WO2012053741A9 - Rna 간섭을 유도하는 핵산 분자 및 그 용도 - Google Patents

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Definitions

  • the present invention relates to a nucleic acid molecule for inducing RNAi having a novel structure and a use thereof, and more particularly, a first strand having a length of 24 to 121 nt including a partial region complementary to a target nucleic acid, A nucleic acid molecule having a new structure which has a structure composed of a second strand of 13 to 21 nts having a region complementary to a region complementary to one strand of the target nucleic acid, thereby increasing the efficiency of inhibiting expression of the target gene; and It relates to a method for inhibiting the expression of the target gene using the same.
  • RNA interference is a very specific and efficient mechanism for inhibiting gene expression, which is composed of a sense strand having a sequence homologous to an mRNA of a gene of interest and an antisense strand having a sequence complementary thereto.
  • the double-stranded RNA (dsRNA) is introduced into cells to induce degradation of the target gene mRNA, thereby suppressing expression of the target gene.
  • siRNAs used in the past are limited to 19-23 nucleotides (nt) in length of antisense strands. This is because the structure of the siRNA that researchers are using mimics the structure of long dsRNAs cut by Dicer in cells (Elbashir et al. Nature 2001, 411: 494-498). Early X-ray crystallography The results suggest a model in which the 5 'and 3' ends of the siRNA antisense strands introduced into Argonaute-2 (Ago2), a key component of the RISC complex, bind to the binding pockets of the Mid and PAZ domains, respectively (Song et. Nat. Struct. Biol.
  • Ago2 Argonaute-2
  • siRNA-DNA constructs have been reported that bind single-stranded DNA molecules that can act as primers for PCR for the detection of siRNAs in samples (US 2009/0012022 A1), which is only quantified. The addition of a tool to do this did not have a positive effect on the inhibition efficiency of the target gene.
  • the present inventors have made efforts to provide a nucleic acid molecule that induces RNAi having a new structure with increased target gene suppression efficiency.
  • the first strand having a length of 24 to 121 nt including some regions complementary to the target nucleic acid is shown.
  • the long single strand region at the 3 'end of the first strand is provided.
  • the nucleic acid oligonucleotides contained in the single stranded region of the 3 'end of the first strand may minimize the off-target, but may have an effect of targeting another target gene or inducing siRNA of the 5' end to the target gene. It was anticipated that the present invention was completed.
  • An object of the present invention is to provide a nucleic acid molecule inducing RNAi of a novel structure with improved gene expression inhibitory effect.
  • the present invention is complementary to the first strand of 24 ⁇ 121nt length comprising a partial region complementary to the target nucleic acid (target nucleic acid), and the partial region complementary to the target nucleic acid of the first strand
  • a nucleic acid molecule that induces RNAi composed of a second strand of 13-21 nt in length having a region that forms an appropriate bond.
  • the present invention also provides a nucleic acid complex in which a cell carrier is bound to the nucleic acid molecule inducing RNAi.
  • the present invention also provides a method for intracellular delivery of a nucleic acid molecule inducing RNAi, wherein the nucleic acid complex is introduced into a cell.
  • the present invention also provides a composition for inhibiting gene expression containing the nucleic acid molecule inducing the RNAi.
  • the present invention also provides a kit for inhibiting gene expression containing the nucleic acid molecule inducing the RNAi.
  • the present invention also provides a method for inhibiting gene expression comprising introducing the RNAi-derived nucleic acid molecule into a cell.
  • the present invention also provides a method for inhibiting the expression of a target gene in a cell comprising the step of expressing the RNAi-derived nucleic acid molecule in a cell.
  • the present invention also provides an anticancer composition containing the nucleic acid molecule inducing the RNAi.
  • the present invention also provides a method for preventing or treating cancer, wherein the nucleic acid molecule for inducing RNAi is used.
  • FIG. 1 is a schematic diagram of a nucleic acid molecule inducing RNAi according to the present invention.
  • FIG. 2 shows a long-antisense siRNA (lsiRNA) in which the 3 'end of the antisense strand is elongated in a sequence complementary to the target mRNA.
  • Figure 3 shows a long-antisense asiRNA (lasiRNA) of the 3 'end of the antisense strand of the asiRNA structure in a sequence complementary to the target mRNA.
  • Figure 4 shows a long stretch of ribozyme or DNAzyme sequence targeting the target mRNA at the three ends of the antisense strand of the siRNA structure.
  • 5 shows siRNA molecular structures that inhibit the expression of KRAS, a gene involved in cancer cell growth.
  • Figure 6 is a graph showing the relative ratio of the KRAS mRNA level according to the introduction of the nucleic acid molecules of FIG.
  • FIG. 7 is a graph showing the results of measuring KRAS mRNA expression levels according to the introduction of the nucleic acid molecules of FIG. 5 on the 1st, 2nd and 3rd days, respectively.
  • FIG. 9 is a graph showing the relative ratio of KRAS mRNA levels according to the introduction of the nucleic acid molecules of FIG.
  • Figure 10 is a graph showing the results of measuring the survival rate of the AGS cell line in accordance with the introduction of the nucleic acid molecules of Figure 8, respectively.
  • FIG. 11 shows lsiRNA (21S + 10r) and lasiRNA (16S + 10r) with mRNA complementary expansion sequences and molecular structures (21S + 10rc, 16S + 10rc) with expansion sequences not complementary to mRNA for KRAS. Indicates.
  • FIG. 12 is a graph showing relative ratios of KRAS mRNA levels according to the introduction of the nucleic acid molecules of FIG. 11.
  • FIG. 14 is a graph showing the results of measuring the KRAS mRNA expression level according to the introduction of the nucleic acid molecules of FIG.
  • FIG. 15 is a graph showing the results of measuring the survival rate of Hep3B cell line following the introduction of the nucleic acid molecules of FIG.
  • FIG. 16 is a photograph showing the results of a 5 ′ RACE (Rapid amplification of cDNA ends) analysis.
  • RNAi RNA interference
  • dsRNA double-stranded RNA
  • RNA small interfering RNA
  • dsRNA short double stranded RNA
  • an “antisense strand” is a polynucleotide that is substantially or 100% complementary to a target nucleic acid of interest, for example mRNA (messenger RNA), a non-mRNA RNA sequence (eg, microRNA, piwiRNA, tRNA, rRNA and hnRNA) or coding or non-coding DNA sequences may be complementary in whole or in part.
  • mRNA messenger RNA
  • non-mRNA RNA sequence eg, microRNA, piwiRNA, tRNA, rRNA and hnRNA
  • antisense strands and guide strands can be used interchangeably.
  • a "sense strand” is a polynucleotide having the same nucleic acid sequence as a nucleic acid of interest, and is characterized by mRNA (messenger RNA), non-mRNA RNA sequences (eg, microRNA, piwiRNA, tRNA, rRNA and hnRNA) or coding. Or a polynucleotide identical in whole or in part to a non-coding DNA sequence.
  • mRNA messenger RNA
  • non-mRNA RNA sequences eg, microRNA, piwiRNA, tRNA, rRNA and hnRNA
  • the regulatory protein includes a transcription factor, a heat shock protein or a protein involved in DNA / RNA replication, transcription and / or translation.
  • the gene of interest to be suppressed expression is inherent in the viral genome and may be integrated into an animal gene or exist as an extrachromosomal component.
  • the gene of interest may be a gene on the HIV genome.
  • siRNA molecules are useful for inactivating translation of HIV genes in mammalian cells.
  • the present invention provides a complementary bond with a first strand having a length of 24 to 121 nt including a partial region complementary to a target nucleic acid, and a partial region complementary to the target nucleic acid of the first strand. It relates to a nucleic acid molecule that induces RNAi composed of a second strand of 13 ⁇ 21nt length having a region to (Fig. 1).
  • the target nucleic acid is not limited thereto, but may be mRNA (messenger RNA), microRNA, piRNA (piwi-interacting RNA), coding DNA sequence, and non-coding DNA sequence.
  • the length of the partial region complementary to the target nucleic acid (target nucleic acid) of the first strand may be characterized in that 19 ⁇ 21nt.
  • the first strand comprises a single stranded region that does not bind to the second strand, preferably the first strand is a nucleic acid selected from the group consisting of antisense DNA, antisense RNA, ribozyme and DNAzyme in the single stranded region. It may be characterized in that it further comprises an oligonucleotide.
  • a single stranded region which does not form a complementary bond with the second strand of the first strand may be connected to a region that forms a complementary bond with the second strand, either directly or by a linker, wherein the linker is It may be characterized as a chemical linker.
  • the chemical linker is not limited thereto, but a nucleic acid (a nucleic acid moiety), PNA (a PNA moiety), peptide (a peptide moiety), a disulfide bond (a disulfide bond) or polyethylene glycol (a polyethylene glycol) moiety).
  • the first strand may be characterized in that the single stranded region further contains a sequence complementary to the target nucleic acid or a sequence not complementary, in the case of complementary
  • the double stranded region of the nucleic acid molecule according to the invention ie, the region complementary to the target nucleic acid of the siRNA, may be located continuously or may be located far away.
  • the sequence targeted by siRNA and the sequence targeted by ribozyme or DNAzyme of the single-stranded region may be consecutively located or distantly located.
  • the single-stranded region of the first strand has a sequence complementary to the target gene of the siRNA
  • the sequence included in the single-stranded region is antisense DNA or antisense RNA
  • the sequence of the sequence and the target gene of the siRNA is At least about 70-80%, preferably at least about 80-90%, even more preferably at least about 95-99%, complementary to each other, and if the single-stranded region is a ribozyme or DNAzyme
  • the sequence of the gene of interest of siRNA may be characterized by complementary to at least about 50-60%.
  • the single stranded region may be 5 to 100nt. If less than 5nt, the effect of increasing the gene expression inhibition efficiency is insignificant, and if more than 100nt, the synthesis efficiency of RNA molecules is reduced.
  • the single-stranded region may be preferably 9 to 100nt, or may be characterized by having a length of 50nt or less, more preferably 10 to 15nt.
  • At least one or more of the bases constituting the single-stranded region may be characterized as including a bulky base analog. If a large base analog, such as a deoxyadenosine derivative with a phenyl group, is included in the extension sequence, mRNA strands that complement the extension sequence will cleavage at the location of the large base analog. Any large base analogue that induces such cleavage can be included in the present invention without limitation.
  • the 5 'end portion acts as an RNAi mechanism and the 3' end portion acts as an antisense mechanism or the 5 'terminal siRNA portion is targeted. It was predicted that it will act to induce mRNA. In this case, when the sequence complementary to the mRNA of the antisense 3 'end is DNA, RNase H-dependent mRNA cleavage may be induced.
  • the bases constituting the single-stranded region of the antisense 3 'terminal contains a bulky base analog, or the single-stranded region is combined with mRNA to form a bulge structure It was predicted that cleavage could be induced. In addition, it was predicted that in the case of nucleic acid molecules in which ribozyme or DNAzyme was introduced into the single-stranded region of the first strand, synergistic cleavage could be induced.
  • siRNA molecule consisting of a 19-21 nt long antisense strand and a 13-16 nt long sense strand, wherein the siRNA construct having the blunt end at the 5 'end of the antisense strand is an off-target effect by the sense strand of the siRNA.
  • off-target effect means that siRNA is originally used to induce degradation of mRNA having a sequence complementary to an antisense strand and to obtain an effect of inhibiting gene expression of the mRNA.
  • the unexpected degradation of other mRNAs generated by the sense strand or the inhibitory effect of expression of the corresponding gene and the antisense strand of the siRNA are paired with the wrong target. It is to include all the inhibitory effect of the degradation of the other mRNA by the antisense strand that occurs degradation of the expression of the gene.
  • Nucleic acid molecules of the present invention may be synthesized in general, but are not limited thereto. That is, in the present invention, the nucleic acid molecule may be synthesized chemically or enzymatically.
  • the siRNA molecules of the invention can be derived from naturally occurring genes by standard recombinant techniques, but in this case can be characterized as being substantially complementary at the nucleotide sequence level with at least a portion of the mRNA of the gene of interest to change expression.
  • the nucleic acid molecule according to the present invention may be characterized by including chemical modification.
  • the chemical modification is such that the hydroxyl group at the 2 'position of the ribose of at least one nucleotide contained in the nucleic acid molecule is substituted with any one of a hydrogen atom, a fluorine atom, an -O-alkyl group, an -O-acyl group, and an amino group.
  • the phosphate backbone of at least one nucleotide may be substituted with any one of phosphorothioate form, phosphorodithioate form, alkylphosphonate form, phosphoroamidate form and boranophosphate form.
  • the chemical modification may be characterized in that at least one nucleotide included in the nucleic acid molecule is substituted with any one of a locked nucleic acid (LNA), an unlocked nucleic acid (UNA), Morpholino, peptide nucleic acid (PNA).
  • LNA locked nucleic acid
  • UNA unlocked nucleic acid
  • PNA Morpholino
  • the chemical modification may be characterized in that the nucleic acid molecule is combined with at least one selected from the group consisting of lipids, cell penetrating peptides, and cell target ligands.
  • nucleic acid molecule according to the present invention may be introduced into the cell by binding to the cell carrier, and thus the present invention relates to a nucleic acid complex in which the cell carrier is bound to the nucleic acid molecule inducing the RNAi.
  • the cell carrier may be selected from the group consisting of cationic polymers, lipids, cell penetrating peptides and cell target ligands, and cationic polymers, such as cationic lipids.
  • Sex carriers are used to deliver nucleic acids, ie siRNAs, into cells in either in vitro or in vivo, and are reagents for positively charged delivery.
  • Cationic cell carriers interact strongly with the nucleic acid molecules of the present invention to form complexes so that nucleic acid molecules that induce RNAi can be efficiently introduced into the cell.
  • Cationic polymers such as polyethyleneimine (PEI) or liposomes such as Lipofectamine 2000 (Invitrogen) can be used, but are not limited to these reagents for positively charged delivery and can be used to provide the complex according to the invention. Will be apparent to those of ordinary skill in the art.
  • lipids such as cholesterol may be linked directly to nucleic acid molecules or indirectly by binding to other cell carriers and then to nucleic acid molecules.
  • the embodiment of the present invention suggests that the RNAi-derived nucleic acid molecule according to the present invention has an effect of effectively inhibiting the expression of a target gene, and the present invention provides a gene containing the nucleic acid-derived nucleic acid molecule from another viewpoint. It relates to a composition for inhibiting expression.
  • the nucleic acid molecule may be included in the form of a nucleus complex conjugated with a cell carrier.
  • siRNAs targeting CTNNB1-2 can significantly increase the efficiency of inhibiting the expression of the target gene when applying the nucleic acid structure according to the present invention.
  • the nucleic acid molecular structure according to the present invention can obtain the same result even when a nucleic acid molecule targeting other target genes is provided.
  • kits for inhibiting gene expression may take the form of bottles, tubs, sachets, envelopes, tubes, ampoules, etc., which may be partially or wholly plastic, glass, paper, foil, It may be formed from a wax or the like.
  • the container may be equipped with a fully or partially separable stopper, which may initially be part of the container or attached to the container by mechanical, adhesive, or other means.
  • the container may also be equipped with a stopper, which may be accessible to the contents by a needle.
  • the kit may include an external package, which may include instructions for use of the components.
  • the present invention relates to a method of inhibiting expression of a target gene in a cell using the nucleic acid molecule inducing RNAi. That is, the present invention may provide a method for inhibiting expression of a target gene in a cell, comprising introducing the RNAi-derived nucleic acid molecule into a cell.
  • the first strand of the nucleic acid molecule inducing RNAi may be characterized in that it is complementary to the mRNA sequence of the target gene.
  • the target gene may be an endogenous gene or a transgene.
  • the nucleic acid molecule according to the present invention is not necessarily limited to the synthetic siRNA, there is an advantage that can be applied to siRNA or shRNA that is expressed using an expression vector or the like in the cell. That is, the nucleic acid molecule according to the present invention can suppress the expression of the target gene by expressing it in a cell.
  • the present invention relates to a method for inhibiting gene expression comprising expressing the RNAi-derived nucleic acid molecule in a cell.
  • the RNAi-derived nucleic acid molecule according to the present invention may be a gene that causes or grows cancer by overexpression, that is, a tumor-related gene as a target gene, and thus may be usefully used as an anticancer composition.
  • tumor-associated genes are not limited thereto, but KRas, Wnt-1, Hec1, Survivin, Livin, Bcl-2, XIAP, Mdm2, EGF, EGFR, VEGF, VEGFR, Mcl-1, IGF1R, Akt1, Grp78, It may be characterized in that any one of STAT3, STAT5a, ⁇ -catenin, WISP1 and c-myc.
  • siRNA molecule of the structure according to the present invention by introducing the siRNA molecule of the structure according to the present invention into the cell inhibits the expression of KRAS, a gene involved in the growth of cancer cells, and by producing a siRNA molecule with beta-catenin as the target gene, Confirmed death.
  • the anticancer composition according to the present invention includes a nucleic acid molecule for inducing the RNAi or a complex in which the nucleic acid molecule and the cell transporter are combined alone or as one or more pharmaceutically acceptable carriers, excipients or diluents.
  • the complex may be included in the pharmaceutical composition in an appropriate pharmaceutically effective amount depending on the disease and its severity, the patient's age, weight, health condition, sex, route of administration and duration of treatment.
  • pharmaceutically acceptable refers to a composition that is physiologically acceptable and that, when administered to a human, typically does not cause an allergic reaction such as gastrointestinal disorders, dizziness, or the like.
  • carriers, excipients and diluents include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, Polyvinylpyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil.
  • the pharmaceutical composition may further include fillers, anti-coagulants, lubricants, wetting agents, fragrances, emulsifiers and preservatives.
  • Pharmaceutical compositions of the invention can also be formulated using methods known in the art to provide rapid, sustained or delayed release of the active ingredient after administration to a mammal.
  • the formulations may be in the form of sterile injectable solutions and the like.
  • RNAi-inducing nucleic acid molecule or the complex in which the nucleic acid molecule and the cell transporter are bound according to the present invention may further include a conventionally known anticancer chemotherapeutic agent, and thus a combination effect can be expected.
  • cisplatin carboplatin, oxaliplatin, doxorubicin, dounorubicin, epirubicin, epirubicin, idarubicin, mitosantron (mitoxantrone), valubicin, curcumin, gefitinib, erlotinib, irinotecan, topotecan, topotecan, vinblastine, vincristine ( vincristine, docetaxel, paclitaxel and the like can be used.
  • Example 1 Construction of long-antisense-guided siRNA: Preparation Example 1
  • the length of the second strand is kept short at 21 nt, the region forming the double strand with the second strand is 19 nt, and the 3 'end of the first strand is a single strand of 17 nt in sequence complementary to the target mRNA. It was made to have an area.
  • SiRNA having a long antisense strand was named as long-antisense siRNA (lsiRNA).
  • the siRNA is induced into the target mRNA by the nucleic acid oligonucleotide included in the extension sequence or acts as a typical antisense mechanism (FIG. 2).
  • SiRNA having a long antisense strand was named as long-antisense asiRNA (lasiRNA).
  • the siRNA is induced into the target mRNA by the nucleic acid oligonucleotide included in the extension sequence or acts as a typical antisense mechanism (FIG. 3).
  • CTNNB1-2siRNA and Dz339 DNAzyme were used to construct a structure having a long antisense strand such that the length of the sense strand was kept short at 21 nt and the DNAzyme at the 3 'end of the 19 nt long antisense strand.
  • the constructed construct was named DNAzyme-guided siRNA (siRZNA) (FIG. 4).
  • Example 4 lsiRNA production and KRAS gene expression inhibition inhibiting the expression of KRAS gene expression
  • SiRNA was designed to inhibit the expression of KRAS, a gene involved in the growth of cancer cells.
  • a long antisense siRNA (lsiRNA) was added to each of the 5 ', 10, and 15 nt of the antisense strand of the existing siRNA structure (19 + 2).
  • the structure expanded with DNA of a sequence complementary to the target mRNA 21S + 5d, 10d, 15d
  • the structure expanded with DNA of a sequence not complementary to the target mRNA as a control 21S + 5c, 10c, 15c)
  • Fig. 5 target gene expression inhibition efficiency
  • a structure (21 + 15d-mut) mutated the seed sequence of lsiRNA was constructed to test whether the gene inhibition of lsiRNA was dependent on seed sequence like siRNA.
  • Each siRNA and lsiRNA were transfected into AGS cells (ATCC CRL 1739, Gastric adenocarcinoma, human) using lipofectamine2000 (invitrogen) at a concentration of 10 nM.
  • Primers used in real-time PCR for mRNA measurement are as follows.
  • the lsiRNA having a single-stranded region complementary to the target mRNA showed improved target gene suppression ability compared to the existing siRNA structure, this trend is proportional to the length of the single-stranded region could know.
  • lsiRNA control with a single stranded region not complementary to the target mRNA could not observe this enhanced gene expression inhibition. Such enhanced gene expression inhibition could not be observed.
  • lsiRNA having a seed sequence mutation it was confirmed that the target gene suppression almost disappeared. This shows that lsiRNA inhibits the target gene by seed sequence-dependent RNAi mechanism like the existing siRNA, and nonspecific gene suppression due to the modified structure does not occur.
  • lsiRNA better maintains target gene suppression after introduction into cells compared to siRNA.
  • the inhibition of gene expression reached the highest after 1 day of cell introduction, and it was confirmed that the inhibition decreased as the 2nd and 3rd days were reached (FIG. 7).
  • lsiRNA was found to maintain the target gene expression inhibition until 3 days after introduction into the cell.
  • lsiRNA control with a single stranded region not complementary to the target mRNA could not observe this enhanced gene expression inhibition. This result shows that the lsiRNA having a single stranded region complementary to the mRNA of the target gene not only shows higher efficiency of gene expression inhibition compared to the existing siRNA structure, but also maintains its efficacy longer.
  • Example 5 lasiRNA production and KRAS gene expression inhibition to inhibit KRAS gene expression confirmed
  • Example 4 it was investigated whether the nucleic acid molecular structure according to the present invention can improve its target gene expression inhibition when applied to asymmetric shorter duplex siRNA (asiRNA).
  • siRNA asymmetric shorter duplex siRNA
  • Example 4 a structure (16S + 5d, 10d, 15d) extended to DNA having a sequence complementary to the target mRNA at the 3 'end of the antisense strand of the conventional asiRNA structure and a control extended to DNA of a non-complementary sequence ( 16S + 5c, 10c, 15c) long antisense asiRNA (lasiRNA) was prepared and transfected into AGS cells to compare cancer cell growth inhibition (FIG. 8). After transfecting these RNAs into AGS cells, real-time PCR was performed in the same manner as in Example 4 to verify KRAS expression inhibitory efficiency as a target gene (FIG. 9). Each asiRNA and lasiRNA were transfected into AGS cells (ATCC CRL 1739, Gastric adenocarcinoma, human) using lipofectamine2000 (invitrogen) at a concentration of 10 nM.
  • AGS cells ATCC CRL 1739, Gastric adenocarcinoma, human
  • lasiRNA having a single-stranded extension sequence complementary to the target mRNA was confirmed to increase the target mRNA inhibitory capacity in proportion to the length of the extension sequence.
  • this effect was not observed when the extension sequence was not complementary to the target mRNA.
  • Example 6 Confirmation of growth inhibition of AGS cancer cell by lasiRNA and lasiRNA that inhibit KRAS gene expression
  • KRAS mRNA expression inhibitory ability and cancer cell growth inhibitory ability had a high correlation. That is, it was confirmed that lsiRNA (21S + 15d) having 15 expansion sequences compared to siRNA showed more potent cancer cell growth inhibitory activity, and also increased cancer cell growth inhibitory activity of lasiRNA (16S + 15d) compared to asiRNA (FIG. 10). ). On the other hand, the lsiRNA introduced a mutation in the seed sequence (LASmut) was confirmed that the induction of cancer cell growth inhibition did not show nonspecific cytotoxicity due to the long expansion sequence structure. These results show that by introducing a single stranded region complementary to the target mRNA at the antisense strand 3′-end of siRNA and asiRNA, it is possible to increase gene suppression and thus intracellular phenotype expression.
  • Example 7 Confirmation of KRAS gene expression inhibition by lsiRNA and lasiRNA whose expansion sequences are RNA
  • lsiRNA (21S + 10r) and lasiRNA (16S + 10r) having 10 mRNA complementary expansion sequences were prepared, and structures having expansion sequences not complementary to mRNA as controls (21S + 10rc, 16S + 10rc). ) was also produced.
  • KRAS mRNA expression inhibition efficiency was examined in the same manner as in Example 4.
  • Example 8 lasiRNA production inhibiting CTNNB1 gene expression and CTNNB1 gene expression inhibition
  • a lasiRNA structure corresponding to asiRNA targeting beta-catenin was prepared to confirm whether the nucleic acid molecular structure according to the present invention can induce an increase in the activity of asiRNA targeting other genes (FIG. 13). Then, Hep3B cells (ATCC HB 8064) were transfected with lipofectamine 2000 at a concentration of 10 nM, and then the expression inhibition of the gene of interest was examined by real-time PCR.
  • Increasing target gene inhibition by this lasiRNA structure was again verified by measuring Hep3B cancer cell growth inhibition. That is, 5 days after the introduction of 10 nM siRNA, asiRNA, lasiRNA into Hep3B cells, the degree of cell growth was examined by measuring the number of cells. Cell viability was investigated by directly measuring the number of cells through microscopic observation. Briefly, 10 nM of siRNA, asiRNA and lasiRNA were transfected into AGS cells seeded in 96 well plates, and the number of surviving cells after 5 days was directly counted and measured.
  • siRNA cancer cell killing ability was slightly reduced compared to siRNA, but lasiRNA having a complementary expansion target gene showed a similar level of cell killing power as siRNA. It was confirmed that lasiRNA with non-complementary expansion sequences did not increase cell killing ability as compared with asiRNA. This indicates that siRNA molecules having an extension sequence containing a sequence complementary to the target gene at the 3 'end of the antisense strand have increased target gene expression inhibitory ability.
  • RNA oligo-ligated mRNA was amplified using gene specific primers. PCR products were then cloned into T & A vector (RBC) and sequenced with M13 forward primer.
  • the nucleic acid molecular structure according to the present invention targets siRNAs by targeting a target gene complementary to some regions of the first strand according to the nucleic acid oligonucleotide included in the single strand region of the 3 'end of the first strand.
  • siRNAs by targeting a target gene complementary to some regions of the first strand according to the nucleic acid oligonucleotide included in the single strand region of the 3 'end of the first strand.
  • the use of the nucleic acid molecule according to the present invention can extend the duration of gene suppression efficiency.
  • the RNAi-derived nucleic acid molecule according to the present invention is useful because it can be used in the treatment of cancer or virus infection using siRNA by replacing the conventional siRNA molecules.

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Abstract

본 발명은 신규 구조의 RNAi를 유도하는 핵산 분자 및 그 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 목적 핵산(target nucleic acid)과 상보적인 일부 영역을 포함하는 24~121nt 길이의 제1가닥과, 상기 제1가닥의 목적 핵산과 상보적인 일부 영역과 상보적 결합을 형성하는 영역을 갖는 13~21nt 길이의 제2가닥으로 구성되는 구조를 갖도록 하여 목적 유전자의 발현 억제 효율을 증가시킨 새로운 구조의 핵산 분자 및 이를 이용한 목적 유전자의 발현 억제 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 핵산 분자 구조는 유전자 억제 효율을 증가시키거나, 또는 antisense DNA, antisense RNA, ribozyme, DNAzyme의 도입에 의해 siRNA와 함께 동일 목적유전자에 대한 결합력 향상 또는 synergistic cleavage가 일어나는 효과가 있어 목적 유전자 억제 효율을 증가시킬 수 있다. 아울러, 본 발명에 따른 핵산 분자를 사용함으로써 유전자 억제 효율의 지속기간을 연장시킬 수 있다. 이에 본 발명에 따른 RNAi를 유도하는 핵산 분자는 종래의 siRNA 분자들을 대체하여 siRNA를 이용한 암이나 바이러스 감염 치료 등에 활용될 수 있어 유용하다.

Description

RNA 간섭을 유도하는 핵산 분자 및 그 용도
본 발명은 신규 구조의 RNAi를 유도하는 핵산 분자 및 그 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 목적 핵산(target nucleic acid)과 상보적인 일부 영역을 포함하는 24~121nt 길이의 제1가닥과, 상기 제1가닥의 목적 핵산과 상보적인 일부 영역과 상보적 결합을 형성하는 영역을 갖는 13~21nt 길이의 제2가닥으로 구성되는 구조를 갖도록 하여 목적 유전자의 발현 억제 효율을 증가시킨 새로운 구조의 핵산 분자 및 이를 이용한 목적 유전자의 발현 억제 방법에 관한 것이다.
RNA 간섭(RNA interference: RNAi)은 매우 특이적이고, 효율적으로 유전자 발현을 억제할 수 있는 메카니즘으로, 이는 목적유전자의 mRNA와 상동인 서열을 가지는 센스 가닥과 이것과 상보적인 서열을 가지는 안티센스 가닥으로 구성되는 이중가닥 RNA(dsRNA)를 세포 등에 도입하여 목적유전자 mRNA의 분해를 유도함으로서 목적유전자의 발현을 억제한다.
기존에 사용되고 있는 siRNA는 대부분 안티센스 가닥(antisense strand)의 길이가 19-23 뉴클레오티드(nucleotide, nt)로 제한되어 있다. 이는 연구자들이 사용하고 있는 siRNA의 구조가 세포 내에서 긴 dsRNA가 Dicer에 의해 잘린 산물의 구조를 모방하고 있기 때문이다 (Elbashir et al. Nature 2001, 411:494-498).또한 초기 X-ray crystallography 연구 결과를 통해 RISC complex의 핵심 요소인 Argonaute-2 (Ago2)에 도입된 siRNA 안티센스 가닥의 5'과 3'말단이 각각 Mid domain과 PAZ domain의 binding pocket에 결합하고 있는 모델이 제시되었으나 (Song et al. Nat. Struct. Biol. 2003, 10:1026-1032),이후 연구를 통해 안티센스 가닥의 16번째 염기 이후 3' 말단 부분은 PAZ domain과 결합하지 않음이 밝혀졌다 (Wang et al. Nature 2009, 461:754-761).이는 siRNA 안티센스 가닥의 3'쪽 부분의 서열 및 길이에 flexibility가 있을 수 있음을 의미한다.
한편, siRNA에 대한 추가 연구의 일환으로 siRNA의 샘플 내 검출을 위하여 PCR을 위한 프라이머로서 작용할 수 있는 단일가닥 DNA 분자를 결합한 변형 siRNA-DNA 구조체가 보고되었으나 (US 2009/0012022 A1), 이는 오직 정량화하기 위한 도구를 추가한 것뿐으로 목적 유전자의 억제 효율에는 긍정적인 영향을 가져오지 못하였다.
이에 본 발명자들은 목적 유전자 억제 효율을 증가시킨 새로운 구조의 RNAi를 유도하는 핵산 분자를 제공하고자 예의 노력한 결과, 목적 핵산(target nucleic acid)과 상보적인 일부 영역을 포함하는 24~121nt 길이의 제1가닥과, 상기 제1가닥의 목적 핵산과 상보적인 일부 영역과 상보적 결합을 형성하는 영역을 갖는 13~21nt 길이의 제2가닥으로 구성되는 구조를 가지는 핵산 분자를 고안하고, 제1가닥의 3' 말단 측의 단일 가닥 영역에 포함되는 핵산올리고뉴클레오티드가 다른 목적유전자를 타겟팅하거나 본 핵산 분자를 목적유전자로 유도할 것으로 예측하였다. 또한, 본 발명자들이 발명한 바 있는 오프-타겟 효과를 최소화하고 RNAi 기구를 포화시키지 않는 siRNA 구조체(대한민국 공개특허 10-2009-0065880)를 이용하여 제1가닥의 3' 말단에 긴 단일 가닥 영역을 가지는 핵산 분자 구조를 만들면, 오프-타겟를 최소화하면서도 제1가닥의 3'말단 측 단일 가닥 영역에 포함되는 핵산올리고뉴클레오티드가 다른 목적유전자를 타겟팅하거나 5' 말단의 siRNA를 목적유전자로 유도하는 효과를 나타낼 수 있을 것으로 예측하였고, 이에 본 발명을 완성하게 되었다.
본 배경기술 부분에 기재된 상기 정보는 오직 본 발명의 배경에 대한 이해를 향상시키기 위한 것이며, 이에 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자에게 있어 이미 알려진 선행기술을 형성하는 정보를 포함하지 않을 수 있다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 유전자 발현 억제 효과가 향상된 새로운 구조의 RNAi를 유도하는 핵산 분자를 제공하는 데 있다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 목적 핵산(target nucleic acid)과 상보적인 일부 영역을 포함하는 24~121nt 길이의 제1가닥과, 상기 제1가닥의 목적 핵산과 상보적인 일부 영역과 상보적 결합을 형성하는 영역을 갖는 13~21nt 길이의 제2가닥으로 구성되는 RNAi를 유도하는 핵산 분자를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 RNAi를 유도하는 핵산 분자에 세포전달체가 결합되어 있는 핵산 복합체를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 핵산 복합체를 세포 내로 도입시키는 것을 특징으로 하는 RNAi를 유도하는 핵산 분자의 세포 내 전달방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 RNAi를 유도하는 핵산 분자를 함유하는 유전자 발현 억제용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 RNAi를 유도하는 핵산 분자를 함유하는 유전자 발현 억제용 키트를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 RNAi를 유도하는 핵산 분자를 세포 내에서 도입시키는 단계를 포함하는 유전자 발현 억제 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 RNAi를 유도하는 핵산 분자를 세포 내 발현시키는 단계를 포함하는 세포 내 목적 유전자의 발현 억제 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 RNAi를 유도하는 핵산 분자를 함유하는 항암조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 RNAi를 유도하는 핵산분자를 이용하는 것을 특징으로 하는 암의 예방 또는 치료방법을 제공한다.
본 발명의 다른 특징 및 구현예는 다음의 상세한 설명 및 첨부된 특허청구범위로부터 더욱 명백해 질 것이다.
도 1은 본 발명에 따른 RNAi를 유도하는 핵산분자의 개략도이다.
도 2는 antisense strand의 3' 말단을 표적 mRNA와 상보적인 서열로 길게 늘인 구조(long-antisense siRNA; lsiRNA)를 나타낸 것이다.
도 3은 asiRNA 구조의 antisense strand의 3'말단을 표적 mRNA와 상보적인 서열로 길게 늘인 구조(long-antisense asiRNA; lasiRNA)를 나타낸 것이다.
도 4는 siRNA 구조의 antisense strand의 3말단에 표적 mRNA를 타겟팅하는 ribozyme 이나 DNAzyme 서열을 길게 늘인 구조를 나타낸 것이다.
도 5는 암세포의 성장에 관여하는 유전자인 KRAS의 발현을 저해하는 siRNA 분자 구조들을 나타낸다.
도 6은 도 5의 핵산 분자들의 도입에 따른 KRAS mRNA 수준을 상대적인 비로 나타낸 그래프이다.
도 7은 도 5의 핵산 분자들의 도입에 따른 KRAS mRNA 발현 수준을 1일, 2일 및 3일차에 각각 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 8은 KRAS에 대한 asiRNA 및 lasiRNA 분자 구조들을 나타낸다.
도 9는 도 8의 핵산 분자들의 도입에 따른 KRAS mRNA 수준을 상대적인 비로 나타낸 그래프이다.
도 10은 도 8의 핵산 분자들의 도입에 따른 AGS 세포주의 생존율을 5일차에 각각 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 11은 KRAS에 대한, mRNA 상보적 확장서열을 가지는 lsiRNA(21S+10r) 및 lasiRNA(16S+10r)와, mRNA에 상보적이지 않은 확장서열을 가지는 분자 구조(21S+10rc, 16S+10rc)를 나타낸다.
도 12는 도 11의 핵산 분자들의 도입에 따른 KRAS mRNA 수준을 상대적인 비로 나타낸 그래프이다.
도 13은 CTNNB1-2에 대한 asiRNA 및 lasiRNA 분자 구조들을 나타낸다.
도 14는 도 13의 핵산 분자들의 도입에 따른 KRAS mRNA 발현 수준을 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 15는 도 13의 핵산 분자들의 도입에 따른 Hep3B 세포주의 생존율을 도입 5일차에 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 16은 5’RACE (Rapid amplification of cDNA ends) 분석을 수행한 결과 사진이다.
발명의 상세한 설명 및 바람직한 구현예
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법 은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명의 상세한 설명 등에서 사용되는 주요 용어의 정의는 다음과 같다.
본원에서 "RNAi (RNA interference)"란, 목적유전자의 mRNA와 상동인 서열을 가지는 가닥과 이것과 상보적인 서열을 가지는 가닥으로 구성되는 이중가닥 RNA(dsRNA)를 세포 등에 도입하여 목적유전자 mRNA의 분해를 유도함으로서 목적유전자의 발현을 억제하는 메카니즘을 의미한다.
본원에서 "siRNA (small interfering RNA)"란, 서열 특이적으로 효율적인 유전자 발현 억제(gene silencing)를 매개하는 짧은 이중 가닥의 RNA(dsRNA)를 의미한다.
본원에서, "안티센스 가닥(antisense strand)"이란 관심있는 목적 핵산(target nucleic acid)에 실질적으로 또는 100% 상보적인 폴리뉴클레오티드로서, 예를 들어 mRNA (messenger RNA), mRNA가 아닌 RNA 서열(e.g., microRNA, piwiRNA, tRNA, rRNA 및 hnRNA) 또는 코딩 또는 비코딩 DNA 서열과 전체로서 또는 일부로서 상보적일 수 있다. 본원에서, 안티센스 가닥 및 가이드 가닥은 교환되어 사용될 수 있다.
본원에서, "센스 가닥(sense strand)"이란 목적 핵산과 동일한 핵산 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드로서, mRNA (messenger RNA), mRNA가 아닌 RNA 서열(e.g., microRNA, piwiRNA, tRNA, rRNA 및 hnRNA) 또는 코딩 또는 비코딩 DNA 서열과 전체로서 또는 일부로서 동일한 폴리뉴클레오티드를 말한다.
본원에서 "유전자"란 최광의의 의미로 간주되어야 하며, 구조 단백질 또는 조절 단백질을 암호화할 수 있다. 이때, 조절단백질은 전사인자, 열 충격단백질 또는 DNA/RNA 복제, 전사 및/또는 번역에 관여하는 단백질을 포함한다. 본 발명에 있어서, 발현 억제의 대상이 되는 목적유전자는 바이러스 게놈에 내재된 것으로, 동물유전자로 통합되거나 염색체 외 구성요소로서 존재할 수 있다. 예컨대, 목적유전자는 HIV 게놈상의 유전자일 수 있다. 이 경우, siRNA 분자는 포유동물 세포 내 HIV 유전자의 번역을 불활성화시키는데 유용하다.
본 발명은 일 관점에서, 목적 핵산(target nucleic acid)과 상보적인 일부 영역을 포함하는 24~121nt 길이의 제1가닥과, 상기 제1가닥의 목적 핵산과 상보적인 일부 영역과 상보적 결합을 형성하는 영역을 갖는 13~21nt 길이의 제2가닥으로 구성되는 RNAi를 유도하는 핵산 분자에 관한 것이다 (도 1).
본 발명에 있어서, 상기 목적 핵산은 이로 한정되는 것은 아니나, mRNA (messenger RNA), microRNA, piRNA (piwi-interacting RNA), 코딩 DNA 서열 및 비코딩 DNA 서열 등 일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 제1가닥의 목적 핵산(target nucleic acid)과 상보적인 일부 영역의 길이는 19~21nt 인 것을 특징으로 할 수 있다. 따라서, 상기 제1가닥은 제2가닥과 결합하지 않는 단일 가닥 영역을 포함하며, 바람직하게는 제1가닥은 단일 가닥 영역에 안티센스 DNA, 안티센스 RNA, 라이보자임 및 DNAzyme으로 구성된 군에서 선택되는 핵산올리고뉴클레오티드를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 제1가닥 중 제2가닥과 상보적 결합을 형성하지 않는 단일 가닥 영역은 직접 또는 링커에 의하여 상기 제2가닥과 상보적 결합을 형성하는 영역에 연결될 수 있으며, 이때 링커는 화학적 링커(chemical linker)임을 특징으로 할 수 있다. 이때, 상기 화학적 링커는 이로 제한되는 것은 아니나, 핵산 (a nucleic acid moiety), PNA (a PNA moiety), 펩타이드 (a peptide moiety), 다이설퍼이드 결합 (a disulfide bond) 또는 폴리에틸렌 글리콜 (a polyethylene glycol moiety)인 것을 특징으로 할 수 있다.
아울러, 본 발명에 있어서, 상기 제1가닥은 단일 가닥 영역에 상기 목적 핵산과 상보적인 서열을 추가로 함유하거나 상보적이지 않은 서열을 함유하는 것을 특징으로 할 수 있고, 상보적인 경우에 있어서, 본 발명에 따른 핵산 분자의 이중 가닥 영역, 즉 siRNA의 목적 핵산에 상보적인 영역과 연속적으로 위치할 수 있고, 멀리 떨어져 위치할 수도 있다. 마찬가지로, siRNA가 표적하는 sequence와 상기 단일가닥 영역의 ribozyme이나 DNAzyme이 표적하는 sequence는 연속적으로 위치할 수도 있고, 멀리 떨어져 위치할 수도 있다. 또한, 상기 제1가닥의 단일가닥 영역이 상기 siRNA의 목적유전자와 상보적인 서열을 갖는 경우에 있어서, 단일가닥 영역에 포함되는 서열이 안티센스 DNA 또는 안티센스 RNA이면 그 서열과 siRNA의 목적유전자의 서열이 약 70-80% 이상, 바람직하게는 약 80-90% 이상, 보다 더 바람직하게는 약 95-99% 이상 서로 상보적인 것을 특징으로 할 수 있고, 단일가닥 영역이 라이보자임 또는 DNAzyme이면 그 서열과 siRNA의 목적유전자의 서열이 약 50-60% 이상 서로 상보적인 것을 특징으로 할 수 있다.
아울러, 상기 단일 가닥 영역은 5 내지 100nt일 수 있다. 5nt 이하이면 유전자 발현 억제 효율의 증가 효과가 미비하며, 100nt이상인 경우 RNA 분자의 합성효율이 저하된다. 또한, 상기 단일가닥 영역은 바람직하게는 9 내지 100nt일 수 있으며, 또는 50nt이하의 길이를 갖는 것을 특징으로 할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 10 내지 15nt의 길이를 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 단일 가닥 영역을 구성하는 염기 중 적어도 하나 이상이 거대한(bulky) 염기 유사체(base analog)를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 페닐 그룹을 가지는 deoxyadenosine 유도체와 같은 거대한 염기 유사체가 확장 서열에 포함되어 있으면, 이 확장 서열과 상보적으로 결합하는 mRNA 가닥은 거대한 염기 유사체의 위치에서 cleavage가 일어나게 된다. 이러한 cleavage를 유도하는 거대한 염기 유사체라면 제한 없이 본 발명에 포함될 수 있다.
본 발명에서는 siRNA의 안티센스 가닥을 표적 mRNA 서열과 상보적으로 길게 늘인 핵산 구조체의 경우, 5'말단 부분은 RNAi 기작으로 작용하며 동시에 3'말단 부분은 안티센스 메커니즘으로 작용하거나 5'말단 siRNA 부분을 표적 mRNA로 유도하는 작용을 할 것으로 예측하였다. 이때, 안티센스 3' 말단의 mRNA에 상보적인 서열이 DNA일 경우에는 RNase H 의존적 mRNA 절단을 유도할 수 있다. 또한, 안티센스 3'말단의 단일가닥 영역을 구성하는 염기 중 적어도 하나 이상이 거대한(bulky) 염기 유사체(base analog)를 포함하거나, 단일가닥 영역이 mRNA와 결합하여 벌지(bulge) 구조를 형성하는 경우에도 cleavage를 유도할 수 있을 것으로 예측하였다. 또한, 제1 가닥의 단일가닥 영역에 ribozyme이나 DNAzyme을 도입한 핵산 분자의 경우에는 synergistic cleavage를 유도할 수 있을 것으로 예측하였다.
19-21nt 길이의 안티센스 가닥 및 13-16nt 길이의 센스 가닥으로 구성된 siRNA 분자로서, 안티센스 가닥의 5' 방향의 말단이 블런트 말단(blunt end)인 siRNA 구조체는 siRNA의 센스 가닥에 의한 오프-타겟 효과의 발생이나 타 RNAi 기작을 저해함 없이 우수한 목적 유전자 발현 억제 효율을 제공하는 것으로(대한민국 공개특허 10-2009-0065880), 이러한 siRNA에 본 발명에 따른 구조를 적용시키는 경우 오프-타겟 효과를 최소화하면서 제1가닥의 단일가닥 영역에 포함되는 핵산올리고뉴클레오티드에 의한 상기와 같은 효과를 동시에 나타낼 수 있다. 본원에서, "오프-타겟 효과(Off-target effect)"란 본래 siRNA는 안티센스 가닥과 상보적인 서열을 갖는 mRNA의 분해를 유도하여 해당 mRNA의 유전자 발현을 억제하는 효과를 얻기 위하여 사용하는 것임에 불구하고, siRNA의 센스 가닥에 의해 타 mRNA의 분해가 발생하게 되는 경우 센스 가닥에 의해 발생하는 이러한 예상치 못한 타 mRNA의 분해 내지 해당 유전자의 발현 억제 효과 및 siRNA의 안티센스 가닥이 잘못된 타겟과 페어링하여 타 mRNA의 분해가 발생하는 안티센스 가닥에 의한 타 mRNA의 분해 내지 해당 유전자의 발현 억제효과를 모두 포함하는 것이다.
본 발명의 핵산 분자는 일반적으로 합성된 것일 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 즉, 본 발명에 있어서, 상기 핵산 분자는 화학적 또는 효소학적으로 합성된 것일 수 있다. 본 발명의 siRNA 분자는 표준 재조합 기법에 의해 자연 발생적 유전자로부터 유도할 수 있으나, 이 경우 발현을 변화시킬 목적 유전자의 mRNA의 적어도 일부분과 뉴클레오티드 서열 수준에서 실질적으로 상보적인 것을 특징으로 할 수 있다.
이에 본 발명에 따른 핵산 분자는 화학적 변형을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 화학적 변형은 상기 핵산 분자에 포함되는 적어도 1종의 뉴클레오티드의 리보스의 2' 위치의 히드록실기가 수소원자, 불소원자, -O-알킬기, -O-아실기, 및 아미노기 중 어느 하나로 치환되는 것을 특징으로 할 수 있으며, 이에 제한되지 않고 핵산 분자의 전달능을 높이기 위해서라면 -Br, -Cl, -R, -R'OR, -SH, -SR, -N3 및 -CN (R= alkyl, aryl, alkylene) 중 어느 하나로도 치환될 수 있다. 또한, 적어도 1종의 뉴클레오티드의 포스페이트 백본이 phosphorothioate form, phosphorodithioate form, alkylphosphonate form, phosphoroamidate form 및 boranophosphate form 중 어느 하나로 치환될 수 있다. 또한, 상기 화학적 변형은 상기 핵산 분자에 포함되는 적어도 1종의 뉴클레오티드가 LNA (locked nucleic acid), UNA(unlocked nucleic acid), Morpholino, PNA (peptide nucleic acid) 중 어느 하나로 치환된 것임을 특징으로 할 수 있으며, 상기 화학적 변형은 상기 핵산 분자가 지질, 세포투과성 펩타이드(cell penetrating peptide) 및 세포 표적 리간드로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상과 결합되는 것을 특징으로 할 수 있다.
아울러, 본 발명에 따른 핵산 분자는 세포전달체에 결합되어 세포 내로 도입될 수 있으며, 이에 본 발명은 다른 관점에서, 상기 RNAi를 유도하는 핵산 분자에 세포전달체가 결합되어 있는 핵산 복합체에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 세포전달체는 양이온성 폴리머, 지질, 세포투과성 펩타이드(cell penetrating peptide) 및 세포 표적 리간드로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으며, 양이온성 폴리머, 양이온성 지질과 같은 양이온성 세포전달체는 in vitro 및 in vivo의 어느 상태에서도 핵산, 즉 siRNA를 세포 내로 전달하기 위하여 사용하는 것으로, 양성으로 전하된 전달을 위한 시약이다. 양이온성 세포전달체는 본 발명의 핵산 분자와 강하게 상호작용을 하여 복합체를 형성함으로써 RNAi를 유도하는 핵산 분자가 효과적으로 세포 내 도입될 수 있도록 한다. 폴리에틸렌이민 (PEI)과 같은 양이온성 폴리머 또는 Lipofectamine 2000(Invitrogen)과 같은 리포좀을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않고 양성으로 전하된 전달을 위한 시약의 경우 본 발명에 따른 복합체를 제공하기 위하여 사용할 수 있음은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자에게 자명할 것이다. 또한, 콜레스테롤과 같은 지질은 핵산 분자에 직접적으로 연결되거나, 다른 세포전달체에 결합된 다음 핵산 분자와 결합함으로써 간접적으로 연결될 수도 있다.
아울러, 본 발명의 실시예는 본 발명에 따른 RNAi를 유도하는 핵산 분자가 효율적으로 목적 유전자 발현 억제 효과를 가져옴을 제시한 바, 본 발명은 다른 관점에서 상기 RNAi를 유도하는 핵산 분자를 함유하는 유전자 발현 억제용 조성물에 관한 것이다. 이때, 상기 핵산 분자는 상게 세포전달체가 결합된 핵신 복합체의 형태로 포함될 수 있다.
본 발명의 실시예에서는, 목적유전자로서 KRAS 뿐만 아니라, CTNNB1-2를 타겟으로 하는 siRNA에 대해서도 동일하게 본 발명에 따른 핵산 구조 적용 시 목적 유전자 발현 억제효율이 현저히 증가하고 그 효능 또한 오래 지속시킬 수 있음을 확인한 바, 본 발명에 따른 핵산 분자 구조는 기타 다른 목적 유전자를 타겟으로 하는 핵산 분자를 제공한 경우에도 동일한 결과를 얻을 수 있다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명한 사항이라 할 것이다.
한편, 상기 유전자 발현 억제용 조성물은 유전자 발현 억제용 키트(kit)의 형태로 제공될 수 있다. 유전자 발현 억제용 키트는 병, 통(tub), 작은 봉지(sachet), 봉투(envelope), 튜브, 앰플(ampoule) 등과 같은 형태를 취할 수 있으며 이들은 부분적으로 또는 전체적으로 플라스틱, 유리, 종이, 호일, 왁스 등으로부터 형성될 수 있다. 용기는, 처음에는 용기의 일부이거나 또는 기계적, 접착성, 또는 기타 수단에 의해 용기에 부착될 수 있는, 완전히 또는 부분적으로 분리가 가능한 마개를 장착할 수 있다. 용기는 또한 주사바늘에 의해 내용물에 접근할 수 있는, 스토퍼가 장착될 수 있다. 상기 키트는 외부 패키지를 포함할 수 있으며, 외부 패키지는 구성 요소들의 사용에 관한 사용설명서를 포함할 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 RNAi를 유도하는 핵산 분자를 이용하여 세포 내 목적 유전자의 발현을 억제시키는 방법에 관한 것이다. 즉, 본 발명은 상기 RNAi를 유도하는 핵산 분자를 세포 내 도입시키는 단계를 포함하는 세포 내 타겟 유전자의 발현 억제 방법을 제공할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 RNAi를 유도하는 핵산 분자의 제1가닥은 목적 유전자의 mRNA 서열에 상보적인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 목적 유전자는 내인성(endogeneous) 유전자이거나 삽입유전자(transgene)일 수 있다.
이때, 본 발명에서 따른 핵산 분자는 반드시 합성 siRNA로 제한되지 않고, 세포내에서 발현 벡터 등을 이용하여 발현되는 siRNA나 shRNA에도 적용이 가능한 장점이 있다. 즉, 본 발명에 따른 핵산 분자는 세포 내에서 발현시킴으로써 목적 유전자의 발현을 억제시킬 수 있다. 따라서, 본 발명은 다른 관점에서, 상기 RNAi를 유도하는 핵산 분자를 세포 내에서 발현시키는 단계를 포함하는 유전자 발현 억제 방법에 관한 것이다.
한편, 본 발명에 따른 RNAi를 유도하는 핵산 분자는 과발현에 의해 암을 발생시키거나 성장시키는 유전자, 즉 종양 관련 유전자를 목적 유전자로 할 수 있으며, 이에 항암 조성물로서 유용하게 사용될 수 있다. 이때, 종양 관련 유전자는 이로서 제한되는 것은 아니나, KRas, Wnt-1, Hec1, Survivin, Livin, Bcl-2, XIAP, Mdm2, EGF, EGFR, VEGF, VEGFR, Mcl-1, IGF1R, Akt1, Grp78, STAT3, STAT5a, β-catenin, WISP1 및 c-myc 중 어느 하나인 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 본 발명에 따른 구조의 siRNA 분자를 세포 내 도입함으로써 암세포의 성장에 관여하는 유전자인 KRAS의 발현을 억제하고, beta-catenin을 목적유전자로 하는 siRNA 분자를 제작하여 암세포주가 사멸함을 확인하였다.
아울러, 본 발명에 따른 항암조성물은 상기 RNAi를 유도하는 핵산 분자 또는 상기 핵산 분자와 세포 전달체가 결합된 복합체를 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하여 약학 조성물로 제공될 수 있으며, 상기 복합체는 질환 및 이의 중증정도, 환자의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료 기간 등에 따라 적절한 약학적으로 유효한 양으로 약학 조성물에 포함될 수 있다.
상기에서 "약학적으로 허용되는"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리톤, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
상기 약학 조성물은 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다. 또한 본 발명의 약학 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 멸균 주사 용액 등의 형태일 수 있다.
한편, 본 발명에 따른 RNAi를 유도하는 핵산 분자 또는 본 핵산 분자와 세포 전달체가 결합된 복합체는 종래에 공지된 항암 화학요법제를 추가로 포함함으로써, 병용 효과를 기대할 수 있다. 예를 들어, 시스플라틴(cisplatin), 카르보플라틴(carboplatin), 옥살리플라틴 (oxaliplatin), 독소루비신(doxorubicin), 다우노루비신(daunorubicin), 에피루비신(epirubicin), 이다루비신 (idarubicin), 미토산트론(mitoxantrone), 발루비신(valubicin), 커큐민(curcumin), 제피티닙(gefitinib), 에를로티닙(erlotinib), 이리노테칸(irinotecan), 토포테칸(topotecan), 빈블라스틴(vinblastine), 빈크리스틴 (vincristine), 도세탁셀(docetaxel), 파클리탁셀(paclitaxel) 등을 사용할 수 있다.
이하 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: long-antisense-guided siRNA의 제작: 제조예 1
제2가닥의 길이는 21nt로 짧게 유지하고, 제1 가닥에서 제2가닥과 이중가닥을 형성하는 영역을 19nt로 하고 제1 가닥의 3' 말단을 표적 mRNA와 상보적인 서열로 17nt 길이의 단일 가닥 영역을 갖도록 제작하였다. 제작된 긴 안티센스 가닥을 가지는 siRNA를 long-antisense siRNA(lsiRNA)로 명명하였다. 확장 서열에 포함되는 핵산올리고뉴클레오티드에 의하여 siRNA가 표적 mRNA로 유도되거나 전형적인 antisense mechanism으로 작용한다(도 2).
실시예 2: long-antisense asiRNA의 제작: 제조예 2
제2 가닥의 길이를 15nt로 짧게 유지하고, 제1 가닥에서 제2가닥과 이중가닥을 형성하는 영역을 19nt로 하고 제1 가닥의 3' 말단을 표적 mRNA와 상보적인 서열로 17nt 길이의 확장 서열을 가지며 5' 말단은 블런트 말단을 가지도록 제작하였다. 제작된 긴 안티센스 가닥을 가지는 siRNA는 long-antisense asiRNA(lasiRNA)로 명명하였다. 확장 서열에 포함되는 핵산올리고뉴클레오티드에 의하여 siRNA가 표적 mRNA로 유도되거나 전형적인 antisense mechanism으로 작용한다(도 3).
실시예 3: DNAzyme(또는 ribozyme)-guided siRNA(siRZNA)의 제작: 제조예 3
CTNNB1-2siRNA 및 Dz339 DNAzyme을 이용하여, 센스 가닥의 길이를 21nt로 짧게 유지하고, 19nt 길이의 안티센스 가닥의 3' 말단에 DNAzyme을 갖도록 긴 안티센스 가닥을 가지는 구조를 제작하였다. 제작된 구조체를 DNAzyme-guided siRNA(siRZNA)로 명명하였다(도 4).
실시예 4: KRAS 유전자의 발현을 저해하는 lsiRNA 제작 및 KRAS 유전자 발현 억제능 확인
암세포의 성장에 관여하는 유전자인 KRAS의 발현을 저해하는 siRNA를 디자인하였다. 또한 기존 siRNA구조(19+2)의 안티센스 가닥의 3' 말단에 각 5, 10, 15 nt가 더해진 long antisense siRNA (lsiRNA)를 제작하였다. 이때 다음과 같이 표적 mRNA와 상보적인 서열의 DNA로 확장된 구조 (21S+5d, 10d, 15d)와 대조군으로 표적 mRNA와 상보적이지 않은 서열의 DNA로 확장된 구조 (21S+5c, 10c, 15c)를 제작하여 표적 유전자 발현 억제 효율을 비교하였다 (도 5). 또한 lsiRNA의 seed sequence를 mutation 시킨 구조 (21+15d-mut)을 제작하여 lsiRNA의 유전자 억제력이 siRNA와 같이 seed sequence 의존적인지를 테스트하였다. 각 siRNA 및 lsiRNA는 10 nM 농도로 lipofectamine2000 (invitrogen)을 이용하여 AGS cell (ATCC CRL 1739, Gastric adenocarcinoma, human)에 transfection 하였다. mRNA 측정을 위한 Real-time PCR에 사용된 프라이머는 다음과 같다.
KRAS
forward sequence 5'-GAGTGCCTTGACGATACAGC-3' (서열번호 15)
reverse sequence 5'-CCCTCATTGCACTGTACTCC-3' (서열번호 16)
그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, 표적 mRNA에 상보적인 단일 가닥 영역을 가지는 lsiRNA의 경우 기존 siRNA 구조에 비해 향상된 표적 유전자 억제력을 보이는 것을 확인하였으며 이 경향은 상기 단일 가닥 영역의 길이에 비례함을 알 수 있었다. 반면, 표적 mRNA에 상보적이지 않은 단일 가닥 영역을 가지는 lsiRNA 대조군의 경우 이러한 향상된 유전자 발현 억제를 관찰할 수 없었다. 이러한 향상된 유전자 발현 억제를 관찰할 수 없었다. 또한, seed sequence mutation을 가지는 lsiRNA의 경우에는 표적 유전자 억제력이 거의 사라진 것을 확인하였다. 이는 lsiRNA가 기존 siRNA와 같이 seed sequence 의존적인 RNAi 메카니즘으로 표적 유전자를 억제하며, 변형된 구조에 의한 비특이적 유전자 억제 현상이 일어나지 않음을 보여준다.
다음으로, lsiRNA가 siRNA에 비해 세포 내 도입 후 표적 유전자 억제력을 더 잘 유지하는지를 조사하였다. 기존 siRNA 구조의 경우 시간이 세포 도입 1일 후 유전자 발현 억제력이 최고에 달했으며 2일, 3일이 됨에 따라 억제력이 감소함을 확인하였다 (도 7). 이와 반면, lsiRNA의 경우 세포 내 도입 후 3일까지도 표적 유전자 발현 억제력이 유지됨을 알 수 있었다. 반면, 표적 mRNA에 상보적이지 않은 단일 가닥 영역을 가지는 lsiRNA 대조군의 경우 이러한 향상된 유전자 발현 억제를 관찰할 수 없었다. 이 결과는 표적 유전자의 mRNA에 상보적인 단일 가닥 영역을 가지는 lsiRNA의 경우 기존 siRNA 구조에 비해 더 높은 효율의 유전자 발현 억제력을 나타낼 뿐 아니라 그 효능 또한 보다 오래 유지됨을 보여준다.
실시예 5: KRAS 유전자 발현을 저해하는 lasiRNA 제작 및 KRAS 유전자 발현 억제능 확인
실시예 4에 추가하여, 본 발명에 따른 핵산 분자 구조가 asymmetric shorter duplex siRNA (asiRNA)에 적용 시 이의 표적 유전자 발현 억제력을 향상시킬 수 있는지 조사하였다.
실시예 4와 마찬가지로 기존 asiRNA구조의 안티센스 가닥의 3' 말단에 표적 mRNA와 상보적인 서열의 DNA로 확장된 구조 (16S+5d, 10d, 15d) 및 상보적이지 않은 서열의 DNA로 확장된 대조군(16S+5c, 10c, 15c) long antisense asiRNA (lasiRNA)를 제작하여 AGS 세포에 transfection한 후 암세포 성장 저해력을 비교하였다 (도 8). 이들 RNA를 AGS 세포에 transfection한 후 실시예 4와 같은 방법으로 real-time PCR를 수행하여 목적유전자인 KRAS 발현 억제 효율을 검증하였다 (도 9). 각 asiRNA 및 lasiRNA는 10 nM 농도로 lipofectamine2000 (invitrogen)을 이용하여 AGS cell (ATCC CRL 1739, Gastric adenocarcinoma, human)에 transfection 하였다.
그 결과, lsiRNA와 유사하게 lasiRNA의 경우에도 표적 mRNA에 상보적인 단일가닥 확장 서열을 가지는 lasiRNA는 확장 서열의 길이에 비례하여 표적 mRNA 억제력이 증가됨을 확인하였다. 반면, 확장 서열이 표적 mRNA에 상보적이지 않은 경우에는 이러한 효과를 관찰하지 못하였다.
실시예 6: KRAS 유전자 발현을 저해하는 lasiRNA 및 lasiRNA에 의한 AGS 암세포 성장 억제능 확인
다음으로 siRNA 및 asiRNA 대비 각각 향상된 표적 유전자 억제력을 나타내는 KRAS 표적 lsiRNA 및 lasiRNA 구조가 AGS 암세포의 성장 억제력도 증가시키는지를 확인하였다. 이를 위해 10 nM의 RNA를 96 웰 플레이트에 시딩된 AGS 세포에 lipofectamine2000으로 transfection한 후 5일 후 세포의 생존률을 현미경 관찰을 통해 직접 세포의 개수를 눈으로 세어 측정하였다.
그 결과, KRAS mRNA 발현 억제능과 암세포 성장 억제력이 높은 상관관계를 가짐을 확인하였다. 즉, siRNA에 비해 15개의 확장 서열을 가지는 lsiRNA (21S+15d)는 더 강력한 암세포 성장 억제력을 보이는 것을 확인하였으며, asiRNA에 비해 lasiRNA (16S+15d)의 암세포 성장 억제력 또한 증가한 것을 확인하였다 (도 10). 한편 seed sequence 에 돌연변이를 도입한 lsiRNA의 경우 (LASmut) 암세포 성장 저해를 유도하지 못함을 확인함으로써 긴 확장서열 구조에 의한 비특이적 세포 독성이 나타나지 않음을 검증할 수 있었다. 이러한 결과는 siRNA 및 asiRNA의 안티센스 가닥 3'-말단에 표적 mRNA에 상보적인 단일 가닥 영역을 도입함으로써 유전자 억제력 및 그에 따른 세포 내 표현형 발현을 증가시킬 수 있음을 보여준다.
실시예 7: 확장서열이 RNA인 lsiRNA 및 lasiRNA에 의한 KRAS 유전자 발현 억제능 확인
다음으로 다음으로 lsiRNA 및 lasiRNA의 확장서열이 DNA가 아닌 RNA인 경우에도 각기 상응하는 siRNA 및 asiRNA에 비해 표적 유전자 발현 억제력이 증가하는지를 조사하였다.
도 11과 같이 10개의 mRNA 상보적 확장서열을 가지는 lsiRNA(21S+10r) 및 lasiRNA(16S+10r)를 제작하였으며 대조군으로 mRNA에 상보적이지 않은 확장서열을 가지는 구조(21S+10rc, 16S+10rc)도 함께 제작하였다. 이들을 AGS 세포에 transfection한 후 실시예 4와 같은 방법으로 KRAS mRNA 발현 억제 효율을 조사하였다.
그 결과 도 12에 나타난 바와 같이, RNA 확장서열을 가지는 경우에도 lsiRNA와 lasiRNA는 각기 상응하는 siRNA와 asiRNA에 비해 더 높은 표적 유전자 억제능을 보였으며 특히 RNA 확장서열을 가지는 lasiRNA는 DNA 확장서열을 가지는 lasiRNA에 비해 더 증가된 억제능을 보임을 확인하였다. 이는 long antisense 확장서열이 DNA 뿐 아니라 RNA인 경우에도 목표하는 유전자 발현 억제능을 달성할 수 있음을 보여주고 있다.
실시예 8: CTNNB1 유전자 발현을 저해하는 lasiRNA 제작 및 CTNNB1 유전자 발현 억제능 확인
8-1: CTNNB1 mRNA 발현 수준 측정
다음으로 본 발명에 따른 핵산 분자 구조가 다른 유전자를 목적유전자로 하는 asiRNA의 활성 증가를 유도할 수 있는지 확인하기 위해 beta-catenin (CTNNB1) 을 표적으로 하는 asiRNA에 대응하는 lasiRNA 구조를 제작하였다 (도 13). 그 다음, Hep3B 세포 (ATCC HB 8064)에 lipofectamine 2000으로 10 nM의 농도로 transfection한 후 real-time PCR로 목적 유전자의 발현 억제력을 조사하였다.
CTNNB1
forward sequence 5'-ATGTCCAGCGTTTGGCTGAA-3' (서열번호 32)
reverse sequence 5'-TGGTCCTCGTCATTTAGCAGTT-3' (서열번호 33)
그 결과, 도 14에 나타난 바와 같이, 기존 siRNA 구조에 비해 asiRNA의 경우 표적 유전자 발현 억제력이 감소하였으나, 15 nt의 mRNA 서열에 상보적인 DNA를 안티센스 3' 말단에 가지는 lasiRNA (16S+15d)의 경우, siRNA와 유사한 정도로 표적 유전자 억제력이 증가함을 확인하였다. 반면, 확장 DNA 서열이 목적 유전자와 상보적이지 않은 경우 (16S+15c)의 경우에는 asiRNA에 비해 목적 유전자 억제력의 감소가 크지 않았다. 따라서, lasiRNA 구조의 경우 asiRNA 서열과 무관하게 lasiRNA 구조의존적으로 표적 유전자 억제력을 증가시킴을 확인하였다.
8-2: Hep3B 암세포 성장 저해력 측정
이러한 lasiRNA 구조에 의한 표적 유전자 억제력 증가는 Hep3B 암세포 성장 저해력 측정을 통해 다시 검증되었다. 즉, 10 nM의 siRNA, asiRNA, lasiRNA 를 Hep3B 세포에 도입한 후 5일 후 세포 성장 정도를 세포 수 측정을 통해 조사하였다. 세포의 생존율은 현미경 관찰을 통해 직접 세포의 개수를 눈으로 측정하여 조사하였다. 간략하게는, 96 웰 플레이트에 시딩된 AGS 세포에 10 nM의 siRNA, asiRNA, lasiRNA를 트렌스펙션 시킨 다음 5일 후에 살아남은 세포의 수를 직접 눈으로 세어 측정하였다.
그 결과, 도 15에 나타난 바와 같이, siRNA에 비해 asiRNA의 암세포 사멸력은 다소 감소하였으나, 목적 유전자 상보적 확장서열을 가지는 lasiRNA의 경우 siRNA와 유사한 정도의 세포 사멸력을 보였으며, 반면 목적 유전자와 상보적이지 않은 확장서열을 가지는 lasiRNA는 세포 사멸력이 asiRNA에 비해 증가하지 않음을확인할수있었다. 이는 안티센스 가닥의 3' 말단에 목적 유전자와 상보적인 서열을 함유하는 확장서열을 가지는 siRNA분자는 목적 유전자 발현 억제력이 증가됨을 나타낸다.
실시예 9: 유전자 발현 억제 기작의 분석
본 발명에 따른 핵산 분자가 종래의 19+2 siRNA나 asiRNA와 동일한 RNAi 기작에 의하여 유전자 발현을 억제시키는지 확인하기 위하여 다음의 실험을 수행하였다. 즉, 목적 mRNA에 대한 절단 부위를 분석하기 위하여 5’RACE (Rapid amplification of cDNA ends) 분석을 수행하였다.
먼저, 실시예 4 및 5에서 제작한 siKRAS, asiKRAS, LaiKRAS, LasiKRAS를 PEI를 이용하여 HeLa 세포에 도입한 다음, 18시간 후에 Tri-reagent kit (Ambion)으로 전체 RNA를 추출하였다. 전체 RNA(3μg)은 전처리없이 0.25μg의 GeneRacer RNA oligo를 라이게이션(ligation)시킨 다음, GeneRacer RNA oligo-라이게이션된 전체 RNA를 GeneRacer oligo dT 및 SuperScriptTMШ RT kit (Invitrogen)을 이용하여 역전사시켰다. RNA 올리고 라이게이션된 mRNA는 유전자 특이적인 프라이머를 이용하여 증폭하였다. 그 다음 PCR 산물은 T＆A vector(RBC)로 클론한 다음, M13 forward primer로 시퀀싱하였다.
KRAS Gene specific Primer:
5'-CTGCATGCACCAAAAACCCCAAGACA-3' (서열번호 34)
KRAS Gene Specific Primer Nested:
5'-CACAAAGAAAGCCCTCCCCAGTCCTCA -3' (서열번호 35)
그 결과, 도 16에 나타난 바와 같이, siKRAS, asiKRAS를 처리한 경우와 LsiKRAS, LasiKRAS를 처리한 경우 모두 동일한 크기의 RACE product를 얻을 수 있었다. 또한 이들 RACE product를 T-vector (RBC)에 클로닝한 후 시퀀싱을 통해 염기서열 상 정확한 잘린 위치를 확인한 결과 siKRAS, asiKRAS, LsiKRAS, LasiKRAS 모두 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 10번째와 11번째 염기 사이에 해당하는 mRNA의 위치를 절단한 것을 확인하였다.
이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 핵산 분자 구조는 제1 가닥의 3'말단의 단일 가닥 영역에 포함되는 핵산올리고뉴클레오티드에 따라 제1가닥의 일부 영역과 상보적인 목적 유전자를 타겟팅함으로써 siRNA를 목적유전자로 유도하여 유전자 억제 효율을 증가시키거나, 또는 antisense DNA, antisense RNA, ribozyme, DNAzyme의 도입에 의해 siRNA와 함께 동일 목적유전자에 대한 결합력 향상 또는 synergistic cleavage가 일어나는 효과가 있어 목적 유전자 억제 효율을 증가시킬 수 있다. 아울러, 본 발명에 따른 핵산 분자를 사용함으로써 유전자 억제 효율의 지속기간을 연장시킬 수 있다. 이에 본 발명에 따른 RNAi를 유도하는 핵산 분자는 종래의 siRNA 분자들을 대체하여 siRNA를 이용한 암이나 바이러스 감염 치료 등에 활용될 수 있어 유용하다.
이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
전자파일 첨부하였음.

Claims (30)

  1. 목적 핵산(target nucleic acid)과 상보적인 일부 영역을 포함하는 24~121nt 길이의 제1가닥과, 상기 제1가닥의 목적 핵산과 상보적인 일부 영역과 상보적 결합을 형성하는 영역을 갖는 13~21nt 길이의 제2가닥으로 구성되는 RNAi를 유도하는 핵산 분자.
  2. 제1항에 있어서, 상기 제1가닥은 5' 말단에 1 내지 3nt의 돌출부를 가지는 것을 특징으로 하는 RNAi를 유도하는 핵산 분자.
  3. 제1항에 있어서, 상기 제2가닥은 3' 말단에 1 내지 3nt의 돌출부를 가지는 것을 특징으로 하는 RNAi를 유도하는 핵산 분자.
  4. 제1항에 있어서, 상기 제1가닥의 5' 방향의 말단이 블런트 말단(blunt end)인 것을 특징으로 하는 RNAi를 유도하는 핵산 분자.
  5. 제4항에 있어서, 상기 제1가닥과 결합하는 제2가닥의 길이는 13~16nt인 것을 특징으로 하는 RNAi를 유도하는 핵산 분자.
  6. 제1항에 있어서, 상기 제1가닥의 목적 핵산(target nucleic acid)과 상보적인 일부 영역의 길이는 19~21nt 인 것을 특징으로 하는 RNAi를 유도하는 핵산 분자.
  7. 제1항에 있어서, 상기 목적 핵산은 mRNA (messenger RNA), microRNA, piRNA (piwi-interacting RNA), 코딩 DNA 서열 및 비코딩 DNA 서열 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 RNAi를 유도하는 핵산 분자.
  8. 제1항에 있어서, 상기 제1가닥 중 제2가닥과 상보적 결합을 형성하지 않는 단일 가닥 영역은, 링커에 의하여 상기 제2가닥과 상보적 결합을 형성하는 영역에 연결되는 것을 특징으로 하는 RNAi를 유도하는 핵산 분자.
  9. 제8항에 있어서, 상기 링커는 화학적 링커(chemical linker)임을 특징으로 하는 RNAi를 유도하는 핵산 분자.
  10. 제9항에 있어서, 상기 화학적 링커는 핵산 (a nucleic acid moiety), PNA (a PNA moiety), 펩타이드 (a peptide moiety), 다이설퍼이드 결합 (a disulfide bond) 또는 폴리에틸렌 글리콜 (a polyethylene glycol moiety)인 것을 특징으로 하는 RNAi를 유도하는 핵산 분자.
  11. 제1항에 있어서, 상기 제1가닥은 단일 가닥 영역에 상기 목적 핵산과 상보적인 서열을 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 RNAi를 유도하는 핵산 분자.
  12. 제1항에 있어서, 상기 제1가닥은 단일 가닥 영역에 안티센스 DNA, 안티센스 RNA, 라이보자임 및 DNAzyme으로 구성된 군에서 선택되는 핵산올리고뉴클레오티드를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 RNAi를 유도하는 핵산 분자.
  13. 제1항에 있어서, 화학적 변형을 포함하는 것을 특징으로 하는 RNAi를 유도하는 핵산 분자.
  14. 제13항에 있어서, 상기 화학적 변형은 상기 핵산 분자에 포함되는 적어도 1종의 뉴클레오티드의 리보스의 2' 위치의 히드록실기가 수소원자, 불소원자, -O-알킬기, -O-아실기 및 아미노기 중 어느 하나로 치환된 것임을 특징으로 하는 RNAi를 유도하는 핵산 분자.
  15. 제13항에 있어서, 상기 화학적 변형은 상기 핵산 분자에 포함되는 적어도 1종의 뉴클레오티드의 포스페이트 백본이 phosphorothioate form, phosphorodithioate form, alkylphosphonate form, phosphoroamidate form 및 boranophosphate form 중 어느 하나로 치환된 것임을 특징으로 하는 RNAi를 유도하는 핵산 분자.
  16. 제13항에 있어서, 상기 화학적 변형은 상기 핵산 분자에 포함되는 적어도 1종의 뉴클레오티드가 LNA (locked nucleic acid), UNA(unlocked nucleic acid), Morpholino 및 PNA (peptide nucleic acid) 중 어느 하나로 치환된 것임을 특징으로 하는 RNAi를 유도하는 핵산 분자.
  17. 제13항에 있어서, 상기 화학적 변형은 상기 핵산 분자가 지질, 세포투과성 펩타이드(cell penetrating peptide) 및 세포 표적 리간드로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상과 결합된 것을 특징으로 하는 RNAi를 유도하는 핵산 분자.
  18. 제1항에 있어서, 상기 제1가닥에서 단일 가닥 영역을 구성하는 염기 중 적어도 하나 이상이 거대한(bulky) 염기 유사체(base analog)를 포함하는 것을 특징으로 하는 RNAi를 유도하는 핵산 분자.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 RNAi를 유도하는 핵산 분자에 세포전달체가 결합되어 있는 핵산 복합체.
  20. 제19항에 있어서, 상기 세포전달체는 양이온성 폴리머, 지질, 세포투과성 펩타이드(cell penetrating peptide) 및 세포 표적 리간드로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 핵산 복합체.
  21. 제19항의 핵산 복합체를 세포 내로 도입시키는 것을 특징으로 하는 RNAi를 유도하는 핵산 분자의 세포 내 전달방법.
  22. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 RNAi를 유도하는 핵산 분자를 함유하는 유전자 발현 억제용 조성물.
  23. 제22항에 있어서, 상기 핵산 분자에 세포전달체를 추가로 결합시킨 것을 특징으로 하는 유전자 발현 억제용 조성물.
  24. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 RNAi를 유도하는 핵산 분자를 세포 내 도입시키는 단계를 포함하는 세포 내 목적 유전자의 발현 억제 방법.
  25. 제24항에 있어서, 상기 핵산 분자에 세포전달체를 추가로 결합시킨 것을 특징으로 하는 세포 내 목적 유전자의 발현 억제 방법.
  26. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 RNAi를 유도하는 핵산 분자를 세포 내에서 발현시키는 단계를 포함하는 세포 내 목적 유전자의 발현 억제 방법.
  27. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 구조를 가지는 RNAi를 유도하는 핵산 분자를 함유하는 항암 조성물.
  28. 제27항에 있어서, 상기 핵산 분자에 세포전달체를 추가로 결합시킨 것을 특징으로 하는 항암 조성물.
  29. 제27항에 있어서, 상기 핵산 분자는 종양 관련 유전자를 목적유전자로 하는 것을 특징으로 하는 항암 조성물.
  30. 제29항에 있어서, 상기 종양 관련 유전자는 KRAS, Wnt-1, Hec1, Survivin, Livin, Bcl-2, XIAP, Mdm2, EGF, EGFR, VEGF, VEGFR, Mcl-1, IGF1R, Akt1, Grp78, STAT3, STAT5a, β-catenin, WISP1 및 c-myc 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 항암 조성물.
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