CN112789031A - 用于核酸递送的包含脂化的阳离子肽化合物的脂质纳米颗粒制剂 - Google Patents

用于核酸递送的包含脂化的阳离子肽化合物的脂质纳米颗粒制剂 Download PDF

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Abstract

本公开涉及用于核酸递送的脂质混合物，其包含脂化的阳离子肽化合物如叔氨基脂化的和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物或类脂质。更具体地，本公开涉及包含脂化的阳离子肽化合物和其他脂质组分(包括结构脂质、磷脂和屏蔽脂质)的脂质纳米颗粒制剂。本公开还涉及制备和使用该脂质混合物的方法。

Description

用于核酸递送的包含脂化的阳离子肽化合物的脂质纳米颗粒 制剂
相关申请的交叉引用
本申请要求2018年9月28日提交的美国临时专利申请第62/738,717号和2019年8月9日提交的美国临时专利申请第62/885,036号的优先权和利益，其各自的公开内容均通过引用整体并入本申请。
技术领域
本公开一般地涉及多组分脂质组合物，其包含脂化的(lipidated)阳离子肽化合物和其他脂质组分与聚阴离子化合物的复合物。更具体地，本公开涉及多组分脂质制剂，其中脂化的阳离子肽化合物包括叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物和/或类脂质(lipitoid)。本公开还涉及制备本文所述的多组分脂质组合物的方法以及使用该脂质组合物向细胞递送核酸的方法。
背景技术
基因治疗仍是一项预期彻底改变医学领域的有希望的技术。然而，在目前的实践中，以可再现且有效的方式将核酸材料递送至患者细胞的能力一直是其可行性的主要障碍，且因此也是基因治疗法广泛采用的主要障碍。这一关键要求通过多种不同的途径获得了不同程度的成功，包括例如使用病毒载体，或通过使用单一(独立)化合物递送媒介或多组分脂质体制剂与核酸材料进行电荷复合的非病毒方法。尽管病毒载体通常表现出比非病毒组合物更有效和更高选择性地将核酸材料递送至细胞，但为了更容易大规模生产和降低宿主免疫原性，非病毒途径是优选的。
因此，正在努力开发具有改善的递送效率的非病毒递送媒介和制剂。然而，尽管上述两种非病毒途径存在乐观的前景，但在使非病毒组合物能够更广泛地适用于所需应用或至少在优化现有递送媒介方面更简单的方面，仍有很大改进空间。
由于将遗传物质插入细胞中用于实际的治疗应用将在很大程度上取决于每种情况下待递送的核酸类型，因此仍然需要新的递送媒介和/或制剂，其具有支持将各种类型的核酸物质递送至一系列不同靶标的灵活性，并且可以更容易地针对任何给定的遗传负载和/或细胞靶标进行优化。
发明内容
本公开提供了具有改进的效率的用于递送核酸的包含脂化的阳离子肽化合物的多组分脂质组合物。
在一个方面，本公开提供了一种组合物，其包含以下的复合物：
一种或多种聚阴离子化合物；和
脂质组分，其中所述脂质组分包括：
(i)任选地一种或多种结构脂质；
(ii)一种或多种磷脂；
(iii)一种或多种屏蔽脂质(shielding lipid)；和
(iv)一种或多种脂化的阳离子肽化合物，其中一种或多种脂化的阳离子肽化合物选自：
(a)式(I)的一种或多种叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物或其盐：
Figure BDA0002987930770000021
其中：
m是0至10的整数；
n是0至5的整数；
s是0至5的整数；
t是0至10的整数；
其中m、n、s和t中的至少一个是非零的；
r是1到20的整数；
每个o独立地为整数0、1或2；
每个q独立地为整数0、1或2；
每个p独立地为整数1或2；
R1是-H、烷基、烷基芳基、COR1a或脂质部分，
其中R1a为-H、-OH、烷基、芳基、烷基芳基、-O-烷基或-O-烷基芳基；
每个R2独立地为式-CH2CH2O(CH2CH2O)uCH3的乙二醇部分，且其中每个u独立地为2至200的整数；
每个R3独立地为脂质部分；
每个R4独立地为中性间隔基部分或脂质部分；
每个R5独立地为阳离子部分；
每个R6独立地为式-CH2CH2O(CH2CH2O)vCH3的乙二醇部分，且其中每个v独立地为2至200的整数；
R7是-H、烷基、酰基、-OH、-OR7a、-NH2、-NHR7a或脂质部分，其中R7a是烷基、酰基或脂质部分；和
Ra和Rb各自独立地为-H、C1-C4烷基或者天然或非天然存在的氨基酸上的侧链部分；
(b)式(II)的一种或多种类脂质：
Figure BDA0002987930770000031
其中：
x是1至100的整数；
每个R9独立地为脂质部分；和
每个R10独立地为阳离子或中性间隔基部分；
和
(c)其任何组合。
在该方面的一些实施方案中，组合物包含脂质组分总重量的40-80％w/w的一种或多种脂化的阳离子肽化合物。在某些实施方案中，组合物包含脂质组分总重量的40-70％w/w的一种或多种脂化的阳离子肽化合物。
在可与一个或多个前述实施方案组合的某些实施方案中，一种或多种脂化阳离子肽化合物是一种或多种式(I)的叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物或其盐。在可与一个或多个前述实施方案组合的某些实施方案中，n或s中的至少一个是非零的。在可与任何前述实施方案组合的再其他实施方案中，一种或多种叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物包含N-脂化的氨基酸残基的嵌段，其中n和s中的至少一个为至少2、至少3或至少4，任选地为2、3或4。在前述实施方案的其他实施方案(其可与任何其他前述实施方案组合)中，每个R3独立地为C4-C22烷基或C4-C22烯基，并且其中C4-C22烯基任选地为单不饱和或多不饱和的。在其他实施方案中，每个R3独立地为C8-C12烷基。还在其他实施方案中，每个R3独立地选自2-乙基己-1-基、己酰基、油基、硬脂基、亚油基、肉豆蔻基和月桂基。
在本方面的一些实施方案中，一种或多种叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物中的至少一种包含含有至少两个具有阳离子部分R5的阳离子氨基酸残基的阳离子域。在可与任何前述实施方案中的一个或多个组合的其他实施方案中，每个R5独立地为氨基烷基、烷基氨基烷基、氨基烷基氨基烷基、胍基烷基、N-杂环烷基或N-杂芳基。在可与任何前述实施方案组合的某些实施方案中，每个R5独立地选自
Figure BDA0002987930770000041
Figure BDA0002987930770000042
还在其他实施方案中，每个R5是
Figure BDA0002987930770000043
还在本方面的其他实施方案中，每个中性间隔基部分R4独立地为被环烷基、杂环基烷基、烷基芳基、芳基烷基、烷基杂芳基、杂芳基烷基、烷氧基、烷氧基烷基或羟烷基取代的C1-C4烷基，其中每个环烷基、杂环基烷基、烷基芳基、芳基烷基、烷基杂芳基、杂芳基烷基、烷氧基、烷氧基烷基或羟烷基任选地被一个或多个取代基-OH、卤素或烷氧基取代。在可与任何前述实施方案中的一个或多个组合的一些实施方案中，每个中性间隔基部分R4独立地选自
Figure BDA0002987930770000051
在某些实施方案中，每个中性间隔基部分R4是
Figure BDA0002987930770000052
在可与任何前述实施方案中的一个或多个组合的再进一步的实施方案中，一种或多种叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物中的至少一种包含含有至少两个具有R5阳离子部分的氨基酸残基的阳离子域，并且其中该阳离子域内的至少两个阳离子氨基酸残基中的每一个被至少一个具有中性间隔基或脂质部分R4的氨基酸残基分隔。在可与任何前述实施方案中的一个或多个组合的该方面的一些实施方案中，一种或多种叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物中的至少一种包含至少一个三聚体亚单元-Rcation-Rneutral-Rneutral，并且其中Rcation是包含阳离子部分R5的氨基酸残基，并且每个Rneutral是包含中性间隔基部分R4的氨基酸残基。在任何前述实施方案的某些实施方案中，每个阳离子部分R5为
Figure BDA0002987930770000053
和每个中性间隔基部分R4为
Figure BDA0002987930770000054
在可与任何一个或多个前述实施方案组合的该方面的一些实施方案中，当m为0至3的整数时，每个u独立地为20至200的整数，任选地为30至50；并且当m是4至10的整数时，每个u独立地是2至10的整数。在可与任何一个或多个前述实施方案组合的该方面的其他实施方案中，当t为0至3的整数时，每个v独立地为30至50的整数；当t为4至10的整数时，每个v独立地为2至10的整数。还在该方面的进一步实施方案中，m为1，和u为40至45的整数；或者t为1，和v为40至45的整数。
在可与任何一个或多个前述实施方案组合的该方面的其他实施方案中，Ra和Rb独立地选自-H和-CH3。在可与任何一个或多个前述实施方案组合的该方面的某些其他实施方案中，Ra和Rb是-H。
在该方面的其他实施方案中，一种或多种脂化的阳离子肽化合物是一种或多种式(II)的类脂质。在某些实施方案中，式(II)的一种或多种类脂质为类脂质1(Lipitoid 1)。
在可与任何一个或多个前述实施方案组合的该方面的再其他实施方案中，组合物包含脂质组分总重量的0-40％w/w的一种或多种结构脂质。还在其他实施方案中，组合物包含脂质组分总重量的0-25％w/w的一种或多种结构脂质。还在进一步的实施方案中，一种或多种结构脂质选自胆固醇、粪甾醇、谷甾醇、麦角甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、菜籽甾醇、番茄碱、熊果酸、α-生育酚及其混合物。在某些实施方案中，一种或多种结构脂质是胆固醇。
在可与前述实施方案中的任何一个或多个组合的该方面的一些实施方案中，组合物包含脂质组分总重量的10-60％w/w的一种或多种磷脂。在其他实施方案中，组合物包含脂质组分总重量的20-40％w/w的一种或多种磷脂。在可与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，一种或多种磷脂选自1,2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DLPC)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-磷酸胆碱(DMPC)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1,2-二-十一酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DUPC)、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)、1,2-二-O-十八烯基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:0Diether PC)、1-油酰基-胆甾醇基半琥珀酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(OChemsPC)、1-十六烷基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(C16Lyso PC)、1,2-二亚麻酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二-二十二碳六烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1,2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(ME 16.0PE)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二亚麻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二-二十二碳六烯酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-rac-(1-甘油)钠盐(DOPG)、鞘磷脂及其任何混合物。在某些实施方案中，一种或多种磷脂为1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)。
在可与前述实施方案中任何一种或多种组合的再其他实施方案中，组合物包含脂质组分总重量的1-5％w/w的一种或多种屏蔽脂质。在前述实施方案的一些实施方案中，一种或多种屏蔽脂质为一种或多种PEG脂质，其选自PEG修饰的磷脂酰乙醇胺、PEG修饰的磷脂酸、PEG修饰的神经酰胺、PEG修饰的二烷基胺、PEG修饰的二酰基甘油、PEG修饰的二烷基甘油及其混合物。在某些实施方案中，一种或多种屏蔽脂质为1,2-二肉蔻酰基-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000(DMG-PEG2000)。
还在该方面的其他实施方案中，一种或多种屏蔽脂质包括一种或多种式(I)的叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物或其盐：
Figure BDA0002987930770000071
其中：
m是0至10的整数；
n是0至5的整数；
s是0至5的整数；
t是0至10的整数；
其中m和t中的至少一个是非零的；
r是1到20的整数；
每个o独立地为整数0、1或2；
每个q独立地为整数0、1或2；
每个p独立地为整数1或2；
R1是-H、烷基、烷基芳基、COR1a或脂质部分，
其中R1a为-H、-OH、烷基、芳基、烷基芳基、-O-烷基或-O-烷基芳基；
每个R2独立地为式-CH2CH2O(CH2CH2O)uCH3的乙二醇部分，且其中每个u独立地为2至200的整数；
每个R3独立地为脂质部分；
每个R4独立地为中性间隔基部分或脂质部分；
每个R5独立地为阳离子部分；
每个R6独立地为式-CH2CH2O(CH2CH2O)vCH3的乙二醇部分，且其中每个v独立地为2至200的整数；
R7是-H、烷基、酰基、-OH、-OR7a、-NH2、-NHR7a或脂质部分，其中R7a是烷基、酰基或脂质部分；和
Ra和Rb各自独立地为-H、C1-C4烷基或者天然或非天然存在的氨基酸上的侧链部分。
在其中一种或多种屏蔽脂质包括一种或多种叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物的该方面的再其他实施方案中，当m为0-3的整数时，每个u独立地为20至200的整数，任选地为30-50；并且当m是4至10的整数时，每个u独立地是2至10的整数。还在可与任何前述实施方案中的一种或多种组合的其他实施方案中，其中一种或多种屏蔽脂质包括一种或多种叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物，所述组合物包含一种或多种叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物，其中当t为0至3的整数时，每个v独立地为30至50的整数；当t为4至10的整数时，每个v独立地为2至10的整数。在可与任何前述实施方案组合的某些实施方案中，m为1，和u为40至45的整数；或者t为1，和v为40至45的整数。
在该方面的再其他实施方案中，脂质组分包含，按脂质组分总重量计：
40-70％w/w的一种或多种脂化的阳离子肽化合物；
0-25％w/w的胆固醇；
20-40％w/w的1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)；和
1-5％w/w的1,2-二肉豆蔻酰基-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000(DMG-PEG2000)。
在可与前述实施方案中的任何一个或多个组合的某些实施方案中，胆固醇与DOPE的质量比为0.5:1至1:1。
在可与任何前述实施方案中的一个或多个组合的该方面的再其他实施方案中，一种或多种聚阴离子化合物包括核酸。在可与任何前述实施方案中的一个或多个组合的该方面的一些实施方案中，一种或多种聚阴离子化合物包括核酸，并且其中该核酸是编码多肽的mRNA。在可与任何前述实施方案中的一个或多个组合的该方面的某些实施方案中，一种或多种聚阴离子化合物包括核酸，并且其中该核酸是编码蛋白质的mRNA。在可与任何前述实施方案中的一个或多个组合的该方面的又一个实施方案中，脂质组分与一种或多种聚阴离子化合物的质量比为2:1至25:1。在某些实施方案中，脂质组分与一种或多种聚阴离子化合物的质量比为5:1至10:1。
在可与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，组合物进一步包含一种或多种小分子活性剂或药物物质。
在本公开的又一方面，本文提供了向细胞递送聚阴离子化合物，包括使细胞与其任何和所有不同实施方案中的前述方面的组合物接触。在该方面的某些实施方案中，接触是通过内吞作用。在可与前述方面组合的该方面的其他实施方案中，细胞在体内或在体外接触。在可与前述任一或两个实施方案组合的包括编码多肽的核酸的该方面的某些实施方案中，细胞在与组合物接触后表达该多肽。在可与一个或多个前述实施方案组合的包括编码蛋白质的核酸的再进一步的实施方案中，细胞在与组合物接触后表达该蛋白质。
本公开的另外的方面提供了通过将一种或多种脂化的阳离子肽化合物、一种或多种磷脂、一种或多种屏蔽脂质以及任选地一种或多种结构脂质与一种或多种聚阴离子化合物组合来制备与组合物相关的前述方面及其任何和所有各种实施方案的组合物的方法。在该方面的一个实施方案中，组合物通过将包含一种或多种脂化的阳离子肽化合物、一种或多种磷脂、一种或多种屏蔽脂质和任选地一种或多种结构脂质的溶液与包含一种或多种聚阴离子化合物的溶液接触而形成。
附图说明
图1显示了示例性仲胺磷脂化的阳离子肽“类脂质1”。
图2A-2F总体显示了叔氨基脂化的阳离子类肽。图2A显示了叔氨基脂化类肽的广义结构。图2B显示了示例性叔氨基脂化的阳离子类肽。图2C显示了示例性的脂质单体。图2D显示了示例性的阳离子单体。图2E显示了示例性间隔单体和聚乙二醇单体。图2F显示了示例性叔氨基脂化的阳离子类肽化合物8。
图3A-3E显示了通过在固相中顺序添加氨基酸残基制备叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物的示例性过程。图3A显示了树脂结合的仲胺与酰化剂溴乙酸的广义酰化反应。图3B显示了所得酰化产物与合适的胺通过亲核取代以生成相应的N-取代氨基酸残基的反应。图3C和图3D显示了酰化和亲核取代反应的连续重复，以产生所需的树脂结合的阳离子肽化合物。图3E显示了阳离子肽化合物从固体树脂支持物的切割以提供游离肽。
图4描绘了如对于在体外用以2:1、3.5:1、5:1和7.5:1的类肽:mRNA质量比单独地与萤火虫荧光素酶(Fluc)mRNA复合的叔氨基脂化的类肽化合物1-18处理的HeLa细胞测量的平均生物发光(RLU)结果的图。
图5显示了在体外用含有类脂质1或本公开的氨基脂化类肽化合物的一种选择的多组分脂质制剂处理的HeLa细胞中观察到的平均生物发光(RLU)的图。类脂质1或选择的氨基脂化类肽化合物以三种质量比(50:16:32:2、63:0:35:2和42:23:33:2)与胆固醇、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)和2-二肉豆蔻酰基-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000(DMG-PEG2000)组合，并进一步以7:1或10:1的任一类肽:mRNA质量比与萤火虫荧光素酶(Fluc)mRNA混合以提供测试制剂。
图6A-6B显示了Fluc mRNA在用41:23:33:3的类肽:胆固醇:DOPE:DMG-PEG2000质量比和10:1的类肽:mRNA质量比的氨基脂化类肽与胆固醇、DOPE和DMG-PEG2000的多组分脂质制剂处理的HeLa细胞中的体外表达。图6A和图6B显示了用制剂1-36(图6A)和37-72(图6B)处理的HeLa细胞中观察到的平均生物发光。
图7A-7B显示了用皮下施用的41:23:33:3的类肽:胆固醇:DOPE:DMG-PEG2000质量比和10:1的类肽:mRNA质量比的氨基脂化类肽与胆固醇、DOPE和DMG-PEG2000的多组分脂质制剂处理的Balb/c小鼠中的Fluc mRNA体内表达。图7A和图7B显示了施用制剂1-36(图7A)和37-72(图7B)后6小时观察到的平均生物发光。
图8A-8B描绘了在体外和体内测定中对于使用类脂质1与胆固醇、DOPE和DMG-PEG2000的多组分脂质制剂递送Fluc mRNA测量的生物发光。图8A显示了对于使用与FlucmRNA复合的96种不同多组分脂质制剂对HeLa细胞进行体外转染监察观察到的生物发光信号(RLU)的图。图8B描绘了在使用单独Fluc mRNA或用商业上可得的脂质纳米颗粒试剂盒、类脂质1、类脂质制剂A和类脂质制剂B配制的Fluc mRNA处理的HeLa细胞中记录的体外生物发光强度(RLU)的柱状图。
具体实施方式
以下描述阐述了示例性方法、参数等。然而，应当认识到这种描述并非旨在限制本公开的范围，而是作为示例性实施方案的描述提供。
本公开提供了用于递送核酸的多组分脂质组合物，其包含脂化的阳离子肽化合物与进一步的脂质组分如结构脂质、磷脂和屏蔽脂质组合的复合物。多组分脂质组合物和其中的复合物可包括阳离子肽-磷脂缀合物，也称为类脂质，或被脂质部分和/或(低聚和/或聚)乙二醇部分N-取代的N-取代阳离子肽化合物(本文称为叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物)作为阳离子肽化合物。
如本文所述，包含类脂质和/或叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物的多组分脂质组合物表现出将核酸物质高效递送至细胞中，其效率超过了对其他商业上可得的脂质纳米颗粒制剂(即，来自试剂盒)或独立试剂(例如，单独的类脂质1)观察到的效率。有趣的是，进一步观察到本公开的脂质组合物在不包含结构脂质的情况下仍获得核酸的成功递送。
本文中使用的“烯基”指不饱和的直链或支链单价烃链或其组合，其具有至少一个烯属不饱和位点(即，具有至少一个式C＝C的部分)并具有指定的碳原子数(即，C2-C10指2至10个碳原子)。烯基可以是“顺式”或“反式”构型，或者是“E”或“Z”构型。特定的烯基是具有2-20个碳原子(“C2-C20烯基”)、具有2-8个碳原子(“C2-C8烯基”)、具有2-6个碳原子(“C2-C6烯基”)或具有2-4个碳原子(“C2-C4烯基”)的那些。烯基的例子包括但不限于例如乙烯基(或乙烯)、丙-1-烯基、丙-2-烯基(或烯丙基)、2-甲基丙-1-烯基、丁-1-烯基、丁-2-烯基、丁-3-烯基、丁-1,3-二烯基、2-甲基丁-1,3-二烯基、其同系物和异构体等的基团。
术语“烷基”是指且包括饱和直链和支链单价烃结构及其组合，其具有指定碳原子数(即，C1-C10指1至10个碳)。特定的烷基是具有1至20个碳原子(“C1-C20烷基”)的那些。更特别的烷基是具有1-8个碳原子(“C1-C8烷基”)、3-8个碳原子(“C3-C8烷基”)、1-6个碳原子(“C1-C6烷基”)、1-5个碳原子(“C1-C5烷基”)或1-4个碳原子(“C1-C4烷基”)的那些。烷基的例子包括但不限于如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、仲丁基，例如，正戊基、正己基、正庚基、正辛基的同系物和异构体等的基团。
本文中使用的“亚烷基”指与烷基相同的残基，但具有二价性。特定的亚烷基是具有1-6个碳原子(“C1-C6亚烷基”)、1-5个碳原子(“C1-C5亚烷基”)、1-4个碳原子(“C1-C4亚烷基”)或1-3个碳原子(“C1-C3亚烷基”)的那些。亚烷基的例子包括，但不限于，如亚甲基(-CH2-)、亚乙基(-CH2CH2-)、亚丙基(-CH2CH2CH2-)、亚丁基(-CH2CH2CH2CH2-)等的基团。
本文中使用的“炔基”指不饱和的直链或支链单价烃链或其组合，其具有至少一个炔属不饱和位点(即，具有至少一个式C≡C的部分)并具有指定的碳原子数(即，C2-C10指2至10个碳原子)。特定的炔基是具有2-20个碳原子(“C2-C20炔基”)、具有2-8个碳原子(“C2-C8炔基”)、具有2-6个碳原子(“C2-C6炔基”)或具有2-4个碳原子(“C2-C4炔基”)的那些。炔基的例子包括但不限于如乙炔基(ethynyl)(或乙炔基(acetylenyl))、丙-1-炔基、丙-2-炔基(或丙炔基)、丁-1-炔基、丁-2-炔基、丁-3-炔基，其同系物和异构体等的基团。
术语“芳基”是指并包括多不饱和芳族烃基。芳基可包含另外的稠合环(例如，1至3个环)，包括另外稠合芳基、杂芳基、环烷基和/或杂环基环。在一种变型中，芳基包含6至14个环碳原子。芳基的例子包括但不限于苯基、萘基、联苯基等。
“羰基”指C＝O基团。
本文中使用的“复合物”包括两个或更多个分子之间的任何化学缔合，其可通过离子相互作用、氢键键合、范德华相互作用、金属-配体配位、其他化学力及前述一种或多种的组合来介导。复合物可以形成更高阶的结构，包括例如polyplexes、凝聚复合物(coacervate complexes)、纳米复合物、纳米颗粒和微粒。
术语“环烷基”是指并包括环状单价烃结构，其可以是完全饱和的、单不饱和的或多不饱和的，但其是非芳族的，具有指定的碳原子数(例如，C1-C10是指1至10个碳)。环烷基可由一个环(如环己基)或多个环(如金刚烷基)组成，但不包括芳基。包含超过一个环的环烷基可以是稠合的、螺环的或桥连的，或者其组合。优选的环烷基是具有3-13个环碳原子的环状烃。更优选的环烷基是具有3-8个环碳原子的环状烃(“C3-C8环烷基”)。环烷基的例子包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环己基、1-环己烯基、3-环己烯基、环庚基、降冰片基等。
“卤基”或“卤素”指原子序数9至85的第17族系列的元素。优选的卤基包括氟、氯、溴和碘。当残基被一个以上卤素取代时，它可以通过使用对应于所连接的卤素部分数量的前缀来指称，例如二卤代芳基、二卤代烷基、三卤代芳基等指被两个(“二”)或三个(“三”)卤代基团取代的芳基和烷基，其可以是但不一定是相同的卤基；因此，4-氯-3-氟苯基属于二卤代芳基的范围。其中每个氢被卤素基团取代的烷基称为“全卤代烷基”。优选的全卤代烷基是三氟烷基。类似地，“全卤代烷氧基”指其中在构成烷氧基的烷基部分的烃中卤素替代每个氢的烷氧基。全卤代烷氧基的例子是三氟甲氧基(-OCF3)。
术语“杂芳基”是指并包括具有1-10个环碳原子和至少一个环杂原子(包括但不限于如氮、氧和硫的杂原子)的不饱和芳族环状基团，其中氮和硫原子任选被氧化，且氮原子任选季铵化。杂芳基可以在环碳或环杂原子处连接到分子的其余部分。杂芳基可包含另外的稠合环(例如，1至3个环)，包括另外稠合的芳基、杂芳基、环烷基和/或杂环基环。杂芳基的例子包括但不限于吡啶基、嘧啶基、噻吩基、呋喃基、噻唑基等。
术语“杂环”或“杂环基”指具有1-10个环碳原子和1-4个环杂原子如氮、硫或氧等的饱和或不饱和非芳族基团，其中氮和硫原子任选被氧化，且氮原子任选季铵化。杂环基可以有单一环或多个稠环，但不包括杂芳基。包含超过一个环的杂环可以是稠合的、螺环的或桥连的，或其任意组合。在稠合环体系中，一个或多个稠合的环可以是芳基或杂芳基。杂环基的例子包括但不限于四氢吡喃基、二氢吡喃基、哌啶基、哌嗪基、吡咯烷基、噻唑啉基、噻唑烷基、四氢呋喃基、四氢噻吩基、2,3-二氢苯并[b]噻吩-2-基、4-氨基-2-氧代嘧啶-1(2H)-基等。
“氧代”指＝O部分。
“硫代羰基”指C＝S基团。
除非另有说明，“任选取代的”指基团可以是未取代的或被一个或多个(例如1、2、3、4或5个)为该基团列出的取代基取代的，其中取代基可以是相同或不同的。在一个实施方案中，任选取代的基团具有一个取代基。在另一个实施方案中，任选取代的基团具有两个取代基。在另一个实施方案中，任选取代的基团具有三个取代基。在另一个实施方案中，任选取代的基团具有四个取代基。在一些实施方案中，任选取代的基团具有1-2、2-5、3-5、2-3、2-4、3-4、1-3、1-4或1-5个取代基。
术语“取代的”指一个部分的一个或多个氢原子被单价或二价基团取代。“任选取代的”表示该部分可以是取代的或未取代的。合适的取代基包括，例如，羟基、硝基、氨基(例如，-NH2或二烷基氨基)、亚氨基、氰基、卤素(例如F、Cl、Br、I)、卤代烷基(如CCl3或CF3)、硫代、磺酰基、硫代酰氨基、脒基、亚脒基(imidino)、氧代、氧代脒基(oxamidino)、甲氧脒基(methoxamidino)、亚脒基、胍基、磺酰胺基、羧基、甲酰基、烷基、烷氧基、烷氧基-烷基、烷基羰基、烷基羰氧基(-OCOR)、氨基羰基、芳基羰基、芳烷基羰基、羰基氨基、杂芳基羰基、杂芳烷基-羰基、烷硫基、氨基烷基、氰基烷基、氨基甲酰基(-NHCOOR-或-OCONHR-)、脲(-NHCONHR-)、芳基等，其中R是任何合适的基团，例如，烷基或烯基。在一些实施方案中，如所述的，任选取代的部分任选地仅被选择的基团取代。在一些实施方案中，上述基团(例如，烷基)任选地被例如烷基(例如，甲基或乙基)、卤代烷基(例如，-CCl3、-CH2CHCl2或-CF3)、环烷基(例如，-C3H5、-C4H7、-C5H9)、氨基(例如，-NH2或二烷基氨基)、烷氧基(例如，甲氧基)、杂环烷基(例如，作为吗啉、哌嗪、哌啶、吖丁啶)、羟基和/或杂芳基(例如，噁唑基)取代。在一些实施方案中，取代基本身被任选地取代。在一些实施方案中，取代基本身未被取代。取代在取代基上的基团可以是，例如，羧基、卤基、硝基、氨基、氰基、羟基、烷基、烯基、炔基、烷氧基、氨基羰基、-SR、硫代酰氨基、-SO3H、-SO2R或环烷基，其中R是任何合适的基团，例如氢或烷基。
在一个方面，本公开提供了包含复合物的组合物，其中复合物包含一种或多种聚阴离子化合物和三种或更多种脂质组分。在前述的一些实施方案中，复合物包含一种或多种聚阴离子化合物、一种或多种脂化的阳离子肽化合物以及两种或更多种其他脂质组分。
在其中包含一种或多种脂化的阳离子肽化合物与一种或多种聚阴离子化合物和/或非阴离子化合物的组合物和复合物进一步包含两种或更多种脂质组分(如本文所述的磷脂、结构脂质和/或屏蔽脂质)的一些实施方案中，组合物可被描述为脂质制剂。在其中组合物包含两种或更多种脂质组分的某些实施方案中，脂质组合物可被描述为多组分脂质制剂。在其中复合物包含脂化的阳离子肽化合物、聚阴离子化合物、磷脂、结构脂质和屏蔽脂质的某些实施方案中，所述组合物包含脂质纳米颗粒。在其中组合物包含脂质纳米颗粒复合物的再其他的实施方案中，组合物可被表征为脂质纳米颗粒(LNP)组合物。
在一些实施方案中，本公开的组合物包含一种或多种聚阴离子化合物和脂质组分的复合物，其中脂质组分包含任选地一种或多种结构脂质；一种或多种磷脂、一种或多种屏蔽脂质和一种或多种脂化的阳离子肽化合物。在一些实施方案中，本公开的组合物包含一种或多种聚阴离子化合物和脂质组分的复合物，其中脂质组分包含一种或多种磷脂、一种或多种屏蔽脂质和一种或多种脂化的阳离子肽化合物。在其他实施方案中，组合物包含一种或多种聚阴离子化合物和脂质组分的复合物，其中脂质组分包含一种或多种结构脂质；一种或多种磷脂、一种或多种屏蔽脂质和一种或多种脂化的阳离子肽化合物。
脂化的阳离子肽化合物
本公开的组合物包含复合物，其中复合物包含一种或多种聚阴离子化合物及脂质组分，其中脂质组分包含任选地一种或多种结构脂质；一种或多种磷脂；一种或多种屏蔽脂质；和一种或多种脂化的阳离子肽化合物。
通过其正电荷，复合物和组合物中的脂化阳离子肽化合物可以形成复合物以抵消聚阴离子负载上的负电荷，因此促进负载摄取到靶细胞中。如本文所述的脂化的阳离子肽化合物具有净零电荷或净正电荷。在其中复合物或组合物包含一种或多种阳离子化合物的一些实施方案中，一种或多种阳离子化合物独立地具有净零电荷或净正电荷。在某些实施方案中，一种或多种脂化的阳离子肽化合物独立地具有至少+1的净正电荷。应当认识到，一种或多种阳离子化合物上存在的净电荷可根据环境条件而变化。例如，在一些实施方案中，一种或多种阳离子化合物在生理相关的pH范围内独立地具有稳定的净正电荷。例如，生理pH为至少约5.5，且通常为至少约6.0。更典型地，生理pH为至少约6.5。通常，生理pH小于约8.5，且通常小于约8.0。更典型地，生理pH小于约7.5。
本文所提供的组合物中使用的脂化的阳离子肽化合物可包括阳离子类肽-磷脂缀合构建体(也称为类脂质)，或在整个肽主链上具有脂质部分和/或(低聚和/或聚)乙二醇部分的N-取代的阳离子肽化合物(本文称为叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物)。在一些实施方案中，本公开的组合物包含含有一种或多种叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物的复合物。在其他实施方案中，组合物包含含有一种或多种类脂质的复合物。在再其他的实施方案中，组合物包含含有一种或多种叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物、一种或多种类脂质或其任何组合的复合物。
叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物
在一些实施方案中，本公开的复合物和组合物包含一种或多种叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物。叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物是包含N-取代氨基酸残基的肽链。本公开的叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物包含寡肽主链，其中该寡肽主链包含任选地与N-取代的中性(“间隔基”)和/或脂质氨基酸残基交错的N-取代的阳离子氨基酸残基的重复亚单元。寡肽主链在N-和/或C-端进一步通过被脂质部分N-取代(“N-脂化”)和/或被低聚乙二醇和/或聚乙二醇N-取代(“N-聚乙二醇化”)的氨基酸残基封端。
在一些实施方案中，本文提供了式(I)的叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物或其盐：
Figure BDA0002987930770000181
在一些实施方案中，叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物可以通过肽化合物中存在的氨基酸残基总数表征，其中每个氨基酸残基由一般结构-(NR-CRaRb-C(O))-表示。在一些实施方案中，氨基酸残基的总数为2-40个氨基酸残基、2-30个氨基酸残基、3-25个氨基酸残基、5-20个氨基酸残基或7-15个氨基酸残基。在某些实施方案中，叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物包含5至20个氨基酸残基。在某些实施方案中，氨基酸残基的总数为m、n、s、t和[r×(o+p+q)]之和。
在其他实施方案中，叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物具有净零电荷或净正电荷。在其中叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物是叔氨基脂化的阳离子肽化合物的某些实施方案中，叔氨基脂化的阳离子肽化合物具有至少+1的净正电荷。在其中叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物是叔氨基聚乙二醇化的阳离子肽化合物或叔氨基脂化和聚乙二醇化的阳离子肽化合物的其他实施方案中，阳离子肽化合物具有净零电荷(即，是电中性的)或净正电荷。在其中叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物是叔氨基聚乙二醇化的阳离子肽化合物或叔氨基脂化和聚乙二醇化的阳离子肽化合物的一些实施方案中，该阳离子肽化合物具有+1的净正电荷。在某些实施方案中，叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物具有(r×p)+的净正电荷。
在某些实施方案中，本文所述的阳离子肽化合物的氨基酸残基是天然存在的氨基酸或非天然存在的氨基酸的N-取代变体，其中碳侧链由Ra和Rb表示。氨基酸残基可以以D-或L-构型存在。另外，应当认识到，氨基酸残基的N位的取代可能限制酰胺键的自由旋转。因此，本公开的叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物也可以以各种旋转异构构象(旋转异构体)存在。
在一些实施方案中，每个Ra和每个Rb独立地为天然或非天然存在的氨基酸上的侧链部分。本文中使用的术语“天然存在的氨基酸”指Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Ser、Thr、Cys、Met、Asp、Glu、Asn、Gln、Lys、Arg、Phe、Tyr、His或Trp。术语“非天然存在的氨基酸”指自然界中通常不存在的氨基酸，包括例如天然存在的氨基酸的D-异构体、2-氨基己二酸、2-氨基丁酸、正缬氨酸、正亮氨酸和鸟氨酸。在某些实施方案中，Ra和Rb各自独立地为-H、-CH3或者
Figure BDA0002987930770000191
Figure BDA0002987930770000192
在其他实施方案中，每个Ra和每个Rb独立地为-H或C1-C4烷基。在某些实施方案中，每个Ra和每个Rb独立地为-H或CH3。在其他实施方案中，Ra和Rb为-H。在其中Ra和Rb为-H的实施方案中，叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物也可称为N-脂化和/或聚乙二醇化的聚甘氨酸化合物或N-脂化和/或聚乙二醇化的类肽化合物。在某些实施方案中，每个Ra和每个Rb独立地为-H、C1-C4烷基或者天然或非天然存在的氨基酸上的侧链部分。
寡肽主链或重复亚单元及结构基序
如本文所述，叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物可用于与聚阴离子化合物(如核酸)的复合，以及用于将这种聚阴离子化合物递送至细胞中。本公开的叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物包含N-取代的阳离子氨基酸残基(其任选地与N-取代的中性间隔氨基酸残基和/或N-脂化的氨基酸残基交错)的重复亚单元的寡肽主链，如以下式(I)的片段所示：
Figure BDA0002987930770000201
寡肽主链的重复亚单元中的阳离子氨基酸残基赋予本公开的化合物正电荷，这允许与聚阴离子物质如核酸的有利静电相互作用和电荷中和。中性或脂化的氨基酸残基在阳离子残基之间的交错允许更好地控制正电荷在整个叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物中的空间分布，这使得能够改善阳离子肽化合物与具有特定长度、电荷分布和/或构象的聚阴离子物质的复合。
在寡肽主链中，r代表叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物中阳离子和中性和/或脂化的氨基酸残基的重复亚单元的数量。在一些实施方案中，r是1至25的整数。在某些实施例中，r是1至20的整数。在其他实施方案中，r是1至15的整数。在一些实施方案中，r是1至5的整数。在某些实施方案中，r是2至4的整数。
应当认识到，每个亚单元r可以与整个叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物内的其他亚单元严格相同或不严格相同。例如，在叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物中，每个亚单元r可以包含阳离子氨基酸残基，并且任选地还包含中性和/或脂化的氨基酸残基，其相对于其他亚单元中存在的阳离子和中性和/或脂化的氨基酸残基独立地选择。
阳离子部分
本公开的叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物的每个重复亚单元包含至少一个阳离子氨基酸残基。阳离子氨基酸残基提供正电荷，其通过与核酸或聚阴离子化合物上的负电荷的相互作用使得本文所述的肽化合物能够与核酸或其他聚阴离子化合物形成静电复合物。核酸的复合部分地或完全地屏蔽核酸的负电荷，并促进通过细胞的脂质膜的转运和进入细胞内部。
在每个亚单元r内，p代表该亚单元中存在的阳离子氨基酸残基的数量。在一些实施方案中，每个p独立地为整数1或2。在某些实施方案中，p为1。
每个阳离子氨基酸残基在N-位包含阳离子部分R5。应当认识到，每个阳离子部分R5不仅可以在阳离子肽化合物的重复亚单元内独立地选择，且也可以在整个寡肽主链上独立地选择。
本文所述的阳离子部分可以是在生理相关的pH范围内具有稳定的净正电荷的取代基。例如，生理pH为至少约5.5，通常为至少约6.0。更典型地，生理pH为至少约6.5。通常，生理pH小于约8.5，通常小于约8.0。更典型地，生理pH小于约7.5。阳离子部分可以通过例如，该部分中存在的官能团的阈pKa值(其足以在生理pH下产生正电荷)来表征。在某些实施方案中，阳离子部分具有至少7.5的pKa值。在其他实施方案中，阳离子部分具有在生理pH和更酸性的pH(例如pH 4.5-5.5)之间的pKa值。在另外的实施方案中，使用具有多个独立pKa值的取代基。
应当认识到，本文所述的叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物可沿寡肽主链包含多个彼此紧密接近的阳离子部分。当沿着寡肽主链存在多个阳离子部分时，某些阳离子部分的质子化或去质子化状态可能影响紧密接近的其他阳离子部分的pKa值。通过这一机制，本文所述的阳离子肽化合物中特定阳离子部分的pKa可相对于其孤立测量的pKa值被改变。例如，寡肽主链中一个胺的质子化(具有约8的pKa)可将附近阳离子部分的pKa值从约7.5的正常值降低至pKa约5-6。
本公开的叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物容纳多个以不同程度彼此接近的阳离子部分的能力使得这些阳离子肽化合物及其任何复合物能够对生理pH的变化以高灵敏度作出反应。这些化合物及其复合物对生理pH变化的敏感性对于促进核酸的递送和在内体转运(核内体区室pH为约4.5至5.5)后释放到胞质溶胶中可能是重要的。
阳离子或带正电的部分可包括，例如，基于氮的取代基，例如包含以下官能团的那些：氨基、胍基、肼基和脒基。这些官能团可以是芳族的、饱和环状的或脂族的。在一些实施方案中，每个R5独立地为氨基烷基、烷基氨基烷基、氨基烷基氨基烷基、胍基烷基、N-杂环基烷基或N-杂芳基。在其他实施方案中，每个R5独立地为
Figure BDA0002987930770000221
在某些实施方案中，每个R5独立地选自：
Figure BDA0002987930770000222
Figure BDA0002987930770000223
在再其他的实施方案中，每个R5是
Figure BDA0002987930770000224
在其中阳离子残基是整个肽化合物的末端残基的再进一步的实施方案中，可以使用不与合成或脱保护条件相容的(例如酸不稳定的接头)或对于其不存在合适的保护基策略(例如多胺)的另外的阳离子部分R5。例如，在一些实施方案中，末端阳离子残基的阳离子部分R5是多胺。在其中末端残基的R5是多胺的一些实施方案中，多胺是
Figure BDA0002987930770000231
Figure BDA0002987930770000232
在某些实施方案中，多胺选自
Figure BDA0002987930770000233
Figure BDA0002987930770000234
在其他实施方案中，末端阳离子残基的阳离子部分R5为羟烷基、羟醚、烷氧基烷基或羟基杂烷基。在某些实施方案中，末端阳离子残基的阳离子部分R5为
Figure BDA0002987930770000235
Figure BDA0002987930770000236
在再进一步的实施方案中，末端阳离子残基的阳离子部分R5为
Figure BDA0002987930770000237
应当进一步认识到，肽链中未取代的氮原子(即其中R5是氢)也可以用作在生理条件下的可电离阳离子部分。在一些实施方案中，阳离子部分R5是氢原子。
中性间隔基部分
在叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物的寡肽主链内，阳离子氨基酸残基可任选地与中性间隔氨基酸残基交错，从而在N-位具有中性间隔基部分。中性氨基酸残基可用于调节叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物中正电荷的空间分布，以改善与待与阳离子肽化合物复合的聚阴离子化合物(包括多核苷酸)的静电相互作用。
在叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物的每个重复亚单元中，中性氨基酸残基可以作为一个或多个R4基团存在于阳离子氨基酸残基的N末端或C末端上。在其中亚单元r包含中性间隔基部分R4的一些实施方案中，对于存在的每个中性间隔基部分的对应o和/或q代表键合到亚单元r内的阳离子氨基酸残基的N末端和C末端的中性间隔残基的相应数量。在一些实施方案中，每个o独立地为整数0、1或2。在其他实施方案中，每个q独立地为整数0、1或2。
每个中性间隔氨基酸残基在N-位包含中性间隔基部分R4。与本文所述的阳离子部分一样，应当认识到，每个中性间隔基部分R4在阳离子肽化合物的重复亚单元内以及在寡肽主链的重复亚单元r之间独立地选择。
还应认识到，中性间隔基部分可包括在生理相关的pH范围内为中性或具有零净电荷的任何取代基。在一些实施方案中，每个中性部分R4独立地为被环烷基、杂环基烷基、烷基芳基、芳基烷基、烷基杂芳基、杂芳基烷基、烷氧基、烷氧基烷基或羟烷基取代的C1-C4烷基，其中每个环烷基、杂环基烷基、烷基芳基、芳基烷基、烷基杂芳基、杂芳基烷基、烷氧基、烷氧基烷基或羟烷基任选地被一个或多个取代基-OH、卤素或烷氧基取代。还在一些实施方案中，每个中性间隔基部分R4独立地选自
Figure BDA0002987930770000241
Figure BDA0002987930770000242
在某些实施方案中，每个中性间隔基部分R4是
Figure BDA0002987930770000243
脂质部分
除了叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物的寡肽主链内中性氨基酸残基与阳离子氨基酸残基的任选交错外，N-脂化氨基酸残基(具有在N-位的脂质部分)也可任选地与阳离子(和任选的中性间隔基)氨基酸残基交错。在其中叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物包含N-脂化的氨基酸残基的一些实施方案中，叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物是N-脂化的。与中性氨基酸残基类似，寡肽主链内的N-脂化氨基酸残基可用于调节叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物中正电荷的空间分布，以及增强其亲脂性用于改善聚阴离子材料的包封和细胞内递送。脂质沿类肽主链的间距也可能影响脂质流动性/结晶度，其已知影响细胞摄取和核内体释放。
如同中性间隔残基一样，在叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物的每个重复亚单元中，N-脂化的氨基酸残基可以作为一个或多个R4基团存在于阳离子氨基酸残基的N末端或C末端或两个末端上。在其中亚单元r包含脂质部分R4的一些实施方案中，存在的每个脂质部分的相应o和/或q也可以代表键合到亚单元r内的阳离子氨基酸残基的N末端和C末端的脂化残基的相应数量。在一些实施方案中，每个o独立地为整数0、1或2。在其他实施方案中，每个q独立地为整数0、1或2。
每个N-脂化的氨基酸残基在N-位包含脂质部分R4。与本文所述的阳离子和中性部分一样，应当认识到，每个脂质部分R4在阳离子肽化合物的重复亚单元内以及在寡肽主链的重复亚单元r之间独立地选择。
合适的脂质部分可包括，例如，任选取代的支链或直链脂族部分，或衍生自天然脂质化合物(包括脂肪酸、甾醇和类异戊二烯)的任选取代的部分。
在一些实施方案中，脂质部分可包括具有约6至约50个碳原子或约10至约50个碳原子的支链或直链脂族部分，任选地包含一个或多个杂原子，并任选地包含一个或多个双键或三键(即，饱和或者单不饱和或多不饱和的)。在某些实施方案中，脂质部分可包括任选取代的脂族、直链或支链部分，每个疏水性尾独立地具有约8至约30个碳原子或约6至约30个碳原子。在某些实施方案中，脂质部分可包括例如衍生自脂肪酸和脂肪醇的脂族碳链。在一些实施方案中，每个脂质部分R4独立地为C8-C24烷基或C8-C24烯基，其中C8-C24烯基任选地为单不饱和或多不饱和的。在一些实施方案中，每个脂质部分R4是C6-C18烷基或C6-C18烯基。在某些实施方案中，每个脂质部分R4是C8-C12烷基。还在其他实施方案中，每个脂质部分R4是C10烷基，例如正癸基。在其他实施方案中，每个脂质部分R4独立地选自2-乙基己-1-基、己烯基、油基、硬脂基、亚油基、肉豆蔻基和月桂基。
在可与任何前述实施方案组合的再其他实施方案中，每个脂质部分R4独立地为
Figure BDA0002987930770000261
Figure BDA0002987930770000262
Figure BDA0002987930770000263
还在可与任何前述实施方案组合的再其他的实施方案中，每个脂质部分R4独立地为式
Figure BDA0002987930770000264
Figure BDA0002987930770000265
的脂质，其中R8为具有约6至约50个碳原子或约10至约50个碳原子的支链或直链脂族部分，任选地包含一个或多个杂原子，并任选地包含一个或多个双键或三键。在某些实施方案中，每个脂质部分R4独立地为
Figure BDA0002987930770000266
Figure BDA0002987930770000271
本发明的实施中使用的天然脂质部分可以衍生自例如磷脂、甘油酯(如二或三甘油酯)、糖基甘油酯、鞘脂、神经酰胺及饱和和不饱和的固醇、类异戊二烯和其他类似的天然脂质。
其他合适的脂质部分可包括亲脂性碳环或芳族基团，例如任选取代的芳基、环烷基、环烷基烷基或芳基烷基部分，包括例如萘基或乙基苄基，或包含酯官能团的脂质，包括例如固醇酯和蜡酯。在再其他的实施方案中，脂质部分R4是
Figure BDA0002987930770000272
结构基序
在一些实施方案中，本公开的叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物可包含阳离子、中性间隔基和脂化的氨基酸残基相对于彼此的特定序列或排列，其可类似于线性共聚物的各种分类(无规、嵌段、交替、周期性、立构嵌段等)进行描述。
例如，在其中叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子化合物包含类属部分Rcation、Rneutral和Rlipid的一些实施方案中，氨基酸残基可以随机序列、交替序列或嵌段序列排列。应当理解，Rcation和Rneutral的表示分别等同于包含阳离子部分R5和中性部分R4的氨基酸残基。取决于N-脂化残基在叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物中的位置，类属部分Rlipid可理解为包括具有脂质部分R4和脂质部分R3的氨基酸残基两者。
阳离子和中性间隔氨基酸残基的交替序列的一个例子可以由Rcation-Rneutral-Rcation-Rneutral或Rneutral-Rcation-Rneutral-Rcation表示。阳离子和脂化氨基酸残基的交替序列的另一个例子可以由Rcation-Rlipid-Rcation-Rlipid或Rneutral-Rcation-Rneutral-Rcationic表示。嵌段序列的一些实例可由Rcation-Rcation-Rcation-Rneutral-Rneutral-Rneutral、Rneutral-Rneutral-Rneutral-Rcation-Rcation-Rcation、Rcation-Rcation-Rcation-Rlipid-Rlipid-Rlipid或Rlipid-Rlipid-Rlipid-Rcation-Rcation-Rcation表示。还在一些实施方案中，阳离子部分、中性间隔基部分和脂化部分可以在整个寡肽化合物内以不同重复亚单元片段的嵌段序列和交替序列排列。例如，在一些实施方案中，在阳离子肽化合物内可能存在较大低聚体单元的重复基序，如Rcation-Rneutral-Rneutral-Rcation-Rneutral-Rneutral。在其他实施方案中，阳离子肽化合物可包含与交替的阳离子和中性残基的嵌段组合的N-脂化残基的嵌段。
如本文所述，本公开的叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽包含至少一个具有阳离子部分R5的阳离子氨基酸残基。在一些实施方案中，叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物的主链包含“阳离子域”或“阳离子嵌段”。阳离子域可以广义地理解为寡肽链内具有多个阳离子部分R5(例如至少两个阳离子残基)的顺序氨基酸残基的片段。在一些实施方案中，叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物包含阳离子域，其中阳离子域包含至少两个、至少三个或至少四个阳离子氨基酸残基。
阳离子域可包括，例如，在连续的线性序列中具有多个R5阳离子部分(例如，R5R5R5或RcationRcationRcation)的氨基酸残基嵌段。在一些实施方案中，叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物包含“阳离子域”，其中叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物包含至少两个、至少三个或至少四个连续的具有R5阳离子部分的氨基酸残基。
在其他实施方案中，“阳离子域”可包括相邻氨基酸残基的嵌段，其中多个阳离子残基具有间隔在两个阳离子残基之间的额外的非阳离子(即，中性或脂化的)残基，使得嵌段内没有任何一个阳离子残基与另一个阳离子残基直接键合。例如，在一些实施方案中，叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物包含“阳离子域”，其中该阳离子域包含至少两个具有阳离子部分R5的阳离子氨基酸残基，并且其中该阳离子域内的至少两个阳离子氨基酸残基中的每一个被至少一个或至少两个具有中性间隔基或脂质部分R4的氨基酸残基分隔。在一些实施方案中，非阳离子残基以均匀长度的规则分隔的间隔在阳离子域内的两个阳离子残基之间交错。在其中阳离子域包含在阳离子残基之间交错的非阳离子残基的一些实施方案中，阳离子域可描述为包含重复(二聚体、三聚体、四聚体等)的亚单元的结构域。这些亚单元可包括但不限于-RcationRneutral-、-RcationRneutralRneutral-、-RcationRlipid-、-RcationRlipidRlipid-、-RcationRneutralRlipid-或-RcationRlipidRneutral-。在其他实施方案中，非阳离子残基散布在阳离子域内的两个阳离子残基之间，每对阳离子残基之间具有不同数量的非阳离子残基。在其中阳离子域包含散布在阳离子残基之间的非阳离子残基的某些实施方案中，每对阳离子残基独立地被至少一个非阳离子残基分隔。
在其中叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物包含阳离子域的一些实施方案中，每个R5为
Figure BDA0002987930770000291
在其中叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽包含阳离子域的其他实施方案中，每个阳离子部分R5为
Figure BDA0002987930770000293
且每个中性间隔基部分为
Figure BDA0002987930770000292
在其中叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽包含含有一个或多个二聚体或三聚体亚单元的阳离子域的某些实施方案中，每个阳离子部分R5为
Figure BDA0002987930770000294
且每个中性间隔基部分为
Figure BDA0002987930770000295
在再其他的实施方案中，叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽包含含有一个或多个三聚体亚单元-RcationRneutralRneutral-的阳离子域，每个阳离子部分R5为
Figure BDA0002987930770000296
和每个中性间隔基部分为
Figure BDA0002987930770000297
如本文所述，本公开的叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物可包含一个或多个不同的阳离子部分(Rcation1、Rcation2、Rcation3等)、一个或多个不同的中性间隔基部分(Rneutral1、Rneutral2、Rneutral3等)和/或一个或多个不同的脂质部分(Rlipid1、Rlipid2、Rlipid3等)。应当认识到，类属阳离子和中性间隔氨基酸残基的序列或排列的以上例子并非旨在限制于本公开的肽化合物。阳离子、中性间隔基和脂质部分(其可如以上一般所述以随机、交替或嵌段序列存在)也可在更大的嵌段或交替结构基序内以单个阳离子部分、中性部分和脂质部分的特定序列存在。例如，一些示例性的残基排列可包括但不限于以下：Rcation1Rneut ral1Rneutral1Rlipid1Rcation1Rneutral1Rneutral1Rlipid1Rcation1Rneutral1Rneutral1、Rcation1Rneutral1Rneutral1Rc ation1Rneutral1Rneutral1Rcation1Rneutral1Rneutral1Rlipid1Rlipid1、Rlipid1Rcation1Rneutral1Rlipid1Rcation1Rneu tral1-Rlipid2Rcation2Rneutral2Rlipid2Rcation2Rneutral2、Rlipid1Rlipid2Rlipid3Rlipid4Rneutral1Rneutral2Rcatio n1Rneutral1Rneutral2Rlipid1Rlipid2Rlipid3Rlipid4或Rlipid1Rlipid2Rlipid1Rlipid2Rcation1Rneutral1Rcation1Rne utral1Rlipid1Rlipid2Rlipid1Rlipid2。
侧链功能化和肽缀合化合物
如上所述，寡肽主链主要包含具有存在于天然或非天然存在的氨基酸上的侧链部分(Ra和Rb)及在N位的阳离子、中性间隔基或脂质部分(R4和R5)的氨基酸残基。
在一个方面，本公开的叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物的Ra、Rb、R4和R5基团可进一步包含可用于与治疗剂和/或靶向元件(如小分子或抗体)共价键合的反应性连接基团。这些额外的官能团还可包含与合成或脱保护条件不相容(例如酸不稳定的接头)或对于其不存在合适的保护基策略(例如，多胺)的阳离子基团。例如，反应性基团可以通过本领域已知的化学方法附接到现有的侧链Ra和/或Rb上，或者附接到R5处的阳离子部分、N位的R4处的中性间隔基或脂质部分。或者，如果具有所需反应性部分的Ra、Rb、R4或R5基团可以作为相应的游离胺在商业上获得，则相应的游离胺可以在肽链的一般合成过程中(例如，在亚单体合成过程中)并入。
在一些实施方案中，叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽包含一个或多个含有反应性基团或连接基团的氨基酸残基。合适的反应性基团可包括但不限于酯、酰胺、异氰酸酯、硫醇或“点击”化学相容部分(例如叠氮基、炔基)。
在另一方面，本公开进一步提供了叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物作为阳离子化合物，其中该肽化合物与治疗剂和/或靶向元件共价结合或缀合。在某些实施方案中，治疗剂和/或靶向元件是小分子、肽序列、抗体或抗体片段、适体、单糖或寡糖(例如，半乳糖)或聚糖。
对特定生理条件环境敏感或在特定生理条件环境下不稳定的连接基团或连接可能有助于实现向特定器官或细胞的靶向递送，随后选择性地将治疗剂和/或聚阴离子材料释放至细胞中(在细胞中释放)。此外，不稳定的连接也可促进在多阴离子物质递送后叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子化合物从细胞(或器官或全身)的消除和清除。在某些实施方案中，选择连接基团以使得叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物与治疗剂或靶向元件之间的共价键是水解不稳定的、化学不稳定的、pH不稳定的、光不稳定的、热不稳定的或可酶促裂解的。
末端(封端)残基和保护端基
如本文所述，本公开的叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物包含寡肽主链，其在N末端和/或C末端通过被脂质部分N-取代(“N-脂化”)和/或被低聚乙二醇和/或聚乙二醇N-取代(“N-聚乙二醇化”)的氨基酸残基封端。阳离子肽化合物的N-脂化赋予该化合物以及该化合物与聚阴离子物质之间形成的任何复合物有利的亲脂性。N-聚乙二醇化提供对颗粒形成和体内聚集的更好控制。N末端和C末端的末端氨基和羧酸部分可进一步被保护端基封端。
如本文所述，叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物可包含N-脂化和/或N-聚乙二醇化的氨基酸残基。本文提供的阳离子肽化合物包含至少一个N-脂化或N-聚乙二醇化的氨基酸残基。在一些实施方案中，叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物是叔氨基脂化的阳离子肽化合物。在其他实施方案中，叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物是叔氨基聚乙二醇化的阳离子肽化合物。还在其他的实施方案中，本公开的叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物包含N-脂化和N-聚乙二醇化的氨基酸残基两者。在一些实施方案中，叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物是叔氨基脂化和聚乙二醇化的阳离子肽化合物。
脂质部分
如上所述，叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物可在N末端和/或C末端包含氨基酸残基，其中该氨基酸残基被脂质部分N-取代，或“N-脂化”。在本文所述的阳离子肽化合物的N-末端和/或C-末端并入N-脂化的氨基酸残基提高化合物的亲脂性。阳离子肽化合物亲脂性的增加增强了其对疏水性环境(如细胞膜的脂质双层)的亲和力，因此增加了叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物及其与聚阴离子化合物的任何复合物转运至细胞中的倾向。
在一些实施方案中，叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物是N-脂化的。在一些实施方案中，本公开的叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物在N末端包含N-脂化的氨基酸残基。在其他实施方案中，本公开的叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物在C末端包含N-脂化的氨基酸残基。在某些实施方案中，本公开的叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物在N末端和C末端包含N-脂化的氨基酸残基。
在一些实施方案中，本文所述的阳离子肽化合物在N末端的N-脂化氨基酸残基的数量通过n表示。在其他实施方案中，本文所述的阳离子肽化合物在N末端的N-脂化氨基酸残基的数量通过s表示。
在一些实施方案中，n是0至8的整数。在某些实施方案中，n是0至5的整数。在其他实施方案中，n是整数0、1、2、3、4、5、6或7。在再其他的实施方案中，n是整数1、2、3或4。在一些实施方案中，s是0至8的整数。在某些实施方案中，s是0至5的整数。在其他实施方案中，s是整数0、1、2、3、4、5、6或7。在再其他的实施方案中，s是整数1、2、3或4。在其中叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物是N-脂化的一些实施方案中，n或s中的至少一个是非零的。在一些实施方案中，n是非零的。在其他实施方案中，s是非零的。在某些实施方案中，n和s都是非零的。
在一些实施方案中，n和s之和是1至8、2至7或4至6的整数。在其他实施方案中，n和s之和为至少2、至少3或至少4。
在一些实施方案中，叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物包含N-脂化残基的嵌段，或“N-脂质嵌段”，其中叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽包含至少两个、至少三个或至少四个彼此相邻的N-脂化残基(例如，RlipidRlipidRlipid)。在一些实施方案中，叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物包含N-脂化残基的嵌段，其中n为至少2、至少3或至少4。在其他实施方案中，叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物包含N-脂化残基的嵌段，其中s为至少2、至少3或至少4。
本公开的叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽中的N-脂化氨基酸残基被脂质部分R3 N-取代。本公开的脂质部分可包括为中性(即不具有电荷或具有零的净电荷)的疏水或亲脂性部分。本文所述叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子化合物的脂质部分可以是天然或合成衍生的。每个R3独立地为脂质部分，其可以相同或不同的。在一些实施方案中，每个R3是相同的。在其他实施方案中，每个R3是不同的。
应当认识到，N-脂化氨基酸残基的特定序列或排列对于改善与核酸的复合和核酸的递送可能特别有用的。例如，在其中叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子化合物包含一组具有两个不同的脂质部分R3a和R3b之一的混合N-脂化氨基酸残基的一些实施方案中，N-脂化氨基酸残基可以以交替或嵌段序列排列在N末端或C末端。N-脂化氨基酸残基的交替序列的一个例子可以通过R3a-R3b-R3a-R3b或R3b-R3a-R3b-R3a表示。嵌段序列的例子可以通过R3a-R3a-R3b-R3b或R3b-R3b-R3a-R3a表示。在其他实施方案中，N-脂化氨基酸残基的序列可以随机排序。应当认识到，两个N-脂化氨基酸残基的序列或排列的上述例子并非旨在进行限制。此外，本公开的叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物可包含两个或更多个不同的R3脂质部分，其可以如以上一般所述的以随机、交替或嵌段序列存在。
合适的脂质部分可包括，例如，任选取代的支链或直链脂族部分，或衍生自天然脂质化合物(包括脂肪酸、甾醇和类异戊二烯)的任选取代的部分。
在一些实施方案中，脂质部分可包括具有约6至约50个碳原子或约10至约50个碳原子的支链或直链脂族部分，任选地包含一个或多个杂原子，并任选地包含一个或多个双键或三键(即饱和或者单不饱和或多不饱和的)。在某些实施方案中，脂质部分可包括任选取代的脂族、直链或支链部分，每个疏水性尾独立地具有约8至约30个碳原子或约6至约30个碳原子。在某些实施方案中，脂质部分可包括例如衍生自脂肪酸和脂肪醇的脂族碳链。在一些实施方案中，每个R3独立地为C8-C24烷基或C8-C24烯基，其中C8-C24烯基任选地为单不饱和或多不饱和的。在一些实施方案中，每个R3是C6-C18烷基或C6-C18烯基。在某些实施方案中，每个R3是C8-C12烷基。在再其他的实施方案中，每个R3是C10烷基，如正癸基。在一些实施方案中，每个R3独立地选自3-乙基己-1-基、辛酰基、己酰基、油基、硬脂基、亚油基、肉豆蔻基和月桂基。在其他实施方案中，每个R3独立地选自油基、硬脂基、亚油基、肉豆蔻基和月桂基。
在可与任何前述实施方案组合的再其他实施方案中，每个R3独立地为
Figure BDA0002987930770000341
Figure BDA0002987930770000342
Figure BDA0002987930770000351
Figure BDA0002987930770000352
还在可与任何前述实施方案组合的其他实施方案中，每个R3独立地为式
Figure BDA0002987930770000353
Figure BDA0002987930770000354
的脂质，其中R8为具有约6至约50个碳原子或约10至约50个碳原子的支链或直链脂族部分，任选地包含一个或多个杂原子，并任选地包含一个或多个双键或三键。在某些实施方案中，每个R3独立地为
Figure BDA0002987930770000355
Figure BDA0002987930770000356
本发明的实施中使用的天然脂质部分可以衍生自例如磷脂、甘油酯(如二或三甘油酯)、糖基甘油酯、鞘脂、神经酰胺及饱和和不饱和的固醇、类异戊二烯和其他类似的天然脂质。
其他合适的脂质部分可包括亲脂性碳环或芳族基团，如任选取代的芳基、环烷基、环烷基烷基或芳基烷基部分，包括例如萘基或乙基苄基，或包含酯官能团的脂质，包括例如固醇酯和蜡酯。在再其他的实施方案中，脂质部分R4是
Figure BDA0002987930770000357
乙二醇部分
本公开的叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽可在N末端和/或C末端包含被乙二醇的低聚物或聚合物N-取代的(即被低聚乙二醇和/或聚乙二醇N-取代的)封端氨基酸残基。将低聚和/或聚乙二醇部分并入本文所述的叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物中可促进与核酸形成的复合物的颗粒稳定性并防止体内的颗粒聚集。
应当认识到，术语“聚乙二醇化的”在本文中用于描述包含可被低聚乙二醇、聚乙二醇或其组合N-取代的末端氨基酸残基的阳离子肽化合物。在一些实施方案中，本文提供的叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物是N-聚乙二醇化的。
在一些实施方案中，叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物在N末端包含N-聚乙二醇化的氨基酸残基，如以下式(I)的片段中所示的：
Figure BDA0002987930770000361
在其中叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物在N末端包含N-聚乙二醇化的氨基酸残基的某些实施方案中，m代表N末端的N-聚乙二醇化的氨基酸残基的数量，并且每个R2独立地为式-CH2CH2O(CH2CH2O)uR2a的乙二醇部分，其中R2a为-H或C1-C4烷基。在一些实施方案中，R2a为-H、-CH3或CH2CH3。在某些实施方案中，R2a为-H。在其他实施方案中，R2a为-CH3。还在其他的实施方案中，R2a为-CH2CH3。
在一些实施方案中，m是0至10的整数、0至3的整数或4至10的整数。在一些实施方案中，每个u独立地为2至200的整数、2至100的整数、2至50的整数、50至200的整数、50至100的整数、100至200的整数或150至200的整数。
在某些实施方案中，m是0至3的整数，并且每个u是20至200的整数，或者任选地是30至50的整数。在某些实施方案中，m为0至3的整数，和u为40至45的整数。还在其他的实施方案中，m为1，和u为40至45的整数。在其他实施方案中，m是4到10的整数，并且每个u是从2到10的整数。在某些实施方案中，m是4至10的整数，和u是2至5的整数。还在其他的实施方案中，m是7至10的整数，和u是3。
在一些实施方案中，叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物在C末端包含N-聚乙二醇化的氨基酸残基，如以下式(I)的片段中所示的：
Figure BDA0002987930770000371
在其中叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物在C末端包含N-聚乙二醇化的氨基酸残基的某些实施方案中，t代表N末端的N-聚乙二醇化的氨基酸残基的数量，并且每个R6独立地为式-CH2CH2O(CH2CH2O)vR6a的乙二醇部分，其中R6a为-H或C1-C4烷基。在一些实施方案中，R6a为-H、-CH3或CH2CH3。在某些实施方案中，R6a为-H。在其他实施方案中，R6a为-CH3。还在其他的实施方案中，R6a为-CH2CH3。
在一些实施方案中，t是0至10的整数、0至3的整数或4至10的整数。在一些实施方案中，每个u独立地为2至200的整数、2至100的整数、2至50的整数、50至200的整数、50至100的整数、100至200的整数或150至200的整数。
在一些实施方案中，t是0至3的整数，并且每个v是30至50的整数。在某些实施方案中，t为0至3的整数，和v为40至45的整数。还在其他的实施方案中，t为1，和v为40至45的整数。在其他实施方案中，t是从4到10的整数，并且每个v是2到10的整数。在某些实施方案中，t是4至10的整数，和v是2至5的整数。还在其他的实施方案中，t是7至10的整数，和v是3。
在其中叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物是N-聚乙二醇化的一些实施方案中，m或t中的至少一个是非零的。在一些实施方案中，m是非零的。在其他实施方案中，t是非零的。在某些实施方案中，m和t都是非零的。
N-脂化的和/或N-聚乙二醇化的
如本文所述，本公开的叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物可包含被N-脂化和/或N-聚乙二醇化的氨基酸残基。本文提供的阳离子肽化合物包含至少一个被N-脂化或N-聚乙二醇化的氨基酸残基。在叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物的一些实施方案中，m、n、s或t中的至少一个是非零的。
在一些实施方案中，叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物是其中n和s中至少一个是非零的叔氨基脂化的阳离子肽化合物。在某些实施方案中，n和s都是非零的。在再某些实施方案中，式(I)的叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物是式(Ia)的叔氨基脂化的阳离子肽化合物：
Figure BDA0002987930770000381
其中n和s中的至少一个是非零的，并且其中R1、R3、R4、R5、R7、Ra、Rb、o、p、q和r如式(I)所定义。在式(Ia)化合物的某些实施方案中，n和s均为非零的。
在其他实施方案中，叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物是其中m和t中至少一个是非零的叔氨基聚乙二醇化的阳离子肽化合物。在某些实施方案中，m和t都是非零的。在某些实施方案中，m和t都是非零的。在其他实施方案中，式(I)的叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物是式(Ib)的叔氨基聚乙二醇化的阳离子肽化合物：
Figure BDA0002987930770000382
其中m和t中的至少一个是非零的，并且其中R1、R2、R4、R5、R6、R7、Ra、Rb、o、p、q和r如式(I)所定义。在式(Ib)化合物的某些实施方案中，m和t均为非零的。
还在其他的实施方案中，本公开的叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物包含N-脂化和N-聚乙二醇化的氨基酸残基两者。在一些实施方案中，叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物是叔氨基脂化和聚乙二醇化的阳离子肽化合物。在其中叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物是叔氨基脂化和聚乙二醇化的阳离子肽化合物的某些实施方案中，m和t中的至少一个是非零的，且n和s中的至少一个是非零的。
在再进一步的实施方案中，式(I)的叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物是式(Ic)的叔氨基脂化和聚乙二醇化的阳离子肽化合物：
Figure BDA0002987930770000391
其中m和t中的至少一个是非零的，且n和s中的至少一个是非零的，并且其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、Ra、Rb、o、p、q和r如式(I)所定义。
在其他实施方案中，本公开的叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物也可包含在N末端或C末端具有其他中性屏蔽聚合物或部分(其提供与N-聚乙二醇化残基类似的屏蔽效果)的N-取代的氨基酸残基。这些可包括如羟烷基、透明质酸、多糖、聚磷酸盐和聚磷酸酯、聚(乙烯吡咯烷酮)、多元醇、亲水性多肽或其他合成的亲水性聚合物的实例。
N末端和C末端端基
本公开的叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物可以具有分别为其游离胺和游离酸形式或为受保护的形式的N末端和C末端。在一些实施方案中，叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物在N末端和/或C末端残基处进一步包含保护或末端封端基团。
在一些实施方案中，叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物在N末端残基处包含保护或末端封端基团R1。在一些实施方案中，R1为-H、烷基、烷基芳基、-COR1a、-CH2-COR1a、阳离子部分、脂质部分或低聚乙二醇或聚乙二醇部分，其中R1a为-H、-OH、烷基、芳基、烷基芳基、-O-烷基、-O-烷基芳基或脂质部分。在某些实施方案中，R1为-H、烷基、烷基芳基、-COR1a或脂质部分，其中R1a为-H、-OH、烷基、芳基、烷基芳基、-O-烷基，或-O-烷基芳基。在其中R1是脂质部分的某些实施方案中，脂质部分不是磷脂。在其中R1是烷基或-COR1a的再其他的实施方案中，其中R1a是烷基，该烷基任选地被-OH或卤素取代。
在其他实施方案中，叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物在C末端残基处包含保护或末端封端基团R7。在一些实施方案中，R7为-H、烷基、酰基、-OH、-OR7a、-NH2、-NHR7a、阳离子部分、脂质部分或低聚乙二醇或聚乙二醇部分，其中R7a为烷基、酰基或脂质部分。在一些实施方案中，R7为-H、烷基、酰基、-OH、-OR7a、-NH2、-NHR7a或脂质部分，其中R7a为烷基、酰基或脂质部分。在其中R7为脂质部分的某些实施方案中，脂质部分不是磷脂。
在再进一步的实施方案中，叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物的N末端和C末端可被选择或进一步修饰以使得R1和R7具有另外的官能团，例如反应性连接基团。
在一些实施方案中，叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽的R1和/或R7独立地包含一个或多个反应性连接基团。合适的反应性基团可包括但不限于酯、酰胺、异氰酸酯、硫醇或“点击”化学相容部分(例如叠氮基、炔基)。
反应性连接基团随之可用于将其他有用的化合物(包括靶向元件或治疗剂)与肽化合物共价结合。在一些实施方案中，叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物与治疗剂和/或靶向元件共价结合或缀合。在某些实施方案中，治疗剂和/或靶向元件是小分子、抗体或抗体片段。
另外，用于R1和R7的另外的官能团也可包含与合成或脱保护条件不相容的阳离子基团(例如酸不稳定的接头)或对于其无法获得合适的保护基策略的阳离子基团(例如多胺)。还在进一步的实施方案中，R1是多胺。在其中R1是多胺的一些实施方案中，多胺是
Figure BDA0002987930770000411
Figure BDA0002987930770000412
在某些实施方案中，多胺选自
Figure BDA0002987930770000413
Figure BDA0002987930770000414
如上所述，对特定生理条件环境敏感或在特定生理条件环境下不稳定的连接基团或连接可促进聚阴离子材料向特定细胞的靶向递送，并改善特定的药代动力学性质如消除。在某些实施方案中，选择连接基团以使得叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物与治疗剂或靶向元件之间的共价键是水解不稳定的、化学不稳定的、pH不稳定的、光不稳定的、热不稳定的或可酶促裂解的。
叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物的组合
本公开的复合物和组合物可包含一种或多种阳离子化合物。在一些实施方案中，本文所述的复合物可包含一种或多种式(I)的叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物。在单一复合物中使用本公开的多种阳离子肽化合物的混合物和组合可以使得能够制备针对特定药代动力学和药效学性质定制的制剂。相关的药代动力学和药效学性质可包括但不限于生物分布、免疫原性、制剂稳定性、包封百分比、转染效率、血浆半衰期等。不同的应用可能需要这些性质的不同组合。
例如，在某些实施方案中，复合物或组合物可包含一种或多种富阳离子的叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物与一种或多种高度脂化的和/或包含至少一个PEG部分的叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物的组合。理论上，通过提供更大的电荷稳定性(通过富阳离子的肽化合物)以及更大的亲脂屏蔽(通过脂化的肽化合物)，这种组合可以赋予改善的聚阴离子化合物的递送。应当进一步认识到，可以调节单个叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物各自的单独量以获得所需的性质。
叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物的合成
在另一方面，本文提供了制备本文所述的叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物的方法。
本公开的叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物可以在不需要额外的接头种类以将脂质部分与寡肽核心缀合的情况下合成。对于本文所述的叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物，脂质和乙二醇部分与肽本身内的氮原子共价和直接结合，也就是说，在氨基酸残基中的酰胺氮或N-位处。因此，叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽可以完全通过本领域已知用于在肽链中产生N-取代残基的方法合成。
叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物可通过对于待添加的每一个氨基酸残基的一系列酰化(酰胺化)和亲核取代(胺化)反应来制备，无论该残基在N-位是否具有阳离子、中性、脂质或低聚/聚乙二醇部分。本文所述的阳离子肽化合物通过顺序添加单个残基到肽链上而合成的。残基的顺序添加可以重复进行，直至达到所需的氨基酸的序列和长度。
本发明的化合物可以通过固相和液相方法合成。下文讨论了通过固相合成制备N-取代的肽(包括本文所述的叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物)的示例性方法，并在图3A-3E中示出。
如图3A所示，在合成开始时提供具有末端仲胺的固体树脂支持物。酰化剂用合适的肽偶联试剂和溶剂添加到末端仲胺以在末端仲胺和酰化剂之间形成酰胺键。酰化剂优选为乙酰化剂。酰化剂包含至少两个合适的离去基团以促进在α-碳上的酰胺化和后续的胺化。在某些实施方案中，酰化剂是卤代乙酸。在其他实施方案中，酰化剂为溴乙酸。
在图3B中，图3A中产生的酰化产物与所需的取代伯或仲胺反应以提供相应的N-取代的末端氨基酸残基。选择的伯胺或仲胺替代α-碳上的离去基团，如溴乙酸中的溴，以产生相应的胺化产物。在一些实施方案中，伯胺或仲胺是选自NHRpR2、NHRpR3、NHRpR4、NHRpR5和NHRpR6的胺，其中Rp是-H或保护基团，并且其中R2、R3、R4、R5和R6如对于本文所述的叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物定义。
酰胺化和胺化反应系列地重复(图3C)直至获得所需的肽序列(图3D)。应当认识到，本文所述的制备叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物的方法可进一步包括保护和脱保护步骤以防止在顺序的酰胺化/胺化反应过程中与肽链中的反应性部分发生任何不希望的反应。例如，保护基Rp可在合成过程中添加到沿着本文所述肽化合物的任何位置的α-碳和/或N-取代基的侧链上。合适的保护基Rp可包括本领域已知的任何保护基团，特别是适合于在正交保护方案中的肽合成的那些，如Boc/Bzl或Fmoc/tBu。
N末端和C末端(R1和R7)处并入端基以及端基和/或沿寡肽主链的氨基酸残基(Ra、Rb、R4、R5)的侧链的功能化可通过本领域已知的方法进行。本领域普通技术人员将认识到，选择合适的方法和相对于整个固相合成的额外功能化步骤的时机取决于待添加的端基和/或连接基团，以及所述方法与肽化合物上存在的其他部分和/或保护基团的相容性。
取决于上述合成中使用的任何保护方案，在合适的反应条件下，如包括盐酸、氢溴酸或三氟乙酸的酸性条件下，所需的肽化合物从固体树脂支持物上切除(图3E)。叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物从固体树脂支持物上的切割在溶液中产生相应的游离阳离子肽化合物。
可以采取进一步的步骤以从溶液中分离和纯化阳离子肽化合物，包括例如从固体树脂支持物过滤含肽溶液和冷冻干燥分离的滤液以提供固体产物。
由于用于实现树脂切割的酸性条件，应当认识到叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物可以相应的酸性盐形式存在。例如，在一些实施方案中，叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物是其盐形式。在某些实施方案中，盐形式为酸加成盐。在一些实施方案中，叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物的盐是盐酸盐(盐酸加成盐)、氢溴酸盐(氢溴酸加成盐)或三氟乙酸盐(三氟乙酸加成盐)。在某些实施方案中，叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物的盐是叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物的三氟乙酸加成盐或三氟乙酸盐。
叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物的酸加成盐形式可通过本领域的方法(例如，离子交换)进一步修饰，以获得一种或多种药学上可接受的盐形式。短语“药学上可接受的”指物质或组合物必须与组成制剂的其他成分和/或该制剂施用的受试者化学和/或毒理学上相容。术语“药学上可接受的酸加成盐”可包括但不限于与无机酸(如盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、硝酸、碳酸、磷酸)和选自有机酸的脂族、环脂族、芳族、芳基-脂族、杂环、羧酸和磺酸种类的有机酸(如甲酸、乙酸、丙酸、葡萄糖酸、乳酸、丙酮酸、草酸、马来酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、天门冬酸、抗坏血酸、谷氨酸、苯甲酸、苯乙酸、甲磺酸“甲磺酸盐”、乙磺酸、对甲苯磺酸和水杨酸)形成的那些药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物的盐是药学上可接受的盐。在某些实施方案中，盐为盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硝酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、酸式磷酸盐、甲酸盐、乙酸盐、丙酸盐、葡萄糖酸盐、乳酸盐、丙酮酸盐、草酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、琥珀酸盐、富马酸盐、酒石酸盐、酒石酸氢盐、柠檬酸盐、天冬氨酸盐、抗坏血酸盐、谷氨酸盐、苯甲酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、对甲苯磺酸盐或水杨酸盐。
类脂质
在一些实施方案中，本文所述的复合物和组合物的一种或多种脂化的阳离子肽化合物包含一种或多种阳离子类肽-磷脂缀合物构建体，也称为类脂质。类脂质是沿着类肽主链具有甘氨酸残基的N-位处的阳离子和/或中性侧链的组合的N-取代的聚甘氨酸化合物(也称为“类肽”)，其进一步与类肽链的单一末端磷脂基团缀合。类脂质及其合成一般地在Simon R.J.等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89,9367-9371(1992)；Lobo,B.A.；Vetro,J.A.；Suich,D.M.；Zuckermann,R.N.；Middaugh,C.R.Structure/Function AnalysisofPeptoid/Lipitoid:DNA Complexes.Journal of Pharmaceutical Sciences 2003,92(9),1905-1918；和Utku,Y.；Dehan,E.；Ouerfelli,O.；Piano,F.；Zuckermann,R.N.；Pagano,M.；Kirshenbaum,K.A Peptidomimetic SiRNA Transfection Reagent forHighly Effective Gene Silencing.Molecular BioSystems 2006,2(6-7),312中所描述。示例性类脂质是如图1所示的九聚体“类脂质1”。类脂质化合物的一般结构如下式(II)所示，其中x为1至100的整数，每个R9独立地为脂质部分，且每个R10独立地为阳离子或中性部分。
Figure BDA0002987930770000451
在上述式(II)中，x是1至100的整数。特定的残基数可能特别适合用于本文所述的复合物和组合物中。例如，在一些实施方案中，x是1至50、2至25或3至15的整数。
如上式(II)所示，R9代表脂质部分，包括但不限于具有约6至约50个碳原子或约10至约50个碳原子的支链或直链脂族部分，任选地包含一个或多个杂原子，并任选地包含一个或多个双键或三键(即，饱和或者单不饱和或多不饱和的)。在某些实施方案中，脂质部分R9可包括任选取代的脂族、直链或支链部分，每个疏水性尾独立地具有约8至约30个碳原子或约6至约30个碳原子。在某些实施方案中，脂质部分可包括例如衍生自脂肪酸和脂肪醇的脂族碳链。在一些实施方案中，每个脂质部分R9独立地为C8-C24烷基或C8-C24烯基，其中C8-C24烯基任选地为单不饱和或多不饱和的。在其他实施方案中，每个脂质部分R9独立地选自油基、硬脂基、亚油基、肉豆蔻基和月桂基。在可与任何前述实施方案组合的再其他实施方案中，每个脂质部分R9独立地为
Figure BDA0002987930770000461
Figure BDA0002987930770000462
氨基甘氨酸残基N-位的基团R10包括类似于以上对于叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物所述的那些的阳离子和中性部分。
阳离子或带正电的部分可包括，例如，基于氮的取代基，如包含以下官能团的那些：氨基、胍基、肼基和脒基。这些官能团可以是芳族的、饱和环状的或脂族的。在类脂质的一些实施方案中，每个阳离子部分独立地为氨基烷基、烷基氨基烷基、氨基烷基氨基烷基、胍基烷基或N-杂环基烷基。在其他实施方案中，每个阳离子部分独立地为
Figure BDA0002987930770000463
Figure BDA0002987930770000471
Figure BDA0002987930770000472
在某些实施方案中，每个阳离子部分独立地选自：
Figure BDA0002987930770000473
Figure BDA0002987930770000474
在再其他的实施方案中，每个阳离子部分是
Figure BDA0002987930770000475
中性部分可包括但不限于被环烷基、杂环基烷基、烷基芳基、芳基烷基、烷基杂芳基、杂芳烷基、烷氧基、烷氧基烷基或羟烷基取代的C1-C4烷基，其中每个环烷基、杂环基烷基、烷基芳基、芳基烷基、烷基杂芳基、杂芳基烷基、烷氧基、烷氧基烷基或羟烷基任选地被一个或多个取代基-OH、卤素或烷氧基取代。在类脂质的一些实施方案中，每个中性部分独立地选自：
Figure BDA0002987930770000476
Figure BDA0002987930770000477
在某些实施方案中，每个中性间隔基部分是
Figure BDA0002987930770000478
在再其他实施方案中，每个中性间隔基部分是
Figure BDA0002987930770000479
在再其他的实施方案中，每个阳离子部分为
Figure BDA00029879307700004710
且每个中性间隔部分为
Figure BDA00029879307700004711
还在进一步的实施方案中，一种或多种类脂质包括类脂质1。
类似于以上的叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物，本文所述的类脂质可包括以随机序列排列的氨基酸残基，或交替序列或嵌段序列的重复基序。在一些实施方案中，式(II)的类脂质可包含x个残基的链中的重复的(二聚体、三聚体、四聚体等)亚单元。这些亚单元可包括但不限于-RcationRneutral-或-RcationRneutralRneutral-，其中Rcation是包含阳离子部分的氨基酸残基，且每个Rneutral是包含中性间隔基部分的氨基酸残基。在其他实施方案中，式(II)的类脂质包含至少一个三聚体亚单元-Rcation-Rneutral-Rneutral，并且其中Rcation是包含阳离子部分的氨基酸残基，和每个Rneutral是包含中性间隔部分的氨基酸残基。
在其中式(II)的类脂质包含阳离子域的一些实施方案中，每个阳离子部分R10为
Figure BDA0002987930770000481
在前述实施方案的其他实施方案中，每个阳离子部分R10为
Figure BDA0002987930770000482
和每个中性间隔部分R10为
Figure BDA0002987930770000483
在某些实施方案中，式(II)的类脂质包含一个或多个二聚体或三聚体亚单元，其中每个阳离子部分为
Figure BDA0002987930770000484
和每个中性间隔部分为
Figure BDA0002987930770000485
在再其他的实施方案中，式(II)的类脂质包括含有一个或多个三聚体亚单元-RcationRneutralRneutral-的阳离子域，其中Rcation是含有阳离子部分的氨基酸残基，和每个Rneutral是含有中性间隔基部分的氨基酸残基，其中每个阳离子部分是
Figure BDA0002987930770000486
和其中每个中性间隔基部分是
Figure BDA0002987930770000487
与叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物一样，本文所述的复合物和组合物可包含一种或多种类脂质。在某些实施方案中，一种或多种阳离子化合物包含一种或多种类脂质。在再其他的实施方案中，一种或多种阳离子化合物包含类脂质1。
其他脂质组分
除了用于作为负载的一种或多种聚阴离子化合物的电荷中和而使用的主要脂质组分的脂化阳离子肽化合物外，多组分脂质组合物和其中的复合物可包含其他脂质组分，包括结构脂质、磷脂和屏蔽脂质。本文所述的另外的脂质组分为阳离子肽化合物和聚阴离子材料的复合物提供物理结构和稳定性，这有助于它们在溶液中的施用并促进复合物摄取到细胞中。
结构脂质
如本文所述，结构脂质可用于赋予多组分组合物中聚阴离子化合物的复合物物理稳定性，并增强复合物的亲脂特性以促进与靶细胞的结合和内吞。在一些实施方案中，本公开的组合物包含含有任选地一种或多种结构脂质作为脂质组分的复合物。在一些变型中，组合物包含含有一种或多种结构脂质的复合物。
适用于本公开的组合物和复合物的结构脂质可包括但不限于固醇。在一些实施方案中，结构脂质选自胆固醇、粪甾醇、谷甾醇、麦角甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、菜籽甾醇、番茄碱、熊果酸、α-生育酚及其混合物。在某些实施方案中，结构脂质是胆固醇。
然而，应当注意，在本公开的一些实施方案中，本文提供的组合物和复合物不含结构脂质，但仍表现出非常良好的递送效率。在某些其他实施方案中，本文提供的组合物和复合物不含结构脂质。
(两性离子)磷脂或两性离子脂质
与上述结构脂质一样，磷脂也可以掺入本公开的复合物和组合物中。通过其两亲特性和破坏细胞膜的能力，磷脂为溶液中的复合物提供了进一步的稳定化，以及促进细胞内吞作用。在一些实施方案中，本文提供的组合物包含含有一种或多种磷脂作为脂质组分的复合物。在某些实施方案中，一种或多种磷脂包括一种或多种两性离子磷脂。
在一些实施方案中，一种或多种磷脂选自1,2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DLPC)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-磷酸胆碱(DMPC)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1,2-二-十一酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DUPC)、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)、1,2-二-O-十八烯基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:0Diether PC)、1-油酰基-胆甾醇基半琥珀酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(OChemsPC)、1-十六烷基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(C 16Lyso PC)、1,2-二亚麻酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二-二十二碳六烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DPPE)、1,2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(ME 16.0PE)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二亚麻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二-二十二碳六烯酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-rac-(1-甘油)钠盐(DOPG)、鞘磷脂及其任何混合物。在某些实施方案中，磷脂为DOPE。
应当认识到，由磷脂提供的有助于破坏细胞膜用于内吞作用的两亲性属性可以可选地由非磷脂的两性离子脂质提供。在一些实施方案中，组合物包含含有一种或多种非磷脂的两性离子脂质的复合物。在再进一步的实施方案中，组合物包含含有一种或多种磷脂、一种或多种两性离子脂质或其任何组合的复合物。
屏蔽脂质
如本文所述，本公开的复合物和组合物可进一步包括一种或多种屏蔽脂质。屏蔽脂质(如聚乙二醇化脂质)可以对作为一种或多种聚阴离子化合物反电荷的一种或多种脂化的阳离子肽化合物提供额外的电荷中和层，并防止被细胞吞噬过程清除。在一些实施方案中，本文提供的组合物包含含有一种或多种作为脂质组分的屏蔽脂质的复合物。
在一些实施方案中，屏蔽脂质是PEG脂质。在其他实施方案中，PEG脂质选自PEG修饰的磷脂酰乙醇胺、PEG修饰的磷脂酸、PEG修饰的神经酰胺、PEG修饰的二烷基胺、PEG修饰的二酰基甘油、PEG修饰的二烷基甘油及其混合物。在一些实施方案中，PEG脂质是PEG修饰的磷脂酰乙醇，其选自PEG修饰的DSPE(DSPE-PEG)、PEG修饰的DPPE(DPPE-PEG)和PEG修饰的DOPE(DOPE-PEG)。在某些实施方案中，PEG脂质选自二肉豆蔻酰甘油-聚乙二醇(DMG-PEG)、二硬脂酰甘油-聚乙二醇(DSG-PEG)、二棕榈酰甘油-聚乙二醇(DPG-PEG)和二油酰甘油-聚乙二醇(DOG-PEG)。在某些实施方案中，PEG脂质为DMG-PEG。
应当进一步认识到，前述PEG脂质中的PEG链的特定分子量可特别有利于掺入到本公开的复合物中。例如，在一些实施方案中，PEG链的分子量为350-6,000克/摩尔、1,000-5,000克/摩尔或2,000-5,000克/摩尔。在某些实施方案中，PEG脂质的PEG链具有约350克/摩尔、500克/摩尔、600克/摩尔、750克/摩尔、1,000克/摩尔、2,000克/摩尔、3,000克/摩尔、5,000克/摩尔或10,000克/摩尔的分子量。在某些其他实施方案中，PEG脂质的PEG链具有约500克/摩尔、750克/摩尔、1,000克/摩尔、2,000克/摩尔或5,000克/摩尔的分子量。例如，在某些实施方案中，聚乙二醇化的脂质是二肉豆蔻酰甘油-聚乙二醇2000(DMG-PEG2000)。
在再进一步的实施方案中，一种或多种PEG脂质包含式(I)的叔氨基聚乙二醇化的阳离子肽化合物，其包含至少一个低聚或聚乙二醇部分。本公开的式(I)叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物通过其在沿肽链主链容纳脂质和聚乙二醇部分两者的灵活性并取决于其特定取代基的性质，不仅可用作脂化的阳离子肽化合物，而且可用作稳定阳离子化合物-聚阴离子化合物复合物的合适屏蔽脂质。应当认识到，式(I)的叔氨基聚乙二醇化的阳离子肽化合物可以与其他种类的阳离子化合物如类脂质或脂质样化合物以及式(I)的其他叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物组合。
在一些实施方案中，PEGy脂质是如本文所述的式(I)的叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物，其中m和t中的至少一个是非零的(即，N-聚乙二醇化的)。在再进一步的实施方案中，PEG脂质是式(I)的叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物，其中m和t独立地为0至10的整数，并且其中m和t中的至少一个是非零的。在一些实施方案中，PEG脂质是式(Ib)的叔氨基聚乙二醇化的阳离子肽化合物。还在其他实施方案中，PEG脂质是式(Ic)的叔氨基脂化和聚乙二醇化的阳离子化合物。
与上述PEG脂质一样，前述叔氨基脂化和聚乙二醇化的阳离子肽化合物中PEG链的特定分子量可特别有利于掺入本公开的复合物中。例如，在一些实施方案中，PEG链的分子量为350-6,000克/摩尔、1,000-5,000克/摩尔或2,000-5,000克/摩尔。在某些实施方案中，叔氨基脂化和聚乙二醇化的阳离子肽化合物的PEG链具有约350克/摩尔、500克/摩尔、600克/摩尔、750克/摩尔、1,000克/摩尔、2,000克/摩尔、3,000克/摩尔或5,000克/摩尔的分子量。在某些其他实施方案中，PEG脂质的PEG链具有约500克/摩尔、750克/摩尔、1,000克/摩尔、2,000克/摩尔或5,000克/摩尔的分子量。
然而，应当认识到，式(I)的叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物可以包含几个短的低聚乙二醇部分，而不是更少的较长聚乙二醇部分，并为复合物提供类似的颗粒稳定性。在其中聚乙二醇化的化合物为式(I)的N-聚乙二醇化阳离子肽化合物的一些实施方案中，叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物包含至少一个式-CH2CH2O(CH2CH2O)uR2a的乙二醇部分R2，其中每个R2a独立地为-H或C1-C4烷基。在其他实施方案中，至少一个式-CH2CH2O(CH2CH2O)vR6a的乙二醇部分R6，其中每个R6a独立地为-H或C1-C4烷基。在可与前述任一实施方案(其中m是非零的)组合的一些实施方案中，m是0至10的整数，其中每个u独立地是2到200的整数。在可与其中t是非零的任何前述实施方案组合的再其他实施方案中，t是0至10的整数，其中每个v独立地是2到200的整数。
在一些实施方案中，PEG脂质是如本文所述的式(I)的叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物，其中m和t中的至少一个是非零的，且n和s中的至少一个是非零的(即，N-脂化的)。在其中式(I)的N-聚乙二醇化阳离子肽化合物也是N-脂化的某些实施方案中，n和s中的至少一个是非零的。在一些实施方案中，n和s之和为至少1、2、3或4。在某些实施例中，s为4。在再进一步的实施方案中，n为4。
聚阴离子化合物
如本文所述，包含本公开的脂化阳离子肽化合物的多组分脂质组合物可用于与一种或多种聚阴离子化合物(例如核酸)的复合。在一个方面，本公开提供了包含含有与一种或多种脂化的阳离子肽化合物复合的复合物和两种或更多种其他脂质组分的组合物。
在一些实施方案中，一种或多种聚阴离子化合物包括核酸。本文所用的核酸包括天然存在的核酸，例如DNA、RNA和/或其杂合体，以及具有非天然主链和修饰的主链连接如硫代磷酸酯、非天然和修饰的碱基以及非天然和修饰的末端的非天然存在的变体。示例性的核酸包括基因组DNA、cDNA、mRNA、miRNA和siRNA。
核酸可以是重组产生的或化学合成的分子。核酸可以是单链、双链、三链和四链的，以及更复杂的三维形式(包括单链和双链区域)。
根据核酸的类型，核酸的长度(适当地以核苷酸单元或碱基对(bp)定义)可能变化。在其中所述核酸为mRNA的一些实施方案中，mRNA可具有100至10,000个核苷酸单元或1,000至3,000个核苷酸单元。在其中核酸为DNA的其他实施方案中，DNA可具有5,000bp至20,000bp，或约10,000bp。
在其中核酸是mRNA的一些实施方案中，mRNA是编码蛋白质或肽的mRNA。在其中所述核酸是mRNA的一些实施方案中，mRNA是编码肽(包括寡肽或多肽)的mRNA。在某些实施方案中，mRNA是编码多肽的mRNA。在再进一步的实施方案中，mRNA是编码蛋白质的mRNA。在其他实施方案中，mRNA是编码肽的mRNA。如上所述，mRNA可以是天然存在的(例如，分离的肿瘤RNA)，或可以是合成的(例如，通过体外转录产生)。对于合成的或非天然存在的mRNA变体，mRNA可包含具有修饰的主链连接如硫代磷酸酯、非天然和修饰的碱基和/或非天然和修饰的末端的非天然主链。在其中所述核酸是mRNA的某些实施方案中，mRNA可包含特殊序列，如自扩增序列或内部核糖体进入位点。
在一些实施方案中，两种或多种特定核酸一起的联合递送对于治疗应用可能特别有用。例如，在一些实施方案中，一种或多种聚阴离子化合物包括作为CRISPR序列的sgRNA(单指导RNA)和编码Cas9的mRNA的组合。在再进一步的实施方案中，核酸也可以与蛋白质复合，例如与CRISPR/Cas9核糖核蛋白复合物复合。
在一些实施方案中，一种或多种聚阴离子化合物可包括非核酸的阴离子或聚阴离子化合物。合适的阴离子化合物可包括但不限于蛋白质、聚磷酸盐或肝素。在一些实施方案中，一种或多种聚阴离子化合物包括一种或多种蛋白质。在一个实施方案中，一种或多种聚阴离子化合物包括Cas9蛋白。在其他实施方案中，一种或多种聚阴离子化合物包括聚磷酸盐。在再其他实施方案中，一种或多种聚阴离子化合物包括肝素或其他糖胺聚糖衍生物。
包含本文所述脂化阳离子肽化合物与其他脂质组分的多组分脂质制剂也可用于与其他非阴离子试剂或负载(包括疏水化合物)形成复合物以递送至细胞中。这些其他负载可包括但不限于，例如，一种或多种小分子活性剂或药物物质(作为单独的治疗剂或与另一药剂(如核酸)组合)和/或免疫佐剂。应当进一步认识到，这些其他负载分子可以与本文所述的任何聚阴离子化合物组合或不组合用于复合。在一些实施方案中，本文所述的复合物包含内体逃逸调节剂、TLR激动剂和化学治疗剂。在其他实施方案中，本公开的复合物包含佐剂或免疫共刺激剂。例如，在一些实施方案中，复合物包含选自CpG寡脱氧核苷酸(ODNs)、脂多糖(LPS)及其任何组合的免疫佐剂。
复合物和组合物的性质
如上所述，本公开的组合物包含含有一种或多种聚阴离子化合物和脂质组分的复合物，其中脂质组分包含一种或多种脂化的阳离子肽化合物、一种或多种磷脂、一种或多种屏蔽脂质和任选地一种或多种结构脂质。本文所述的复合物和组合物的物理性质可受到对于给定聚阴离子化合物的脂质组分的特定选择以及复合物和组合物中各组分的量的影响。在一些实施方案中，复合物及其组合物中的脂质组分可通过脂质组分(单独或组合)相对于存在的总脂质组分的质量百分比和/或单个脂质组分相对于彼此的质量比表征。
在一些实施方案中，本公开的组合物通过存在的脂质组分的质量百分比表征。如本文所述，脂质组分的总质量或重量是存在的任何脂化的阳离子肽化合物、任何结构脂质、任何磷脂和任何屏蔽脂质的单个质量的总和。
在一些实施方案中，本文所述的组合物包含含有一种或多种脂化阳离子肽化合物的复合物。在前述的一些变型中，组合物和其中的复合物包含脂质组分总重量的40-80％w/w的一种或多种脂化的阳离子肽化合物。在某些变型中，组合物和其中的复合物包含脂质组分总重量的40-70％w/w的一种或多种脂化的阳离子肽化合物。在前述的其他变型中，组合物和其中的复合物包含脂质组分总重量的40-80％w/w的一种或多种式(I)的叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物或其盐。在某些变型中，组合物和其中的复合物包含脂质组分总重量的40-70％w/w的一种或多种式(I)的叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物或其盐。在前述的再其他的变型中，组合物和其中的复合物包含脂质组分总重量的40-80％w/w的一种或多种式(II)的类脂质。在某些变型中，组合物和其中的复合物包含脂质组分总重量的40-70％w/w的一种或多种式(II)的类脂质。
如本文所述，包含复合物的组合物可任选地包含一种或多种结构脂质。在可与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，组合物和其中的复合物包含脂质组分总重量的0-25％w/w的一种或多种结构脂质。在某些变型中，组合物和其中的复合物包含脂质组分总重量的0-25％w/w的胆固醇。
本文所述的组合物和复合物还包含一种或多种磷脂。在再其他的实施方案中，组合物和其中的复合物包含脂质组分总重量的10-60％w/w的一种或多种磷脂。在某些变型中，组合物和其中的复合物包含脂质组分总重量的20-40％w/w的一种或多种磷脂。在一些实施方案中，组合物和其中的复合物包含脂质组分总重量的10-60％w/w的1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)。在某些实施方案中，组合物和其中的复合物包含脂质组分总重量的20-40％w/w的1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)。
在进一步的实施方案中，组合物和其中的复合物包含一种或多种屏蔽脂质。在一些实施方案中，组合物和其中的复合物包含脂质组分总重量的1-5％的一种或多种屏蔽脂质。在某些实施方案中，组合物和其中的复合物包含脂质组分总重量的1-5％的一种或多种PEG脂质。在再其他的实施方案中，组合物和其中的复合物包含脂质组分总重量的1-5％的1,2-二肉豆蔻基-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇(DMG-PEG)。
在再其他的实施方案中，本公开的组合物和其中的复合物包含脂质组分总重量的40-80％w/w的一种或多种脂化的阳离子肽化合物；0-25％w/w的一种或多种结构脂质；10-60％w/w的磷脂；和1-5％的一种或多种屏蔽脂质。还在进一步的实施方案中，本公开的组合物和其中的复合物包含脂质组分总重量的40-70％w/w的一种或多种脂化的阳离子肽化合物；0-25％w/w的一种或多种结构脂质；20-40％w/w的磷脂；和1-5％的一种或多种屏蔽脂质。
在其他实施方案中，本公开的组合物和其中的复合物包含脂质组分总重量的40-80％w/w的一种或多种式(I)的叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物或其盐；0-25％w/w的胆固醇；10-60％w/w的DOPE；和1-5％的DMG-PEG2000。还在进一步的实施方案中，本公开的组合物和其中的复合物包含脂质组分总重量的40-70％w/w的一种或多种式(I)的叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物或其盐；0-25％w/w的胆固醇；20-40％w/w的DOPE；和1-5％的DMG-PEG2000。
还在其他的实施方案中，本公开的组合物和其中的复合物包含脂质组分总重量的40-80％w/w的一种或多种式(II)的类脂质；0-25％w/w的胆固醇；10-60％w/w的DOPE；和1-5％的DMG-PEG2000。还在进一步的实施方案中，本公开的组合物和其中的复合物包含脂质组分总重量的40-70％w/w的一种或多种式(II)的类脂质；0-25％w/w的胆固醇；20-40％w/w的DOPE；和1-5％的DMG-PEG2000。
在其中复合物包含脂化的阳离子肽化合物、核酸、磷脂、PEG脂质以及任选地结构脂质的一些实施方案中，复合物可通过单个组分彼此的质量比，或者一种或多种组分与一种或多种其他组分的质量比表征。例如，在一些实施方案中，本公开的组合物和复合物可以通过脂化的阳离子肽化合物与磷脂与结构脂质(如果存在)与屏蔽脂质的第一质量比和脂化的阳离子肽化合物与核酸的第二质量比来描述。或者，在其他实施方案中，本文提供的组合物和复合物可通过总脂质组分与核酸的质量比来描述，其中总脂质组分包括存在的任何脂化的阳离子肽化合物、结构脂质、磷脂和屏蔽脂质。
在另一方面，本公开的复合物和组合物可通过单个组分彼此的质量比表征。例如，如本文所述，本公开的复合物包含一种或多种磷脂和任选地一种或多种结构脂质。在其中组合物包含含有一种或多种结构脂质和一种或多种磷脂的复合物的一些实施方案中，组合物可通过一种或多种结构脂质与一种或多种磷脂的质量比表征。在一些实施方案中，一种或多种结构脂质(当存在时)与一种或多种磷脂的质量比在0.5:1至2:1之间。在其中组合物包含胆固醇和DOPE的某些实施方案中，胆固醇与DOPE的质量比在0.5:1至2:1之间。
就本公开的复合物和组合物中存在的聚阴离子化合物而言，复合物以及因此组合物内的聚阴离子化合物的量可通过多种方式表征。在一些实施方案中，本文所述的组合物和复合物可通过脂化的阳离子肽化合物上的阳离子基团数与核酸上阴离子磷酸酯基团数的比率表征。在一些实施方案中，复合物包含阳离子:阴离子电荷比为0.5:1至20:1、0.5:1至10:1、0.5:1至5:1、1:1至20:1、1:1至10:1、1:1至5:1、2:1至20:1、2:1至10:1或2:1至5:1的脂化的阳离子肽化合物和核酸。在某些实施方案中，复合物包含阳离子:阴离子电荷比2:1至5:1的脂化阳离子肽化合物和核酸。还在进一步的其他实施方案中，复合物包含阳离子:阴离子电荷比3:1的脂化阳离子肽化合物和核酸。
或者，本文所述的复合物和包含该复合物的组合物可通过复合物中脂化的阳离子肽化合物与聚阴离子化合物和/或其他负载的相对质量比表征。基于用于制备复合物的各组分储备溶液的已知浓度和体积可以容易地计算复合物中组分的质量比。此外，如果复合物中存在非阴离子负载，则质量比可以提供与阳离子:阴离子电荷比相比更精确的脂化的阳离子肽化合物与总体负载的相对量的表示，该阳离子:阴离子电荷比不考虑非阴离子材料。
在一些实施方案中，复合物包含质量比为0.5:1至20:1、0.5:1至10:1、0.5:1至5:1、1:1至20:1、1:1至10:1、1:1至5:1、2:1至20:1、2:1至10:1或2:1至5的一种或多种脂化的阳离子肽化合物与一种或多种聚阴离子化合物和/或非阴离子化合物。在某些实施方案中，复合物包含质量比为2:1至5:1的一种或多种脂化的阳离子肽化合物和一种或多种聚阴离子化合物和/或非阴离子化合物。还在进一步的其他实施方案中，复合物包含质量比为3:1的一种或多种脂化的阳离子肽化合物和一种或多种聚阴离子化合物和/或非阴离子化合物。
在其中复合物包含核酸的某些实施方案中，复合物包含质量比为0.5:1至20:1、0.5:1至10:1、0.5:1至5:1、1:1至20:1、1:1至10:1、1:1至5:1、2:1至20:1、2:1至10:1或2:1至5:1的脂化阳离子肽化合物和核酸。在某些实施方案中，复合物包含质量比为2:1至5:1的脂化阳离子肽化合物和核酸。还在其他的实施方案中，复合物包含质量比为3:1的脂化阳离子肽化合物和核酸。
在再其他的实施方案中，复合物及其组合物中存在的聚阴离子化合物的量可以通过脂质组分(脂化的阳离子肽化合物、磷脂、屏蔽脂质和结构脂质(如果存在))与一种或多种聚阴离子化合物的质量比表征。在一些实施方案中，脂质组分与一种或多种聚阴离子化合物的质量比为0.5:1至20:1、0.5:1至10:1、0.5:1至5:1、1:1至20:1、1:1至10:1、1:1至5:1、2:1至25:1、2:1至20:1、2:1至10:1或2:1至5:1。在某些实施方案中，脂质组分与一种或多种聚阴离子化合物的质量比为5:1至10:1或6:1至7:1。
本公开的复合物包含与至少一种聚阴离子化合物或其他合适的负载化合物复合的至少一种脂化的阳离子肽化合物。在一些实施方案中，本文所述的复合物可包含一种或多种式(I)的叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物。在其他实施方案中，本文提供的复合物包含一种或多种式(II)的类脂质。本公开的多种脂化阳离子肽化合物的混合物和组合在单一复合物中的使用可以使得能够制备针对特定药代动力学和药效学性质定制的制剂。相关的药代动力学和药效学性质可包括但不限于生物分布、免疫原性、制剂稳定性、包封百分比、转染效率、血浆半衰期等。不同的应用可能需要这些性质的不同组合。
例如，在某些实施方案中，复合物可包含一种或多种富阳离子的叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物与一种或多种高度脂化的叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物的组合。理论上，通过提供更大的电荷稳定性(通过富阳离子的肽化合物)以及更大的亲脂屏蔽(通过脂化的肽化合物)，这种组合可以赋予改善的聚阴离子化合物的递送。应当进一步认识到，可以调整单个脂化的阳离子肽化合物各自的单独量以获得所需的性质。
另外的组分
还可以向复合物添加另外的组分以促进聚阴离子负载的高度包封和/或其靶向的受控释放。这些另外的组分可包括例如聚合物和表面活性组分。
如本公开中所提供的，复合物可包括可用于向细胞递送核酸负载和其他化合物的进一步组分。这些组分可包括但不限于共同形成例如超复合物或与脂质纳米颗粒相当的其他递送系统(例如，混合脂质-聚合物纳米颗粒)的那些组分。
聚合物掺入本文所述的复合物中可通过形成聚合物纳米颗粒囊泡或者在另外的脂质组分存在下形成混合脂质-聚合物纳米颗粒来稳定包含脂化的阳离子肽化合物和聚阴离子化合物的复合物。在一些实施方案中，本公开的复合物包含聚合物。合适的聚合物可包括中性聚合物(例如聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)或聚乙醇酸(PGA))、阴离子聚合物(包括聚(天冬氨酸)、聚(谷氨酸)和肝素)和/或阳离子聚合物(例如，聚乙烯亚胺、鱼精蛋白)。
在其他实施方案中，本文所述的复合物和组合物包含表面活性组分，如靶向配体、稳定剂和/或表面活性剂。
在另一方面，本公开提供了包含含有本文所述复合物的组合物的制剂。本文所述的制剂包括用于制备本文的复合物的储备溶液的混合物以及用于施用的纯化药物制剂。应当理解，包含本公开的复合物的制剂也必然包含本文所述复合物中存在的组分。
在一些实施方案中，制剂为溶液、悬浮液、胶体悬浮液、喷雾或气溶胶。在其他实施方案中，制剂为脂质复合物制剂。在一些实施方案中，制剂为肠内制剂、胃肠外制剂或局部制剂。在一些实施方案中，制剂为可注射制剂，例如静脉内制剂、皮下制剂、肌内制剂、皮内制剂、眼内制剂或鞘内制剂。在其他实施方案中，制剂为口服制剂。在再其他的实施方案中，制剂为粘膜制剂，包括例如鼻制剂、肛门内制剂、口腔制剂或阴道内制剂等。
如以上针对本公开的复合物和组合物所述的，本文提供的组合物可包含一种或多种脂化的阳离子肽化合物、一种或多种磷脂、一种或多种屏蔽脂质以及任选地一种或多种结构性脂质与一种或多种聚阴离子化合物和/或非阴离子化合物。除了脂化的阳离子肽、其他脂质组分和一种或多种聚阴离子化合物和/或非阴离子化合物外，应当认识到，制剂中还可包含再进一步的组分以调节其药代动力学和药效学性质。
应进一步认识到，用于制备本公开的复合物和制剂的组分以及用于制备所述复合物或制剂的工艺参数可根据复合物和/或制剂是否旨在立即使用(“及时”)或储存以备将来使用而进行适应。特别地，对于储存的考虑因素可包括复合物和/或制剂保持的温度(例如，在室温、4℃、-20℃、-78℃下)和储存持续时间。
合适的赋型剂可包括但不限于有助于施用或提高储存稳定性的那些赋型剂(例如，冷冻保护剂)。例如，除了上述组分外，本文所述的制剂可包含药学上可接受的赋形剂，如载体、溶剂、分散剂、稀释剂、填充剂、稳定剂、防腐剂等。
制备复合物及其组合物的方法
可通过多种物理和/或化学方法制备脂化的阳离子肽化合物、其他脂质组分和聚阴离子化合物的复合物及其组合物以调节其物理、化学和生物学性质。这些通常包括在水中或与水混溶的有机溶剂中的脂化的阳离子肽化合物(例如，叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽或类脂质)与在水或水性缓冲液中的所需的聚阴离子化合物(例如，寡核苷酸)快速组合。这些方法可包括通过移液或微流体混合工艺(例如涉及T型混合器、涡流混合器或其他无序混合结构的那些)的组分简单混合。本公开的组合物可以类似方式制备。
在一个方面，本公开提供了制备本文所述的复合物和组合物的方法，包括将一种或多种脂化的阳离子肽化合物、一种或多种磷脂、一种或多种屏蔽脂质和任选地一种或多种结构脂质与一种或多种聚阴离子化合物接触。在一些实施方案中，本文提供了制备组合物的方法，包括将一种或多种叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物、一种或多种磷脂、一种或多种屏蔽脂质和任选地一种或多种结构脂质与一种或多种聚阴离子化合物接触。在其他实施方案中，本文提供了制备组合物的方法，包括将一种或多种类脂质、一种或多种磷脂、一种或多种屏蔽脂质和任选地一种或多种结构脂质与一种或多种聚阴离子化合物接触。
在一些实施方案中，制备包含含有一种或多种聚阴离子化合物、一种或多种脂化的阳离子肽化合物、一种或多种磷脂、一种或多种屏蔽脂质和任选地一种或多种结构脂质的复合物的组合物的方法包括将包含一种或多种脂化的阳离子肽化合物、一种或多种磷脂、一种或多种屏蔽脂质和任选地一种或多种结构脂质的溶液与包含一种或多种聚阴离子化合物的溶液接触。在某些实施方案中，聚阴离子化合物包括核酸。在一些实施方案中，一种或多种脂化的阳离子肽化合物包括一种或多种叔氨基脂化的和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物。在其他实施方案中，一种或多种阳离子化合物包括一种或多种类脂质。
复合物和组合物中的另外的组分，例如聚合物、表面活性剂、靶向剂或赋形剂的另外组分，可以在聚阴离子化合物和脂质组分的主要组分组合之前、期间或之后与组合物混合和组合。
制备本文所述复合物和组合物的特定工艺条件可相应调整或选择以提供组合物所需的物理性质。例如，可能影响最终组成的用于混合组合物组分的参数可包括但不限于混合的顺序、混合的温度、混合速度/速率、流速、储备溶液浓度、组分质量比(例如，肽:负载)和溶剂。
使用复合物及其制剂的方法
如上所述，本文所述的组合物有助于将聚阴离子化合物递送至细胞，特别是细胞内环境。因此，组合物可用于许多临床应用和研究应用。将聚阴离子化合物递送至细胞可用于临床应用，例如与预防、诊断和/或治疗方法相关的那些应用。例如，在一些实施方案中，合适的临床应用可包括疫苗接种、癌症免疫治疗、蛋白质替代治疗和/或体内基因编辑、离体细胞治疗转染、离体干细胞诱导。将聚阴离子化合物递送至细胞的方法也可用于研究或非临床应用，包括生物测定和试剂。
在另一方面，本文提供了向细胞递送聚阴离子化合物的方法。在一些实施方案中，将聚阴离子化合物递送至细胞的方法包括使细胞与包含一种或多种聚阴离子化合物和脂质组分的复合物接触，其中脂质组分包含任选地一种或多种结构脂质；一种或多种磷脂；一种或多种屏蔽脂质；和一种或多种脂化的阳离子肽化合物。在其他实施方案中，将聚阴离子化合物递送至细胞的方法包括使细胞与包含一种或多种聚阴离子化合物和脂质组分的复合物接触，其中脂质组分包含任选地一种或多种结构脂质；一种或多种磷脂；一种或多种屏蔽脂质；和一种或多种式(I)的叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物或其盐。在再其他的实施方案中，将聚阴离子化合物递送至细胞的方法包括使细胞与包含一种或多种聚阴离子化合物和脂质组分的复合物接触，其中脂质组分包含任选地一种或多种结构脂质；一种或多种磷脂；一种或多种屏蔽脂质；和一种或多种式(II)的类脂质。在前述方法的一些实施方案中，接触是通过内吞作用。
在再其他的实施方案中，将聚阴离子化合物递送至细胞的方法包括使细胞与包含含有一种或多种聚阴离子化合物和脂质组分的复合物的组合物接触，其中所述脂质组分包含任选地一种或多种结构脂质；一种或多种磷脂；一种或多种屏蔽脂质；和一种或多种脂化的阳离子肽化合物。在其他实施方案中，将聚阴离子化合物递送至细胞的方法包括使细胞与包含含有一种或多种聚阴离子化合物和脂质组分的复合物的组合物接触，其中所述脂质组分包含任选地一种或多种结构脂质；一种或多种磷脂；一种或多种屏蔽脂质；和一种或多种式(I)的叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物或其盐。在再其他的实施方案中，将聚阴离子化合物递送至细胞的方法包括使细胞与包含含有一种或多种聚阴离子化合物和脂质组分的复合物的组合物接触，其中所述脂质组分包含任选地一种或多种结构脂质；一种或多种磷脂；一种或多种屏蔽脂质；和一种或多种式(II)的类脂质。
在前述方法的一些实施方案中，将聚阴离子化合物递送至细胞的方法包括使细胞与包含一种或多种聚阴离子化合物和脂质组分的复合物接触，其中脂质组分包含任选地一种或多种结构脂质；一种或多种磷脂；一种或多种屏蔽脂质；和一种或多种脂化的阳离子肽化合物，其中细胞在体外、离体或在体内接触。在某些实施方案中，向细胞递送聚阴离子化合物的方法包括使细胞与包含一种或多种聚阴离子化合物和脂质组分的复合物接触，其中脂质组分包含一种或多种结构脂质；一种或多种磷脂；一种或多种屏蔽脂质；和一种或多种脂化的阳离子肽化合物，其中细胞在体外、离体或在体内接触。
在其他实施方案中，将聚阴离子化合物递送至细胞的方法包括使细胞与包含含有一种或多种聚阴离子化合物和脂质组分的复合物的组合物接触，其中所述脂质组分包含任选地一种或多种结构脂质；一种或多种磷脂；一种或多种屏蔽脂质；和一种或多种脂化的阳离子肽化合物，其中细胞在体外、离体或在体内接触。在某些实施方案中，将聚阴离子化合物递送至细胞的方法包括使细胞与包含含有一种或多种聚阴离子化合物和脂质组分的复合物的组合物接触，其中脂质组分包含一种或多种结构脂质；一种或多种磷脂；一种或多种屏蔽脂质；和一种或多种脂化的阳离子肽化合物，其中细胞在体外、离体或在体内接触。
在其中细胞在体外接触的一些实施方案中，细胞是HeLa细胞。在其中细胞在体内接触的其他实施方案中，本公开的复合物或其组合物或其制剂施用于哺乳动物受试者。哺乳动物受试者可包括但不限于人或小鼠受试者。在其中细胞离体接触的再其他的实施方案中，细胞从人或小鼠受试者获得。
在其中细胞在体内接触的前述方法的一些实施方案中，本文所述的复合物和组合物可通过注射施用。在某些实施方案中，本文所述的复合物及其组合物可通过注射(静脉内(IV)、皮下(SC)、肌内(IM)、鞘内)施用。在一些实施方案中，复合物和组合物通过静脉内(IV)、皮下(SC)、肌内(IM)或鞘内注射施用。在其他实施方案中，本文所述的复合物和组合物通过浓注或静脉输注施用。在其中细胞在体内接触的其他实施方案中，本公开的复合物和组合物通过经鼻或经口吸入施用。在其中细胞在体内接触的一些实施方案中，本文所述的复合物和组合物经口施用。在其中细胞在体内接触的再其他的实施方案中，复合物和组合物通过吸收到粘膜中(包括局部、肛门内、口腔、阴道内等)施用。
应当理解，临床应用，例如以上公开的诊断、预防和治疗实例，可涉及给药方案(例如，施用的剂量水平和时间进程)，其可针对所使用的具体复合物和组合物、施用途径、复合物和组合物的施用对象和/或期望的生理效果而适当变化。例如，在一些实施方案中，本公开的方法包括以0.001mg/kg至约1mg/kg体重的剂量施用复合物或组合物。
实施例
通过参考以下实施例将更好地理解当前公开的主题，这些实施例提供作为本发明的示例而非限制。
实施例1-用于核酸递送的示例性叔氨基脂化阳离子肽的合成
以下实施例描述了合成如本文所述的式(I)的叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物的一般方案。
Figure BDA0002987930770000651
在以下提供的描述中，所有Ra和Rb均为-H。所有聚合物使用溴乙酸和伯胺合成。图2B-2E提供了制备本公开的叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物的R2、R3、R4、R5和R6处的伯胺的一些示例性取代基。
Fmoc-Rink酰胺树脂用作固体支持物。树脂上的Fmoc基团用20％(v/v)哌啶-二甲基甲酰胺(DMF)脱保护。氨基树脂然后用溴乙酸酰胺化。随后通过用伯胺亲核取代溴对α-碳进行胺化。连续重复这两个步骤以产生所需的阳离子肽序列。
除非另有说明，所有反应和洗涤在室温下进行。树脂的洗涤是指向树脂添加洗涤溶剂(通常DMF或二甲基亚砜(DMSO))，搅拌树脂以获得均匀的浆料，然后将溶剂从树脂彻底排干。通过反应容器的烧结底部真空过滤除去溶剂，直至树脂表现为干的。在所有的合成中，树脂浆料通过烧结容器的底部鼓泡氩气进行搅拌。
初始树脂脱保护。烧结的反应容器中加载Fmoc-Rink酰胺树脂。将DMF加入树脂中，搅拌该溶液使树脂溶胀。然后，排干DMF。通过向树脂中加入DMF中的20％哌啶、搅拌树脂并排干树脂来去除Fmoc基团。向树脂中加入DMF中的20％哌啶，并搅拌15分钟，然后排干。然后用DMF洗涤树脂，六次。
酰化/酰胺化。然后去阻断的胺通过向树脂中加入DMF中的溴乙酸，随后加入DMF中的N,N-二异丙基碳二亚胺(DIC)酰化(图3A)。该溶液在室温下搅拌30分钟，然后排干。该步骤重复第二次。树脂然后用DMF洗涤两次和用DMSO洗涤一次。这是一个完整的反应循环。
亲核取代/胺化。酰化树脂用所需的伯胺或仲胺处理以经历在α-碳上溴离去基团的亲核取代(图3B)。重复该酰化/置换循环(图3C)直至获得所需的肽序列(图3D)。
从树脂的肽切割。干燥的树脂置于包含特氟龙涂覆的微型搅拌棒的玻璃闪烁小管中，并加入95％三氟乙酸(TFA)水溶液。将溶液搅拌20分钟，然后通过配备有聚乙烯玻璃料的固相萃取(SPE)柱过滤至聚丙烯锥形离心管中。
树脂用1mL 95％TFA洗涤。然后将合并的滤液从1:1的乙腈:水冻干三次。将冻干的肽(图3E)以5mg/mL的浓度重新溶解于无水乙醇或以10mg/mL的浓度溶解于DMSO中。
纯化和表征。重新溶解的粗肽通过制备型HPLC纯化。纯化后的肽通过LC-MS分析表征。
实施例2-代表性氨基脂化类肽的合成和表征
通过以上实施例1中所描述的亚单体方法用溴乙酸和N,N’-二异丙基碳二亚胺(DIC)合成氨基脂化类肽。聚苯乙烯支持的MBHA Fmoc保护的Rink酰胺(200毫克代表性规模，0.64毫摩尔/克加载，Protein Technologies)树脂用作固体支持物。对于溴乙酰化，树脂与2M溴乙酸和2M N,N’-二异丙基碳二亚胺(DIC)的1:1混合物组合5分钟。胺置换使用DMF中的1M胺溶液进行1小时。合成后，粗制类肽使用5ml的95:2.5:2.5三氟乙酸(TFA):水:三异丙基硅烷的混合物在室温下从树脂切割40分钟。通过过滤除去树脂，并使用Biotage V10蒸发器浓缩滤液。粗制类肽通过冻干从25％的MeCN水溶液进一步浓缩。在Waters AcquityUPLC Peptide BEH C4柱上使用Waters Acquity UPLC系统(具有Acquity Diode Array UV检测器和Waters SQD2质谱仪)在5-95％的梯度内分析纯度和身份。在Waters XBridgeBEH300 Prep C4柱上通过具有Waters 2489UV/可见光检测器的制备型Waters Prep150LC系统在30分钟内使用具有0.1％TFA的水中的5-40％乙腈梯度纯化选择的粗制类肽。
表1A显示了通过实施例2中所描述的方法制备的代表性氨基脂化类肽。表1B提供了表1A中制备的氨基脂化类肽化合物1-72的表征数据，包括预测的分子量、保留时间(以分钟计，通过λ＝218nm的UPLC-UV测量确定)和主要的观察质荷比(m/z，MH+，通过电喷雾电离-质谱)。对于氨基脂化和聚乙二醇化的类肽化合物48、56、64和72中的每一种，由于类肽上连接的PEG部分的多分散性(平均分子量2000g/mol)，质谱包含几个峰分布。对于这些氨基脂化和聚乙二醇化的类肽化合物报告的质荷比率峰是MH22+峰分布的中心值，具有有效单体分离δ～22m/z(-OCH2CH2-，乙二醇分子量44g/mol)。
表1A
Figure BDA0002987930770000671
Figure BDA0002987930770000681
Figure BDA0002987930770000691
Figure BDA0002987930770000701
Figure BDA0002987930770000711
Figure BDA0002987930770000721
Figure BDA0002987930770000731
Figure BDA0002987930770000741
Figure BDA0002987930770000751
Figure BDA0002987930770000761
Figure BDA0002987930770000771
Figure BDA0002987930770000781
Figure BDA0002987930770000791
Figure BDA0002987930770000801
Figure BDA0002987930770000811
Figure BDA0002987930770000821
Figure BDA0002987930770000831
Figure BDA0002987930770000841
Figure BDA0002987930770000851
Figure BDA0002987930770000861
表1B
Figure BDA0002987930770000862
Figure BDA0002987930770000871
Figure BDA0002987930770000881
实施例3-代表性氨基脂化类肽与寡核苷酸的配制以形成纳米颗粒组合物
以下实施例描述了如本文所述的式(I)的叔氨基脂化和/或聚乙二醇化阳离子肽化合物与寡核苷酸的配制的一般方案。
在标准配制中，叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物以0.5mg/mL(用于体外实验)或5mg/mL(用于体内实验)的浓度溶解于无水乙醇中。所得溶液在室温下稳定，但应在-20℃下储存。核酸负载以0.2mg/mL(用于体外实验)或1mg/mL(用于体内实验)的最终浓度溶于不含DNAse或RNAse的水中。这些溶液应储存在-20℃下或在-78℃下(更长时间)。
为制备纳米颗粒制剂，叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物通过移液以约1:1(肽化合物:负载)至20:1的质量比与核酸混合。在配制前，将叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物和负载(如核酸)分别稀释在乙醇和酸性缓冲液(PBS，用0.1M HCl调节至pH 5.5)中至1:3的体积比，并以约0.05mg/mL至0.2mg/mL的最终负载浓度为目标。
实施例4-代表性的mRNA/类肽制剂的物理性质的表征
将实施例2中所描述的示例性氨基脂化的阳离子类肽1-36与萤火虫荧光素酶(Fluc)mRNA组合以形成用于针对体外或体内治疗和/或预防目的评估的纳米颗粒组合物。制剂根据实施例3的方案制备，并通过简单移液混合。
通过动态光散射(DLS)评估类肽:负载质量比5:1的mRNA/类肽制剂，以确定mRNA/类肽复合物的体积平均颗粒尺寸/直径(nm)和制剂内的尺寸多分散性指数(PDI)。通过Triton X-100在颗粒裂解之前和之后的Qubit RNA HS(Invitrogen)染料的荧光来确定示例性化合物的每种制剂的mRNA包封百分比。结果显示于下表2中。
表2
Figure BDA0002987930770000891
Figure BDA0002987930770000901
NA＝样品不适合于DLS测量
实施例5-用代表性Fluc mRNA/氨基脂化的阳离子类肽制剂处理后萤火虫荧光素酶(Fluc)的体外表达
基于其向培养的细胞递送萤火虫荧光素酶(Fluc)报告基因的能力，在体外评估了mRNA/氨基脂化类肽制剂的效力。将实施例2的氨基脂化的阳离子类肽1-36以5:1w/w的比率单独与Fluc mRNA组合，并将所得颗粒以100ng/孔(总体积100μL)的剂量加入培养的HeLa细胞中。在处理6小时和24小时后，通过发光板阅读仪测量所得的荧光素酶表达(RLU)。下表3显示了在两个时间点对于Fluc mRNA/氨基脂化类肽制剂观察到的荧光素酶表达。
表3.用代表性的Fluc mRNA/氨基脂化类肽制剂处理后萤火虫荧光素酶(Fluc)的体外表达
Figure BDA0002987930770000911
Figure BDA0002987930770000921
还对实施例2的示例性氨基脂化的阳离子类肽化合物1-18以2:1、3.5:1、5:1和7.5:1的类肽:mRNA质量比进行了体外荧光素酶表达测量。观察到的荧光素酶表达通过发光平板阅读仪作为平均生物发光(RLU)测量，如图4所示的。
实施例6-在多组分脂质制剂中用代表性Fluc mRNA/氨基脂化的类肽复合物处理后萤火虫荧光素酶(Fluc)的体外表达
基于其在体外向培养的HeLa细胞递送萤火虫荧光素酶(Fluc)报告基因的能力，评估了多组分脂质制剂中的mRNA/氨基脂化类肽的效力。使用胆固醇、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)和2-二肉豆蔻酰基-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000(DMG-PEG2000)相对于氨基脂化的类肽制备三种具有不同质量百分比的脂质组分的脂质制剂(类肽:胆固醇:DOPE:DMG-PEG2000，50:165:32:2、63:0:35:2和42:23:33:2)。然后将氨基脂化类肽的每种基础制剂以质量比7:1或10:1(类肽:负载)与mRNA组合。本实施例中评估的六种脂质制剂的组成如下表4所示。使用类脂质1代替氨基脂化的阳离子类肽化合物的制剂以表4中相同的质量百分比制备用于比较。
表4
Figure BDA0002987930770000931
细胞培养：在处理前18小时将HeLa细胞以10,000孔接种在100μL含有10％FBS和1％青霉素/链霉素的DMEM中，并使其粘附。在转染前立即用100μL新鲜的含血清DMEM替换培养基。
mRNA制备：采用标准体外转录(IVT)方法内部制备用于转染实验的Fluc mRNA。
mRNA配制：根据上述比例，使用氨基脂化类肽(化合物2和6-18)或类脂质1(乙醇中5mg/mL)、胆固醇(5mg/mL)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE，5mg/mL)和2-二肉豆蔻酰基-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000(DMG-PEG2000，0.5mg/mL)的主原液制备脂质混合物。考虑到剩余体积(并调整总脂与mRNA的有效比率)，加入100％的乙醇。然后将8μL的该脂质混合物以15ng/μL的浓度加入到24μL溶于酸化PBS(pH 5.5)中的mRNA。混合后，将10μL所得溶液加入到96孔板的相应孔中。所有处理一式三份进行，并且值表示为平均值。用所得溶液处理HeLa细胞6小时，之后用新鲜DMEM替换培养基。作为阴性对照，HeLa细胞用单独mRNA的溶液处理。对于Lipo条件，根据制造商的指示，mRNA用Lipofectamine2000(ThermoFisher)配制。
体外成像：在成像前，向每个孔中加入10μl的30mg/mL D-荧光素溶液，然后在37℃下孵育10分钟。这之后，使用SpectraMax iD3平板阅读仪(Molecular Devices)测量整个平板的发光。图5描绘了每种脂质制剂的观察的平均生物发光(RLU)的柱状图。
实施例7-用多组分质脂制剂中的代表性Fluc mRNA/氨基脂化类肽复合物处理后萤火虫荧光素酶(Fluc)的体外表达
进行了额外的实验以评价氨基脂化类肽1-72与胆固醇、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)和2-二肉豆蔻酰基-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000(DMG-PEG2000)的制剂至HeLa细胞的体外递送效率，其中类肽:胆固醇:DOPE:DMG-PEG2000的质量比为41:23:33:3且类肽:Fluc mRNA比率为10:1。
如实施例6中所述的方案被用于多组分脂质制剂氨基脂化类肽1-72的全组评估。简而言之，用制剂处理HeLa细胞6小时(每孔50ng Fluc mRNA)，之后培养基用新鲜的DMEM替换。在成像前，向每个孔中加入10μl的30mg/mL D-荧光素溶液，随后在37℃下孵育10分钟。之后，使用SpectraMax iD3平板阅读仪(Molecular Devices)测量整个平板的发光。观察到的氨基脂化类肽化合物1-72的平均发光(RLU)显示于图6A(化合物1-36)和图6B(化合物37-72)。所有处理一式三份进行，且值表示为平均值。
实施例8-在皮下施用代表性Fluc mRNA/氨基脂化多组分脂质制剂后萤火虫荧光素酶(Fluc)的体内全身表达。
通过皮下注射施用进一步评估氨基脂化类肽化合物对Balb/c小鼠(n＝3)的FlucmRNA体内递送效率。制备了包含氨基脂化类肽1-72与Fluc mRNA(2μg)、胆固醇、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)和2-二肉豆蔻酰基-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000(DMG-PEG2000)的多组分脂质制剂，其中类肽:胆固醇:DOPE:DMG-PEG2000的质量比为41:23:33:3和类肽:Fluc mRNA比率为10:1。制剂通过尾静脉注射以0.1毫克/千克的剂量(约2μgFluc mRNA/剂)施用，且6小时后定量所得的生物发光。
图7A和7B显示了Fluc在测试小鼠中的体内全身表达，其量化为平均生物发光(RLU)。
实施例9-在施用代表性Fluc mRNA/类脂质1多组分脂质制剂后萤火虫荧光素酶(Fluc)的体外表达。
进行进一步的实验以评估含有类脂质(具体地类脂质1)与胆固醇、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)和2-二肉豆蔻酰基-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000(DMG-PEG2000)的多组分脂质制剂向HeLa细胞递送Fluc mRNA的可行性。
具体而言，在以下范围(质量百分比)内评估四种脂质组分的不同比率：20-80％类脂质1；6-40％胆固醇；10-53％DOPE；且总脂质组分(类脂质1、胆固醇、DOPE和DMG-PEG2000)与mRNA的比率在5:1至8:1之间；在这些实验中，DMG-PEG2000的质量百分比保持恒定在2％。使用实施例6中所述的方案用于制备多组分制剂和体外生物发光分析。
通过在乙醇中预混合脂质组分，并将乙醇脂质溶液与Fluc mRNA水溶液复合制备了96种独特的制剂。乙醇与水溶液体积的比率保持在3:1水溶液:乙醇(体积/体积)。在乙醇与水溶液的固定比率内独立调节每种脂质组分的浓度。
用制剂处理HeLa细胞6小时(每孔50ng Fluc mRNA)，之后培养基用新鲜的DMEM替换。在成像前，向每个孔中加入10μl 30mg/mL的D-荧光素溶液，随后在37℃下孵育10分钟。之后，使用SpectraMax iD3平板阅读仪(Molecular Devices)测量整个平板的发光。所有测量一式三份进行，且值显示为平均值。
图8A显示了对于96种制剂中每一种测量的体外生物发光强度(RLU)的表格。图8A的不同象限代表四种不同的胆固醇:DOPE比率(左上象限0.5:1；右上象限1:1；左下象限1.5:1；和右下象限2:1)。基于对类脂质1的96种制剂中每一种所观察到的生物发光，观察到特定制剂表现出更好的mRNA递送效率。
根据对以上96种制剂的初步调查中观察的结果，选择了两种制剂进行进一步的体外评价。在初始调查中测试了一种制剂(制剂A，类脂质:胆固醇:DOPE:DMG-PEG2000的质量比50:16:32:2，和总脂质组分与mRNA的比率7:1)。基于将实验数据与二阶回归模型的拟合并获得全局最大值选择第二制剂(制剂B，类脂质:胆固醇:DOPE:DMG-PEG2000的质量比63:0:35:2，和总脂质组分与mRNA的比率6.12)。
在进一步的体外评估中，相对于不含递送媒介的mRNA(单独mRNA)、商业上可得的脂质纳米粒制剂中的mRNA(对照LNP试剂盒)和具有单独mRNA的类脂质1(类脂质1)评价了类脂质制剂A和B向HeLa细胞的Fluc mRNA递送效率。采用与上述相同的体外转染和生物发光测量的方案。
图8B描绘了对于以上每一种处理(单独的mRNA、对照LNP试剂盒、类脂质1、类脂质制剂A和类脂质制剂B)以及作为阴性对照的未处理的HeLa细胞记录的生物发光强度(RLU)的柱状图。如图8B所示，类脂质制剂A和制剂B显示出比单独的类脂质1更高的生物发光强度。

Claims (56)

1.一种组合物，其包含以下的复合物：
一种或多种聚阴离子化合物；和
脂质组分，其中所述脂质组分包括：
(i)任选地一种或多种结构脂质；
(ii)一种或多种磷脂；
(iii)一种或多种屏蔽脂质；和
(iv)一种或多种脂化的阳离子肽化合物，其中所述一种或多种脂化的阳离子肽化合物选自：
(a)一种或多种式(I)的叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物或其盐：
Figure FDA0002987930760000011
其中：
m是0至10的整数；
n是0至5的整数；
s是0至5的整数；
t是0至10的整数；
其中m、n、s和t中的至少一个是非零的；
r是1到20的整数；
每个o独立地为整数0、1或2；
每个q独立地为整数0、1或2；
每个p独立地为整数1或2；
R1是-H、烷基、烷基芳基、-COR1a或脂质部分，
其中R1a为-H、-OH、烷基、芳基、烷基芳基、-O-烷基或-O-烷基芳基；
每个R2独立地为式-CH2CH2O(CH2CH2O)uCH3的乙二醇部分，且其中每个u独立地为2至200的整数；
每个R3独立地为脂质部分；
每个R4独立地为中性间隔基部分或脂质部分；
每个R5独立地为阳离子部分；
每个R6独立地为式-CH2CH2O(CH2CH2O)vCH3的乙二醇部分，且其中每个v独立地为2至200的整数；
R7为-H、烷基、酰基、-OH、-OR7a、-NH2、-NHR7a或脂质部分，其中R7a是烷基、酰基或脂质部分；和
Ra和Rb各自独立地为-H、C1-C4烷基或者天然或非天然存在的氨基酸上的侧链部分；
(b)一种或多种式(II)的类脂质：
Figure FDA0002987930760000021
其中：
x是1至100的整数；
每个R9独立地为脂质部分；和
每个R10独立地为阳离子或中性间隔基部分；
和
(c)其任何组合。
2.根据权利要求1所述的组合物，其包含占所述脂质组分总重量的40-80％w/w的一种或多种脂化的阳离子肽化合物。
3.根据权利要求1或2所述的组合物，其包含占所述脂质组分总重量的40-70％w/w的一种或多种脂化的阳离子肽化合物。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的组合物，其中所述一种或多种脂化的阳离子肽化合物是一种或多种式(I)的叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物或其盐。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的组合物，其中n或s中的至少一个是非零的。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的组合物，其中所述一种或多种叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物包含N-脂化氨基酸残基的嵌段，其中n和s中的至少一个为至少2、至少3或至少4，任选地为2、3或4。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的组合物，其中每个R3独立地为C4-C22烷基或C4-C22烯基，并且其中所述C4-C22烯基任选地为单不饱和或多不饱和的。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的组合物，其中每个R3独立地为C8-C12烷基。
9.根据权利要求1至7中任一项所述的组合物，其中每个R3独立地选自2-乙基己-1-基、己酰基、油基、硬脂基、亚油基、肉豆蔻基和月桂基。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的组合物，其中所述一种或多种叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物中的至少一种包含含有至少两个具有阳离子部分R5的阳离子氨基酸残基的阳离子域。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的组合物，其中每个R5独立地为氨基烷基、烷基氨基烷基、氨基烷基氨基烷基、胍基烷基、N-杂环基烷基或N-杂芳基。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的组合物，其中每个R5独立地选自：
Figure FDA0002987930760000031
Figure FDA0002987930760000032
13.根据权利要求1至12中任一项所述的组合物，其中每个R5为
Figure FDA0002987930760000033
14.根据权利要求1至13中任一项所述的组合物，其中每个中性间隔基部分R4独立地为被环烷基、杂环基烷基、烷基芳基、芳基烷基、烷基杂芳基、杂芳基烷基、烷氧基、烷氧基烷基或羟烷基取代的C1-C4烷基，其中每个环烷基、杂环基烷基、烷基芳基、芳基烷基、烷基杂芳基、杂芳基烷基、烷氧基、烷氧基烷基或羟烷基任选地被一个或多个取代基-OH、卤基或烷氧基取代。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的组合物，其中每个中性间隔基部分R4独立地选自：
Figure FDA0002987930760000041
Figure FDA0002987930760000042
16.根据权利要求1至15中任一项所述的组合物，其中每个中性间隔基部分R4是
Figure FDA0002987930760000043
17.根据权利要求1至16中任一项所述的组合物，其中所述一种或多种叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物中的至少一种包含含有至少两个具有R5阳离子部分的氨基酸残基的阳离子域，并且其中所述阳离子域内的所述至少两个阳离子氨基酸残基中的每一个被至少一个具有中性间隔基或脂质部分R4的氨基酸残基分隔。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的组合物，其中所述一种或多种叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物包含至少一个三聚体亚单元-Rcation-Rneutral-Rneutral，并且其中Rcation是包含阳离子部分R5的氨基酸残基且每个Rneutral是包含中性间隔基部分R4的氨基酸残基。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的组合物，其中每个阳离子部分R5为
Figure FDA0002987930760000044
和每个中性间隔基部分R4为
Figure FDA0002987930760000045
20.根据权利要求1至19中任一项所述的组合物，其中
当m为0至3的整数时，每个u独立地为20至200的整数，任选地为30至50；和
当m为4至10的整数时，每个u独立地为2至10的整数。
21.根据权利要求1至20中任一项所述的组合物，其中
当t为0至3的整数时，每个v独立地为30至50的整数；
当t为4至10的整数时，每个v独立地为2至10的整数。
22.根据权利要求1至21中任一项所述的组合物，其中
m为1，且u为40至45的整数；或者
t为1，且v为40至45的整数。
23.根据权利要求1至22中任一项所述的组合物，其中Ra和Rb独立地选自-H和-CH3。
24.根据权利要求1至23中任一项所述的组合物，其中Ra和Rb为-H。
25.根据权利要求1所述的组合物，其中所述一种或多种脂化的阳离子肽化合物是一种或多种式(II)的类脂质。
26.根据权利要求25所述的组合物，其中所述一种或多种式(II)的类脂质为类脂质1。
27.根据权利要求1至26中任一项所述的组合物，其包含占所述脂质组分总重量的0-40％w/w的一种或多种结构脂质。
28.根据权利要求1至27中任一项所述的组合物，其包含占所述脂质组分总重量的0-25％w/w的一种或多种结构脂质。
29.根据权利要求1至28中任一项所述的组合物，其中所述一种或多种结构脂质选自胆固醇、粪甾醇、谷甾醇、麦角甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、菜籽甾醇、番茄碱、熊果酸、α-生育酚及其混合物。
30.根据权利要求1至29中任一项所述的组合物，其中所述一种或多种结构脂质为胆固醇。
31.根据权利要求1至30中任一项所述的组合物，其包含占所述脂质组分总重量的10-60％w/w的一种或多种磷脂。
32.根据权利要求1至31中任一项所述的组合物，其包含占所述脂质组分总重量的20-40％w/w的一种或多种磷脂。
33.根据权利要求1至32中任一项所述的组合物，其中所述一种或多种磷脂选自1,2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DLPC)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-磷酸胆碱(DMPC)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1,2-二-十一酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DUPC)、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)、1,2-二-O-十八烯基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:0 Diether PC)、1-油酰基-2-胆甾醇基半琥珀酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(OChemsPC)、1-十六烷基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(C 16 Lyso PC)、1,2-二亚麻酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二-二十二碳六烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1,2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(ME 16.0 PE)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二亚麻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二-二十二碳六烯酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-rac-(1-甘油)钠盐(DOPG)、鞘磷脂及其任何混合物。
34.根据权利要求1至33中任一项所述的组合物，其中所述一种或多种磷脂为1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)。
35.根据权利要求1至34中任一项所述的组合物，其包含占所述脂质组分总重量的1-5％w/w的一种或多种屏蔽脂质。
36.根据权利要求1至35中任一项所述的组合物，其中所述一种或多种屏蔽脂质为一种或多种PEG脂质，其选自PEG修饰的磷脂酰乙醇胺、PEG修饰的磷脂酸、PEG修饰的神经酰胺、PEG修饰的二烷基胺、PEG修饰的二酰基甘油、PEG修饰的二烷基甘油及其混合物。
37.根据权利要求1至36中任一项所述的组合物，其中所述一种或多种屏蔽脂质为1,2-二肉豆蔻基-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000(DMG-PEG2000)。
38.根据权利要求1至35中任一项所述的组合物，其中所述一种或多种屏蔽脂质包括一种或多种式(I)的叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物或其盐：
Figure FDA0002987930760000061
Figure FDA0002987930760000071
其中：
m是0至10的整数；
n是0至5的整数；
s是0至5的整数；
t是0至10的整数；
其中m和t中的至少一个是非零的；
r是1到20的整数；
每个o独立地为整数0、1或2；
每个q独立地为整数0、1或2；
每个p独立地为整数1或2；
R1为-H、烷基、烷基芳基、-COR1a或脂质部分，
其中R1a为-H、-OH、烷基、芳基、烷基芳基、-O-烷基或-O-烷基芳基；
每个R2独立地为式-CH2CH2O(CH2CH2O)uCH3的乙二醇部分，且其中每个u独立地为2至200的整数；
每个R3独立地为脂质部分；
每个R4独立地为中性间隔基部分或脂质部分；
每个R5独立地为阳离子部分；
每个R6独立地为式-CH2CH2O(CH2CH2O)vCH3的乙二醇部分，且其中每个v独立地为2至200的整数；
R7为-H、烷基、酰基、-OH、-OR7a、-NH2、-NHR7a或脂质部分，其中R7a是烷基、酰基或脂质部分；和
Ra和Rb各自独立地为-H、C1-C4烷基或者天然或非天然存在的氨基酸上的侧链部分。
39.根据权利要求38所述的组合物，其中所述一种或多种屏蔽脂质包括一种或多种式(I)的叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物或其盐，其中：
当m为0至3的整数时，每个u独立地为20至200的整数，任选地为30至50；和
当m为4至10的整数时，每个u独立地为2至10的整数。
40.根据权利要求38或权利要求39所述的组合物，其中所述一种或多种屏蔽脂质包括一种或多种式(I)的叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物或其盐，其中：
当t为0至3的整数时，每个v独立地为30至50的整数；
当t为4至10的整数时，每个v独立地为2至10的整数。
41.根据权利要求38至40中任一项所述的组合物，其中所述一种或多种屏蔽脂质包括一种或多种式(I)的叔氨基脂化和/或聚乙二醇化的阳离子肽化合物或其盐，其中：
m为1，和u为40至45的整数；或者
t为1，和v为40至45的整数。
42.根据权利要求1至37中任一项所述的组合物，其中所述脂质组分以所述脂质组分的总重量计包括：
a.40-70％w/w的一种或多种脂化的阳离子肽化合物；
b.0-25％w/w的胆固醇；
c.20-40％w/w的1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)；和
d.1-5％w/w的1,2-二肉豆蔻基-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000(DMG-PEG2000)。
43.根据权利要求42所述的组合物，其中胆固醇与DOPE的质量比为0.5:1至1:1。
44.根据权利要求1至43中任一项所述的组合物，其中所述一种或多种聚阴离子化合物包括核酸。
45.根据权利要求1至44中任一项所述的组合物，其中所述一种或多种聚阴离子化合物包括核酸，并且其中所述核酸是编码多肽的mRNA。
46.根据权利要求1至45中任一项所述的组合物，其中所述一种或多种聚阴离子化合物包括核酸，并且其中所述核酸是编码蛋白质的mRNA。
47.根据权利要求1至46中任一项所述的组合物，其中所述脂质组分与所述一种或多种聚阴离子化合物的质量比为2:1至25:1。
48.根据权利要求1至47中任一项所述的组合物，其中所述脂质组分与所述一种或多种聚阴离子化合物的质量比为5:1至10:1。
49.根据权利要求1至48中任一项所述的组合物，其包含一种或多种小分子活性剂或药物物质。
50.一种向细胞递送聚阴离子化合物的方法，包括使所述细胞与权利要求1至49中任一项的组合物接触。
51.根据权利要求50所述的方法，其中所述接触是通过内吞作用。
52.根据权利要求50或51所述的方法，其中所述细胞在体内或在体外接触。
53.根据权利要求50至52中任一项所述的方法，其中所述聚阴离子化合物包括作为编码所述多肽的mRNA的核酸，并且所述细胞在与所述复合物接触后表达所述多肽。
54.根据权利要求50至53中任一项所述的方法，其中所述聚阴离子化合物包括作为编码蛋白质的mRNA的核酸，并且所述细胞在与所述复合物接触后表达所述蛋白质。
55.一种制备权利要求1至49中任一项的组合物的方法，包括：
将一种或多种脂化的阳离子肽化合物、一种或多种磷脂、一种或多种屏蔽脂质和任选地一种或多种结构脂质与一种或多种聚阴离子化合物组合。
56.根据权利要求55所述的方法，包括将包含所述一种或多种脂化的阳离子肽化合物、一种或多种磷脂、一种或多种屏蔽脂质和任选地一种或多种结构脂质的溶液与包含所述一种或多种聚阴离子化合物的溶液接触。
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