KR20210068093A - 핵산 전달을 위한 지질화 양이온성 펩타이드 화합물을 포함하는 지질 나노입자 제형 - Google Patents

핵산 전달을 위한 지질화 양이온성 펩타이드 화합물을 포함하는 지질 나노입자 제형 Download PDF

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콜린 제임스 맥킨레이
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Abstract

본 개시내용은 핵산 전달을 위해 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물 또는 리피토이드와 같은 지질화 양이온성 펩타이드 화합물을 포함하는 지질 혼합물에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 개시내용은 지질화 양이온성 펩타이드 화합물 및 구조적 지질, 인지질 및 차폐 지질을 포함하는 다른 지질 성분을 포함하는 지질 나노입자 제형에 관한 것이다. 본 개시내용은 또한 지질 혼합물을 제조하고 사용하는 방법에 관한 것이다.

Description

핵산 전달을 위한 지질화 양이온성 펩타이드 화합물을 포함하는 지질 나노입자 제형
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2018년 9월 28일자로 출원된 미국 가출원 제62/738,717호 및 2019년 8월 9일자로 출원된 미국 가출원 제62/885,036호의 우선권을 우선권을 주장하며, 이들 각각의 개시내용은 그 전문이 참조에 의해 본 명세서에 원용된다.
기술 분야
본 개시내용은 일반적으로 지질화 양이온성 펩타이드 화합물 및 기타 지질 성분과 다중음이온성 화합물의 복합체를 포함하는 다성분 지질 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 개시내용은 다성분 지질 제형에 관한 것이되, 지질화 양이온성 펩타이드 화합물은 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물 및/또는 리피토이드(lipitoid)를 포함한다. 본 개시내용은 또한 본 명세서에 기재된 다성분 지질 조성물을 제조하는 방법 및 핵산을 세포에 전달하기 위해 지질 조성물을 사용하는 방법에 관한 것이다.
유전자 요법은 의학 분야에 혁명을 일으킬 것으로 기대되는 유망한 기법으로 남아 있다. 그러나, 현재의 관행에서, 재현 가능하고 효율적인 방식으로 핵산 물질을 환자의 세포에 전달하는 능력은 생존력에 대한 주요 장애물이었으므로, 유전자 치료제의 광범위한 채택도 이루어졌다. 이러한 중요한 요구 사항은 예를 들어, 바이러스 벡터의 사용을 포함하는 다양한 접근법에 의해 또는 핵산 물질과의 전하 복합체화를 위한 단일(독립형) 화합물 전달 비히클 또는 다성분 리포솜 제형을 활용하는 비-바이러스 방법을 통해 다양한 성공으로 달성되었다. 바이러스 벡터는 전형적으로 비-바이러스 조성물보다 핵산 물질의 세포로의 더욱 효율적이고 선택적인 전달을 보여주지만, 보다 쉬운 대규모 생산 및 감소된 숙주 면역원성을 위해 비-바이러스 접근법이 바람직하다.
따라서, 전달 효율이 개선된 비-바이러스 전달 비히클 및 제형을 개발하려는 노력이 진행되고 있다. 그러나, 위에서 상세히 설명된 두 가지 비-바이러스 접근법에 대한 긍정적인 전망에도 불구하고, 목적하는 적용을 위해 비-바이러스 조성물의 더 넓은 유연성을 가능하게 하거나 또는 최소한 기존의 전달 비히클의 최적화에서 더 큰 단순성을 가능하게 하는 측면에서 개선의 여지가 여전히 많이 남아 있다.
실시 가능한 치료적 적용을 위해 유전 물질을 세포에 삽입하는 것은 각 상황에 대해 전달될 핵산의 유형에 따라 크게 달라질 것이기 때문에, 다양한 유형의 핵산 물질의 다양한 표적으로의 전달을 지원하고, 임의의 주어진 유전자 카고(cargo) 및/또는 세포 표적에 대해 더 쉽게 최적화될 수 있는 유연성을 가진 새로운 전달 비히클 및/또는 제형에 대한 필요성이 여전히 남아 있다.
본 개시내용은 개선된 효율을 갖는 핵산의 전달을 위한 지질화 양이온성 펩타이드 화합물을 포함하는 다성분 지질 조성물을 제공한다.
일 양태에서, 본 개시내용은 다음의 복합체를 포함하는 조성물을 제공한다:
하나 이상의 다중음이온성 화합물; 및
지질 성분, 여기서 지질 성분은 다음을 포함한다:
(i) 선택적으로 하나 이상의 구조적 지질;
(ii) 하나 이상의 인지질;
(iii) 하나 이상의 차폐 지질(shielding lipid); 그리고
(iv) 하나 이상의 지질화 양이온성 펩타이드 화합물, 여기서 하나 이상의 지질화 양이온성 펩타이드 화합물은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다:
(a) 화학식 (I)의 하나 이상의 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물 또는 이의 염:
Figure pct00001
식 중:
m은 0 내지 10의 정수이고;
n은 0 내지 5의 정수이며;
s는 0 내지 5의 정수이고;
t는 0 내지 10의 정수이되;
m, n, s 및 t 중 적어도 하나는 0이 아니고;
r은 1 내지 20의 정수이며;
각각의 o는 독립적으로 0, 1 또는 2의 정수이고;
각각의 q는 독립적으로 0, 1 또는 2의 정수이며;
각각의 p는 독립적으로 1 또는 2의 정수이고;
R1은 -H, 알킬, 알킬아릴, -COR1a 또는 지질 모이어티이되,
R1a는 -H, -OH, 알킬, 아릴, 알킬아릴, -O-알킬 또는 -O-알킬아릴이고;
각각의 R2는 독립적으로 화학식 -CH2CH2O(CH2CH2O)uCH3의 에틸렌 글리콜 모이어티이되, 각각의 u는 독립적으로 2 내지 200의 정수이고;
각각의 R3은 독립적으로 지질 모이어티이며;
각각의 R4는 독립적으로 중성 스페이서 모이어티 또는 지질 모이어티이고;
각각의 R5는 독립적으로 양이온성 모이어티이며;
각각의 R6은 독립적으로 화학식 -CH2CH2O(CH2CH2O)vCH3의 에틸렌 글리콜 모이어티이되, 각각의 v는 독립적으로 2 내지 200의 정수이고;
R7은 -H, 알킬, 아실, -OH, -OR7a, -NH2, -NHR7a 또는 지질 모이어티이되, R7a는 알킬, 아실 또는 지질 모이어티이며; 그리고
각각의 Ra 및 Rb는 독립적으로 -H, C1-C4-알킬 또는 자연 발생적 또는 비-자연 발생적 아미노산에서 발견되는 측쇄 모이어티이고;
(b) 화학식 (II)의 하나 이상의 리피토이드:
Figure pct00002
식 중:
x는 1 내지 100의 정수이고;
각각의 R9는 독립적으로 지질 모이어티이며; 그리고
각각의 R10은 독립적으로 양이온성 또는 중성 스페이서 모이어티이고;
그리고
(c) 이들의 임의의 조합.
이 양태의 일부 실시형태에서, 조성물은 지질 성분의 총 중량의 40% 내지 80% w/w의 하나 이상의 지질화 양이온성 펩타이드 화합물을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 조성물은 지질 성분의 총 중량의 40% 내지 70% w/w의 하나 이상의 지질화 양이온성 펩타이드 화합물을 포함한다.
선행하는 실시형태 중 하나 이상과 조합될 수 있는 소정의 실시형태에서, 하나 이상의 지질화 양이온성 펩타이드 화합물은 화학식 (I)의 하나 이상의 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물 또는 이의 염이다. 선행하는 실시형태 중 하나 이상과 조합될 수 있는 소정의 실시형태에서, n 또는 s 중 적어도 하나는 0이 아니다. 임의의 이전의 실시형태와 조합될 수 있는 또 다른 실시형태에서, 하나 이상의 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물은 N-지질화 아미노산 잔기의 블록을 포함하되, n 및 s 중 적어도 하나는 적어도 2, 적어도 3 또는 적어도 4, 선택적으로 2, 3 또는 4이다. 임의의 다른 전술한 실시형태와 조합될 수 있는 전술한 실시형태의 다른 실시형태에서, 각각의 R3은 독립적으로 C4-C22-알킬 또는 C4-C22-알켄일이되, C4-C22-알켄일은 선택적으로 단일- 또는 다중-불포화된다. 다른 실시형태에서, 각각의 R3은 독립적으로 C8-C12 알킬이다. 여전히 또 다른 실시형태에서, 각각의 R3은 독립적으로 2-에틸헥스-1-일, 카프로일, 올레일, 스테아릴, 리놀레일, 미리스틸 및 라우릴로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 양태의 일부 실시형태에서, 하나 이상의 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물 중 적어도 하나는 양이온성 모이어티 R5를 갖는 적어도 2개의 양이온성 아미노산 잔기를 포함하는 양이온성 도메인을 포함한다. 임의의 이전의 실시형태 중 하나 이상과 조합될 수 있는 다른 실시형태에서, 각각의 R5는 독립적으로 아미노알킬, 알킬아미노알킬, 아미노알킬아미노알킬, 구아니디노알킬, N-헤테로사이클릴알킬 또는 N-헤테로아릴이다. 임의의 전술한 실시형태와 조합될 수 있는 소정의 다른 실시형태에서, 각각의 R5는 독립적으로
Figure pct00003
,
Figure pct00004
,
Figure pct00005
,
Figure pct00006
,
Figure pct00007
및
Figure pct00008
이다. 또 다른 실시형태에서, 각각의 R5는
Figure pct00009
이다.
본 발명의 양태의 또 다른 실시형태에서, 각각의 중성 스페이서 모이어티 R4는 독립적으로 사이클로알킬, 헤테로사이클릴알킬, 알킬아릴, 아릴알킬, 알킬헤테로아릴, 헤테로아릴알킬, 알콕시, 알콕시알킬 또는 하이드록시알킬로 치환된 C1-C4-알킬이되, 각각의 사이클로알킬, 헤테로사이클릴알킬, 알킬아릴, 아릴알킬, 알킬헤테로아릴, 헤테로아릴알킬, 알콕시, 알콕시알킬 또는 하이드록시알킬은 선택적으로 하나 이상의 치환기 -OH, 할로 또는 알콕시로 치환된다. 임의의 선행하는 실시형태 중 하나 이상과 조합될 수 있는 일부 실시형태에서, 각각의 중성 스페이서 모이어티 R4는
Figure pct00010
,
Figure pct00011
,
Figure pct00012
,
Figure pct00013
및
Figure pct00014
로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다. 소정의 실시형태에서, 각각의 중성 스페이서 모이어티 R4는
Figure pct00015
이다.
임의의 이전의 실시형태 중 하나 이상과 조합될 수 있는 다른 추가의 실시형태에서, 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물은 R5 양이온성 모이어티를 갖는 적어도 2개의 아미노산 잔기를 포함하는 양이온성 도메인을 포함하되, 양이온성 도메인 내의 적어도 2개의 양이온성 아미노산 잔기 각각은 중성 스페이서 또는 지질 모이어티 R4를 갖는 적어도 하나의 아미노산 잔기에 의해 분리된다. 임의의 전술한 실시형태 중 하나 이상과 조합될 수 있는 본 발명의 양태의 일부 실시형태에서, 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물은 적어도 하나의 삼량체 서브유닛 -R양이온-R중성-R중성을 포함하되, R양이온은 양이온성 모이어티 R5를 포함하는 아미노산 잔기이고, 각각의 R중성은 중성 스페이서 모이어티 R4를 포함하는 아미노산 잔기이다. 임의의 전술한 실시형태의 소정의 실시형태에서, 각각의 양이온성 모이어티 R5는
Figure pct00016
이고, 각각의 중성 스페이서 모이어티 R4는
Figure pct00017
이다.
이전의 실시형태 중 임의의 하나 이상과 조합될 수 있는 이 양태의 일부 실시형태에서, m이 0 내지 3의 정수인 경우, 각각의 u는 독립적으로 20 내지 200, 선택적으로 30 내지 50의 정수이고; m이 4 내지 10의 정수인 경우, 각각의 u는 독립적으로 2 내지 10의 정수이다. 이전의 실시형태 중 임의의 하나 이상과 조합될 수 있는 이 양태의 다른 실시형태에서, t가 0 내지 3의 정수인 경우, 각각의 v는 독립적으로 30 내지 50의 정수이고; t가 4 내지 10의 정수인 경우, 각각의 v는 독립적으로 2 내지 10의 정수이다. 이 양태의 여전히 또 다른 실시형태에서, m은 1이고, u는 40 내지 45의 정수이거나 t는 1이고, v는 40 내지 45의 정수이다.
이전의 실시형태 중 임의의 하나 이상과 조합될 수 있는 이 양태의 다른 실시형태에서, Ra 및 Rb는 독립적으로 -H 및 -CH3으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 이전의 실시형태 중 임의의 하나 이상과 조합될 수 있는 이 양태의 소정의 다른 실시형태에서, Ra 및 Rb는 -H이다.
본 발명의 양태의 다른 실시형태에서, 하나 이상의 지질화 양이온성 펩타이드 화합물은 화학식 (II)의 하나 이상의 리피토이드이다. 소정의 실시형태에서, 화학식 (II)의 하나 이상의 리피토이드 리피토이드 1이다.
이전의 실시형태 중 임의의 하나 이상과 조합될 수 있는 이 양태의 또 다른 실시형태에서, 조성물은 지질 성분의 총 중량의 0% 내지 40% w/w의 하나 이상의 구조적 지질을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 조성물은 지질 성분의 총 중량의 0% 내지 25% w/w의 하나 이상의 구조적 지질을 포함한다. 여전히 추가의 실시형태에서, 하나 이상의 구조적 지질은 콜레스테롤, 페코스테롤, 시토스테롤, 에르고스테롤, 캄페스테롤, 스티그마스테롤, 브라시카스테롤, 토마티딘, 우르솔산, 알파-토코페롤 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된다. 소정의 실시형태에서, 하나 이상의 구조적 지질은 콜레스테롤이다.
선행하는 실시형태 중 임의의 하나 이상과 조합될 수 있는 본 발명의 일부 실시형태에서, 조성물은 지질 성분의 총 중량의 10% 내지 60% w/w의 하나 이상의 인지질을 포함한다. 다른 실시형태에서, 조성물은 지질 성분의 총 중량의 20% 내지 40% w/w의 하나 이상의 인지질을 포함한다. 임의의 선행하는 실시형태와 조합될 수 있는 일부 실시형태에서, 하나 이상의 인지질은 1,2-다이리놀레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DLPC), 1,2-다이미리스토일-sn-글리세로-포스포콜린(DMPC), 1,2-다이올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC), 1,2-다이팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DPPC), 1,2-다이스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC), 1,2-다이운데카노일-sn-글리세로-포스포콜린(DUPC), 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(POPC), 1,2-다이-O-옥타데센일-sn-글리세로-3-포스포콜린(18:0 다이에터 PC), 1-올레오일-2-콜레스테릴헤미석시노일-sn-글리세로-3-포스포콜린(OChemsPC), 1-헥사데실-sn-글리세로-3-포스포콜린(C 16 Lyso PC), 1,2-다이리놀레노일-sn-글리세로-3-포스포콜린, 1,2-다이아라키도노일-sn-글리세로-3-포스포콜린, 1,2-다이도코사헥사에노일-sn-글리세로-3-포스포콜린, 1,2-다이올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE),1,2-다이팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DPPE), 1,2-다이피타노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(ME 16.0 PE), 1,2-다이스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민, 1,2-다이리놀레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민, 1,2-다이리놀레노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민, 1,2-다이아라키도노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민, 1,2-다이도코사헥사에노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민, 1,2-다이올레오일-sn-글리세로-3-포스포-rac-(1-글리세롤) 소듐염(DOPG), 스핑고마이엘린 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된다. 소정의 실시형태에서, 하나 이상의 인지질은 1,2-다이올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE)이다.
선행하는 실시형태 중 임의의 하나 이상과 조합될 수 있는 여전히 추가의 실시형태에서, 조성물은 지질 성분의 총 중량의 1% 내지 5% w/w의 하나 이상의 차폐 지질을 포함한다. 선행하는 실시형태의 일부 실시형태에서, 하나 이상의 차폐 지질은 PEG-변형된 포스파티딜에탄올아민, PEG-변형된 포스파티드산, PEG-변형된 세라마이드, PEG-변형된 다이알킬아민, PEG-변형된 다이아실글리세롤, PEG-변형된 다이알킬글리세롤 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 PEG 지질이다. 소정의 실시형태에서, 하나 이상의 차폐 지질은 1,2-다이미리스토일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌 글리콜-2000(DMG-PEG2000)이다.
이 양태의 여전히 또 다른 실시형태에서, 하나 이상의 차폐 지질은 화학식 (I)의 하나 이상의 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물 또는 이의 염을 포함한다:
Figure pct00018
식 중:
m은 0 내지 10의 정수이고;
n은 0 내지 5의 정수이며;
s는 0 내지 5의 정수이고;
t는 0 내지 10의 정수이되;
m 및 t 중 적어도 하나는 0이 아니고;
r은 1 내지 20의 정수이며;
각각의 o는 독립적으로 0, 1 또는 2의 정수이고;
각각의 q는 독립적으로 0, 1 또는 2의 정수이며;
각각의 p는 독립적으로 1 또는 2의 정수이고;
R1은 -H, 알킬, 알킬아릴, -COR1a 또는 지질 모이어티이되,
R1a는 -H, -OH, 알킬, 아릴, 알킬아릴, -O-알킬 또는 -O-알킬아릴이고;
각각의 R2는 독립적으로 화학식 -CH2CH2O(CH2CH2O)uCH3의 에틸렌 글리콜 모이어티이되, 각각의 u는 독립적으로 2 내지 200의 정수이며;
각각의 R3은 독립적으로 지질 모이어티이고;
각각의 R4는 독립적으로 중성 스페이서 모이어티 또는 지질 모이어티이며;
각각의 R5는 독립적으로 양이온성 모이어티이고;
각각의 R6은 독립적으로 화학식 -CH2CH2O(CH2CH2O)vCH3의 에틸렌 글리콜 모이어티이되, 각각의 v는 독립적으로 2 내지 200의 정수이며;
R7은 -H, 알킬, 아실, -OH, -OR7a, -NH2, -NHR7a 또는 지질 모이어티이되, R7a는 알킬, 아실 또는 지질 모이어티이고; 그리고
각각의 Ra 및 Rb는 독립적으로 -H, C1-C4-알킬 또는 자연 발생적 또는 비-자연 발생적 아미노산에서 발견되는 측쇄 모이어티이다.
하나 이상의 차폐 지질이 하나 이상의 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물을 포함하는 본 발명의 양태의 또 다른 실시형태에서, m이 0 내지 3의 정수인 경우, 각각의 u는 독립적으로 20 내지 200, 선택적으로 30 내지 50의 정수이고; m이 4 내지 10의 정수인 경우, 각각의 u는 독립적으로 2 내지 10의 정수이다. 하나 이상의 차폐 지질이 하나 이상의 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물을 포함하는 임의의 이전의 실시형태 중 하나 이상과 조합될 수 있는 여전히 또 다른 실시형태에서, 조성물은 하나 이상의 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물을 포함하되, t가 0 내지 3의 정수인 경우, 각각의 v는 독립적으로 30 내지 50의 정수이고; t가 4 내지 10의 정수인 경우, 각각의 v는 독립적으로 2 내지 10의 정수이다. 임의의 선행하는 실시형태와 조합될 수 있는 소정의 실시형태에서, m은 1이고, u는 40 내지 45의 정수이거나; 또는 t는 1이고, v는 40 내지 45의 정수이다.
여전히 본 발명의 양태의 다른 실시형태에서, 지질 성분은 지질 성분의 총 중량 기준으로 다음을 포함한다:
40% 내지 70% w/w의 하나 이상의 지질화 양이온성 펩타이드 화합물;
0% 내지 25% w/w의 콜레스테롤;
20% 내지 40% w/w의 1,2-다이올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE); 및
1% 내지 5% w/w의 1,2-다이미리스토일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌 글리콜-2000(DMG-PEG2000).
선행하는 실시형태 중 임의의 하나 이상과 조합될 수 있는 소정의 실시형태에서, 콜레스테롤 대 DOPE의 질량비는 0.5:1 내지 1:1이다.
임의의 선행하는 실시형태 중 하나 이상과 조합될 수 있는 본 발명의 양태의 또 다른 실시형태에서, 하나 이상의 다중음이온성 화합물은 핵산이다. 임의의 이전의 실시형태 중 하나 이상과 조합될 수 있는 본 발명의 일부 실시형태에서, 하나 이상의 다중음이온성 화합물은 핵산을 포함하되, 핵산은 폴리펩타이드를 암호화하는 mRNA이다. 임의의 선행하는 실시형태 중 하나 이상과 조합될 수 있는 본 발명의 양태의 소정의 실시형태에서, 하나 이상의 다중음이온성 화합물은 핵산을 포함하되, 핵산은 단백질을 암호화하는 mRNA이다. 임의의 선행하는 실시형태 중 하나 이상과 조합될 수 있는 본 발명의 양태의 여전히 또 다른 실시형태에서, 지질 성분 대 하나 이상의 다중음이온성 화합물의 질량비는 2:1 내지 25:1이다. 소정의 실시형태에서, 지질 성분 대 하나 이상의 다중음이온성 화합물의 질량비는 5:1 내지 10:1이다.
선행하는 실시형태 중 어느 하나와 조합될 수 있는 일부 실시형태에서, 조성물은 하나 이상의 소분자 활성제 또는 약물 물질을 더 포함한다.
본 개시내용의 또 다른 양태에서, 세포를 임의의 및 모든 다양한 실시형태에서 선행하는 양태의 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 다중음이온성 화합물을 세포에 전달하는 것이 본 명세서에 제공된다. 이 양태의 소정의 실시형태에서, 접촉은 엔도사이토시스(endocysis)에 의한 것이다. 선행하는 양태와 조합될 수 있는 이 양태의 다른 실시형태에서, 세포는 생체내 또는 시험관내에서 접촉될 수 있다. 선행하는 실시형태 중 하나 또는 둘 다와 조합될 수 있는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함하는 이 양태의 소정의 실시형태에서, 세포는 조성물과 접촉된 후 폴리펩타이드를 발현한다. 선행하는 실시형태 중 하나 이상과 조합될 수 있는 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 여전히 추가의 실시형태에서, 세포는 조성물과 접촉된 후 단백질을 발현한다.
본 개시내용의 추가적인 양태는 하나 이상의 지질화 양이온성 펩타이드 화합물, 하나 이상의 인지질, 하나 이상의 차폐 지질 및 선택적으로 하나 이상의 다중음이온성 화합물을 갖는 하나 이상의 구조적 지질을 배합함으로써, 조성물 및 임의의 및 모든 다양한 실시형태와 관련된 선행하는 양태의 조성물을 제조하는 방법을 제공한다. 이 양태의 실시형태에서, 조성물은 하나 이상의 지질화 양이온성 펩타이드 화합물, 하나 이상의 인지질, 하나 이상의 차폐 지질 및 선택적으로 하나 이상의 구조적 지질을 포함하는 용액을 하나 이상의 다중음이온성 화합물을 포함하는 용액과 접촉시킴으로써 형성된다.
도 1은 예시적인 2차 아민 광지질화 양이온성 펩타이드인 "리피토이드 1"을 보여준다.
도 2a 내지 도 2f는 일반적인 3차 아미노 지질화 양이온성 펩토이드(tertiary amino lipidated cationic peptoid)를 보여준다. 도 2a는 3차 아미노 지질화 펩토이드의 일반적인 구조를 보여준다. 도 2b는 예시적인 3차 아미노 지질화 양이온성 펩토이드를 보여준다. 도 2c는 예시적인 지질 단량체를 보여준다. 도 2d는 예시적인 양이온성 단량체를 보여준다. 도 2e는 예시적인 스페이서 단량체 및 폴리에틸렌 글리콜 단량체를 보여준다. 도 2f는 예시적인 3차 아미노 지질화 양이온성 펩토이드 화합물 8을 보여준다.
도 3a 내지 도 3e는 고체상에서 아미노산 잔기의 연속적인 첨가를 통해 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물을 제조하는 예시적인 과정을 보여준다. 도 3a는 수지-결합된 2차 아민의 아실화제인 브로모아세트산에 대한 일반적인 아실화 반응을 보여준다. 도 3b는 상응하는 N-치환된 아미노산 잔기를 생성하기 위한 친핵성 치환반응(nucleophilic displacement)을 통한 생성된 아실화 생성물과 적합한 아민의 반응을 보여준다. 도 3c 및 도 3d는 목적하는 수지-결합된 양이온성 펩타이드 화합물을 생산하기 위한 아실화 및 친핵성 치환반응의 연속적인 반복을 보여준다. 도 3e는 유리 펩타이드를 제공하기 위한 고체 수지 지지체로부터의 양이온성 펩타이드 화합물의 절단을 보여준다.
도 4는 2:1, 3.5:1, 5:1 및 7.5:1의 펩토이드:mRNA 질량비로 파이어플라이 루시퍼레이스(firefly luciferase: Fluc) mRNA와 개별적으로 복합체화된 3차 아미노 지질화 펩토이드 화합물 1 내지 18로 시험관내 처리된 HeLa 세포에 대해 측정된 평균 생물발광(RLU) 결과의 그래프를 도시한다.
도 5는 리피토이드 1 또는 다양한 본 개시내용의 아미노 지질화 펩토이드 화합물 중 하나를 함유하는 다성분 지질 제형으로 시험관내 처리된 HeLa 세포에서 관찰된 평균 생물발광(RLU)의 그래프를 보여준다. 리피토이드 1 또는 선택된 아미노 지질화 펩토이드 화합물은 3가지의 질량비(50:16:32:2, 63:0:35:2 및 42:23:33:2)로 콜레스테롤, 1,2-다이올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE) 및 2-다이미리스토일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌 글리콜-2000(DMG-PEG2000)과 배합되었고, 테스트 제형을 제공하기 위해 7:1 또는 10:1의 펩토이드:mRNA 질량비로 파이어플라이 루시퍼레이스(Fluc) mRNA와 더 혼합되었다.
도 6a 내지 도 6b는 41:23:33:3의 펩토이드:콜레스테롤:DOPE:DMG-PEG2000 질량비 및 10:1의 펩토이드:mRNA 질량비로 콜레스테롤, DOPE 및 DMG-PEG2000를 갖는 아미노 지질화 펩토이드의 다성분 지질 제형으로 처리된 HeLa 세포에서 Fluc mRNA의 시험관내 발현을 보여준다. 도 6a 및 도 6b는 제형 1 내지 36(도 6a) 및 37 내지 72(도 6b)로 처리된 HeLa 세포에서 관찰된 평균 생물발광을 보여준다.
도 7a 내지 도 7b는 41:23:33:3의 펩토이드:콜레스테롤:DOPE:DMG-PEG2000 질량비 및 10:1의 펩토이드:mRNA 질량비로 콜레스테롤, DOPE 및 DMG-PEG2000를 갖는 아미노 지질화 펩토이드의 다성분 지질 제형의 피하 투여로 처리된 Balb/c 마우스에서 Fluc mRNA의 생체내 발현을 보여준다. 도 7a 및 도 7b는 제형 1 내지 36(도 7a) 및 37 내지 72(도 7b)로 투여한 후 6시간에 관찰된 평균 생물발광을 보여준다.
도 8a 내지 도 8b는 콜레스테롤, DOPE 및 DMG-PEG2000을 갖는 리피토이드 1의 다성분 지질 제형을 사용하여 Fluc mRNA의 전달에 대해 시험관내 및 생체내에서 측정된 생물발광을 도시한다. 도 8a는 Fluc mRNA와 복합체화된 96개의 상이한 다성분 지질 제형을 사용하여 HeLa 세포의 시험관내 형질감염 조사에 대해 관찰된 생물발광 신호(RLU)의 플롯을 보여준다. 도 8b는 Fluc mRNA 단독 또는 리피토이드 1, 리피토이드 제형 A 및 리피토이드 제형 B와 함께 상업적으로 입수 가능한 지질 나노입자 키트로 제형화된 Fluc mRNA로 처리된 HeLa 세포에서 기록된 시험관내 생물발광 세기(RLU)의 막대 그래프를 도시한다.
다음 설명은 예시적인 방법, 매개변수 등을 제시한다. 그러나, 이러한 설명은 본 개시내용의 범위를 제한하는 것으로 의도된 것이 아니라 예시적인 실시형태의 설명으로서 제공된다는 것을 이해하여야 한다.
본 개시내용은 핵산의 전달을 위해 구조적 지질, 인지질 및 차폐 지질과 같은 추가의 지질 성분과 조합된 지질화 양이온성 펩타이드 화합물의 복합체를 포함하는 다성분 지질 조성물을 제공한다. 다성분 지질 조성물 및 그 안의 복합체는 리피토이드로도 알려진 양이온성 펩타이드-인지질 접합체(conjugate) 또는 양이온성 펩타이드 화합물로서 지질 모이어티 및/또는 (올리고- 및/또는 폴리)에틸렌 글리콜 모이어티(본 명세서에서 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물로도 지칭됨)로 N-치환된 N-치환된 양이온성 펩타이드 화합물을 포함할 수 있다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, 리피토이드 및/또는 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물을 포함하는 다성분 지질 조성물은 다른 상업적으로 입수 가능한 지질 나노입자 제형(즉, 키트로부터) 또는 독립형 작용제(예를 들어, 리피토이드 1 단독)에 대해 관찰된 효율을 초과하는 핵산 물질의 세포로의 매우 효율적인 전달을 나타낸다. 흥미롭게도, 본 개시내용의 지질 조성물이 구조적 지질의 포함 없이도 여전히 핵산의 성공적인 전달을 달성한다는 것이 추가로 관찰되었다.
본 명세서에서 사용되는 "알켄일"은 적어도 하나의 올레핀성 불포화 부위(즉, 화학식 C=C의 적어도 하나의 모이어티를 가짐)를 가지며 지정된 탄소 원자의 수(즉, C2-C10은 2 내지 10개의 탄소 원자를 의미함)를 갖는 불포화된 선형 또는 분지형의 1가 탄화수소 사슬 또는 이의 조합을 지칭한다. 알켄일기는 "시스" 또는 "트랜스" 구조 또는 대안적으로 "E" 또는 "Z" 구조일 수 있다. 특정 알켄일기는 2 내지 20개의 탄소 원자를 갖는 것("C2-C20 알켄일"), 2 내지 8개의 탄소 원자를 갖는 것("C2-C8 알켄일"), 2 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 것("C2-C6 알켄일") 또는 2 내지 4개의 탄소 원자를 갖는 것("C2-C4 알켄일)이다. 알켄일의 예는 에텐일(또는 바이닐, 프로프-1-엔일, 프로프-2-엔일(또는 알릴), 2-메틸프로프-1-엔일, 뷰트-1-엔일, 뷰트-2-엔일, 뷰트-3-엔일, 뷰타-1,3-다이엔일, 2-메틸뷰타-1,3-다이엔일과 같은 기, 이들의 동족체 및 이성질체 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
용어 "알킬"은 지정된 탄소 원자의 수(즉, C1-C10은 1 내지 10개의 탄소를 의미함)를 갖는 포화된 선형 및 분지형 1가 탄화수소 구조 및 이의 조합을 지칭하고 포함한다. 특정 알킬기는 1 내지 20개의 탄소 원자를 갖는 것("C1-C20 알킬")이다. 더 구체적인 알킬기는 1 내지 8개의 탄소 원자를 갖는 것("C1-C8 알킬"), 3 내지 8개의 탄소 원자를 갖는 것("C3-C8 알킬"), 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 것("C1-C6 알킬"), 1 내지 5개의 탄소 원자를 갖는 것("C1-C5 알킬") 또는 1 내지 4개의 탄소 원자를 갖는 것("C1-C4 알킬")이다. 알킬의 예는 메틸, 에틸, n-프로필, 아이소프로필, n-뷰틸, t-뷰틸, 아이소뷰틸, sec-뷰틸과 같은 기, 이의 동족체 및 이성질체, 예를 들어, n-펜틸, n-헥실, n-헵틸, n-옥틸 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 "알킬렌"은 알킬과 동일한 잔기를 지칭하지만, 2가를 갖는다. 특정 알킬렌기는 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 것("C1-C6 알킬렌"), 1 내지 5개의 탄소 원자를 갖는 것("C1-C5 알킬렌"), 1 내지 4개의 탄소 원자를 갖는 것("C1-C4 알킬렌") 또는 1 내지 3개의 탄소 원자를 갖는 것("C1-C3 알킬렌")이다. 알킬렌의 예는 메틸렌(-CH2-), 에틸렌(-CH2CH2-), 프로필렌(-CH2CH2CH2-), 뷰틸렌(-CH2CH2CH2CH2-) 등과 같은 기를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 "알킨일"은 적어도 하나의 아세틸렌성 불포화 부위(즉, 화학식 C≡C의 적어도 하나의 모이어티를 가짐) 및 지정된 탄소 원자의 수(즉, C2-C10은 2 내지 10개의 탄소 원자를 의미함)를 갖는 불포화된 선형 또는 분지형 1가 탄화수소 사슬 또는 이의 조합을 지칭한다. 특정 알킨일기는 2 내지 20개의 탄소 원자를 갖는 것("C2-C20 알킨일"), 2 내지 8개의 탄소 원자를 갖는 것("C2-C8 알킨일"), 2 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 것("C2-C6 알킨일") 또는 2 내지 4 탄소 원자를 갖는 것("C2-C4 알킨일")이다. 알킨일의 예는 에틴일(또는 아세틸렌일), 프로프-1-인일, 프로프-2-인일(또는 프로파길), 뷰트-1-인일, 뷰트-2-인일, 뷰트-3-인일과 같은 기, 이들의 동족체 및 이성질체 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
용어 "아릴"은 다중불포화 방향족 탄화수소기를 지칭하고 포함한다. 아릴은 추가적으로 융합 아릴, 헤테로아릴, 사이클로알킬 및/또는 헤테로사이클릴 고리를 포함하여 추가적인 융합 고리(예를 들어, 1 내지 3개의 고리)를 포함할 수 있다. 일 변형에서, 아릴기는 6 내지 14개의 고리모양(annular) 탄소 원자를 포함한다. 아릴기의 예는 페닐, 나프틸, 바이페닐 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
"카보닐"은 C=O 기를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 "복합체"는 이온 상호작용, 수소 결합, 반 데르 발스 상호작용, 금속-리간드 배위, 기타 화학적 힘 및 전술한 것들 중 하나 이상의 조합에 의해 매개될 수 있는 2개 이상의 분자 사이의 임의의 화학적 결합을 포함한다. 복합체는 예를 들어, 폴리플렉스, 코아세르베이트 복합체, 나노복합체, 나노입자 및 마이크로입자를 포함하는 고차 구조를 형성할 수 있다.
용어 "사이클로알킬"은 지정된 탄소 원자의 수(예를 들어, C1-C10은 1 내지 10개의 탄소를 의미함)를 갖는, 완전 포화, 단일- 또는 다중불포화될 수 있지만 비-방향족인 고리형 1가 탄화수소 구조를 지칭하고 포함한다. 사이클로알킬은 사이클로헥실과 같은 하나의 고리 또는 아다만틸과 같은 다중 고리로 구성될 수 있지만, 아릴기는 제외한다. 하나 초과의 고리를 포함하는 사이클로알킬은 융합, 스피로 또는 브리지 또는 이들의 조합일 수 있다. 바람직한 사이클로알킬은 3 내지 13개의 고리모양 탄소 원자를 갖는 고리형 탄화수소이다. 더욱 바람직한 사이클로알킬은 3 내지 8개의 고리모양 탄소 원자를 갖는 고리형 탄화수소("C3-C8 사이클로알킬")이다. 사이클로알킬의 예는 사이클로프로필, 사이클로뷰틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 1-사이클로헥센일, 3-사이클로헥센일, 사이클로헵틸, 노본일 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
"할로" 또는 "할로겐"은 원자 번호 9 내지 85를 갖는 17족 계열의 원소를 지칭한다. 바람직한 할로기는 플루오로, 클로로, 브로모 및 아이오도를 포함한다. 잔기가 하나 초과의 할로겐으로 치환된 경우, 부착된 할로겐 모이어티의 수에 해당하는 접두사를 사용하여 지칭될 수 있으며, 예를 들어, 다이할로아릴, 다이할로알킬, 트라이할로아릴 등은 동일한 할로일 수 있지만 반드시 그럴 필요는 없는 2개("다이") 또는 3개("트라이")의 할로기로 치환된 아릴 및 알킬을 지칭하므로; 4-클로로-3-플루오로페닐은 다이할로아릴의 범위 내에 있다. 각 수소가 할로기로 대체된 알킬기는 "퍼할로알킬"로 지칭된다. 바람직한 퍼할로알킬기는 트라이플루오로알킬이다. 유사하게는, "퍼할로알콕시"는 알콕시기의 알킬 모이어티를 구성하는 탄화수소에서 할로겐이 각각의 H를 대신하는 알콕시기를 지칭한다. 퍼할로알콕시기의 예는 트라이플루오로메톡시(-OCF3)이다.
용어 "헤테로아릴"은 질소, 산소 및 황과 같은 헤테로원자를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 1 내지 10개의 고리모양 탄소 원자 및 적어도 하나의 고리모양 헤테로원자를 갖는 불포화 방향족 고리형기를 지칭하고 포함하되, 질소 및 황 원자는 선택적으로 산화되고, 질소 원자(들)는 선택적으로 4차화된다. 헤테로아릴기는 고리모양 탄소 또는 고리모양 헤테로원자에서 분자의 나머지 부분에 부착될 수 있다. 헤테로아릴은 추가적으로 융합 아릴, 헤테로아릴, 사이클로알킬 및/또는 헤테로사이클릴 고리를 포함하는 추가적인 융합 고리(예를 들어, 1 내지 3개의 고리)를 포함할 수 있다. 헤테로아릴기의 예는 피리딜, 피리미딜, 티오페닐, 퓨란일, 티아졸일 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
용어 "헤테로사이클" 또는 "헤테로사이클릴"은 1 내지 10개의 고리모양 탄소 원자 및 1 내지 4개의 고리모양 헤테로원자, 예컨대 질소, 황 또는 산소 등을 갖는 포화 또는 불포화 비-방향족기를 지칭하되, 질소 및 황 원자는 선택적으로 산화되고, 질소 원자(들)는 선택적으로 4차화된다. 헤테로사이클릴기는 단일 고리 또는 다중 축합 고리를 가질 수 있지만, 헤테로아릴기는 제외한다. 하나 초과의 고리를 포함하는 헤테로사이클은 융합, 스피로 또는 브리지 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 융합 고리계에서, 융합 고리 중 하나 이상은 아릴 또는 헤테로아릴일 수 있다. 헤테로사이클릴기의 예는 테트라하이드로피란일, 다이하이드로피란일, 피페리딘일, 피페라진일, 피롤리딘일, 티아졸린일, 티아졸리딘일, 테트라하이드로퓨란일, 테트라하이드로티오페닐, 2,3-다이하이드로벤조[b]티오펜-2-일, 4-아미노-2-옥소피리미딘-1(2H)-일 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
"옥소"는 모이어티 =O를 지칭한다.
"티오카보닐"은 C=S 기를 지칭한다.
달리 명시되지 않는 한 "선택적으로 치환된"은 기가 치환기가 동일하거나 상이할 수 있는 기에 대해 나열된 치환기 중 하나 이상(예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개)에 의해 비치환 또는 치환될 수 있음을 의미한다. 일 실시형태에서, 선택적으로 치환된 기는 1개의 치환기를 갖는다. 다른 실시형태에서, 선택적으로 치환된 기는 2개의 치환기를 갖는다. 다른 실시형태에서, 선택적으로 치환된 기는 3개의 치환기를 갖는다. 다른 실시형태에서, 선택적으로 치환된 기는 4개의 치환기를 갖는다. 일부 실시형태에서, 선택적으로 치환된 기는 1 내지 2개, 2 내지 5개, 3 내지 5개, 2 내지 3개, 2 내지 4개, 3 내지 4개, 1 내지 3개, 1 내지 4개 또는 1 내지 5개의 치환기를 갖는다.
용어 "치환된"은 모이어티의 하나 이상의 수소 원자를 1가 또는 2가의 라디칼로 대체하는 것을 지칭한다. "선택적으로 치환된"은 모이어티가 치환 또는 비치환될 수 있음을 나타낸다. 적합한 치환기는 예를 들어, 하이드록실, 나이트로, 아미노(예를 들어, -NH2 또는 다이알킬 아미노), 이미노, 사이아노, 할로(예컨대, F, Cl, Br, I), 할로알킬(예컨대, -CCl3 또는 -CF3), 티오, 설폰일, 티오아미도, 아미디노, 이미디노, 옥소, 옥사미디노, 메톡사미디노, 이미디노, 구아니디노, 설폰아미도, 카복실, 폼일, 알킬, 알콕시, 알콕시-알킬, 알킬카보닐, 알킬카보닐옥시(-OCOR), 아미노카보닐, 아릴카보닐, 아르알킬카보닐, 카보닐아미노, 헤테로아릴카보닐, 헤테로아르알킬-카보닐, 알킬티오, 아미노알킬, 사이아노알킬, 카바모일(-NHCOOR- 또는 -OCONHR-), 우레아(-NHCONHR-), 아릴 등(여기서, R은 임의의 적합한 기, 예를 들어, 알킬 또는 알킬렌임)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 선택적으로 치환된 모이어티는 기재된 바와 같이 선택 라디칼로만 선택적으로 치환된다. 일부 실시형태에서, 위의 기(예를 들어, 알킬기)는 예를 들어, 알킬(예를 들어, 메틸 또는 에틸), 할로알킬(예를 들어, -CCl3, -CH2CHCl2 또는 -CF3), 사이클로알킬(예를 들어, -C3H5, -C4H7, -C5H9), 아미노(예를 들어, -NH2 또는 다이알킬 아미노), 알콕시(예를 들어, 메톡시), 헤테로사이클로알킬(예를 들어, 모폴린, 피페라진, 피페리딘, 아제티딘), 하이드록실 및/또는 헤테로아릴(예를 들어, 옥사졸일)로 선택적으로 치환된다. 일부 실시형태에서, 치환기기는 그 자체가 선택적으로 치환된다. 일부 실시형태에서, 치환기는 그자체가 치환되지 않는다. 치환기에 치환된 기는 예를 들어, 카복실, 할로, 나이트로, 아미노, 사이아노, 하이드록실, 알킬, 알켄일, 알킨일, 알콕시, 아미노카보닐, -SR, 티오아미도, -SO3H, -SO2R 또는 사이클로알킬(여기서, R은 임의의 적합한 기, 예를 들어, 수소 또는 알킬임)일 수 있다.
일 양태에서, 본 개시내용은 복합체를 포함하는 조성물을 제공하되, 복합체는 하나 이상의 다중음이온성 화합물 및 3개 이상의 지질 성분을 포함한다. 전술한 일부 실시형태에서, 복합체는 하나 이상의 다중음이온성 화합물, 하나 이상의 지질화 양이온성 펩타이드 화합물 및 2개 이상의 다른 지질 성분을 포함한다.
하나 이상의 다중음이온성 화합물 및/또는 비-음이온성 화합물을 갖는 하나 이상의 지질화 양이온성 펩타이드 화합물을 포함하는 조성물 및 복합체가 2개 이상의 지질 성분(예컨대, 본 명세서에 기재된 인지질, 구조적 지질 및/또는 차폐 지질)을 더 포함하는 일부 실시형태에서, 조성물은 지질 제형으로 기재될 수 있다. 조성물이 2개 이상의 지질 성분을 포함하는 소정의 실시형태에서, 지질 조성물은 다성분 지질 제형으로 기재될 수 있다. 복합체가 지질화 양이온성 펩타이드 화합물, 다중음이온성 화합물, 인지질, 구조적 지질 및 차폐 지질을 포함하는 소정의 실시형태에서, 조성물은 지질 나노입자를 포함한다. 조성물이 지질 나노입자 복합체를 포함하는 또 다른 실시형태에서, 조성물은 지질 나노입자(LNP) 조성물로 특징지어질 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 조성물은 하나 이상의 다중음이온성 화합물 및 지질 성분의 복합체를 포함하되, 지질 성분은 선택적으로 하나 이상의 구조적 지질; 하나 이상의 인지질, 하나 이상의 차폐 지질 및 하나 이상의 지질화 양이온성 펩타이드 화합물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 조성물은 하나 이상의 다중음이온성 화합물 및 지질 성분의 복합체를 포함하되, 지질 성분은 하나 이상의 인지질, 하나 이상의 차폐 지질 및 하나 이상의 지질화 양이온성 펩타이드 화합물을 포함한다. 다른 실시형태에서, 조성물은 하나 이상의 다중음이온성 화합물 및 지질 성분의 복합체를 포함하되, 지질 성분은 하나 이상의 구조적 지질; 하나 이상의 인지질, 하나 이상의 차폐 지질 및 하나 이상의 지질화 양이온성 펩타이드 화합물을 포함한다.
지질화 양이온성 펩타이드 화합물
본 개시내용의 조성물은 복합체를 포함하되, 복합체는 하나 이상의 다중음이온성 화합물 및 지질 성분을 포함하고, 지질 성분은 선택적으로 하나 이상의 구조적 지질; 하나 이상의 인지질; 하나 이상의 차폐 지질; 및 하나 이상의 지질화 양이온성 펩타이드 화합물을 포함한다.
이들의 양전하로 인해, 복합체 및 조성물 내의 지질화 양이온성 펩타이드 화합물은 다중음이온성 카고 상의 음전하를 상쇄(counterbalance)하는 복합체를 형성할 수 있으므로, 카고의 표적 세포로의 흡수를 촉진한다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 지질화 양이온성 펩타이드 화합물은 순 영전하(net zero charge) 또는 순 양전하(net positive charge)를 갖는다. 복합체 또는 조성물이 하나 이상의 양이온성 화합물을 포함하는 일부 실시형태에서, 하나 이상의 양이온성 화합물은 독립적으로 순 영전하 또는 순 양전하를 갖는다. 소정의 실시형태에서, 하나 이상의 지질화 양이온성 펩타이드 화합물은 독립적으로 적어도 +1의 순 양전하를 갖는다. 하나 이상의 양이온성 화합물에 존재하는 순 전하는 환경적 조건에 따라 달라질 수 있음을 인식하여야 한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 하나 이상의 양이온성 화합물은 독립적으로 생리학적으로 관련된 pH 범위에서 안정한 순 양전하를 갖는다. 예를 들어, 생리학적 pH는 적어도 약 5.5, 전형적으로 적어도 약 6.0이다. 보다 전형적으로, 생리학적 pH는 적어도 약 6.5이다. 통상적으로, 생리학적 pH는 약 8.5 미만, 전형적으로 약 8.0 미만이다. 보다 전형적으로, 생리학적 pH는 약 7.5 미만이다.
본 명세서에서 제공되는 바와 같은 조성물에서 이용되는 지질화 양이온성 펩타이드 화합물은 리피토이드로도 알려진 양이온성 펩토이드-인지질 접합체 작제물 또는 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물로 본 명세서에서 지칭되는 펩타이드 골격 전체에 걸친 지질 모이어티 및/또는(올리고- 및/또는 폴리)에틸렌 글리콜 모이어티를 포함하는 N-치환된 양이온성 펩타이드 화합물을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 조성물은 하나 이상의 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물을 포함하는 복합체를 포함한다. 다른 실시형태에서, 조성물은 하나 이상의 리피토이드를 포함하는 복합체를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 조성물은 하나 이상의 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물, 하나 이상의 리피토이드 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 복합체를 포함한다.
3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 복합체 및 조성물은 하나 이상의 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물을 포함한다. 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물은 N-치환된 아미노산 잔기를 포함하는 펩타이드 사슬이다. 본 개시내용의 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물은 N-치환된 아미노산 잔기를 포함하는 펩타이드 사슬이다. 본 개시내용의 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물은 올리고펩타이드 골격을 포함하되, 올리고펩타이드 골격은 N-치환된 중성("스페이서") 및/또는 지질 아미노산 잔기가 선택적으로 개재된(interleaved) N-치환된 양이온성 아미노산 잔기의 반복 서브유닛을 포함한다. 올리고펩타이드 골격은 지질 모이어티로 N-치환("N-지질화")되고/되거나 올리고에틸렌 글리콜 및/또는 폴리에틸렌 글리콜로 N-치환("N-페길화")된 아미노산 잔기에 의해 N-말단 및/또는 C-말단에서 추가로 캐핑된다.
일부 실시형태에서, 화학식 (I)의 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물 또는 이의 염이 본 명세서에 제공된다:
Figure pct00019
일부 실시형태에서, 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물은 펩타이드 화합물에 존재하는 아미노산 잔기의 총 수를 특징으로 할 수 있되, 각각의 아미노산 잔기는 일반 구조 -(NR-CRaRb-C(O))-로 표시된다. 일부 실시형태에서, 아미노산 잔기의 총 수는 2 내지 40개의 아미노산 잔기, 2 내지 30개의 아미노산 잔기, 3 내지 25개의 아미노산 잔기, 5 내지 20개의 아미노산 잔기 또는 7 내지 15개의 아미노산 잔기이다. 소정의 실시형태에서, 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물은 5 내지 20개의 아미노산 잔기를 포함한다. 소정의 실시형태에서, 아미노산 잔기의 총 수는 m, n, s, t 및 [r×(o + p + q)]의 합이다.
다른 실시형태에서, 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물은 순 영전하 또는 순 양전하를 갖는다. 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물이 3차 아미노 지질화 양이온성 펩타이드 화합물인 소정의 실시형태에서, 3차 아미노 지질화 양이온성 펩타이드 화합물은 적어도 +1의 순 양전하를 갖는다. 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물이 3차 아미노 페길화 양이온성 펩타이드 화합물 또는 3차 아미노 지질화 및 페길화 양이온성 펩타이드 화합물인 다른 실시형태에서, 양이온성 펩타이드 화합물은 순 영전하(즉, 전하 중성임) 또는 순 양전하를 갖는다. 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물이 3차 아미노 페길화 양이온성 펩타이드 화합물 또는 3차 아미노 지질화 및 페길화 양이온성 펩타이드 화합물인 일부 실시형태에서, 양이온성 펩타이드 화합물은 +1의 순 양전하를 갖는다. 소정의 실시형태에서, 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물은 (r×p)+의 순 양전하를 갖는다.
소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 양이온성 펩타이드 화합물의 아미노산 잔기는 자연 발생적 아미노산 또는 비-자연 발생적 아미노산의 N-치환된 변이체이되, 탄소 측쇄는 Ra 및 Rb로 표시된다. 아미노산 잔기는 D- 또는 L-구조로 존재할 수 있다. 또한, 아미노산 잔기의 N-위치의 치환은 아마이드 결합의 자유 회전을 제한할 수 있음을 인식하여야 한다. 따라서, 본 개시내용의 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물은 또한 다양한 회전 이성질체 형태(로타머)로 존재할 수 있다.
일부 실시형태에서, 각각의 Ra 및 각각의 Rb는 독립적으로 자연- 또는 비-자연 발생적 아미노산에서 발견되는 측쇄 모이어티이다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "자연 발생적 아미노산"은 Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Ser, Thr, Cys, Met, Asp, Glu, Asn, Gln, Lys, Arg, Phe, Tyr, His 또는 Trp를 지칭한다. 용어 "비-자연 발생적 아미노산"은 예를 들어, 자연 발생적 아미노산의 D-이성질체, 2-아미노아디프산, 2-아미노뷰티르산, 노르발린, 노르류신 및 오르니틴을 포함하는, 자연에서 전형적으로 발견되지 않는 아미노산을 지칭한다. 소정의 실시형태에서, 각각의 Ra 및 Rb는 독립적으로 -H, -CH3 또는
Figure pct00020
,
Figure pct00021
,
Figure pct00022
,
Figure pct00023
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Figure pct00024
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Figure pct00025
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Figure pct00026
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,
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,
Figure pct00029
,
Figure pct00030
,
Figure pct00031
,
Figure pct00032
,
Figure pct00033
,
Figure pct00034
,
Figure pct00035
또는
Figure pct00036
이다.
다른 실시형태에서, 각각의 Ra 및 각각의 Rb는 독립적으로 -H 또는 C1-C4-알킬이다. 소정의 실시형태에서, 각각의 Ra 및 각각의 Rb는 독립적으로 -H 또는 CH3이다. 다른 실시형태에서, Ra 및 Rb는 -H이다. Ra 및 Rb가 -H인 실시형태에서, 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물은 또한 N-지질화 및/또는 페길화 폴리글리신 화합물 또는 N-지질화 및/또는 페길화 펩토이드 화합물로 지칭될 수 있다. 소정의 실시형태에서, 각각의 Ra 및 각각의 Rb는 독립적으로 -H, C1-C4-알킬 또는 자연 발생적 또는 비-자연 발생적 아미노산에서 발견되는 측쇄 모이어티이다.
올리고펩타이드 골격 또는 반복 서브유닛 및 구조적 모티프
본 명세서에 기재된 바와 같이, 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물은 핵산과 같은 다중음이온성 화합물과의 복합체화 및 이러한 다중음이온성 화합물의 세포로의 전달에 유용할 수 있다. 본 개시내용의 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물은 아래 화학식 (I)의 단편에 나타낸 바와 같이 N-치환된 중성 스페이서 아미노산 잔기 및/또는 N-지질화 아미노산 잔기가 선택적으로 개재된 N-치환된 양이온성 아미노산 잔기의 반복 서브유닛의 올리고펩타이드 골격을 포함한다:
Figure pct00037
올리고펩타이드 골격의 반복 서브유닛 내의 양이온성 아미노산 잔기는 본 개시내용의 화합물에 양전하를 부여하며, 이는 핵산과 같은 다중음이온성 종의 양호한 정전기적 상호작용 및 전하 중화(charge neutralization)를 가능하게 한다. 양이온성 잔기 사이에 있는 중성 또는 지질화 아미노산 잔기의 개재는 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물 전체에 걸쳐 양전하의 공간 분포를 더 잘 제어할 수 있게 하며, 이는 양이온성 펩타이드 화합물을 특정 길이, 전하 분포 및/또는 형태를 갖는 다중음이온성 종으로 개선된 복합체화를 가능하게 한다.
올리고펩타이드 골격에서, r은 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물에서의 양이온성 및 중성 및/또는 지질화 아미노산 잔기의 반복 서브유닛의 수를 나타낸다. 일부 실시형태에서, r은 1 내지 25의 정수이다. 소정의 실시형태에서, r은 1 내지 20의 정수이다. 다른 실시형태에서, r은 1 내지 15의 정수이다. 일부 실시형태에서, r은 1 내지 5의 정수이다. 소정의 실시형태에서, r은 2 내지 4의 정수이다.
각각의 서브유닛 r은 전체 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물 내의 다른 서브유닛과 엄격하게 동일하거나 또는 동일하지 않을 수 있음을 인식하여야 한다. 예를 들어, 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물 내에서, 각각의 서브유닛 r은 양이온성 아미노산 잔기 및 선택적으로 또한 다른 서브유닛에 존재하는 양이온성 및 중성 및/또는 지질화 아미노산 잔기와 관련하여 독립적으로 선택되는 중성 및/또는 지질화 아미노산 잔기를 포함할 수 있다.
양이온성 모이어티
본 개시내용의 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물의 각각의 반복 서브유닛은 적어도 하나의 양이온성 아미노산 잔기를 포함한다. 양이온성 아미노산 잔기는 본 명세서에 기재된 펩타이드 화합물이 핵산 또는 다중음이온성 화합물 상의 음전하와 상호작용함으로써 핵산 또는 다른 다중음이온성 화합물과 정전기적 복합체를 형성할 수 있게 하는 양전하를 제공한다. 핵산의 복합체화는 핵산의 음전하를 부분적으로 또는 완전히 차단하고, 세포의 지질막을 통해 세포 내부로의 수송을 촉진한다.
각각의 서브유닛 r 내에서, p는 그 서브유닛에 존재하는 양이온성 아미노산 잔기의 수를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 각각의 p는 독립적으로 1 또는 2의 정수이다. 소정의 실시형태에서, p는 1이다.
각각의 양이온성 아미노산 잔기는 N-위치에 양이온성 모이어티 R5를 포함한다. 각각의 양이온성 모이어티 R5는 양이온성 펩타이드 화합물의 반복 서브유닛 내에서뿐만 아니라 올리고펩타이드 골격 전체에서 독립적으로 선택될 수 있음을 인식하여야 한다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 양이온성 모이어티는 생리학적으로 관련된 pH 범위에서 안정한 순 양전하를 갖는 치환기일 수 있다. 예를 들어, 생리학적 pH는 적어도 약 5.5, 전형적으로 적어도 약 6.0이다. 보다 전형적으로, 생리학적 pH는 적어도 약 6.5이다. 통상적으로, 생리학적 pH는 약 8.5 미만이고, 전형적으로 약 8.0 미만이다. 보다 전형적으로, 생리학적 pH는 약 7.5 미만이다. 양이온성 모이어티는 생리학적 pH에서 양전하를 생성하기에 충분한 모이어티에 존재하는 작용기에 대한 역치 pKa 값을 특징으로 할 수 있다. 소정의 실시형태에서, 양이온성 모이어티는 적어도 7.5의 pKa 값을 갖는다. 다른 실시형태에서, 양이온성 모이어티는 생리학적 pH와 보다 산성인 pH, 예를 들어 pH 4.5 내지 5.5 사이의 pKa를 갖는다. 추가적인 실시형태에서, 다중 독립적인 pKa 값을 갖는 치환기가 사용된다.
본 명세서에 기재된 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물은 서로 매우 근접한 올리고펩타이드 골격을 따라 다중 양이온성 모이어티를 포함할 수 있음을 인식하여야 한다. 다중 양이온성 모이어티가 올리고펩타이드 골격을 따라 존재할 경우, 소정의 양이온성 모이어티의 양자화 또는 탈양자화된 상태는 근접한 다른 양이온성 모이어티의 pKa 값에 영향을 미칠 수 있다. 이러한 메커니즘에 의해, 본 명세서에 기재된 양이온성 펩타이드 화합물에서 특정 양이온성 모이어티의 pKa는 단리된 상태에서 측정된 그 pKa 값과 관련하여 변경될 수 있다. 예를 들어, 약 8의 pKa를 갖는 올리고펩타이드 골격에서 하나의 아민의 양자화는 인근 양이온성 모이어티의 pKa 값을 약 7.5의 정상 값에서 pKa 약 5 내지 6으로 낮출 수 있다.
본 개시내용의 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물이 서로 다양한 근접성에서 다중 양이온성 모이어티를 수용할 수 있는 능력은 이러한 양이온성 펩타이드 화합물 및 이의 임의의 복합체가 생리학적 pH에서 변이에 대해 높은 민감도로 반응할 수 있게 한다. 생리학적 pH의 변화에 대한 이들 화합물 및 이의 복합체의 민감도는 엔도솜 수송(엔도솜 구획 pH 약 4.5 내지 5.5) 후 세포기질로 핵산의 전달 및 방출을 촉진하는데 중요할 수 있다.
양이온성 또는 양으로 하전된 모이어티는 예를 들어, 다음의 작용기를 함유하는 것들과 같은 질소-기반 치환기를 포함할 수 있다: 아미노, 구아니디노, 하이드라지도 및 아미디노. 이러한 작용기는 방향족, 포화된 고리형 또는 지방족일 수 있다. 일부 실시형태에서, 각각의 R5는 독립적으로 아미노알킬, 알킬아미노알킬, 아미노알킬아미노알킬, 구아니디노알킬, N-헤테로사이클릴알킬 또는 N-헤테로아릴이다. 다른 실시형태에서, 각각의 R5는 독립적으로
Figure pct00038
,
Figure pct00039
,
Figure pct00040
,
Figure pct00041
,
Figure pct00042
,
Figure pct00043
,
Figure pct00044
,
Figure pct00045
,
Figure pct00046
,
Figure pct00047
,
Figure pct00048
,
Figure pct00049
,
Figure pct00050
,
Figure pct00051
,
Figure pct00052
,
Figure pct00053
,
Figure pct00054
,
Figure pct00055
,
Figure pct00056
또는
Figure pct00057
이다.
소정의 실시형태에서, 각각의 R5는 다음으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다:
Figure pct00058
,
Figure pct00059
,
Figure pct00060
,
Figure pct00061
,
Figure pct00062
및
Figure pct00063
. 또 다른 실시형태에서, 각각의 R5는
Figure pct00064
이다.
양이온성 잔기가 전체 펩타이드 화합물의 말단 잔기인 또 다른 추가의 실시형태에서, 합성 또는 탈보호 조건에 적합하지 않거나(예컨대, 산-불안정성(acid-labile) 링커) 또는 적합한 보호기 전략을 사용할 수 없는(예를 들어, 폴리아민) 추가적인 양이온성 모이어티 R5가 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 말단 양이온성 잔기의 양이온성 모이어티 R5는 폴리아민이다. 말단 잔기의 R5가 폴리아민인 일부 실시형태에서, 폴리아민은
Figure pct00065
,
Figure pct00066
,
Figure pct00067
,
Figure pct00068
,
Figure pct00069
,
Figure pct00070
,
Figure pct00071
,
Figure pct00072
,
Figure pct00073
또는
Figure pct00074
이다. 소정의 실시형태에서, 폴리아민은
Figure pct00075
,
Figure pct00076
,
Figure pct00077
및
Figure pct00078
로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다른 실시형태에서, 말단 양이온성 잔기의 양이온성 모이어티 R5는 하이드록시알킬, 하이드록시에터, 알콕시알킬 또는 하이드록실헤테로알킬이다. 소정의 실시형태에서, 말단 양이온성 잔기의 양이온성 모이어티 R5는
Figure pct00079
,
Figure pct00080
,
Figure pct00081
,
Figure pct00082
,
Figure pct00083
,
Figure pct00084
,
Figure pct00085
또는
Figure pct00086
이다.
여전히 추가의 실시형태에서, 말단 양이온성 잔기의 양이온성 모이어티 R5는
Figure pct00087
이다.
펩타이드 사슬에서 비치환된 질소 원자, 즉 R5가 수소인 것은 또한 생리학적 조건하에서 이온화 가능한 양이온성 모이어티로 작용할 수도 있음을 추가로 인식하여야 한다. 일부 실시형태에서, 양이온성 모이어티 R5는 수소 원자이다.
중성 스페이서 모이어티
3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물의 올리고펩타이드 골격 내에서, 양이온성 아미노산 잔기에는 N-위치에 중성 스페이서 모이어티를 갖는 중성 스페이서 아미노산 잔기가 선택적으로 개재될 수 있다. 중성 아미노산 잔기는 양이온성 펩타이드 화합물과 복합체화될 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 다중음이온성 화합물과의 향상된 정전기적 상호작용을 위해 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물에서 양전하의 공간 분포를 조절하는데 유용할 수 있다.
3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물의 각각의 반복 서브유닛에서, 중성 아미노산 잔기는 양이온성 아미노산 잔기의 N-말단 또는 C-말단에 하나 이상의 R4기로서 존재할 수 있다. 서브유닛 r이 중성 스페이서 모이어티 R4를 포함하는 일부 실시형태에서, 존재하는 각각의 중성 스페이서 모이어티에 대한 상응하는 o 및/또는 q는 서브유닛 r 내에서 양이온성 아미노산 잔기(들)의 N-말단 및 C-말단에 결합된 중성 스페이서 잔기의 각각의 수를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 각각의 o는 독립적으로 0, 1 또는 2의 정수이다. 다른 실시형태에서, 각각의 q는 독립적으로 0, 1 또는 2의 정수이다.
각각의 중성 스페이서 아미노산 잔기는 N-위치에 중성 스페이서 모이어티 R4를 포함한다. 본 명세서에 기재된 양이온성 모이어티와 마찬가지로, 각각의 중성 스페이서 모이어티 R4는 양이온성 펩타이드 화합물의 반복 서브유닛 내에서뿐만 아니라 올리고펩타이드 골격의 반복 서브유닛 r 중에서 독립적으로 선택됨을 인식하여야 한다.
중성 스페이서 모이어티는 생리학적으로 관련된 pH 범위에서 중성이거나 또는 0의 순 전하를 갖는 임의의 치환기를 포함할 수 있음을 인식하여야 한다. 일부 실시형태에서, 각각의 중성 모이어티 R4는 독립적으로 사이클로알킬, 헤테로사이클릴알킬, 알킬아릴, 아릴알킬, 알킬헤테로아릴, 헤테로아릴알킬, 알콕시, 알콕시알킬 또는 하이드록시알킬로 치환된 C1-C4-알킬이되, 각각의 사이클로알킬, 헤테로사이클릴알킬, 알킬아릴, 아릴알킬, 알킬헤테로아릴, 헤테로아릴알킬, 알콕시, 알콕시알킬 또는 하이드록시알킬은 하나 이상의 치환기 -OH, 할로 또는 알콕시로 선택적으로 치환된다. 여전히 일부 실시형태에서, 각각의 중성 스페이서 모이어티 R4는
Figure pct00088
,
Figure pct00089
,
Figure pct00090
,
Figure pct00091
및
Figure pct00092
로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다. 소정의 실시형태에서, 각각의 중성 스페이서 모이어티 R4는
Figure pct00093
이다.
지질 모이어티
3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물의 올리고펩타이드 골격 내에서 양이온성 아미노산 잔기를 갖는 중성 아미노산 잔기의 선택적 개재에 더하여, N-위치에 지질 모이어티를 갖는 N-지질화 아미노산 잔기에는 또한 양이온성(및 선택적인 중성 스페이서) 아미노산 잔기가 선택적으로 개재될 수 있다. 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물이 N-지질화 아미노산 잔기를 포함하는 일부 실시형태에서, 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물은 N-지질화된다. 중성 아미노산 잔기와 유사하게, 올리고펩타이드 골격 내에서 N-지질화 아미노산 잔기는 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물에서 양전하의 공간 분포를 조절할 뿐만 아니라 개선된 다중음이온성 물질의 캡슐화 및 세포내 전달을 위해 친유성을 증가시키는데 유용할 수 있다. 펩토이드 골격을 따라 지질에 간격을 두는 것(spacing)은 또한 세포 흡수 및 엔도솜 방출에 영향을 미치는 것으로 알려진 지질 지질 유동성/결정성에 영향을 미칠 수 있다.
중성 스페이서 잔기와 마찬가지로, 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물의 각각의 반복 서브유닛에서, N-지질화 아미노산 잔기는 하나 이상의 R4기로서 양이온성 아미노산 잔기의 N-말단 또는 C-말단 또는 양 말단에 존재할 수 있다. 서브유닛 r이 지질 모이어티 R4를 포함하는 일부 실시형태에서, 존재하는 각각의 지질 모이어티에 대해 상응하는 o 및/또는 q는 또한 서브유닛 r 내에서 양이온성 아미노산 잔기(들)의 N-말단 및 C-말단에 결합된 지질화 잔기의 각각의 수를 나타낼 수 있다. 일부 실시형태에서, 각각의 o는 독립적으로 0, 1 또는 2의 정수이다. 다른 실시형태에서, 각각의 q는 독립적으로 0, 1 또는 2의 정수이다.
각각의 N-지질화 아미노산 잔기는 N-위치에 지질 모이어티 R4를 포함한다. 본 명세서에 기재된 양이온성 및 중성 모이어티와 마찬가지로, 각각의 지질 모이어티 R4는 양이온성 펩타이드 화합물의 반복 서브유닛 내에서뿐만 아니라 올리고펩타이드 골격의 반복 서브유닛 r 중에서 독립적으로 선택됨을 인식하여야 한다.
적합한 지질 모이어티는 예를 들어, 선택적으로 치환된 분지쇄 또는 직쇄 지방족 모이어티 또는 지방산, 스테롤 및 아이소프레노이드를 포함하는 천연 지질 화합물로부터 유래되는 선택적으로 치환된 모이어티를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 지질 모이어티는 약 6 내지 약 50개의 탄소 원자 또는 약 10 내지 약 50개의 탄소 원자를 갖고, 선택적으로 하나 이상의 헤테로원자를 포함하며, 선택적으로 하나 이상의 이중 또는 삼중 결합(즉, 포화 또는 단일- 또는 다중-불포화)을 포함하는 분지쇄 또는 직쇄 지방족 모이어티를 포함할 수 있다. 소정의 실시형태에서, 지질 모이어티는 선택적으로 치환된 지방족, 직쇄 사슬 또는 분지형 모이어티를 포함할 수 있으며, 각각의 소수성 꼬리는 독립적으로 약 8 내지 약 30개의 탄소 원자 또는 약 6 내지 약 30개의 탄소 원자를 갖는다. 소정의 실시형태에서, 지질 모이어티는 예를 들어, 지방산 및 지방 알코올로부터 유래되는 지방족 탄소 사슬을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 각각의 지질 모이어티 R4는 독립적으로 C8-C24-알킬 또는 C8-C24-알켄일이되, C8-C24-알켄일은 선택적으로 단일- 또는 다중-불포화된다. 일부 실시형태에서, 각각의 지질 모이어티 R4는 C6-C18 알킬 또는 C6-C18 알켄일이다. 소정의 실시형태에서, 각각의 지질 모이어티 R4는 C8-C12 알킬이다. 또 다른 실시형태에서, 각각의 지질 모이어티 R4는 n-데실과 같은 C10-알킬이다. 다른 실시형태에서, 각각의 지질 모이어티 R4는 2-에틸헥스-1-일, 카프로일, 올레일, 스테아릴, 리놀레일, 미리스틸 및 라우릴로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다.
임의의 선행하는 실시형태와 조합될 수 있는 또 다른 실시형태에서, 각각의 지질 모이어티 R4는 독립적으로
Figure pct00094
,
Figure pct00095
,
Figure pct00096
,
Figure pct00097
,
Figure pct00098
,
Figure pct00099
,
Figure pct00100
,
Figure pct00101
,
Figure pct00102
,
Figure pct00103
,
Figure pct00104
,
Figure pct00105
,
Figure pct00106
,
Figure pct00107
또는
Figure pct00108
이다. 임의의 선행하는 실시형태와 조합될 수 있는 여전히 또 다른 실시형태에서, 각각의 지질 모이어티 R4는 독립적으로 화학식
Figure pct00109
,
Figure pct00110
,
Figure pct00111
또는
Figure pct00112
의 지질이되, R8는 약 6 내지 약 50개의 탄소 원자 또는 약 10 내지 약 50개의 탄소 원자를 갖고, 선택적으로 하나 이상의 헤테로원자를 포함하며, 선택적으로 하나 이상의 이중 또는 삼중 결합을 포함하는 분지쇄 또는 직쇄 지방족 모이어티이다. 소정의 실시형태에서, 각각의 지질 모이어티 R4는 독립적으로
Figure pct00113
,
Figure pct00114
,
Figure pct00115
,
Figure pct00116
,
Figure pct00117
또는
Figure pct00118
이다.
본 발명의 실시에 사용되는 천연 지질 모이어티는 예를 들어, 인지질, 글리세라이드(예컨대, 다이- 또는 트라이-글리세라이드), 글리코실글리세라이드, 스핑고지질, 세라마이드 및 포화 및 불포화 스테롤, 아이소프레노이드 및 다른 유사 천연 지질로부터 유래될 수 있다.
다른 적합한 지질 모이어티는 예를 들어, 나프탈렌일 또는 에틸벤질을 포함하는 선택적으로 치환된 아릴, 사이클로알킬, 사이클로알킬알킬 또는 아릴알킬 모이어티와 같은 친유성 탄소고리형 또는 방향족기 또는 예를 들어, 스테롤 에스터 및 왁스 에스터를 포함하는 에스터 작용기를 포함하는 지질을 포함할 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 지질 모이어티 R4는
Figure pct00119
또는
Figure pct00120
이다.
구조적 모티프
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물은 서로에 대해 양이온성, 중성 스페이서 및 지질화 아미노산 잔기의 특정 서열 또는 배열을 포함할 수 있으며, 이는 선형 공중합체의 다양한 분류(랜덤, 블록, 교호, 주기, 스테레오블록 등)와 유사하게 설명될 수 있다.
예를 들어, 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 화합물이 일반(generic) 모이어티 R양이온, R중성 및 R지질을 포함하는 일부 실시형태에서, 아미노산 잔기는 랜덤 서열, 교호 서열 또는 블록 서열로 배열될 수 있다. R양이온 및 R중성의 표현은 양이온성 모이어티 R5 및 중성 모이어티 R4를 각각 포함하는 아미노산 잔기와 동등함을 이해하여야 한다. 일반 모이어티 R지질은 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물에서 N-지질화 잔기의 위치에 따라 지질 모이어티 R4 및 지질 모이어티 R3을 갖는 아미노산 잔기를 모두 포함하는 것으로 이해될 수 있다.
양이온성 및 중성 스페이서 아미노산 잔기의 교호 서열의 하나의 예는 R양이온-R중성-R양이온-R중성 또는 R중성-R양이온-R중성-R양이온으로 나타낼 수 있다. 양이온성 및 지질화 아미노산 잔기의 교호 서열의 다른 예는 R양이온-R지질-R양이온-R지질 또는 R중성-R양이온-R중성-R양이온성으로 나타낼 수 있다. 블록 서열의 일부 예는 R양이온-R양이온-R양이온-R중성-R중성-R중성, R중성-R중성-R중성-R양이온-R양이온-R양이온, R양이온-R양이온-R양이온-R지질-R지질-R지질 또는 R지질-R지질-R지질-R양이온-R양이온-R양이온으로 나타낼 수 있다. 여전히 일부 실시형태에서, 양이온성 모이어티, 중성 스페이서 모이어티 및 지질화 모이어티는 전체 올리고펩타이드 화합물 내에서 상이한 반복 서브유닛 세그먼트에 대해 블록 서열 및 교호 서열로 배열될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 양이온성 펩타이드 화합물 내에 R양이온-R중성-R중성-R양이온-R중성-R중성과 같은 더 큰 올리고머의 반복 모티프가 있을 수 있다. 다른 실시형태에서, 양이온성 펩타이드 화합물은 교호 양이온성 및 중성 잔기의 블록과 조합된 N-지질화 잔기의 블록을 포함할 수 있다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, 본 개시내용의 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드는 양이온성 모이어티 R5를 갖는 적어도 하나의 양이온성 아미노산 잔기를 포함한다. 일부 실시형태에서, 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물의 골격은 "양이온성 도메인" 또는 "양이온성 블록"을 포함한다. 양이온성 도메인은 복수의 양이온성 모이어티 R5, 예를 들어, 적어도 2개의 양이온성 잔기를 갖는 올리고펩타이드 사슬 내에 순차적인 아미노산 잔기의 세그먼트로서 광범위하게 이해될 수 있다. 일부 실시형태에서, 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물은 양이온성 도메인을 포함하되, 양이온성 도메인은 적어도 2개, 적어도 3개 또는 적어도 4개의 양이온성 아미노산 잔기를 포함한다.
양이온성 도메인은 근접한 선형 서열(예를 들어, R5R5R5 또는 R양이온R양이온R양이온)에서 복수의 R5 양이온성 모이어티를 갖는 아미노산 잔기의 블록을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물은 "양이온성 도메인"을 포함하되, 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물은 R5 양이온성 모이어티를 갖는 적어도 2개, 적어도 3개 또는 적어도 4개의 근접한 아미노산 잔기를 포함한다.
다른 실시형태에서, "양이온성 도메인"은 인접한 아미노산 잔기의 블록을 포함할 수 있되, 복수의 양이온성 잔기는 블록 내에 양이온성 잔기가 없고, 다른 양이온성 잔기에 직접 결합되지 않도록 2개의 양이온성 잔기 사이에 이격된 추가적인 비-양이온성(즉, 중성 또는 지질화) 잔기를 특징으로 한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물은 "양이온성 도메인"을 포함하되, 양이온성 도메인은 양이온성 모이어티 R5를 갖는 적어도 2개의 양이온성 아미노산 잔기를 포함하고, 양이온성 도메인 내에서 적어도 2개의 양이온성 아미노산 잔기 각각은 중성 스페이서 또는 지질 모이어티 R4를 갖는 적어도 하나의 또는 적어도 2개의 아미노산 잔기에 의해 분리된다. 일부 실시형태에서, 비-양이온성 잔기는 양이온성 도메인 내에서 2개의 양이온성 잔기 사이에 균일한 길이의 규칙적으로 이격된 간격으로 개제된다. 양이온성 도메인이 양이온성 잔기 사이에 개재된 비-양이온성 잔기를 포함하는 일부 실시형태에서, 양이온성 도메인은 반복(이량체, 삼량체, 사량체 등) 서브유닛을 포함하는 도메인으로 기재될 수 있다. 이러한 서브유닛은 -R양이온R중성-, -R양이온R중성R중성-, -R양이온R지질-, -R양이온R지질R지질-, -R양이온R중성R지질- 또는 -R양이온R지질R중성-을 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다. 다른 실시형태에서, 비-양이온성 잔기는 양이온성 도메인 내에서 2개의 양이온성 잔기 사이에 산재되어 있으며, 각 쌍의 양이온성 잔기 사이에 다양한 수의 비-양이온성 잔기를 갖는다. 양이온성 도메인이 양이온성 잔기 사이에 산재된 비-양이온성 잔기를 포함하는 소정의 실시형태에서, 각 쌍의 양이온성 잔기는 독립적으로 적어도 하나의 비-양이온성 잔기에 의해 분리된다.
3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물이 양이온성 도메인을 포함하는 일부 실시형태에서, 각각의 R5는
Figure pct00121
이다. 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드가 양이온성 도메인을 포함하는 다른 실시형태에서, 각각의 양이온성 모이어티 R5는
Figure pct00122
이고, 각각의 중성 스페이서 모이어티는
Figure pct00123
이다. 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드가 하나 이상의 이량체 또는 삼량체 서브유닛을 포함하는 양이온성 도메인을 포함하는 소정의 실시형태에서, 각각의 양이온성 모이어티 R5는
Figure pct00124
이고, 각각의 중성 스페이서 모이어티는
Figure pct00125
이다. 또 다른 실시형태에서, 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드는 하나 이상의 삼량체 서브유닛 -R양이온R중성R중성-을 포함하는 양이온성 도메인을 포함하며, 각각의 양이온성 모이어티 R5는
Figure pct00126
이고, 각각의 중성 스페이서 모이어티는
Figure pct00127
이다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, 본 개시내용의 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물은 하나 이상의 상이한 양이온성 모이어티(R양이온1, R양이온2, R양이온3 등), 하나 이상의 상이한 중성 스페이서 모이어티(R중성1, R중성2, R중성3 등) 및/또는 하나 이상의 상이한 지질 모이어티(R지질1, R지질2, R지질3 등)을 포함할 수 있다. 일반 양이온성 및 중성 스페이서 아미노산 잔기의 서열 또는 배열의 위의 예는 본 개시내용의 펩타이드 화합물을 제한하는 것으로 의도되지 않음을 인식하여야 한다. 일반적으로 위에 기재된 바와 같이 랜덤, 교호 또는 블록 서열로 존재할 수 있는 양이온성, 중성 스페이서 및 지질 모이어티는 또한 더 큰 블록 또는 교호 구조적 모티프 내에서 개별적인 양이온성 모이어티, 중성 모이어티 및 지질 모이어티의 특정 서열에 존재할 수 있다. 예를 들어, 잔기의 일부 예시적인 배열은 다음을 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다: R양이온1R중성1R중성1R지질1R양이온1R중성1R중성1R지질1R양이온1R중성1R중성1, R양이온1R중성1R중성1R양이온1R중성1R중성1R양이온1R중성1R중성1R지질1R지질1, R지질1R양이온1R중성1R지질1R양이온1R중성1-R지질2R양이온2R중성2R지질2R양이온2R중성2, R지질1R지질2R지질3R지질4R중성1R중성2R양이온1R중성1R중성2R지질1R지질2R지질3R지질4 또는 R지질1R지질2R지질1R지질2R양이온1R중성1R양이온1R중성1R지질1R지질2R지질1R지질2.
측쇄 기능화 및 펩타이드 접합체 화합물
위에 기재된 바와 같이, 올리고펩타이드 골격은 주로 N-위치(R4 및 R5)에 양이온성, 중성 스페이서 또는 지질 모이어티를 갖는 자연 발생적- 또는 비-자연 발생적 아미노산(Ra 및 Rb)에서 발견되는 측쇄 모이어티를 갖는 아미노산 잔기를 포함한다.
일 양태에서, 본 개시내용의 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물의 Ra, Rb, R4 및 R5 기는 소분자 또는 항체와 같은 치료제 및/또는 표적화 요소에 공유 결합시키는데 사용될 수 있는 반응성 링커기를 더 포함할 수 있다. 이러한 추가적인 작용기는 또한 합성 또는 탈보호 조건에 적합하지 않거나(예컨대, 산에 불안정한 링커) 또는 적합한 보호기 전략을 사용할 수 없는(예를 들어, 폴리아민) 양이온성기를 포함할 수 있다. 반응성기(들)는 예를 들어, 당업계에 공지된 화학적 방법을 통해 기존의 측쇄 Ra 및/또는 Rb 또는 R5의 양이온성 모이어티, N-위치에서 R4의 중성 스페이서 또는 지질 모이어티에 부가될 수 있다. 대안적으로, 목적하는 반응성 모이어티를 갖는 Ra, Rb, R4 또는 R5 기가 상응하는 유리 아민으로서 상업적으로 입수 가능한 경우, 상응하는 유리 아민은 펩타이드 사슬의 일반 합성 동안(예를 들어, 서브 단량체 합성 동안) 혼입될 수 있다.
일부 실시형태에서, 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드는 반응성기 또는 링커기를 포함하는 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함한다. 적합한 반응성기는 에스터, 아마이드, 아이소사이아네이트, 티올 또는 "클릭(click)" 화학 적합성 모이어티(예를 들어, 아지도, 알킨일)를 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다.
다른 양태에서, 본 개시내용은 양이온성 화합물로서 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물을 더 제공하되, 펩타이드 화합물은 치료제 및/또는 표적화 요소에 공유 결합되거나 또는 접합된다. 소정의 실시형태에서, 치료제 및/또는 표적화 요소는 소분자, 펩타이드 서열, 항체 또는 항체 단편, 압타머, 단일- 또는 올리고-사카라이드(예를 들어, 갈락토스) 또는 글리칸이다.
소정의 생리학적 조건 환경하에서 민감하거나 불안정한 링커기 또는 연결은 소정의 장기 또는 세포로의 표적화된 전달 후 치료제 및/또는 다중음이온성 물질의 세포로의 선택적 방출을 가능하게 하는데 유용할 수 있다. 더욱이, 불안정한 연결은 또한 다중음이온성 물질의 전달 후 세포(또는 장기 또는 전신)로부터 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 화합물의 제거(elimination) 및 청소(clearance)를 촉진할 수 있다. 소정의 실시형태에서, 링커기는 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물과 치료제 또는 표적화 요소 사이의 공유 결합이 가수분해적으로 불안정, 화학적으로 불안정, pH 불안정, 광불안정, 열적으로 불안정 또는 효소적으로 절단 가능하도록 선택된다.
말단(캐핑(Capping)) 잔기 및 보호 말단기
본 명세서에 기재된 바와 같이, 본 개시내용의 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물은 지질 모이어티로 N-치환된("N-지질화") 및/또는 올리고에틸렌 글리콜 및/또는 폴리에틸렌 글리콜로 N-치환된("N-페길화") 아미노산 잔기에 의해 N-말단 및/또는 C-말단에서 캐핑된 올리고펩타이드 골격을 포함한다. 양이온성 펩타이드 화합물의 N-지질화는 화합물뿐만 아니라 화합물과 다중음이온성 종 사이에 형성된 임의의 복합체에 양호한 친유성을 부여한다. N-페길화는 입자 형성 및 생체내 응집에 대한 더 큰 제어를 제공한다. N-말단 및 C-말단의 말단 아미노 및 카복실산 모이어티는 보호 말단기로 더 캐핑될 수 있다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물은 N-지질화 및/또는 N-페길화 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 본 명세서에서 제공되는 양이온성 펩타이드 화합물은 N-지질화 또는 N-페길화된 적어도 하나의 아미노산 잔기를 포함한다. 일부 실시형태에서, 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물은 3차 아미노 지질화 양이온성 펩타이드 화합물이다. 다른 실시형태에서, 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물은 3차 아미노 페길화 양이온성 펩타이드 화합물이다. 여전히 또 다른 실시형태에서, 본 개시내용의 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물은 N-지질화 및 N-페길화 아미노산 잔기 모두를 포함한다. 일부 실시형태에서, 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물은 3차 아미노 지질화 및 페길화 양이온성 펩타이드 화합물이다.
지질 모이어티
위에 기재된 바와 같이, 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물은 N-말단 및/또는 C-말단에 아미노산 잔기를 포함할 수 있되, 아미노산 잔기는 지질 모이어티로 N-치환되거나 또는 "N-지질화"된다. 본 명세서에 기재된 양이온성 펩타이드 화합물의 N-말단 및/또는 C-말단에 N-지질화 아미노산 잔기의 혼입은 화합물의 친유성을 증가시킨다. 양이온성 펩타이드 화합물의 증가된 친유성은 세포막의 지질 이중층과 같은 소수성 환경에 대한 친화성을 향상시켜, 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물 및 다중음이온성 화합물과 이들의 임의의 복합체가 세포로 수송되는 경향을 증가시킨다.
일부 실시형태에서, 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물은 N-지질화된다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 3차 아민 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물은 N-말단에 N-지질화 아미노산 잔기를 포함한다. 다른 실시형태에서, 본 개시내용의 3차 아민 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물은 C-말단에 N-지질화 아미노산 잔기를 포함한다. 소정의 실시형태에서, 본 개시내용의 3차 아민 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물은 N-말단 및 C-말단에 N-지질화 아미노산 잔기를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 양이온성 펩타이드 화합물의 N-말단에서의 N-지질화 아미노산 잔기의 수는 n으로 표시된다. 다른 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 양이온성 펩타이드 화합물의 N-말단에서의 N-지질화 아미노산 잔기의 수는 s로 표시된다.
일부 실시형태에서, n은 0 내지 8의 정수이다. 소정의 실시형태에서, n은 0 내지 5의 정수이다. 다른 실시형태에서, n은 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7의 정수이다. 또 다른 실시형태에서, n은 1, 2, 3 또는 4의 정수이다. 일부 실시형태에서, s는 0 내지 8의 정수이다. 소정의 실시형태에서, s는 0 내지 5의 정수이다. 다른 실시형태에서, s는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7의 정수이다. 또 다른 실시형태에서, s는 1, 2, 3 또는 4의 정수이다. 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물이 N-지질화된 일부 실시형태에서, n 또는 s 중 적어도 하나는 0이 아니다. 일부 실시형태에서, n은 0이 아니다. 다른 실시형태에서, s는 0이 아니다. 소정의 실시형태에서, n 및 s는 모두 0이 아니다.
일부 실시형태에서, n과 s의 합은 1 내지 8의 정수, 2 내지 7의 정수 또는 4 내지 6의 정수이다. 다른 실시형태에서, n과 s의 합은 적어도 2, 적어도 3 또는 적어도 4이다.
일부 실시형태에서, 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물은 N-지질화 잔기의 블록 또는 "N-지질 블록"을 포함하되, 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드는 서로 인접한 적어도 2개, 적어도 3개 또는 적어도 4개의 N-지질화 잔기(예를 들어, R지질R지질R지질)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물은 N-지질화 잔기의 블록을 포함하되, n은 적어도 2, 적어도 3 또는 적어도 4이다. 다른 실시형태에서, 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물은 N-지질화 잔기의 블록을 포함하되, s는 적어도 2, 적어도 3 또는 적어도 4이다.
본 개시내용의 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드에서 N-지질화 아미노산 잔기는 지질 모이어티 R3으로 N-치환된다. 본 개시내용의 지질 모이어티는 중성(즉, 전하를 갖지 않거나 또는 순 전하가 0임)인 소수성 또는 친유성 모이어티를 포함할 수 있다. 본 명세서에 기재된 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 화합물의 지질 모이어티는 천연 또는 합성적으로 유래될 수 있다. 각각의 R3은 독립적으로 동일하거나 상이할 수 있는 지질 모이어티이다. 일부 실시형태에서, 각각의 R3은 동일하다. 다른 실시형태에서, 각각의 R3은 상이하다.
N-지질화 아미노산 잔기의 특정 서열 또는 배열은 핵산과의 복합체화 및 이의 전달을 개선하는데 특히 유용할 수 있음을 인식하여야 한다. 예를 들어, 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 화합물이 2개의 상이한 지질 모이어티 R3a 및 R3b 중 하나를 갖는 일련의 혼합된 N-지질화 아미노산 잔기를 포함하는 일부 실시형태에서, N-지질화 아미노산 잔기는 교호 또는 블록 서열의 N-말단 또는 C-말단 상에 배열될 수 있다. N-지질화 아미노산 잔기의 교호 서열의 하나의 예는 R3a-R3b-R3a-R3b 또는 R3b-R3a-R3b-R3a로 표시될 수 있다. 블록 서열의 예는 R3a-R3a-R3b-R3b 또는 R3b-R3b-R3a-R3a로 표시될 수 있다. 다른 실시형태에서, N-지질화 아미노산 잔기의 서열은 무작위로 정렬될 수 있다. 2개의 N-지질화 아미노산 잔기의 서열 또는 배열의 위의 예는 제한하는 것으로 의도되지 않음을 인식하여야 한다. 더욱이, 본 개시내용의 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물은 R3의 2개 이상의 상이한 지질 모이어티를 포함할 수 있으며, 이는 일반적으로 위에 기재된 바와 같이 랜덤, 교호 또는 블록 서열에 존재할 수 있다.
적합한 지질 모이어티는 예를 들어, 선택적으로 치환된 분지쇄 또는 직쇄 지방족 모이어티 또는 지방산, 스테롤 및 아이소프레노이드를 포함하는 천연 지질 화합물로부터 유래되는 선택적으로 치환된 모이어티를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 지질 모이어티는 약 6 내지 약 50개의 탄소 원자 또는 약 10 내지 약 50개의 탄소 원자를 갖고, 선택적으로 하나 이상의 헤테로원자를 포함하며, 선택적으로 하나 이상의 이중 또는 삼중 결합(즉, 포화 또는 단일- 또는 다중-불포화)을 포함하는 분지쇄 또는 직쇄 지방족 모이어티를 포함할 수 있다. 소정의 실시형태에서, 지질 모이어티는 선택적으로 치환된 지방족, 직쇄 사슬 또는 분지형 모이어티를 포함할 수 있으며, 각각의 소수성 꼬리는 독립적으로 약 8 내지 약 30개의 탄소 원자 또는 약 6 내지 약 30개의 탄소 원자를 갖는다. 소정의 실시형태에서, 지질 모이어티는 예를 들어, 지방산 및 지방 알코올로부터 유래된 지방족 탄소 사슬을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 각각의 R3은 독립적으로 C8-C24-알킬 또는 C8-C24-알켄일이되, C8-C24-알켄일은 선택적으로 단일- 또는 다중-불포화된다. 일부 실시형태에서, 각각의 R3은 C6-C18 알킬 또는 C6-C18 알켄일이다. 소정의 실시형태에서, 각각의 R3은 C8-C12 알킬이다. 또 다른 실시형태에서, 각각의 R3은 n-데실과 같은 C10-알킬이다. 일부 실시형태에서, 각각의 R3은 3-에틸헥스-1-일, 카프릴일, 카프로일, 올레일, 스테아릴, 리놀레일, 미리스틸 및 라우릴로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다. 다른 실시형태에서, 각각의 R3은 올레일, 스테아릴, 리놀레일, 미리스틸 및 라우릴로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다.
임의의 선행하는 실시형태와 조합될 수 있는 또 다른 실시형태에서, 각각의 R3은 독립적으로
Figure pct00128
,
Figure pct00129
,
Figure pct00130
,
Figure pct00131
,
Figure pct00132
,
Figure pct00133
,
Figure pct00134
,
Figure pct00135
,
Figure pct00136
,
Figure pct00137
,
Figure pct00138
,
Figure pct00139
,
Figure pct00140
,
Figure pct00141
또는
Figure pct00142
이다. 임의의 선행하는 실시형태와 조합될 수 있는 여전히 또 다른 실시형태에서, 각각의 R3은 독립적으로 화학식
Figure pct00143
,
Figure pct00144
,
Figure pct00145
또는
Figure pct00146
의 지질이되, R8은 약 6 내지 약 50개의 탄소 원자 또는 약 10 내지 약 50개의 탄소 원자를 갖고, 선택적으로 하나 이상의 헤테로원자를 포함하며, 선택적으로 하나 이상의 이중 또는 삼중 결합을 포함하는 분지쇄 또는 직쇄 지방족 모이어티이다. 소정의 실시형태에서, 각각의 R3은 독립적으로
Figure pct00147
,
Figure pct00148
,
Figure pct00149
,
Figure pct00150
,
Figure pct00151
또는
Figure pct00152
이다.
본 발명의 실시에 사용되는 천연 지질 모이어티는 예를 들어, 인지질, 글리세라이드(예컨대, 다이- 또는 트라이-글리세라이드), 글리코실글리세라이드, 스핑고지질, 세라마이드 및 포화 및 불포화 스테롤, 아이소프레노이드 및 기타 유사 천연 지질로부터 유래될 수 있다.
다른 적합한 지질 모이어티는 친유성 탄소고리형 또는 방향족기, 예컨대, 예를 들어, 나프탈렌일 또는 에틸벤질을 포함하는 선택적으로 치환된 아릴, 사이클로알킬, 사이클로알킬알킬 또는 아릴알킬 모이어티 또는 예를 들어, 스테롤 에스터 및 왁스 에스터를 포함하는 에스터 작용기를 포함하는 지질을 포함할 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 지질 모이어티 R4는
Figure pct00153
또는
Figure pct00154
이다.
에틸렌 글리콜 모이어티
본 개시내용의 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드는 에틸렌 글리콜의 올리고머 또는 폴리머에 의해 N-치환된, 즉, 올리고에틸렌 글리콜 및/또는 폴리에틸렌 글리콜로 N-치환된 N-말단 및/또는 C-말단에서 아미노산 잔기를 캐핑하는 것을 포함할 수 있다. 올리고- 및/또는 폴리에틸렌 글리콜 모이어티의 본 명세서에 기재된 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물로의 혼입은 핵산으로 형성된 복합체의 입자 안정성을 촉진하고, 생체내 입자 응집을 방지할 수 있다.
용어 "페길화"는 올리고에틸렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜 또는 이들의 조합으로 N-치환될 수 있는 말단 아미노산 잔기를 포함하는 양이온성 펩타이드 화합물을 설명하기 위해 본 명세서에서 사용됨을 인식하여야 한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물은 N-페길화된다.
일부 실시형태에서, 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물은 아래의 화학식 (I)의 단편에 나타낸 바와 같이 N-말단에 N-페길화 아미노산 잔기를 포함한다:
Figure pct00155
3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물이 N-말단에 N-페길화 아미노산 잔기를 포함하는 소정의 실시형태에서, m은 N-말단에서의 N-페길화 아미노산 잔기의 수를 나타내며, 각각의 R2는 독립적으로 화학식 -CH2CH2O(CH2CH2O)uR2a의 에틸렌 글리콜 모이어티이되, R2a는 -H 또는 C1-C4-알킬이다. 일부 실시형태에서, R2a는 -H, -CH3 또는 CH2CH3이다. 소정의 실시형태에서, R2a는 -H이다. 다른 실시형태에서, R2a는 -CH3이다. 여전히 또 다른 실시형태에서, R2a는 CH2CH3이다.
일부 실시형태에서, m은 0 내지 10의 정수, 0 내지 3의 정수 또는 4 내지 10의 정수이다. 일부 실시형태에서, 각각의 u는 독립적으로 2 내지 200의 정수, 2 내지 100의 정수, 2 내지 50의 정수, 50 내지 200의 정수, 50 내지 100의 정수, 100 내지 200의 정수 또는 150 내지 200의 정수이다.
소정의 실시형태에서, m은 0 내지 3의 정수이고, 각각의 u는 20 내지 200의 정수 또는 선택적으로 30 내지 50의 정수이다. 소정의 실시형태에서, m은 0 내지 3의 정수이며, u는 40 내지 45의 정수이다. 여전히 또 다른 실시형태에서, m은 1이고, u는 40 내지 45의 정수이다. 다른 실시형태에서, m은 4 내지 10의 정수이고, 각각의 u는 2 내지 10의 정수이다. 소정의 실시형태에서, m은 4 내지 10의 정수이며, u는 2 내지 5의 정수이다. 여전히 또 다른 실시형태에서, m은 7 내지 10의 정수이고, u는 3이다.
일부 실시형태에서, 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물은 아래 화학식 (I)의 단편에 나타낸 바와 같이 C-말단에 N-페길화 아미노산 잔기를 포함한다:
Figure pct00156
3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물이 C-말단에 N-페길화 아미노산 잔기를 포함하는 소정의 실시형태에서, t는 N-말단에서의 N-페길화 아미노산 잔기의 수를 나타내며, 각각의 R6은 독립적으로 화학식 -CH2CH2O(CH2CH2O)vR6a의 에틸렌 글리콜 모이어티이되, R6a는 -H 또는 C1-C4-알킬이다. 일부 실시형태에서, R6a는 -H, -CH3 또는 CH2CH3이다. 소정의 실시형태에서, R6a는 -H이다. 다른 실시형태에서, R6a는 -CH3이다. 여전히 또 다른 실시형태에서, R6a는 -CH2CH3이다.
일부 실시형태에서, t는 0 내지 10의 정수, 0 내지 3의 정수 또는 4 내지 10의 정수이다. 일부 실시형태에서, 각각의 u는 독립적으로 2 내지 200의 정수, 2 내지 100의 정수, 2 내지 50의 정수, 50 내지 200의 정수, 50 내지 100의 정수, 100 내지 200의 정수 또는 150 내지 200의 정수이다.
일부 실시형태에서, t는 0 내지 3의 정수이고, 각각의 v는 30 내지 50의 정수이다. 소정의 실시형태에서, t는 0 내지 3의 정수이고, v는 40 내지 45의 정수이다. 여전히 또 다른 실시형태에서, t는 1이고, v는 40 내지 45의 정수이다. 다른 실시형태에서, t는 4 내지 10의 정수이고, 각각의 v는 2 내지 10의 정수이다. 소정의 실시형태에서, t는 4 내지 10의 정수이고, v는 2 내지 5의 정수이다. 여전히 또 다른 실시형태에서, t는 7 내지 10의 정수이고, v는 3이다.
3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물이 N-페길화된 일부 실시형태에서, m 또는 t 중 적어도 하나는 0이 아니다. 일부 실시형태에서, m은 0이 아니다. 다른 실시형태에서, t는 0이 아니다. 소정의 실시형태에서, m과 t는 모두 0이 아니다.
N-지질화 및/또는 N-페길화
본 명세서에 기재된 바와 같이, 본 개시내용의 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물은 N-지질화 및/또는 N-페길화된 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 본 명세서에서 제공되는 양이온성 펩타이드 화합물은 N-지질화 또는 N-페길화된 적어도 하나의 아미노산 잔기를 포함한다. 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물의 일부 실시형태에서, m, n, s 또는 t 중 적어도 하나는 0이 아니다.
일부 실시형태에서, 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물은 n 및 s 중 적어도 하나가 0이 아닌 3차 아미노 지질화 양이온성 펩타이드 화합물이다. 소정의 실시형태에서, n과 s는 모두 0이 아니다. 여전히 소정의 실시형태에서, 화학식 (I)의 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물은 화학식 (Ia)의 3차 아미노 지질화 양이온성 펩타이드 화합물이다:
Figure pct00157
식 중, n 및 s 중 적어도 하나는 0이 아니고, R1, R3, R4, R5, R7, Ra, Rb, o, p, q 및 r은 화학식 (I)에 대해 정의된 바와 같다. 화학식 (Ia)의 화합물의 소정의 실시형태에서, n과 s는 모두 0이 아니다.
다른 실시형태에서, 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물은 m 및 t 중 적어도 하나가 0이 아닌 3차 아미노 페길화 양이온성 펩타이드 화합물이다. 소정의 실시형태에서, m과 t는 모두 0이 아니다. 소정의 실시형태에서, m과 t는 모두 0이 아니다. 다른 실시형태에서, 화학식 (I)의 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물은 화학식 (Ib)의 3차 아미노 페길화 양이온성 펩타이드 화합물이다:
Figure pct00158
식 중, m 및 t 중 적어도 하나는 0이 아니고, R1, R2, R4, R5, R6, R7, Ra, Rb, o, p, q 및 r은 화학식 (I)에 대해 정의된 바와 같다. 화학식 (Ib)의 화합물의 소정의 실시형태에서, m과 t는 모두 0이 아니다.
여전히 또 다른 실시형태에서, 본 개시내용의 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물은 N-지질화 및 N-페길화 아미노산 잔기 모두를 포함한다. 일부 실시형태에서, 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물은 3차 아미노 지질화 및 페길화 양이온성 펩타이드 화합물이다. 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물이 3차 아미노 지질화 및 페길화 양이온성 펩타이드 화합물인 소정의 실시형태에서, m 및 t 중 적어도 하나는 0이 아니고, n 및 s 중 적어도 하나는 0이 아니다.
여전히 추가의 실시형태에서, 화학식 (I)의 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물은 화학식 (Ic)의 3차 아미노 지질화 및 페길화 양이온성 펩타이드 화합물이다:
Figure pct00159
식 중, m 및 t 중 적어도 하나는 0이 아니고, n 및 s 중 적어도 하나는 0이 아니며, R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, Ra, Rb, o, p, q 및 r은 화학식 (I)에 대해 정의된 바와 같다.
다른 실시형태에서, 본 개시내용의 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물은 또한 N-페길화 잔기와 유사한 차폐 효과를 제공하는 N-말단 또는 C-말단에 다른 중성 차폐 폴리머 또는 모이어티를 갖는 N-치환된 아미노산 잔기를 가질 수 있다. 이들은 하이드록실알킬, 하이알루론산, 폴리사카라이드, 폴리포스페이트 및 폴리포스포에스터, 폴리(바이닐 피롤리돈), 폴리올, 친수성 폴리펩타이드 또는 다른 합성 친수성 폴리머와 같은 예를 포함할 수 있다.
N-말단기 및 C-말단기
본 개시내용의 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물은 각각 유리 아민 및 유리 산 형태로 또는 보호된 형태로 N-말단 및 C-말단과 함께 제공될 수 있다. 일부 실시형태에서, 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물은 N-말단 및/또는 C-말단 잔기에 보호기 또는 말단 캐핑기를 더 포함한다.
일부 실시형태에서, 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물은 N-말단 잔기에 보호기 또는 말단 캐핑기 R1을 포함한다. 일부 실시형태에서, R1은 -H, 알킬, 알킬아릴, -COR1a, -CH2-COR1a, 양이온성 모이어티, 지질 모이어티 또는 올리고에틸렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜 모이어티이되, R1a는 -H, -OH, 알킬, 아릴, 알킬아릴, -O-알킬, -O-알킬아릴 또는 지질 모이어티이다. 소정의 실시형태에서, R1은 -H, 알킬, 알킬아릴, -COR1a 또는 지질 모이어티이되, R1a는 -H, -OH, 알킬, 아릴, 알킬아릴, -O-알킬 또는 -O-알킬아릴이다. R1이 지질 모이어티인 소정의 실시형태에서, 지질 모이어티는 인지질이 아니다. R1이 알킬 또는 -COR1a이고 R1a가 알킬인 또 다른 실시형태에서, 알킬은 -OH 또는 할로로 선택적으로 치환된다.
다른 실시형태에서, 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물은 C-말단 잔기에 보호기 또는 말단 캐핑기 R7을 포함한다. 일부 실시형태에서, R7은 -H, 알킬, 아실, -OH, -OR7a, -NH2, -NHR7a, 양이온성 모이어티, 지질 모이어티 또는 올리고에틸렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜 모이어티이되, R7a는 알킬, 아실 또는 지질 모이어티이다. 일부 실시형태에서, R7은 -H, 알킬, 아실, -OH, -OR7a, -NH2, -NHR7a 또는 지질 모이어티이되, R7a는 알킬, 아실 또는 지질 모이어티이다. R7이 지질 모이어티인 소정의 실시형태에서, 지질 모이어티는 인지질이 아니다.
여전히 추가의 실시형태에서, 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물의 N-말단 및 C-말단은 R1 및 R7이 반응성 링커기와 같은 추가적인 작용기를 갖도록 선택되거나 더 변형될 수 있다.
일부 실시형태에서, 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드의 R1 및/또는 R7은 독립적으로 하나 이상의 반응성 링커기를 포함한다. 적합한 반응성기는 에스터, 아마이드, 아이소사이아네이트, 티올 또는 "클릭" 화학 적합성 모이어티(예를 들어, 아지도, 알킨일)를 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다.
반응성 링커기는 표적화 요소 또는 치료제를 포함하는 다른 유용한 화합물을 펩타이드 화합물에 공유 결합시키기 위해 차례로 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물은 치료제 및/또는 표적화 요소에 공유 결합되거나 접합된다. 소정의 실시형태에서, 치료제 및/또는 표적화 요소는 소분자, 항체 또는 항체 단편이다.
또한, R1 및 R7에 대한 추가적인 작용기는 또한 합성 또는 탈보호 조건에 적합하지 않거나(예컨대, 산에 불안정한 링커) 또는 적합한 보호기 전략을 이용할 수 없는(예를 들어 폴리아민) 양이온성기를 포함할 수 있다. 다른 추가의 실시형태에서, R1은 폴리아민이다. R1이 폴리아민인 일부 실시형태에서, 폴리아민은
Figure pct00160
,
Figure pct00161
,
Figure pct00162
,
Figure pct00163
,
Figure pct00164
,
Figure pct00165
,
Figure pct00166
,
Figure pct00167
,
Figure pct00168
또는
Figure pct00169
이다. 소정의 실시형태에서, 폴리아민은
Figure pct00170
,
Figure pct00171
,
Figure pct00172
및
Figure pct00173
로 이루어진 군으로부터 선택된다.
위에 기재된 바와 같이, 소정의 생리학적 조건 환경하에서 민감하거나 불안정한 링커기 또는 연결은 다중음이온성 물질의 특정 세포로의 표적 전달을 용이하게 하고, 제거와 같은 소정의 약동학적 특성을 개선할 수 있다. 소정의 실시형태에서, 링커기는 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물과 치료제 또는 표적화 요소 사이의 공유 결합이 가수분해적으로 불안정, 화학적으로 불안정, pH 불안정, 광불안정, 열적으로 불안정 또는 효소적으로 절단 가능하도록 선택된다.
3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물의 조합
본 개시내용의 복합체 및 조성물은 하나 이상의 양이온성 화합물을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 복합체는 화학식 (I)의 하나 이상의 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물을 포함할 수 있다. 단일 복합체에서 본 개시내용의 다중 양이온성 펩타이드 화합물의 혼합물 및 조합의 사용은 특정 약동학적 및 약력학적 특성에 맞는 제형의 제조를 가능하게 할 수 있다. 관련있는 약동학적 및 약력학적 특성은 생체분포, 면역원성, 제형 안정성, 캡슐화 백분율, 형질감염 효율, 혈장 반감기 등을 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다. 이러한 특성의 상이한 조합이 다양한 응용 분야에 필요할 수 있다.
예를 들어, 소정의 실시형태에서, 복합체 또는 조성물은 양이온이 풍부한 하나 이상의 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물과 고도로 지질화되고/되거나 적어도 하나의 PEG 모이어티를 함유하는 하나 이상의 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물의 조합을 포함할 수 있다. 이론적으로, 이러한 조합은 더 큰 친유성 차폐(지질화 펩타이드 화합물에 의해)와 함께 더 큰 전하 안정화(양이온이 풍부한 펩타이드 화합물을 통해)를 제공함으로써 다중음이온성 화합물의 개선된 전달을 제공할 수 있다. 각각의 개별적인 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물의 개별적인 양은 목적하는 특성을 달성하기 위해 조정될 수 있음을 추가로 인식하여야 한다.
3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물의 합성
다른 양태에서, 본 명세서에 기재된 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물을 제조하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
본 개시내용의 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물은 지질 모이어티를 올리고펩타이드 코어에 접합시키기 위한 추가적인 링커 종의 필요 없이 합성될 수 있다. 본 명세서에 기재된 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물의 경우, 지질 및 에틸렌 글리콜 모이어티는 펩타이드 자체 내의 질소 원자, 다시 말해서, 아미노산 잔기의 아마이드 질소 또는 N-위치에 공유 및 직접 결합된다. 따라서, 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드는 펩타이드 사슬에서 N-치환된 잔기를 생산하기 위한 당업계에 공지된 방법에 의해 완전히 합성될 수 있다.
3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물은 잔기가 N-위치에 양이온성, 중성, 지질 또는 올리고-/폴리에틸렌 글리콜 모이어티를 갖는지 여부에 관계없이, 첨가될 각각의 아미노산 잔기에 대한 일련의 아실화(아미드화) 및 친핵성 치환(아미노화) 반응에 의해 제조될 수 있다. 본 명세서에 기재된 양이온성 펩타이드 화합물은 펩타이드 사슬에 대한 개별적인 잔기의 순차적인 첨가에 의해 합성된다. 잔기의 순차적인 첨가는 목적하는 서열 및 아미노산의 길이가 달성될 때까지 반복하여 수행될 수 있다.
본 발명의 화합물은 고체상 및 용액상 방법 모두에 의해 합성될 수 있다. 고체상 합성에 의해 본 명세서에 기재된 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물을 포함하는 N-치환된 펩타이드를 제조하기 위한 예시적인 방법이 아래에 논의되며, 도 3a 내지 도 3e에 나타나 있다.
도 3a에 나타낸 바와 같이, 말단 2차 아민을 갖는 고체 수지 지지체는 합성의 시작시에 제공된다. 아실화제는 말단 2차 아민과 아실화제 사이에 아마이드 결합을 형성하기 위해 적합한 펩타이드 커플링 시약 및 용매와 함께 말단 2차 아민에 첨가된다. 아실화제는 바람직하게는 아세틸화제이다. 아실화제는 α-탄소에서 아미드화 및 후속 아미노화를 촉진하기 위해 적어도 2개의 적합한 이탈기를 포함한다. 소정의 실시형태에서, 아실화제는 할로아세트산이다. 다른 실시형태에서, 아실화제는 브로모아세트산이다.
도 3b에서, 도 3a에서 생성된 아실화 생성물은 목적하는 치환된 1차 또는 2차 아민과 반응하여 상응하는 N-치환된 말단 아미노산 잔기를 제공한다. 선택된 1차 또는 2차 아민은 α-탄소 상에서 브로모아세트산 중 브로민과 같은 이탈기를 대체하여 상응하는 아미노화 생성물을 생성한다. 일부 실시형태에서, 1차 또는 2차 아민은 NHRpR2, NHRpR3, NHRpR4, NHRpR5 및 NHRpR6으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아민이되, Rp는 -H 또는 보호기이고, R2, R3, R4, R5 및 R6은 본 명세서에 기재된 바와 같은 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물에 대해 정의된 바와 같다.
아미드화 및 아미노화 반응은 목적하는 펩타이드 서열이 얻어질 때까지(도 3d) 연속적으로 반복된다(도 3c). 본 명세서에 기재된 바와 같은 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물을 제조하는 방법은 연속적인 아미드화/아미노화 반응의 경과에 따라 펩타이드 사슬에서 반응성 모이어티와의 임의의 원치 않는 반응을 방지하기 위해 보호 및 탈보호 단계를 더 포함할 수 있음을 인식하여야 한다. 예를 들어, 보호기 Rp는 합성 동안 본 명세서에 기재된 펩타이드 화합물을 따라 어디에서나 α-탄소(들) 및/또는 N-치환기(들)의 측쇄에 첨가될 수 있다. 적합한 보호기 Rp는 당업계에 공지된 임의의 보호기, 특히 Boc/Bzl 또는 Fmoc/tBu와 같은 직교화 보호 체계에서 펩타이드 합성에 적합한 것들을 포함할 수 있다.
올리고펩타이드 골격을 따라 N-말단 및 C-말단(R1 및 R7)에서의 말단기의 혼입뿐만 아니라 아미노산 잔기(Ra, Rb, R4, R5)의 말단기 및/또는 측쇄의 기능화는 당업계에 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다. 당업자는 전체 고체상 합성에 대한 적합한 방법의 선택 및 추가적인 기능화 단계(들)의 타이밍이 첨가될 말단기 및/또는 링커기뿐만 아니라 펩타이드 화합물에 존재하는 다른 모이어티 및/또는 보호기와 상기 방법의 적합성에 따라 달라질 것임을 인식할 것이다.
목적하는 펩타이드 화합물은 위에 기재된 바와 같은 합성에서 사용되는 임의의 보호 체계에 따라 염산, 브롬화수소산 또는 트라이플루오로아세트산을 포함하는 산성 조건과 같은 적합한 반응 조건하에서 고체 수지 지지체(도 3e)로부터 절단된다. 고체 수지 지지체로부터 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물의 절단은 용액에서 상응하는 유리 양이온성 펩타이드 화합물을 생성한다.
예를 들어, 고체 수지 지지체로부터 펩타이드-함유 용액의 여과 및 고체 생성물을 제공하기 위한 단리된 여과액의 동결건조를 포함하여, 용액으로부터 양이온성 펩타이드 화합물을 단리 및 정제하기 위한 추가의 단계가 수행될 수 있다.
수지 절단을 수행하기 위해 사용되는 산성 조건으로 인해, 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물은 상응하는 산성염 형태로 존재할 수 있음을 인식하여야 한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물은 이의 염 형태이다. 소정의 실시형태에서, 염 형태는 산 부가염이다. 일부 실시형태에서, 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물의 염은 하이드로클로라이드염(염산 부가염), 하이드로브로마이드염(브롬화수소산 부가염 또는 트라이플루오로아세테이트염(트라이플루오로아세트산 부가염)이다. 소정의 실시형태에서, 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물의 염은 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물의 트라이플루오로아세트산 부가염 또는 트라이플루오로아세테이트염이다.
3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물의 산 부가염 형태는 하나 이상의 약제학적으로 허용 가능한 염 형태를 얻기 위해 당업계의 방법(예를 들어, 이온 교환)을 통해 더 변형될 수 있다. 문구 "약제학적으로 허용 가능한"은 물질 또는 조성물이 제형을 포함하는 다른 성분 및/또는 제형이 투여되는 대상체와 화학적으로 및/또는 독성학적으로 양립할 수 있어야 함을 나타낸다. 용어 "약제학적으로 허용 가능한 산 부가염"은 염산, 브롬화수소산, 요오드화수소산, 황산, 질산, 탄산, 인산과 같은 무기산 및 지방족, 사이클로지방족, 방향족, 아릴-지방족, 헤테로고리형, 카복실산으로부터 선택되는 유기산 및 설폰산 부류의 유기산, 예컨대 폼산, 아세트산, 프로피온산, 글루콘산, 락트산, 피루브산, 옥살산, 말레산, 말론산, 석신산, 퓨마르산, 타타르산, 시트르산, 아스파르트산, 아스코르브산, 글루탐산, 벤조산, 페닐아세트산, 메테인설폰산 "메실레이트", 에테인설폰산, p-톨루엔설폰산 및 살리실산으로 형성된 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다.
일부 실시형태에서, 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물의 염은 약제학적으로 허용 가능한 염이다. 소정의 실시형태에서, 염은 하이드로클로라이드염, 하이드로브로마이드염, 하이드로아이오다이드염, 나이트레이트염, 설페이트염, 바이설페이트염, 포스페이트염, 산성 포스페이트염, 포메이트염, 아세테이트염, 프로피오네이트염, 글루코네이트염, 락테이트염, 피루베이트염, 옥살레이트염, 말리에이트염, 말로네이트염, 석시네이트염, 퓨마레이트염, 타타레이트염, 바이타타레이트염, 시트레이트염, 아스파테이트염, 아스코르베이트염, 글루타메이트염, 벤조에이트염, 메테인설포네이트염, 에테인설포네이트, p-톨루엔설포네이트염 또는 살리실레이트염이다.
리피토이드
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 복합체 및 조성물의 하나 이상의 지질화 양이온성 펩타이드 화합물은 리피토이드로도 알려진 하나 이상의 양이온성 펩토이드-인지질 접합체 작제물을 포함한다. 리피토이드는 펩토이드 골격을 따라 글리신 잔기의 N-위치에 양이온성 및/또는 중성 측쇄의 조합을 갖는 N-치환된 폴리글리신 화합물("펩토이드"로도 알려짐)이며, 이는 펩토이드 사슬의 단일 말단 인지질기에 추가로 접합되고, 이들의 합성은 일반적으로 문헌[Simon R.J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 9367-9371 (1992); Lobo, B. A.; Vetro, J. A.; Suich, D. M.; Zuckermann, R. N.; Middaugh, C. R. Structure/Function Analysis of Pepid/Lipiid:DNA Complexes. Journal of Pharmaceutical Sciences 2003, 92 (9), 1905-1918; 및 Utku, Y.; Dehan, E.; Ouerfelli, O.; Piano, F.; Zuckermann, R. N.; Pagano, M.; Kirshenbaum, K. A Peptidomimetic SiRNA Transfection Reagent for Highly Effective Gene Silencing. Molecular BioSystems 2006, 2 (6-7), 312]에 기재되어 있다. 예시적인 리피토이드는 도 1에 도시된 바와 같은 노나머(nonamer)인 "리피토이드 1" 이다. 리피토이드 화합물의 일반 구조는 아래 화학식 (II)에 나타나 있되, x는 1 내지 100의 정수이고, 각각의 R9는 독립적으로 지질 모이어티이며, 각각의 R10은 독립적으로 양이온성 또는 중성 모이어티이다.
Figure pct00174
위의 화학식 (II)에서, x는 1 내지 100의 정수이다. 특정 수의 잔기는 본 명세서에 기재된 복합체 및 조성물에 사용하기에 특히 적합할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, x는 1 내지 50, 2 내지 25 또는 3 내지 15의 정수이다.
위의 화학식 (II)에 나타낸 바와 같이, R9는 약 6 내지 약 50개의 탄소 원자 또는 약 10 내지 약 50개의 탄소 원자를 갖고, 선택적으로 하나 이상의 헤테로원자를 포함하고, 선택적으로 하나 이상의 이중 또는 삼중 결합(즉, 포화 또는 단일- 또는 다중-불포화)을 포함하는 분지쇄 또는 직쇄 지방족 모이어티를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 지질 모이어티를 나타낸다. 소정의 실시형태에서, 지질 모이어티 R9는 선택적으로 치환된 지방족, 직쇄 또는 분지쇄 모이어티를 포함할 수 있으며, 각각의 소수성 꼬리는 독립적으로 약 8 내지 약 30개의 탄소 원자 또는 약 6 내지 약 30개의 탄소 원자를 갖는다. 소정의 실시형태에서, 지질 모이어티는 예를 들어, 지방산 및 지방 알코올로부터 유래되는 지방족 탄소 사슬을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 각각의 지질 모이어티 R9는 독립적으로 C8-C24-알킬 또는 C8-C24-알켄일이되, C8-C24-알켄일은 선택적으로 단일- 또는 다중-불포화된다. 다른 실시형태에서, 각각의 지질 모이어티 R9는 올레일, 스테아릴, 리놀레일, 미리스틸 및 라우릴로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다. 임의의 선행하는 실시형태와 조합될 수 있는 또 다른 실시형태에서, 각각의 지질 모이어티 R9는 독립적으로
Figure pct00175
,
Figure pct00176
,
Figure pct00177
,
Figure pct00178
,
Figure pct00179
,
Figure pct00180
,
Figure pct00181
,
Figure pct00182
,
Figure pct00183
,
Figure pct00184
,
Figure pct00185
,
Figure pct00186
,
Figure pct00187
,
Figure pct00188
또는
Figure pct00189
이다.
아미노 글리신 잔기의 N-위치에 있는 R10기(들)는 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물에 대해 위에 기재된 것들과 유사한 양이온성 및 중성 모이어티를 포함한다.
양이온성 또는 양으로 하전된 모이어티는 예를 들어, 다음의 작용기를 함유하는 것들과 같은 질소-기반 치환기를 포함할 수 있다: 아미노, 구아니디노, 하이드라지도 및 아미디노. 이러한 작용기는 방향족, 포화된 고리형 또는 지방족일 수 있다. 리피토이드의 일부 실시형태에서, 각각의 양이온성 모이어티는 독립적으로 아미노알킬, 알킬아미노알킬, 아미노알킬아미노알킬, 구아니디노알킬 또는 N-헤테로사이클릴알킬이다. 다른 실시형태에서, 각각의 양이온성 모이어티는 독립적으로
Figure pct00190
,
Figure pct00191
,
Figure pct00192
,
Figure pct00193
,
Figure pct00194
,
Figure pct00195
,
Figure pct00196
,
Figure pct00197
,
Figure pct00198
,
Figure pct00199
,
Figure pct00200
,
Figure pct00201
,
Figure pct00202
,
Figure pct00203
,
Figure pct00204
,
Figure pct00205
,
Figure pct00206
,
Figure pct00207
,
Figure pct00208
또는
Figure pct00209
이다. 소정의 실시형태에서, 각각의 양이온성 모이어티는
Figure pct00210
,
Figure pct00211
,
Figure pct00212
,
Figure pct00213
,
Figure pct00214
및
Figure pct00215
로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다. 또 다른 실시형태에서, 각각의 양이온성 모이어티는
Figure pct00216
이다.
중성 모이어티는 사이클로알킬, 헤테로사이클릴알킬, 알킬아릴, 아릴알킬, 알킬헤테로아릴, 헤테로아릴알킬, 알콕시, 알콕시알킬 또는 하이드록시알킬로 치환된 C1-C4-알킬을 포함할 수 있지만 이들로 제한되지 않되, 각각의 사이클로알킬, 헤테로사이클릴알킬, 알킬아릴, 아릴알킬, 알킬헤테로아릴, 헤테로아릴알킬, 알콕시, 알콕시알킬 또는 하이드록시알킬은 하나 이상의 치환기 -OH, 할로 또는 알콕시로 선택적으로 치환된다. 리피토이드의 일부 실시형태에서, 각각의 중성 모이어티는
Figure pct00217
,
Figure pct00218
,
Figure pct00219
및
Figure pct00220
로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다. 소정의 실시형태에서, 각각의 중성 스페이서 모이어티는
Figure pct00221
이다. 또 다른 실시형태에서, 각각의 중성 스페이서 모이어티는
Figure pct00222
이다.
또 다른 실시형태에서, 각각의 양이온성 모이어티는
Figure pct00223
이고, 각각의 중성 스페이서 모이어티는
Figure pct00224
이다. 또 다른 추가의 실시형태에서, 하나 이상의 리피토이드는 리피토이드 1을 포함한다.
위의 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물과 유사하게, 본 명세서에 기재된 리피토이드는 랜덤 서열로 배열된 아미노산 잔기 또는 교호 서열 또는 블록 서열의 반복 모티프를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 화학식 (II)의 리피토이드는 x 잔기의 사슬 내에 반복(이량체, 삼량체, 사량체 등) 서브유닛을 포함할 수 있다. 이러한 서브유닛은 -R양이온R중성- 또는 -R양이온R중성R중성-을 포함할 수 있지만 이로 제한되지 않되, R양이온은 양이온성 모이어티를 포함하는 아미노산 잔기이고, 각각의 R중성은 중성 스페이서 모이어티를 포함하는 아미노산 잔기이다. 다른 실시형태에서, 화학식 (II)의 리피토이드는 적어도 하나 삼량체 서브유닛 -R양이온-R중성-R중성을 포함하되, R양이온은 양이온성 모이어티를 포함하는 아미노산 잔기이고, 각각의 R중성은 중성 스페이서 모이어티를 포함하는 아미노산 잔기이다.
화학식 (II)의 리피토이드가 양이온성 도메인을 포함하는 일부 실시형태에서, 각각의 양이온성 모이어티 R10은
Figure pct00225
이다. 전술한 실시형태의 다른 실시형태에서, 각각의 양이온성 모이어티 R10은
Figure pct00226
이고, 각각의 중성 스페이서 모이어티 R10은
Figure pct00227
이다. 소정의 실시형태에서, 화학식 (II)의 리피토이드는 하나 이상의 이량체 또는 삼량체 서브유닛을 포함하되, 각각의 양이온성 모이어티는
Figure pct00228
이고, 각각의 중성 스페이서 모이어티는
Figure pct00229
이다. 또 다른 실시형태에서, 화학식 (II)의 리피토이드는 하나 이상의 삼량체 서브유닛 -R양이온R중성R중성-을 포함하는 양이온성 도메인을 포함하되, R양이온은 양이온성 모이어티를 포함하는 아미노산 잔기이고, 각각의 R중성은 중성 스페이서 모이어티를 포함하는 아미노산 잔기이며, 각각의 양이온성 모이어티는
Figure pct00230
이고, 각각의 중성 스페이서 모이어티는
Figure pct00231
이다.
3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물과 마찬가지로, 본 명세서에 기재된 복합체 및 조성물은 하나 이상의 리피토이드를 포함할 수 있다. 소정의 실시형태에서, 하나 이상의 양이온성 화합물은 하나 이상의 리피토이드를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 하나 이상의 양이온성 화합물은 리피토이드 1을 포함한다.
다른 지질 성분
카고로서 하나 이상의 다중음이온성 화합물의 전하 중화를 위해 1차 지질 성분으로 사용되는 지질화 양이온성 펩타이드 화합물에 더하여, 다성분 지질 조성물 및 그 안의 복합체는 구조적 지질, 인지질 및 차폐 지질을 포함하는 다른 지질 성분을 포함할 수 있다. 본 명세서에 기재된 추가적인 지질 성분은 용액에서 이들의 투여를 용이하게 하고, 복합체의 세포로의 흡수를 촉진하는 양이온성 펩타이드 화합물 및 다중음이온성 물질의 복합체에 물리적 구조 및 안정성을 제공한다.
구조적 지질
다성분 조성물 내의 다중음이온성 화합물의 복합체에 물리적 안정성을 부여하고, 표적 세포와의 결합 및 엔도사이토시스를 촉진하기 위해 복합체의 친유성 특성을 향상시키기 위해 본 명세서에 기재된 바와 같은 구조적 지질이 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 조성물은 지질 성분으로서 선택적으로 하나 이상의 구조적 지질을 포함하는 복합체를 포함한다. 일부 변형에서, 조성물은 하나 이상의 구조적 지질을 포함하는 복합체를 포함한다.
본 개시내용의 조성물 및 복합체에 적합한 구조적 지질은 스테롤을 포함할 수 있지만, 이로 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 구조적 지질은 콜레스테롤, 페코스테롤, 시토스테롤, 에르고스테롤, 캄페스테롤, 스티그마스테롤, 브라시카스테롤, 토마티딘, 우르솔산, 알파-토코페롤 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된다. 소정의 실시형태에서, 구조적 지질은 콜레스테롤이다.
그러나, 본 개시내용의 일부 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 조성물 및 복합체는 구조적 지질을 함유하지 않지만 여전히 매우 우수한 전달 효율을 나타냄에 유의하여야 한다. 소정의 다른 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 조성물 및 복합체는 구조적 지질을 함유하지 않는다.
(양성이온성) 인지질 또는 양성이온성 지질
위에 기재된 구조적 지질과 마찬가지로 인지질은 또한 본 개시내용의 복합체 및 조성물에 혼입될 수 있다. 인지질은 용액 내 복합체에 대한 추가 안정화를 제공할 뿐만 아니라 이의 양친매성 특성 및 세포막을 파괴하는 능력에 의해 세포 엔도사이토시스를 촉진한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 조성물은 지질 성분으로서 하나 이상의 인지질을 포함하는 복합체를 포함한다. 소정의 실시형태에서, 하나 이상의 인지질은 하나 이상의 양성이온성(zwitterionic) 인지질을 포함한다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 인지질은 1,2-다이리놀레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DLPC), 1,2-다이미리스토일-sn-글리세로-포스포콜린(DMPC), 1,2-다이올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC), 1,2-다이팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DPPC), 1,2-다이스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC), 1,2-다이운데카노일-sn-글리세로-포스포콜린(DUPC), 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(POPC), 1,2-다이-O-옥타데센일-sn-글리세로-3-포스포콜린(18:0 다이에터 PC), 1-올레오일-2-콜레스테릴헤미석시노일-sn-글리세로-3-포스포콜린(OChemsPC), 1-헥사데실-sn-글리세로-3-포스포콜린(C 16 Lyso PC), 1,2-다이리놀레노일-sn-글리세로-3-포스포콜린, 1,2-다이아라키도노일-sn-글리세로-3-포스포콜린, 1,2-다이도코사헥사에노일-sn-글리세로-3-포스포콜린, 1,2-다이올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE),1,2-다이팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DPPE), 1,2-다이피타노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(ME 16.0 PE), 1,2-다이스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민, 1,2-다이리놀레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민, 1,2-다이리놀레노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민, 1,2-다이아라키도노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민, 1,2-다이도코사헥사에노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민, 1,2-다이올레오일-sn-글리세로-3-포스포-rac-(1-글리세롤) 소듐염(DOPG), 스핑고마이엘린 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된다. 소정의 실시형태에서, 인지질은 DOPE이다.
엔도사이토시스를 위한 세포막의 파괴를 촉진하기 위해 인지질에 의해 제공되는 양친매성은 대안적으로 인지질이 아닌 양성이온성 지질에 의해 제공될 수 있음을 인식하여야 한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 인지질이 아닌 하나 이상의 양성이온성 지질을 포함하는 복합체를 포함한다. 여전히 추가의 실시형태에서, 조성물은 하나 이상의 인지질, 하나 이상의 양성이온성 지질 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 복합체를 포함한다.
차폐 지질
본 명세서에 기재된 바와 같이, 본 개시내용의 복합체 및 조성물은 하나 이상의 차폐 지질을 더 포함할 수 있다. 페길화 지질과 같은 차폐 지질은 하나 이상의 다중음이온성 화합물에 대한 반대전하로서 하나 이상의 지질화 양이온성 펩타이드 화합물에 대한 추가적인 전하 중화의 층을 제공하고, 세포 식세포성 프로세스에 의한 청소를 방지할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 조성물은 지질 성분으로서 하나 이상의 차폐 지질을 포함하는 복합체를 포함한다.
일부 실시형태에서, 차폐 지질은 PEG 지질이다. 다른 실시형태에서, PEG 지질은 PEG-변형된 포스파티딜에탄올아민, PEG-변형된 포스파티드산, PEG-변형된 세라마이드, PEG-변형된 다이알킬아민, PEG-변형된 다이아실글리세롤, PEG-변형된 다이알킬글리세롤 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, PEG 지질은 PEG-변형된 DSPE(DSPE-PEG), PEG-변형된 DPPE(DPPE-PEG) 및 PEG-변형된 DOPE(DOPE-PEG)로 이루어진 군으로부터 선택되는 PEG-변형된 포스파티딜에탄올이다. 소정의 실시형태에서, PEG 지질은 다이미리스토일글리세롤-폴리에틸렌 글리콜(DMG-PEG), 다이스테아로일글리세롤-폴리에틸렌 글리콜(DSG-PEG), 다이팔미토일글리세롤-폴리에틸렌 글리콜(DPG-PEG) 및 다이올레오일글리세롤-폴리에틸렌 글리콜(DOG-PEG)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 소정의 실시형태에서, PEG 지질은 DMG-PEG이다.
전술한 PEG 지질에서 특정 분자량의 PEG 사슬이 본 개시내용의 복합체로의 혼입에 특히 유리할 수 있다는 것이 추가로 인식되어야 한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, PEG 사슬은 350 내지 6,000 g/㏖, 1,000 내지 5,000 g/㏖ 또는 2,000 내지 5,000 g/㏖의 분자량을 갖는다. 소정의 실시형태에서, PEG 지질의 PEG 사슬은 약 350 g/㏖, 500 g/㏖, 600 g/㏖, 750 g/㏖, 1,000 g/㏖, 2,000 g/㏖, 3,000 g/㏖, 5,000 g/㏖ 또는 10,000 g/㏖의 분자량을 갖는다. 소정의 다른 실시형태에서, PEG 지질의 PEG 사슬은 약 500 g/㏖, 750 g/㏖, 1,000 g/㏖, 2,000 g/㏖ 또는 5,000 g/㏖의 분자량을 갖는다. 예를 들어, 소정의 실시형태에서, 페길화 지질은 다이미리스토일글리세롤-폴리에틸렌 글리콜 2000(DMG-PEG 2000)이다.
여전히 추가의 실시형태에서, 하나 이상의 PEG 지질은 적어도 하나의 올리고- 또는 폴리에틸렌 글리콜 모이어티를 포함하는 화학식 (I)의 3차 아미노 페길화 양이온성 펩타이드 화합물을 포함한다. 펩타이드 사슬의 골격을 따라 지질 및 PEG 모이어티 모두를 수용하는 가요성에 의해, 그리고 특정 치환기의 특성에 따라, 본 개시내용의 화학식 (I)의 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물은 지질화 양이온성 펩타이드 화합물로 작용할 뿐만 아니라 양이온성 화합물-다중음이온성 화합물 복합체를 안정화시키기 위한 적합한 차폐 지질로도 작용할 수 있다. 화학식 (I)의 3차 아미노 페길화 양이온성 펩타이드 화합물은 화학식 (I)의 다른 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물뿐만 아니라 리피토이드 또는 지질-유사 화합물과 같은 다르 부류의 양이온성 화합물과 조합될 수 있음을 인식하여야 한다.
일부 실시형태에서, PEGy 지질은 본 명세서에 기재된 바와 같은 화학식 (I)의 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물이되, m 및 t 중 적어도 하나는 0이 아니다(즉, N-페길화). 여전히 추가의 실시형태에서, PEG 지질은 화학식 (I)의 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물이되, m 및 t는 독립적으로 0 내지 10의 정수이고, m 및 t 중 적어도 하나는 0이 아니다. 일부 실시형태에서, PEG 지질은 화학식 (Ib)의 3차 아미노 페길화 양이온성 펩타이드 화합물이다. 또 다른 실시형태에서, PEG 지질은 화학식 (Ic)의 3차 아미노 지질화 및 페길화 양이온성 화합물이다.
위에 기재된 PEG 지질과 마찬가지로, 전술한 3차 아미노 지질화 및 페길화 양이온성 펩타이드 화합물에서 특정 분자량의 PEG 사슬은 본 개시내용의 복합체로의 혼입에 특히 유리할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, PEG 사슬은 350 내지 6,000 g/㏖, 1,000 내지 5,000 g/㏖ 또는 2,000 내지 5,000 g/㏖의 분자량을 갖는다. 소정의 실시형태에서, 3차 아미노 지질화 및 페길화 양이온성 펩타이드 화합물의 PEG 사슬은 약 350 g/㏖, 500 g/㏖, 600 g/㏖, 750 g/㏖, 1,000 g/㏖, 2,000 g/㏖, 3,000 g/㏖ 또는 5,000 g/㏖의 분자량을 갖는다. 소정의 다른 실시형태에서, PEG 지질의 PEG 사슬은 약 500 g/㏖, 750 g/㏖, 1,000 g/㏖, 2,000 g/㏖ 또는 5,000 g/㏖의 분자량을 갖는다.
그러나, 화학식 (I)의 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물은 더 적은 수의 더 긴 폴리에틸렌 글리콜 모이어티 대신에 여러 개의 짧은 올리고에틸렌 글리콜 모이어티를 포함할 수 있고, 복합체에 유사한 입자 안정화를 제공할 수 있음을 인식하여야 한다. 페길화 화합물이 화학식 (I)의 N-페길화 양이온성 펩타이드 화합물인 일부 실시형태에서, 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물은 화학식 -CH2CH2O(CH2CH2O)uR2a의 적어도 하나의 에틸렌 글리콜 모이어티 R2를 포함하되, 각각의 R2a는 독립적으로 -H 또는 C1-C4-알킬이다. 다른 실시형태에서, 화학식 -CH2CH2O(CH2CH2O)vR6a의 적어도 하나의 에틸렌 글리콜 모이어티 R6에서, 각각의 R6a는 독립적으로 -H 또는 C1-C4-알킬이다. m이 0이 아니고, m이 0 내지 10의 정수인 임의의 선행하는 실시형태와 조합될 수 있는 일부 실시형태에서, 각각의 u는 독립적으로 2 내지 200의 정수이다. t가 0이 아니고, t가 0 내지 10의 정수인 임의의 선행하는 실시형태와 조합될 수 있는 여전히 추가의 실시형태에서, 각각의 v는 독립적으로 2 내지 200의 정수이다.
일부 실시형태에서, PEG 지질은 본 명세서에 기재된 바와 같은 화학식 (I)의 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물이되, m 및 t 중 적어도 하나는 0이 아니고, n 및 s 중 적어도 하나는 0이 아니다(즉, N-지질화). 화학식 (I)의 N-페길화 양이온성 펩타이드 화합물이 또한 N-지질화된 소정의 실시형태에서, n 및 s 중 적어도 하나는 0이 아니다. 일부 실시형태에서, n 및 s의 합은 적어도 1, 2, 3 또는 4이다. 소정의 실시형태에서, s는 4이다. 다른 추가의 실시형태에서, n은 4이다.
다중음이온성 화합물
본 명세서에 기재된 바와 같이, 본 개시내용의 지질화 양이온성 펩타이드 화합물을 포함하는 본 명세서에 기재된 다성분 지질 조성물은 핵산과 같은 하나 이상의 다중음이온성 화합물과의 복합체화에 유용할 수 있다. 일 양태에서, 본 개시내용은 하나 이상의 지질화 양이온성 펩타이드 화합물 및 2개 이상의 다른 지질 성분에 복합체화된 본 명세서에 기재된 바와 같은 하나 이상의 다중음이온성 화합물을 포함하는 복합체를 포함하는 조성물을 제공한다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 다중음이온성 화합물은 핵산을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 핵산은 DNA, RNA 및/또는 이들의 하이브리드와 같은 자연 발생적 핵산뿐만 아니라 비천연 골격 및 변형된 골격 연결, 예컨대 포스포로티오에이트, 비천연 및 변형된 염기 및 비천연 및 변형된 말단을 갖는 비자연 발생적 변이를 포함한다. 예시적인 핵산은 게놈 DNA, cDNA, mRNA, miRNA 및 siRNA를 포함한다.
핵산은 재조합으로 생산되거나 또는 화학적으로 합성된 분자일 수 있다. 핵산은 단일-가닥, 이중-가닥, 삼중 가닥 및 사중 가닥뿐만 아니라 단일 및 이중 가닥 영역을 포함하는 더 복잡한 3차원 형태일 수 있다.
핵산의 유형에 따라, 핵산의 길이(적절하게 뉴클레오타이드 단위 또는 염기 쌍(bp)으로 정의됨)는 달라질 수 있다. 핵산이 mRNA인 일부 실시형태에서, mRNA는 100 내지 10,000개의 뉴클레오타이드 단위 또는 1,000 내지 3,000개의 뉴클레오타이드 단위를 가질 수 있다. 핵산이 DNA인 다른 실시형태에서, DNA는 5,000bp 내지 20,000bp 또는 약 10,000bp를 가질 수 있다.
핵산이 mRNA인 일부 실시형태에서, mRNA는 단백질 또는 펩타이드를 암호화하는 mRNA이다. 핵산이 mRNA인 일부 실시형태에서, mRNA는 올리고펩타이드 또는 폴리펩타이드를 포함하는 펩타이드를 암호화하는 mRNA이다. 소정의 실시형태에서, mRNA는 폴리펩타이드를 암호화하는 mRNA이다. 다른 추가의 실시형태에서, mRNA는 단백질을 암호화하는 mRNA이다. 다른 실시형태에서, mRNA는 펩타이드를 암호화하는 mRNA이다. 위에 기재된 바와 같이, mRNA는 자연 발생적(예를 들어, 단리된 종양 RNA)일 수 있거나 또는 합성적(예를 들어, 시험관내 전사에 의해 생성됨)일 수 있다. mRNA의 합성적 또는 비자연 발생적 변이의 경우, mRNA는 변형된 골격 연결, 예컨대 포스포로티오에이트, 비천연 및 변형된 염기 및/또는 비천연 및 변형된 말단을 갖는 비천연 골격을 포함할 수 있다. 핵산이 mRNA인 소정의 실시형태에서, mRNA는 자가-증폭 서열 또는 내부 리보솜 진입 부위와 같은 특수 서열을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 2개 이상의 특정 핵산을 함께 전달하는 조합은 치료적 적용에 특히 유용할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 하나 이상의 다중음이온성 화합물은 CRISPR 서열로서 sgRNA(단일 가이드 RNA) 및 Cas9를 암호화하는 mRNA의 조합을 포함한다. 여전히 추가의 실시형태에서, 핵산은 또한 CRISPR/Cas9 리보뉴클레오단백질 복합체와 같은 단백질과 복합체화될 수 있다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 다중음이온성 화합물은 핵산이 아닌 음이온성 또는 다중음이온성 화합물을 포함할 수 있다. 적합한 음이온성 화합물은 단백질, 폴리포스페이트 또는 헤파린을 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 다중음이온성 화합물은 하나 이상의 단백질을 포함한다. 일 실시형태에서, 하나 이상의 다중음이온성 화합물은 Cas9 단백질을 포함한다. 다른 실시형태에서, 하나 이상의 다중음이온성 화합물은 폴리포스페이트를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 하나 이상의 다중음이온성 화합물은 헤파린 또는 다른 글리코사미노글리칸 유도체를 포함한다.
본 명세서에 기재된 다른 지질 성분을 갖는 지질화 양이온성 펩타이드 화합물을 포함하는 다성분 지질 제형은 또한 세포로 전달하기 위한 다른 비-음이온성 작용제 또는 카고(소수성 화합물을 포함)와 복합체를 형성하는데 활용될 수 있다. 이러한 다른 카고는 예를 들어, 하나 이상의 소분자 활성제 또는 약물 물질(독립형 치료제 또는 핵산과 같은 다른 작용제와의 조합으로) 및/또는 면역학적 보조제를 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다. 이러한 다른 카고 분자는 복합체화를 위해 본 명세서에 기재된 임의의 다중음이온성 화합물과 조합될 수 있거나 조합되지 않을 수 있음을 추가로 인식하여야 한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 복합체는 엔도솜 탈출 조절인자(endosomal escape modular), TLR 효현제 및 화학요법을 포함한다. 다른 실시형태에서, 본 개시내용의 복합체는 보조제 또는 면역 보조-자극인자를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 복합체는 CpG 올리고데옥시뉴클레오타이드(ODN), 리포폴리사카라이드(LPS) 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 면역학적 보조제를 포함한다.
복합체 및 조성물의 특성
위에 기재된 바와 같이, 본 개시내용의 조성물은 하나 이상의 다중음이온성 화합물 및 지질 성분을 포함하는 복합체를 포함하되, 지질 성분은 하나 이상의 지질화 양이온성 펩타이드 화합물, 하나 이상의 인지질, 하나 이상의 차폐 지질 및 선택적으로 하나 이상의 구조적 지질을 포함한다. 본 명세서에 기재된 복합체 및 조성물의 물리적 특성은 주어진 다중음이온성 화합물에 대한 지질 성분의 특정 선택에 의해서뿐만 아니라 복합체 및 조성물 내의 각각의 성분의 양에 의해서도 영향을 받을 수 있다. 일부 실시형태에서, 복합체 및 이의 조성물 내의 지질 성분은 존재하는 총 지질 성분의 질량에 대한 지질 성분(단독 또는 조합으로)의 질량 백분율 및/또는 서로에 대한 개별적인 지질 성분의 질량비를 특징으로 할 수 있다
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 조성물은 존재하는 지질 성분의 질량 백분율을 특징으로 한다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 지질 성분의 총 질량 또는 중량은 존재하는 임의의 지질화 양이온성 펩타이드 화합물, 임의의 구조적 지질, 임의의 인지질 및 임의의 차폐 지질의 개별 질량의 합이다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 조성물은 하나 이상의 지질화 양이온성 펩타이드 화합물을 포함하는 복합체를 포함한다. 전술한 일부 변형에서, 조성물 및 그 안의 복합체는 지질 성분의 총 중량의 40% 내지 80% w/w의 하나 이상의 지질화 양이온성 펩타이드 화합물을 포함한다. 소정의 변형에서, 조성물 및 그 안의 복합체는 지질 성분의 총 중량의 40% 내지 70% w/w의 하나 이상의 지질화 양이온성 펩타이드 화합물을 포함한다. 전술한 다른 변형에서, 조성물 및 그 안의 복합체는 지질 성분의 총 중량의 40% 내지 80% w/w의 화학식 (I)의 하나 이상의 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물 또는 이의 염을 포함한다. 소정의 변형에서, 조성물 및 그 안의 복합체는 지질 성분의 총 중량의 40% 내지 70% w/w의 화학식 (I)의 하나 이상의 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물 또는 이의 염을 포함한다. 전술한 또 다른 변형에서, 조성물 및 그 안의 복합체는 지질 성분의 총 중량의 40% 내지 80% w/w의 화학식 (II)의 하나 이상의 리피토이드를 포함한다. 소정의 변형에서, 조성물 및 그 안의 복합체는 지질 성분의 총 중량의 40% 내지 70% w/w의 화학식 (II)의 하나 이상의 리피토이드를 포함한다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, 복합체를 포함하는 조성물은 선택적으로 하나 이상의 구조적 지질을 포함할 수 있다. 임의의 전술한 실시형태와 조합될 수 있는 일부 실시형태에서, 조성물 및 그 안의 복합체는 지질 성분의 총 중량의 0% 내지 25% w/w의 하나 이상의 구조적 지질을 포함한다. 소정의 변형에서, 조성물 및 그 안의 복합체는 지질 성분의 총 중량의 0% 내지 25% w/w의 콜레스테롤을 포함한다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 조성물 및 복합체는 또한 하나 이상의 인지질을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 조성물 및 그 안의 복합체는 지질 성분의 총 중량의 10% 내지 60% w/w의 하나 이상의 인지질을 포함한다. 소정의 변형에서, 조성물 및 그 안의 복합체는 지질 성분의 총 중량의 20% 내지 40% w/w의 하나 이상의 인지질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 조성물 및 그 안의 복합체는 지질 성분의 총 중량의 10% 내지 60% w/w의 1,2-다이올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE)을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 조성물 및 그 안의 복합체는 지질 성분의 총 중량의 20% 내지 40% w/w의 1,2-다이올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE)을 포함한다.
추가의 실시형태에서, 조성물 및 그 안의 복합체는 하나 이상의 차폐 지질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 조성물 및 그 안의 복합체는 지질 성분의 총 중량의 1% 내지 5%의 하나 이상의 차폐 지질을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 조성물 및 그 안의 복합체는 지질 성분의 총 중량의 1% 내지 5%의 하나 이상의 PEG 지질을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 조성물 및 그 안의 복합체는 지질 성분의 총 중량의 1% 내지 5%의 1,2-다이미리스토일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌 글리콜(DMG-PEG)을 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 본 개시내용의 조성물 및 그 안의 복합체는 지질 성분의 총 중량의, 40% 내지 80% w/w의 하나 이상의 지질화 양이온성 펩타이드 화합물; 0% 내지 25% w/w의 하나 이상의 구조적 지질; 10% 내지 60% w/w의 인지질; 및 1% 내지 5%의 하나 이상의 차폐 지질을 포함한다. 또 다른 추가의 실시형태에서, 본 개시내용의 조성물 및 그 안의 복합체는 지질 성분의 총 중량의, 40% 내지 70% w/w의 하나 이상의 지질화 양이온성 펩타이드 화합물; 0% 내지 25% w/w의 하나 이상의 구조적 지질; 20% 내지 40% w/w의 인지질; 및 1% 내지 5%의 하나 이상의 차폐 지질을 포함한다.
다른 실시형태에서, 본 개시내용의 조성물 및 그 안의 복합체는 지질 성분의 총 중량의, 40% 내지 80% w/w의 화학식 (I)의 하나 이상의 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물 또는 이의 염; 0% 내지 25% w/w의 콜레스테롤; 10% 내지 60% w/w의 DOPE; 및 1% 내지 5%의 DMG-PEG2000을 포함한다. 다른 추가의 실시형태에서, 본 개시내용의 조성물 및 그 안의 복합체는 지질 성분의 총 중량의, 40% 내지 70% w/w의 화학식 (I)의 하나 이상의 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물 또는 이의 염; 0% 내지 25% w/w의 콜레스테롤; 20% 내지 40%의 w/w의 DOPE; 및 1% 내지 5%의 DMG-PEG2000을 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 본 개시내용의 조성물 및 그 안의 복합체는 지질 성분의 총 중량의, 40% 내지 80% w/w의 화학식 (II)의 하나 이상의 리피토이드; 0% 내지 25% w/w의 콜레스테롤; 10% 내지 60% w/w의 DOPE; 및 1% 내지 5%의 DMG-PEG2000을 포함한다. 또 다른 추가의 실시형태에서, 본 개시내용의 조성물 및 그 안의 복합체는 지질 성분의 총 중량의, 40% 내지 70% w/w의 화학식 (II)의 하나 이상의 리피토이드; 0% 내지 25% w/w의 콜레스테롤; 20% 내지 40% w/w의 DOPE; 및 1% 내지 5%의 DMG-PEG2000을 포함한다.
복합체가 지질화 양이온성 펩타이드 화합물, 핵산, 인지질, PEG 지질 및 선택적으로 또한 구조적 지질을 포함하는 일부 실시형태에서, 복합체는 서로에 대한 개별 성분의 질량비 또는 하나 이상의 성분 대 하나 이상의 다른 성분의 질량비를 특징으로 할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 조성물 및 복합체는 지질화 양이온성 펩타이드 화합물 대 인지질 대 구조적 지질(존재하는 경우) 대 차폐 지질의 제1 질량비 및 지질화 양이온성 펩타이드 화합물 대 핵산의 제2 질량비로 기재될 수 있다. 대안적으로, 다른 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 조성물 및 복합체는 총 지질 성분 대 핵산의 질량비로 기재될 수 있되, 총 지질 성분은 존재하는 임의의 지질화 양이온성 펩타이드 화합물, 구조적 지질, 인지질 및 차폐 지질을 포함한다.
다른 양태에서, 본 개시내용의 복합체 및 조성물은 서로에 대한 개별 성분의 질량비를 특징으로 할 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같이, 본 개시내용의 복합체는 하나 이상의 인지질 및 선택적으로 하나 이상의 구조적 지질을 포함한다. 조성물이 하나 이상의 구조적 지질 및 하나 이상의 인지질을 포함하는 복합체를 포함하는 일부 실시형태에서, 조성물은 하나 이상의 구조적 지질 대 하나 이상의 인지질의 질량비를 특징으로 할 수 있다. 일부 실시형태에서, 존재하는 경우 하나 이상의 구조적 지질 대 하나 이상의 인지질의 질량비는 0.5:1 내지 2:1이다. 조성물이 콜레스테롤 및 DOPE를 포함하는 소정의 실시형태에서, 콜레스테롤 대 DOPE의 질량비는 0.5:1 내지 2:1이다.
본 개시내용의 복합체 및 조성물에 존재하는 다중음이온성 화합물과 관련하여, 복합체 내의 다중음이온성 화합물의 양 및 그에 따른 조성물의 양은 다양한 방식으로 특징지어질 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 조성물 및 복합체는 지질화 양이온성 펩타이드 화합물 상의 양이온성기의 수 대 핵산 상의 음이온성 포스페이트기의 수의 비를 특징으로 할 수 있다. 일부 실시형태에서, 복합체는 0.5:1 내지 20:1, 0.5:1 내지 10:1, 0.5:1 내지 5:1, 1:1 내지 20:1, 1:1 내지 10:1, 1:1 내지 5:1, 2:1 내지 20:1, 2:1 내지 10:1 또는 2:1 내지 5:1의 양이온:음이온 전하 비로 지질화 양이온성 펩타이드 화합물 및 핵산을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 복합체는 2:1 내지 5:1의 양이온:음이온 전하 비로 지질화 양이온성 펩타이드 화합물 및 핵산을 포함한다. 여전히 또 다른 실시형태에서, 복합체는 3:1의 양이온:음이온 전하 비로 지질화 양이온성 펩타이드 화합물 및 핵산을 포함한다.
대안적으로, 본 명세서에 기재된 복합체 및 복합체를 포함하는 조성물은 지질화 양이온성 펩타이드 화합물(들) 대 다중음이온성 화합물(들) 및/또는 복합체 내의 다른 카고의 상대적 질량비를 특징으로 할 수 있다. 복합체 내 성분의 질량비는 복합체를 제조하는데 사용된 각 성분의 스톡 용액의 알려진 농도 및 부피에 기초하여 쉽게 계산될 수 있다. 더욱이, 비-음이온성 카고가 복합체에 존재하는 경우, 질량비는 전체 카고에 대한 지질화 양이온성 펩타이드 화합물의 상대적인 양을 비-음이온성 물질을 고려하지 않는 양이온:음이온 전하 비보다 더 정확하게 나타낼 수 있다.
일부 실시형태에서, 복합체는 0.5:1 내지 20:1, 0.5:1 내지 10:1, 0.5:1 내지 5:1, 1:1 내지 20:1, 1:1 내지 10:1, 1:1 내지 5:1, 2:1 내지 20:1, 2:1 내지 10:1 또는 2:1 내지 5:1의 질량비로 하나 이상의 지질화 양이온성 펩타이드 화합물 및 하나 이상의 다중음이온성 화합물 및/또는 비-음이온성 화합물을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 복합체는 2:1 내지 5:1의 질량비로 하나 이상의 지질화 양이온성 펩타이드 화합물 및 하나 이상의 다중음이온성 화합물 및/또는 비-음이온성 화합물을 포함한다. 여전히 또 다른 실시형태에서, 복합체는 3:1의 질량비로 하나 이상의 지질화 양이온성 펩타이드 화합물 및 하나 이상의 다중음이온성 화합물 및/또는 비-음이온성 화합물을 포함한다.
복합체가 핵산을 포함하는 소정의 실시형태에서, 복합체는 0.5:1 내지 20:1, 0.5:1 내지 10:1, 0.5:1 내지 5:1, 1:1 내지 20:1, 1:1 내지 10:1, 1:1 내지 5:1, 2:1 내지 20:1, 2:1 내지 10:1 또는 2:1 내지 5:1의 질량비로 지질화 양이온성 펩타이드 화합물 및 핵산을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 복합체는 2:1 내지 5:1의 질량비로 지질화 양이온성 펩타이드 화합물 및 핵산을 포함한다. 여전히 또 다른 실시형태에서, 복합체는 3:1의 질량비로 지질화 양이온성 펩타이드 화합물 및 핵산을 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 복합체 및 이의 조성물에 존재하는 다중음이온성 화합물의 양은 지질 성분(지질화 양이온성 펩타이드 화합물, 인지질, 차폐 지질 및 존재하는 경우 구조적 지질) 대 하나 이상의 다중음이온성 화합물의 질량비를 특징으로 할 수 있다. 일부 실시형태에서, 지질 성분 대 하나 이상의 다중음이온성 화합물의 질량비는 0.5:1 내지 20:1, 0.5:1 내지 10:1, 0.5:1 내지 5:1, 1:1 내지 20:1, 1:1 내지 10:1, 1:1 내지 5:1, 2:1 내지 25:1, 2:1 내지 20:1, 2:1 내지 10:1 또는 2:1 내지 5:1이다. 소정의 실시형태에서, 지질 성분 대 하나 이상의 다중음이온성 화합물의 질량비는 5:1 내지 10:1 또는 6:1 내지 7:1이다.
본 개시내용의 복합체는 적어도 하나 다중음이온성 화합물 또는 다른 적합한 카고 화합물과 복합체화된 적어도 하나 지질화 양이온성 펩타이드 화합물을 포함할 것이다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 복합체는 화학식 (I)의 하나 이상의 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물을 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 복합체는 화학식 (II)의 하나 이상의 리피토이드를 포함한다. 단일 복합체에서 본 개시내용의 다중 양이온성 펩타이드 화합물의 혼합물 및 조합의 사용은 특정 약동학적 및 약력학적 특성에 맞는 제형의 제조를 가능하게 할 수 있다. 관련있는 약동학적 및 약력학적 특성은 생체분포, 면역원성, 제형 안정성, 캡슐화 백분율, 형질감염 효율, 혈장 반감기 등을 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다. 이러한 특성의 상이한 조합이 다양한 응용 분야에 필요할 수 있다.
예를 들어, 소정의 실시형태에서, 복합체는 양이온이 풍부한 하나 이상의 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물과 고도로 지질화된 하나 이상의 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물의 조합을 포함할 수 있다. 이론적으로, 이러한 조합은 더 큰 친유성 차폐(지질화 펩타이드 화합물에 의해)와 함께 더 큰 전하 안정화(양이온이 풍부한 펩타이드 화합물을 통해)를 제공함으로써 다중음이온성 화합물의 개선된 전달을 제공할 수 있다. 각각의 개별적인 지질화 양이온성 펩타이드 화합물의 개별적인 양은 목적하는 특성을 달성하기 위해 조정될 수 있음을 추가로 인식하여야 한다.
추가적인 성분
다중음이온성 카고의 높은 캡슐화 및/또는 이의 표적화되고, 제어된 방출을 용이하게 하기 위해 추가적인 성분이 또한 복합체에 첨가될 수 있다. 이러한 추가적인 성분은 예를 들어, 폴리머 및 표면-활성 성분을 포함할 수 있다.
본 개시내용에서 제공되는 바와 같이, 복합체는 핵산 카고 및 기타 화합물을 세포로 전달하는데 유용한 추가의 성분을 포함할 수 있다. 이러한 성분은 예를 들어, 지질 나노입자와 유사한 슈퍼복합체 또는 다른 전달 시스템(예를 들어, 하이브리드 지질-폴리머 나노입자)을 함께 형성하는 성분을 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다.
본 명세서에 기재된 복합체에 폴리머를 혼입시키는 것은 폴리머성 나노입자 소포 또는 추가적인 지질 성분의 존재하에 하이브리드 지질-폴리머 나노입자를 형성함으로써 지질화 양이온성 펩타이드 화합물 및 다중음이온성 화합물을 포함하는 복합체를 안정화시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 복합체는 폴리머를 포함한다. 적합한 폴리머는 중성 폴리머(예컨대, 폴리(락틱-코-글리콜산)(poly(lactic-co-glycolic acid): PLGA) 또는 폴리글리콜산(PGA)), 음이온성 폴리머(폴리(아스파테이트), 폴리(글루타메이트) 및 헤파린을 포함) 및/또는 양이온성 폴리머(예를 들어, 폴리에틸렌이민, 프로타민)를 포함할 수 있다.
다른 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 복합체 및 조성물은 표적 리간드, 안정화제 및/또는 계면활성제와 같은 표면-활성 성분을 포함한다.
다른 양태에서, 본 개시내용은 본 명세서에 기재된 바와 같은 복합체를 포함하는 조성물을 포함하는 제형을 제공한다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 제형은 본 명세서에서 복합체를 제조하는데 사용된 스톡 용액의 혼합물뿐만 아니라 투여를 위해 사용되는 정제된 약제학적 제형을 포함한다. 본 개시내용의 복합체를 포함하는 제형은 또한 본 명세서에 기재된 바와 같은 복합체에 존재하는 성분을 반드시 포함할 것임을 이해하여야 한다.
일부 실시형태에서, 제형은 용액, 현탁액, 콜로이드성 현탁액, 스프레이 또는 에어로졸이다. 다른 실시형태에서, 제형은 지질 복합체 제형이다. 일부 실시형태에서, 제형은 경장(enteral) 제형, 비경구 제형 또는 국부 제형이다. 일부 실시형태에서, 제형은 정맥내 제형, 피하 제형, 근육내 제형, 피내 제형, 안내 제형 또는 경막내 제형과 같은 주사 가능한 제형이다. 다른 실시형태에서, 제형은 경구 제형이다. 또 다른 실시형태에서, 제형은 예를 들어, 비강 제형, 항문내 제형, 협측 제형 또는 질내 제형 등을 포함하는 점막 제형이다.
본 개시내용의 복합체 및 조성물에 대해 위에 기재된 바와 같이, 본 명세서에서 제공되는 조성물은 하나 이상의 지질화 양이온성 펩타이드 화합물, 하나 이상의 인지질, 하나 이상의 차폐 지질 및 선택적으로 하나 이상의 다중음이온성 화합물 및/또는 비-음이온성 화합물을 갖는 하나 이상의 구조적 지질을 포함할 수 있다. 지질화 양이온성 펩타이드, 다른 지질 성분 및 하나 이상의 다중음이온성 화합물 및/또는 비-음이온성 화합물 이외에, 약동학적 및 약력학적 특성을 조정하기 위해 여전히 추가의 성분이 제형에 포함될 수 있음을 인식하여야 한다.
본 개시내용의 복합체 및 제형을 제조하는데 사용되는 성분뿐만 아니라 상기 복합체 또는 제형을 제조하기 위한 공정 매개변수는 복합체 및/또는 제형이 즉시 사용("적시(just-in-time)")하거나 또는 추후 사용을 위해 보관소에 보관될 것인지 여부에 따라 조정될 수 있음을 추가로 인식하여야 한다. 특히, 보관을 위한 고려 사항은 복합체 및/또는 제형이 유지되는 온도(예를 들어, 실온, 4℃, -20℃, -78℃) 및 보관 기간을 포함할 수 있다.
적합한 부형제는 투여를 용이하게 하거나 또는 보관 안정성(예를 들어, 동해방지제)을 개선시키는 것을 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다. 예를 들어, 위에 기재된 성분에 더하여, 본 명세서에 기재된 제형은 담체, 용매, 분산제, 희석제, 충진제, 안정제, 방부제 등과 같은 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함할 수 있다.
복합체 및 이의 조성물을 제조하는 방법
지질화 양이온성 펩타이드 화합물, 다른 지질 성분 및 다중음이온성 화합물의 복합체 및 이의 조성물은 물리적, 화학적 및 생물학적 특성을 조절하기 위해 다양한 물리적 및/또는 화학적 방법을 통해 제조될 수 있다. 이는 전형적으로 물 또는 물-혼화성 유기 용매 중 지질화 양이온성 펩타이드 화합물(예를 들어, 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 또는 리피토이드)과 물 또는 수성 완충 용액 중 목적하는 다중음이온성 화합물(예를 들어, 올리고뉴클레오타이드)의 신속한 배합을 포함한다. 이러한 방법은 피펫팅에 의한 성분의 단순 혼합 또는 T-믹서, 볼텍싱 믹서 또는 다른 카오스 혼합 구조를 포함하는 것과 같은 미세 유체 혼합 프로세스를 포함할 수 있다. 본 개시내용의 조성물은 유사한 방식으로 제조될 수 있다.
일 양태에서, 본 개시내용은 하나 이상의 지질화 양이온성 펩타이드 화합물, 하나 이상의 인지질, 하나 이상의 차폐 지질 및 선택적으로 하나 이상의 구조적 지질을 하나 이상의 다중음이온성 화합물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 본 명세서에 기재된 바와 같은 복합체 및 조성물을 제조하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물, 하나 이상의 인지질, 하나 이상의 차폐 지질 및 선택적으로 하나 이상의 구조적 지질을 하나 이상의 다중음이온성 화합물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 조성물을 제조하는 방법이 본 명세서에 제공된다. 다른 실시형태에서, 하나 이상의 리피토이드, 하나 이상의 인지질, 하나 이상의 차폐 지질 및 선택적으로 하나 이상의 구조적 지질을 하나 이상의 다중음이온성 화합물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 조성물을 제조하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 다중음이온성 화합물, 하나 이상의 지질화 양이온성 펩타이드 화합물, 하나 이상의 인지질, 하나 이상의 차폐 지질 및 선택적으로 하나 이상의 구조적 지질을 포함하는 복합체를 포함하는 조성물을 제조하는 방법은 하나 이상의 지질화 양이온성 펩타이드 화합물, 하나 이상의 인지질, 하나 이상의 차폐 지질 및 선택적으로 하나 이상의 구조적 지질을 포함하는 용액을 하나 이상의 다중음이온성 화합물을 포함하는 용액과 접촉시키는 단계를 포함한다. 소정의 실시형태에서, 다중음이온성 화합물은 핵산을 포함한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 지질화 양이온성 펩타이드 화합물은 하나 이상의 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물을 포함한다. 다른 실시형태에서, 하나 이상의 양이온성 화합물은 하나 이상의 리피토이드를 포함한다.
폴리머, 표면-활성제, 표적화제 또는 부형제의 추가적인 성분과 같은 복합체 및 조성물 내의 추가적인 성분은 다중음이온성 화합물의 주요 성분 및 지질 성분이 배합되기 이전, 도중 또는 이후에 조성물과 혼합되고 배합될 수 있다
본 명세서에 기재된 복합체 및 조성물을 제조하기 위한 특정 프로세스 조건은 조성물의 목적하는 물리적 특성을 제공하기 위해 그에 따라 조정되거나 선택될 수 있다. 예를 들어, 최종 조성물에 영향을 미칠 수 있는 조성물의 성분을 혼합하기 위한 매개변수는 혼합 순서, 혼합 온도, 혼합 속도/비율, 유속, 스톡 용액의 농도, 성분(예를 들어, 펩타이드:카고)의 질량비 및 용매를 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다.
복합체 및 이의 제형의 사용 방법
위에 기재된 바와 같이, 본 명세서에 기재된 조성물은 세포, 특히 세포내 환경으로의 다중음이온성 화합물의 전달을 용이하게 한다. 따라서, 조성물은 많은 임상 적용 및 연구 적용에서 사용될 수 있다. 다중음이온성 화합물의 세포로의 전달은 예방, 진단 및/또는 치료적 방법과 관련된 것들과 같은 임상 적용에 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 적합한 임상 적용은 백신 접종, 암 면역요법, 단백질 대체 요법 및/또는 생체내 유전자 편집, 생체외 세포 요법 형질감염, 생체외 줄기 세포 유도를 포함할 수 있다. 다중음이온성 화합물을 세포에 전달하는 방법은 또한 생물학적 검정 및 시약을 포함하여, 연구 또는 비-임상 적용에도 유용할 수 있다.
다른 양태에서, 다중음이온성 화합물을 세포에 전달하는 방법이 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 다중음이온성 화합물을 세포에 전달하는 방법은 세포를 하나 이상의 다중음이온성 화합물 및 지질 성분을 포함하는 복합체와 접촉시키는 단계를 포함하되, 지질 성분은 선택적으로 하나 이상의 구조적 지질; 하나 이상의 인지질; 하나 이상의 차폐 지질; 및 하나 이상의 지질화 양이온성 펩타이드 화합물을 포함한다. 다른 실시형태에서, 다중음이온성 화합물을 세포에 전달하는 방법은 세포를 하나 이상의 다중음이온성 화합물 및 지질 성분을 포함하는 복합체와 접촉시키는 단계를 포함하되, 지질 성분은 선택적으로 하나 이상의 구조적 지질; 하나 이상의 인지질; 하나 이상의 차폐 지질; 및 화학식 (I)의 하나 이상의 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물 또는 이의 염을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 다중음이온성 화합물을 세포에 전달하는 방법은 세포를 하나 이상의 다중음이온성 화합물 및 지질 성분을 포함하는 복합체와 접촉시키는 단계를 포함하되, 지질 성분은 선택적으로 하나 이상의 구조적 지질; 하나 이상의 인지질; 하나 이상의 차폐 지질; 및 화학식 (II)의 하나 이상의 리피토이드를 포함한다. 전술한 방법의 일부 실시형태에서, 접촉은 엔도사이토시스에 의한 것이다.
또 다른 실시형태에서, 다중음이온성 화합물을 세포에 전달하는 방법은 세포를 하나 이상의 다중음이온성 화합물 및 지질 성분을 포함하는 복합체를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하되, 지질 성분은 선택적으로 하나 이상의 구조적 지질; 하나 이상의 인지질; 하나 이상의 차폐 지질; 및 하나 이상의 지질화 양이온성 펩타이드 화합물을 포함한다. 다른 실시형태에서, 다중음이온성 화합물을 세포에 전달하는 방법은 세포를 하나 이상의 다중음이온성 화합물 및 지질 성분을 포함하는 복합체를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하되, 지질 성분은 선택적으로 하나 이상의 구조적 지질; 하나 이상의 인지질; 하나 이상의 차폐 지질; 및 화학식 (I)의 하나 이상의 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물 또는 이의 염을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 다중음이온성 화합물을 세포에 전달하는 방법은 세포를 하나 이상의 다중음이온성 화합물 및 지질 성분을 포함하는 복합체를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하되, 지질 성분은 선택적으로 하나 이상의 구조적 지질; 하나 이상의 인지질; 하나 이상의 차폐 지질; 및 화학식 (II)의 하나 이상의 리피토이드를 포함한다.
전술한 방법의 일부 실시형태에서, 다중음이온성 화합물을 세포에 전달하는 방법은 세포를 하나 이상의 다중음이온성 화합물 및 지질 성분을 포함하는 복합체와 접촉시키는 단계를 포함하되, 지질 성분은 선택적으로 하나 이상의 구조적 지질; 하나 이상의 인지질; 하나 이상의 차폐 지질; 및 하나 이상의 지질화 양이온성 펩타이드 화합물을 포함하고, 세포는 시험관내, 생체외 또는 생체내에서 접촉된다. 소정의 실시형태에서, 다중음이온성 화합물을 세포에 전달하는 방법은 세포를 하나 이상의 다중음이온성 화합물 및 지질 성분을 포함하는 복합체와 접촉시키는 단계를 포함하되, 지질 성분은 하나 이상의 구조적 지질; 하나 이상의 인지질; 하나 이상의 차폐 지질; 및 하나 이상의 지질화 양이온성 펩타이드 화합물을 포함하고, 세포는 시험관내, 생체외 또는 생체내에서 접촉된다.
세포가 시험관내에서 접촉되는 일부 실시형태에서, 세포는 HeLa 세포이다. 세포가 생체내에서 접촉되는 다른 실시형태에서, 본 개시내용의 복합체, 또는 이의 조성물 또는 이의 제형은 포유동물 대상체에 투여된다. 포유동물 대상체는 인간 또는 마우스 대상체를 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다. 세포가 생체외에서 접촉되는 또 다른 실시형태에서, 세포는 인간 또는 마우스 대상체로부터 수득된다.
세포가 생체내에서 접촉되는 전술한 방법의 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 복합체 및 조성물은 주사에 의해 투여될 수 있다. 소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 복합체 및 이의 조성물은 주사(정맥내(IV), 피하(SC), 근육내(IM), 경막내)에 의해 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 복합체 및 조성물은 정맥내(IV), 피하(SC), 근육내(IM) 또는 경막내 주사에 의해 투여된다. 다른 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 복합체 및 조성물은 볼루스 주사 또는 정맥내 주입에 의해 투여된다. 세포가 생체내에서 접촉되는 다른 실시형태에서, 본 개시내용의 복합체 및 조성물은 비강 또는 경구 흡입에 의해 투여된다. 세포가 생체내에서 접촉되는 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 복합체 및 조성물은 경구로 투여된다. 세포가 생체내에서 접촉되는 또 다른 실시형태에서, 복합체 및 조성물은 점막(국부, 항문내, 협측, 질내 등을 포함)으로 흡수를 통해 투여된다.
위에 개시된 진단, 예방 및 치료적 예와 같은 임상 적용은 사용되는 특정 복합체 및 조성물, 투여 경로, 복합체 및 조성물이 투여되는 대상체 및/또는 목적하는 생리학적 효과에 대해 적절하게 변경될 수 있는 투여 양생법(예를 들어, 투여량 수준 및 투여에 대한 시간 경과)을 포함할 수 있음을 이해하여야 한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 방법은 복합체 또는 조성물을 0.001 ㎎/㎏ 내지 약 1 ㎎/㎏ 체중의 용량으로 투여하는 단계를 포함한다.
실시예
현재 개시된 특허 대상은 제한이 아닌 본 발명의 예시로서 제공되는 하기 실시예를 참조하여 더 잘 이해될 것이다.
실시예 1 - 핵산 전달을 위한 예시적인 3차 아미노 지질화 양이온성 펩타이드의 합성
다음 실시예는 본 명세서에 기재된 바와 같은 화학식 (I)의 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물의 합성을 위한 일반 프로토콜을 설명한다.
Figure pct00232
아래에 제공되는 설명에서, 모든 Ra 및 Rb는 -H이다. 모든 폴리머는 브로모아세트산 및 1차 아민을 사용하여 합성하였다. 도 2b 내지 도 2e는 본 개시내용의 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물을 제조하기 위해 R2, R3, R4, R5 및 R6의 1차 아민의 예시적인 치환기 중 일부를 제공한다.
Fmoc-Rink 아마이드 수지를 고체 지지체로서 사용하였다. 수지 상의 Fmoc기를 20%(v/v) 피페리딘-다이메틸폼아마이드(DMF)로 탈보호시켰다. 그런 다음, 아미노 수지를 브로모아세트산으로 아미드화하였다. 다음으로 1차 아민을 사용한 브로마이드의 친핵성 치환반응에 의한 α-탄소의 아미노화를 수행하였다. 두 단계를 연속적으로 반복하여 목적하는 양이온성 펩타이드 서열을 생성하였다.
모든 반응 및 세척은 달리 언급하지 않는 한 실온에서 수행하였다. 수지의 세척은 수지에 세척 용매(통상적으로 DMF 또는 다이메틸설폭사이드(DMSO))를 첨가하고, 수지를 교반하여 균일한 슬러리를 얻은 다음, 수지로부터 용매를 철저히 배출시키는 것을 지칭한다. 수지가 건조해질 때까지 반응 용기의 프릿 바닥(fritted botm)을 통해 진공 여과에 의해 용매를 제거하였다. 모든 합성에서, 수지 슬러리는 프릿 용기의 바닥을 통한 아르곤의 취입을 통해 교반하였다.
초기 수지 탈보호. 프릿 반응 용기를 Fmoc-Rink 아마이드 수지로 채웠다. DMF를 수지에 첨가하고, 이 용액을 교반하여 수지를 팽창시켰다. 그런 다음, DMF를 배출하였다. DMF 중 20% 피페리딘을 수지에 첨가하고, 수지를 교반하고 수지를 배출하여 Fmoc기를 제거하였다. DMF 중 20% 피페리딘을 수지에 첨가하여 15분 동안 교반한 다음 배출하였다. 그런 다음, 수지를 DMF로 6회 세척하였다.
아실화/아미드화. 그런 다음, 수지에 DMF 중 브로모아세트산을 첨가한 다음 DMF 중 N,N-다이아이소프로폴리카보다이이미드(DIC)를 첨가하여 디블록킹된 아민을 아실화하였다(도 3a). 이 용액을 실온에서 30분 동안 교반한 다음 배출하였다. 이 단계를 2회 반복하였다. 그런 다음, 수지를 DMF로 2회, DMSO로 1회 세척하였다. 이것은 하나의 완료된 반응 사이클이다.
친핵성 치환반응/아미노화. 아실화된 수지를 목적하는 1차 또는 2차 아민으로 처리하여 α-탄소 상의 브로민 이탈기에서 친핵성 치환반응을 일으켰다(도 3b). 목적하는 펩타이드 서열이 얻어질 때까지(도 3d) 이러한 아실화/치환 사이클을 반복하였다(도 3c).
수지로부터 펩타이드 절단. 건조된 수지를 테플론 코팅된 마이크로 교반 바를 포함하는 유리 신틸레이션 바이알에 넣고, 물 중 95% 트라이플루오로아세트산(TFA)을 첨가하였다. 용액을 20분 동안 교반한 다음, 폴리에틸렌 프릿이 장착된 고체상 추출(SPE) 칼럼을 통해 폴리프로필렌 원추형 원심분리관에 여과하였다.
수지를 1㎖의 95% TFA로 세척하였다. 그런 다음, 합한 여과액을 1:1 아세토나이트릴:물로 3회 동결건조시켰다. 동결건조된 펩타이드(도 3e)를 5 ㎎/㎖ 농도의 무수 에탄올 또는 10 ㎎/㎖ 농도의 DMSO에 재용해하였다.
정제 및 특성화. 재용해된 미정제 펩타이드를 분취 HPLC로 정제하였다. 정제된 펩타이드를 LC-MS 분석에 의해 특성화하였다.
실시예 2 - 대표적인 아미노 지질화 펩토이드의 합성 및 특성화
브로모아세트산 및 N,N'-다이아이소프로필카보다이이미드(DIC)를 사용하여 위의 실시예 1에 기재된 서브 단량체 방법에 의해 아미노 지질화 폴리글리신 화합물("펩토이드")을 합성하였다. 폴리스타이렌-지지된 MBHA Fmoc-보호 Rink 아마이드(200㎎ 대표 척도, 0.64 m㏖/g 로딩, 프로테인 테크놀로지스(Protein Technologies)) 수지를 고체 지지체로 사용하였다. 브로모아세틸화를 위해, 수지를 2M 브로모아세트산과 2M N,N'-다이아이소프로필카보다이이미드(DIC)의 1:1 혼합물과 5분 동안 배합하였다. DMF 중 1M 아민 용액을 사용하여 1시간 동안 아민 치환을 수행하였다. 합성 후, 5mℓ의 95:2.5:2.5의 트라이플루오로아세트산(TFA):물:트라이아이소프로필 식염수의 혼합물을 사용하여 실온에서 40분 동안 수지로부터 미정제 펩토이드를 절단하였다. 수지를 여과에 의해 제거하고, 여과액을 Biotage V10 증발기를 사용하여 농축하였다. 미정제 펩토이드를 물 중 25% MeCN 용액으로 동결건조하여 더 농축하였다. 5% 내지 95% 구배에 걸쳐 Waters Acquity UPLC 펩타이드 BEH C4 칼럼 상에 Acquity Diode Array UV 검출기와 Waters SQD2 질량 분석기를 갖춘 Waters Acquity UPLC 시스템으로 순도와 정체를 검정하였다. Waters XBridge BEH300 Prep C4 칼럼 상에 Waters 2489 UV/가시선 검출기를 갖춘 분취 Waters Prep150LC 시스템에 의해 30분에 걸쳐 0.1% TFA 구배로 물 중 5% 내지 40% 아세토나이트릴을 사용하여 선택 미정제 펩토이드를 정제하였다.
표 1A는 실시예 2에 기재된 방법에 의해 제조된 대표적인 아미노 지질화 펩토이드 화합물 1 내지 72를 보여준다. 표 1B는 예측 분자량, 머무름 시간(분 단위, λ=218㎚에서 UPLC-UV 측정에 의해 결정됨) 및 1차 관찰된 질량-대-전하 비(m/z, MH+, 전자분무 이온화-질량 분광법에 의해)를 포함하여, 표 1A의 제조된 아미노 지질화 펩토이드 화합물 1 내지 72에 대한 특성화 데이터를 제공한다. 각각의 아미노 지질화 및 페길화 펩토이드 화합물 48, 56, 64 및 72에 대해, 질량 스펙트럼은 펩토이드에 부착된 PEG 모이어티(평균 분자량 2000 g/㏖)의 다분산성으로 인해 여러 개의 피크 분포를 포함하였다. 이러한 아미노 지질화 및 페길화 펩토이드 화합물에 대해 보고된 질량-대-전하 비 피크는 효과적인 단량체 분리 δ 약 22 m/z(-OCH2CH2-, 에틸렌 글리콜 분자량 44 g/㏖)를 갖는 피크의 MH2 2+ 분포의 중심 값이다.
Figure pct00233
Figure pct00234
Figure pct00235
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Figure pct00251
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Figure pct00254
Figure pct00255
Figure pct00256
실시예 3 - 나노입자 조성물을 형성하기 위해 올리고뉴클레오타이드를 사용한 대표적인 아미노 지질화 펩토이드의 제형화
다음 실시예는 올리고뉴클레오타이드를 사용한 본 명세서에 기재된 바와 같은 화학식 (I)의 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물의 제형화를 위한 일반적인 프로토콜을 설명한다.
표준 제형화에서, 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물을 0.5 ㎎/㎖(시험관내 실험의 경우) 또는 5 ㎎/㎖(생체내 실험의 경우)의 농도로 무수 에탄올에 용해하였다. 생성된 용액은 실온에서 안정하였지만, -20℃에 보관하여야 한다. 핵산 카고를 DNAse 또는 RNAse가 없는 물에 0.2 ㎎/㎖(시험관내 실험의 경우) 또는 1 ㎎/㎖(생체내 실험의 경우)의 최종 농도로 용해하였다. 이러한 용액은 -20℃ 또는 -78℃에서 장기간 보관하여야 한다.
나노입자 제형을 제조하기 위해, 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물을 대략 1:1(펩타이드 화합물:카고) 내지 20:1의 질량비로 핵산과 피펫팅하여 혼합하였다. 제형화 전에, 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물 및 카고(예컨대, 핵산)를 각각 에탄올 및 산성 완충액(0.1M HCl을 사용하여 pH 5.5로 조정된 PBS)에 1:3의 부피비로 희석하였으며, 최종 카고 농도는 대략 0.05 ㎎/㎖ 내지 0.2 ㎎/㎖였다.
실시예 4 - 대표적인 mRNA/펩토이드 제형의 물리적 특성의 특성화
실시예 2에 기재된 예시적인 아미노 지질화 양이온성 펩토이드 1 내지 36을 파이어플라이 루시퍼레이스(Fluc) mRNA와 배합하여 시험관내 또는 생체내 치료 및/또는 예방 목적을 위해 평가될 나노입자 조성물을 형성하였다. 실시예 3의 프로토콜에 따라 제형을 제조하고, 간단한 피펫팅에 의해 혼합하였다.
mRNA/펩토이드 복합체의 부피 평균 입자 크기/직경(㎚) 및 제형 내 크기 다분산 지수(size polydispersity index: PDI)를 결정하기 위해, 5:1 질량비의 펩토이드:카고의 mRNA/펩토이드 제형을 동적 광 산란(size polydispersity index: DLS)에 의해 평가하였다. 예시적인 화합물의 각 제형에 대한 mRNA 캡슐화의 백분율을 트라이톤 X-100에 의한 입자의 용해 전 및 후에 Qubit RNA HS(인비트로젠(Invitrogen)) 염료의 형광에 의해 결정하였다. 결과는 아래 표 2에 나타나 있다.
Figure pct00257
실시예 5 - 대표적인 파이어플라이 루시퍼레이스(Fluc) mRNA/아미노 지질화 양이온성 펩토이드 제형으로 처리한 후 Fluc의 시험관내 발현
mRNA/아미노 지질화 펩토이드 제형의 효능을 파이어플라이 루시퍼레이스(Fluc) 리포터 유전자를 배양된 세포에 전달하는 능력에 기초하여 시험관내에서 평가하였다. 실시예 2의 아미노 지질화 양이온성 펩토이드 1 내지 36을 개별적으로 Fluc mRNA와 5:1 w/w의 비로 배합하고, 생성된 입자를 100 ng/웰(100㎕의 총 부피로)의 용량으로 배양된 HeLa 세포에 첨가하였다. 생성된 루시퍼레이스 발현(RLU)을 6시간 및 24시간의 처리 후 발광 플레이트 판독기로 측정하였다. 아래의 표 3은 두 시점에서 Fluc mRNA/아미노 지질화 펩토이드 제형에 대해 관찰된 루시퍼레이스 발현을 보여준다.
Figure pct00258
Figure pct00259
시험관내 루시퍼레이스 발현 측정을 또한 2:1, 3.5:1, 5:1 및 7.5:1의 펩토이드:mRNA 질량비로 실시예 2로부터의 예시적인 아미노 지질화 양이온성 펩토이드 화합물 1 내지 18에 대해 수행하였다. 관찰된 루시퍼레이스 발현을 발광 플레이트 판독기에 의해 도 4에 나타낸 평균 생물발광(RLU)으로 측정하였다.
실시예 6 - 다성분 지질 제형에서 대표적인 파이어플라이 루시퍼레이스(Fluc) mRNA/아미노 지질화 펩토이드 복합체로 처리된 후 Fluc의 시험관내 발현
다성분 지질 제형에서 mRNA/아미노 지질화 펩토이드의 효능을 파이어플라이 루시퍼레이스(Fluc) 리포터 유전자를 시험관내 배양된 HeLa 세포에 전달하는 능력에 기초하여 평가하였다. 아미노 지질화 펩토이드에 대해 콜레스테롤, 1,2-다이올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE) 및 2-다이미리스토일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌 글리콜-2000(DMG-PEG2000)을 사용하여 상이한 질량 백분율의 지질 성분을 갖는 3개의 지질 제형을 제조하였다(펩토이드:콜레스테롤:DOPE:DMG-PEG2000, 50:165:32:2, 63:0:35:2 및 42:23:33:2). 그런 다음, 아미노 지질화 펩토이드의 기본 제형 각각을 7:1 또는 10:1(펩토이드:카고)의 질량비로 mRNA와 배합하였다. 이 실시예에서 평가된 6개 지질 제형의 조성물은 아래 표 4에 예시되어 있다. 비교를 위해 아미노 지질화 양이온성 펩토이드 화합물 대신에 리피토이드 1을 사용한 제형을 표 4에서 동일한 질량 백분율로 제조하였다
Figure pct00260
세포 배양: HeLa 세포를 처리 18시간 전에 10% FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 100㎕의 DMEM이 담긴 10,000-웰에 시딩하고 부착하게 두었다. 형질감염 직전에 배지를 100㎕의 신선한 혈청-함유 DMEM으로 교체하였다.
mRNA 제조: 형질감염 실험을 위한 Fluc mRNA를 표준 시험관내 전사(in vitro transcription: IVT) 방법을 사용하여 사내에서 제조하였다.
mRNA 제형: 지질 혼합물을 아미노 지질화 펩토이드(화합물 2 및 6 내지 18) 또는 리피토이드 1(에탄올 중 5 ㎎/㎖), 콜레스테롤(5 ㎎/㎖), 1,2-다이올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE, 5 ㎎/㎖) 및 2-다이미리스토일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌 글리콜-2000(DMG-PEG2000, 0.5 ㎎/㎖)의 마스터 스톡을 사용하여 위에 언급된 비에 따라 제조하였다. 남은 부피를 고려하여(그리고 mRNA에 대한 총 지질의 유효 비를 조정), 100% 에탄올을 첨가하였다. 그런 다음, 8㎕의 이 지질 혼합물을 15 ng/㎕의 농도로 산성화된 PBS(pH 5.5)에 용해된 24㎕의 mRNA에 첨가하였다. 혼합 후, 10㎕의 생성된 용액을 96-웰 플레이트의 해당 웰에 첨가하였다. 모든 처리는 삼중으로 수행하고, 값은 평균으로 나타내었다. HeLa 세포를 6시간 동안 생성된 용액으로 처리한 후, 배지를 새로운 DMEM으로 교체하였다. 음성 대조군으로서, HeLa 세포를 mRNA 용액으로만 처리하였다. 리포(Lipo) 조건의 경우, mRNA는 제조업체의 지시에 따라 리포펙타민 2000(써모 피셔(Thermo Fisher))으로 제형화하였다.
시험관내 이미징: 이미징 전에, 30 ㎎/㎖의 D-루시페린 용액의 10㎕를 각각의 웰에 첨가한 후, 37℃에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 이후, SpectraMax iD3 플레이트 판독기(몰리큘러 디바이시스(Molecular Devices))를 사용하여 전체 플레이트의 발광을 측정하였다. 도 5는 각 지질 제형에 대해 관찰된 평균 생물발광(RLU)의 막대 차트를 도시한다.
실시예 7 - 다성분 지질 제형에서 대표적인 파이어플라이 루시퍼레이스(Fluc) mRNA/아미노 지질화 펩토이드 복합체로 처리 후 Fluc의 시험관내 발현
41:23:33:3의 펩토이드:콜레스테롤:DOPE:DMG-PEG2000의 질량비 및 HeLa 세포에 대해 10:1의 펩토이드:Fluc mRNA 비로 콜레스테롤, 1,2-다이올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE) 및 2-다이미리스토일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌 글리콜-2000(DMG-PEG2000)을 갖는 아미노 지질화 펩토이드 1 내지 72의 제형의 시험관내 전달 효율을 평가하기 위해 추가적인 실험을 수행하였다.
다성분 지질 제형 아미노 지질화 펩토이드 1 내지 72의 전체 패널 평가를 위해 실시예 6에 기재된 바와 같은 프로토콜을 이용하였다. 간략하게는, HeLa 세포를 6시간 동안 제형(웰당 50ng의 Fluc mRNA)으로 처리한 후, 배지를 새로운 DMEM으로 교체하였다. 이미징 전에, 30 ㎎/㎖의 D-루시페린 용액의 10㎕를 각각의 웰에 첨가한 후, 37℃에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 이후, SpectraMax iD3 플레이트 판독기(몰리큘러 디바이시스)를 사용하여 전체 플레이트의 발광을 측정하였다. 아미노 지질화 펩토이드 화합물 1 내지 72에 대해 관찰된 평균 발광(RLU)을 도 6a(화합물 1 내지 36) 및 도 6b(화합물 37 내지 72)에 나타내었다. 모든 처리는 삼중으로 수행하고, 값은 평균으로 나타내었다.
실시예 8 - 대표적인 파이어플라이 루시퍼레이스(Fluc) mRNA/아미노 지질화 다성분 지질 제형의 피하 투여 후 Fluc의 생체내 전신 발현
피하 주사 투여에 의해 Balb/c 마우스(n=3)에 대한 Fluc mRNA의 생체내 전달 효율에 대해 아미노 지질화 펩토이드 화합물을 더 평가하였다. Fluc mRNA(2㎍, 콜레스테롤, 1,2-다이올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE) 및 2-다이미리스토일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌 글리콜-2000(DMG-PEG2000)를 갖는 아미노 지질화 펩토이드 1 내지 72를 포함하는 다성분 지질 제형을 41:23:33:3의 펩토이드:콜레스테롤:DOPE:DMG-PEG2000의 질량비 및 10:1의 펩토이드:Fluc mRNA 비로 제조하였다. 제형을 꼬리-정맥 주사(대략 2㎍의 Fluc mRNA/용량)를 통해 0.1 ㎎/㎏의 용량으로 투여하고, 생성된 생물발광을 6시간 후에 정량화하였다.
도 7a 및 도 7b는 평균 생물발광(RLU)으로 정량화된 테스트 마우스에서 Fluc의 생체내 전신 발현을 보여준다.
실시예 9 - 대표적인 파이어플라이 루시퍼레이스(Fluc) mRNA/리피토이드 1 다성분 지질 제형의 투여 후 Fluc의 시험관내 발현.
Fluc mRNA를 HeLa 세포에 전달하기 위해 콜레스테롤, 1,2-다이올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE) 및 2-다이미리스토일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌 글리콜-2000(DMG-PEG2000)과 조합된 리피토이드, 구체적으로 리피토이드 1을 함유하는 다성분 지질 제형의 실행 가능성을 평가하기 위해 추가 실험을 수행하였다.
구체적으로, 다양한 비의 4개의 지질 성분을 다음의 범위(질량 백분율)에서 평가하였: 20% 내지 80%의 리피토이드 1; 6% 내지 40%의 콜레스테롤; 10% 내지 53%의 DOPE; 5:1 내지 8:1의 총 지질 성분(리피토이드 1, 콜레스테롤, DOPE 및 DMG-PEG2000) 대 mRNA의 비; DMG-PEG2000의 질량 백분율은 이 실험에서 2%로 일정하게 유지하였다. 다성분 제형의 제조 및 시험관내 발광 검정을 위해 실시예 6에 기재된 바와 같은 프로토콜을 사용하였다.
에탄올에 지질 성분을 미리 혼합하고, 에탄올성 지질 용액을 Fluc mRNA 수용액과 복합체화하여 96개의 고유한 제형을 제조하였다. 에탄올 대 수용액 부피의 비는 3:1의 수용액:에탄올(vol/vol)로 유지하였다. 각 지질 성분의 농도는 에탄올 대 수용액의 고정된 비 내에서 독립적으로 조정하였다.
HeLa 세포를 제형으로 6시간 동안 처리한 후(웰당 50ng Fluc mRNA), 배지를 새로운 DMEM으로 교체하였다. 이미징 전에, 30 ㎎/mℓ의 D-루시페린의 10㎕를 각각의 웰에 첨가한 후, 37℃에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 이후, SpectraMax iD3 플레이트 판독기(몰리큘러 디바이시스)를 사용하여 전체 플레이트의 발광을 측정하였다. 모든 측정은 삼중으로 수행하고, 값은 평균으로 나타내었다.
도 8a는 96개의 제형 각각에 대해 측정된 시험관내 생물발광 세기(RLU)의 표를 보여준다. 도 8a의 서로 다른 사분면은 4개의 상이한 콜레스테롤:DOPE 비(왼쪽 상단 사분면에서는 0.5:1; 오른쪽 상단 사분면에서는 1:1; 왼쪽 하단 사분면에서는 1.5:1; 오른쪽 하단 사분면에서는 2:1)를 나타낸다. 리피토이드 1의 각각의 96개의 제형에 대해 관찰된 생물발광에 기초하여, 특정 제형이 더 나은 mRNA 전달 효율을 나타내는 것으로 관찰되었다.
위의 96개의 제형에 대한 초기 조사에서 관찰된 결과에 기초하여 추가 시험관내 평가를 위해 2개의 제형을 선택하였다. 하나의 제형을 초기 조사에서 테스트하였다(제형 A, 50:16:32:2의 리피토이드:콜레스테롤:DOPE:DMG-PEG2000의 질량비 및 7:1의 총 지질 성분 대 mRNA의 비). 2차 회귀 모델을 사용하여 실험 데이터를 피팅하고, 전구간 최대값(제형 B, 63:0:35:2의 리피토이드:콜레스테롤:DOPE:DMG-PEG2000의 질량비 및 6.12의 총 지질 성분 대 mRNA의 비)을 구한 것에 기초하여 두 번째 제형을 선택하였다.
추가의 시험관내 평가에서, 리피토이드 제형 A 및 B를 전달 비히클이 없는 mRNA(mRNA 단독), 시판되는 지질 나노입자 제형(대조군 LNP 키트)의 mRNA 및 mRNA만 있는 리피토이드 1(리피토이드 1)의 전달 효율과 비교하여 HeLa 세포에 대한 Fluc mRNA 전달 효율에 대해 평가하였다. 위에 기재된 바와 같은 시험관내 형질감염 및 생물발광 측정을 위한 동일한 프로토콜을 사용하였다.
도 8b는 위의 각각의 처리(mRNA 단독, 대조군 LNP 키트, 리피토이드 1, 리피토이드 제형 A 및 리피토이드 제형 B)뿐만 아니라 음성 대조군으로서 비처리된 HeLa 세포에 대해 기록된 생물발광 세기(RLU)의 막대 그래프를 도시한다. 도 8b에 나타낸 바와 같이, 리피토이드 제형 A 및 제형 B 둘 다 리피토이드 1 단독보다 더 큰 생물발광 세기를 나타내었다.

Claims (56)

  1. 하나 이상의 다중음이온성 화합물; 및 지질 성분의 복합체를 포함하는 조성물로서,
    상기 지질 성분은
    (i) 선택적으로 하나 이상의 구조적 지질;
    (ii) 하나 이상의 인지질;
    (iii) 하나 이상의 차폐 지질; 그리고
    (iv) 하나 이상의 지질화 양이온성 펩타이드 화합물
    을 포함하되, 상기 하나 이상의 지질화 양이온성 펩타이드 화합물은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조성물:
    (a) 하기 화학식 (I)의 하나 이상의 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물 또는 이의 염:
    Figure pct00261

    식 중:
    m은 0 내지 10의 정수이고;
    n은 0 내지 5의 정수이며;
    s는 0 내지 5의 정수이고;
    t는 0 내지 10의 정수이되;
    m, n, s 및 t 중 적어도 하나는 0이 아니고;
    r은 1 내지 20의 정수이고;
    각각의 o는 독립적으로 0, 1 또는 2의 정수이며;
    각각의 q는 독립적으로 0, 1 또는 2의 정수이고;
    각각의 p는 독립적으로 1 또는 2의 정수이며;
    R1은 -H, 알킬, 알킬아릴, -COR1a 또는 지질 모이어티이되,
    R1a는 -H, -OH, 알킬, 아릴, 알킬아릴, -O-알킬 또는 -O-알킬아릴이고;
    각각의 R2는 독립적으로 화학식 -CH2CH2O(CH2CH2O)uCH3의 에틸렌 글리콜 모이어티이고, 각각의 u는 독립적으로 2 내지 200의 정수이고;
    각각의 R3은 독립적으로 지질 모이어티이며;
    각각의 R4는 독립적으로 중성 스페이서 모이어티 또는 지질 모이어티이고;
    각각의 R5는 독립적으로 양이온성 모이어티이며;
    각각의 R6은 독립적으로 화학식 -CH2CH2O(CH2CH2O)vCH3의 에틸렌 글리콜 모이어티이고, 각각의 v는 독립적으로 2 내지 200의 정수이고;
    R7은 -H, 알킬, 아실, -OH, -OR7a, -NH2, -NHR7a 또는 지질 모이어티이되, R7a는 알킬, 아실 또는 지질 모이어티이고; 그리고
    각각의 Ra 및 Rb는 독립적으로 -H, C1-C4-알킬 또는 자연 발생적 또는 비-자연 발생적 아미노산에서 발견되는 측쇄 모이어티이며;
    (b) 하기 화학식 (II)의 하나 이상의 리피토이드(lipitoid):
    Figure pct00262

    식 중:
    x는 1 내지 100의 정수이고;
    각각의 R9는 독립적으로 지질 모이어티이며; 그리고
    각각의 R10은 독립적으로 양이온성 또는 중성 스페이서 모이어티이고; 및
    (c) 이들의 임의의 조합.
  2. 제1항에 있어서, 지질 성분의 총 중량의 40% 내지 80% w/w의 하나 이상의 지질화 양이온성 펩타이드 화합물을 포함하는, 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 지질 성분의 총 중량의 40% 내지 70% w/w의 하나 이상의 지질화 양이온성 펩타이드 화합물을 포함하는, 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 지질화 양이온성 펩타이드 화합물은 화학식 (I)의 하나 이상의 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물 또는 이의 염인, 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, n 또는 s 중 적어도 하나는 0이 아닌, 조성물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물은 N-지질화 아미노산 잔기의 블록을 포함하되, n 및 s 중 적어도 하나는 적어도 2, 적어도 3 또는 적어도 4, 선택적으로 2, 3 또는 4인, 조성물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 각각의 R3은 독립적으로 C4-C22-알킬 또는 C4-C22-알켄일이되, C4-C22-알켄일은 선택적으로 단일- 또는 다중-불포화된, 조성물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 각각의 R3은 독립적으로 C8-C12 알킬인, 조성물.
  9. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 각각의 R3은 독립적으로 2-에틸헥스-1-일, 카프로일, 올레일, 스테아릴, 리놀레일, 미리스틸 및 라우릴로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조성물.
  10. 제1항 내지 제9항 중, 상기 하나 이상의 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물 중 적어도 하나는 양이온성 모이어티 R5를 갖는 적어도 2개의 양이온성 아미노산 잔기를 포함하는 양이온성 도메인을 포함하는, 조성물.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 각각의 R5는 독립적으로 아미노알킬, 알킬아미노알킬, 아미노알킬아미노알킬, 구아니디노알킬, N-헤테로사이클릴알킬 또는 N-헤테로아릴인, 조성물.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 각각의 R5는
    Figure pct00263
    ,
    Figure pct00264
    ,
    Figure pct00265
    ,
    Figure pct00266
    ,
    Figure pct00267
    및
    Figure pct00268
    로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는, 조성물.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 각각의 R5는
    Figure pct00269
    인, 조성물.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 각각의 중성 스페이서 모이어티 R4는 독립적으로 사이클로알킬, 헤테로사이클릴알킬, 알킬아릴, 아릴알킬, 알킬헤테로아릴, 헤테로아릴알킬, 알콕시, 알콕시알킬 또는 하이드록시알킬로 치환된 C1-C4-알킬이되, 각각의 상기 사이클로알킬, 헤테로사이클릴알킬, 알킬아릴, 아릴알킬, 알킬헤테로아릴, 헤테로아릴알킬, 알콕시, 알콕시알킬 또는 하이드록시알킬은 하나 이상의 치환기 -OH, 할로 또는 알콕시로 선택적으로 치환된, 조성물.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 각각의 중성 스페이서 모이어티 R4는
    Figure pct00270
    ,
    Figure pct00271
    ,
    Figure pct00272
    ,
    Figure pct00273
    및
    Figure pct00274
    로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는, 조성물.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 각각의 중성 스페이서 모이어티 R4는
    Figure pct00275
    인, 조성물.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물 중 적어도 하나는 R5 양이온성 모이어티를 갖는 적어도 2개의 아미노산 잔기를 포함하는 양이온성 도메인을 포함하되, 상기 양이온성 도메인 내의 상기 적어도 2개의 양이온성 아미노산 잔기 각각은 중성 스페이서 또는 지질 모이어티 R4를 갖는 적어도 하나 아미노산 잔기에 의해 분리되는, 조성물.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물은 적어도 하나 삼량체 서브유닛 -R양이온-R중성-R중성을 포함하되, R양이온은 양이온성 모이어티 R5를 포함하는 아미노산 잔기이고, 각각의 R중성은 중성 스페이서 모이어티 R4를 포함하는 아미노산 잔기인, 조성물.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 각각의 양이온성 모이어티 R5는
    Figure pct00276
    이고, 각각의 중성 스페이서 모이어티 R4는
    Figure pct00277
    인, 조성물.
  20. 제1항 내지 제19항에 있어서,
    m이 0 내지 3의 정수인 경우, 각각의 u는 독립적으로 20 내지 200, 선택적으로 30 내지 50의 정수이고; 그리고
    m이 4 내지 10의 정수인 경우, 각각의 u는 독립적으로 2 내지 10의 정수인, 조성물.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
    t가 0 내지 3의 정수인 경우, 각각의 v는 독립적으로 30 내지 50의 정수;
    t가 4 내지 10의 정수인 경우, 각각의 v는 독립적으로 2 내지 10의 정수인, 조성물.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
    m은 1이고, u는 40 내지 45의 정수이거나; 또는
    t는 1이고, v는 40 내지 45의 정수인, 조성물.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, Ra 및 Rb는 -H 및 -CH3으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는, 조성물.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, Ra 및 Rb는 -H인, 조성물.
  25. 제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 지질화 양이온성 펩타이드 화합물은 화학식 (II)의 하나 이상의 리피토이드인, 조성물.
  26. 제25항에 있어서, 상기 화학식 (II)의 하나 이상의 리피토이드는 리피토이드 1인, 조성물.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 지질 성분의 총 중량의 0% 내지 40% w/w의 하나 이상의 구조적 지질을 포함하는, 조성물.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 지질 성분의 총 중량의 0% 내지 25% w/w의 하나 이상의 구조적 지질을 포함하는, 조성물.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 구조적 지질은 콜레스테롤, 페코스테롤, 시토스테롤, 에르고스테롤, 캄페스테롤, 스티그마스테롤, 브라시카스테롤, 토마티딘, 우르솔산, 알파-토코페롤 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조성물.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 구조적 지질은 콜레스테롤인, 조성물.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 지질 성분의 총 중량의 10% 내지 60% w/w의 하나 이상의 인지질을 포함하는, 조성물.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 지질 성분의 총 중량의 20% 내지 40% w/w의 하나 이상의 인지질을 포함하는, 조성물.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 인지질은 1,2-다이리놀레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DLPC), 1,2-다이미리스토일-sn-글리세로-포스포콜린(DMPC), 1,2-다이올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC), 1,2-다이팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DPPC), 1,2-다이스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC), 1,2-다이운데카노일-sn-글리세로-포스포콜린(DUPC), 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(POPC), 1,2-다이-O-옥타데센일-sn-글리세로-3-포스포콜린(18:0 다이에터 PC), 1-올레오일-2-콜레스테릴헤미석시노일-sn-글리세로-3-포스포콜린(OChemsPC), 1-헥사데실-sn-글리세로-3-포스포콜린(C 16 Lyso PC), 1,2-다이리놀레노일-sn-글리세로-3-포스포콜린, 1,2-다이아라키도노일-sn-글리세로-3-포스포콜린, 1,2-다이도코사헥사에노일-sn-글리세로-3-포스포콜린, 1,2-다이올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE),1,2-다이팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DPPE), 1,2-다이피타노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(ME 16.0 PE), 1,2-다이스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민, 1,2-다이리놀레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민, 1,2-다이리놀레노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민, 1,2-다이아라키도노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민, 1,2-다이도코사헥사에노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민, 1,2-다이올레오일-sn-글리세로-3-포스포-rac-(1-글리세롤) 소듐염(DOPG), 스핑고마이엘린 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조성물.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 인지질은 1,2-다이올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE)인, 조성물.
  35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 지질 성분의 총 중량의 1% 내지 5% w/w의 하나 이상의 차폐 지질을 포함하는, 조성물.
  36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 차폐 지질은 PEG-변형된 포스파티딜에탄올아민, PEG-변형된 포스파티드산, PEG-변형된 세라마이드, PEG-변형된 다이알킬아민, PEG-변형된 다이아실글리세롤, PEG-변형된 다이알킬글리세롤 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 PEG 지질인, 조성물.
  37. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 성가 하나 이상의 차폐 지질은 1,2-다이미리스토일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌 글리콜-2000(DMG-PEG2000)인, 조성물.
  38. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 차폐 지질은 하기 화학식 (I)의 하나 이상의 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물 또는 이의 염인, 조성물:
    Figure pct00278

    식 중:
    m은 0 내지 10의 정수이고;
    n은 0 내지 5의 정수이며;
    s는 0 내지 5의 정수이고;
    t는 0 내지 10의 정수이되;
    m 및 t 중 적어도 하나는 0이 아니고;
    r은 1 내지 20의 정수이고;
    각각의 o는 독립적으로 0, 1 또는 2의 정수이며;
    각각의 q는 독립적으로 0, 1 또는 2의 정수이고;
    각각의 p는 독립적으로 1 또는 2의 정수이고;
    R1은 -H, 알킬, 알킬아릴, -COR1a 또는 지질 모이어티이되,
    R1a는 -H, -OH, 알킬, 아릴, 알킬아릴, -O-알킬 또는 -O-알킬아릴이고;
    각각의 R2는 독립적으로 화학식 -CH2CH2O(CH2CH2O)uCH3의 에틸렌 글리콜 모이어티이되, 각각의 u는 독립적으로 2 내지 200의 정수이고;
    각각의 R3은 독립적으로 지질 모이어티이며;
    각각의 R4는 독립적으로 중성 스페이서 모이어티 또는 지질 모이어티이고;
    각각의 R5는 독립적으로 양이온성 모이어티이며;
    각각의 R6은 독립적으로 화학식 -CH2CH2O(CH2CH2O)vCH3의 에틸렌 글리콜 모이어티이되, 각각의 v는 독립적으로 2 내지 200의 정수이고;
    R7은 -H, 알킬, 아실, -OH, -OR7a, -NH2, -NHR7a 또는 지질 모이어티이되, R7a는 알킬, 아실 또는 지질 모이어티이며; 그리고
    각각의 Ra 및 Rb는 독립적으로 -H, C1-C4-알킬 또는 자연 발생적- 또는 비-자연 발생적 아미노산에서 발견되는 측쇄 모이어티인, 조성물.
  39. 제38항에 있어서, 상기 하나 이상의 차폐 지질은 화학식 (I)의 하나 이상의 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물 또는 이의 염을 포함하되,
    m이 0 내지 3의 정수인 경우, 각각의 u는 독립적으로 20 내지 200, 선택적으로 30 내지 50의 정수이고; 그리고
    m이 4 내지 10의 정수인 경우, 각각의 u는 독립적으로 2 내지 10의 정수인, 조성물.
  40. 제38항 또는 제39항에 있어서, 상기 하나 이상의 차폐 지질은 화학식 (I)의 하나 이상의 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물 또는 이의 염을 포함하되,
    t가 0 내지 3의 정수인 경우, 각각의 v는 독립적으로 30 내지 50의 정수이고;
    t가 4 내지 10의 정수인 경우, 각각의 v는 독립적으로 2 내지 10의 정수인, 조성물.
  41. 제38항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 차폐 지질은 화학식 (I)의 하나 이상의 3차 아미노 지질화 및/또는 페길화 양이온성 펩타이드 화합물 또는 이의 염을 포함하되,
    m은 1이고, u는 40 내지 45의 정수이거나; 또는
    t는 1이고, v는 40 내지 45의 정수인, 조성물.
  42. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 지질 성분은 지질 성분의 총 중량 기준으로 다음을 포함하는, 조성물:
    a. 40% 내지 70% w/w의 하나 이상의 지질화 양이온성 펩타이드 화합물;
    b. 0% 내지 25% w/w의 콜레스테롤;
    c. 20% 내지 40% w/w의 1,2-다이올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE); 및
    d. 1% 내지 5% w/w의 1,2-다이미리스토일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌 글리콜-2000(DMG-PEG2000).
  43. 제42항에 있어서, 상기 콜레스테롤 대 DOPE의 질량비는 0.5:1 내지 1:1인, 조성물.
  44. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 다중음이온성 화합물은 핵산을 포함하는, 조성물.
  45. 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 다중음이온성 화합물은 핵산을 포함하되, 상기 핵산은 폴리펩타이드를 암호화하는 mRNA인, 조성물.
  46. 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 다중음이온성 화합물은 핵산을 포함하되, 상기 핵산은 단백질을 암호화하는 mRNA인, 조성물.
  47. 제1항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 지질 성분 대 하나 이상의 다중음이온성 화합물의 질량비는 2:1 내지 25:1인, 조성물.
  48. 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 지질 성분 대 하나 이상의 다중음이온성 화합물의 질량비는 5:1 내지 10:1인, 조성물.
  49. 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 소분자 활성제 또는 약물 물질을 포함하는, 조성물.
  50. 다중음이온성 화합물을 세포에 전달하는 방법으로서, 상기 세포를 제1항 내지 제49항 중 어느 한 항에 따른 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 다중음이온성 화합물을 세포에 전달하는 방법.
  51. 제50항에 있어서, 상기 접촉은 엔도사이토시스(endocysis)에 의한 것인, 다중음이온성 화합물을 세포에 전달하는 방법.
  52. 제50항 또는 제51항에 있어서, 상기 세포는 생체내 또는 시험관내에서 접촉되는, 다중음이온성 화합물을 세포에 전달하는 방법.
  53. 제50항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다중음이온성 화합물은 폴리펩타이드를 암호화하는 mRNA인 핵산을 포함하며, 상기 세포는 복합체와 접촉된 후 상기 폴리펩타이드를 발현하는, 다중음이온성 화합물을 세포에 전달하는 방법.
  54. 제50항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다중음이온성 화합물은 단백질을 암호화하는 mRNA인 핵산을 포함하며, 상기 세포는 복합체와 접촉된 후 상기 단백질을 발현하는, 다중음이온성 화합물을 세포에 전달하는 방법.
  55. 제1항 내지 제49항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 제조하는 방법으로서,
    하나 이상의 지질화 양이온성 펩타이드 화합물, 하나 이상의 인지질, 하나 이상의 차폐 지질 및 선택적으로 하나 이상의 구조적 지질을 하나 이상의 다중음이온성 화합물과 배합하는 단계를 포함하는, 조성물을 제조하는 방법.
  56. 제55항에 있어서, 하나 이상의 지질화 양이온성 펩타이드 화합물, 하나 이상의 인지질, 하나 이상의 차폐 지질 및 선택적으로 하나 이상의 구조적 지질을 포함하는 용액을 하나 이상의 다중음이온성 화합물을 포함하는 용액과 접촉시키는 단계를 포함하는, 조성물을 제조하는 방법.
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