセンス鎖へのハイブリダイゼーションにより、突出した一本鎖完全ホスホロチオエート領域が形成され、これは、組織分布、細胞取り込み、および有効性の発揮に不可欠である。本明細書に提示されている構造は、4つのモノマーのグリコールベースのリンガーを利用する。リンカーの化学的同一性は、有効性に影響を与えることなく変更できる。それは、長さ、化学組成(全て炭素)、飽和度、または化学標的リガンドの付加によって調整できる。
図25は、ジ分岐状siRNAの化学合成、精製および品質管理を示す。
図26は、図25に示されている方法によって製造された化合物のHPLCおよび品質管理を示す。マススペクトロメトリーにより、TEGリンカー、ジ分岐状オリゴ、およびVit-D(カルシフェロール)コンジュゲートを有するセンス鎖として3つの主要生成物を同定した。すべての生成物は独立して、HPLCによって精製し、インビボで試験した。ジ分岐状オリゴは唯一、分岐状構造が組織保持および分布に不可欠であることを示す前例のない組織分布および有効性を特徴とする。
ジ分岐状オリゴヌクレオチドの質量を確認するためのマススペクトロメトリーを示す。観察された11683の質量は、3'末端によりTEGリンカーを介して結合された2本のセンス鎖に対応する。
図28は、代替の化学経路を用いた、分岐状オリゴヌクレオチドの合成を示す。
図29は、例示的なアミダイトリンカー、スペーサーおよび分岐状部分を示す。
図30は、オリゴヌクレオチドの分岐状モチーフを示す。二重らせんは、オリゴヌクレオチドを示す。さまざまなリンカー、スペーサーおよび分岐点の組み合わせにより、多種多様な分岐状hsiRNA構造が生じることを可能にする。
図31は、構造的に多様な分岐状オリゴヌクレオチドを示す。
図32は、4つの一本鎖ホスホロチオエート領域を有する本発明の非対称化合物を示す。
図33は、3つのオリゴヌクレオチドをアニーリングすることによって形成された本発明の分岐状オリゴヌクレオチド(A)を示す。より長い結合オリゴヌクレオチドは、未修飾RNA、DNAまたはUNA(ロックされていない核酸)の形態の切断可能な領域；(B)前述のリンカーまたは空間に3'および5'結合を有する非対称分岐状オリゴヌクレオチドを含み得る。これは、センス鎖またはアンチセンス鎖の3'および5'末端、またはこれらの組み合わせ；(C)3つの別々の鎖からなる分岐状オリゴヌクレオチドに適用することができる。長い二重センス鎖は、3'-3'隣接または5'-5'隣接末端を可能にする3'ホスホロアミダイトおよび5'ホスホロアミダイトで合成することができる。
図34は、コンジュゲートされた生物活性部分を有する本発明の分岐状オリゴヌクレオチドを示す。
図35は、ホスホロチオエート含有量と立体選択性との間の関連性を示す。
図36は、例示的な疎水性部分を示す。
図37は、例示的なヌクレオチド間結合を示す。
図38は、例示的なヌクレオチド間骨格結合を示す。
図39は、例示的な糖修飾を示す。
図40は、hsiRNAおよび完全に代謝された(FM)hsiRNAの構造を示す。
図41は、一本鎖完全修飾オリゴヌクレオチドの化学的多様性を示す。一本鎖オリゴヌクレオチドは、ギャップマー、ミックスマー、miRNA阻害剤、SSO、PMO、またはPNAからなり得る。
図42は、分岐状オリゴヌクレオチド構造へ疎水性部分を取り込むための第一の戦略を示す。
図43は、分岐状オリゴヌクレオチド構造へ疎水性部分を取り込むための第二の戦略を示す。
図44は、分岐状オリゴヌクレオチド構造へ疎水性部分を取り込むための第三の戦略を示す。
図45は、中枢神経系の外側(図45A)および内側(図45B)のマウス組織におけるC9ORF72 mRNAの総ノックダウンを定量化したプロットを含む。
図46は、中枢神経系の外側(図46A)および内側(図46B)のマウス組織におけるC9ORF72 mRNAの疾患アイソフォーム特異的ノックダウンを定量化したプロットを含む。
図47は、マウスの線条体におけるC9ORF72タンパク質のウェスタンブロット(図47A)、およびC9ORF72タンパク質発現におけるノックダウンを定量化した図表(図47B)を含む。
図48は、マウスの視床におけるC9ORF72タンパク質のウェスタンブロット(図48A)、およびC9ORF72タンパク質発現のノックダウンを定量化した図表(図48B)を含む。
図49は、中枢神経系の外側(図49A)および内側(図49B)のマウス組織におけるC9ORF72 mRNAの総ノックダウンを定量化したプロットを含む。
図50は、中枢神経系の外側(図50A)および内側(図50B)のマウス組織におけるC9ORF72 mRNAの疾患アイソフォーム特異的ノックダウンを定量化したプロットを含む。
図51は、マウスの視床におけるC9ORF72タンパク質のウェスタンブロット(図51A)、およびC9ORF72タンパク質発現のノックダウンを定量化した図表(図51B)を含む。
図52は、肝臓、腎臓、または脾臓に注射することによって処置したマウスで測定された、C9ORF72 mRNA発現の総ノックダウン(図52A)および疾患特異的ノックダウン(図52B)を定量化したプロットを含む。
図53は、脊柱における頸部、胸郭、または腰部に注射することによって処置したマウスで測定した、C9ORF72 mRNA発現の総ノックダウン(図53A)および疾患特異的ノックダウン(図53B)を定量化したプロットを含む。
図54は、前頭葉前部皮質、運動皮質、小脳、または脳幹に注射することによって処置したマウスで測定した、C9ORF72 mRNA発現の総ノックダウン(図54A)および疾患特異的ノックダウン(図54B)を定量化したプロットを含む。
図55は、線条体、視床、海馬、または体性感覚皮質に注射することによって処置したマウスで測定した、C9ORF72 mRNA発現の総ノックダウン(図55A)および疾患特異的なノックダウン(図55B)を定量化したプロットを含む。
(特定の例示的な実施態様の詳細な説明)
本明細書では、アイソフォーム-選択的および非選択的標的配列を含む、新規なC9ORF72標的配列が提供される。また、C9ORF72 mRNAの選択的および非選択的標的配列を標的とすることによって特異的および非特異的mRNAバリアント調節を可能にする新規なsiRNAも提供される。また、C9ORF72関連の病態、例えば筋萎縮性側索硬化症(ALS)や前頭側頭型変性症(FTD)を処置する方法も提供される。
ヌクレアーゼによる分解に対する耐性および自己送達機能を提供する完全修飾疎水性siRNA(FM-hsiRNA)のプラットフォームを用いて、C9ORF72を標的とする100個を超える配列のスクリーニングが行われた。さまざまな関心領域を標的とする約15個のヒットが特定された。二次スクリーンは、ヒト患者の線維芽細胞で行われ、C9ORF72のバリアント特異的でかつ非特異的である調節を可能にするイントロンおよびエキソン領域を標的とする同定を可能にした。同定された化合物は、関連するC9ORF72 mRNAバリアントを下方制御し、核および細胞質でのRNA病巣形成を低減することもできる。これらの化合物は、C9ORF72毒性の主要な決定因子の1つであるジ-ペプチドの発現を低減するのにも効果的であった。
RANジペプチドは、センスおよびアンチセンスのヘキサヌクレオチドを含む転写産物から発現され、C9の神経病理を低減するためには標的にすべきである。このように、本開示では、同一分子内に2本のガイド鎖を持ち、センスおよびアンチセンスの両方の転写産物を同時にサイレンシングすることができる、C9の二重標的siRNAという概念を初めて導入した。
特に断らない限り、本明細書に記載の細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、タンパク質および核酸の化学ならびにハイブリダイゼーションに関連して使用される命名法は、当該技術分野でよく知られ、一般的に使用されているものである。特に断らない限り、本明細書で提供される方法および技術は、当該技術分野で周知の従来の方法に従って、特に断らない限り本明細書全体で引用および論じられる様々な一般的およびより具体的な参考文献に記載されるように実施される。酵素反応および精製技術は、当該技術分野で一般的に達成されているように、または本明細書に記載されているように、製造業者の仕様に従って実施される。本書に記載の分析化学、有機合成化学、医薬化学に関連して使用される命名法、およびそれらの検査法および技術は、当該技術分野でよく知られており、一般的に使用されているものである。標準的な技術は、化学合成、化学分析、医薬品、製剤、送達、および患者の処置に使用される。
本明細書で特に定義されていない限り、本明細書で使用されている科学技術用語は、当業者が一般的に理解している意味を有する。いずれかの潜在的意味不明の場合は、本明細書で提供される定義を、辞書または外部の定義より優先する。文脈上特に必要とされない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。「or」の使用は、別段の記載がない限り、「および／または」を意味する。「含む(including)」という用語ならびに「含む(includes)」および「含まれる」などの他の形態の使用は限定されない。
本出願がより容易に理解されるように、まず特定の用語を定義する。
「改変」とは、本明細書に記載のものなどの標準的な当該技術分野で知られている方法によって検出される遺伝子、mRNAまたはポリペプチドの発現レベルの変化(増加または低減)を意味する。本明細書において使用されるとき、増加または低減には、発現レベルの10％の変化、25％の変化、40％の変化、または50％またはそれ以上の変化が含まれる。特定の実施態様において、増加または低減は、約30％～約50％または約30％～約40％の発現レベルの変化である。「改変」は、本出願のmRNAまたはポリペプチド(例えば、C9ORF72およびRANペプチド)のいずれかの生物学的活性の変化(増加または低減)を示すこともできる。C9ORF72の生物学的活性の例としては、神経変性疾患、例えばALSやFTDの1つまたはそれ以上の臨床症状が挙げられる。本明細書では、増加または低減には、生物学的活性の10％の変化、または25％の変化、または40％の変化、または50％またはそれ以上の変化が含まれる。特定の好ましい実施態様において、増加または低減は、約30％～約50％、または約30％～40％の発現レベルの変化である。
本出願の特定の実施対象は、ALSまたは他のC9ORF72疾患の処置を対象としている。「C9ORF72に関連する障害の処置」とは、C9ORF72に関連する障害の処置のための医薬組成物における本出願のオリゴヌクレオチド(例えば、siRNA)の使用を意味する。このように、オリゴヌクレオチドを含有する医薬組成物は、C9ORF72の発現、RANペプチドの形成、およびC9ORF72の核または細胞質の病巣の生成などの細胞プロセスの阻害を必要とする疾患、状態、および障害の処置に有用である。
「筋萎縮性側索硬化症」(ALS)とは、随意筋の制御の退化を特徴とする神経系疾患を意味する。ALSは、筋肉の硬直、筋肉が痙攣し、筋肉の大きさの低減による漸進的な衰弱を特徴とする。
「治療量」とは、ALSまたはその他の疾患に罹患している患者に投与されたときに、本明細書に記載のALSまたはその他の疾患の症状の質的または量的な低減を引き起こすのに十分な量を意味する。また、「治療量」とは、ALSもしくはその他の疾患に罹患している患者または対象に投与されたときに、本明細書に記載の1つまたはそれ以上のアッセイによって測定される1つまたはそれ以上のC9ORF72 RANペプチドまたはC9ORF72転写産物の発現レベルの低下を引き起こすのに十分な量を意味することができる。
「対象」とは、ヒトまたはヒト以外の哺乳動物、例えば、ウシ、ウマ、イヌ、オウギ、ネコ、マウスなどのヒト以外の霊長類または他の動物を含むが、これらに限定されない哺乳動物を意味する。
用語「ヌクレオシド」とは、プリンまたはピリミジン塩基がリボースまたはデオキシリボース糖に共有結合する分子を意味する。例示的なヌクレオシドとしては、アデノシン、グアノシン、シチジン、ウリジンおよびチミジンがある。さらなる例示的なヌクレオシドとしては、イノシン、1-メチルイノシン、シュードウリジン、5,6-ジヒドロウリジン、リボチミジン、2N-メチルグアノシンおよび2,2N,N-ジメチルグアノシン(「希少」ヌクレオシドとも称される)がある。用語「ヌクレオチド」とは、糖部分にエステル結合で接合される1つまたはそれ以上のホスフェートを有するヌクレオシドを意味する。例示的なヌクレオチドとしては、ヌクレオシドモノホスフェート、ジホスフェートおよびトリホスフェートがある。用語「ポリヌクレオチド」および「核酸分子」とは、本明細書において互換的に使用され、5'および3'炭素原子間のホスホジエステルまたはホスホロチオエート結合によって完全に接合されるヌクレオチドのポリマーを意味する。
用語「RNA」または「RNA分子」または「リボ核酸分子」とは、リボヌクレオチドのポリマー(例えば、2、3、4、5、10、15、20、25、30、またはそれ以上のリボヌクレオチド)を意味する。用語「DNA」または「DNA分子」または「デオキシリボ核酸分子」とは、デオキシリボヌクレオチドのポリマーを意味する。DNAおよびRNAは、自然に合成することができる(例えば、それぞれDNA複製またはDNAの転写によって)。RNAは転写後に修飾されることがある。また、DNAおよびRNAは化学的に合成することができる。DNAおよびRNAは、一本鎖(すなわち、それぞれssRNAおよびssDNA)または多本鎖(例えば、二本鎖、すなわち、それぞれdsRNAおよびdsDNA)であり得る。「mRNA」または「メッセンジャーRNA」は、1つまたはそれ以上のポリペプチド鎖のアミノ酸配列を特定する一本鎖RNAである。この情報は、タンパク質合成中にリボソームがmRNAに結合する時に翻訳される。
本明細書において使用されるとき、用語「低分子干渉RNA」(「siRNA」)(当該技術分野では「短干渉RNA」とも称される)とは、RNA干渉を指示または媒介することができる約10～50個のヌクレオチド(またはヌクレオチドアナログ)を含むRNA(またはRNAアナログ)を意味する。普段は、siRNAは、約15～30個のヌクレオチドもしくはヌクレオチドアナログ、または約16～25個のヌクレオチド(またはヌクレオチドアナログ)、または約18～23個のヌクレオチド(またはヌクレオチドアナログ)、または約19～22個のヌクレオチド(またはヌクレオチドアナログ)(例えば、19、20、21または22個のヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ)を含む。用語「短い」siRNAとは、約21個のヌクレオチド(またはヌクレオチドアナログ)、例えば、19、20、21または22個のヌクレオチドを含むsiRNAを意味する。用語「長い」siRNAとは、約24～25個のヌクレオチド、例えば、23、24、25または26個のヌクレオチドを含むsiRNAを意味する。短いsiRNAsは、場合によっては、19個未満のヌクレオチド、例えば、16、17または18個のヌクレオチドを含むことがあり、但し、該より短いsiRNAはRNAiを媒介する能力を保持する。同様に、長いsiRNAは、場合によっては、26個を超えるヌクレオチドを含むことがあり、但し、より長いsiRNAは、短いsiRNAへのさらなる処理(例えば、酵素処理)がなくても、RNAiを媒介する能力を保持する。
用語「ヌクレオチドアナログ」または「改変ヌクレオチド」または「修飾ヌクレオチド」とは、非天然のリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドを含む、非標準のヌクレオチドを意味する。例示的なヌクレオチドアナログは、ヌクレオチドの特定の化学性質を改変するようにいずれかの位置で修飾されるにもかかわらずその意図する機能を果たすヌクレオチドアナログの能力を保持する。誘導体化され得るヌクレオチドの位置の例としては、5位、例えば、5-(2-アミノ)プロピルウリジン、5-ブロモウリジン、5-プロピンウリジン、5-プロペニルウリジンなど；6位、例えば、6-(2-アミノ)プロピルウリジン；アデノシンおよび／またはグアノシンの8位、例えば、8-ブロモグアノシン、8-クロログアノシン、8-フルオログアノシンなどがある。また、ヌクレオチドアナログには、デアザヌクレオチド、例えば、7-デアザ-アデノシン；O-およびN-修飾(例えば、アルキル化、例えば、N6-メチルアデノシン、または当該技術分野で他に知られている)ヌクレオチド；およびHerdewijn, Antisense Nucleic Acid Drug Dev., 2000 Aug. 10(4):297-310に記載されている他のヘテロ環式的に修飾されたヌクレオチドアナログがある。
ヌクレオチドアナログはまた、ヌクレオチドの糖部分への修飾を含み得る。例えば、2'OH-基は、H、OR、R、F、Cl、Br、I、SH、SR、NH2、NHR、NR2、またはCOORから選択される群によって置き換えられていてもよく、ここで、Rは、置換または非置換C1-C6アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールなどである。他の可能な修飾としては、米国特許5,858,988および6,291,438に記載されているものがある。
ヌクレオチドのホスフェート基はまた、例えば、ホスフェートの1つまたはそれ以上の酸素を硫黄で置換することによって(例えば、ホスホロチオエート)、あるいは、例えば、Eckstein, Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 2000 Apr. 10(2):117-21, Rusckowski et al. Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 2000 Oct. 10(5):333-45, Stein, Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 2001 Oct. 11(5): 317-25, Vorobjev et al. Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 2001 Apr. 11(2):77-85、および米国特許5,684,143に記載されているように、該ヌクレオチドがその意図する機能を果たすことを可能にする他の置換を作ることによって修飾することができる。上述の特定の修飾(例えば、ホスフェート基修飾)は、好ましくは、例えば、インビボまたはインビトロで該アナログを含むポリヌクレオチドの加水分解率を低下させる。
用語「オリゴヌクレオチド」とは、ヌクレオチドおよび／またはヌクレオチドアナログの短いポリマーを意味する。用語「RNAアナログ」とは、対応する未改変または未修飾のRNAと比較して、少なくとも1つの改変または修飾ヌクレオチドを有するが、対応する未改変または未修飾のRNAと同じまたは類似の性質または機能を保持するポリヌクレオチド(例えば、化学的に合成されたポリヌクレオチド)を意味する。上述したように、オリゴヌクレオチドは、ホスホジエステル結合を有するRNA分子と比較して、RNAアナログの加水分解率が低くなるような結合で結合することがある。例えば、アナログのヌクレオチドは、メチレンジオール、エチレンジオール、オキシメチルチオ、オキシエチルチオ、オキシカルボニルオキシ、ホスホロジアミデート、ホスホロアミデート、および／またはホスホロチオエート結合を含むことができる。好ましいRNAアナログは、糖-および／または骨格-修飾リボヌクレオチドおよび／またはデオキシリボヌクレオチドを含む。このような改変または修飾は、例えば、RNAの末端へまたは内部的に(RNAの1つまたはそれ以上のヌクレオチド)非ヌクレオチド材料を追加することをさらに含むことができる。RNAアナログは、RNA干渉を媒介する能力を有するように、天然のRNAと十分に類似していればよい。
本明細書において使用されるとき、用語「RNA干渉」(「RNAi」)とは、RNAの選択的な細胞内分解を意味する。RNAiは、外来のRNA(例えば、ウイルスのRNA)を除去するために、細胞内で自然に発生する。天然のRNAiは、分解性メカニズムを他の同様のRNA配列に指示する遊離dsRNAから切断される断片を介して進行する。あるいは、RNAiは、例えば、標的遺伝子の発現をサイレンシングするために、人間の手によって開始できる。
RNAi剤、例えばRNAサイレンシング剤は、「標的特異的なRNA干渉(RNAi)を指示するために標的mRNA配列に十分に相補的な配列」である鎖を有し、その鎖がRNAiメカニズムまたはプロセスによる標的mRNAの破壊を誘発するのに十分な配列を有することを意味する。
本明細書において使用されるとき、用語「単離されたRNA」(例えば、「単離されたsiRNA」または「単離されたsiRNA前駆体」)とは、組換え技術によって生成されると、他の細胞材料または培養液を実質的に含まず、化学的に合成されると、化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まないRNA分子を意味する。
本明細書において使用されるとき、用語「RNAサイレンシング」とは、対応するタンパク質コード化遺伝子の発現の阻害または「サイレンシング」をもたらす、RNA分子よって媒介される、配列特異的調節メカニズム(例えば、RNA干渉(RNAi)、転写レベルでの遺伝子サイレンシング(transcriptional gene silencing, TGS)、転写後遺伝子サイレンシング(post-transcriptional gene silencing, PTGS)、クエリング(quelling)、同時サプレッション(co-suppression)、および翻訳抑制)の群を意味する。RNAサイレンシングは、植物、動物、菌類などの多くの生物で観察されている。
本明細書において使用されるとき、用語「差別的なRNAサイレンシング」とは、例えば、両方のポリヌクレオチド配列が同じ細胞内に存在する場合に、「第一の」または「標的」ポリヌクレオチド配列の発現を実質的に阻害するが、「第二の」または「非標的」ポリヌクレオチド配列の発現を実質的に阻害しないRNA分子の能力を意味する。特定の実施態様において、標的ポリヌクレオチド配列は標的遺伝子に対応し、一方、非標的ポリヌクレオチド配列は非標的遺伝子に対応する。他の実施態様において、標的ポリヌクレオチド配列は標的対立遺伝子に対応し、一方、非標的ポリヌクレオチド配列は非標的対立遺伝子に対応する。特定の実施態様において、標的ポリヌクレオチド配列は、標的遺伝子の調節領域(例えば、プロモーターまたはエンハンサーエレメント)をコードするDNA配列である。別の実施態様において、標的ポリヌクレオチド配列は、標的遺伝子によってコードされる標的mRNAである。
用語「インビトロ」とは、その技術的に認識された意味を有し、例えば、精製された試薬または抽出物、例えば、細胞抽出物、および典型的にはエクスビボの生きている細胞、例えば、不死化細胞、初代細胞、および細胞株を含む。また、用語「インビボ」とは、その技術的に認識された意味、例えば、生物体内の細胞を意味する。
本明細書において使用されるとき、用語「導入遺伝子」とは、策略によって細胞に挿入され、その細胞から生長する生物のゲノムの一部となるいずれかの核酸分子を意味する。このような導入遺伝子は、トランスジェニック生物に対して一部または全部が異種(すなわち、外来)の遺伝子を含むことができるか、生物の内在性遺伝子に相同な遺伝子を表すことができる。用語「導入遺伝子」とはまた、トランスジェニック生物、例えば動物において発現させるための、操作されたRNA前駆体の1つまたはそれ以上をコードする核酸配列、例えば、DNAから選択される1つまたはそれ以上を含む核酸分子を意味し、これは、トランスジェニック動物に対して一部または全部が異種、すなわち、外来であるか、またはトランスジェニック動物の内在性遺伝子に相同であるが、天然遺伝子とは異なる位置で動物のゲノムに挿入されるように設計されている。導入遺伝子は、1つまたはそれ以上のプロモーター、および選択された核酸配列の発現に必要なイントロンなどの他のDNAを含み、すべてが選択された配列に操作可能に結合されており、エンハンサー配列を含むことができる。
疾患または障害に「関与する」遺伝子には、その正常または異常な発現または機能が、該疾患もしくは障害または該疾患または障害の少なくとも1つの症状をもたらす、または引き起こす、といった遺伝子が含まれる。
本明細書において使用される用語「機能獲得型変異」とは、遺伝子によってコードされるタンパク質(すなわち、変異タンパク質)が、疾患または障害を引き起こすか、またはそれに関与するそのタンパク質(すなわち、野生型タンパク質)とは通常関連しない機能を獲得する、遺伝子におけるいずれかの変異を意味する。機能獲得型変異は、コードされるタンパク質の機能に変化をもたらす遺伝子におけるヌクレオチドの欠失、付加、または置換であり得る。一実施態様において、機能獲得型変異は、変異タンパク質の機能を変化させるか、他のタンパク質との相互作用を引き起こす。別の実施態様において、機能獲得型変異は、例えば、改変された変異タンパク質と正常な野生型タンパク質との相互作用によって、該正常な野生型タンパク質の低減または除去を引き起こす。
「標的対立遺伝子」は、発現が選択的に阻害または「サイレンシングされた」対立遺伝子(例えば、SNP対立遺伝子)である。このサイレンシングは、RNAサイレンシング、例えば、siRNAによって標的遺伝子または標的対立遺伝子のmRNAを切断することによって達成することができる。用語「非標的対立遺伝子」は、発現が実質的にサイレンシングされない対立遺伝子である。特定の実施態様において、標的対立遺伝子および非標的対立遺伝子は、同じ標的遺伝子に対応することができる。他の実施態様において、標的対立遺伝子は、標的遺伝子に対応するか、またはそれに関連し、非標的対立遺伝子は、非標的遺伝子に対応するか、またはそれに関連する。一実施態様において、標的対立遺伝子および非標的対立遺伝子のポリヌクレオチド配列は、1つまたはそれ以上のヌクレオチドが異なることがある。別の実施態様において、標的対立遺伝子および非標的対立遺伝子は、1つまたはそれ以上の対立遺伝子多型(例えば、1つまたはそれ以上のSNP)が異なることがある。別の実施態様において、標的対立遺伝子および非標的対立遺伝子は、100％未満の配列同一性を共有できる。
本明細書において使用される用語「多型」とは、異なるソースまたは対象から(ただし、同じ生物から)の同じ遺伝子配列を比較するときに同定または検出される遺伝子配列における多様性(例えば、1つまたはそれ以上のの欠失、挿入、または置換)を意味する。例えば、多型は、異なる対象からの同じ遺伝子配列を比較するときに同定され得る。このような多型の同定は、当該技術分野では日常的に行われており、その方法は、例えば、乳癌の点変異を検出するために使用される方法と同様である。同定は、例えば、対照のリンパ球から抽出されるDNAを用い、その後、多型領域に特異的なプライマーを用いて該多型領域を増幅することにより行うことができる。あるいは、多型は、同じ遺伝子の2つの対立遺伝子を比較する時に同定され得る。特定の実施態様において、多型は単一ヌクレオチド多型(SNP)である。
本明細書において、生物内の同じ遺伝子の2つの対立遺伝子間の配列における多様性を「対立遺伝子多型」と称する。特定の実施態様において、対立遺伝子多型は、SNP対立遺伝子に対応する。例えば、対立遺伝子多型は、SNPの2つの対立遺伝子間の一塩基多様性(single nucleotide variation)を含むことができる。多型はコード領域内のヌクレオチドにあることができるが、遺伝暗号の縮退により、アミノ酸配列の変化はコードされない。あるいは、多型配列、特定の位置で異なるアミノ酸をコードすることができるが、このアミノ酸おけるこの変化は、タンパク質の機能に影響を与えない。多型領域は、遺伝子の非コード領域にも見出されることがある。例示的な実施態様において、多型は、遺伝子のコード領域または遺伝子の非翻訳領域(例えば、5'UTRまたは3'UTR)にみられる。
本明細書において使用される用語「対立遺伝子頻度」とは、個体群における単一の遺伝子座での対立遺伝子(例えば、SNP対立遺伝子)の相対頻度の尺度(例えば、割合またはパーセンテージ)である。例えば、個体群が、それらの体細胞のそれぞれに、特定の染色体座位(およびその遺伝子座を占める遺伝子)の遺伝子座をn個保有していると、対立遺伝子の対立遺伝子頻度は、その対立遺伝子がその群内で占める遺伝子座の比率またはパーセンテージである。特定の実施態様において、対立遺伝子(例えば、SNP対立遺伝子)の対立遺伝子頻度は、サンプル集団において少なくとも10％(例えば、少なくとも15％、20％、25％、30％、35％、40％またはそれ以上)である。
本明細書において使用されるとき、用語「サンプル集団(sample population)」とは、統計的に有意な数の個体を含む個体群を意味する。例えば、サンプル集団は、50、75、100、200、500、1000またはそれ以上の個体を含むことができる。特定の実施態様において、サンプル集団は、少なくとも共通の疾患表現型(例えば、機能獲得型障害)または変異(例えば、機能獲得型変異)に関して共有する個体を含むことができる。
本明細書において使用されるとき、用語「ヘテロ接合性」とは、特定の遺伝子座(例えば、SNP)においてヘテロ接合的(例えば、2つまたはそれ以上の異なる対立遺伝子を含む)である群内の個体の比率を意味する。ヘテロ接合性は、当業者によく知られている方法でサンプル集団について計算することができる。
本明細書において使用される用語「ポリグルタミンドメイン」とは、ペプチド結合に結合された連続するグルタミン残基からなるタンパク質のセグメントまたはドメインを意味する。一実施態様において、連続する領域は、少なくとも5個のグルタミン残基を含む。
本明細書において使用される用語「伸長ポリグルタミンドメイン」または「伸長ポリグルタミンセグメント」とは、ペプチド結合によって結合された少なくとも35個の連続するグルタミン残基を含むタンパク質のセグメントまたはドメインを意味する。このような伸長セグメントは、本明細書に記載のポリグルタミン障害にに苦しんでいる対象では、その対象が顕性症状を示しているか否かにかかわらず見られる。
本明細書において使用される用語「トリヌクレオチド反復」または「トリヌクレオチド反復領域」とは、特定のトリヌクレオチド配列の連続する反復からなる核酸配列のセグメントを意味する。一実施態様において、トリヌクレオチド反復は、少なくとも5個の連続するトリヌクレオチド配列を含む。例示的なトリヌクレオチド配列は、CAG、CGG、GCC、GAA、CTGおよび／またはCGGを含むが、これらに限定されない。
本明細書において使用される用語「トリヌクレオチド反復疾患」とは、遺伝子内に位置する伸長トリヌクレオチド反復領域を特徴とするあらゆる疾患または障害を意味し、伸長トリヌクレオチド反復領域は疾患または障害の原因因子である。トリヌクレオチド反復疾患の例としては、脊髄小脳失調症12型、脊髄小脳失調症8型、脆弱Ｘ症候群、脆弱XE精神遅滞、フリートライヒ運動失調症および筋緊張性ジストロフィーがあるが、これらに限定されない。本発明による処置のための例示的なトリヌクレオチド反復疾患は、遺伝子のコード領域の5'末端の伸長トリヌクレオチド反復領域を特徴とするか、またはそれによって起こされるものであり、その遺伝子は、疾患または障害を引き起こす、またはその原因となる変異タンパク質をコードする。変異がコード領域に関連していない特定のトリヌクレオチド疾患、例えば脆弱性X症候群は、RNAiによって標的とされる適切なmRNAが存在しないため、本発明の方法論による処置に適さない可能性がある。対照的に、フリートライヒ運動失調症のような疾患は、原因となる変異がコード領域内ではない(すなわち、イントロン内にある)ものの、変異が例えばmRNA前駆体(例えば、プレスプライスされたmRNA前駆体)内にあり得るため、本発明の方法論による処置に適していると考えられる。
「細胞または生物における遺伝子の機能を考察する」という表現は、そこから生じる発現、活性、機能または表現型を考察または研究することを意味する。
本明細書において使用されるとき、用語「RNAサイレンシング剤」とは、標的遺伝子の発現を阻害または「サイレンシング」できるRNAを意味する。特定の実施態様において、RNAサイレンシング剤は、転写後サイレンシングメカニズムを介して、mRNA分子の完全なプロセシング(例えば、完全な翻訳および／または発現)を防止することができる。RNAサイレンシング剤は、小さな(<50b.p.)、非コードRNA分子、例えば、対の鎖を含むRNA二重鎖、およびそのような小さな非コードRNAが生成され得る前駆体RNAを含む。例示的なRNAサイレンシング剤は、siRNA、miRNA、siRNA-様二重鎖、shRNA、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ギャップマー分子、および二重機能のオリゴヌクレオチドならびにこれらの前駆体を含む。一実施態様において、RNAサイレンシング剤は、RNA干渉を誘導することができる。別の実施態様において、RNAサイレンシング剤は、翻訳抑制を媒介することができる。
本明細書において使用されるとき、用語「希少ヌクレオチド」とは、稀に現れる天然に存在するヌクレオチドを意味し、まれに発生する天然に存在するデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド、例えば、グアノシン、アデノシン、シトシン、またはウリジンでない天然に存在するリボヌクレオチドを含む。希少ヌクレオチドの例として、イノシン、1-メチルイノシン、シュードウリジン、5,6-ジヒドロウリジン、リボチミジン、2N-メチルグアノシンおよび2,2N,N-ジメチルグアノシンを含むが、これらに限定されない。
操作されたRNA前駆体または操作された核酸分子における用語「操作された」とは、前駆体または分子が自然界に存在しないことを示しており、この前駆体または分子の核酸配列のすべてまたは一部が人間によって作成または選択されていることを意味する。一旦作成または選択された配列は、細胞内でのメカニズムによって複製、翻訳、転写されるか、またはその他の方法によって操作される。こうして、操作された核酸分子を含む導入遺伝子から細胞内で生成されるRNA前駆体は、操作されたRNA前駆体である。
本明細書において使用されるとき、用語「マイクロRNA」(「miRNA」)とは、当該技術分野では「小分子RNA」(「stRNA」)とも称されており、(例えば、ウイルス、哺乳類、または植物のゲノムによって)遺伝子学的にコードされ、RNAサイレンシングを指示または媒介することができる小さな(10～50個のヌクレオチド)RNAを意味する。「miRNA障害」とは、miRNAの異常な発現または活性を特徴とする疾患または障害を意味する。
本明細書において使用されるとき、用語「二重機能性オリゴヌクレオチド」とは、式T-L-μ［式中、TはmRNA標的部分であり、Lは結合部分であり、そして、μはmiRNA動員部分である］で示されるRNAサイレンシング剤を意味する。本明細書において使用されるとき、用語「mRNA標的部分(mRNA targeting moiety)」、「標的部分(targeting moiety)」、「mRNA標的部分(mRNA targeting portion)」または「標的部分(targeting portion)」とは、サイレンシングのために選択または標的とされるmRNAの一部または領域に対して十分なサイズと十分な相補性を有する(すなわち、この部分が標的mRNAを捕捉するのに十分な配列を有する)二重機能性オリゴヌクレオチドのドメイン、部分または領域を意味する。本明細書において使用されるとき、用語「結合部分(linking moiety)」または「結合部分(linking portion)」とは、mRNAを共有結合で接合または結合するRNAサイレンシング剤のドメイン、部分または領域を意味する。
本明細書において使用されるとき、RNAサイレンシング剤、例えば、siRNAまたはRNAサイレンシング剤の「アンチセンス鎖」という用語とは、サイレンシングのために標的とされる遺伝子のmRNAの約10～50個のヌクレオチド、例えば、約15～25個、15～30個、16～25個、18～23個または19～22個のヌクレオチドのセクションに実質的に相補的な鎖を意味する。アンチセンス鎖または第一鎖は、直接な標的-特異的なサイレンシングのための所望の標的mRNA配列に十分に相補的な配列、例えば、RNAiマシナリーまたは操作(RNAi干渉)によって所望の標的mRNAの破壊を誘発するのに十分な相補性を有するか、または所望の標的mRNAの翻訳抑制を誘発するのに十分な相補性を有する配列を有する。
RNAサイレンシング剤、例えばsiRNAまたはRNAサイレンシング剤の「センス鎖」または「第二鎖」という用語は、アンチセンス鎖または第一鎖に相補的な鎖を意味する。アンチセンス鎖およびセンス鎖は、第一鎖または第二鎖とも称され、第一鎖または第二鎖は標的配列に相補性を有し、第二鎖または第一鎖はそれぞれ、該第一鎖または該第二鎖に相補性を有する。miRNA二重鎖中間体またはsiRNA-様二重鎖は、サイレンシングのために標的とされる遺伝子のmRNAの約10～50個のヌクレオチドのセクションに十分な相補性を有するmiRNA鎖、およびmiRNA鎖と二重鎖を形成するのに十分な相補性を有するmiRNA鎖を含む。
本明細書において使用されるとき、用語「ガイド鎖」とは、RISC複合体に入り、標的mRNAの切断を指示するRNAサイレンシング剤の鎖、例えば、siRNA二重鎖またはsiRNA配列のアンチセンス鎖を意味する。
本明細書において使用されるとき、RNAサイレンシング剤(例えば、shRNAのステム)の二重領域の非対称における「非対称」という用語とは、二重鎖の一方の鎖の5'末端が相補的な鎖の5'末端よりも頻繁に一時的な不対の状態、例えば一本鎖の状態になるような、RNAサイレンシング剤の末端間(例えば、第一鎖またはステム部分の末端ヌクレオチドと、対向する第二鎖またはステム部分の末端ヌクレオチドとの間)の結合強度または塩基対合の強度の不均等を意味する。この構造的な違いにより、二重鎖の一方の鎖が優先的にRISC複合体に組み込まれることが決まる。5'末端が相補的な鎖と緊密に対になっていない鎖の方が優先的にRISCに組み込まれ、RNAiを媒介することになる。
本明細書において使用されるとき、用語「結合強度」または「塩基対強度」とは、オリゴヌクレオチド二重鎖(例えば、siRNA二重鎖)の対向する鎖上のヌクレオチド(またはヌクレオチドアナログ)の対の間の、主に該ヌクレオチド(またはヌクレオチドアナログ)間のH結合、ファンデルワールス相互作用などに起因する相互作用の強度を意味する。
本明細書において使用されるとき、アンチセンス鎖の5'末端における「5'末端」とは、5'末端ヌクレオチド、例えばアンチセンス鎖の5'末端の1～約5個のヌクレオチドの領域を意味する。本明細書において使用されるとき、センス鎖の3'末端における「3'末端」は、相補的なアンチセンス鎖の5'末端のヌクレオチドと相補的な領域、例えば、1～約5個のヌクレオチドの領域を意味する。
本明細書において使用されるとき、用語「不安定化ヌクレオチド」とは、塩基対が従来の塩基対(すなわち、ワトソン-クリック塩基対)よりも低い結合強度を有するように第二のヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログと塩基対を形成することができる第一のヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログを意味する。特定の実施態様において、不安定化ヌクレオチドは、第二のヌクレオチドとミスマッチ塩基対を形成することができる。他の実施態様において、不安定化ヌクレオチドは、第二のヌクレオチドとゆらぎ塩基対を形成することができる。さらに他の実施態様において、不安定化ヌクレオチドは第二のヌクレオチドとあいまいな塩基対を形成することができる。
本明細書において使用されるとき、用語「塩基対」とは、オリゴヌクレオチド二重鎖(例えば、RNAサイレンシング剤の鎖および標的mRNA配列によって形成される二重鎖)の対向する鎖上のヌクレオチド(またはヌクレオチドアナログ)の対の間の、主に該ヌクレオチド(またはヌクレオチドアナログ)の間のH結合、ファンデルワールス相互作用などに起因する相互作用を意味する。本明細書において使用されるとき、「結合強度」または「塩基対強度」という用語は、塩基対の強度を意味する。
本明細書において使用されるとき、用語「ミスマッチ塩基対」とは、非相補的なまたは非ワトソン・クリック塩基対、例えば、正常な相補的なG:C、A:TまたはA:U塩基対でないものからなる塩基対を意味する。本明細書において使用されるとき、用語「あいまいな塩基対」(非差別的な塩基対とも知られている)とは、ユニバーサルヌクレオチドによって形成される塩基対を意味する。
本明細書において使用されるとき、用語「ユニバーサルヌクレオチド」(「ニュートラルヌクレオチド」としても知られている)は、塩基対を形成する際に相補的なポリヌクレオチド上の塩基間を有意に差別しない塩基(「ユニバーサル塩基」または「ニュートラル塩基」)を有するヌクレオチド(例えば、特定の不安定化ヌクレオチド)を含む。ユニバーサルヌクレオチドは、主に疎水性の分子で、スタッキング相互作用のため、逆平行二重核酸(例えば、二本鎖DNAまたはRNA)に効率的に詰め込むことができる。ユニバーサルヌクレオチドの塩基部分は、典型的には、窒素含有芳香族ヘテロ環式部分を含む。
本明細書において使用されるとき、「十分な相補性」または「十分な程度の相補性」という用語は、RNAサイレンシング剤が、それぞれ所望の標的RNAに結合して、標的mRNAのRNAサイレンシングを誘発するのに十分な配列(例えば、アンチセンス鎖、mRNA標的部分またはmiRNA動員部分において)を有することを意味する。
本明細書において使用されるとき、用語「翻訳抑制」とは、mRNAの翻訳の選択的阻害を意味する。自然な翻訳抑制は、shRNA前駆体から切断されたmiRNAを介して進行する。RNAiと翻訳抑制の両方は、RISCよって媒介される。RNAiと翻訳抑制の両方は、自然に起こるものであるか、人間の手によって開始して、例えば、標的遺伝子の発現をサイレンシングすることができる。
本発明の様々な方法論は、値、レベル、特徴、特性、プロパティなどを、本明細書では交換可能に「適切な対照」と称される「適当な対照」と比較する工程を含む。「適当な対照」または「適切な対照」は、比較の目的に有用な、当業者になじみのある対照または基準である。一実施態様において、「適当な対照」または「適切な対照」は、本明細書に記載されているように、RNAi方法論を実行する前に決定される値、レベル、特徴、特性などである。例えば、本発明のRNAサイレンシング剤を細胞または生物に導入する前に、転写率、mRNAレベル、翻訳率、タンパク質レベル、生物学的活性、細胞の特性および性質、遺伝子型、表現型などを決定することができる。別の実施態様において、「適当な対照」または「適切な対照」は、細胞または生物、例えば、正常な形質を示す対照または正常な細胞または生物において決定される値、レベル、特徴、特性、性質などである。さらに別の実施態様において、「適当な対照」または「適切な対照」は、あらかじめ定義された値、レベル、特徴、特性、性質などである。
特に定義されていない限り、本明細書で使用されているすべての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野の通常の技術者によって一般的に理解されているのと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと同様または同等の方法および材料を本発明の実施または試験に使用することができるが、適当な方法および材料を以下に説明する。本明細書に記載のすべての出版物、特許出願、特許、およびその他の参考文献は、その全体が引用により包含される。矛盾が生じた場合は、定義を含めて本明細書が優先される。また、材料、方法、および実施例は例示に過ぎず、限定を意図したものではない。
本出願のさまざまな態様は、以下のサブセクションでさらに詳細に説明する。
I. C9ORF72標的配列
いくつかの実施態様において、本出願のRNAサイレンシング剤は、C9ORF72 mRNA分子における選択的および非選択的領域を標的とするように設計される。特定のC9ORF72 mRNAは、RANペプチドをコードし得る。
本出願は、1つまたはそれ以上のC9ORF72 mRNA内の領域およびそれらの対応するタンパク質を標的とする。二本鎖RNA(siRNA)の一方の鎖は、C9ORF72mRNA内の標的配列と相補的である。対象または細胞にsiRNAを導入すると、siRNAは部分的に巻き戻され、C9ORF72 mRNA内の標的領域に部位特異的な方式で結合し、mRNAヌクレアーゼを活性化する。このヌクレアーゼがC9ORF72 mRNAを切断することで、C9ORF72タンパク質またはRANペプチドの翻訳が停止する。細胞は、部分的に消化されたmRNAを取り除くことで、翻訳を阻止し、または細胞は部分的に翻訳されたタンパク質を消化する。特定の実施態様において、C9ORF72タンパク質またはRANペプチド発現は、対象または細胞において、約30％～50％、または約30％～40％低減する。
本出願の実施態様において、本出願のRNAサイレンシング剤は、以下の表1～5に記載されている1つまたはそれ以上の遺伝子領域標的配列の転写産物を標的できる。特定の例示的な実施態様において、本出願のRNAサイレンシング剤は、ヒトC9ORF72遺伝子の018、028、031、048、052、056、127、129、136、143、148、149、150、180、182、187、191、202、211、214、215、219、226、237、241、244、250、251、272、275、282、288、291、294、305、および306からなる群から選択される遺伝子位置に記載されている1つまたはそれ以上の標的配列の転写産物を標的できる。ヒトC9ORF72遺伝子の特に例示的な標的配列は、214位(5' TGCTCTCACAGTACTCGCTGAGGGTGAACAAGAAAAGACCTGATA 3')および243位(5' AAGAAAAGACCTGATAAAGATTAACCAGAAGAAAACAAGGAGGGA 3')で見出され得る。各標的配列のゲノム配列は、例えば、NCBIによって維持されている一般に利用可能なデータベースで見出され得る。
本願のさまざまな態様は、以下のサブセクションでさらに詳細に説明される。
II. siRNAの設計
いくつかの実施態様において、siRNAは以下のように設計される。まず、標的遺伝子(例えば、C9ORF72遺伝子)の一部、例えば、表1～5に記載の標的配列の1つまたはそれ以上を選択する。これらの位置でのmRNAの切断により、対応するC9ORF72タンパク質またはRANペプチドの翻訳を排除するべきである。センス鎖は、標的配列に基づいて設計された。(表1～5を参照のこと)。通常、この部分(および対応するセンス鎖またはアンチセンス鎖)は、約15～25個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施態様において、この部分(および対応するセンス鎖)は、21、22または23個のヌクレオチドを含む。しかし、当業者は、19未満ヌクレオチド長または25を超えるヌクレオチド長を有するsiRNAもRNAiを媒介するように機能することができることを理解するであろう。したがって、そのような長さのsiRNAも、RNAiを媒介する機能を保持していれば、本発明の範囲内である。より長いRNAi剤は、特定の哺乳動物の細胞内でのインターフェロンまたはPKR反応を誘発することが実証されており、これは望ましくない可能性がある。通常、本出願のRNAi剤は、PKR応答を誘発しない(すなわち、十分に短い長さである)。しかし、より長いRNAi物質は、例えば、PKR反応を起こすことができない細胞型、またはPKR反応が代替の手段によって下方制御されるか、もしくは弱めらる、といった状況では有用であり得る。
標的遺伝子がセンス方向にある場合、センス鎖の配列は、標的配列が基本的に鎖の中央にあるように設計される。標的配列を中心から外れた位置に移動させると、場合によっては、siRNAによる切断の効率が低下することがある。そのような組成物、すなわち、効率の低い組成物は、野生型mRNAのオフ-サイレンシングが検出された場合に使用するのが望ましい場合がある。
アンチセンス鎖は、ルーチン的にはセンス鎖と同じ長さであり、相補的なヌクレオチドを含む。一実施態様において、該鎖は、完全に相補的であり、すなわち、該鎖は、整列またはアニールしたときに平滑末端になる。別の実施態様において、該鎖は、1-、2-、3-、4-、5-、6-または7-ヌクレオチド突出部が生成される、例えば、センス鎖の3'末端がアンチセンス鎖の5'末端よりも1、2、3、4、5、6、または7個のヌクレオチドを延長するか、および／またはアンチセンス鎖の3'末端がセンス鎖の5'末端よりも1、2、3、4、5、6、または7個のヌクレオチドを延長するような整列またはアニールを含む。突出部は、標的遺伝子配列(またはその補体)に対応するヌクレオチドを含むことができるか、それからなり得る。あるいは、突出部は、デオキシリボヌクレオチド、例えば、dTs、またはヌクレオチドアナログ、または他の適当な非ヌクレオチド材料を含むことができるか、それらからなり得る。
アンチセンス鎖のRISCへの進入を容易にすることで、(標的切断およびサイレンシングの効率を高める、または改善する)ために、センス鎖の5'末端およびアンチセンス鎖の3'末端の間の塩基対強度が変動されることがあり、例えば、名称が“Methods and Compositions for Controlling Efficacy of RNA Silencing”(2003年6月2日に提出)である米国特許7,459,547、7,772,203および7,732,593、ならびに名称が“Methods and Compositions for Enhancing the Efficacy and Specificity of RNAi”(2003年6月2日に提出)である米国特許8,309,704、7,750,144、8,304,530、8,329,892および8,309,705に詳しく記載されているように和らげるか、低減でき、これらの内容は本引用により本明細書に包含される。本出願のこれらの態様の一実施態様において、第一のまたはアンチセンス鎖の5'端と第二のまたはセンス鎖の3'端との間のG：C塩基対が、第一のまたはアンチセンス鎖の3'端と第二のまたはセンス鎖の5'端との間のG：C塩基対よりも少ないため、塩基対強度が低くなっている。別の実施態様において、第一のまたはアンチセンス鎖の5'末端と第二のまたはセンス鎖の3'末端との間に少なくとの1つのミスマッチ塩基対があるため、塩基対強度が低くなっている。特定の例示的な実施態様において、ミスマッチ塩基対は、G:A、C:A、C:U、G:G、A:A、C:CおよびU:Uからなる群から選択される。別の実施態様において、第一のまたはアンチセンス鎖の5'末端と第二のまたはセンス鎖の3'末端との間に少なくとも1つのゆらぎ塩基対、例えば、G:Uがあるため、塩基対強度が低くなっている。別の実施態様において、少なくとも1つの塩基対が希少ヌクレオチド、例えば、イノシン(I)を含んでいるため、塩基対強度が低くなっている。特定の例示的な実施態様において、塩基対は、I:A、I:UおよびI:Cからなる群から選択される。さらに別の実施態様において、少なくとも1つの塩基対が修飾ヌクレオチドを含んでいるため、塩基対強度が低くなっている。特定の例示的な実施態様において、修飾ヌクレオチドは、2-アミノ-G、2-アミノ-A、2,6-ジアミノ-G、および2,6-ジアミノ-Aからなる群から選択される。
表1～5に示されるC9ORF72標的配列を標的とするのに適したsiRNAの設計について、以下に詳細に説明する。siRNAは、C9ORF72遺伝子に見出されるいずれかの他の標的配列に対して、上記の例示的な教示に従って設計することができる。さらに、本技術は、いずれかの他の標的配列、例えば、非疾患原因の標的配列を標的とすることにも適用可能である。
siRNAがmRNA(例えば、C9ORF72 mRNA)を破壊する有効性を検証するために、DrosophilaベースのインビトロmRNA発現システムにおいて、siRNAをcDNA(例えば、C9ORF72 cDNA)と共にインキュベートすることができる。32Pで放射性標識された、新しく合成されたmRNA(例えば、C9ORF72 mRNA)は、アガロースゲルでオートラジオグラフィーによって検出される。切断されたmRNAの存在は、mRNAヌクレアーゼ活性を示す。適当な対照は、siRNAの省略を含む。あるいは、対照のsiRNAとしては、選択されるsiRNAと同じヌクレオチド組成を有するが、適切な標的遺伝子に対して有意な配列相補性を有しないものが選択される。このような陰性対照は、選択されるsiRNAのヌクレオチド配列を無作為にスクランブリングすることによって設計でき、相同性検索を実行して、陰性対照が適切なゲノム内のいずれかの他の遺伝子に対して相同性を欠いていることを確認できる。さらに、陰性対照のsiRNAは、1つまたはそれ以上の塩基ミスマッチを配列に導入することによって設計できる。
III. RNAi剤
本出願は、例えば、上記のように設計されたsiRNA分子を含む。本出願のsiRNA分子は、化学的に合成できるか、DNA鋳型からインビトロで、もしくは例えばshRNAからインビボで転写させることができるか、または、組換えヒトDICER酵素を用いて、インビトロで転写させたdsRNA鋳型を切断して、例えば、RNAiを媒介する20-、21-または23-bpの二重鎖RNAのプールにすることができる。siRNA分子は、当該技術分野で知られているいずれかの方法を用いて設計できる。
一態様において、RNAi物質が干渉性リボ核酸、例えば、上記のsiRNAまたはshRNAである代わりに、RNAi剤は、上記のように、干渉性リボ核酸、例えば、shRNAをコードすることができる。言い換えれば、RNAi剤は干渉性リボ核酸の転写鋳型であり得る。したがって、本発明のRNAi剤は、小ヘアピンRNA(shRNA)、およびshRNAを発現するように操作された発現コンストラクトも含むことができる。shRNAの転写は、ポリメラーゼIII(pol III)プロモーターで開始され、4-5-チミン転写終結部位の2位で終結すると考えられている。shRNAは、発現すると、3'UU-突出部を有するステム-ループ構造に折り畳まれ、その後、これらのshRNAの末端が処理されて、約21～23個のヌクレオチドのsiRNA様分子に変換されると考えられている(Brummelkamp et al., 2002; Lee et al., 2002, Supra; Miyagishi et al., 2002; Paddison et al., 2002, supra; Paul et al., 2002, supra; Sui et al., 2002 supra; Yu et al., 2002, supra. shRNAの設計および使用に関する詳細は、インターネットの次のアドレスで見出され得る: katandin.cshl.org:9331/RNAi/docs/BseRI-BamHI_Strategy.pdf および katandin.cshl.org:9331/RNAi/docs/Web_version_of_PCR_strategy1.pdf)。
本出願の発現コンストラクトは、適切な発現システムでの使用に適したいずれかのコンストラクトを含み、当該技術分野で知られているレトロウイルスベクター、線形発現カセット、プラスミドおよびウイルスまたはウイルス由来のベクターを含むが、これらに限定されない。このような発現コンストラクトは、1つまたはそれ以上の誘導性プロモーター、RNA Pol IIIプロモーターシステム、例えば、U6 snRNAプロモーターまたはH1 RNAポリメラーゼIIIプロモーター、または当該技術分野で知られている他のプロモーターを含むことができる。コンストラクトは、siRNAの片方または両方の鎖を含むことができる。両方の鎖を発現する発現コンストラクトはまた、両方の鎖を結合するループ構造を含むこともできるか、または各鎖が同じコンストラクト内で別々のプロモーターから別々に転写されることもある。また、各鎖は、別々の発現コンストラクトから転写されることもある (Tuschl, T., 2002, Supra) 。
合成siRNAは、カチオンリポソームトランスフェクションやエレクトロポレーションを含めた、当技術分野で知られている方法で細胞内に送達することができる。標的遺伝子(例えば、C9ORF72遺伝子)のより長期的な抑制を得るために、また特定の状況下での送達を容易にするために、組換えDNAコンストラクトから細胞内で1つまたはそれ以上のsiRNAを発現させることができる。組換えDNAコンストラクトから細胞内でsiRNA二重鎖を発現させ、細胞内でより長期的な標的遺伝子の抑制を可能にするこのような方法としては、機能的な二本鎖siRNAを発現することができる哺乳類Pol IIIプロモーターシステム(例えば、H1またはU6／snRNAプロモーターシステム(Tuschl，T．2002, supra)；(Bagella et al., 1998； Lee et al., 2002, supra； Miyagishi et al., 2002, supra； Paul et al., 2002, supra； Yu et al., 2002, supra； Sui et al., 2002, supra) などが当技術分野で知られている。RNA Pol IIIによる転写終結は、DNA鋳型における4つの連続するT残基の実行で発生し、これは、特定の配列でsiRNA転写産物を終結させるメカニズムを提供する。siRNAは、標的遺伝子の配列に対して5'-3'および3'-5'の配向に相補的であり、siRNAの二本の鎖は、同じコンストラクトで発現させることも、別々のコンストラクトで発現させることもできる。H1またはU6 snRNAプロモーターによって駆動され、細胞内で発現するヘアピンsiRNAは、標的遺伝子の発現を阻害することができる(Bagella et al., 1998; Lee et al., 2002, supra; Miyagishi et al., 2002, supra; Paul et al., 2002, supra; Yu et al., 2002), supra; Sui et al., 2002, supra).。また、T7プロモーターの制御下にあるsiRNA配列を含むコンストラクトは、細胞内でT7 RNAポリメラーゼを発現するベクターとコトランスフェクトすると、機能的なsiRNAを作ることができる(Jacque et al., 2002, supra)。単一のコンストラクトは、同一遺伝子または複数の遺伝子を標的とするsiRNAをコードする複数の配列、例えば、C9ORF72をコードする複数の配列を含むことができ、別々のPolIIIプロモーター部位によって駆動することができる。
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Figure 2022528487000043
動物細胞は、動物の発育中の転写後または翻訳後のレベルで遺伝子発現を調節することができる、マイクロRNA(miRNA)と称される約22個のヌクレオチドの一連の非コードRNAを発現する。miRNAの一般的な特徴の一つは、おそらくRNase III型酵素であるDicerまたはそのホモログによって約70個のヌクレオチドの前駆体RNAのステムループから全てが切り取られることである。miRNA前駆体のステム配列を標的mRNAと相補的な配列で置換することにより、操作された前駆体を発現するベクターコンストラクトを用いて、哺乳類細胞内での特定のmRNA標的に対してRNAiを開始するsiRNAを産生することができる(Zeng et al., 2002, supra)。ポリメラーゼIIIプロモーターを含むDNAベクターによって発現させると、マイクロRNAで設計されたヘアピンは、遺伝子発現をサイレンシングすることができる(McManus et al., 2002, supra)。多型を標的とするマイクロRNAはまた、siRNA媒介遺伝子-サイレンシングが存在しない場合に、変異タンパク質の翻訳をブロッキングするのにも有用である。このような適用は、例えば、設計されたsiRNAが野生型タンパク質のオフ-標的サイレンシング(off-target silencing)を引き起こすといった状況で有用である。
ウイルス媒介送達メカニズムはまた、例えば、RNA Pol IIプロモーター転写制御下でsiRNAを保有する組換えアデノウイルスを生成することにより、siRNAの発現を介して標的遺伝子の特異的サイレンシングを誘導するのに使用することもできる(Xia et al., 2002, supra)。これらの組換えアデノウイルスをHeLa細胞に感染させることにより、内因性の標的遺伝子の発現を低下させることができる。組換えアデノウイルスベクターを、siRNAの標的遺伝子を発現しているトランスジェニックマウスに注射することにより、標的遺伝子の発現のインビボでの低下をもたらす。同上(Id.)。動物モデルにおいて、全胚エレクトロポレーションにより、着床後のマウス胚に合成siRNAを効率的に送達できる(Calegari et al., 2002)。成体マウスにおいて、siRNAの効率的な送達は、「高圧」送達技術である、尾静脈を介した動物への大量のsiRNA含有溶液の迅速な注射(5秒以内)によって達成することができる(Liu et al., 1999, supra； McCaffrey et al., 2002, supra； Lewis et al., 2002)。また、ナノ粒子およびリポソームは、siRNAを動物へ送達するのに使用することができる。特定の例示的な実施態様において、組換えアデノ随伴ウイルス(rAAVs)およびそれらの関連するベクターは、1つまたはそれ以上のsiRNAを細胞、例えば、神経細胞(例えば、脳細胞)へ送達するのに使用することができる(米国特許出願2014/0296486、2010/0186103、2008/0269149、2006/0078542および2005/0220766)。
本出願の核酸組成物は、未修飾siRNAおよび、当技術分野で知られている修飾siRNAの両方、例えば架橋siRNA誘導体、または、例えばそれらの3'または5'末端に結合された非ヌクレオチド部分を有する誘導体などの両方を含むものである。この方法でsiRNA誘導体を修飾することにより、対応するsiRNAと比較して、得られるsiRNA誘導体の細胞取込を改善するか、得られるsiRNA誘導体の細胞標的活性を向上させることができ、対応するsiRNAと比較して細胞内でsiRNA誘導体を追跡するのに有用であるか、siRNA誘導体の安定性を改善する。
本明細書に記載されているように、細胞または生物全体に導入される操作されたRNA前駆体は、所望のsiRNA分子の作製につながる。このようなsiRNA分子は、RNAi経路の内因性タンパク質コンポーネントと結合して、切断および破壊のための特定のmRNA配列に結合し、それを標的とする。これにより、操作されたRNA前駆体から生成されたsiRNAによって標的とされるmRNAは細胞または生物から枯渇し、これは、そのmRNAによってコードされるタンパク質の細胞または生物における濃度が低減する。RNA前駆体は、単独にdsRNAのどちらか一方の鎖をコードするか、またはRNAヘアピンループ構造の全ヌクレオチド配列をコードする核酸分子が一般的である。
本発明の核酸組成物はコンジュゲートされていなくてよくまたは組成物の性質、例えば、吸収、有効性、バイオアベイラビリティおよび／または半減期などの薬物動態パラメータを増強するために、ナノ粒子などの他の部分にコンジュゲートさせ得る。コンジュゲーションは、当分野で知られる方法により、例えば、Lambert et al., Drug Deliv. Rev.: 47(1), 99-112 (2001)(ポリアルキルシアノアクリレート(PACA)ナノ粒子に充填された核酸を記載); Fattal et al., J. Control Release 53(1-3):137-43 (1998)(ナノ粒子に結合した核酸を記載)); Schwab et al., Ann. Oncol. 5 Suppl. 4:55-8 (1994)(挿入剤、疎水性基、ポリカチオンまたはPACAナノ粒子に結合した核酸を記載)；およびGodard et al., Eur. J. Biochem. 232(2):404-10 (1995)(ナノ粒子に結合した核酸を記載)を使用して、達成され得る。
本出願の核酸分子はまた、当該技術分野で知られているいずれかの方法を用いて、標識もされ得る。例えば、核酸組成物は、フルオロフォア、例えば、Cy3、フルオレセイン、またはローダミンで標識され得る。標識は、キット、例えば、SILENCERTM siRNA標識キット(Ambion)を用いて実施され得る。さらに、siRNAは、例えば、3H、32Pまたは他の適切な同位体を用いて放射性標識され得る。
さらに、RNAiは少なくとも1つの一本鎖RNA中間体を介して進行すると考えられているため、当業者は、ss-siRNA(例えば、ds-siRNAのアンチセンス鎖)も、本明細書に記載されているように設計(例えば、化学合成のために)、生成(例えば、酵素的に生成)または発現(例えば、ベクターまたはプラスミドから)することができ、請求された方法論に従って利用することができることを理解するであろう。さらに、無脊椎動物において、RNAiのエフェクターとして作用する長いdsRNA(例えば、約100～1000ヌクレオチド長、例えば、約200～500ヌクレオチド長、例えば、約250、300、350、400または450ヌクレオチド長のdsRNA)によって、RNAiを効果的に誘発することができる(Brondani et al., Proc Natl Acad Sci USA. 2001 Dec. 4； 98(25):14428-33. Epub 2001 Nov. 27.)。
IV. 抗C9ORF72 RNAサイレンシング剤
一実施態様において、本出願は、新規な抗C9ORF72 RNAサイレンシング剤(例えば、siRNAおよびshRNA)、該RNAサイレンシング剤の製造方法、およびC9ORF72タンパク質のRNAサイレンシングのために該改善されたRNAサイレンシング剤(またはその一部)を使用するための方法(例えば、研究および／または治療的方法)を提供する。該RNAサイレンシング剤は、ヘテロ接合の単一ヌクレオチド多型に十分に相補的であることでRNA媒介サイレンシングメカニズム(例えば、RNAi)を媒介するアンチセンス鎖(またはその一部)を含む。また、C9ORF72アンチセンス転写産物をサイレンシングするための第二タイプのRNAサイレンシング剤(その一部)も提供される。該第二タイプのRNAサイレンシング剤は、センス鎖(またはその一部)を含み、ここで、センス鎖は、RNA媒介サイレンシングメカニズムを媒介するアンチセンス転写物に対して十分な相補性を有する。
特定の実施態様において、以下の特性の1つまたはいずれかの組み合わせを有するsiRNA化合物が提供される：(1)完全に化学的に安定化されている(すなわち、未修飾2'-OH残基がない)；(2)非対称性；(3)11～16塩基対の二重鎖；(4)化学修飾ヌクレオチドの交互のパターン(例えば、2'-フルオロ修飾および2'-メトキシ修飾)；および(5)5～8塩基の一本鎖で完全にホスホロチオエート化テイル。ホスホロチオエート修飾の数は、種々の実施態様において合計6～17まで変動する。
特定の実施態様において、本明細書に記載のsiRNA化合物は、コレステロール、DHA、フェニルトロパン、コルチゾール、ビタミンA、ビタミンD、GalNac、およびガングリオシドを含むがこれらに限定されない、さまざまな標的剤にコンジュゲートすることができる。コレステロール修飾バージョンは、これまで使用されてきた化学的安定化パターン(例えば、プリン体はすべて修飾されているが、ピリミジン(purimidine)は修飾されていない)と比較して、幅広い種類の細胞型(例えば、HeLa、神経細胞、肝細胞、栄養芽細胞)において、インビトロでの有効性が5～10倍改善した。
上述および本明細書に記載の構造性質を有する本出願の特定の化合物は、「hsiRNA-ASP」(高度な安定化パターンを特徴とする疎水性修飾低分子干渉RNA)と称し得る。さらに、このhsiRNA-ASPパターンは、脳、脊髄を通じて肝臓、胎盤、腎臓、脾臓、およびいくつかの他の組織への送達の劇的改善を示し、治療介入のために利用可能である。
。
肝臓で、hsiRNA-ASPは内皮およびクッパー細胞に特異的に送達されるが、肝細胞にはされず、この化学修飾パターンを、GalNacコンジュゲートの競合的ではなく、補完的テクノロジーとする。
本出願の化合物は、以下の態様および実施態様で説明することができる。
第一態様において、本明細書では、5'末端および3'末端を有し、標的に対して相補性を有する、少なくとも16個の連続するヌクレオチドのオリゴヌクレオチドであって、(1)オリゴヌクレオチドは、2'-メトキシ-リボヌクレオチドおよび2'-フルオロ-リボヌクレオチドを交互に含み；(2)5'末端から2位および14位のヌクレオチドは、2'-メトキシ-リボヌクレオチドではなく；(3)ヌクレオチドは、ホスホジエステルまたはホスホロチオエート結合を介して結合され；そして(4)3'末端から1～6位、または3'末端から1～7位のヌクレオチドは、ホスホロチオエート結合を介して隣接するヌクレオチドに結合されている、オリゴヌクレオチドが提供される。
第二の態様において、本明細書では、第一のオリゴヌクレオチドおよび第二のオリゴヌクレオチドを含む二本鎖の化学修飾核酸であって、(1)第一のオリゴヌクレオチドは、本明細書に記載の(例えば、表1～5の標的配列の1つを含む)オリゴヌクレオチドであり；(2)第一のオリゴヌクレオチドの一部は、第二のオリゴヌクレオチドの一部と相補的であり；(3)第二のオリゴヌクレオチドは、2'-メトキシ-リボヌクレオチドおよび2'-フルオロ-リボヌクレオチドを交互に含み；(4)第二のオリゴヌクレオチドの3'末端から2位および14位のヌクレオチドは、2'-メトキシ-リボヌクレオチドであり；そして(5)第二のオリゴヌクレオチドのヌクレオチドは、ホスホジエステルまたはホスホロチオエート結合を介して結合されている、二本鎖の化学修飾核酸が提供される。
第三の態様において、本明細書では、構造：
X-A(-L-B-L-A)j(-S-B-S-A)r(-S-B)t-OR
［ここで、Xは、5'ホスフェート基であり；Aは、出現するごとに独立して、2'-メトキシ-リボヌクレオチドであり；Bは、出現するごとに独立して、2'-フルオロ-リボヌクレオチドであり；Lは、出現するごとに独立して、ホスホジエステルまたはホスホロチオエートリンカーであり；Sは、ホスホロチオエートリンカーであり；そして、Rは、水素およびキャッピング基(capping group)(例えば、アセチルなどのアシル)から選択され；jは、4、5、6または7であり；rは、2または3であり；そして、tは、0または1である］を有するオリゴヌクレオチドが提供される。
第四の態様において、本明細書では、第一のオリゴヌクレオチドおよび第二のオリゴヌクレオチドを含む二本鎖の化学修飾核酸であって、(1)第一のオリゴヌクレオチドは、第三の態様のオリゴヌクレオチドから選択され；(2)第一のオリゴヌクレオチドの一部は、第二のオリゴヌクレオチドの一部と相補的であり；そして、(3)第二のオリゴヌクレオチドは、構造:
C-L-B(-S-A-S-B)m'(-P-A-P-B)n'(-P-A-S-B)q'(-S-A)r'(-S-B)t'-OR
［ここで、Cは、疎水性分子であり；Aは、出現するごとに独立して、2'-メトキシ-リボヌクレオチドであり；Bは、出現するごとに独立して、2'-フルオロ-リボヌクレオチドであり；Lは、エチレングリコール、ホスホジエステル、およびホスホロチオエートの0～4の反復単位からなる群から選択される1つまたはそれ以上の部分を含むリンカーであり；Sは、ホスホロチオエートリンカーであり；Pは、ホスホジエステルリンカーであり；Rは、水素およびキャッピング基(例えば、アセチルなどのアシル)から選択され；m'は、0または1であり；n'は、4、5または6であり；q'は、0または1であり；r'は、0または1であり；そして、t'は、0または1である］を有する、二本鎖の化学修飾核酸が提供される。
a)抗C9ORF72 siRNA分子の設計
例示的な実施態様において、本出願のsiRNA分子は、センス鎖および相補的なアンチセンス鎖からなる二重鎖であり、アンチセンス鎖は、RNAiを媒介するC9ORF72 mRNAに対して十分な相補性を有する。また、センス鎖が、RNAiを媒介するC9ORF72アンチセンス鎖に対して十分な相補性を有するsiRNA分子が提供される。通常、siRNA分子は、約10～50またはそれ以上のヌクレオチド長を有し、すなわち、各鎖は、10～50個のヌクレオチド(またはヌクレオチドアナログ)を含む。いくつかの実施態様において、siRNA分子は、各鎖において約15～30、例えば、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30ヌクレオチド長を有し、ここで、鎖の一方は、標的領域に十分に相補的である。通常、鎖は、アニールされるときに二重鎖の一方または両方の末端に1、2または3個の残基の突出部が発生するように、整列しない(すなわち、対向する鎖に相補的な塩基が存在しない)鎖の末端に少なくとも1、2または3個の塩基があるように整列されている。通常、siRNA分子は、約10～50またはそれ以上のヌクレオチド長を有し、すなわち、各鎖は、10～50個のヌクレオチド(またはヌクレオチドアナログ)を含む。いくつかの実施態様において、siRNA分子は、各鎖において約15～30、例えば、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30ヌクレオチド長を有し、ここで、一方の鎖は標的配列に実質的に相補的であり、他方の鎖は第一鎖と同一または実質的に同一である。
通常、siRNAは、当技術分野で知られているいずれかの方法を用いて設計することができ、例えば、以下のプロトコールを用いて設計することができる。
1. siRNAは、標的配列、例えば、表1-5に示される標的配列に特異的であるべきである。一実施態様において、標的配列は、野生型C9ORF72対立遺伝子に見出される。別の実施態様において、標的配列は、C9ORF72変異対立遺伝子および野生型C9ORF72対立遺伝子の両方に見出される。別の実施態様において、標的配列は、野生型C9ORF72対立遺伝子に見出される。第一鎖は、標的配列に相補的であるべきであり、および他方の鎖は、第一鎖に実質的に相補的である。(例示的なセンスおよびアンチセンス鎖については表1～5を参照のこと)。例示的な標的のセンス配列は、標的遺伝子の5'非翻訳領域(5'-UTR)から選択される。これらの部位でのmRNAの切断は、対応するC9ORF72タンパク質の翻訳を排除するはずである。いくつかのアンチセンス配列を含むC9ORF72遺伝子の他の領域からの標的配列も、標的に適している。センス鎖は、標的配列に基づいて設計される。さらに、G/C含量が低い(35～55％)siRNAは、G/C含量が55％よりも高いものよりも活性が高いことがある。したがって、一実施態様において、本出願は、35～55％のG/C含量を有する核酸分子を含む。
2. 標的配列がセンス方向である実施態様において、siRNAのセンス鎖は、選択される標的部位の配列に基づいて設計される。通常、センス鎖は、約19～25個のヌクレオチド、例えば、19、20、21、22、23、24または25個のヌクレオチドを含む。通常、センス鎖は、21、22または23個のヌクレオチドを含む。しかし、当業者は、19未満ヌクレオチド長または25超ヌクレオチド長を有するsiRNAもRNAiを媒介するように機能することができることを理解するであろう。したがって、そのような長さのsiRNAも、RNAiを媒介する機能を保持していれば、本出願の範囲内である。より長いRNAサイレンシング剤は、望ましくない可能性のある特定の哺乳類細胞内でのインターフェロンまたはタンパク質キナーゼR(PKR)反応を誘発することが立証されている。通常、本出願のRNAサイレンシング剤は、PKR反応を誘発しない(すなわち、十分に短い長さである)。しかし、より長いRNAサイレンシング剤は、例えば、PKR反応を起こすことができない細胞型、またはPKR反応が代替の手段で下方制御されるか、弱められる、といった状況に有用であり得る。
本出願のsiRNA分子は、siRNAがRNAiを媒介することができるように、標的配列に対して十分な相補性を有する。一般的には、標的遺伝子のRISC媒介切断をもたらすために、標的遺伝子の標的配列部分と十分に同一のヌクレオチド配列を含むsiRNAが好ましい。したがって、好ましい実施態様において、siRNAのセンス鎖は、標的の一部と十分に同一の配列を有するように設計される。例えば、センス鎖は標的部位と100％同一であってもよい。しかし、100％の同一性は必須ではない。センス鎖と標的RNA配列との間に80％を超える同一性、例えば、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、または、さらには100％の同一性を有することが好ましい。本出願には、RNAiの効率および特異性を向上させるための、特定の配列の多様性が許容できるといった利点がある。一実施態様において、センス鎖は、野生型対立遺伝子と変異型対立遺伝子との間で少なくとも1つの塩基対が異なる標的領域、例えば、機能獲得変異を含む標的領域などの標的領域と4個、3個、2個、1個、または0個のミスマッチヌクレオチドを有し、他方の鎖は第一鎖と同一または実質的に同一である。さらに、1または2個のヌクレオチドの小さな挿入または欠失を有するsiRNA配列も、RNAiを媒介するのに有効である。あるいは、ヌクレオチドアナログの置換または挿入を有するsiRNA配列も、阻害に有効であり得る。
配列同一性は、当技術分野で知られている配列比較および整列アルゴリズムによって決定することができる。2つの核酸配列(または2つのアミノ酸配列)のパーセント同一性(percent identity)を決定するために、最適な比較を目的として配列を整列させる(例えば、最適な整列のために、第一の配列または第二の配列にギャップを導入することができる)。そして、対応するヌクレオチド(またはアミノ酸)の位置のヌクレオチド(またはアミノ酸残基)を比較する。第一の配列のある位置が、第二配列の対応する位置と同じ残基によって占められている場合、その位置では分子は同一である。2つの配列間のパーセント同一性は、配列によって共有される同一の位置の数の関数であり(すなわち、％相同性=同一の位置の数/位置の総数x100)、任意で、導入されたギャップの数および/または導入されたギャップの長さに対してスコアにペナルティを課す。
2つの配列間の配列比較およびパーセント同一性(percent identity)の決定は、数学的アルゴリズムを用いて行うことができる。一実施態様において、整列は、十分な同一性を有する整列された配列の特定の部分にわたって生成されるが、低い程度の同一性を有する部分では生成されない(すなわち、局所的整列)。配列の比較に利用される局所的整列アルゴリズムの好ましい非限定的な例は、Karlin and Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68のアルゴリズムであり、Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77のように修飾されている。このようなアルゴリズムは、Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10のBLASTプログラム(バージョン2.0)に組み込まれている。
別の実施態様において、整列を適切なギャップの導入により最適化し、パーセント同一性を、整列した配列の長さにわたり決定する(すなわち、ギャップ付き整列)。比較目的でギャップ付き整列を得るために、Gapped BLASTを、Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402に記載のとおり利用できる。別の実施態様において、整列は適切なギャップの導入により最適化され、パーセント同一性は、整列された配列の全長にわたり決定される(すなわち、包括的整列)。好ましい、配列の包括的比較に利用する数学的アルゴリズムの非限定的例は、Myers and Miller, CABIOS (1989)のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、GCG配列整列ソフトウェアパッケージの一部であるALIGNプログラム(version 2.0)に組み込まれる。アミノ酸配列の比較のためにALIGNプログラムを利用するとき、PAM120過重残基表、ギャップ長ペナルティ１２およびギャップペナルティ4が使用され得る。
3. siRNAのアンチセンス鎖またはガイド鎖は、ルーチン的にはセンス鎖と同じ長さであり、相補的なヌクレオチドを含む。一実施態様において、ガイド鎖およびセンス鎖は完全に相補的であり、すなわち、鎖は、整列またはアニールされるときに平滑末端である。別の実施態様において、siRNAの鎖は、1～7個(例えば、2、3、4、5、6、または7個)、または1～4個、例えば2、3、または4個のヌクレオチドの3'突出部を有するような方法で対にすることができる。突出部は、標的遺伝子配列(またはその補体)に対応するヌクレオチドを含み得るか(またはそれからなり得る)。あるいは、突出部は、デオキシリボヌクレオチド、例えばdT、またはヌクレオチドアナログ、または他の適切な非ヌクレオチド材料を含み得るか(またはそれからなり得る)。したがって、別の実施態様において、核酸分子は、2ヌクレオチドの3'突出部、例えばTTを有していてもよい。突出部ヌクレオチドは、RNAまたはDNAどちらかであってもよい。上述したように、変異体：野生型のミスマッチがプリン：プリンのミスマッチである標的領域を選択することが望ましい。
4. 当技術分野で知られているいずれかの方法を用いて、潜在的な標的を適切なゲノムデータベース(ヒト、マウス、ラットなど)と比較し、他のコード配列に対して有意な相同性を有する標的配列を考慮から除外する。このような配列相同性検索の方法としては、BLASTと知られており、National Center for Biotechnology Informationのウェブサイトで入手できる。
5. 評価の基準を満たす1つまたはそれ以上の配列の選択
siRNAの設計および使用に関するさらなる一般的な情報は、The Max-Plank-Institut fur Biophysikalische Chemieのウェブサイトで入手可能な「The siRNA User Guide」で見出すことができる。
あるいは、siRNAを、標的配列とハイブリダイズ(例えば、400mM NaCl、40mM PIPES pH6.4、1mM EDTA、12～16時間、50℃または70℃ハイブリダイゼーション；続く洗浄)できるヌクレオチド配列(またはオリゴヌクレオチド配列)として機能的に定義し得る。さらなる好ましいハイブリダイゼーション条件は、70℃で1xSSCまたは50℃で1xSSC、５０％ホルムアミドでハイブリダイゼーション、続く70℃で0.3xSSCで洗浄または70℃で4xSSCまたは50℃で4xSSC、50％ホルムアミドでハイブリダイゼーション、続く67℃で1xSSCで洗浄を含む。50塩基対長より短いことが予測されるハイブリッドのハイブリダイゼーション温度は、ハイブリッドの融解温度(Tm)より5～10℃低く、ここで、Tmは、次の式に従い決定される。18塩基対長より短いハイブリッドについて、Tm(℃)＝2(A+T塩基数)+4(G+C塩基数)。18～49塩基対長ハイブリッドについて、Tm(℃)＝81.5+16.6(log 10[Na+])+0.41(%G+C)-(600/N)、ここで、Ｎはハイブリッドの塩基数であり、[Na+]はハイブリダイゼーション緩衝液中のナトリウムイオン濃度である(1xSSCの[Na+]＝0.165M)。ポリヌクレオチドハイブリダイゼーションのストリンジェンシー条件のさらなる例は、引用により本明細書に包含させる Sambrook, J., E. F. Fritsch, and T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., chapters 9 and 11, and Current Protocols in Molecular Biology, 1995, F. M. Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., sections 2.10 and 6.3-6.4に提供される。
陰性対照のsiRNAは、選択されるsiRNAと同じヌクレオチド組成を有するべきであるが、適切なゲノムに対して有意な配列相補性を有しない。このような陰性対照は、選択されるsiRNAのヌクレオチド配列を無作為にスクランブリングすることによって設計することができる。相同性検索を行って、陰性対照が適切なゲノムのいずれかの他の遺伝子に対して相同性を欠いていることを確認できる。また、陰性対照のsiRNAは、1つまたはそれ以上の塩基ミスマッチを配列に導入することによって設計することができる。
6. siRNAが標的mRNA(例えば、野生型または変異型C9ORF72 mRNA)を破壊する有効性を検証するために、DrosophilaベースのインビトロmRNA発現システムにおいて、siRNAを標的cDNA(例えば、C9ORF72 cDNA)とインキュベートしてもよい。32Pで放射性標識された、新しく合成された標的mRNA(例えば、C9ORF72 mRNA)は、アガロースゲルでオートラジオグラフィーによって検出される。切断された標的mRNAの存在は、mRNAヌクレアーゼ活性を示す。適当な対照は、siRNAの省略および非標的cDNAの使用を含む。あるいは、対照のsiRNAとしては、選択されるsiRNAと同じヌクレオチド組成を有するが、適切な標的遺伝子に対して有意な配列相補性を有しないものが選択される。このような陰性対照は、選択されるsiRNAのヌクレオチド配列を無作為にスクランブリングすることによって設計できる。相同性検索を実行して、陰性対照が適切なゲノム内のいずれかの他の遺伝子に対して相同性を欠いていることを確認できる。さらに、陰性対照のsiRNA、1つまたはそれ以上の塩基ミスマッチを配列に導入することによって設計できる。
抗C9ORF72 siRNAは、上記の標的配列のいずれかを標的とするように設計され得る。該siRNAは、標標的配列のサイレンシングを媒介する、標的配列と十分に相補的であるアンチセンス鎖を含む。特定の実施態様において、RNAサイレンシング剤はsiRNAである。
特定の実施態様において、siRNAは、図3Aに示される配列を含むセンス鎖、および図3Aに示される配列を含むアンチセンス鎖を含む。
siRNA-mRNAの相補性部位は、最適なmRNAの特異性と最大のmRNA切断をもたらすものが選択される。
b) siRNA様分子
本出願のsiRNA様分子は、C9ORF72 mRNAの標的配列と「十分に相補的」な配列を有し(すなわち、配列を有する鎖を有し)、RNAiまたは翻訳抑制のどちらかによって遺伝子サイレンシングを指示する。siRNA様分子は、siRNA分子と同じ方法で設計されが、センス鎖と標的RNAとの間の配列同一性の度合いは、miRNAとその標的との間で観察されるものに近似している。一般には、miRNA配列と対応する標的遺伝子配列との間の配列同一性の度合いが低下するにつれて、RNAiではなく翻訳抑制によって転写後遺伝子サイレンシングを媒介する傾向が増加する。したがって、標的遺伝子の翻訳抑制による転写後遺伝子サイレンシングが望まれる代替の実施態様において、miRNA配列は標的遺伝子の配列と部分的な相補性を有する。特定の実施態様において、miRNA配列は、標的mRNA内(例えば、標的mRNAの3'-UTR内)に分散されている1つまたはそれ以上の短い配列(相補性部位)と部分的な相補性を有する(Hutvagner and Zamore, Science, 2002； Zeng et al., Mol. Cell, 2002； Zeng et al., RNA, 2003； Doench et al., Genes & Dev., 2003)。翻訳抑制のメカニズムは協調的であるため、特定の実施態様においては、複数の相補性部位(例えば、2、3、4、5、または6個)を標的とすることができる。
RNAiまたは翻訳抑制を媒介するsiRNA様二重鎖の機能は、相補性のある部位における標的遺伝子配列とサイレンシング剤のヌクレオチド配列との間の非同一のヌクレオチドの分布によって予測することができる。翻訳抑制による遺伝子サイレンシングが望まれる一実施態様において、相補性部位の中央部分に少なくとも1つの非同一のヌクレオチドが存在し、それによってmiRNAガイド鎖および標的mRNAによって形成される二重鎖は中央の「バルジ」を含む(Doench J G et al., Genes & Dev., 2003)。別の実施態様において、2、3、4、5、または6個の連続するまたは非連続の非同一のヌクレオチドが導入される。非同一のヌクレオチドは、ゆらぎ塩基対(例えば、G:U)またはミスマッチ塩基対(G:A、C:A、C:U、G:G、A:A、C:C、U:U)を形成するように選択することができる。さらに好ましい実施態様において、「バルジ」は、miRNA分子の5'末端から12位および13位のヌクレオチドを中心とする。
c) 短いヘアピンRNA(shRNA)分子
特定の特徴的な実施態様において、本出願は、向上された選択性でC9ORF72標的配列のRNAサイレンシングを媒介することができるshRNAを提供する。siRNAとは対照的に、shRNAはマイクロRNA(miRNA)の天然の前駆体を模倣しており、遺伝子サイレンシング経路の最上位に入る。このため、shRNAは、天然の遺伝子サイレンシング経路全体を介して供給されることにより、遺伝子サイレンシングをより効率的に媒介すると考えられている。
miRNAは、植物および動物の発育中に転写後または翻訳後のレベルで遺伝子発現を調節することができる約22個のヌクレオチドの非コードRNAである。miRNAの一般的な特徴の1つは、おそらくRNase III型の酵素であるDicerまたはそのホモログによって、pre-miRNAと称される約70個のヌクレオチドの前駆体RNAステムループからすべて切り取られることである。天然に存在するmiRNA前駆体(pre-miRNA)は、一般的に相補的な2つの部分を含む二重鎖ステムを形成する一本鎖、およびステムの2つの部分を結合するループを有する。典型的なpre-miRNAにおいて、ステムは、1つまたはそれ以上のバルジ、例えば、ステムの1つの部分に単一ヌクレオチドの「ループ」を作る余分なヌクレオチド、および/または、ステムの2つの部分の互いのハイブリダイゼーションにギャップを作る1つまたはそれ以上の不対ヌクレオチドを含む。本出願の短いヘアピンRNAまたは操作されたRNA前駆体は、これらの天然に存在するpre-miRNAに基づく人工コンストラクトであるが、所望のRNAサイレンシング剤(例えば、本出願のsiRNA)を送達するように操作される。pre-miRNAのステム配列を、標的mRNAと相補的な配列によって置換することで、shRNAが形成される。shRNAは、細胞の遺伝子サイレンシング経路全体で処理されるため、RNAiを効率的に媒介する。
shRNA分子の必要な要素は、第一部分および第二部分を含み、アニールまたはハイブリダイズして二重鎖または二本鎖のステム部分を形成するのに十分な相補性を有する。この2つの部分は、完全にまたは完璧に相補的である必要はない。第一および第二の「ステム」部分は、shRNAの他の部分にアニールまたはハイブリダイズするのに十分な配列相補性を有しない配列を有する部分によって結合されている。この後者の部分は、shRNA分子における「ループ」部分と称される。このshRNA分子が処理されてsiRNAを生成する。shRNAはまた、1つまたはそれ以上のバルジ、すなわち、ステムの一部に小さなヌクレオチド「ループ」を作る余分なヌクレオチド、例えば1、2、3個のヌクレオチドループを含むことができる。ステム部分は同じ長さであってもよく、一部分が、例えば、1～5個のヌクレオチドの突出部を含んでいてもよい。突出部ヌクレオチドは、例えば、ウラシル(U)、例えば、すべてのUを含むことができる。このようなUは、特にshRNAをコードするDNA中のチミジン(T)によってコードされ、これは転写の終結を示す。
本出願のshRNA(または操作された前駆体RNA)において、二重鎖ステムの1つの部分はC9ORF72標的配列と相補的な(またはアンチセンスの)核酸配列である。通常、shRNAのステム部分の一方の鎖は、標的RNA(例えば、mRNA)の配列と十分に相補的(例えば、アンチセンス)であり、RNA干渉(RNAi)を介して該標的RNAの分解または切断を媒介する。このように、操作されたRNA前駆体は、2つの部分を有する二重鎖ステム、および該2つのステム部分を結合するループを含む。アンチセンス部分は、ステムの5'または3'末端にあってもよい。例示的な実施態様において、shRNAのステム部分は、約15～約50ヌクレオチド長である。例として、該2つのステム部分は、約18または19～約21、22、23、24、25、30、35、37、38、39、または40またはこれ以上のヌクレオチド長であり得る。好ましい実施態様において、ステム部分の長さは、21個のヌクレオチドまたはそれ以上であるべきである。哺乳類細胞に使用する場合、インターフェロン経路のような非特異的な反応を誘発しないように、ステム部分の長さは約30個未満のヌクレオチドにするべきである。非哺乳動類細胞において、ステムは30より長いヌクレオチドであり得る。実際、ステムは、標的mRNAと相補的なはるかに大きなセクションを含み得る(mRNA全体まで、および、mRNA全体を含む)。実際、ステム部分は、標的mRNAと相補的なはるかに大きなセクションを含むことができる(mRNA全体までおよびmRNA全体を含む)。
二重鎖ステムの2つの部分は、ハイブリダイズして二重鎖ステムを形成するのに十分に相補的あるべきである。したがって、該2つの部分は、完全にまたは完璧に相補的であり得るが、必ずしもそうする必要はない。さらに、該2つのステム部分は、同じ長さを有していてもよく、1つの部分が、1、2、3、または4個のヌクレオチドの突出部を含んでいてもよい。突出部ヌクレオチドは、例えば、ウラシル(U)、例えば、すべてのUを含むことができる。shRNAまたは操作されたRNA前駆体におけるループは、ループ配列を修飾することによって対のヌクレオチドの数を増減するか、ループ配列の全部または一部をテトラループまたは他のループ配列に置き換えることにより、天然のpre-miRNA配列とは異なる。したがって、shRNAまたは操作されたRNA前駆体におけるループは、2、3、4、5、6、7、8、9、またはそれ以上、例えば、15または20、またはそれ以上のヌクレオチド長であり得る。
shRNAまたは操作されたRNA前駆体におけるループは、ループ配列を修飾して対のヌクレオチドの数を増減するか、ループ配列の全部または一部をテトラループまたは他のループ配列に置き換えることにより、天然のpre-miRNA配列とは異なる。したがって、shRNAにおけるループ部分は、約2～約20ヌクレオチド長、すなわち、約2、3、4、5、6、7、8、9、またはそれ以上、例えば、15または20、またはそれ以上のヌクレオチド長であることができる。好ましいループは、「テトラループ」配列からななるか、それを含む。例示的なテトラループ配列は、配列GNRA［ここで、Nは、いずれかのヌクレオチドであり、Rは、プリンヌクレオチドである］、GGGG、およびUUUを含むが、これらに限定されない。
特定の実施態様において、本出願のshRNAsは、上記の所望のsiRNA分子の配列を含む。他の実施態様において、shRNAのアンチセンス部分の配列は、基本的には上記のように設計することができるか、または、一般的には、標的RNA(例えば、C9ORF72 mRNA)内から、例えば、翻訳開始の上流または下流の100～200または300個のヌクレオチドの領域から、18、19、20、21個のヌクレオチド、またはそれ以上の配列を選択することによって設計することができる。一般的には、配列は、5'UTR(非翻訳領域)、コード配列、または3'UTRを含む標的RNA(例えば、mRNA)のいずれかの部分から選択され得る。この配列は、隣接するAAヌクレオチドを2つ含む標的遺伝子の領域の直後に任意で続くことができる。ヌクレオチド配列の最後の2つのヌクレオチドは、UUになるように選択できる。この21個ほどのヌクレオチド配列は、shRNAにおける二重鎖ステムの一部分を作るのに使用される。この配列は、例えば、酵素的に野生型pre-miRNA配列のステム部分を置き換えることができか、または、合成される完全な配列に含まれる。例えば、ステムループの操作されたRNA前駆体全体をコードするDNAオリゴヌクレオチド、または前駆体の二重ステムに挿入される部分だけをコードするDNAオリゴヌクレオチドを合成し、制限酵素を用いて、例えば、野生型pre-miRNAから、操作されたRNA前駆体コンストラクトを構築することができる。
操作されたRNA前駆体は、インビボで生成されることが所望されるsiRNAまたはsiRNA様二重鎖の21～22個ほどのヌクレオチド配列を二重鎖ステムに含む。このように、操作されたRNA前駆体のステム部分は、その発現が低減または阻害される遺伝子のエキソン部分の配列に対応する少なくとも18または19個のヌクレオチド対を含む。ステムのこの領域をフランキングする2つの3'ヌクレオチドは、操作されたRNA前駆体からのsiRNAの生成を最大化し、インビボおよびインビトロでRNAiによる翻訳抑制または破壊のために対応するmRNAを標的とする際に得られるsiRNAの有効性を最大化するために、選択される。
特定の実施態様において、本出願のshRNAは、RISCへのエントリーを強化するために、miRNA配列、任意に末端修飾されたmiRNA配列を含む。miRNA配列は、天然に存在するいずれかのmiRNAと同様または同一であることができる(例えば、The miRNA Registry; Griffiths-Jones S, Nuc. Acids Res., 2004を参照のこと)。これまでに1,000種類以上の天然のmiRNAが同定されており、これらを合わせると、ゲノムにおいて予測される全ての遺伝子の約1％を含むと考えられている。多くの天然のmiRNAは、pre-mRNAのイントロンに集まっており、相同性ベースの検索(Pasquinelli et al., 2000； Lagos-Quintana et al., 2001； Lau et al., 2001； Lee and Ambros, 2001)、またはpri-mRNA(Grad et al., Mol. Cell., 2003； Lim et al., Genes Dev., 2003； Lim et al., Science, 2003； Lai E C et al., Genome Bio., 2003)のステムループ構造を形成するmiRNA候補遺伝子の機能を予測するコンピュータアルゴリズム(例えば、MiRScan、MiRSeeker)を用いて、インシリコで同定することができる。オンラインレジストリでは、公開されているすべてのmiRNA配列の検索可能なデータベースを提供している(The miRNA Registry at the Sanger Institute website； Griffiths-Jones S, Nuc. Acids Res., 2004)。例示的な天然のmiRNAには、lin-4、let-7、miR-10、mirR-15、miR-16、miR-168、miR-175、miR-196およびこれらのホモログ、ならびにヒトおよび国際PCT公開第WO 03/029459号に記載されているドロソフィラ・メラノガステル(Drosophila melanogaster)、カノルハブジチス・エレガンス(Caenorhabditis elegans)、ゼブラフィッシュ(zebrafish)、アラビドプシス・タラニア(Arabidopsis thalania)、ハツカネズミ(Mus musculus)、およびラッツス・ノルベギクス( Rattus norvegicus)を含む特定のモデル生物からの他の天然のmiRNAが含まれる。
天然に存在するmiRNAは、インビボでの内在性遺伝子によって発現され、Dicerまたは他のRNAseによってヘアピンまたはステムループ前駆体(pre-miRNAまたはpri-miRNA)から処理される(Lagos-Quintana et al., Science, 2001； Lau et al., Science, 2001； Lee and Ambros, Science, 2001； Lagos-Quintana et al., Curr. Biol., 2002； Mourelatos et al., Genes Dev., 2002； Reinhart et al., Science, 2002； Ambros et al., Curr. Biol., 2003； Brennecke et al., 2003； Lagos-Quintana et al., RNA, 2003； Lim et al., Genes Dev., 2003； Lim et al., Science, 2003)。miRNAは、インビボでは一時的に二本鎖の二重鎖として存在するが、RISC複合体に取り込まれるのは一本鎖のみで、遺伝子サイレンシングを指示する。特定のmiRNA、例えば、植物のmiRNAは、それらの標的mRNAに対して完璧または完璧に近い相補性を有し、それゆえにその標的mRNAを直接的に切断する。その他のmiRNAは、それらの標的mRNAに対して相補性が完全ではなく、それゆえに標的mRNAの翻訳を直接的に抑制する。miRNAとその標的mRNAとの間の相補性の度合いが、その作用のメカニズムを決定すると考えられている。例えば、miRNAとその標的mRNAとの間の完璧または完璧に近い相補性は切断メカニズムを予測し(Yekta et al., Science, 2004)、完全ではない相補性は翻訳抑制メカニズムを予測する。特定の実施態様において、miRNA配列は、天然に存在するmiRNA配列のものであり、その異常発現または活性はmiRNA障害と相関性がある。
d)二重機能性オリゴヌクレオチドテザー
他の実施態様において、本出願のRNAサイレンシング剤は、miRNAの細胞間動員に有用な二重機能性オリゴヌクレオチドテザーを含む。動物細胞は、転写後または翻訳後のレベルで遺伝子発現を調節できる約22個のヌクレオチドの非コードRNAである一連のmiRNAを発現する。RISCに結合されているmiRNAを結合し、それを標的mRNAに動員することにより、二重機能性オリゴヌクレオチドテザーは、例えば、動脈硬化過程に関与する遺伝子の発現を抑制することができる。オリゴヌクレオチドテザーの使用では、特定の遺伝子の発現を抑制する既存の技術と比較して、いくつかの利点がある。まず、本明細書に記載の方法により、内因性分子(多くの場合、豊富に存在する)であるmiRNAがRNAサイレンシングを媒介することを可能にする。したがって、本明細書に記載の方法により、RNAサイレンシングを媒介するために外来分子(例えば、siRNA)を導入する必要性を除去する。第二に、RNAサイレンシング剤と、特に結合部分(例えば、2'-O-メチルオリゴヌクレオチドなどのオリゴヌクレオチド)を、安定かつヌクレアーゼ活性に対して耐性のあるものにすることができる。その結果、本出願のテザーは直接送達用に設計することができ、これは、細胞内で所望の薬剤を作るように設計される前駆体分子またはプラスミドを間接的に送達する必要性を除去する。第三に、テザーとそのそれぞれの部分は、特定のmRNA部位および特定のmiRNAに適合するように設計することができる。この設計により、細胞や遺伝子産物に特化したものにすることができる。第四に、本明細書に開示されている方法では、mRNAをそのまま残し、これは、当業者が細胞自身のマシナリーを用いて短いパルスでタンパク質合成をブロックすることを可能にする。その結果、これらのRNAサイレンシングの方法は、高度に制御可能である。
本出願の二重機能性オリゴヌクレオチドテザー(「テザー」)は、目的の遺伝子の調節を誘導するように、miRNA(例えば、内因性細胞miRNA)を標的mRNAに動員するように設計される。好ましい実施態様において、テザーは、式T-L-μ［式中、Tは、mRNA標的部分であり、Lは、結合部分であり、そして、μは、miRNA動員部分である］を有する。いずれかの1つまたはそれ以上の部分は、二本鎖であってもよい。例示的な実施態様において、各部位は一本鎖である。
テザー内の部分は、式T-L-μ(すなわち、標的部分の3'末端が結合部分の5'末端に結合され、結合部分の3'末端がmiRNA動員部分の5'末端に結合されている)に示されるように、(5'から3'方向に)配列するか、または結合され得る。あるいは、この部分は、以下のようにテザー内で配列するか、または結合され得る：μ-T-L(すなわち、miRNA動員部分の3'末端が結合部分の5'末端に結合され、結合部分の3'末端が標的部分の5'末端に結合されている)。
上記のmRNA標的部分は、特定の標的mRNAを捕捉することができる。本出願によれば、標的mRNAの発現は所望しなく、それによってmRNAの翻訳抑制を所望する。mRNA標的部分は、標的mRNAと効果的に結合するのに十分な大きさであるべきである。標的部分の長さは、部分的には、標的mRNAの長さ、および標的mRNAと標的部分との間の相補性の度合いに応じて大きく変動するであろう。さまざまな実施態様において、標的部分は、約200、100、50、30、25、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、または5ヌクレオチド長未満である。特定の実施態様において、標的部分は、約15～約25ヌクレオチド長である。
上記のmiRNA動員部位は、miRNAと会合することができる。本出願によれば、miRNAは、標的mRNAを抑制できるいずれかのmiRNAであってよい。哺乳動物には250種類以上の内在性miRNAがあると報告されている(Lagos-Quintana et al. (2002) Current Biol. 12:735-739； Lagos-Quintana et al. (2001) Science 294:858-862；およびLim et al. (2003) Science 299:1540)。さまざまな実施態様において、miRNAは、当技術分野で認識されているいずれかのmiRNAであってもよい。
結合部分は、標的部位の活性が維持されるように、標的部分を結合することができるいずれかの薬剤である。例の結合部分は、標的剤がそれらのそれぞれの標的と十分に相互作用できるような十分な数のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド部位を含む。結合部分は、細胞内でのmRNAまたはmiRNA配列と配列相同性がほとんど、あるいは全くない。例示的な結合部分は、1つまたはそれ以上の2'-O-メチルヌクレオチド、例えば、2'-β-メチルアデノシン、2'-O-メチルチミジン、2'-O-メチルグアノシンまたは2'-O-メチルウリジンを含む。
e)遺伝子サイレンシングオリゴヌクレオチド
特定の例示的な実施態様において、遺伝子発現(すなわち、C9ORF72遺伝子発現)は、2つまたはそれ以上のアクセス可能な3'末端の存在を可能にするそれらの5'末端を介して結合された2つまたはそれ以上の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドベースの化合物を用いて調節して、C9ORF72遺伝子の発現を効果的に阻害または低減できる。このように結合されたオリゴヌクレオチドは、遺伝子サイレンシングオリゴヌクレオチド(Gene Silencing Oligonucleotide, GSO)としても知られている。(例えば、Idera Pharmaceuticals, Inc.に譲渡された米国特許第8,431,544号を参照のこと。すべての目的のためにその全体が引用により本明細書に包含される。)
GSOの5'末端での結合は、他のオリゴヌクレオチド結合とは独立しており、ヌクレオチドの2'または3'ヒドロキシル位置のいずれかを利用して、5'、3'、または2'ヒドロキシル基を介して直接的に、または非ヌクレオチドリンカーまたはヌクレオシドを介して間接的に行うことができる。結合は、5'末端ヌクレオチドの官能化された糖または核酸塩基を利用し得る。
GSOは、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、または非ヌクレオシドリンカーを介してそれらの5'-5'末端でコンジュゲートされた2つの同一または異なる配列を含むことができる。このような化合物は、遺伝子産物のアンチセンスダウンレギュレーションの目的のmRNA標的の特定の部分と相補的な15～27個のヌクレオチドを含み得る。同一の配列を含むGSOは、ワトソン・クリック水素結合相互作用を介して特定のmRNAに結合され、たンパク質の発現を阻害することができる。異なる配列を含むGSOは、1つまたはそれ以上のmRNA標的の2つまたはそれ以上の異なる領域に結合され、たンパク質の発現を阻害することができる。このような化合物は、標的mRNAと相補的なヘテロヌクレオチド配列からなり、ワトソン・クリック水素水素結合を介して安定な二重鎖構造を形成する。特定の条件下では、2つの遊離3'末端(5'-5'結合アンチセンス)を含むGSOは、単一の遊離3'末端を含むものまたは遊離3'末端を含まないものよりも、より強力な遺伝子発現阻害剤となり得る。
いくつかの実施態様において、非ヌクレオチドリンカーは、グリセロール、または式-O-(CH2)o-CH(OH)-(CH2)p-O-［式中、oおよびpは、独立して、1～約6、1～約4または1～約3の整数である］のグリセロールホモログである。いくつかの他の実施態様において、非ヌクレオチドリンカーは、1,3-ジアミノ-2-ヒドロキシプロパンの誘導体である。このような誘導体のいくつかは、式-O-(CH2)m-C(O)NH-CH2-CH(OH)-CH2-NHC(O)-(CH2)m-O-［式中、mは、0～約10、0～約6、2～約6または2～約4の整数である］を有する。
いくつかの非ヌクレオチドリンカーは、2つを超えるGSO成分の結合を可能にする。例えば、非ヌクレオチドリンカーグリセロールは、GSO成分が共有結合し得る3つのヒドロキシル基を有する。したがって、本出願のいくつかのオリゴヌクレオチドベースの化合物は、ヌクレオチドまたは非ヌクレオチドリンカーに結合された2つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチドを含む。本出願によるそのようなオリゴヌクレオチドは、「分岐状」されていると称される。
特定の実施態様において、GSOは、少なくとも14ヌクレオチド長である。特定の例示的な実施態様において、GSOは、15～40ヌクレオチド長または20～30ヌクレオチド長である。したかって、GSOのコンポーネントのオリゴヌクレオチドは、独立して14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39または40ヌクレオチド長であり得る。
これらのオリゴヌクレオチドは、手動でまたは自動化シンセサイザーによって実施することができる、ホスホルアミデート(phosphoramidate)またはH-ホスホネート化学などの当技術分野で認められている方法によって調製することができる。これらのオリゴヌクレオチドはまた、mRNAにハイブリダイズしているそれらの能力を損なうことなく、いくつかの方法で修飾することができる。このような修飾は、アルキルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、メチルホスホネート、ホスフェートエステル、アルキルホスホロチオエート(alkylphosphonothioate)、ホスホルアミデート、カルバメート、カーボネート、ホスフェートヒドロキシル、アセトアミダートまたはカルボキシメチルエステルまたはこれらの組み合わせであるオリゴヌクレオチドの少なくとも1つのヌクレオチド間結合、および1つのヌクレオチドの5'末端と別のヌクレオチドの3'末端との間の他のヌクレオチド間結合であって、5'ヌクレオチドホスホジエステル結合がさまざまな化学基に置き換えられているものを含み得る。
IV. 修飾抗C9ORF72 RNAサイレンシング剤
本出願の特定の態様において、上記の本出願のRNAサイレンシング剤(またはそのいずれかの部分)は、その薬剤の活性がさらに改善されるように修飾されてもよい。例えば、上記のセクションIIに記載のRNAサイレンシング剤は、以下に記載のいずれかの修飾で修飾されてもよい。この修飾は、部分的には、標的識別をさらに向上させること、薬剤の安定性を向上させること(例えば、分解を防ぐ)、細胞取込を促進すること、標的効率を向上させること、(例えば、標的)への結合において有効性を改善すること、薬剤に対する患者の耐性を改善すること、および／または毒性を低減するのに役に立つことができる。
1)標的識別の向上のための修飾
特定の実施態様において、本出願のRNAサイレンシング剤は、単一ヌクレオチド標的識別を向上させるために不安定化ヌクレオチドで置換されていてもよい(2007年1月25日出願の米国出願Ser. No.11/698,689、2006年1月25日出願の米国仮出願No.60/762,225を参照のこと。両方は引用により本明細書に包含される)。このような修飾は、標的mRNA(例えば、機能獲得型変異体mRNA)に対するRNAサイレンシング剤の特異性に感知できるほどに影響を与えることなく、非標的mRNA(例えば、野生型mRNA)に対するRNAサイレンシング剤の特異性を破壊するのに十分であり得る。
好ましい実施態様において、本出願のRNAサイレンシング剤は、そのアンチセンス鎖に少なくとも1つの一般的なヌクレオチドを導入することによって修飾される。一般的なヌクレオチドは、従来のヌクレオチドの四つの塩基(例えば、A、G、C、U)のいずれかと無差別に塩基対合できる塩基部分を含む。一般的なヌクレオチドは、RNA二重鎖、またはRNAサイレンシング剤のガイド鎖および標的mRNAによって形成される二重鎖の安定性に対して比較的小さな影響しか及ぼさないため、好ましい。例示的な一般的なヌクレオチドは、イノシン塩基部分または、デオキシノシン(例えば、2'-デオキシノシン)、7-デアザ2'-デオキシノシン、2'-アザ－2'-デオキシノシン、PNA-イノシン、モルホリノ-イノシン、LNA-イノシン、ホスホルアミデート-イノシン、2'-O-メトキシエチル-イノシン、および2'-OMe-イノシンからなる群から選択されるイノシンアナログ塩基部分を有するものを含む。特に好ましい実施態様において、一般的なヌクレオチドは、イノシン残基またはその天然に存在するアナログである。
特定の実施態様において、本出願のRNAサイレンシング剤は、特異性決定ヌクレオチド(すなわち、疾患関連多型を認識するヌクレオチド)から5のヌクレオチド以内に少なくとも1つの不安定化ヌクレオチドを導入することによって修飾される。例えば、不安定化ヌクレオチドは、特異性決定ヌクレオチドから5、4、3、2、または1のヌクレオチド以内の位置に導入することができる。例示的な実施態様において、不安定化ヌクレオチドは、特異性決定ヌクレオチドから3のヌクレオチドの位置に導入される(すなわち、不安定化ヌクレオチドと特異性決定ヌクレオチドとの間に2つの安定化ヌクレオチドが存在するように)。二本の鎖または鎖部分を有するRNAサイレンシング剤(例えば、siRNAおよびshRNA)において、特異性決定ヌクレオチドを含有しない鎖または鎖部分に不安定化ヌクレオチドが導入され得る。好ましい実施態様において、不安定化ヌクレオチドは、特異性決定ヌクレオチドを含む同じ鎖または鎖部分に導入される。
2)有効性および特異性の向上に対する修飾
特定の実施態様において、本出願のRNAサイレンシング剤は、非対称設計ルールによるRNAiの媒介において有効性および特異性の向上を容易にするように改変されてもよい(米国特許8,309,704、7,750,144、8,304,530、8,329,892および8,309,705を参照のこと)。このような改変は、siRNA(例えば、本出願の方法を用いて設計されたsiRNAまたはshRNAから作製されたsiRNA)のアンチセンス鎖が、センス鎖のためにRISCにエントリーすることを容易にし、アンチセンス鎖が標的mRNAの切断または翻訳抑制を優先的に導くようにして、標的切断およびサイレンシングの効率を増加または改善させる。RNAサイレンシング剤の非対称は、RNAサイレンシング剤のアンチセンス鎖5'末端(AS 5')とセンス鎖3'末端(S 3')との間の塩基対強度を、該RNAサイレンシング剤のアンチセンス鎖3'末端(AS 3')とセンス鎖5'末端(S'5)との間の結合強度または塩基対強度と比較して減らすことによって向上させる。
一実施態様において、本出願のRNAサイレンシング剤の非対称は、第一またはアンチセンス鎖の5'末端とセンス鎖部分の3'末端との間のG：C塩基対が、第一またはアンチセンス鎖の3'端とセンス鎖部分の5'端との間のG：C塩基対よりも少ないように向上されてもよい。別の実施態様において、本出願のRNAサイレンシング剤の非対称は、第一またはアンチセンス鎖の5'末端とセンス鎖部分の3'末端との間に少なくとも1つのミスマッチ塩基対があるように向上されてもよい。例示的な実施態様において、ミスマッチ塩基対は、G:A、C:A、C:U、G:G、A:A、C:CおよびU:Uからなる群から選択される。別の実施態様において、本出願のRNAサイレンシング剤の非対称は、第一またはアンチセンス鎖の5'末端とセンス鎖部分の3'末端との間に、少なくとも1つのゆらぎ塩基対、例えばG：Uがあるように向上されてもよい。別の実施態様において、本出願のRNAサイレンシング剤の非対称は、希少ヌクレオチド、例えばイノシン(I)を含む塩基対が少なくとも1つあるように向上されてもよい。代表的な実施態様において、塩基対は、I:A、I:UおよびI:Cからなる群から選択される。さらに別の実施態様において、本出願のRNAサイレンシング剤の非対称は、修飾ヌクレオチドを含む塩基対が少なくとも1つあるように向上されてもよい。好ましい実施態様において、修飾ヌクレオチドは、2-アミノ-G、2-アミノ-A、2,6-ジアミノ-G、および2,6-ジアミノ-Aからなる群から選択される。
3)安定性が向上されたRNAサイレンシング剤
本発明のRNAサイレンシング剤は、血清中または細胞培養のための成長培地中での安定性を改善させるように修飾することができる。安定性を向上させるために、3'-残基は分解に対して安定化されていてもよく、例えば、プリンヌクレオチド、特にアデノシンまたはグアノシンヌクレオチドからなるように選択されてもよい。あるいは、ピリミジンヌクレオチドを修飾アナログで置換すること、例えばウリジンを2'-デオキシチミジンで置換することは許容され、RNA干渉の効率に影響を与えない。
一態様において、本出願は、第二鎖および／または第一鎖が内部ヌクレオチドを修飾ヌクレオチドで置換することによって修飾されている第一および第二の鎖を含み、それによって対応する未修飾RNAサイレンシング剤と比較してインビボでの安定性が向上するようにするRNAサイレンシング剤を特徴とする。本明細書で定義されているように、「内部」ヌクレオチドは、核酸分子、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの5'末端または3'末端以外のいずれかの位置に発生するヌクレオチドである。内部ヌクレオチドは、一本鎖分子内、または二重鎖または二本鎖分子の鎖内にあり得る。一実施態様において、センス鎖および／またはアンチセンス鎖は、少なくとも1つの内部ヌクレオチドの置換によって修飾されている。別の実施態様において、センス鎖および／またはアンチセンス鎖は、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25個またはそれ以上の内部ヌクレオチドの置換によって修飾されている。別の実施態様において、センス鎖および／またはアンチセンス鎖は、少なくとも5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％またはそれ以上の内部ヌクレオチドの置換によって修飾されている。さらに別の実施態様において、センス鎖および／またはアンチセンス鎖は、全ての内部ヌクレオチドの置換によって修飾される。
一態様において、本出願は、少なくとも80％が化学的に修飾されているRNAサイレンシング剤を特徴とする。本出願の好ましい実施態様において、RNAサイレンシング剤は、完全に化学的に修飾されており、すなわち、ヌクレオチドの100％が化学的に修飾されている。
本出願の好ましい実施態様において、RNAサイレンシング剤は、少なくとも1つの修飾ヌクレオチドアナログを含み得る。ヌクレオチドアナログは、標的特異的サイレンシング活性、例えば、RNAi媒介活性または翻訳抑制活性が実質的に影響を受けていない位置、例えば、siRNA分子の5'末端および／または3'末端の領域に位置されていてもよい。特に、末端は、修飾ヌクレオチドアナログを組み込むことによって安定化されてもよい。
例示的なヌクレオチドアナログは、糖-および／または骨格-修飾リボヌクレオチドを含む(すなわち、リン酸-糖骨格に対する修飾を含む)。例えば、天然のRNAのホスホジエステル結合は、窒素または硫黄のヘテロ原子の少なくとも1つを含むように修飾されていてもよい。例示的な骨格-修飾リボヌクレオチドにおいて、隣接するリボヌクレオチドに結合されたホスホエステル基は、修飾基、例えば、ホスホチオエート基によって置き換えられている。例示的な糖-修飾リボヌクレオチドにおいて、2'OH-基は、H、OR、R、ハロ、SH、SR、NH2、NHR、NR2またはONからなる群から選択される基によって置き換えられておい、ここで、Rは、C1-C6アルキル、アルケニルまたはアルキニルであり、ハロは、F、Cl、BrまたはIである。
特定の実施態様において、修飾は、2'-フルオロ、2'-アミノおよび／または2'-チオ修飾である。特定の好ましい修飾は、2'-フルオロ-シチジン、2'-フルオロ-ウリジン、2'-フルオロ-アデノシン、2'-フルオロ-グアノシン、2'-アミノ-シチジン、2'-アミノ-ウリジン、2'-アミノ-アデノシン、2'-アミノ-グアノシン、2,6-ジアミノプリン、4-チオ-ウリジン、および／または5-アミノ-アリル-ウリジンを含む。特定の実施態様において、2'-フルオロリボヌクレオチドは、あらゆるウリジンおよびシチジンである。追加の例示的な修飾は、5-ブロモ-ウリジン、5-ヨード-ウリジン、5-メチル-シチジン、リボチミジン、2-アミノプリン、2'-アミノ-ブチリル-ピレン-ウリジン、5-フルオロ-シチジン、および5-フルオロ-ウリジンを含む。2'-デオキシヌクレオチドおよび2'-Omeヌクレオチドはまた、本出願の修飾RNAサイレンシング剤部分内で使用することができる。追加の修飾残基は、デオキシ脱塩基、イノシン、N3-メチル-ウリジン、N6,N6-ジメチル-アデノシン、シュードウリジン、プリンリボヌクレオシドおよびリバビリンを含む。特に好ましい実施態様において、2'部分は、結合部分が2'-O-メチルオリゴヌクレオチドであるようなメチル基である。
例示的な実施態様において、本出願のRNAサイレンシング剤は、ロックされた核酸(LNA)を含む。LNAは、ヌクレアーゼ活性に抵抗し(非常に安定している)、mRNAの単一ヌクレオチド識別を有する糖修飾ヌクレオチドを含む(Elmen et al., Nucleic Acids Res., (2005), 33(1): 439-447； Braasch et al. (2003) Biochemistry 42:7967-7975, Petersen et al. (2003) Trends Biotechnol 21:74-81)。これらの分子は、2'-O,4'-C-エチレン架橋核酸を有し、2'-デオキシ-2''-フルオロウリジンのような修飾が可能である。さらに、LNAは、糖部分を3'-末端構造に束縛することによってオリゴヌクレオチドの特異性を増加させ、それによって塩基対合のためにヌクレオチドを事前にオーガナイズし、オリゴヌクレオチドの融解温度を塩基あたり10℃も上昇させる。
別の例示的な実施態様において、本出願のRNAサイレンシング剤は、ペプチド核酸(PNA)を含む。PNAは、ヌクレオチドの糖-リン酸部分が、ヌクレアーゼ消化に対して非常に耐性があり、分子に改善された結合特異性を付与するポリアミド骨格を形成することができる中性の２－アミノエチルグリシン部分で置き換えられている修飾ヌクレオチドを含む(Nielsen, et al., Science, (2001), 254: 1497-1500)。
また、核酸塩基修飾リボヌクレオチド、すなわち、天然に存在する核酸塩基の代わりに少なくとも1つの非天然の核酸塩基を含むリボヌクレオチドも好ましい。塩基は、アデノシンデアミナーゼの活性をブロックするように修飾することができる。例示的な修飾核酸塩基としては、5位で修飾されているウリジンおよび／またはシチジン、例えば5-(2-アミノ)プロピルウリジン、5-ブロモウリジン；8位で修飾されているアデノシンおよび／またはグアノシン、例えば8-ブロモグアノシン；デアザヌクレオチド、例えば7-デアザ デノシン、O-およびN-アルキル化ヌクレオチド、例えば、N6-メチルアデノシンが適当であるが、これらに限定されない。なお、上記の修飾は組み合わせてもよい。
他の実施態様において、架橋は、RNAサイレンシング剤の薬物動態を改変するのに、例えば、体内の半減期を増加させるのに利用できる。したがって、本出願は、核酸の2つの相補的な鎖を有するRNAサイレンシング剤であって、該2つの鎖は架橋されているものを含む。本出願はまた、別の部分(例えば、ペプチドなどの非核酸部分、有機化合物(例えば、染料)、など)にコンジュゲートされているか、コンジュゲートされていない(例えば、その3'末端で)RNAサイレンシング剤を含む。このようにsiRNA誘導体を修飾することにより、対応するsiRNAと比較して、得られるsiRNA誘導体の細胞取込を改善するか、得られるsiRNA誘導体の細胞内での標的を向上させることができ、細胞におけるsiRNA誘導体の追跡に有用であるか、または対応するsiRNAと比較してsiRNA誘導体の安定性を改善する。
他の例示的な修飾には以下のものが含まれる：(a)2'修飾、例えば、センス鎖またはアンチセンス鎖、特にセンス鎖のUへの2'OMe部分の提供、または3'突出部、例えば、3'末端(3'末端とは、文脈によって示されるような、分子の3'原子、または最3'末端、例えば最3'Pまたは2'位置を意味する)への2'OMe部分の提供；(b)骨格の修飾であって、例えば、リン酸骨格における0をSに置き換えるもの、例えば、UもしくはAまたは両方へのホスホロチオエート修飾の提供；例えば、0をSに置き換えるもの；(c)UをC5アミノリンカーで置き換え；(d)AをGで置き換え(配列変動は、アンチセンス鎖ではなく、センス鎖に位置することが好ましい)；および(d)2'位、6'位、7'位、または8位での修飾を含む。例示的な実施態様は、これらの修飾の1つまたはそれ以上がセンス鎖に存在するがアンチセンス鎖には存在しないもの、またはアンチセンス鎖がそのような修飾が少ない実施態様である。さらに他の例示的な修飾は、3'突出部、例えば、3'末端でのメチル化Pの使用；2'修飾の組み合わせ、例えば2'OMe部分の提供および骨格の修飾(例えばOをSに置き換える)、例えば、ホスホロチオエート修飾の提供、または3'突出部、例えば3'末端でのメチル化Pの使用；3'アルキルによる修飾；3'突出部、例えば3'末端での脱塩基性ピロリドンによる修飾；ナプロキセン、イブプロフェン、または3'末端での分解を阻害する他の部分による修飾、を含む。
4)細胞取込を向上させるための修飾
他の実施態様において、RNAサイレンシング剤は、例えば、標的細胞(例えば、神経細胞)による細胞取込を向上させるために、化学的部分で修飾されてもよい。したがって、本出願は、別の部分(例えば、ペプチドなどの非核酸部分)、有機化合物(例えば、染料)などにコンジュゲートされているか、コンジュゲートされていない(例えば、その3'末端で)RNAサイレンシング剤を含む。コンジュゲーションは、当該技術分野で知られている方法によって、例えば、Lambert et al., Drug Deliv. Rev.: 47(1), 99-112 (2001)(ポリアルキルシアノアクリレート(PACA)ナノ粒子にロードされている核酸が記載されいる)； Fattal et al., J. Control Release 53(1-3):137-43 (1998) (ナノ粒子に結合された核酸が記載されている)； Schwab et al., Ann. Oncol. 5 Suppl. 4:55-8 (1994) (挿入剤、疎水性基、ポリカチオンまたはPACAナノ粒子に結合された核酸が記載されている)；およびGodard et al., Eur. J. Biochem. 232(2):404-10 (1995) (ナノ粒子に結合された核酸が記載されている)の方法を用いて達成できる。
特定の実施態様において、本出願のRNAサイレンシング剤は、親油性部分にコンジュゲートされている。一実施態様において、親油性部分は、カチオン基を含むリガンドである。別の実施態様において、親油性部分は、siRNAの一方または両方に結合されている。例示的な実施態様において、親油性部分は、siRNAのセンス鎖の一方の末端に結合されている。別の例示的な実施態様において、親油性部分は、センス鎖の3'末端に結合されている。特定の実施態様において、親油性部分は、コレステロール、ビタミンE、ビタミンK、ビタミンA、葉酸、またはカチオン染料(例えば、Cy3)からなる群から選択される。例示的な実施態様において、親油性部分は、コレステロールである。他の親油性部分は、コール酸、アダマンタン酢酸、1-ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、1,3-ビス-O(ヘキサデシル)グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、1,3-プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、O3-(オレオイル)リトコール酸、O3-(オレオイル)コレン酸、ジメトキシトリチル、またはフェノキサジンを含む。
5)テザーリガンド
他のエンティティは、本出願のRNAサイレンシング剤にテザーされ得る。例えば、安定性、標的核酸とのハイブリダイゼーション熱力学、特定の組織または細胞型の標的、または、例えば、エンドサイトーシス依存性または非依存性メカニズムによる細胞透過性を改善する、RNAサイレンシング剤にテザーされているリガンド。リガンドおよび関連する修飾はまた、配列特異性を増加させ、その結果、オフサイト標的を低減できる。テザーリガンドは、介入物として機能することができる修飾塩基または糖を1つまたはそれ以上含むことができる。これらは、好ましくは、RNAサイレンシング剤／標的二重鎖のバルジのような内部領域に位置する。介入物は、芳香族、例えば、多環式芳香族またはヘテロ環式芳香族化合物であることができる。多環式介入物は、スタッキング機能を有することができ、2、3、または4の縮合環を有するシステムを含むことができる。本明細書に記載の一般的な塩基は、リガンド上に含まれ得る。一実施態様において、リガンドは、標的核酸の切断によって標的遺伝子の阻害に寄与する切断基を含むことができる。切断基は、例えば、ブレオマイシン(例えば、ブレオマイシン-A5、ブレオマイシン-A2、またはブレオマイシン-B2)、ピレン、フェナントロリン(例えば、O-フェナントロリン)、ポリアミン、トリペプチド(例えば、lys-tyr-lysトリペプチド)、または金属イオンキレート基であり得る。金属イオンキレート基は、例えば、Lu(III)またはEU(III)大環状錯体、Zn(II)2,9-ジメチルフェナントロリン誘導体、Cu(II)テルピリジン、またはアクリジンを含むことができ、Lu(III)などの遊離金属イオンによるバルジの部位での標的RNAの選択的切断を促進することができる。いくつかの実施態様において、ペプチドリガンドは、RNAサイレンシング剤にテザーされて、例えば、バルジ領域で標的RNAの切断を促進することができる。例えば、1,8-ジメチル-1,3,6,8,10,13-ヘキサアザシクロテトラデカン(サイクラム)は、ペプチド(例えば、アミノ酸誘導体によって)にコンジュゲートされて、標的RNAの切断を促進することができる。テザーリガンドは、RNAサイレンシング剤が改善されたハイブリダイゼーション性質または改善された配列特異性を有するようにすることができるアミノグリコシドリガンドであることができる。例示的なアミノグリコシドは、グリコシル化ポリリシン、ガラクトシル化ポリリシン、ネオマイシンB、トブラマイシン、カナマイシンA、およびアミノグリコシドのアクリジンコンジュゲート、例えば、ネオ-N-アクリジン、ネオ-S-アクリジン、ネオ-C-アクリジン、トブラ-N-アクリジン、およびKanaA-N-アクリジンを含む。アクリジンアナログの使用により配列特異性を増加させることができる。例えば、ネオマイシンBは、DNAと比較してRNAに対して高い親和性を有するが、配列特異性は低い。アクリジンアナログであるネオ-5-アクリジンは、HIV Rev-応答配列(Rev-response element, RRE)に対して増加された親和性を有する。いくつかの実施態様において、アミノグリコシドリガンドのグアニジンアナログ(グアニジノグリコシド)は、RNAサイレンシング剤にテザーされている。グアニジノグリコシドにおいて、アミノ酸のアミン基がグアニジン基に交換されている。グアニジンアナログの結合により、RNAサイレンシング剤の細胞透過性を向上させることができる。テザーリガンドは、オリゴヌクレオチド剤の細胞取込を向上させることができるポリ-アルギニンペプチド、ペプトイドまたはペプチド模倣のものであることができる。
例示的なリガンドは、通常、共有結合で、直接または介在するテザーを介して間接的に、リガンド-コンジュゲート担体に結合する。例示的な実施態様において、リガンドは、介在するテザーを介して担体に結合されている。例示的な実施態様において、リガンドは、それが組み込まれているRNAサイレンシング剤の分布、標的、または寿命を改変させる。例示的な実施態様において、リガンドは、例えば、そのようなリガンドが存在しない種と比較して、選択された標的、例えば、分子、細胞または細胞型、コンパートメント、例えば、身体の細胞または器官のコンパートメント、組織、器官または領域に対する親和性を向上させる。
例示的なリガンドは、輸送、ハイブリダイゼーション、および特異性性質を改善することができ、また、結果として得られる天然または修飾RNAサイレンシング剤、または本明細書に記載のモノマーおよび／または天然または修飾リボヌクレオチドのいずれかの組み合わせを含むポリマー分子のヌクレアーゼ耐性を改善することもある。リガンドは、例えば、取り込みを向上させるための治療的修飾因子；例えば、分布をモニタリングするための診断用化合物またはレポーター群；架橋剤；ヌクレアーゼ耐性付与部分；および天然または珍しい核酸塩基を含むことができる。一般的な例としては、親油性物質、脂質、ステロイド(例えば、ウバオール、ヘチゲニン(hecigenin)、ジオスゲニン)、テルペン(例えば、トリテルペン、例えば、サルササポゲニン、フリーデリン、エピフリーデラノール誘導体化リトコール酸)、ビタミン(例えば、葉酸、ビタミンA、ビオチン、ピリドキーサル)、炭水化物、タンパク質、タンパク質結合剤、インテグリン標的分子、ポリカチオン、ペプチド、ポリアミン、およびペプチドミメティックがある。リガンドは、天然に存在する物質(例えば、ヒト血清アルブミン(HSA)、低密度リポタンパク質(LDL)、またはグロブリン)；炭水化物(例えば、デキストラン、プルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロデキストリンまたはヒアルロン酸)；アミノ酸または脂質を含むことができる。また、リガンドは、組換えまたは合成分子、例えば、合成ポリマー、例えば、合成ポリアミノ酸であってもよい。ポリアミノ酸の例としては、ポリリシン(PLL)、ポリL-アスパラギン酸、ポリL-グルタミン酸、スチレン-マレイン酸無水物コポリマー、ポリ(L-ラクチド-co-グリコリド)コポリマー、ジビニルエーテル-マレイン無水物コポリマー、N-(2-ヒドロキシプロピル)メタクリルアミドコポリマー(HMPA)、ポリエチレングリコール(PEG)、ポリビニルアルコール(PVA)、ポリウレタン、ポリ(2-エチルアクリル酸)、N-イソプロピルアクリルアミドポリマー、またはポリフォスファジンであるポリアミノ酸を含む。ポリアミンの例としては、ポリエチレンイミン、ポリリシン(PLL)、スペルミン、スペルミジン、ポリアミン、シュードペプチド-ポリアミン、ペプチドミメティックのポリアミン、デンドリマーポリアミン、アルギニン、アミジン、プロタミン、カチオン性脂質、カチオン性ポルフィリン、ポリアミンの四級塩、またはアルファ螺旋ペプチドがある。
リガンドはまた、標的基、例えば、細胞または組織標的剤、例えば、腎臓細胞などの特定の細胞型に結合するレクチン、糖タンパク質、脂質またはタンパク質、例えば、抗体を含むことができる。標的基は、サイロトロピン、メラノトロピン、レクチン、糖タンパク質、界面活性剤タンパク質A、ムチン炭水化物、多価ラクトース、多価ガラクトース、N-アセチル-ガラクトサミン、N-アセチル-グルコサミン、多価マンノース、多価フコース、グリコシル化ポリアミノ酸、多価ガラクトース、トランスフェリン、ビスホスホネート、ポリグルタメート、ポリアスパルテート、脂質、コレステロール、ステロイド、胆汁酸、葉酸塩、ビタミンB12、ビオチン、またはRGDペプチドまたはRGDペプチドミメティックであり得る。リガンドの他の例としては、染料、挿入剤(例えば、アクリジンおよび置換アクリジン)、架橋剤(例えば、ソラレン、マイトマイシンC)、ポルフィリン(TPPC4、テキサフィリン、サフィリン)、多環式芳香族炭化水素(例えば、フェナジン、ジヒドロフェナジン、フェナントロリン、ピレン)、lys-tyr-lysトリペプチド、アミノグリコシド、グアニジウムアミノグリコディ、人工エンドヌクレアーゼ(例えば、EDTA)、親油性分子、例えば、コレステロール(およびそのチオアナログ)、コール酸、コール酸、リトコール酸、アダマンタン酢酸、1-ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、グリセロール(例えば、エステル(例えば、モノ、ビス、またはトリス脂肪酸エステル、例えば、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19、またはC20脂肪酸)およびそれらのエーテル、例えば、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19、またはC20アルキル；例えば、1,3-ビス-O(ヘキサデシル)グリセロール、1,3-ビス-O(オクタデシル)グリセロール)、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、1,3-プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ステアリン酸(例えば、ジステアリン酸グリセリル)、オレイン酸、ミリスチン酸、O3-(オレオイル)リトコール酸、O3-(オレオイル)コレン酸、ジメトキシトリチル、またはフェノキサジン)およびペプチドコンジュゲート(例えば、アンテナペディアペプチド、Tatペプチド)、アルキル化剤、ホスフェート、アミノ、メルカプト、PEG(例えば、PEG-40K)、MPEG、[MPEG]2、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル、放射性標識マーカー、酵素、ハプテン(例えば、ビオチン)、輸送/吸収ファシリテーター(例えば、アスピリン、ナプロキセン、ビタミンE、葉酸)、合成リボヌクレアーゼ(例えば、イミダゾール、ビスイミダゾール、ヒスタミン、イミダゾールクラスター、アクリジン-イミダゾールコンジュゲート、テトラアザ大環状環Eu3+複合体)、ジニトロフェニル、HRPまたはAPが挙げられる。
リガンドは、タンパク質、例えば、糖タンパク質、またはペプチド、例えば、コリガンド(co-ligand)、または抗体、例えば、癌細胞、内皮細胞、または骨細胞などの特定の細胞型に結合する抗体に対して特異的親和性を有する分子であり得る。リガンドはまた、ホルモンおよびホルモン受容体を含んでもよい。これらはまた、非ペプチド種、例えば、脂質、レクチン、炭水化物、ビタミン、補因子、多価ラクトース、多価ガラクトース、N-アセチル-ガラクトサミン、N-アセチル-グルコサミン多価マンノース、または多価フコースを含み得る。リガンドは、、例えば、リポ多糖、p38MAPキナーゼの活性化因子、またはNF-κBの活性化因子であり得る。
リガンドは、例えば、細胞骨格を破壊することによって、例えば、細胞の微小管、マイクロフィラメント、および／または中間径フィラメントを破壊することによって、細胞中へのRNAサイレンシング剤の取り込みを増加させることができる物質、例えば、薬物であり得る。薬物は、例えば、タクソン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、サイトカラシン、ノコダゾール、ジャスプラキノリド、ラトランクリンA、ファロイジン、スウィンホリドA、インダノシン、またはミオセルビンであり得る。リガンドは、例えば、炎症反応を活性化することによって、細胞中へのRNAサイレンシング剤の取り込みを増加させることができる。そのような効果を有し得る例示的なリガンドとしては、腫瘍壊死因子α(TNFα)、インターロイキン-1β、またはγインターフェロンが挙げられる。一態様において、リガンドは、脂質または脂質ベースの分子である。このような脂質または脂質ベースの分子は、血清タンパク質、例えば、ヒト血清アルブミン(HSA)に結合し得る。HSA結合リガンドは、身体の標的組織、例えば、非腎臓標的組織へのコンジュゲートの分布を可能にする。例えば、標的組織は、肝臓の実質細胞を含む肝臓であり得る。HSAに結合できる分子も、リガンドとして使用され得る。例えば、ネプロキシン(neproxin)またはアスピリンが使用され得る。脂質または脂質ベースのリガンドは、(a)コンジュゲートの分解に対する耐性を増加させることができ、(b)標的細胞または細胞膜への標的化または輸送を増加させることができ、および／または(c)血清タンパク質、例えば、HSAへの結合を調整するのに使用され得る。脂質ベースのリガンドを用いて、標的組織へのコンジュゲートの結合を調節する、例えば、制御することができる。例えば、より強くHSAに結合する脂質または脂質ベースのリガンドは、腎臓に対して標的化される可能性が低く、したがって、身体から除去される可能性が低い。より弱くHSAに結合する脂質または脂質ベースのリガンドを用いて、コンジュゲートを腎臓に対して標的化することができる。好ましい実施態様において、脂質ベースのリガンドはHSAに結合する。脂質ベースのリガンドは、コンジュゲートが好ましくは非腎臓組織に分配されるような十分な親和性でHSAに結合することができる。しかしながら、親和性は、HSA-リガンド結合が反転され得ないほど強力でないのが好ましい。別の好ましい実施態様において、コンジュゲートが好ましくは腎臓に分配されるように、脂質ベースのリガンドは、HSAに弱く結合するかまたｈ全く結合しない。腎臓細胞を標的とする他の部分も、脂質ベースのリガンドの代わりにまたはそれに加えて使用され得る。
別の態様において、リガンドは、標的細胞、例えば、増殖細胞によって取り込まれる部分、例えば、ビタミンである。これらは、例えば、悪性または非悪性型の望ましくない細胞増殖、例えば、癌細胞を特徴とする障害を処置するのに特に有用である。例示的なビタミンは、ビタミンA、E、およびKを含む。他の例示的なビタミンには、ビタミンB、例えば、葉酸、B12、リボフラビン、ビオチン、ピリドキーサルまたは他のビタミンあるいは癌細胞によって取り込まれる栄養素が含まれる。HSAおよび低密度リポタンパク質(LDL)も含まれる。
別の態様において、リガンドは、細胞透過剤(cell-permeation agent)、例えば、螺旋状細胞透過剤(cell-permeation agent)である。例示的な実施態様において、この剤は両親媒性である。例示的な剤は、tatまたはアンテノペディア(antennopedia)などのペプチドである。この剤がペプチドである場合、これはペプチジルミメティック(peptidylmimetic)、逆転異性体、非ペプチドまたはシュード-ペプチド結合、およびD-アミノ酸の使用を含めて修飾され得る。螺旋状剤は、親油性および疎油性相を含み得るα－螺旋状剤である。
リガンドは、ペプチドまたはペプチドミメティックであり得る。ペプチドミメティック(本明細書においてオリゴペプチドミメティックとも称される)は、天然ペプチドと類似した明確な3次元構造に折り畳まれることが可能な分子である。ペプチドおよびペプチドミメティックのオリゴヌクレオチドへの結合は、例えば細胞認識および吸収を向上させることによって、RNAサイレンシング剤の薬物動態分布に影響を及ぼし得る。ペプチドまたはペプチドミメティック部分は、約5～50のアミノ酸の長さ、例えば、約5、10、15、20、25、30、35、40、45、または50のアミノ酸の長さであり得る。ペプチドまたはペプチドミメティックは、例えば、細胞透過性ペプチド、カチオン性ペプチド、両親媒性ペプチド、または疎水性ペプチド(例えば、主にTyr、TrpまたはPheからなる)であり得る。ペプチド部分は、デンドリマーペプチド、拘束性(constrained)ペプチドまたは架橋ペプチドであり得る。ペプチド部分は、L-ペプチドまたはD-ペプチドであり得る。別の代替例において、ペプチド部分は、疎水性膜トランスロケーション配列(MTS)を含み得る。ペプチドまたはペプチドミメティックは、ファージディスプレイライブラリー、または1ビーズ1化合物(one-bead-one-compound)(OBOC)組み合わせライブラリーから特定されたペプチドなどのDNAの無作為配列によってコードされ得る(Lam et al., Nature 354:82-84, 1991)。例示的な実施態様において、組み込まれたモノマー単位を介してRNAサイレンシング剤にテザーされたペプチドまたはペプチドミメティックは、アルギニン-グリシン-アスパラギン酸(RGD)-ペプチド、またはRGDミメティックなどの細胞標的ペプチドである。ペプチド部分は、約5のアミノ酸～約40のアミノ酸の長さの範囲であり得る。ペプチド部分は、安定性または直接的な配座特性を増加させるためなどの構造修飾を有し得る。後述される構造修飾のいずれも用いられ得る。
V. 分岐状オリゴヌクレオチド
上記の2つまたはそれ以上の抗C9ORF72 RNAサイレンシング剤、例えば、siRNAなどのオリゴヌクレオチドコンストラクトは、リンカー、スペーサーおよび分岐点から独立して選択される1つまたはそれ以上の部分によって互いに結合されて、2つまたはそれ以上のRNAサイレンシング剤を含む分岐状オリゴヌクレオチドを形成することができる。図70は、2つのsiRNAを送達するためのジ-siRNA足場の例を示す。典型的な実施態様において、分岐状オリゴヌクレオチドの各核酸はアンチセンス鎖(またはその部分)を含み、ここで、アンチセンス鎖は、RNA媒介サイレンシングメカニズム(例えば、RNAi)を媒介するようにへテロ接合単一ヌクレオチド多型に対して十分な相補性を有する。他の実施態様において、C9ORF72アンチセンス転写産物をサイレンシングするためのセンス鎖(たまはその部分)を含む核酸を特徴とする第二型の分岐状オリゴヌクレオチドであって、センス鎖は、RNA媒介サイレンシングメカニズムを媒介するようにアンチセンス転写産物に対して十分な相補性を有する分岐状オリゴヌクレオチドが提供される。さらなる実施態様において、両方の型の核酸、すなわち、アンチセンス鎖(またはその部分)を核酸、およびセンス鎖(またはその部分)を含むオリゴヌクレオチドを含む第三型の分岐状オリゴヌクレオチドが提供される。
例示的な実施態様において、分岐状オリゴヌクレオチドは、リンカーを介して結合された2～8のRNAサイレンシング剤を有し得る。リンカーは、疎水性であり得る。特定の実施態様において、本出願の分岐状オリゴヌクレオチドは、2～3のオリゴヌクレオチドを含む。一実施態様において、オリゴヌクレオチドは、独立して実質的な化学的安定化を有する(例えば、構成塩基の少なくとも40％が化学的に修飾されている)。特定の実施態様において、オリゴヌクレオチドは、完全な化学的安定化を有する(すなわち、構成塩基の全てが化学的に修飾されている)。いくつかの実施態様において、分岐状オリゴヌクレオチドは、そらぞれ独立して2～20個のヌクレオチドを有する1つまたはそれ以上の一本鎖ホスホロチオエート化尾部を有する。特定の実施態様において、各一本鎖の尾部は、8～10個のヌクレオチドを有する。
特定の実施態様において、分岐状オリゴヌクレオチドは3つの性質を特徴とする:(1)分岐状構造、(2)完全な代謝安定化、および(3)ホスホロチオエートリンカーを含む一本鎖の尾部の存在。特定の実施態様において、分岐状オリゴヌクレオチドは、2または3個の分岐を有する。分岐状構造の全体的なサイズの増加は、取り込みの増加を促進すると考えられている。また、特定の活動理論に拘束されることなく、複数の隣接する分岐(たとえば、2または3個)は、各分岐が協調して動作することを可能にし、したがって、内在化、トラフィッキング、および放出の速度を劇的に向上させると考えられている。
分岐状オリゴヌクレオチドは、さまざまな構造的に多様な実施態様において提供される。図30に示されるように、例えば、いくつかの実施態様において、分岐点で結合された核酸は、一本鎖であり、miRNA阻害剤、ギャップマー、ミックスマー、スプライススイッチング核酸(splice-switching nucleic acid、SSO)、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴヌクレオチド(PMO)、またはペプチド核酸(PNA)からなる。これらの一本鎖は、それらの3'または5'末端で結合し得る。siRNAおよび一本鎖オリゴヌクレオチドの組み合わせも二重機能に使用させ得る。別の実施態様において、ギャップマー、ミックスマー、miRNA阻害剤、SSO、PMO、およびPNAと相補的な短い核酸を用いて、活性な一本鎖核酸を運び、分布および細胞内在化を向上させることができる。短い二重鎖領域は、低い融解温度(Tm～37℃)を有し、分岐状構造が細胞中に内在化されると、急速に分解する。
図34に示されるように、ジ-siRNA分岐状オリゴヌクレオチドは、化学的に多様なコンジュゲートを含み得る。コンジュゲート生理活性リガンドを用いて、細胞特異性を向上させ、膜結合性、内在化、および血清タンパク質結合を促進することができる。コンジュゲーションに使用される生物活性部分の例としては、DHAg2、DHA、GalNAc、およびコレステロールを含む。これらの部分はジ-siRNAに、結合リンカーまたはスペーサーを介して結合されているか、別の遊離siRNA末端に結合された追加のリンカーまたはスペーサーを介して追加され得る。
分岐状構造の存在は、同じ化学組成の非分岐状化合物と比較して、脳内の組織保持レベルを100倍超えて向上させ、これは、細胞の保持および分布の新しいメカニズムを示している。分岐状オリゴヌクレオチドは、脊髄および脳全体に予想外に均一に分布する。さらに、分岐状オリゴヌクレオチドは、さまざまな組織への予想外に効率的な全身送達、および非常に高レベルの組織蓄積を示す。
分岐状オリゴヌクレオチドは、ASO、miRNA、miRNA阻害剤、スプライススイッチング(splice switching)、PMO、PNAを含むさまざまな治療的核酸を含む。いくつかの実施態様において、分岐状オリゴヌクレオチドはコンジュゲート疎水性部分をさらに含み、インビトロおよびインビボで先例のないサイレンシングおよび有効性を示す。
分岐状オリゴヌクレオチド形状の非限定的な実施態様は、図24、30～32、および33～35に開示されている。リンカー、スペーサーおよび分岐点の非限定的な例は、図34に開示されている。
リンカー
分岐状オリゴヌクレオチドの実施態様において、各リンカーは、独立して、エチレングリコール鎖、アルキル鎖、ペプチド、RNA、DNA、ホスフェート、ホスホネート、ホスホルアミデート、エステル、アミド、トリアゾール、およびこれらの組み合わせから選択され；ここで、リンカーのいずれかの炭素または酸素原子は、場合によって窒素原子によって置き換えられていてよく、ヒドロキシル置換基を有するか、オキソ置換基を有する。一実施態様において、各リンカーは、エチレングリコール鎖である。別の実施態様において、各リンカーは、アルキル鎖である。別の実施態様において、各リンカーは、ペプチドである。別の実施態様において、各リンカーは、RNAである。別の実施態様において、各リンカーは、DNAである。別の実施態様において、各リンカーは、ホスフェートである。別の実施態様において、各リンカーは、ホスホネートである。別の実施態様において、各リンカーは、ホスホルアミデートである。別の実施態様において、各リンカーは、エステルである。別の実施態様において、各リンカーは、アミドである。別の実施態様において、各リンカーは、トリアゾールである。別の実施態様において、各リンカーは、図30の式から選択される構造である。
VI. 式(I)で示される化合物
別の態様において、本明細書では、式(I)：
Figure 2022528487000044
 ［式(I)中、Lは、エチレングリコール鎖、アルキル鎖、ペプチド、RNA、DNA、ホスフェート、ホスホネート、ホスホルアミデート、エステル、アミド、トリアゾール、およびこれらの組み合わせから選択され、ここで、式(I)は、1つまたはそれ以上の分岐点B、および1つまたはそれ以上のスペーサーSをさらに含んでいてよく(ここで、Bは、出現するごとに独立して、多価有機種またはその誘導体であり;Sは、出現するごとに独立して、エチレングリコール鎖、アルキル鎖、ペプチド、RNA、DNA、ホスフェート、ホスホネート、ホスホルアミデート、エステル、アミド、トリアゾール、およびこれらの組み合わせから選択される);Nは、センス鎖およびアンチセンス鎖を含むRNAであり、ここで、アンチセンス鎖は、5' AAGAAAAGACCUGAUAAAGAUUAACCAGAAGAAAACAAGGAGGGA 3'と実質的に相補的な相補性領域を含み、センス鎖およびアンチセンス鎖は、それぞれ独立して、1つまたはそれ以上の化学修飾を含み;そして、nは、2、3、4、5、6、7または8である］で示される化合物が提供される。
いくつかの実施態様において、式(I)で示される化合物は、表6の式(I-1)～(I-9)から選択される構造を有する。
Figure 2022528487000045
一実施態様において、式(I)で示される化合物は、式(I-1)である。別の実施態様において、式(I)で示される化合物は、式(I-2)である。別の実施態様において、式(I)で示される化合物は、式(I-3)である。別の実施態様において、式(I)で示される化合物は、式(I-4)である。別の実施態様において、式(I)で示される化合物は、式(I-5)である。別の実施態様において、式(I)で示される化合物は、式(I-6)である。別の実施態様において、式(I)で示される化合物は、式(I-7)である。別の実施態様において、式(I)で示される化合物は、式(I-8)である。別の実施態様において、式(I)で示される化合物は、式(I-9)である。
式(I)で示される化合物の実施態様において、各リンカーは、独立して、エチレングリコール鎖、アルキル鎖、ペプチド、RNA、DNA、ホスフェート、ホスホネート、ホスホルアミデート、エステル、アミド、トリアゾール、およびこれらの組み合わせから選択され;ここで、リンカーのいずれかの炭素または酸素原子は、場合により窒素原子によって置き換えられていてよく、ヒドロキシル置換基を有するか、オキソ置換基を有する。式(I)で示される化合物の一実施態様において、各リンカーは、エチレングリコール鎖である。別の実施態様において、各リンカーは、アルキル鎖である。式(I)で示される化合物の別の実施態様において、各リンカーは、ペプチドである。式(I)で示される化合物の別の実施態様において、各リンカーは、RNAである。式(I)で示される化合物の別の実施態様において、各リンカーは、DNAである。式(I)で示される化合物の別の実施態様において、各リンカーは、ホスフェートである。別の実施態様において、各リンカーは、ホスホネート。式(I)で示される化合物の別の実施態様において、各リンカーは、ホスホルアミデートである。式(I)で示される化合物の別の実施態様において、各リンカーは、エステルである。式(I)で示される化合物の別の実施態様において、各リンカーは、アミドである。式(I)で示される化合物の別の実施態様において、各リンカーは、トリアゾールである。式(I)で示される化合物の別の実施態様において、各リンカーは、図30から選択される構造である。
式(I)で示される化合物の一実施態様において、Bは、多価有機種である。式(I)で示される化合物の別の実施態様において、Bは、多価有機種の誘導体である。式(I)で示される化合物の一実施態様において、Bは、トリオールまたはテトロール誘導体である。別の実施態様において、Bは、トリ-またはテトラ-カルボン酸誘導体である。別の実施態様において、Bは、アミン誘導体である。別の実施態様において、Bは、トリ-またはテトラ-アミン誘導体である。別の実施態様において、Bは、アミノ酸誘導体である。式(I)で示される化合物の別の実施態様において、Bは、図29の式から選択される。
多価有機種は、炭素および3つまたはそれ以上の原子価(すなわち、上記で定義されているS、LまたはNなどの部分との結合点)を含む部分である。多価有機種の非限定的な例は、トリオール(例えば、グリセロール、フロログルシノール、など)、テトロール(例えば、リボース、ペンタエリトリトール、1,2,3,5-テトラヒドロキシベンゼン、など)、トリ-カルボン酸(例えば、クエン酸、1,3,5-シクロヘキサントリカルボン酸、トリメシン酸、など)、テトラ-カルボン酸(例えば、エチレンジアミンテトラ酢酸、ピロメリット酸、など)、三級アミン(例えば、トリプロパルギルアミン、トリエタノールアミン、など)、トリアミン(例えば、ジエチレントリアミンなど)、テトラミン、およびヒドロキシル、チオール、アミノ、および／またはカルボキシル部分(例えば、リシン、セリン、システインなどのアミノ酸)の組み合わせを含む種を含む。
式(I)で示される化合物の実施態様において、各核酸は、1つまたはそれ以上の化学修飾ヌクレオチドを含む。式(I)で示される化合物の実施態様において、各核酸は、化学修飾ヌクレオチドからなる。式(I)で示される化合物の特定の実施態様において、各核酸の>95％、>90％、>85％、>80％、>75％、>70％、>65％、>60％、>55％または>50％は、化学修飾ヌクレオチドを含む。
いくつかの実施態様において、各アンチセンス鎖は、独立して、表7の群から選択される5'末端基Rを含む。
Figure 2022528487000046
一実施態様において、Rは、R1である。別の実施態様において、Rは、R2である。別の実施態様において、Rは、R3である。別の実施態様において、Rは、R4である。別の実施態様において、Rは、R5である。別の実施態様において、Rは、R6である。別の実施態様において、Rは、R7である。別の実施態様において、Rは、R8である。
式(II)の構造
いくつかの実施態様において、式(I)で示される化合物は、式(II)：
Figure 2022528487000047
 ［式中、Xは、出現するごとに独立して、アデノシン、グアノシン、ウリジン、シチジン、およびそれらの化学修飾誘導体から選択され;Yは、出現するごとに独立して、アデノシン、グアノシン、ウリジン、シチジン、およびそれらの化学修飾誘導体から選択され;-は、ホスホジエステルヌクレオシド間結合を示し;=は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合を示し;そして、---は、出現するごとに単独に、塩基対合の相互作用またはミスマッチを示す］の構造を有する。
特定の実施態様において、式(II)の構造は、ミスマッチを含まない。一実施態様において、式(II)の構造は、1個のミスマッチを含む。別の実施態様において、式(II)で示される化合物は、2個のミスマッチを含む。別の実施態様において、式(II)で示される化合物は、3個のミスマッチを含む。別の実施態様において、式(II)で示される化合物は、4個のミスマッチを含む。いくつかの実施態様において、各核酸は、化学修飾ヌクレオチドからなる。
特定の実施態様において、式(II)の構造のX'の>95％、>90％、>85％、>80％、>75％、>70％、>65％、>60％、>55％または>50％は、化学修飾ヌクレオチドである。他の実施態様において、式(II)の構造のX'の>95％、>90％、>85％、>80％、>75％、>70％、>65％、>60％、>55％または>50％は、化学修飾ヌクレオチドである。
式(III)の構造
いくつかの実施態様において、式(I)で示される化合物は、式(III):
Figure 2022528487000048
 ［式中、Xは、出現するごとに独立して、2'-デオキシ-2'-フルオロ修飾を含むヌクレオチドであり;Xは、出現するごとに独立して、2'-O-メチル修飾を含むヌクレオチドであり;Yは、出現するごとに独立して、2'-デオキシ-2'-フルオロ修飾を含むヌクレオチドであり;そして、Yは、出現するごとに独立して、2'-O-メチル修飾を含むヌクレオチドである］の構造を有する。
いくつかの実施態様において、Xは、2'-デオキシ-2'-フルオロ修飾アデノシン、グアノシン、ウリジンまたはシチジンからなる群から選択される。いくつかの実施態様において、Xは、2'-O-メチル修飾アデノシン、グアノシン、ウリジンまたはシチジンからなる群から選択される。いくつかの実施態様において、Yは、2'-デオキシ-2'-フルオロ修飾アデノシン、グアノシン、ウリジンまたはシチジンからなる群から選択される。いくつかの実施態様において、Yは、2'-O-メチル修飾アデノシン、グアノシン、ウリジンまたはシチジンからなる群から選択される。
特定の実施態様において、式(III)の構造は、ミスマッチを含まない。一実施態様において、式(III)の構造は、1個のミスマッチを含む。別の実施態様において、式(III)で示される化合物は、2個のミスマッチを含む。別の実施態様において、式(III)で示される化合物は、3個のミスマッチを含む。別の実施態様において、式(III)で示される化合物は、4個のミスマッチを含む。
式(IV)の構造
いくつかの実施態様において、式(I)で示される化合物は、式(IV):
Figure 2022528487000049
 ［式中、Xは、出現するごとに独立して、アデノシン、グアノシン、ウリジン、シチジン、およびそれらの化学修飾誘導体から選択され;Yは、出現するごとに独立して、アデノシン、グアノシン、ウリジン、シチジン、およびそれらの化学修飾誘導体から選択され;-は、ホスホジエステルヌクレオシド間結合を示し;=は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合を示し;そして、---は、出現するごとに単独に、塩基対合の相互作用またはミスマッチを示す］の構造を有する。
特定の実施態様において、式(IV)の構造は、ミスマッチを含まない。一実施態様において、式(IV)の構造は、1個のミスマッチを含む。別の実施態様において、式(IV)で示される化合物は、2個のミスマッチを含む。別の実施態様において、式(IV)で示される化合物は、3個のミスマッチを含む。別の実施態様において、式(IV)で示される化合物は、4個のミスマッチを含む。いくつかの実施態様において、各核酸は、化学修飾ヌクレオチドからなる。
特定の実施態様において、式(II)の構造のX'の>95％、>90％、>85％、>80％、>75％、>70％、>65％、>60％、>55％または>50％は、化学修飾ヌクレオチドである。他の実施態様において、式(II)の構造のX'の>95％、>90％、>85％、>80％、>75％、>70％、>65％、>60％、>55％または>50％は、化学修飾ヌクレオチドである。
式(V)の構造
いくつかの実施態様において、式(I)で示される化合物は、式(V):
Figure 2022528487000050
 ［式中、Xは、出現するごとに独立して、2'-デオキシ-2'-フルオロ修飾を含むヌクレオチドであり;Xは、出現するごとに独立して、2'-O-メチル修飾を含むヌクレオチドであり;Yは、出現するごとに独立して、2'-デオキシ-2'-フルオロ修飾を含むヌクレオチドであり;そして、Yは、出現するごとに独立して、2'-O-メチル修飾を含むヌクレオチドである］の構造を有する。
特定の実施態様において、Xは、2'-デオキシ-2'-フルオロ修飾アデノシン、グアノシン、ウリジンまたはシチジンからなる群から選択される。いくつかの実施態様において、Xは、2'-O-メチル修飾アデノシン、グアノシン、ウリジンまたはシチジンからなる群から選択される。いくつかの実施態様において、Yは、2'-デオキシ-2'-フルオロ修飾アデノシン、グアノシン、ウリジンまたはシチジンからなる群から選択される。いくつかの実施態様において、Yは、2'-O-メチル修飾アデノシン、グアノシン、ウリジンまたはシチジンからなる群から選択される。
特定の実施態様において、the 式(V)の構造 does not contain ミスマッチes。一実施態様において、式(V)の構造は、1個のミスマッチを含む。別の実施態様において、式(V)で示される化合物は、2個のミスマッチを含む。別の実施態様において、式(V)で示される化合物は、3個のミスマッチを含む。別の実施態様において、式(V)で示される化合物は、4個のミスマッチを含む。
可変リンカー
式(I)で示される化合物の実施態様において、Lは、L1:
Figure 2022528487000051
 の構造を有する。
L1の実施態様において、RはR3であり、nは2である。
式(II)の構造の実施態様において、Lは、L1の構造を有する。式(III)の構造の実施態様において、Lは、L1の構造を有する。式(IV)の構造の実施態様において、Lは、L1の構造を有する。式(V)の構造の実施態様において、Lは、L1の構造を有する。式(VI)の構造の実施態様において、Lは、L1の構造を有する。式(VI)の構造の実施態様において、Lは、L1の構造を有する。
式(I)で示される化合物の実施態様において、Lは、L2:
Figure 2022528487000052
 の構造を有する。
L2の実施態様において、RはR3であり、nは2である。式(II)の構造の実施態様において、Lは、L2の構造を有する。式(III)の構造の実施態様において、Lは、L2の構造を有する。式(IV)の構造の実施態様において、Lは、L2の構造を有する。式(V)の構造の実施態様、Lは、L2の構造を有する。式(VI)の構造の実施態様において、Lは、L2の構造を有する。式(VI)の構造の実施態様において、Lは、L2の構造を有する。
送達システム
第三の態様において、本明細書では、式(VI):
Figure 2022528487000053
 ［式(VI)中、Lは、エチレングリコール鎖、アルキル鎖、ペプチド、RNA、DNA、ホスフェート、ホスホネート、ホスホルアミデート、エステル、アミド、トリアゾール、およびこれらの組み合わせから選択され、ここで、式(VI)は、場合により1つまたはそれ以上の分岐点B、および1つまたはそれ以上のスペーサーSをさらに含んでいてよく(ここで、Bは、出現するごとに独立して、多価有機種またはその誘導体であり;Sは、出現するごとに独立して、エチレングリコール鎖、アルキル鎖、ペプチド、RNA、DNA、ホスフェート、ホスホネート、ホスホルアミデート、エステル、アミド、トリアゾール、およびこれらの組み合わせから選択される);各cNA、独立して、1つまたはそれ以上の化学修飾を含む担体核酸であり;そして、nは、2、3、4、5、6、7または8である］の構造を有する、治療的核酸のための送達システムが提供される。
送達システムの一実施態様において、Lはエチレングリコール鎖である。送達システムの別の実施態様において、Lはアルキル鎖である。送達システムの別の実施態様において、Lはペプチドである。送達システムの別の実施態様において、LはRNAである。送達システムの別の実施態様において、LはDNAである。送達システムの別の実施態様において、Lはホスフェートである。送達システムの別の実施態様において、Lはホスホネートである。送達システムの別の実施態様において、Lはホスホルアミデートである。送達システムの別の実施態様において、Lはエステルである。送達システムの別の実施態様において、Lはアミドである。送達システムの別の実施態様において、Lはトリアゾールである。
送達システムの一実施態様において、Sはエチレングリコール鎖である。別の実施態様において、Sはアルキル鎖である。送達システムの別の実施態様において、Sはペプチドである。別の実施態様において、SはRNAである。送達システムの別の実施態様において、SはDNAである。送達システムの別の実施態様において、Sはホスフェートである。送達システムの別の実施態様において、Sはホスホネートである。送達システムの別の実施態様において、Sはホスホルアミデートである。送達システムの別の実施態様において、Sはエステルである。別の実施態様において、Sはアミドである。別の実施態様において、Sはトリアゾールである。
送達システムの一実施態様において、nは2である。送達システムの別の実施態様において、nは3である。送達システムの別の実施態様において、nは4であり。送達システムの別の実施態様において、nは5である。送達システムの別の実施態様において、nは6である。送達システムの別の実施態様において、nは7である。送達システムの別の実施態様において、nは8である。
特定の実施態様において、各cNAは、>95％、>90％、>85％、>80％、>75％、>70％、>65％、>60％、>55％または>50％の化学修飾ヌクレオチドを含む。
いくつかの実施態様において、式(VI)で示される化合物は、表7:
Figure 2022528487000054
 の式(VI-1)～(VI-9)から選択される構造を有する。
いくつかの実施態様において、式(VI)で示される化合物は、式(VI-1)の構造である。いくつかの実施態様において、式(VI)で示される化合物は、式(VI-2)の構造である。いくつかの実施態様において、式(VI)で示される化合物は、式(VI-3)の構造である。いくつかの実施態様において、式(VI)で示される化合物は、式(VI-4)の構造である。いくつかの実施態様において、式(VI)で示される化合物は、式(VI-5)の構造である。いくつかの実施態様において、式(VI)で示される化合物は、式(VI-6)の構造である。いくつかの実施態様において、式(VI)で示される化合物は、式(VI-7)の構造である。いくつかの実施態様において、式(VI)で示される化合物は、式(VI-8)の構造である。いくつかの実施態様において、式(VI)で示される化合物は、式(VI-9)の構造である。
いくつかの実施態様において、式(VI)(例えば、式(VI-1)-(VI-9)を含む)で示される化合物は、各cNAが、独立して、少なくとも15個の連続するヌクレオチドを含む。いくつかの実施態様において、各cNAは、独立して、化学修飾ヌクレオチドからなる。
いくつかの実施態様において、送達システムは、n個の治療的核酸(NA)をさらに含み、ここで、各NAは、5' AAGAAAAGACCUGAUAAAGAUUAACCAGAAGAAAACAAGGAGGGA 3'と実質的に相補的な相補性領域を含む。また、各NAは、少なくとも1つのcNAにハイブリダイズしている。一実施態様において、送達システムは、2個のNAからなる。別の実施態様において、送達システムは、3個のNAからなる。別の実施態様において、送達システムは、4個のNAからなる。別の実施態様において、送達システムは、5個のNAからなる。別の実施態様において、送達システムは、6個のNAからなる。別の実施態様において、送達システムは、7個のNAからなる。別の実施態様において、送達システムは、8個のNAからなる。
いくつかの実施態様において、各NAは、独立して、少なくとも16個の連続するヌクレオチドを含む。いくつかの実施態様において、各NAは、独立して、16～20個の連続するヌクレオチドを含む。いくつかの実施態様において、各NAは、独立して、16個の連続するヌクレオチドを含む。別の実施態様において、各NAは、独立して、17個の連続するヌクレオチドを含む。別の実施態様において、各NAは、独立して、18個の連続するヌクレオチドを含む。別の実施態様において、各NAは、独立して、19個の連続するヌクレオチドを含む。別の実施態様において、各NAは、独立して、20個の連続するヌクレオチドを含む。
いくつかの実施態様において、各NAは、少なくとも2個のヌクレオチドの不対突出部を含む。別の実施態様において、各NAは、少なくとも3個のヌクレオチドの不対突出部を含む。別の実施態様において、各NAは、少なくとも4個のヌクレオチドの不対突出部を含む。別の実施態様において、各NAは、少なくとも5個のヌクレオチドの不対突出部を含む。別の実施態様において、各NAは、少なくとも6個のヌクレオチドの不対突出部を含む。いくつかの実施態様において、突出部のヌクレオチドは、ホスホロチオエート結合を介して結合されている。
いくつかの実施態様において、各NA、独立して、DNA、siRNA、アンタゴmiR、miRNAs、ギャップマー、ミックスマー、またはガイドRNAからなる群から選択される。一実施態様において、各NAは、独立してDNAである。別の実施態様において、各NAは、独立してsiRNAである。別の実施態様において、各NAは、独立してアンタゴmiRである。別の実施態様において、各NAは、独立してmiRNAである。別の実施態様において、各NAは、独立してギャップマーである。別の実施態様において、各NAは、独立してミックスマーである。別の実施態様において、各NAは、独立してガイドRNAである。いくつかの実施態様において、各NAは同じである。いくつかの実施態様において、各NAは異なっている。
いくつかの実施態様において、n個の治療的核酸(NA)をさらに含む送達システムは、式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)、および本明細書に記載のそれらの実施態様から選択される構造を有する。一実施態様において、送達システムは、2個の治療的核酸(NA)をさらに含む式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)、および本明細書に記載のそれらの実施態様から選択される構造を有する。別の実施態様において、送達システムは、3個の治療的核酸(NA)をさらに含む式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)、および本明細書に記載のそれらの実施態様から選択される構造を有する。一実施態様において、送達システムは、4個の治療的核酸(NA)をさらに含む式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)、および本明細書に記載のそれらの実施態様から選択される構造を有する。一実施態様において、送達システムは、5個の治療的核酸(NA)をさらに含む式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)、および本明細書に記載のそれらの実施態様から選択される構造を有する。一実施態様において、送達システムは、6個の治療的核酸(NA)をさらに含む式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)、および本明細書に記載のそれらの実施態様から選択される構造を有する。一実施態様において、送達システムは、7個の治療的核酸(NA)をさらに含む式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)、および本明細書に記載のそれらの実施態様から選択される構造を有する。一実施態様において、送達システムは、8個の治療的核酸(NA)をさらに含む式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)、および本明細書に記載のそれらの実施態様から選択される構造を有する。
一実施態様において、送達システムは、構造L1またはL2［ここで、RはR3であり、nは2である］のリンカーをさらに含む式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)から選択される構造を有する。別の実施態様において、送達システムは、構造L1［ここで、RはR3であり、nは2である］のリンカーをさらに含む式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)から選択される構造を有する。別の実施態様において、送達システムは、構造L2［ここで、RはR3であり、nは2である］のリンカーをさらに含む式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)から選択される構造を有する。
送達システムの実施態様において、送達の標的は、脳、肝臓、皮膚、腎臓、脾臓、膵臓、結腸、脂肪、肺、筋肉、および胸腺からなる群から選択される。一実施態様において、送達の標的は脳である。別の実施態様において、送達の標的は脳の線条体である。別の実施態様において、送達の標的は脳の皮質である。別の実施態様において、送達の標的は脳の線条体である。一実施態様において、送達の標的は肝臓である。一実施態様において、送達の標的は皮膚である。一実施態様において、送達の標的は腎臓である。一実施態様において、送達の標的は脾臓である。一実施態様において、送達の標的は膵臓である。一実施態様において、送達の標的は結腸である。一実施態様において、送達の標的は脂肪である。一実施態様において、送達の標的は肺である。一実施態様において、送達の標的は筋肉である。一実施態様において、送達の標的は胸腺である。一実施態様において、送達の標的は脊髄である。
本開示に記載の方法は、本明細書に開示されている特定の方法および実験条件に限定されるものではなく、そのような方法および条件は変動し得ることを理解すべきである。また、本明細書で使用されている用語は、ただ特定の実施様態を説明する目的のためのものであり、限定することを意図したものではないことを理解すべきである。
さらに、本明細書に記載の実験は、特に断らない限り、当業者の範囲内で従来の分子・細胞生物学的および免疫学的技術を使用する。そのような技術は、当業者にはよく知られており、文献で十分に説明されている。例えば、Ausubel, et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY (1987-2008), including all supplements, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Fourth Edition) by MR Green and J. Sambrook and Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Chapter 14, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (2013, 2nd edition)を参照のこと。
特定の実施態様において、本出願の化合物は、以下の性質を特徴とする:(1)例えば、3'および5'末端の数が等しくない2つまたはそれ以上の分岐状オリゴヌクレオチド；(2)実質的に化学的に安定化されており、例えば、40％を超える、最適には100％のオリゴヌクレオチドが化学的に修飾されている(例えば、RNAがなく、かつ場合によりDNAがなくてよい)；および(3)少なくとも3個の、最適には5～20個のホスホロチオエート化結合を含むホスホロチオネート化単一のオリゴヌクレオチド。
V. 核酸、ベクター、宿主細胞の導入方法
本出願のRNAサイレンシング剤は、細胞(例えば、神経細胞)に(すなわち、細胞内に)直接導入されてもよく、細胞外でキャビティ、間質腔、生物の循環に導入されてもよく、経口的に導入されてもよく、核酸を含有する溶液に細胞または生物を浸すことによって導入されてもよい。血管または血管外循環、血液またはリンパ系、および脳脊髄液が、核酸が導入され得る部位である。
本出願のRNAサイレンシング剤は、核酸を含有する溶液の注射、核酸によって覆われた粒子による衝撃(bombardment)、核酸の溶液への細胞または生物の浸漬、または核酸の存在下での細胞膜のエレクトロポレーションを含む、当技術分野で知られている核酸送達方法を用いて導入することができる。細胞に核酸を導入するための当技術分野で知られている他の方法、例えば、脂質媒介担体輸送、化学媒介輸送、およびリン酸カルシウムなどのカチオン性リポソームトランスフェクションなどを使用することができる。核酸は、細胞による核酸取り込みを増強するか、または、標的遺伝子の阻害を増加させる、といった活動の1つまたはそれ以上を行う他の成分と共に導入され得る。
核酸を導入する物理的方法は、RNAを含有する溶液の注射、RNAによって覆われた粒子による衝撃、RNAの溶液への細胞または生物の浸漬、またはRNAの存在下での細胞膜のエレクトロポレーションを含む。ウイルス粒子にパッケージされたウイルスコンストラクトは、細胞への発現コンストラクトの効率的な導入と、この発現コンストラクトによってコードされるRNAの転写の両方を達成し得る。細胞に核酸を導入するための当技術分野で知られている他の方法、例えば、脂質媒介担体輸送、リン酸カルシウムなどの化学媒介輸送などを使用することができる。このように、RNAは、細胞によるRNAの取り込みを向上させるか、一本鎖のアニーリングを阻害するか、一本鎖を安定化させるか、または標的遺伝子の阻害を増加させる、といった活動の1つまたはそれ以上を行う成分と共に導入され得る。
RNAは、細胞に(すなわち、細胞内に)直接導入されるか、細胞外でキャビティ、間質腔、生物の循環に導入されるか、経口的に導入されるか、細胞または生物をRNAを含有する溶液に浸すことによって導入されることができる。血管または血管外循環、血液またはリンパ系、および脳脊髄液は、RNAが導入され得る部位である。
標的遺伝子を有する細胞は、生殖細胞系または体細胞系細胞、分化全能性または多能性細胞、分裂または非分裂細胞、実質または上皮細胞、不死化または形質転換細胞などに由来し得る。細胞は、ステム細胞または分化型細胞であり得る。分化される細胞型は、脂肪細胞、線維芽細胞、筋細胞、心筋細胞、内皮細胞、神経細胞、膠細胞、血液細胞、巨核球、リンパ球、マクロファージ、好中球、好酸球、好塩基球、肥満細胞、白血球、顆粒球、ケラチン生成細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、肝細胞、および内分泌または外分泌腺の細胞を含む。
特定の標的遺伝子、および送達される二本鎖RNA材料の用量に応じて、このプロセスは、標的遺伝子の機能の部分的または完全な損失を提供することができる。標的とされる細胞の少なくとも50％、60％、70％、80％、90％、95％または99％またはそれ以上の低下または損失が例示的である。遺伝子発現の阻害とは、標的遺伝子からのタンパク質および/またはmRNA産物のレベルが存在しない(または観察可能な低減)ことを意味する。特異性とは、細胞の他の遺伝子に影響を顕在化することなく、標的遺伝子を阻害する力を意味する。阻害の結果は、細胞または生物の外見上の性質を試験することにより(以下の実施例で示される)、あるいはRNA溶液ハイブリダイゼーション、ヌクレアーゼ保護、ノーザンハイブリダイゼーション、逆転写、マイクロアレイでの遺伝子発現モニタリング、抗体結合、酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)、ウエスタンブロット法、放射免疫測定法(RIA)、その他の免疫測定法、および蛍光標識細胞分取(FACS)などの生化学的技術により確認することができる。
細胞株または生物全体におけるRNA媒介阻害の場合、遺伝子の発現は、タンパク質産物が容易にアッセイされるレポーター遺伝子またっは薬物耐性遺伝子を使用することによって簡便にアッセイすることができる。このようなレポーター遺伝子は、アセトヒドロキシ酸シンターゼ(AHAS)、アルカリホスファターゼ(AP)、βガラクトシダーゼ(LacZ)、βグルクロニダーゼ(GUS)、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)、緑色蛍光タンパク質(GFP)、セイヨウワサビペルオキシダーゼ(HRP)、ルシフェラーゼ(Luc)、ノパリンシンターゼ(NOS)、オクトピンシンターゼ(OCS)、およびそれらの誘導体を含む。アンピシリン、ブレオマイシン、クロラムフェニコール、ゲンタマイシン、ハイグロマイシン、カナマイシン、リンコマイシン、メトトレキサート、ホスフィノトリシン、ピューロマイシン、およびテトラサイクリンに対する耐性をもたらす複数の選択可能なマーカーが利用できる。アッセイに応じて、遺伝子の発現量を定量することにより、本出願によって処理されていない細胞と比較して、10％、33％、50％、90％、95％または99％を超える阻害の度合いを判定することを可能にする。注射される材料の用量が少なく、RNAi剤の投与後の時間が長いと、より少ない画分の細胞(例えば、標的細胞の少なくとも10％、20％、50％、75％、90％、または95％)で阻害が生じ得る。細胞中の遺伝子発現を量子化すると、標的mRNAの蓄積または標的タンパク質の翻訳のレベルで、同様の量の阻害を示し得る。一例として、阻害の効率は、細胞中の遺伝子産物の量を評価することによって決定することができ、mRNAは、阻害性二本鎖RNAに使用される領域の外側のヌクレオチド配列を有するハイブリダイゼーションプローブで検出されるか、翻訳されたポリペプチドは、その領域のポリペプチド配列に対して上昇された抗体で検出され得る。
RNAは、細胞あたり少なくとも1コピーの送達を可能にする量で導入され得る。高用量(例えば、細胞あたり少なくとも5、10、100、500または1000コピー)の材料は、より効果的な阻害をもたらすことができ、低用量も特定の適用に有用であり得る。
例示的な態様において、本出願のRNAi剤(例えば、C9ORF72標的配列を標的とするsiRNA)の有効性は、細胞、特に、神経細胞(例えば、線条体または皮質神経細胞のクローンライン(clonal line)および／または初代神経細胞)において、変異mRNA(例えば、C9ORF72 mRNAおよび／またはC9ORF72タンパク質の産生)を特異的に分解する能力について試験される。細胞ベースの検証アッセイにも適しているのは、他の容易にトランスフェクション可能な細胞、例えば、HeLa細胞またはCOS細胞である。細胞は、ヒトの野生型または変異型cDNA(例えば、ヒトの野生型または変異型C9ORF72 cDNA)でトランスフェクトされる。標準的なsiRNA、修飾siRNA、またはUループmRNAからsiRNAを生成できるベクターはコトランスフェクトされる。標的mRNA(例えば、C9ORF72 mRNA)および／または標的タンパク質(例えば、C9ORF72タンパク質)における選択的低減が測定される。標的mRNAまたはタンパク質の低減は、RNAi剤の非存在下、またはC9ORF72 mRNAを標的としないRNAi剤の存在下で、標的mRNAまたはタンパク質のレベルと比較することができる。外因的に導入されたmRNAまたはタンパク質(または内因性のmRNAまたはタンパク質)は、比較の目的でアッセイすることができる。標準的なトランスフェクション技術にいくらか耐性があることが知られている神経細胞を利用する場合、受動的取り込みによってRNAi剤(例えば、siRNA)を導入することが望ましいことがある。
組換えアデノ随伴ウイルスおよびベクター
特定の例示的な実施態様において、組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)およびその関連するベクターを用いて、1つまたはそれ以上のsiRNAを細胞、例えば、神経細胞(例えば、脳細胞)へ送達することができる。AAVは、さまざまな細胞型に感染することができるが、感染効率は、カプシドタンパク質の配列によって決定される血清型によって異なる。いくつかのネイティブなAAVの血清型が同定されており、血清型1～9が組換えAAVに最もよく使用されている。AAV-2は最もよく研究され、発表されている血清型である。AAV-DJシステムには、血清型AAV-DJおよびAAV-DJ/8を含む。これらの血清型は、複数のAAV血清型のDNAシャッフリングによって作成され、さまざまな細胞および組織においてインビトロ(AAV-DJ)およびインビボ(AAV-DJ/8)で形質導入効率が改善されたハイブリッドキャプシドを有するAAVを生成する。
特定の実施態様において、広範な中枢神経系(CNS)送達は、組換えアデノ随伴ウイルス7(RAAV7)、RAAV9およびrAAV10、または他の適切なrAAVの血管内送達によって達成することができる(Zhang et al. (2011) Mol. Ther. 19(8):1440-8. doi: 10.1038/mt.2011.98. Epub 2011 May 24)。rAAVおよびその関連するベクターは、当該技術分野ではよく知られており、米国特許出願2014/0296486、2010/0186103、2008/0269149、2006/0078542、および2005/0220766に記載されており、これらの各出願はすべての目的のためにその全体が引用により本明細書に包含される。
rAAVは、当該技術分野で知られているいずれかの適切な方法によって、組成物で対象に送達され得る。rAAVは、生理学的に適合する担体(すなわち、組成物)に懸濁でき、対象、すなわち、ヒト、マウス、ラット、ネコ、イヌ、ヒツジ、ウサギ、ウマ、ウシ、ヤギ、ブタ、モルモット、ハムスター、ニワトリ、シチメンチョウ、非ヒト霊長類(例えば、マカク)などの宿主動物に投与され得る。特定の実施態様において、宿主動物は非ヒト宿主動物である。
哺乳動物対象への1つまたはそれ以上のrAAVの送達は、例えば、筋肉内注射または哺乳動物対象の血流への投与により実施され得る。血流への投与は、静脈、動脈またはいずれかの他の血管導管への注射により得る。特定の実施態様において、1つまたはそれ以上のrAAVは、rAAVビリオンの投与前に、技術者が1つの肢を全身循環から分離することを本質的に可能とする方法である、外科分野でよく知られている技術である分離式肢灌流の方法で血流に投与される。米国特許6,177,403に記載されている分離式肢灌流技術の変法も、筋肉細胞または組織への形質導入を潜在的に向上させるために、分離した肢の脈管構造にビリオンを投与するために当業者により用いられ得る。さらに、ある状況で、対象の中枢神経系(CNS)にビリオンを送達することが望ましいかもしれない。「CNS」は、脊椎動物の脳および脊髄の全ての細胞および組織を意味する。故に、本用語は、神経細胞、グリア細胞、星状膠細胞、脳脊髄液(CSF)、間質性空間、骨、軟骨などを含むが、これらに限定されない。組換えAAVは、定位的注射によるなどの当分野で知られる脳神経外科技術を用いて、針、カテーテルまたは関連するデバイスで、例えば、脳室領域、ならびに線条体(例えば、線条体の尾状核または被殻)、脊髄および神経筋接合部または小脳小葉に注入することにより、CNSまたは脳に直接的に送達され得る(例えば、Stein et al., J Virol 73:3424-3429, 1999; Davidson et al., PNAS 97:3428-3432, 2000; Davidson et al., Nat. Genet. 3:219-223, 1993; and Alisky and Davidson, Hum. Gene Ther. 11:2315-2329, 2000を参照のこと)。
本出願の組成物は、rAAVを単独で、または1つまたはそれ以上の他のウイルス(例えば、1つまたはそれ以上の異なる導入遺伝子を有するコード化第二rAAV)と組み合わせて含み得る。特定の実施態様において、組成物は、それぞれ1つまたはそれ以上の異なる導入遺伝子を有する1、2、3、4、5、6、7、8、9、10またはそれ以上の異なるrAAVを含む。
rAAVの有効量は、所望の組織を標的とする動物の標的感染に十分な量である。いくつかの実施態様において、rAAVの有効量は、安定な体細胞トランスジェニック動物モデルを産生するのに十分な量である。有効量は、主に対象の種、年齢、体重、健康状態、標的とされる組織などの因子に依存し、動物および組織間で変わり得る。例えば、1つまたはそれ以上のrAAVの有効量は、一般に約109～1016ゲノムコピーを含む約1ml～約100mlの溶液の範囲である。いくつかの場合、約1011～1012rAAVゲノムコピーの用量が適切である。特定の実施態様において、1012rAAVゲノムコピーは、心臓、肝臓、および膵臓の組織を標的とするのに有効である。いくつかの場合、安定なトランスジェニック動物は、rAAVの複数回の投与により産生される。
いくつかの実施態様において、rAAV組成物は、特に、rAAVが高濃度(例えば、約1013ゲノムコピー／mLまたはそれ以上)で存在するとき、組成物中のAAV粒子の凝集を低減するように製剤化される。rAAVの凝集を低減する方法は当該分野でよく知られており、例えば、界面活性剤の添加、pH調整、塩濃度の調整などを含む。(例えば、内容を引用により本明細書に包含させるWright et al. (2005) Molecular Therapy 12:171-178を参照のこと)
「組換えAAV(rAAV)ベクター」は、最小限、導入遺伝子およびその調節配列、ならびに5'および3'AAV逆位末端配列(ITR)を含む。キャプシドタンパク質に包装され、選択標的細胞に送達されるのは、この組換えAAVベクターである。いくつかの実施態様において、導入遺伝子は、目的のポリペプチド、タンパク質、機能的RNA分子(例えば、siRNA)または他の遺伝子産物をコードする、ベクター配列と異種の核酸配列である。核酸コード配列は、標的組織の細胞における導入遺伝子の転写、翻訳および／または発現を可能にする方法で、調節成分に操作可能に結合する。
ベクターのAAV配列は、典型的にはシス作用性5'および3'逆位末端(ITR)配列を含む(例えば、B. J. Carter, in "Handbook of Parvoviruses", ed., P. Tijsser, CRC Press, pp. 155 168 (1990)を参照のこと)。ITR配列は、通常、約145塩基対長である。特定の実施態様において、実質的にはITRをコードする配列全体が分子に使用されるが、これらの配列のある程度の小さな修飾は許容される。これらのITR配列を修飾する能力は当業者の技術範囲内である(例えば、Sambrook et al, "Molecular Cloning. A Laboratory Manual", 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1989)； and K. Fisher et al., J Virol., 70:520 532 (1996)の文章を参照のこと)。本出願で使用されるこのような分子の例は、選択導入遺伝子配列および関連する調節要素が5'および3'AAV ITR配列に隣接されている、導入遺伝子を含む「シス作用性」プラスミドである。AAV ITR配列は、本明細書にさらに記載される哺乳動物AAV型を含む、知られているいずれかのAAVから得ることができる。
VI. 処置方法
本出願は、C9ORF72遺伝子における異常によって全体的または部分的に引き起こされる疾患または障害の危険性がある(またはその影響を受けやすい)対象を処置する予防的および治療的方法を提供する。一実施態様において、このような異常が脳および脊髄における神経変性の進行を予測することが見出されている。別の実施態様において、疾患または障害は、ポリグルタミン障害である。好ましい実施態様において、CNSにおけるC9ORF72の低減によりADおよびALSなどの神経変性疾患に見られる臨床症状を低減する疾患または障害のもの。
本明細書で使用される「処置」または「処置する」は、患者への治療剤(例えば、RNA剤またはそれをコードするベクターもしくは導入遺伝子)の適用または投与、または、疾患もしくは障害を有するか、疾患もしくは障害の症状を有するか、疾患または障害の素因を有する患者からの単離組織または細胞株に、疾患または障害、疾患または障害の症状、または疾患の素因を治す、治癒する、軽減する、緩和する、変化させる、治療する、回復する(ameliorate)、改善するまたは影響する目的で治療剤を適用または投与することとして定義される。
一態様において、本出願は、対象に治療剤(例えば、RNAi剤またはそれをコードするベクターまたは導入遺伝子)を該患者に投与することによって、対象における上記の疾患または障害を予防する方法を提供する。疾患に対する危険性のある対象は、例えば、本明細書に記載の診断または予測アッセイのいずれかまたは組み合わせによって特定され得る。予防剤の投与は、疾患または障害の特徴の症状の顕在化前に行い、それにより、疾患または障害が予防されるか、あるいはその進行を遅らせることができる。
本出願の別の態様は、患者を治療的に処置する、すなわち、疾患または障害の症状の発症を変化させる方法に関するものである。例示的な実施態様において、本出願の修飾方法は、C9ORF72を発現するCNS細胞に、遺伝子との配列特異的干渉が達成されるように、遺伝子中の標的配列に特異的な治療剤(例えば、RNAi剤またはそれをコードするベクターもしくは導入遺伝子)を接触させることを含む。これらの方法は、インビトロ(例えば、薬剤を用いて細胞を培養することによって)、または代わりにインビボ(例えば、対象に薬剤を投与することによって)で行うことができる。
処置の予防的方法および治療的方法の両方に関して、このような処置は、薬理ゲノミクス分野から得られる知識に基づいて、特にテーラードまたは修飾し得る。本明細書において使用される「薬理ゲノミクス」とは、臨床開発中の薬物および市販されている薬物への遺伝子シークエンシング、統計遺伝学、遺伝子発現解析などのゲノミクス技術の応用を意味する。より具体的には、本用語は、患者の遺伝子が薬物に対する応答をどのように決定するか(例えば、患者の「薬物応答表現型」または「薬物応答遺伝子型」)を研究することを意味する。したがって、本出願の別の態様は、個体の予防的または治療的処置を、その個体の薬物応答遺伝子型に従い、本出願の標的遺伝子分子または標的遺伝子モジュレーター用いてテーラリングする方法を提供する。薬理ゲノミクスにより、臨床医または医師は処置により最も利益を受けるであろう患者を予防または治療処置の標的とし、毒性薬物関連副作用を経験するであろう患者の処置を回避することが可能となる。
治療剤は、適切な動物モデルで試験され得る。例えば、本明細書に記載のRNAi剤(またはそれをコードする発現ベクターもしくは導入遺伝子)を動物モデルに使用して、該薬剤での処置の有効性、毒性、または副作用を決定し得る。あるいは、治療剤を動物モデルに使用して、このような薬剤の作用メカニズムを決定し得る。例えば、薬剤を動物モデルに使用して、この薬剤での処置の有効性、毒性、または副作用を決定し得る。あるいは、薬剤を動物モデルに使用して、この薬剤の作用メカニズムを決定し得る。
本出願のRNAサイレンシング剤を含む医薬組成物は、神経変性疾患を有するか、またはそれを発症する危険性があると診断された患者に投与することができる。一実施態様において、患者は神経疾患を有すると診断され、患者のその他の全身的な健康状態は良好である。例えば、患者は末期疾患状態ではなく、患者は、少なくとも診断後2年、3年、5年、またはそれ以上生存する可能性がある。患者は、診断後すぐに処置され得てまたは患者がパーキンソン病患者における運動変動や異常運動などのより衰弱させる症状を経験するまで処置を遅らせてもよい。別の実施態様において、患者は疾患の進行段階に到達しない。
神経細胞への取り込みを向上させるために修飾されたRNAサイレンシング剤は、約1.4mg／体重kg未満または10mg、5mg、2mg、1mg、0.5mg、0.1mg、0.05mg、0.01mg、0.005mg、0.001mg、0.0005mg、0.0001mg、0.00005mgまたは0.00001mg／体重kg未満および200nmoleのRNA剤(例えば、約4.4×1016コピー)／体重kg未満または1500nmole、750nmole、300nmole、150nmole、75nmole、15nmole、7.5nmole、1.5nmole、0.75nmole、0.15nmole、0.075nmole、0.015nmole、0.0075nmole、0.0015nmole、0.00075nmole、0.00015nmoleのRNAサイレンシング剤／kg体重未満の単位用量で投与することができる。単位用量は、例えば、注射(例えば、静脈内または筋肉内、髄腔内または脳内に直接的に)、吸入投与または局所適用によって投与することができる。特に好ましい投与量は、2mg、1mg、または0.1mg／体重kg未満である。
臓器へのRNAサイレンシング剤の直接的な(例えば、脳に直接的に)送達は、約0.00001mg～約3mg／臓器または約0.0001～0.001mg／臓器、約0.03～3.0mg／臓器、約0.1～3.0mg／眼または約0.3～3.0mg／臓器程度の投与量であり得る。投与量は、神経変性疾患または障害、例えば、ADまたはALSの処置または予防に有効な量であり得る。一実施態様において、単位用量を、しばしば1日1回未満、例えば、2日、4日、8日、または30日ごと未満の頻度で投与する。別の実施態様において、単位用量をアル頻度で投与しない(例えば、一定頻度ではない)。例えば、単位用量を一度に投与し得る。一実施態様において、有効量を他の伝統的な治療モダリティーと共に投与する。
一実施態様において、対象に、RNAサイレンシング剤の初期用量および1つまたはそれ以上の維持用量が投与される。維持用量は、一般的に初期投与量よりも少ない、例えば、初期用量の半分少ない。維持レジメンは、0.01g～1.4mg／体重kg／日、例えば、10mg、1mg、0.1mg、0.01mg、0.001mg、または0.00001mg／体重kg／日の範囲の1以上の用量での対象の処置を含み得る。例示的な実施態様において、維持用量は、5日、10日または30日ごとに1回以下の頻度で投与される。さらに、処置レジメンは、特定の疾患の性質、その重症度、および患者の全体的な状態に応じて変化する期間にわたって継続し得る。好ましい実施態様において、投与量は、1日1回を超えない、例えば、24時間、36時間、48時間、またはそれ以上あたり1回を超えない、例えば、5日または8日ごとに1回を超えないで投与量が送達され得る。処置後、患者は、状態の変化および疾患状態の症状の緩和についてモニターされ得る。化合物の投与量は、患者が現投与量レベルに有意に応答しない場合には増量できまたは疾患状態の症状の緩和が観察される、疾患状態が除去されるまたは望まない副作用が観察されるならば、用量を減量し得る。
有効量は、特定の状況下で所望されるまたは適切と考えられる単回用量または2つまたはそれ以上の用量で投与され得る。繰り返しまたは頻繁な注入を容易にすることが望まれれば、送達デバイス、例えば、ポンプ、半永久的ステント(例えば、静脈内、腹腔内、嚢内(intracisternal)または関節内(intracapsular))、またはリザーバーの移植が望ましい。一実施態様において、医薬組成物は、複数のRNAサイレンシング剤種を含む。別の実施態様において、RNAサイレンシング剤種は、天然に存在する標的配列に関して、別の種と非オーバーラップの隣接してない配列を有する。別の実施態様において、複数のRNAサイレンシング剤種は、天然に存在する異なる標的遺伝子に特異的である。別の実施態様において、RNAサイレンシング剤は、対立遺伝子特異的である。別の実施態様において、複数のRNAサイレンシング剤種は、2つまたはそれ以上の標的配列(例えば、2、3、4、5、6、またはそれ以上の標的配列)を標的とする。
処置成功後、疾患状態の再発を予防するために患者が維持療法を受けるのが望ましいことがあり、ここで、本出願の化合物は0.01g～100g／体重kgの範囲の維持用量で投与される(米国特許6,107,094号を参照のこと)。
RNAサイレンシング剤組成物の濃度は、障害の処置もしくは予防またはヒトにおける生理的状態の制御に有効であるのに十分な量である。投与するRNAサイレンシング剤の濃度または量は、薬剤および投与方法、例えば経鼻、頬側または肺について決定されるパラメータによる。例えば、経鼻製剤は、鼻腔の刺激または傷害を避けるため、一部成分ではるかに低い濃度を必要とする傾向にある。適当な経鼻製剤を提供するために、経口製剤を最大10～100倍希釈することが望まれることがある。
疾患または障害の重症度、先の処置、全身的体調および／または対象の年齢および存在する他の疾患を含むが、これらに限定されない特定の因子が、対象の効率的に処置に必要な投与量に影響し得る。さらに、治療有効量のRNAサイレンシング剤での対象の処置は、単回処置を含み得てまたは、一連の処置を含み得る。処置のためのRNAサイレンシング剤の有効投与量は、特定の処置の経過中に増加または低減し得ることも認識される。投与量の変化は、本明細書に記載の診断アッセイの結果に起因し、明らかとなり得る。例えば、対象は、RNAサイレンシング剤組成物投与後モニターされ得る。モニタリングした情報に基づき、さらなる量のRNAサイレンシング剤組成物が投与され得る。
投与は処置する疾患状態の重症度および応答性に依存し、処置の過程は数日～数カ月または治癒がもたらされるまでまたは疾患状態の低減が達成されるまで継続する。最適投与スケジュールは、患者体内の薬物蓄積の測定により計算され得る。当業者は、最適な投与量、投与方法および反復回数を容易に決定できる。最適な投与量は、個々の化合物の相対的効力により変わり得て、一般にインビトロおよびインビボ動物モデルで有効であると判明したEC50に基づき推定され得る。いくつかの実施態様において、動物モデルは、ヒト遺伝子、例えば、標的RNAを産生する遺伝子、例えば、神経細胞で発現されるRNAを発現するトランスジェニック動物を含む。トランスジェニック動物は、対応する内因性RNAが欠損し得る。別の実施態様において、試験用組成物は、動物モデルにおける標的RNAとヒトにおける標的RNAで保存されている、配列に、少なくとも内部領域で相補的であるRNAサイレンシング剤を含む。
VII. 医薬組成物および投与方法
本発明は、後記のとおり、予防および／または治療処置のための上記薬剤の使用に関する。従って、本出願のモジュレーター(例えば、RNAサイレンシング剤)を、投与に適する医薬組成物に組み込み得る。このような組成物は、一般に核酸分子、タンパク質、抗体または修飾性化合物および薬学的に許容できる担体を含む。本明細書において使用されるとき、用語「薬学的に許容できる担体」は、医薬投与に適合性の、任意かつ全ての溶媒、分散媒体、コーティング、抗細菌および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤などを含むことを意図する。薬学的活性物質のためのこのような媒体および薬剤は当分野でよく知られている。慣用の媒体または薬剤が活性化合物と不適合ではない限り、組成物におけるその使用は考慮される。補助的活性化合物も、組成物に組み込み得る。
本出願の医薬組成物は、その意図する投与経路に適合性であるように製剤化する。投与経路の例は、非経腸、例えば、静脈内、皮内、皮下、腹腔内、筋肉内、経口(例えば、吸入)、経皮(局所)および経粘膜投与を含む。特定の例示的実施態様において、本出願の医薬組成物は、線条体内(IS)投与、脳室内(ICV)投与および髄腔内(IT)投与(例えば、ポンプを介する、注入など)を含むが、これらに限定されない投与経路により脳脊髄液(CSF)に送達される。非経腸、皮内または皮下適用に使用する溶液または懸濁液は、次の成分を含み得る：無菌希釈剤、例えば、注射用水、食塩水溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒；抗細菌剤、例えばベンジルアルコールまたはメチルパラベン；抗酸化剤、例えばアスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウム；キレート剤、例えばエチレンジアミン四酢酸；緩衝液、例えばアセテート、シトレートまたはホスフェートおよび張性調節用薬剤、例えば塩化ナトリウムまたはデキストロース。pHは、塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基で調節され得る。非経腸調剤は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジまたは複数回用バイアルに封入され得る。
注射使用に適する医薬組成物は、無菌水溶液(水溶性であるとき)または分散剤および無菌注射用溶液または分散剤の即時の調製のための無菌粉末を含む。静脈内、IS、ICＶおよび／またはIT投与のために、適当な担体は、生理食塩水、静菌水、Cremophor ELTM(BASF, Parsippany, N.J.)またはリン酸緩衝化食塩水(PBS)を含む。全例で、組成物は無菌でなければならずかつ容易な注射針通過性が存在する程度に流動性でなければならない。製造および保存条件下で安定でなければならずかつ細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して保存されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど)および適当なそれらの混合物を含む、溶媒または分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用により、分散剤の場合必要な粒子径の維持によりおよび界面活性剤の使用により維持され得る。微生物の作用の阻止は、種々の抗細菌および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどにより達成され得る。多くの場合、組成物に等張剤、例えば、糖、ポリアルコール、例えば、マンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウムを包含させることが好ましい。注射用組成物の長期吸収は、組成物を吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンに包含させることによりもたらし得る。
無菌注射用溶液は、活性化合物を必要な量で、必要に応じて上記成分の一つまたは組み合わせと適切な溶媒に取り込み、その後濾過滅菌することにより調製され得る。一般に、分散剤は、活性化合物を、基本分散媒体および上記からの必要な他の成分を含む無菌媒体に組み込むことにより調製され得る。無菌注射用溶液を調製するための無菌粉末の場合、好ましい調製方法は、活性成分と予め無菌濾過した溶液からの何らかのさらなる所望の成分の粉末を生じる真空乾燥および凍結乾燥である。
経口組成物は、一般に不活性希釈剤または食用担体を含む。それらはゼラチンカプセルに入れられまたは錠剤に圧縮され得る。経口治療投与の目的で、活性化合物は添加物と共に組み込まれ、錠剤、トローチ剤またはカプセル剤の形で使用される。経口組成物はまた洗口液として使用する流体担体を使用しても調製され、ここで、流体担体中の化合物は経口で適用され、口を漱ぎ、吐き出すかまたは嚥下される。薬学的に適合性の結合剤および／またはアジュバント材料は組成物の一部として取り込まれ得る。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤などは、次の成分または類似する性質の化合物を含み得る：結合剤、例えば微結晶セルロース、トラガカントガムまたはゼラチン；賦形剤、例えばデンプンまたはラクトース、崩壊剤、例えばアルギン酸、プリモゲルまたはコーンデンプン；滑沢剤、例えばステアリン酸マグネシウムまたはステロート；流動促進剤、例えばコロイド状二酸化ケイ素；甘味剤、例えばスクロースまたはサッカリン；または風味剤、例えばペパーミント、サリチル酸メチルまたはオレンジ風味剤。
吸入による投与のために、化合物は、適当な噴射剤、例えば、二酸化炭素などのガスを含む、加圧容器またはディスペンサーからのエアロゾルスプレーまたはネブライザーの形で送達される。
全身投はまた経粘膜または経皮手段にもより得る。経粘膜または経皮投与のために、透過すべき障壁に適する透過剤が製剤で使用される。このような透過剤は一般に当分野で知られ、例えば、経粘膜投与について、界面活性剤、胆汁酸塩およびフシジン酸誘導体を含む。経粘膜投与は経鼻スプレーまたは坐薬の使用を介して達成され得る。経皮投与のために、活性化合物を、当分野で一般に知られるとおり、軟膏剤、膏薬、ゲル剤またはクリーム剤に製剤化する。
化合物は直腸送達用の坐薬(例えば、カカオバターおよび他のグリセリドなどの慣用の坐薬基剤と)または停留浣腸の形でも製剤化され得る。
RNAサイレンシング剤はまた、McCaffrey et al. (2002), Nature, 418(6893), 38-9 (流体力学トランスフェクション); Xia et al. (2002), Nature Biotechnol., 20(10), 1006-10 (ウイルス介在送達);またはPutnam (1996), Am. J. Health Syst. Pharm. 53(2), 151-160, erratum at Am. J. Health Syst. Pharm. 53(3), 325 (1996)に記載の方法を含むが、これらに限定されない方法を使用して、トランスフェクションまたは感染によっても投与され得る。
RNAサイレンシング剤はまたDNAワクチンなどの核酸剤の投与に適するいずれかの方法でも投与できる。これらの方法は、遺伝子銃、バイオ注射器および皮膚パッチならびに米国特許6,194,389に開示の微粒子DNAワクチンテクノロジーおよび米国特許6,168,587に開示の粉末形態ワクチンの哺乳動物経皮無針ワクチン接種などの無針方法を含む。さらに、鼻腔内送達が、とりわけ、Hamajima et al. (1998), Clin. Immunol. Immunopathol., 88(2), 205-10に記載のとおり、可能である。リポソーム(例えば、米国特許6,472,375に記載)およびマイクロカプセル化も使用され得る。生分解性標的可能微粒子送達システムも使用され得る(例えば、米国特許6,471,996に記載)。
一実施態様において、活性化合物は、インプラントおよびマイクロカプセル化送達システムを含む制御放出製剤など化合物を体内からの急速な排除から保護する担体と共に調製できる。エチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸などの生分解性、生体適合性ポリマーが使用される。このような製剤を調製する方法は、当業者には明らかである。材料はまたAlza CorporationおよびNova Pharmaceuticals, Inc.から購入できる。リポソーム懸濁液(ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体で感染細胞に標的化されるリポソームを含む)も薬学的に許容できる担体として使用され得る。これらは、例えば、米国特許4,522,811に記載のとおり、当業者に知られる方法により調製され得る。
投与の容易さおよび投与量の均一性のために、経口または非経腸組成物を投与量単位で製剤化するのが特に有利である。本明細書において使用する投与量単位形態は、処置対象のための単位投与量として適する物理的に分けられた単位を意味し；各単位は、必要な医薬担体と共に所望の治療効果を生じるために計算された予定量の活性化合物を含む。本出願の投与量単位形態の明細は、活性化合物の特有の特徴および達成すべき具体的治療効果ならびに個体の処置のためのこのような活性化合物の製造の分野に固有の制限により支持されおよび直接的に依存する。
このような化合物の毒性および治療有効性は、例えば、LD50(集団の50％に致死の量)およびED50(集団の50％に治療的有効な量)を決定するための、細胞培養または実験動物における標準的医薬過程により決定され得る。毒性および治療効果の間の用量比は治療指数であり、比LD50／ED50として表され得る。大きな治療指数を示す化合物が好ましい。毒性副作用を示す化合物も使用し得るが、非感染細胞への損傷の可能性を最小限にし、それにより副作用を低減するために、罹患組織の部位にこのような化合物を標的とする送達システムの設計に注意すべきである。
細胞培養アッセイおよび動物試験で得られたデータを、ヒトに使用するための一定範囲の投与量の計算に使用できる。このような化合物の投与量は、毒性がわずかかまたはなく、ED50を含む循環濃度の範囲内に入り得る。投与量は、用いる投与量および利用する投与経路により、この範囲内で変わり得る。本出願の方法で使用するあらゆる化合物について、治療的有効用量を最初細胞培養アッセイから推定し得る。動物モデルで一定用量を製剤して、細胞培養で決定したEC50(すなわち、最大応答の半分を達成する試験化合物の濃度)を含む循環血漿濃度範囲を達成し得る。このような情報を使用して、ヒトで有用な用量をより正確に決定し得る。血漿レベルを、例えば、高速液体クロマトグラフィーにより測定し得る。
医薬組成物を、投与のための使用説明書と共に、容器、パックまたはディスペンサーに包含させ得る。
本明細書で定義するRNAサイレンシング剤の治療有効量(すなわち、有効投与量)は、選択したRNAサイレンシング剤による。例えば、shRNAをコードするプラスミドが選択されたら、約1μg～1000mgの範囲一回用量が投与される；いくつかの実施態様において、10μg、30μg、100μgまたは1000μgが投与され得る。いくつかの実施態様において、1～5gの組成物が投与され得る。組成物は、1日1回またはそれ以上～毎週1回またはそれ以上で投与され得て；隔日に１回を含む。当業者は、疾患または障害の重症度、先の処置、全身的健康状態および／または対象の年齢および存在する他の疾患を含むがこれらに限定されない特定の因子が、対象の効率的処置に必要な投与量および時機に影響し得ることを認識する。さらに、治療有効量のタンパク質、ポリペプチドまたは抗体での対象の処置は、単回処置を含み得てまたは、一連の処置を含み得る。
本出願の核酸分子は、例えば、Xia et al., (2002), Supraに記載のものを含むが、これに限定されない、当分野で知られる方法を使用して、発現コンストラクト、例えば、ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、発現カセットまたはプラスミドウイルスベクターに導入し得る。発現コンストラクトは、例えば、吸入、経口、静脈内注射、局所投与(米国特許5,328,470を参照のこと)または定位的注射(例えば、Chen et al. (1994), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 3054-3057を参照のこと)により、対象に送達され得る。送達ベクターの医薬品は、許容できる希釈剤にベクターを含み得るかまたは送達媒体が包埋される徐放マトリックスを含み得る。あるいは、完全送達ベクターが組み換え細胞、例えば、レトロウイルスベクターからインタクトで産生され得るならば、医薬品は、遺伝子送達システムを産生する1つまたはそれ以上の細胞を含み得る。
本出願の核酸分子はまた小ヘアピンRNA(shRNA)およびshRNAを発現するよう操作された発現コンストラクトも含む。shRNAの転写はポリメラーゼIII(pol III)プロモーターで開始し、4-5-チミン転写終結部位の2位で終結する。発現により、shRNAは、3'UU-突出部を有するステムループ構造に折りたたまれると考えられる；その後、これらのshRNAの末端は加工され、shRNAを、約21個のヌクレオチドのsiRNA様分子に変換する. Brummelkamp et al. (2002), Science, 296, 550-553; Lee et al, (2002). supra; Miyagishi and Taira (2002), Nature Biotechnol., 20, 497-500; Paddison et al. (2002), supra; Paul (2002), supra; Sui (2002) supra; Yu et al. (2002), supra。
発現コンストラクトは適切な発現システムで使用するのに適するあらゆるコンストラクトであり得て、当分野で知られるとおり、レトロウイルスベクター、直鎖状発現カセット、プラスミドおよびウイルスまたはウイルス由来ベクターを含むが、これらに限定されない。このような発現コンストラクトは、1つまたはそれ以上の誘導性プロモーター、U6 snRNAプロモーターまたはH1 RNAポリメラーゼIIIプロモーターなどのRNA Pol IIIプロモーター系または当分野で知られる他のプロモーターを含み得る。コンストラクトは、siRNAの一方または両方の鎖を含み得る。両鎖を発現する発現コンストラクトはまた両鎖を結合するループ構造を含み得るまたは各鎖は同じコンストラクト内の別のプロモーターから別々に転写され得る。各鎖は別の発現コンストラクトからも転写され得る、Tuschl (2002), Supra。
特定の例示的実施態様において、本出願のRNAサイレンシング剤を含む組成物は、多様な経路により対象の神経系に送達し得る。経路の例は、髄腔内、実質(例えば、脳の)、経鼻および眼送達を含む。組成物を、例えば、静脈内、皮下または筋肉内注射により全身にも送達でき、これは、末梢神経細胞へのRNAサイレンシング剤の送達に特に有用である。好ましい送達経路は、脳、例えば、脳室もしくは脳の視床下部または脳の側面もしくは背部部位に直接的である。神経細胞送達のためのRNAサイレンシング剤は、投与に適する医薬組成物に取り込まれ得る。
例えば、組成物は、1つまたはそれ以上のRNAサイレンシング剤種および薬学的に許容できる担体を含み得る。本出願の医薬組成物を、局所処置または全身処置が望まれるかおよび処置領域により、多数の方法で投与し得る。投与は、局所(眼、鼻腔内、経皮を含む)、経口または非経腸であり得る。非経腸投与は、静脈内点滴、皮下、腹腔内または筋肉内注射、髄腔内または室内(例えば、脳室内)投与を含む。特定の例示的実施態様において、本出願のRNAサイレンシング剤は、多様な適当な組成物および本明細書に記載の方法を用いて、血液－脳－関門(BBB)を超えて送達される。
送達経路は、患者の障害による。例えば、神経変性疾患を有すると診断された対象に、本出願の抗C9ORF72 RNAサイレンシング剤を、直接的に脳(例えば、基底ガングリアの淡蒼球または線条体および線条体の中型有棘ニューロン近く)に投与し得る。本出願のRNAサイレンシング剤に加えて、患者に、第二の治療、例えば、対症療法的治療および／または疾患特異的治療を施用し得る。第二の治療は、例えば、対症的(例えば、症状軽減のため)、神経保護的(例えば、疾患進行緩徐化または停止のため)または回復性(例えば、疾患過程逆転のため)であり得る。他の治療は、心理療法、理学療法、言語療法、コミュニケーションおよび記憶補助、社会支援サービスおよび喫食のアドバイスであり得る。
RNAサイレンシング剤を、脳の神経細胞に送達し得る。組成物が血液－脳関門を超える必要がない送達方法が利用され得る。例えば、RNAサイレンシング剤を含む医薬組成物を、疾患罹患細胞を含む領域に直接的に注入することにより、患者に送達し得る。例えば、医薬組成物は、脳に直接的に注射することにより送達され得る。注射は、脳の特定領域(例えば、黒質、皮質、海馬、線条体または淡蒼球)への定位的注射により得る。RNAサイレンシング剤は、中枢神経系の複数の領域(例えば、脳の複数の領域および／または脊髄)に送達され得る。RNAサイレンシング剤は、脳の汎発性領域(例えば、脳の皮質の汎発性送達)に送達され得る。
一実施態様において、RNAサイレンシング剤は、組織、例えば、脳、例えば、脳の黒質、皮質、海馬、線条体または淡蒼球に一端がインプラントされた、カニューレまたは他の送達デバイスの使用により送達され得る。カニューレは、RNAサイレンシング剤のリザーバーに接続され得る。送流または送達は、ポンプ、例えば、Alzetポンプ(Durect, Cupertino, CA)などの浸透圧ポンプまたはミニポンプにより媒介され得る。一実施態様において、ポンプおよびリザーバーは、組織から遠位の領域、例えば、腹部にインプラントされ、送達は、ポンプまたはリザーバーから放出部位に至る導管により実施される。脳への送達のためのデバイスは、例えば、米国特許6,093,180および5,814,014に記載される。
本出願のRNAサイレンシング剤は、血液脳関門を通過できるように、さらに修飾され得る。例えば、RNAサイレンシング剤は、薬剤の関門の通過を可能とする分子にコンジュゲートされ得る。このような修飾RNAサイレンシング剤を、例えば、脳室内または筋肉内注射または肺送達などの、何らかの所望の方法で投与し得る。
特定の実施態様において、エキソソームを、本出願のRNAサイレンシの送達に使用する。エキソソームは、BBBを通過でき、全身注射後siRNA、アンチセンスオリゴヌクレオチド、化学療法剤およびタンパク質を、特に神経細胞に送達させる(Alvarez-Erviti L, Seow Y, Yin H, Betts C, Lakhal S, Wood MJ. (2011). Delivery of siRNA to the mouse brain by systemic injection of targeted exosomes. Nat Biotechnol. 2011 Apr;29(4):341-5. doi: 10.1038/nbt.1807; El-Andaloussi S, Lee Y, Lakhal-Littleton S, Li J, Seow Y, Gardiner C, Alvarez-Erviti L, Sargent IL, Wood MJ.(2011). Exosome-mediated delivery of siRNA in vitro and in vivo. Nat Protoc. 2012 Dec;7(12):2112-26. doi: 10.1038/nprot.2012.131; EL Andaloussi S, Mager I, Breakefield XO, Wood MJ. (2013). Extracellular vesicles: biology and emerging therapeutic opportunities. Nat Rev Drug Discov. 2013 May;12(5):347-57. doi: 10.1038/nrd3978; El Andaloussi S, Lakhal S, Mager I, Wood MJ. (2013). Exosomes for targeted siRNA delivery across biological barriers. Adv Drug Deliv Rev. 2013 Mar;65(3):391-7. doi: 10.1016/j.addr.2012.08.008を参照のこと)。
特定の実施態様において、1つまたはそれ以上の親油性分子を、本出願のRNAサイレンシング剤のBBBを通過する送達を可能とするために使用する(Alvarez-Ervit (2011))。次いで、RNAサイレンシング剤は、例えば、薬物をその活性形態で放出するための、親油性偽装化合物の酵素分解により、活性化される。
特定の実施態様において、化合物の透過化に介在する1つまたはそれ以上の受容体を使用して、BBBの透過性を増加させ、本出願のRNAサイレンシング剤の送達を可能とし得る。これらの薬物は、内皮細胞間の密着結合を緩める、血液中の浸透圧の一時的増加により、BBBの透過性を増加させる((El-Andaloussi (2012))。密着結合を緩めることにより、RNAサイレンシング剤の通常の静脈内注射が実施され得る。
特定の実施態様において、ナノ粒子ベースの送達システムが、BBBを通過する本出願のRNAサイレンシング剤の送達に使用される。本明細書において使用されるとき、「ナノ粒子」は、薬物または遺伝子担体として広く研究されている、一般に固体、生分解性、コロイド状系である重合ナノ粒子を意味する(S. P. Egusquiaguirre, M. Igartua, R. M. Hernandez, and J. L. Pedraz, “Nanoparticle delivery systems for cancer therapy: advances in clinical and preclinical research,” Clinical and Translational Oncology, vol. 14, no. 2, pp. 83-93, 2012)。重合ナノ粒子は、天然ポリマーおよび合成ポリマーの2つの大きなカテゴリーに分類される。siRNA送達のための天然ポリマーは、シクロデキストリン、キトサンおよびアテロコラーゲンを含むが、これらに限定されない(Y. Wang, Z. Li, Y. Han, L. H. Liang, and A. Ji, “Nanoparticle-based delivery system for application of siRNA in vivo,” Current Drug Metabolism, vol. 11, no. 2, pp. 182-196, 2010)。合成ポリマーは、集中的研究されている、ポリエチレンイミン(PEI)、ポリ(dl-ラクチド－コ－グリコリド)(PLGA)およびデンドリマーを含むが、これらに限定されない(X. Yuan, S. Naguib, and Z. Wu, “Recent advances of siRNA delivery by nanoparticles,” Expert Opinion on Drug Delivery, vol. 8, no. 4, pp. 521-536, 2011). For a review of nanoparticles and other suitable delivery systems, See Jong-Min Lee, Tae-Jong Yoon, and Young-Seok Cho, “Recent Developments in Nanoparticle-Based siRNA Delivery for Cancer Therapy,” BioMed Research International, vol. 2013, Article ID 782041, 10 pages, 2013. doi:10.1155/2013/782041(引用により全体として包含される))。
本出願のRNAサイレンシング剤は、網膜障害、例えば、網膜症の処置のためなどに、眼投与され得る。例えば、医薬組成物を、眼表面または隣接組織、例えば、眼瞼内に適用できる。局所的に、例えば、噴射、点眼、眼洗浄液または軟膏として適用され得る。軟膏または滴下可能液体を、アプリケーターまたは点眼器などの当分野で知られる眼送達システムにより送達し得る。このような組成物は、ムコミメティック、例えばヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、ヒドロキシプロピルメチルセルロースまたはポリ(ビニルアルコール)、防腐剤、例えばソルビン酸、EDTAまたは塩化ベンジルクロニウムおよび通常の量の希釈剤および／または担体を含み得る。医薬組成物はまた眼内部にも投与でき、選択領域または構造に導入できる針または他の送達デバイスにより導入され得る。RNAサイレンシング剤を含む組成物は、眼パッチを介しても投与され得る。
一般に、本出願のRNAサイレンシング剤は、あらゆる適当な方法で投与され得る。本明細書において使用されるとき、局所送達とは、眼、粘膜、体腔表面またはいずれかの内部表面を含む、体のあらゆる表面へのRNAサイレンシング剤の直接適用を意味する。局所投与用製剤は、経皮パッチ剤、軟膏剤、ローション剤、クリーム剤、ゲル剤、液滴剤、スプレー剤および液剤を含み得る。慣用の医薬担体、水性、粉末または油性基剤、濃厚剤などが必要であるか望ましいことがある。RNAサイレンシング剤を対象の表皮または真皮またはその特定の層または裏層組織に選択的に送達する手段として、局所投与も使用され得る。
髄腔内または脳室内(例えば、脳室内)投与用組成物は、緩衝液、希釈剤および他の適当な添加剤も含み得る無菌水溶液を含み得る。いくつかの実施態様において、髄腔内または脳室内投与用組成物は、トランスフェクション試薬または、例えば、RNAサイレンシング剤に結合された親油性部分以外の、付加的親油性部分を含まない。
非経腸投与用製剤は、緩衝液、希釈剤および他の適当な添加剤も含み得る無菌水溶液を含む。脳室内注射は、例えば、リザーバーに接続した脳室内カテーテルにより促進され得る。静脈内使用について、溶質の総濃度は、調剤を等張とするために制御すべきである。
本出願のRNAサイレンシング剤は、肺送達によって対象に投与され得る。肺送達組成物は、分散剤内の組成物が、肺に達し、そこで、肺胞領域を介して容易に直接的に血液循環に吸収され得るように、分散剤の吸入によって送達され得る。肺送達は、全身送達および肺疾患処置のための局所化送達の両方のために有効であり得る。一実施態様において、肺送達によって投与されるRNAサイレンシング剤は、血液脳関門を通過できるように修飾されている。
肺送達は、噴霧、エアロゾル化、ミセルおよび乾燥粉末ベースの製剤を含む、さまざまなアプローチによって達成され得る。送達は、液体ネブライザー、エアロゾルベースの吸入器および乾燥粉末分散デバイスで達成され得る。定量デバイスが好ましい。アトマイザーまたは吸入器を使用する利益の一つは、デバイスが自己充足式であるため、汚染の可能性が最小化されることである。乾燥粉末分散デバイスは、例えば、乾燥粉末として容易に製剤化され得る薬物を送達する。RNAサイレンシング剤組成物は、それ自体でまたは適当な粉末担体と組み合わせて、凍結乾燥または噴霧乾燥粉末として安定に保存され得る。吸入用組成物の送達は、デバイスに取り込まれたとき、エアロゾル医薬投与中の用量追跡、遵守モニタリングおよび／または患者の投与のトリガーを可能とする、タイマー、用量カウンター、時間測定デバイスまたは時間インジケーターを含み得る投与時限要素が介在し得る。
担体として有用な医薬賦形剤のタイプは、安定化剤、例えばヒト血清アルブミン(HSA)、充填剤、例えば炭水化物、アミノ酸およびポリペプチド；pH調節因子または緩衝液；塩、例えば塩化ナトリウムなどを含む。これらの担体は、結晶または非晶質形態であってよくまたは2種の混合物であり得る。
特に価値ある充填剤は、適合性の炭水化物、ポリペプチド、アミノ酸またはこれらの組み合わせを含む。適当な炭水化物は、単糖、例えばガラクトース、D-マンノース、ソルボースなど；二糖、例えばラクトース、トレハロースなど；シクロデキストリン、例えば2-ヒドロキシプロピル－ベータ－シクロデキストリン；および多糖、例えばラフィノース、マルトデキストリン、デキストランなど；アルジトール、例えばマンニトール、キシリトールなどを含む。好ましい炭水化物群は、ラクトース、トレハロース、ラフィノースマルトデキストリンおよびマンニトールを含む。適当なポリペプチドは、アスパルテームを含む。アミノ酸はアラニンおよびグリシンを含み、グリシンが好ましい。
適当なpH調節因子または緩衝液は、有機酸および塩基から調製した有機塩、例えばクエン酸ナトリウム、アスコルビン酸ナトリウムなどを含み；クエン酸ナトリウムが好ましい。
本出願のRNAサイレンシング剤は、経口および経鼻送達によって投与され得る。例えば、これらの膜を介して投与された薬物は、作用発生が急速であり、治療血漿レベルを提供し、肝臓代謝の初回通過効果を避け、不利な消化器(GI)環境への薬物の暴露を回避する。さらなる利点は、薬物が容易に適用、局所化および除去され得るような膜部位への接近容易性を含む。一実施態様において、経口または経鼻送達により投与されたRNAサイレンシング剤は、血液－脳関門を通過できるよう修飾されている。
一実施態様において、RNAサイレンシング剤を含む単位用量または定量の組成物は、植込み型デバイスにより分配される。デバイスは、対象内のパラメータをモニターするセンサーを含み得る。例えば、デバイスは、浸透圧ポンプなどのポンプおよび、所望により、関連電子機器を含み得る。
RNAサイレンシング剤は、ウイルス天然カプシドまたは化学的もしくは酵素的に産生した人工カプシドまたはそれ由来の構造に包装され得る。
VIII. キット
特定の他の態様において、本出願は、RNAサイレンシング剤、例えば、二本鎖RNAサイレンシング剤またはｓRNA剤(例えば、前駆体、例えば、sRNA剤に処理され得る大型RNAサイレンシング剤、またはRNAサイレンシング剤、例えば、二本鎖RNAサイレンシング剤またはsRNA剤またはその前駆体をコードするDNA)の医薬製剤を含む適当な容器を含むキットを提供する。特定の実施態様において、医薬製剤の個々の成分は1つの容器に提供され得る。あるいは、医薬製剤の成分を2つまたはそれ以上の、例えば、一つの容器はRNAサイレンシング剤調剤および少なくとも一つの他方は担体化合物用の容器に提供するのが望ましいことがある。キットは、一つの箱に1つまたはそれ以上の容器などの多数の種々の配置で包装され得る。種々の成分を、例えば、キットと共に提供される使用説明書により、合わせ得る。成分を、例えば、医薬組成物を調製し、投与するために、本明細書に記載の方法により組み合わせ得る。キットはまた送達デバイスも含み得る。
本明細に記載の方法の他の適当な修飾および適応が、本明細書に開示する実施態様の範囲を逸脱することなく、適当な等価物を使用してなされ得ることが当業者には容易に明らかである。ある実施態様を詳細に記載しているが、それは次の実施例を参照してより明確に理解され、それは、説明の目的でのみ包含され限定的であることは意図されない。
実施例1
非選択的領域においてC9orf72を標的とする機能的siRNAを同定するための系統的スクリーニング
C9orf72機能的siRNAの候補を以下のようにスクリーニングした。C9orf72レポータープラスミドをHeLa細胞におけるpsiCHECK2システムに挿入した。siRNAは1.5μMの濃度で適用させた。72時間後、レポーター発現ノックダウンについてDualGloアッセイによって試料を分析した。図3に示すように、候補を、エキソン1、エキソン1／イントロン1接合部、イントロン1、およびエキソン2の各領域で同定した。
次に、候補siRNA分子を、ルシフェラーゼレポーターアッセイにおいて、増加する用量のsiRNAで試験した。図4に見られるように、用量反応曲線を作成し、機能的な候補を同定した。図5に示すように、3つの候補分子のIC50値を計算した。候補6686は約5nMのIC50を示し、候補6974は約4nMのIC50を示し、候補7028は約62nMのIC50を示した。
インビボでの候補siRNA分子の効果を決定するために、U87MG神経膠芽腫細胞を異なるsiRNA分子に曝露し、そしてmRNAレベルをqPCRによって評価した。図6に見られるように、C9orf72 mRNAレベルを未処理の対照細胞と比較した。候補7005および7032でmRNAの強力なノックダウンが観察された。
4つの候補siRNA分子を、2人の患者からのC9 ALS患者線維芽細胞における有効性について試験した。siRNAで処理した後のC9.2およびC9.3患者の線維芽細胞でqPCRによってmRNAレベルを評価し、未処理の対照と比較した。図7に示すように、4つの候補分子すべてで両方の患者の線維芽細胞株においてC9orf72 mRNAの強力なノックダウンが観察された。
次に、5つの候補分子をC9 ALSのマウスモデルで試験した。ALSマウスをsiRNAで処理し、犠牲にして、脊髄組織からRNAを抽出した。次に、図8に見られるように、C9orf72 mRNAレベルをqPCRで評価し、未処理の対照と比較した。複数の実験において、3つの候補分子で一貫してC9orf72転写産物の強力なノックダウンが観察された。
実施例2
選択領域においてC9orf72を標的とする機能的siRNAを同定するための系統的スクリン
C9orf72機能的siRNAの候補を以下のようにスクリーニングした。C9orf72レポータープラスミドを、HeLa細胞におけるpsiCHECK2システムに挿入した。siRNAを1.5μMで適用させた。72時間後、レポーター発現ノックダウンについてDualGloアッセイで試料を分析した。図9に示すように、候補を、エキソン1およびイントロン1にまたがる領域で同定した。ノックダウンは、候補244に対して最も強力であることが観察された。
「センスウォーク」実験を実施して、候補244に隣接する選択領域内の追加の候補分子のノックダウンを決定した。レポーター発現を上記のように分析した。候補分子は、ヌクレオチド領域を標的として開発した。ヌクレオチド238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248または249で始まり、20ヌクレオチド下流で終わる領域を測定し、結果を図17に示す。未処理の対照レポーターの発現と比較して、すべての候補者で強力なノックダウンが観察された。
選択的標的候補分子を、C9 ALS患者線維芽細胞株C9.2(図11A)およびC9.3(図11B)で試験した。C9患者線維芽細胞を、siRNAの8種類の候補分子で処理した。RNAを抽出して、C9or72のmRNAレベルをqPCRで評価した。両患者の株からの結果をまとめて図11Cに示した。52s、56s、143s、214s、226s、および241など、いくつかの候補分子でmRNAの有意な低減が観察された。
選択的標的候補を、C9 ALSマウスからの初代培養神経細胞で試験した(図10)。培養した神経細胞を19種類の異なるsiRNA候補で処理した。RNAを抽出して、C9orf72のmRNAレベルをqPCRで評価した。12種類の候補分子では、未処理の対照神経細胞と比較して、強力なノックダウンが観察された。
同定された化合物は、関連するC9 mRNAバリアントを下方制御し、核および細胞質においてRNA病巣形成を低減することもできた。化合物は、C9毒性の主要な決定要因の1つであるジペプチドの発現を低減する効果もあった。
実施例3
ジ-siRNAsおよびビタミンDコンジュゲートhsiRNAの化学合成
インビトロおよびインビボでの有効性評価に使用されるジ-siRNAを、以下のように合成した。図25に示すように、トリエチレングリコールをアクリロニトリルと反応させて、保護されたアミン官能性を導入した。次に、分岐点をトシル化ソルケタールとして加え、続いてニトリルを還元して一級アミンを得て、これをカルバメートリンカーを介してビタミンD(カルシフェロール)に結合させた。次に、ケタールを加水分解させて、一級ヒドロキシルでジメトキシトリチル(DMTr)保護基で選択的に保護されていたシス-ジオールを放出し、続いて無水コハク酸でスクシニル化した。得られた部分を固体支持体に結合させた後、固相オリゴヌクレオチド合成および脱保護を行い、VitD、キャップされたリンカー、およびジ-siRNAの3つの生成物を得た。次に、合成の生成物を、実施例6に記載されているように分析した。
実施例4
代替合成経路1
図28に示すように、モノホスホアミデートリンカーのアプローチは、以下の工程を含む：モノアジドテトラエチレングリコールは、トシル化ソルケタールとして付加された分岐点を有する。その後、ケタールを除去して、1級ヒドロキシルでジメトキシトリチル(DMTr)保護基で選択的に保護されているシス-ジオールを放出し、続いて、アジドをトリフェニルホスフィンで一次アミンに還元して、それを直ちにモノメトキシトリチル(MMTr)保護基で保護する。残りのヒドロキシルを無水コハク酸でスクシニル化し、固体支持体(LCAA CPG)に結合させた。オリゴヌクレオチドの合成および脱保護により、ホスフェートおよびホスホアミデート結合を有するジ-siRNAという1つの主要生成物を得た。この例では、ホスフェートおよびホスホアミデートリンカーのみを生成する代替の直接的な合成経路を紹介している。
実施例5
代替合成経路2
ジ-ホスフェート含有部分を作製するために、第二の代替合成アプローチを開発した。図28に示すように、ジホスホネートリンカーのアプローチは以下の工程を含む：ソルケタール修飾テラエチレングリコールから出発し、ケタールを除去し、2つの一級ヒドロキシルをジメトキシトリチル(DMTr)で選択的に保護する。残りのヒドロキシルは、シリルで保護された1-ブロモエタノールで長さを伸ばす。TBDMSを除去し、サクシニル化し、固体支持体に結合させる。続いて、固相オリゴヌクレオチド合成および脱保護を行い、ジホスフェート含有リンカーを有するジ-siRNAを生成する。
実施例6
ジ-siRNAおよびビタミンDコンジュゲートhsiRNAの化学合成の品質管理
HPLC
ジ-siRNAおよびビタミンDコンジュゲートhsiRNAの化学合成の品質を評価するために、分析用HPLCを用いて合成された生成物を同定し、定量した。3つの主要な生成物を同定した：トリエチレングリコール(TEG)リンカーでキャップされたsiRNAセンス鎖、ジ-siRNA、およびビタミンDコンジュゲートsiRNAセンス鎖(図3)。各生成物をHPLCによって単離し、その後の実験に使用した。合成した3つの主要生成物の化学構造を図26に示す。HPLCの条件にはいかのものが含まれた：5～80％Bを15分間、緩衝液A(0.1M TEAA + 5％ACN)、緩衝液B(100％ACN)。
マススペクトロメトリー
さらにマススペクトロメトリーによって品質管理を行い、ジ-siRNA複合体の同一性を確認した。生成物は、11683m/zの質量を有することが観察され、これは、TEGリンカーを介して3'末端に結合されたsiRNAの2つのセンス鎖に対応する(図27)。この特定の例において、ハンチンチン遺伝子(Htt)を標的とするようにsiRNAのセンス鎖を設計した。実施例5に要約されている化学合成方法により、ハンチンチン遺伝子を標的とするジ-分岐状siRNA複合体の所望の生成物を成功的に生成した。LC-MSの条件にはいかのものが含まれていた：0～100％Bを7分間、0.6mL/分. 緩衝液A(25mM HFIP、15mM DBAの20％MeOH)、緩衝液B(MeOHと20％緩衝液A )。
実施例7
分岐状オリゴヌクレオチド構造における疎水性部分の取り込み：戦略1
一例において、2-シアノエトキシ-ビス(N,N-ジイソプロピルアミノ)ホスフィン(またはその他の適当なホスファイト化試薬)でホスフィレート化できる保護されていないヒドロキシル基(またはアミン)を有する短い疎水性アルキレンまたはアルカン(Hy)を用いて、対応する親油性ホスホロアミダイト(phosphoramidite)を生成する。これらの親油性ホスホロアミダイトは、従来のオリゴヌクレオチド合成条件を用いて、分岐状オリゴヌクレオチドの末端位置に加えることができる。この戦略は、図42に示している。
実施例8
分岐状オリゴヌクレオチド構造における疎水性部分の取り込み:戦略2
別の例において、2-シアノエトキシ-ビス(N,N-ジイソプロピルアミノ)ホスフィン(または他の適当なホスフィチル化試薬)でホスフィチル化できる正電荷を有するか、または有しない保護されていないヒドロキシル基(またはアミン)を有する短い／小芳香族平面分子(Hy)を用いて、対応する芳香族疎水性ホスホロアミダイトを生成する。芳香族部分は、正電荷を有することができる。これらの親油性ホスホロアミダイトは、従来のオリゴヌクレオチド合成条件を用いて、分岐状オリゴヌクレオチドの末端位置に加えることができる。この戦略は、図43に示している。
実施例9
分岐状オリゴヌクレオチド構造における疎水性部分の取り込み:戦略3
生物学的に重要な疎水性部分を導入するために、短い親油性ペプチドを、固体支持体上または溶液中で逐次ペプチド合成することによって作成する(後者については本明細書で説明する)。短い(1-10)アミノ酸鎖は、正電荷または極性アミノ酸部分を含むことができ、これは、正電荷はオリゴヌクレオチドの全体的な正味電荷を低減し、したがって疎水性を増加させるからである。適切な長さのペプチドを作成したら、無水酢酸または別の短い脂肪酸でキャッピングして、疎水性を増加させ、遊離アミンをマスクするべきである。その後、カルボニル保護基を除去して、3-アミノプロパン-1-オールを結合させ、遊離ヒドロキシル(またはアミン)をホスフィチル化するようにする。その後、このアミノ酸ホスホロアミダイトは、従来のオリゴヌクレオチド合成条件を用いて、分岐状オリゴヌクレオチドの末端5'位置に加えることができる。この戦略は、図44に示している。
実施例10
C9ALS研究モデルにおけるRNAiベースの治療法
C9ALSトランスジェニックマウスは、「Balohマウス」(系統名：C57BL/6J-Tg(C9orf72_i3)112Lutzy/J)とも知られており、C9遺伝子のイントロン1内に疾患関連反復G4C2ヘキサヌクレオチド展開を発現し、ALSおよびFTDの研究において研究モデルとして使用することができる。ヘテロ接合性のC9ALSマウスは、生存可能であり、繁殖力があり、メンデルの法則で生まれる。それらは、神経系におけるRNA病巣を含む、C9orf72拡張担体で観察される中核的な病理学的特徴を発達させる。生後3か月までに、脳全体の細胞の40～80％がセンスおよびアンチセンス病巣を示す。
疾患アイソフォーム配列C9ORF72 AS241およびC9ORF72 S241を標的とする修飾オリゴヌクレオチドを、表8：
Figure 2022528487000055
 に示される通り、本明細書で「P3」として定義される修飾パターンで合成した。
この合成により、第一のアンチセンス修飾オリゴヌクレオチドおよび第二のセンス修飾オリゴヌクレオチド得た。本明細書で「C9ORF72_241」と標識されている第一のオリゴヌクレオチドは、以下の式：
C9ORF72_241：
VP(mU)#(fU)#(mC)(fU)(fU)(fC)(mU)(fG)(mG)(fU)(mU)(fA)(mA)#(fU)#(mC)#(mU)#(mU)#(mU)#(mA)#(fU)によって特徴付けられた。
第二のセンスヌクレオチドは、その3'末端を図27のリンカーに共有結合させることにより二量体化し、シアニン-3色素部分で標識し、以下の式：
C9_S_DIO_Cy3_241:
CyMN3－(mG)#(mA)#(fU)(mU)(fA)(mA)(fC)(mC)(fA)(mG)(mA)(mA)(fG)#(mA)#(mA)-DIOの「ジオリゴ」を得た。
C9_AS_241およびC9_S_DIO_Cy3_241をアニールして、図1Cおよび1Dの図に示すように、本明細書で「c9-241」と標識し、C9ORF72遺伝子の疾患アイソフォームバリアントを標的とするジ-siRNAを形成した。また、図1Aおよび図1Bの略図に示すように、C9ORF72の転写産物を非選択的かつ全体的に標的とするように設計された、本明細書で「c9-7005」と標識された第二のジ-siRNAも合成した。
ヘテロ接合性になるように飼育した90日齢のBalohマウスにc9-241またはc9-7005のいずれかを注射した。対照マウスにはPBS溶液またはテンプレートなしの対象(NTC)を注射した。注入後6週目にマウスを犠牲にし、C9ORF72 mRNAおよびタンパク質の定量のために処理した。図45の図表は、中枢神経系の外側(図45A)および内側(図45B)の組織において、c9-7005で処理したマウスで測定したC9ORF72 mRNA発現の総ノックダウンを定量化したプロットである。図46の図表にプロットされているのは、中枢神経系の外測(図46A)および内側(図46B)の組織において、c9-241で処理したマウスで測定したC9ORF72疾患アイソフォーム特異的mRNAノックダウンのレベルである。図47Aは、マウス線条体におけるC9ORF72タンパク質のウェスタンブロットであり、図47Bは、PBSを注射した対照マウスに対するC9ORF72タンパク質発現におけるノックダウンを定量化した図表である。図48Aは、マウスの視床におけるC9ORF72タンパク質のウェスタンブロットであり、図48Bは、PBSを注射した対照マウスに対するC9ORF72タンパク質発現のノックダウンを定量化したグ図表である。
今度は、140～146日齢のヘテロ接合性Balohマウスで実験を繰り返した。注射後4週間目でマウスを犠牲にし、C9ORF72 mRNAおよびタンパク質の定量のために処理した。図49の図表は、中枢神経系の外側(図49A)および内側(図49B)の組織において、c9-7005で処理したマウスで測定したC9ORF72 mRNA発現の総ノックダウンを定量化したプロットである。図50の図表にプロットされているのは、中枢神経系の外側(図50A)および内側(図50B)の組織において、c9-241で処理したマウスで測定したC9ORF72疾患アイソフォーム特異的mRNAのノックダウンのレベルである。図51Aは、マウスの線条体におけるC9ORF72タンパク質のウェスタンブロットであり、図51Bは、PBSを注射した対照マウスに対するC9ORF72タンパク質発現のノックダウンを定量化した図表である。
実施例11
C9ALS研究モデルにおけるRNAiベースの追加療法
実施例10を報告した実験を行い、上述の「P3」修飾パターンを有する修飾オリゴヌクレオチドの2つの追加セットを合成した。第一のセットは、本明細書で「C9ORF72_052」と標識された第一のアンチセンス修飾オリゴヌクレオチドを含み、以下の式：
C9ORF72_052:
VP(mU)#(fC)#(mU)(fU)(fU)(fU)(mA)(fC)(mG)(fU)(mG)(fG)(mG)#(fC)#(mG)#(fG)#(mA)#(mA)#(mC)#(fU)によってで特徴付けられた。
第一のセットの第二のセンスヌクレオチドは、その3'末端を図27のリンカーに共有結合させることで二量体化し、シアニン-3色素部分で標識し、以下の式：
C9_S_DIO_Cy3_52:
CyMN3-(mC)#(mG)#(fC)(mC)(fC)(mA)(fC)(mG)(fU)(mA)(mA)(mA)(fA)#(mG)#(mA)-DIOの「ジオリゴ」を得た。
第二のセットは、本明細書で「C9ORF72_143」と標識されている第一のアンチセンス修飾オリゴヌクレオチドを含み、これは、以下の式：
C9ORF72_143:
VP(mU)#(fC)#(mA)(fC)(fC)(fU)(mC)(fC)(mU)(fA)(mA)(fA)(mC)#(fC)#(mC)#(fA)#(mC)#(mA)#(mC)#(fC)によって特徴付けられた。
第二のセットの第二のセンスヌクレオチドも、その3'末端を図27のリンカーに共有結合させることによって二量体化し、シアニン-3色素部分で標識し、以下の式：
C9_S_DIO_Cy3_143:
CyMN3-(mG)#(mG)#(fG)(mU)(fU)(mU)(fA)(mG)(fG)(mA)(mG)(mG)(fU)#(mG)#(mA)-DIOの「ジオリゴ」を得た。
第一のセットのC9ORF72_052およびC9_S_DIO_Cy3_052をアニールして、本明細書で「c9-52」または「C9CNS-52」と標識したジ-siRNAを形成した。同様に、第二のセットのC9ORF72_143およびC9_S_DIO_Cy3_143をアニールして、本明細書で「c9-143」または「C9CNS-143」と標識したジ-siRNAを形成した。図1および図2の概略図に示すように、生成物ジ-siRNAは、C9ORF72遺伝子の疾患アイソフォームバリアントを標的とした。さらに、図1Aおよび図1Bに示すように、C9ORF72転写産物を非選択的に完全に標的とするように設計された、本明細書では「c9-6793」または「C9CNS-6793」、および「c9-6974」または「C9CNS-6974」と標識した2つの追加のジ-siRNAも合成した。
ヘテロ接合性になるように飼育した90日齢のBalohマウスを対象に、C9CNS-52、C9CNS-143、C9CNS-6793、C9CNS-6974のいずれかを、心室ごとに5μl中10nmol(10μl中合計20nmol)の量で両心室ICV注射することによって定位的に投与した。対照マウスに、PBS溶液またはテンプレートなしの対象(NTC)を注射した。注射後6週目にマウスを犠牲にし、QUANTIGENE(登録商標)(Waltham, Massachusetts)の分岐状DNAアッセイによりC9ORF72 mRNAを処理した。遺伝子発現をハウスキーピング遺伝子であるヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HPRT)に正規化し、一元配置分散分析(ANOVA)を行い、平均値±SDでプロットした。*>0.1、**>0.01、***>0.001、****>0.0001。
図52の図表は、肝臓、腎臓、または脾臓に注射して処置したマウスで測定した、C9ORF72 mRNA発現の総ノックダウン(図52A)および疾患バリアント特異的ノックダウン(図52B)を定量化したプロットである。図53の図表は、脊柱における頸部、胸郭、または腰部に注射して処置したマウスで測定したC9ORF72 mRNA発現の総ノックダウン(図53A)および疾患バリアント特異的ノックダウン(図53B)を定量化したプロットである。図54の図表は、前頭葉前部皮質、運動皮質、小脳、または脳幹に注射して処置したマウスで測定したC9ORF72 mRNA発現の総ノックダウン(図54A)および疾患バリアント特異的ノックダウン(図54B)を定量化したプロットである。図55の図表は、線条体、視床、海馬、体性感覚皮質に注射して処置したマウスで測定したC9ORF72 mRNA発現の総ノックダウン(図55A)および疾患バリアント特異的ノックダウン(図55B)を定量化したプロットである。
参照による取り込み
本出願をとおして引用され得る全ての言及した参考文献(文献参照、特許、特許出願およびウェブサイト)を、ここに、引用により、全ての目的のために全体として本明細書に包含させる。本発明は、特に断らない限り、当分野で周知の免疫学、分子生物学および細胞生物学の慣用の技術を使用する。
本開示はまた分子生物学および薬物送達分野で周知の技術を全体的に引用により包含させる。これらの技術は、次の刊行物に記載される技術を含むが、これらに限定されない。
Atwell et al. J. Mol. Biol. 1997, 270: 26-35;
Ausubel et al. (eds.), CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley &Sons, NY (1993);
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Giege, R. and Ducruix, A. Barrett, CRYSTALLIZATION OF NUCLEIC ACIDS AND PROTEINS, a Practical Approach, 2nd ea., pp. 20 1-16, Oxford University Press, New York, New York, (1999);
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均等物
本発明は、その精神または必須特徴から逸脱することなく、他の特定の形態で具現化され得る。それ故に前記実施態様は、全ての本発明の限定ではなく、全ての点で説明用であると解釈されるべきである。故に、本発明の範囲は、上の記載ではなく、添付する特許請求の範囲により示され、特許請求の範囲の均等物の意味および範囲内の全ての変化は、それ故に本明細書に包含されることが意図される。

Claims (118)

  1. (i)5' AAGAAAAGACCUGAUAAAGAUUAACCAGAAGAAAACAAGGAGGGA 3'、または(ii)5' AAGAAAAGACCUGAUAAAGAUUAACCAGAAGAAAACAAGGAGGGA 3'における10～30個の連続するヌクレオチドの長さを有するその一部、と実質的に相補的な相補性領域を含む、15～35塩基長のRNA分子。
  2. AUAAAGAUUAACCAGAAGAAと実質的に相補的な相補性領域を含む、請求項1に記載のRNA分子。
  3. 一本鎖(ss)RNAまたは二本鎖(ds)RNAである、請求項1に記載のRNA分子。
  4. センス鎖およびアンチセンス鎖を含む、請求項3に記載のdsRNAであって、ここで、アンチセンス鎖は5' AAGAAAAGACCUGAUAAAGAUUAACCAGAAGAAAACAAGGAGGGA 3'と実質的に相補的な相補性領域を含む、該dsRNA。
  5. 15～25塩基長である、請求項1に記載のRNA分子。
  6. 該相補性領域が、5' AAGAAAAGACCUGAUAAAGAUUAACCAGAAGAAAACAAGGAGGGA 3'の少なくとも10、11、12または13個の連続するヌクレオチドと相補的である、請求項3に記載のdsRNA。
  7. 該相補性領域が、5' AAGAAAAGACCUGAUAAAGAUUAACCAGAAGAAAACAAGGAGGGA 3'とのミスマッチを3個以下で含む、請求項3に記載のdsRNA。
  8. 該相補性領域が、5' AAGAAAAGACCUGAUAAAGAUUAACCAGAAGAAAACAAGGAGGGA 3'と完全に相補的である、請求項3に記載のdsRNA。
  9. 平滑末端である、請求項3に記載のdsRNA。
  10. 少なくとも1つの一本鎖ヌクレオチド突出部を含む、請求項3に記載のdsRNA。
  11. 天然に存在するヌクレオチドを含む、請求項3に記載のdsRNA。
  12. 少なくとも1つの修飾ヌクレオチドを含む、請求項3に記載のdsRNA。
  13. 該修飾ヌクレオチドが、2'-O-メチル修飾ヌクレオチド、5'-ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、およびコレステリル誘導体もしくはドデカン酸ビスデシルアミド基に結合された末端ヌクレオチドからなる群から選択される、請求項12に記載のdsRNA。
  14. 該修飾ヌクレオチドが、2'-デオキシ-2'-フルオロ修飾ヌクレオチド、2'-デオキシ-修飾ヌクレオチド、ロックされたヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、2'-アミノ-修飾ヌクレオチド、2'-アルキル-修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホルアミデートおよび非天然塩基を含むヌクレオチドからなる群から選択される、請求項12に記載のdsRNA。
  15. 2'-O-メチル修飾ヌクレオチドを少なくとも1つ、および5'ホスホロチオエート基を含むヌクレオチドを少なくとも1つ含む、請求項3記載のdsRNA。
  16. 少なくとも80％が化学的に修飾されている、請求項3に記載のdsRNA。
  17. 完全に化学的に修飾されている、請求項3に記載のdsRNA。
  18. コレステロール部分を含む、請求項3に記載のdsRNA。
  19. 5'末端および3'末端を含み、標的に対して相補性を有する、請求項1に記載のRNA分子であって、
    (1)RNA分子は、2'-メトキシ-リボヌクレオチドおよび2'-フルオロ-リボヌクレオチドを交互に含み;
    (2)5'末端から2位および14位のヌクレオチドは、2'-メトキシ-リボヌクレオチドではなく;
    (3)ヌクレオチドは、ホスホジエステルまたはホスホロチオエート結合を介して結合され;そして
    (4)3'末端から1～2位から1～7位のヌクレオチドは、ホスホロチオエート結合を介して隣接するヌクレオチドに結合されている、該RNA分子。
  20. 5'末端および3'末端を有し、標的に対して相補性を有し、そして第一のオリゴヌクレオチドおよび第二のオリゴヌクレオチドを含む、請求項3に記載のdsRNAであって、
    (1)第一のオリゴヌクレオチドは、5' AAGAAAAGACCUGAUAAAGAUUAACCAGAAGAAAACAAGGAGGGA 3'と実質的に相補的な配列を含み;
    (2)第一のオリゴヌクレオチドの一部は、第二のオリゴヌクレオチドの一部と相補的であり;
    (3)第二のオリゴヌクレオチドは、2'-メトキシ-リボヌクレオチドおよび2'-フルオロ-リボヌクレオチドを交互に含み;
    (4)第二のオリゴヌクレオチドの3'末端から2位および14位のヌクレオチドは、2'-メトキシ-リボヌクレオチドであり;そして
    (5)第二のオリゴヌクレオチドのヌクレオチドは、ホスホジエステルまたはホスホロチオエート結合を介して結合されている、該dsRNA。
  21. 5'末端および3'末端を含み、標的に対して相補性を有する、請求項1に記載のRNA分子であって、
    (1)RNA分子は、3つの連続する2'-フルオロ-リボヌクレオチドの領域を含み;
    (2)5'末端から2位および14位のヌクレオチドは、2'-メトキシ-リボヌクレオチドではなく;
    (3)ヌクレオチドは、ホスホジエステルまたはホスホロチオエート結合を介して結合され;
    (4)3'末端から1～2位から1～7位のヌクレオチドは、ホスホロチオエート結合を介して隣接するヌクレオチドに結合され;そして、
    (5)5'末端から1～2位のヌクレオチドは、ホスホロチオエート結合を介して互いに結合されている、該RNA分子。
  22. 5'末端および3'末端を有し、標的に対して相補性を有し、そして第一のオリゴヌクレオチドおよび第二のオリゴヌクレオチドを含む、請求項3に記載のdsRNAであって、
    (1)第一のオリゴヌクレオチドは、5' AAGAAAAGACCUGAUAAAGAUUAACCAGAAGAAAACAAGGAGGGA 3'と実質的に相補的な配列を含み;
    (2)第一のオリゴヌクレオチドの一部は、第二のオリゴヌクレオチドの一部と相補的であり;
    (3)第二のオリゴヌクレオチドは、3つの連続する2'-メトキシ-リボヌクレオチドの領域を含み;
    (4)第二のオリゴヌクレオチドの3'末端から2位および14位のヌクレオチドは、2'-メトキシ-リボヌクレオチドであり;そして
    (5)第二のオリゴヌクレオチドのヌクレオチドは、ホスホジエステルまたはホスホロチオエート結合を介して結合されている、該dsRNA。
  23. 第二のオリゴヌクレオチドが、その3'末端に疎水性分子が結合されている、請求項20または21に記載の核酸。
  24. 第二のオリゴヌクレオチドと疎水性分子との間の結合が、ポリエチレングリコールまたはトリエチレングリコールを含む、請求項23に記載の核酸。
  25. 第二のオリゴヌクレオチドの3'末端から1位および2位のヌクレオチドが、ホスホロチオエート結合を介して隣接するヌクレオチドに結合されている、請求項20または21に記載の核酸。
  26. 第二のオリゴヌクレオチドの3'末端から1位および2位のヌクレオチド、および第二のオリゴヌクレオチドの5'末端から1位および2位のヌクレオチドが、ホスホロチオエート結合を介して隣接するリボヌクレオチドに結合されている、請求項20または21に記載の核酸。
  27. 請求項3に記載のdsRNA、および薬学的に許容できる担体を含む、生物においてC9ORF72遺伝子の発現を阻害するための医薬組成物。
  28. dsRNAが、該C9ORF72遺伝子の発現を少なくとも50％阻害する、請求項27に記載の医薬組成物。
  29. dsRNAが、該C9ORF72遺伝子の発現を少なくとも90％阻害する、請求項27に記載の医薬組成物。
  30. 細胞内でのC9ORF72遺伝子の発現を阻害する方法であって、
    (a)請求項3に記載の二本鎖リボ核酸(dsRNA)を細胞に導入すること;および
    (b)工程(a)で作製された細胞を、C9ORF72遺伝子のmRNA転写産物の分解を得るのに十分な時間を維持することを含み、それによって細胞内でのC9ORF72遺伝子の発現を阻害する方法。
  31. 神経変性疾患を処置または管理する方法であって、そのような処置または管理を必要とする患者に、請求項3に記載の該dsRNAの治療有効量を投与することを含む方法。
  32. 該dsRNAが、患者の脳に投与される、請求項31に記載の方法。
  33. 該dsRNAが、脳室内(ICV)または髄腔内(IT)注射によって投与される、請求項31に記載の方法。
  34. dsRNAの投与により、脳においてC9ORF72遺伝子の低減を引き起こす、請求項31に記載の方法。
  35. dsRNAの投与により、脊髄においてC9ORF72遺伝子の低減を引き起こす、請求項31に記載の方法。
  36. dsRNAが、該C9ORF72遺伝子の発現を少なくとも50％阻害する、請求項31に記載の方法。
  37. dsRNAが、該C9ORF72遺伝子の発現を少なくとも90％阻害する、請求項31に記載の方法。
  38. 細胞内でのC9ORF72遺伝子の発現を阻害するためのベクターであって、5' AAGAAAAGACCUGAUAAAGAUUAACCAGAAGAAAACAAGGAGGGA 3'と実質的に相補的なRNA分子をコードするヌクレオチド配列に操作可能に結合された調節配列を含み、ここで、該RNA分子は、10～35塩基長であり、該RNA分子は、該C9ORF72遺伝子を発現する細胞と接触すると、該C9ORF72遺伝子の発現を少なくとも50％阻害する、該ベクター。
  39. RNA分子が、該C9ORF72遺伝子の発現を少なくとも90％阻害する、請求項38に記載のベクター。
  40. 該RNA分子が、ssRNAまたはdsRNAである、請求項38に記載のベクター。
  41. dsRNAが、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、ここで、アンチセンス鎖は5' AAGAAAAGACCUGAUAAAGAUUAACCAGAAGAAAACAAGGAGGGA 3'と実質的に相補的な相補性領域を含む、請求項40に記載のベクター。
  42. 請求項38に記載のベクターを含む細胞。
  43. 5' AAGAAAAGACCUGAUAAAGAUUAACCAGAAGAAAACAAGGAGGGA 3'と実質的に相補的な相補性領域を含む、15～35塩基長のRNA分子であって、C9ORF72遺伝子mRNAのイントロンを標的とする、該RNA分子。
  44. 該RNA分子が、ssRNAまたはdsRNAである、請求項43に記載のRNA分子。
  45. センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、ここで、アンチセンス鎖は5' AAGAAAAGACCUGAUAAAGAUUAACCAGAAGAAAACAAGGAGGGA 3'と実質的に相補的な相補性領域を含む、請求項44に記載のdsRNA。
  46. C9ORF72 mRNAと実質的に相補的な相補性領域を含む、15～35塩基長の2つのRNA分子を含むジ分岐状RNA化合物であって、該2つのRNA分子は、リンカー、スペーサーおよび分岐点から独立して選択される1つまたはそれ以上の部分によって互いに結合されている、該ジ分岐状RNA化合物。
  47. 5' AAGAAAAGACCUGAUAAAGAUUAACCAGAAGAAAACAAGGAGGGA 3'と実質的に相補的な相補性領域を含む、請求項46に記載のRNA分子。
  48. AUAAAGAUUAACCAGAAGAAと実質的に相補的な相補性領域を含む、請求項46に記載のRNA分子。
  49. ssRNAまたはdsRNAである、請求項46に記載のRNA分子。
  50. アンチセンス分子またはギャップマー分子である、請求項46に記載のRNA分子。
  51. 該アンチセンス分子が、アンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項50に記載のRNA分子。
  52. 該アンチセンス分子が、相補性領域の分解を向上させる、請求項51に記載のRNA分子。
  53. 該分解が、ヌクレアーゼ分解である、請求項52に記載のRNA分子。
  54. 該ヌクレアーゼ分解が、RNase Hによって媒介される、請求項53に記載のRNA分子。
  55. 表1、表2、表3、表4、または表5に記載のC9ORF72遺伝子における遺伝子領域と実質的に相補的な相補性領域を含む、15～35塩基長のRNA分子。
  56. 一本鎖(ss)RNAまたは二本鎖(ds)RNAである、請求項55に記載のRNA分子。
  57. 2つまたはそれ以上の核酸を含む分岐状オリゴヌクレオチド化合物であって、
    各核酸は、独立して、15～35塩基長であり、
    各核酸は、独立して、5' AAGAAAAGACCUGAUAAAGAUUAACCAGAAGAAAACAAGGAGGGA 3'と実質的に相補的な相補性領域を含み、そして、
    該2つまたはそれ以上の核酸は、リンカー、スペーサーおよび分岐点から選択される1つまたはそれ以上の部分によって互い結合されている、該分岐状オリゴヌクレオチド化合物。
  58. 各核酸が、独立して、15～25塩基長である、請求項57に記載の分岐状オリゴヌクレオチド化合物。
  59. 少なくとも1つの相補性領域が、5' AUAAAGAUUAACCAGAAGAA 3'と実質的に相補的である、請求項57に記載の分岐状オリゴヌクレオチド化合物。
  60. 核酸が二本鎖(ds)RNAであり、各核酸がセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、各アンチセンス鎖は5' AAGAAAAGACCUGAUAAAGAUUAACCAGAAGAAAACAAGGAGGGA 3'と実質的に相補的な相補性領域を含む、請求項57に記載の分岐状オリゴヌクレオチド化合物。
  61. 各相補性領域が、5' AAGAAAAGACCUGAUAAAGAUUAACCAGAAGAAAACAAGGAGGGA 3'の少なくとも10、11、12または13個の連続するヌクレオチドと相補的ある、請求項60に記載の分岐状オリゴヌクレオチド化合物。
  62. 各相補性領域が、5' AAGAAAAGACCUGAUAAAGAUUAACCAGAAGAAAACAAGGAGGGA 3'とのミスマッチを3個以下で含む、請求項60に記載の分岐状オリゴヌクレオチド化合物。
  63. 各相補性領域が、5' AAGAAAAGACCUGAUAAAGAUUAACCAGAAGAAAACAAGGAGGGA 3'と完全に相補的である、請求項60に記載の分岐状オリゴヌクレオチド化合物。
  64. 少なくとも1つの核酸のdsRNAが、少なくとも1つの修飾ヌクレオチドを含む、請求項60に記載の分岐状オリゴヌクレオチド化合物。
  65. 該修飾ヌクレオチドが、2'-O-メチル修飾ヌクレオチド、5'-ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、2'-デオキシ-2'-フルオロ修飾ヌクレオチド、2'-デオキシ-修飾ヌクレオチド、ロックされたヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、2'-アミノ-修飾ヌクレオチド、2'-アルキル-修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホルアミデート、非天然塩基を含むヌクレオチド、およびコレステリル誘導体もしくはドデカン酸ビスデシルアミド基に結合された末端ヌクレオチドからなる群から選択される、請求項64に記載の分岐状オリゴヌクレオチド化合物。
  66. 少なくとも1つの核酸のdsRNAが、少なくとも80％が化学的に修飾されている、請求項60に記載の分岐状オリゴヌクレオチド化合物。
  67. 少なくとも1つの核酸のdsRNAが、完全に化学的に修飾されている、請求項60に記載の分岐状オリゴヌクレオチド化合物。
  68. 各核酸が、5'末端および3'末端を含み、標的に対して相補性を有する、請求項60に記載の分岐状オリゴヌクレオチド化合物であって、
    (1)核酸は、2'-メトキシ-リボヌクレオチドおよび2'-フルオロ-リボヌクレオチドを交互に含み;
    (2)5'末端から2位および14位のヌクレオチドは、2'-メトキシ-リボヌクレオチドではなく;
    (3)ヌクレオチドは、ホスホジエステルまたはホスホロチオエート結合を介して結合され;そして、
    (4)3'末端から1～2位から1～7位のヌクレオチドが、ホスホロチオエート結合を介して隣接するヌクレオチドに結合されている、分岐状オリゴヌクレオチド化合物。
  69. 2、3、4、6、または8の核酸を含む、請求項57に記載の分岐状オリゴヌクレオチド化合物。
  70. 核酸が二本鎖(ds)RNAであり、各核酸が、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、各dsRNAが、独立して、センス鎖またはアンチセンス鎖の3'末端または5'末端でリンカー、スペーサーまたは分岐点に結合されている、請求項57に記載の分岐状オリゴヌクレオチド化合物。
  71. 各リンカーが、独立して、エチレングリコール鎖、アルキル鎖、ペプチド、RNA、DNA、ホスフェート、ホスホネート、ホスホルアミデート、エステル、アミド、トリアゾール、およびこれらの組み合わせから選択され;ここで、リンカーのいずれかの炭素または酸素原子は窒素原子によって置き換えられていてよく、ヒドロキシル置換基を有するか、オキソ置換基を有する、請求項57に記載の分岐状オリゴヌクレオチド化合物。
  72. 式(I)：
    Figure 2022528487000056
     ［式(I)中、
    Lは、エチレングリコール鎖、アルキル鎖、ペプチド、RNA、DNA、ホスフェート、ホスホネート、ホスホルアミデート、エステル、アミド、トリアゾール、およびこれらの組み合わせから選択され、ここで、式(I)は、1つまたはそれ以上の分岐点B、および1つまたはそれ以上のスペーサーSをさらに含んでいてよく(ここで、
    Bは、出現するごとに独立して、多価有機種またはその誘導体であり;
    Sは、出現するごとに独立して、エチレングリコール鎖、アルキル鎖、ペプチド、RNA、DNA、ホスフェート、ホスホネート、ホスホルアミデート、エステル、アミド、トリアゾール、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される);
    Nは、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む15～35塩基長の二本鎖核酸であり、ここで、
    アンチセンス鎖は、5' AAGAAAAGACCUGAUAAAGAUUAACCAGAAGAAAACAAGGAGGGA 3'と実質的に相補的な相補性領域を含み;
    センス鎖およびアンチセンス鎖は、それぞれ独立して、1つまたはそれ以上の化学修飾を含み;そして、
    nは、2、3、4、5、6、7または8である］
    で示される化合物。
  73. 式(I-1)～(I-9):
    Figure 2022528487000057
     から選択される構造を有する、請求項72に記載の化合物。
  74. アンチセンス鎖が、
    Figure 2022528487000058
     からなる群から選択される5'末端基Rを含む、請求項72に記載の化合物。
  75. 式(II):
    Figure 2022528487000059
     ［式中、
    Xは、出現するごとに独立して、アデノシン、グアノシン、ウリジン、シチジン、およびそれらの化学修飾誘導体から選択され;
    Yは、出現するごとに独立して、アデノシン、グアノシン、ウリジン、シチジン、およびそれらの化学修飾誘導体から選択され;
    -は、ホスホジエステルヌクレオシド間結合を示し;
    =は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合を示し;そして、
    ---は、出現するごとに単独に、塩基対合の相互作用またはミスマッチを示す］
    の構造を有する、請求項72に記載の化合物。
  76. 式(III):
    Figure 2022528487000060
     ［式中、
    Xは、出現するごとに独立して、2'-デオキシ-2'-フルオロ修飾を含むヌクレオチドであり;
    Xは、出現するごとに独立して、2'-O-メチル修飾を含むヌクレオチドであり;
    Yは、出現するごとに独立して、2'-デオキシ-2'-フルオロ修飾を含むヌクレオチドであり;そして、
    Yは、出現するごとに独立して、2'-O-メチル修飾を含むヌクレオチドである］
    の構造を有する、請求項75に記載の化合物。
  77. 式(IV):
    Figure 2022528487000061
     ［式中、
    Xは、出現するごとに独立して、アデノシン、グアノシン、ウリジン、シチジン、およびそれらの化学修飾誘導体から選択され;
    Yは、出現するごとに独立して、アデノシン、グアノシン、ウリジン、シチジン、およびそれらの化学修飾誘導体から選択され;
    -は、ホスホジエステルヌクレオシド間結合を示し;
    =は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合を示し;そして、
    ---は、出現するごとに単独に、塩基対合の相互作用またはミスマッチを示す］
    の構造を有する、請求項72に記載の化合物。
  78. 式(V):
    Figure 2022528487000062
     ［式中、
    Xは、出現するごとに独立して、2'-デオキシ-2'-フルオロ修飾を含むヌクレオチドであり;
    Xは、出現するごとに独立して、2'-O-メチル修飾を含むヌクレオチドであり;
    Yは、出現するごとに独立して、2'-デオキシ-2'-フルオロ修飾を含むヌクレオチドであり;そして、
    Yは、出現するごとに独立して、2'-O-メチル修飾を含むヌクレオチドである］
    の構造を有する、請求項77に記載の化合物。
  79. Lが、構造L1:
    Figure 2022528487000063
     である、請求項72～78のいずれか一項に記載の化合物。
  80. RがR3であり、nが2である、請求項79に記載の化合物。
  81. Lが、構造L2:
    Figure 2022528487000064
     である、請求項72～78のいずれか一項に記載の化合物。
  82. RがR3であり、nが2である、請求項81に記載の化合物。
  83. 式(VI):
    Figure 2022528487000065
     ［式(VI)中、
    Lは、エチレングリコール鎖、アルキル鎖、ペプチド、RNA、DNA、ホスフェート、ホスホネート、ホスホルアミデート、エステル、アミド、トリアゾール、およびこれらの組み合わせからなる群から選択され、ここで、式(VI)は、1つまたはそれ以上の分岐点B、および1つまたはそれ以上のスペーサーSをさらに含んでいてよく(ここで、
    Bは、出現するごとに独立して、多価有機種またはその誘導体であり;
    Sは、出現するごとに独立して、エチレングリコール鎖、アルキル鎖、ペプチド、RNA、DNA、ホスフェート、ホスホネート、ホスホルアミデート、エステル、アミド、トリアゾール、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される);
    各cNAは、独立して、1つまたはそれ以上の化学修飾を含む担体核酸であり;
    各cNAは、独立して、5' AAGAAAAGACCUGAUAAAGAUUAACCAGAAGAAAACAAGGAGGGA 3'の少なくとも15個の連続するヌクレオチドを含み;そして、
    nは、2、3、4、5、6、7または8である］
    の構造を有する、治療的核酸のための送達システム。
  84. 式(VI-1)～(VI-9):
    Figure 2022528487000066
     から選択される構造を有する、請求項83に記載の送達システム。
  85. 各cNAが、独立して、化学修飾ヌクレオチドを含む、請求項83に記載の送達システム。
  86. n個の治療的核酸(NA)をさらに含み、ここで、各NAは、少なくとも1つのcNAにハイブリダイズしている、請求項83に記載の送達システム。
  87. 各NAが、独立して、少なくとも16個の連続するヌクレオチドを含む、請求項86に記載の送達システム。
  88. 各NAが、独立して、16～20個の連続するヌクレオチドを含む、請求項87に記載の送達システム。
  89. 各NAが、少なくとも2個のヌクレオチドの不対突出部を含む、請求項87に記載の送達システム。
  90. 突出部のヌクレオチドが、ホスホロチオエート結合を介して結合されている、請求項89に記載の送達システム。
  91. 各NAが、独立して、DNA、siRNA、アンタゴmiR、miRNA、ギャップマー、ミックスマー、またはガイドRNAからなる群から選択される、請求項86に記載の送達システム。
  92. 生物においてC9ORF72遺伝子の発現を阻害する医薬組成物であって、請求項55～80のいずれか一項に記載の分岐状オリゴヌクレオチド化合物または請求項83～91のいずれか一項に記載の送達システムおよび薬学的に許容できる担体を含む、該医薬組成物。
  93. 分岐状オリゴヌクレオチド化合物または送達システムが、該C9ORF72遺伝子の発現を少なくとも50％阻害する、請求項92に記載の医薬組成物。
  94. 分岐状オリゴヌクレオチド化合物または送達システムが、該C9ORF72遺伝子の発現を少なくとも90％阻害する、請求項92に記載の医薬組成物。
  95. 細胞内でのC9ORF72遺伝子の発現を阻害する方法であって、
    (a)請求項57～82のいずれか一項に記載の分岐状オリゴヌクレオチド化合物または請求項83～91のいずれか一項に記載の送達システムを細胞に導入すること;および
    (b)工程(a)で作製された細胞を、C9ORF72遺伝子のmRNA転写産物を得るのに十分な時間維持することを含み、それによって細胞内でのC9ORF72遺伝子の発現を阻害する方法。
  96. 神経変性疾患を処置または管理する方法であって、そのよう処置または管理を必要とする患者に、治療有効量の請求項57～82のいずれか一項に記載の分岐状オリゴヌクレオチド化合物または請求項83～91のいずれか一項に記載の送達システムを投与することを含む方法。
  97. 分岐状オリゴヌクレオチド化合物または送達システムが、患者の脳に投与される、請求項96に記載の方法。
  98. 分岐状オリゴヌクレオチド化合物または送達システムが、脳室内(ICV)または髄腔内(IT)注射によって投与される、請求項97に記載の方法。
  99. 分岐状オリゴヌクレオチド化合物または送達システムの投与により、脳においてC9ORF72遺伝子mRNAの低減を引き起こす、請求項96に記載の方法。
  100. 分岐状オリゴヌクレオチド化合物または送達システムの投与により、脊髄においてC9ORF72遺伝子mRNAの低減を引き起こす、請求項96に記載の方法。
  101. 分岐状オリゴヌクレオチド化合物または送達システムが、C9ORF72遺伝子の発現を少なくとも50％阻害する、請求項96に記載の方法。
  102. 分岐状オリゴヌクレオチド化合物または送達システムが、C9ORF72遺伝子の発現を少なくとも90％阻害する、請求項96に記載の方法。
  103. それぞれ独立して15～35塩基長である二つの核酸を含む分岐状オリゴヌクレオチド化合物であって、各核酸は、C9ORF72 mRNAと実質的に相補的な相補性領域を含み、ここで、該二つの核酸は、リンカー、スペーサーおよび分岐点からなる群から独立して選択される1つまたはそれ以上の部分によって互いに結合されている、該分岐状オリゴヌクレオチド化合物。
  104. 各核酸が、独立して、表1、表2、表3、表4、または表5に記載のC9ORF72遺伝子における遺伝子領域と実質的に相補的な相補性領域を含む、請求項103に記載の分岐状オリゴヌクレオチド化合物。
  105. 各核酸が、独立して、一本鎖(ss)RNAまたは二本鎖(ds)RNAである、請求項103に記載の分岐状オリゴヌクレオチド化合物。
  106. 第一のガイド鎖、第二のガイド鎖、第一のパッセンジャー鎖、第二のパッセンジャー鎖、およびリンカーを含むジ分岐状オリゴヌクレオチド化合物であって、
    第一のガイド鎖および第二のガイド鎖は、それぞれ独立して、5' GAUUAACCAGAAGAA 3'と実質的に相補的な相補性領域を含み;そして、
    第一のパッセンジャー鎖および第二のパッセンジャー鎖は、リンカーを介して互いに結合されている、該ジ分岐状オリゴヌクレオチド化合物。
  107. 第一のガイド鎖および第二のガイド鎖は、それぞれ独立して、5' VP(mU)#(fU)#(mC)(fU)(fU)(fC)(mU)(fG)(mG)(fU)(mU)(fA)(mA)#(fU)#(mC)#(mU)#(mU)#(mU)#(mA)#(fU) 3'を含む、請求項106に記載のジ分岐状オリゴヌクレオチド化合物。
  108. 第一のパッセンジャー鎖および第二のパッセンジャー鎖はそれぞれ、5' (mG)#(mA)#(fU)(mU)(fA)(mA)(fC)(mC)(fA)(mG)(mA)(mA)(fG)#(mA)#(mA) 3'を含む、請求項106に記載のジ分岐状オリゴヌクレオチド化合物。
  109. リンカーが、エチレングリコール鎖、アルキル鎖、ペプチド、RNAオリゴヌクレオチド、DNAオリゴヌクレオチド、ホスフェート、ホスホネート、ホスホルアミデート、エステル、アミド、トリアゾール、およびこれらの組み合わせからなる群から選択され;
    ここで、リンカーのいずれかの炭素または酸素原子は、窒素原子によって置き換えられていてよく、ヒドロキシル置換基を有していてよく、またはオキソ置換基を有していてよい、請求項106に記載のジ分岐状オリゴヌクレオチド化合物。
  110. リンカーが、グリセロールまたは式-O-(CH2)o-CH(OH)-(CH2)p-O-［式中、oおよびpは、独立して、1～約6の整数である］のグリセロールホモログ鎖;および
    式-O-(CH2)m-C(O)NH-CH2-CH(OH)-CH2-NHC(O)-(CH2)m-O-［式中、mは、0～約10の整数である］の1,3-ジアミノ-2-ヒドロキシプロパンの誘導体からなる群から選択される、請求項106に記載のジ分岐状オリゴヌクレオチド化合物。
  111. 第一のパッセンジャー鎖の3'末端が、リンカーを介して第二のパッセンジャー鎖の3'末端に結合されている、請求項106に記載のジ分岐状オリゴヌクレオチド。
  112. 神経変性疾患を処置または管理する方法であって、そのような処置または管理を必要とする患者に、請求項106～111のいずれか一項に記載の治療有効量のジ分岐状オリゴヌクレオチド化合物を投与することを含む方法。
  113. ジ分岐状オリゴヌクレオチド化合物が、患者の脳に投与される、請求項112に記載の方法。
  114. ジ分岐状オリゴヌクレオチド化合物が、脳室内(ICV)または髄腔内注射によって投与される、請求項112に記載の方法。
  115. ジ分岐状オリゴヌクレオチド化合物の投与により、脳においてC9ORF72疾患アイソフォーム遺伝子mRNAの低減を引き起こす、請求項112に記載の方法。
  116. ジ分岐状オリゴヌクレオチド化合物の投与により、脊髄においてC9ORF72疾患アイソフォーム遺伝子mRNAの低減を引き起こす、請求項112に記載の方法。
  117. ジ分岐状オリゴヌクレオチド化合物が、C9ORF72疾患アイソフォーム遺伝子の発現を少なくとも50％阻害する、請求項112に記載の方法。
  118. ジ分岐状オリゴヌクレオチド化合物が、C9ORF72疾患アイソフォーム遺伝子の発現を少なくとも90％阻害する、請求項112に記載の方法。
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