ES2865030T3 - Estructuras de ARNip para una alta actividad y una inespecificidad reducida - Google Patents

Abstract

Molécula de ácido nucleico, en la que: a) la molécula tiene una cadena sentido del polinucleótido y una cadena antisentido del polinucleótido; b) cada cadena de la molécula tiene desde 15 hasta 30 nucleótidos de longitud; c) una región contigua de desde 15 hasta 30 nucleótidos de la cadena antisentido es complementaria a una secuencia de un ARNm; d) al menos una porción de la cadena sentido es complementaria a al menos una porción de la cadena antisentido, y la molécula tiene una región de dúplex de desde 15 hasta 30 nucleótidos de longitud, en la que uno o más de los nucleótidos en la región de dúplex en las posiciones de 3 a 8 desde el extremo 5' de la cadena antisentido son desoxinucleótidos, en la que la cadena antisentido tiene desoxinucleótidos en una pluralidad de posiciones, siendo la pluralidad de posiciones una de las siguientes: cada una de las posiciones 4, 6 y 8, desde el extremo 5' de la cadena antisentido; cada una de las posiciones 3, 5 y 7, desde el extremo 5' de la cadena antisentido; cada una de las posiciones 1, 3, 5 y 7, desde el extremo 5' de la cadena antisentido; cada una de las posiciones 3-8, desde el extremo 5' de la cadena antisentido; cada una de las posiciones 5-8, desde el extremo 5' de la cadena antisentido; y la molécula es una molécula de iARN activa para modular la expresión del ARNm.

Description

Estructuras de ARNip para una alta actividad y una inespecificidad reducida

Campo técnico de la invención

Esta invención se refiere a los campos de productos biofarmacéuticos y terapéuticos que se componen de moléculas basadas en ácidos nucleicos. Más particularmente, esta invención se refiere a las estructuras de compuestos que utilizan interferencia de ARN (iARN) para modular la expresión de genes, y a usos de las mismas.

Antecedentes de la invención

La interferencia de ARN (iARN) se ha usado para el silenciamiento génico postranscripcional específico de secuencia en animales mediado por ARN de interferencia pequeños (ARNip). Véase, por ejemplo, Zamore et al., Cell, 2000, vol.

101, págs. 25-33; Fire et al., Nature, 1998, vol. 391, págs. 806-811; Sharp, Genes & Development, 1999, vol. 13, págs.

139-141.

Una respuesta de la iARN en células puede desencadenarse por un ARN bicatenario (ARNbc), aunque el mecanismo aún no se entiende completamente. En general, los ARNip pueden tener desde aproximadamente 21 hasta aproximadamente 23 nucleótidos de longitud e incluir una región de dúplex de pares de bases de aproximadamente 19 nucleótidos de longitud.

La iARN implica un complejo de endonucleasa conocido como complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC). Un ARNip tiene una cadena antisentido o guía que entra en el complejo RISC y media la escisión de una diana de ARN monocatenario que tiene una secuencia complementaria a la cadena antisentido del dúplex de ARNip. La otra cadena del ARNip es la cadena pasajera. La escisión del ARN diana tiene lugar en medio de la región complementaria a la cadena antisentido del dúplex de ARNip Véase, por ejemplo, Elbashir et al., Genes & Development, 2001, vol. 15, págs. 188-200.

Para mejorar las propiedades de los compuestos de ARNip para su uso como agentes farmacológicos, la estructura de los compuestos de ARNip se ha modificado de diversas maneras para mejorar la estabilidad y reducir los efectos inespecíficos. La actividad inespecífica de un ARNip implica la modulación de ácidos nucleicos celulares distintos del ARN seleccionado como diana, lo que puede producirse a través de diversos mecanismos.

Las modificaciones de compuestos de ARNip incluyen variación estructural de la base, azúcar y/o estructura principal de cualquiera de los nucleótidos. Una manera de modificar los nucleótidos de ARNip es reemplazar determinados ribonucleótidos en el ARNip con desoxinucleótidos. En particular, los desoxinucleótidos se utilizan a menudo en los nucleótidos de proyección o terminales de la estructura de ARNip.

Sin embargo, un inconveniente del uso de desoxinucleótidos en una estructura de ARNip es que los desoxinucleótidos no pueden usarse en la región semilla del ARNip. Esto es porque tal modificación del ARNip no es favorable ya que se reduce la actividad de silenciamiento génico.

Existe la necesidad urgente de estructuras de iARN para modular la expresión de genes que reducen la acción inespecífica sin pérdida de actividad.

En particular, los productos terapéuticos basados en la supresión de oncogenes y genes relacionados con cáncer mediantre iARN requerirán secuencias y estructuras de ARNip muy potentes y estables.

Lo que se necesita son compuestos de ARNip con una estructura muy activa para modular la expresión génica.

Ge et al., RNA, vol. 16, n.° 1, páginas 118-130, 1 de enero de 2010 estudia los efectos de la modificación química sobre la potencia, estabilidad en suero y las propiedades inmunoestimuladoras de ARNhc pequeños. Chiu y Rana, RNA, vol. 9, n.° 9, páginas 1034-1048, 1 de enero de 2003 se refiere a la función de ARNip en la iARN y al análisis de modificación química.

Breve sumario

Esta invención se refiere a compuestos, composiciones y métodos para modular la expresión de genes diana usando interferencia de ARN. Los compuestos y estructuras de ARNip de esta divulgación pueden ser muy activos para modular la expresión génica.

Las estructuras de iARN de esta invención pueden usarse para modular la expresión de genes con niveles sorprendentemente altos de actividad y acciones inespecíficas reducidas.

En algunas realizaciones, esta invención proporciona moléculas para silenciamiento génico mediante interferencia de En realizaciones adicionales, esta invención proporciona moléculas para silenciamiento génico mediante interferencia de ARN que reducen la acción inespecífica, con actividad de silenciamiento génico inesperadamente alta.

Las moléculas de iARN de esta invención pueden proporcionar estructuras de ARNip muy potentes y estables que pueden usarse para productos terapéuticos basados en la supresión de genes mediante iARN.

En realizaciones adicionales, la estructuras, moléculas y composiciones de esta invención pueden usarse en métodos para prevenir o tratar enfermedades, o mejorar síntomas de estados o trastornos asociados con uno o más genes. Las realizaciones de esta invención incluyen lo siguiente:

Una molécula de ácido nucleico, en la que:

a) la molécula tiene una cadena sentido del polinucleótido y una cadena antisentido del polinucleótido;

b) cada cadena de la molécula tiene desde 15 hasta 30 nucleótidos de longitud;

c) una región contigua de desde 15 hasta 30 nucleótidos de la cadena antisentido es complementaria a una secuencia de un ARNm;

d) al menos una porción de la cadena sentido es complementaria a al menos una porción de la cadena antisentido, y la molécula tiene una región de dúplex de desde 15 hasta 30 nucleótidos de longitud, en la que uno o más de los nucleótidos en la región de dúplex en las posiciones de 3 a 8 desde el extremo 5' de la cadena antisentido son desoxinucleótidos, en la que la cadena antisentido de la molécula de ácido nucleico tiene desoxinucleótidos en una pluralidad de posiciones, siendo la pluralidad de posiciones una de las siguientes:

cada una de las posiciones 4, 6 y 8, desde el extremo 5' de la cadena antisentido;

cada una de las posiciones 3, 5 y 7, desde el extremo 5' de la cadena antisentido;

cada una de las posiciones 1, 3, 5 y 7, desde el extremo 5' de la cadena antisentido;

cada una de las posiciones 3-8, desde el extremo 5' de la cadena antisentido; y

cada una de las posiciones 5-8, desde el extremo 5' de la cadena antisentido, y la molécula es una molécula de iARN activa para modular la expresión del ARNm. El ARNm puede ser un ARNm humano.

Las moléculas de ácido nucleico pueden ser moléculas de iARN que son activas para modular la expresión del ARNm. En determinadas realizaciones, las moléculas de ácido nucleico pueden ser activas para inhibir la expresión de un gen seleccionado de genes que codifican para proteínas, proto-oncogenes, oncogenes, genes supresores de tumores y genes de señalización de células.

En realizaciones adicionales, el ARNm puede ser un ARNm humano que expresa cualquier miembro o submiembro de la familia humana de proteínas que incluye SRY, beta-globina, RAS, Gs T citosólica, GST mitocondrial, GST MAPEG, GST-rc, p16, p21, p53, albúmina sérica, colágeno de tipo VII, complemento C3, apolipoproteína B, fenilalanina hidroxilasa, factor VIII, huntingtina, proteína de retinoblastoma RB1, CFTR, titina, utrofina y distrofina.

Las moléculas de ácido nucleico pueden tener una CI50 para la atenuación génica del ARNm de menos de 100 pM, o menos de 50 pM, o menos 10 pM. En determinadas realizaciones, las moléculas de ácido nucleico pueden inhibir el ARNm en al menos el 25% in vivo después de una única administración de las moléculas.

En algunas realizaciones, cada cadena de la molécula tiene desde 18 hasta 22 nucleótidos de longitud. La región de dúplex puede tener 19 nucleótidos de longitud. En determinadas realizaciones, la cadena sentido del polinucleótido y la cadena antisentido del polinucleótido pueden estar conectadas como una única cadena, y formar una región de dúplex conectada en un extremo mediante un bucle.

Las moléculas de ácido nucleico pueden tener un extremo romo. En determinadas realizaciones, las moléculas de ácido nucleico pueden tener una o más proyecciones en 3'.

Las realizaciones de esta invención incluyen moléculas de ácido nucleico que tienen uno o más de los nucleótidos en la región de dúplex que están modificados o químicamente modificados. Los nucleótidos modificados o químicamente modificados pueden ser nucleótidos sustituidos con 2'-O-alquilo, nucleótidos sustituidos con 2'-desoxi-2'-fluoro, nucleótidos de fosforotioatos, nucleótidos bloqueados o cualquier combinación de los mismos.

Esta invención contempla además composiciones farmacéuticas que contienen las moléculas de ácido nucleico y un portador farmacéuticamente aceptable. El portador puede ser una molécula lipídica o un liposoma.

Las realizaciones de esta invención incluyen además una célula que contiene las moléculas de ácido nucleico.

Esta invención también contempla composiciones para su uso en métodos para prevenir, tratar o mejorar una enfermedad en un sujeto que lo necesita mediante silenciamiento génico, administrando al sujeto una composición que contiene las moléculas de ácido nucleico. La enfermedad puede ser tumor, cáncer, sarcoma o carcinoma malignos.

Las realizaciones de esta invención incluyen el uso de una composición de las moléculas de ácido nucleico para prevenir, tratar o mejorar una enfermedad o un estado en un sujeto que lo necesita.

En determinadas realizaciones, una composición de esta invención puede ser para su uso en terapia médica.

En realizaciones adicionales, una composición de esta invención puede ser para su uso en el tratamiento del cuerpo de un humano o animal.

En realizaciones adicionales, una composición de esta invención puede ser para preparar o fabricar un medicamento para prevenir, tratar o mejorar una enfermedad o estado en un sujeto que lo necesita.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1: la figura 1 muestra la reducción significativa de tumores de cáncer de pulmón ortotópicos in vivo mediante un ARNip de esta invención dirigido contra GST-rc. El ARNip de GST-rc se administró en una formulación liposomal a una dosis de 2 mg/kg a ratones atímicos desnudos que presentaban tumores de cáncer de pulmón ortotópicos A549. Los pesos finales del tumor primario se midieron en la necropsia para el grupo de tratamiento y un grupo de control con vehículo. El ARNip de GST-rc mostró una eficacia significativa para la inhibición de tumores de cáncer de pulmón en este estudio de seis semanas. Tal como se muestra en la figura 1, después de 43 días, el ARNip de GST-rc mostró una inhibición del tumor marcadamente ventajosa, con una reducción significativa de pesos promedio finales del tumor primario de 2,8 veces, en comparación con el control.

Figura 2: la figura 2 muestra la eficacia de inhibición del tumor in vivo para un ARNip de GST-rc. Se utilizó un modelo de xenoinjerto de cáncer usando células A549 con una dosis relativamente baja de ARNip a 0,75 mg/kg. El ARNip de GST-n: mostró una inhibición del tumor ventajosa en el plazo de unos pocos días. Después de 36 días, el ARNip de GST-n: mostró una inhibición del tumor marcadamente ventajosa, con una reducción significativa de volúmenes promedio finales del tumor de aproximadamente 2 veces, en comparación con el control.

Figura 3: la figura 3 muestra la eficacia de inhibición del tumor in vivo para un ARNip de GST-rc en el punto final de la figura 2. El ARNip de GST-rc mostró una inhibición del tumor ventajosa con una reducción de pesos promedio del tumor de más de 2 veces.

Figura 4: la figura 4 muestra que un ARNip de GST-rc de esta invención aumentó en gran medida la muerte de células cancerosas mediante apoptosis in vitro. El ARNip de GST-rc provocó la regulación por incremento de PUMA, un biomarcador para la apoptosis, que está asociado con la pérdida de viabilidad celular. En la figura 4, la expresión de PUMA se aumentó en gran medidad desde 2-6 días después de la transfección del ARNip de GST-rc.

Figura 5: la figura 5 muestra que un ARNip de GST-rc de esta invención proporcionó eficacia de atenuación génica para tumores de xenoinjerto A549 in vivo. La atenuación génica dependiente de la dosis de ARNm de GST-rc se observó en ratones hembra atímicos desnudos (nu/nu) (Charles River) con el ARNip dirigido contra GST-rc. Tal como se muestra en la figura 5, a una dosis de 4 mg/kg, se detectó una reducción significativa de aproximadamente el 40% en el ARNm de GST-rc 24 horas después de la inyección.

Figura 6: la figura 6 muestra que un ARNip de GST-rc de esta invención inhibió tumores de xenoinjerto de cáncer de páncreas in vivo. El ARNip de GST-rc proporcionó potencia de silenciamiento génico in vivo cuando se administró en una formulación liposomal a tumores de xenoinjerto de cáncer de páncreas en ratones hembra atímicos desnudos de 6 a 8 semanas de edad. Tal como se muestra en la figura 6, una respuesta a la dosis se obtuvo con dosis que oscilaban desde 0,375 mg/kg hasta 3 mg/kg de ARNip dirigido contra GST-rc. El ARNip de GST-rc mostró una inhibición del tumor ventajosa en el plazo de unos pocos días después de la administración, reduciéndose el volumen del tumor en aproximadamente 2 veces en el punto final.

Figura 7: la figura 7 muestra que un ARNip de GST-rc de esta invención presentó estabilidad en suero mejorada. Tal como se muestra en la figura 7, la semivida (ty2) en suero tanto para la cadena sentido (figura 7, parte superior) como Figura 8: la figura 8 muestra que un ARNip de GST-rc de esta invención presentó estabilidad mejorada en la formulación en plasma. La figura 8 muestra la incubación de una formulación liposomal de un ARNip de GST-rc en suero humano al 50% en PBS, y la detección del ARNip restante en diversos puntos de tiempo. Tal como se muestra en la figura 8, la semivida (ty2) en plasma de la formulación del ARNip de GST-rc era significativamente mayor de 100 horas.

Figura 9: la figura 9 muestra la atenuación génica in vitro para la cadena guía de un ARNip de GST-rc. Tal como se muestra en la figura 9, la atenuación génica de la cadena guía del ARNip de GST-rc era aproximadamente exponencial, en comparación con un control con secuencia reorganizada al azar que no presentó ningún efecto.

Figura 10: la figura 10 muestra la atenuación génica in vitro para la cadena pasajera del ARNip de GST-rc de la figura 9. Tal como se muestra en la figura 10, la atenuación génica inespecífica de la cadena pasajera para el ARNip de GST-rc se redujo en gran medida, sin esencialmente ningún efecto.

Figura 11: la figura 11 muestra la atenuación génica in vitro para las cadenas guía de varios ARNip de GST-rc muy activos. Tal como se muestra en la figura 11, la actividades de atenuación génica de la cadena guía de los ARNip de GST-rc eran aproximadamente exponenciales.

Figura 12: la figura 12 muestra la atenuación génica in vitro para la cadena pasajera de los ARNip de GST-rc de la figura 11. Tal como se muestra en la figura 12, las actividades de atenuación génica inespecífica de la cadena pasajera para los ARNip de GST-rc se redujeron significativamente por debajo de aproximadamente 500 pM.

Figura 13: la figura 13 muestra la atenuación génica in vitro para la cadena guía de un ARNip de GST-rc muy activo. Tal como se muestra en la figura 13, la actividad de atenuación génica de la cadena guía del ARNip de GST-rc era aproximadamente exponencial.

Figura 14: la figura 14 muestra la atenuación génica in vitro para la cadena pasajera del ARNip de GST-rc de la figura 13. Tal como se muestra en la figura 14, la actividad de atenuación génica inespecífica de la cadena pasajera para el ARNip de GST-rc se redujo significativamente.

Figura 15: la figura 15 muestra la eficacia de inhibición del tumor in vivo para un ARNip de p21. Se utilizó un modelo de xenoinjerto de cáncer usando células A549 con una dosis relativamente baja de ARNip a 0,75 mg/kg. El ARNip de p21 mostró una inhibición del tumor ventajosa en el plazo de unos pocos días. Después de 30 días, el ARNip de GST-rc mostró una inhibición del tumor marcadamente ventajosa, con una reducción significativa de volúmenes promedio finales del tumor de más de 2 veces, en comparación con el control.

Descripción detallada de la invención

Esta invención se refiere a compuestos, composiciones y métodos para productos terapéuticos basados en ácidos nucleicos para modular la expresión génica.

En algunas realizaciones, esta invención proporciona moléculas activas en interferencia de ARN, así como estructuras y composiciones que pueden silenciar la expresión de un gen.

Las estructuras y composiciones de esta divulgación pueden usarse en la prevención o el tratamiento de diversas enfermedades.

En realizaciones adicionales, esta invención proporciona composiciones para la administración y captación de una o más moléculas de iARN terapéuticas de esta invención, así como métodos de uso de las mismas. Las composiciones basadas en ARN de esta invención pueden usarse en métodos para prevenir o tratar tumores malignos, tales como cánceres.

Las composiciones terapéuticas de esta invención incluyen moléculas de ácido nucleico que son activas en interferencia de ARN. Las moléculas de ácido nucleico terapéuticas pueden dirigirse contra diversos genes para el silenciamiento génico.

En diversas realizaciones, esta invención proporciona una gama de moléculas que pueden ser activas como un ARN de interferencia pequeño (ARNip) y pueden regular o silenciar la expresión génica.

También se divulga en el presente documento un vehículo, formulación o formulación de nanopartículas lipídicas para administrar los ARNip de la invención a sujetos que necesitan prevenir o tratar una enfermedad. Esta divulgación contempla además métodos para administrar ARNip como productos terapéuticos a mamíferos.

prevención o el tratamiento de una enfermedad, administrando un compuesto o una composición a un sujeto que lo necesita.

Esta divulgación proporciona una gama de moléculas de iARN, en la que cada molécula tiene una cadena sentido del polinucleótido y una cadena antisentido del polinucleótido; cada cadena de la molécula tiene desde 15 hasta 30 nucleótidos de longitud; una región contigua de desde 15 hasta 30 nucleótidos de la cadena antisentido es al menos parcialmente complementaria a una secuencia de un ARNm; y al menos una porción de la cadena sentido es complementaria a al menos una porción de la cadena antisentido, y la molécula tiene una región de dúplex de desde 15 hasta 30 nucleótidos de longitud.

Una molécula de iARN de esta divulgación puede tener una región contigua de desde 15 hasta 30 nucleótidos de la cadena antisentido que es complementaria a una secuencia de un ARNm humano, que está ubicada en la región de dúplex de la molécula.

En algunas realizaciones, una molécula de iARN puede tener una región contigua de desde 15 hasta 30 nucleótidos de la cadena antisentido que es complementaria a una secuencia de un ARNm humano.

Las realizaciones de esta invención pueden proporcionar además composiciones para su uso en métodos para prevenir, tratar o mejorar uno o más síntomas de una enfermedad o un estado, o reducir el riesgo de desarrollar una enfermedad o un estado, o retrasar la aparición de una enfermedad o un estado en un mamífero que lo necesita. Estructuras de iARN para silenciamiento genómico universal

Las realizaciones de esta invención pueden proporcionar moléculas de iARN dirigidas contra cualquier gen, que presentan alta actividad para silenciar la expresión del gen.

Las moléculas de iARN de esta divulgación pueden presentar una actividad sorprendentemente alta para silenciar la expresión de un gen, mientras que proporcionan efectos inespecíficos reducidos.

En algunas realizaciones, una molécula de iARN de esta invención contiene uno o más 2'-desoxinucleótidos. En estas realizaciones, el uno o más 2'-desoxinucleótidos pueden estar ubicados en la región semilla del ARNip.

El uno o más 2'-desoxinucleótidos pueden ser monodesoxinucleótidos.

Tal como se usa en el presente documento, desoxinucleótido se refiere a un mono-2-desoxinucleótido.

Un 2'-desoxinucleótido puede estar sustituido en la posición 2' con un halógeno.

En determinadas realizaciones, una molécula de iARN de esta invención contiene uno o más 2'-desoxinucleótidos en la cadena antisentido o guía del ARNip. Más particularmente, el uno o más desoxinucleótidos pueden estar ubicados en las posiciones de 1 a 8 desde el extremo 5' de la cadena antisentido del ARNip. En determinadas realizaciones, el uno o más desoxinucleótidos pueden estar ubicados en las posiciones de 2 a 8 desde el extremo 5' de la cadena antisentido del ARNip. En realizaciones adicionales, el uno o más desoxinucleótidos pueden estar ubicados en las posiciones de 3 a 8 desde el extremo 5' de la cadena antisentido del ARNip.

Esta invención contempla estructuras de ARNip que tienen una cadena antisentido que contiene desoxinucleótidos en una pluralidad de posiciones.

En algunas realizaciones, una estructura de ARNip puede tener una cadena antisentido que contiene desoxinucleótidos en cada una de las posiciones 4, 6 y 8 desde el extremo 5' de la cadena antisentido.

En realizaciones adicionales, una estructura de ARNip puede tener una cadena antisentido

que contiene desoxinucleótidos en cada una de las posiciones 3, 5 y 7 desde el extremo 5' de la cadena antisentido.

En realizaciones adicionales, una estructura de ARNip puede tener una cadena antisentido que contiene desoxinucleótidos en cada una de las posiciones 1, 3, 5 y 7 desde el extremo 5' de la cadena antisentido.

En determinadas realizaciones, una estructura de ARNip puede tener una cadena antisentido que contiene desoxinucleótidos en cada una de las posiciones de 3 a 8 desde el extremo 5' de la cadena antisentido.

En algunas realizaciones, una estructura de ARNip puede tener una cadena antisentido que contiene desoxinucleótidos en cada una de las posiciones de 5 a 8 desde el extremo 5' de la cadena antisentido.

Cualquiera de estas estructuras puede combinarse con uno o más nucleótidos modificados o químicamente modificados en otras posiciones.

Las moléculas de iARN de esta invención pueden inhibir la expresión del ARNm de un gen con una CI50 ventajosa de menos de aproximadamente 200 pM. En determinadas realizaciones, las moléculas de iARN de esta invención pueden inhibir la expresión del ARNm de un gene con una CI50 ventajosa de menos de aproximadamente 100 pM, o de menos de aproximadamente 50 pM, o de menos de aproximadamente 30 pM, o de menos de aproximadamente 20 pM, o de menos de aproximadamente 10 pM, o de menos de aproximadamente 5 pM, o de menos de aproximadamente 1 pM.

En realizaciones adicionales, las moléculas de iARN de esta invención pueden inhibir la expresión del nivel de ARNm de un gen en al menos el 25% in vivo, tras una única administración.

Un ARNip de esta invención puede dirigirse contra cualquier gen.

Los ejemplos de genes contra los que un ARNip de esta invención puede dirigirse incluyen los genes enumerados en el en Índice de Familias de Genes del Comité de Nomenclatura de Genes de HUGO.

Los ejemplos de genes contra los que un ARNip de esta invención puede dirigirse incluyen genes nucleares, genes mitocondriales, genes que codifican para proteínas, proto-oncogenes, oncogenes, genes supresores de tumores y genes de señalización de células.

Los ejemplos de genes contra los que un ARNip de esta invención puede dirigirse incluyen genes que expresan cualquier miembro o submiembro de la familia humana de proteínas que incluye SRY, beta-globina, RAS, GST citosólica, GST mitocondrial, GST MAPEG, GST-rc, p16, p21, p53, albúmina sérica, colágeno de tipo VII, complemento C3, apolipoproteína B, fenilalanina hidroxilasa, factor VIII, huntingtina, proteína de retinoblastoma RB1, CFTr , titina, utrofina y distrofina.

ARNip modificados y modificados químicamente

Las realizaciones de esta invención abarcan moléculas de ARNip que se modifican o se modifican químicamente para proporcionar propiedades mejoradas para el uso terapéutico, tal como actividad y potencia aumentadas para el silenciamiento génico. Esta invención proporciona moléculas de ARNip modificadas o modificadas químicamente que pueden tener estabilidad en suero aumentada, así como efectos inespecíficos reducidos, sin pérdida de actividad y potencia de las moléculas de ARNip para la modulación génica y el silenciamiento génico. En algunos aspectos, esta invención proporciona ARNip que tienen modificaciones o modificaciones químicas en diversas combinaciones, que mejoran la estabilidad y eficacia del ARNip.

Tal como se usan en el presente documento, los términos modificado y modificado químicamente se refieren a cambios realizados en la estructura de una estructura de nucleótido o ácido nucleico que se produce de manera natural de un ARNip, que abarca ARNip que tienen uno o más análogos de nucleótido, nucleótidos alterados, nucleótidos no convencionales, nucleótidos que no se producen de manera natural y combinaciones de los mismos.

En algunas realizaciones, el número de estructuras modificadas o químicamente modificadas en un ARNip puede incluir todos los componentes estructurales y/o todos los nucleótidos de la molécula de ARNip.

Los ejemplos de ARNip modificados y modificados químicamente incluyen ARNip que tienen una modificación del grupo azúcar de un nucleótido, modificación de una nucleobase de un nucleótido, modificación de una estructura principal o un enlace de ácido nucleico, modificación de la estructura de un nucleótido o nucleótidos en el extremo terminal de una cadena de ARNip y combinaciones de los mismos.

Los ejemplos de ARNip modificados y modificados químicamente incluyen ARNip que tienen una modificación del sustituyente en el carbono 2' del azúcar.

Los ejemplos de ARNip modificados y modificados químicamente incluyen ARNip que tienen una modificación en el extremo 5', el extremo 3' o en ambos extremos de una cadena.

Los ejemplos de ARNip modificados y modificados químicamente incluyen ARNip que tienen modificaciones que producen apareamientos erróneos en la complementariedad entre las cadenas.

Los ejemplos de ARNip modificados y modificados químicamente incluyen ARNip que tienen un grupo extremo 5'-propilamina, un extremo 5'-fosforilado, un extremo 3'-puromicina o un extremo 3'-biotina.

Los ejemplos de ARNip modificados y modificados químicamente incluyen ARNip que tienen un ribonucleótido sustituido con 2'-fluoro, un ribonucleótido sustituido con 2'-OMe, un 2'-desoxirribonucleótido, un ribonucleótido sustituido con 2'-amino, un ribonucleótido sustituido con 2'-tio.

Los ejemplos de ARNip modificados y modificados químicamente incluyen ARNip que tienen una o más 5-halouridinas, 5-halocitidinas, 5-metilcitidinas, ribotimidinas, 2-aminopurinas, 2,6-diaminopurinas, 4-tiouridinas o 5-aminoaliluridinas.

Los ejemplos de ARNip modificados y modificados químicamente incluyen ARNip que tienen uno o más grupos fosforotioato.

Los ejemplos de ARNip modificados y modificados químicamente incluyen ARNip que tienen uno o más ribonucleótidos sustituidos con 2'-fluoro, 2'-fluorouridinas, 2'-fluorocitidinas, 2'-desoxirribonucleótidos, 2'-desoxiadenosinas o 2'-desoxiguanosinas.

Los ejemplos de ARNip modificados y modificados químicamente incluyen ARNip que tienen uno o más enlaces fosforotioato.

Los ejemplos de ARNip modificados y modificados químicamente incluyen ARNip que tienen uno o más enlaces alquileno-diol, enlaces oxi-alquiltio o enlaces oxicarboniloxilo.

Los ejemplos de ARNip modificados y modificados químicamente incluyen ARNip que tienen uno o más grupos desoxiabásicos, inosinas, N3-metil-uridinas, N6,N6-dimetiladenosinas, pseudouridinas, ribonucleósidos de purina y ribavirinas.

Los ejemplos de ARNip modificados y modificados químicamente incluyen ARNip que tienen uno o más grupos terminales invertidos en 3' o 5'.

Los ejemplos de ARNip modificados y modificados químicamente incluyen ARNip que tienen una o más 5-(2-amino)propiluridinas, 5-bromouridinas, adenosinas, 8-bromoguanosinas, 7-deaza-adenosinas o N6-metiladenosina.

Moléculas de GST-rc e iARN

Se ha encontrado que diversos tejidos cancerosos humanos se correlacionan con la aparición de gen KRAS mutado. En algunos casos, los tejidos también presentan un nivel elevado de expresión de glutatión S-tranferasa Pi (GST-rc). (Miyanishi et al., Gastroenterology, 2001, vol. 121:865-874, resumen) Por ejemplo, se observaron niveles elevados de GST-rc en suero en pacientes con diversas neoplasias malignas gastrointestinales. (Niitsu et al., Cancer, 1989, vol.63, n.°2, págs. 317-323, resumen).

GST-rc es un miembro de una familia GST de enzimas que desempeñan un papel en la destoxificación catalizando la conjugación de compuestos hidrofóbicos y electrofílicos con glutatión reducido. La expresión de GST-rc puede reducirse in vitro con un ARNip (Niitsu et al., documento US 2014/0315975 A1). Sin embargo, los agentes de ARNip existentes presentan muchos inconvenientes, tales como actividad insuficiente, efectos inespecíficos, falta de estabilidad en suero y falta de potencia o eficacia in vivo.

La secuencia de ácido nucleico de un ejemplo de ARNm de glutatión S-transferasa pi humano diana (GST-rc humana) se divulga en el número de registro de GenBank NM_000852.3 (hGSTP1) y tiene 986 nucleótidos de longitud.

Un experto habitual en la técnica entenderá que una secuencia notificada puede cambiar a lo largo del tiempo y sabrá incorporar cualquier cambio necesario en las moléculas de ácido nucleico en el presente documento en consecuencia.

Las realizaciones de esta invención pueden proporcionar composiciones y métodos para el silenciamiento génico de la expresión de GST-rc usando moléculas de ácido nucleico pequeñas. Los ejemplos de moléculas de ácido nucleico incluyen moléculas activas en interferencia de ARN (moléculas de iARN), ARN de interferencia pequeño (ARNip), ARN bicatenario (ARNbc), micro-ARN (miARN) y ARN en horquilla corto (ARNhc), así como ARN dirigido a ADN (ARNdA), ARN de interacción con piwi (ARNiP) y ARNip asociado con repetición (ARNipar). Tales moléculas son capaces de mediar la interferencia de ARN contra la expresión génica de GST-rc .

La composición y métodos divulgados en el presente documento también pueden usarse en el tratamiento de diversas clases de tumores malignos en un sujeto.

Las moléculas de ácido nucleico y métodos de esta invención pueden usarse para regular por disminución la expresión de genes que codifican para GST-rc.

Las composiciones y métodos de esta invención pueden incluir una o más moléculas de ácido nucleico que, independientemente o en combinación, pueden modular o regular la expresión de proteína de GST-rc y/o genes que codifican para proteínas de GST-rc , proteínas y/o genes que codifican para GST-rc asociados con el mantenimiento y/o desarrollo de enfermedades, estados o trastornos asociados con GST-rc, tal como tumor maligno.

Las composiciones y métodos de esta invención se describen con referencia a secuencias a modo de ejemplo de GST-rc. Un experto habitual en la técnica entenderá que diversos aspectos y realizaciones de la invención se refieren a cualquier gen, secuencia o variante de GST-rc, tales como genes homólogos y variantes de transcripto, y En algunas realizaciones, las composiciones y métodos de esta invención pueden proporcionar una molécula de ácido nucleico de interferencia pequeña bicatenaria (ARNip) que regula por disminución la expresión de un gen de GST-rc , por ejemplo GST-rc humana.

Una molécula de iARN de esta invención puede dirigirse contra GST-rc y cualquier secuencia homóloga, por ejemplo, usando secuencias complementarias o incorporando pares de bases no canónicas, por ejemplo, apareamientos erróneos y/o pares de bases oscilantes, que pueden proporcionar secuencias diana adicionales.

En casos en los que se identifican apareamientos erróneos, pueden usarse pares de bases no canónicas, por ejemplo, apareamientos erróneos y/o bases oscilantes, para generar moléculas de ácido nucleico que se dirigen contra más de una secuencia genética.

Por ejemplo, pares de bases no canónicas tales como pares de bases UU y CC pueden usarse para generar moléculas de ácido nucleico que son capaces de dirigirse contra secuencias para diferentes dianas de GST-rc que comparten homología de secuencia. Por tanto, una molécula de iARN puede dirigirse contra una secuencia de nucleótidos conservada entre genes homólogos, y puede usarse una única molécula de iARN para inhibir la expresión de más de un gen.

En algunos aspectos, las composiciones y métodos de esta invención incluyen moléculas de iARN que son activas contra ARNm de GST-rc, en las que la molécula de iARN incluye una secuencia complementaria a cualquier ARNm que codifica para una secuencia de GST-rc.

En algunas realizaciones, una molécula de iARN de esta divulgación puede tener actividad contra ARN de GST-rc, en la que la molécula de iARN incluye una secuencia complementaria a un ARN que tiene una secuencia que codifica para GST-rc variante, por ejemplo, un gen mutante de GST-rc conocido en la técnica por asociarse con tumor maligno.

En realizaciones adicionales, una molécula de iARN de esta invención puede incluir una secuencia de nucleótidos que puede interactuar con una secuencia de nucleótidos de un gen de GST-rc y mediar el silenciamiento de la expresión génica de GST-rc.

Las moléculas de ácido nucleico para inhibir la expresión de GST-rc pueden tener una cadena sentido y una cadena antisentido, en las que las cadenas forman una región de dúplex. Las moléculas de ácido nucleico pueden tener uno o más de los nucleótidos en la región de dúplex modificados o modificados químicamente, incluyendo tales modificaciones tal como se conocen en la técnica. Cualquier nucleótido en una proyección del ARNip también puede modificarse o modificarse químicamente.

En algunas realizaciones, los nucleótidos modificados o químicamente modificados preferidos son 2'-desoxinucleótidos. En realizaciones adicionales, los nucleótidos modificados o químicamente modificados pueden incluir nucleótidos sustituidos con 2'-O-alquilo, nucleótidos sustituidos con 2'-desoxi-2'-fluoro, nucleótidos de fosforotioatos, nucleótidos bloqueados o cualquier combinación de los mismos.

La estructura tiene una cadena antisentido que contiene desoxinucleótidos en una pluralidad de posiciones, siendo la pluralidad de posiciones una de las siguientes: cada una de las posiciones 4, 6 y 8, desde el extremo 5' de la cadena antisentido; cada una de las posiciones 3, 5 y 7, desde el extremo 5' de la cadena antisentido; cada una de las posiciones 1, 3, 5 y 7, desde el extremo 5' de la cadena antisentido; cada una de las posiciones 3-8, desde el extremo 5' de la cadena antisentido; y cada una de las posiciones 5-8, desde el extremo 5' de la cadena antisentido, y está activa para modular la expresión de un ARNm. Cualquiera de estas estructuras puede combinarse con uno o más nucleótidos sustituidos con 2'-desoxi-2'-fluoro en la región de dúplex.

Las moléculas de ácido nucleico de esta invención pueden inhibir la expresión de ARNm de GST-rc con una CI50 ventajosa de menos de aproximadamente 200 pM. Además, las moléculas de ácido nucleico pueden inhibir la expresión de los niveles de ARNm de GST-rc en al menos el 25% in vivo, tras una única administración.

En esta invención se contemplan composiciones farmacéuticas que pueden contener uno o más ARNip tal como se describe en el presente documento, en combinación con un portador farmacéuticamente aceptable. Puede usarse cualquier portador adecuado, incluyendo los conocidos en la técnica, así como moléculas lipídicas, nanopartículas lipídicas o liposomas, cualquiera de las cuales pueden encapsular las moléculas de ARNip.

Esta invención divulga composiciones para su uso en métodos para tratar una enfermedad asociada con la expresión de GST-rc , métodos que incluyen administrar a un sujeto que lo necesita una composición que contiene uno o más de los ARNip. Las enfermedades que van a tratarse pueden incluir tumor, cáncer, cáncer provocado por células que expresan k Ra S mutado, sarcoma y carcinoma malignos, entre otros.

Tabla 1: secuencias de moléculas de iARN contra GST-rc

Clave para la tabla 1: las letras mayúsculas A, G, C y U se refieren a ribo-A, ribo-G, ribo-C y ribo-U, respectivamente. Las letras minúsculas a, u, g, c, t se refieren a 2'-desoxi-A, 2'-desoxi-U, 2'-desoxi-G, 2'-desoxi-C y desoxitimidina, respectivamente.

Los ejemplos de moléculas de iARN de esta invención dirigidas contra ARNm de GST-rc se muestran en la tabla 2. Tabla 2: secuencias de moléculas de iARN contra GST-rc

Clave para la tabla 2: las letras mayúsculas A, G, C y U se refieren a ribo-A, ribo-G, ribo-C y ribo-U, respectivamente. Las letras minúsculas a, u, g, c, t se refieren a 2'-desoxi-A, 2'-desoxi-U, 2'-desoxi-G, 2'-desoxi-C y desoxitimidina (dT = T = t), respectivamente. El subrayado se refiere a sustituido con 2'-OMe, por ejemplo, U. La letra minúscula f se refiere a sustitución con 2'-desoxi-2'-fluoro, por ejemplo fU es 2'-desoxi-2'-fluoro-U. N es A, C, G, U, U, a, c, g, u, t o un nucleótido modificado, invertido o modificado químicamente.

Los ejemplos de moléculas de iARN de esta invención dirigidas contra ARNm de GST-rc se muestran en la tabla 3. Tabla 3: secuencias de moléculas de iARN contra GST-rc

Clave para la tabla 3: las letras mayúsculas A, G, C y U se refieren a ribo-A, ribo-G, ribo-C y ribo-U, respectivamente. Las letras minúsculas a, u, g, c, t se refieren a 2'-desoxi-A, 2'-desoxi-U, 2'-desoxi-G, 2'-desoxi-C y desoxitimidina (dT = T = t), respectivamente. El subrayado se refiere a sustituido con 2'-OMe, por ejemplo, U. La letra minúscula f se refiere a sustitución con 2'-desoxi-2'-fluoro, por ejemplo fU es 2'-desoxi-2'-fluoro-U. N es A, C, G, U, U, a, c, g, u, t o un nucleótido modificado, invertido o modificado químicamente.

Los ejemplos de moléculas de iARN de esta invención dirigidas contra ARNm de GST-rc se muestran en la tabla 4. Tabla 4: secuencias de moléculas de iARN contra GST-rc

Clave para la tabla 4: las letras mayúsculas A, G, C y U se refieren a ribo-A, ribo-G, ribo-C y ribo-U, respectivamente. Las letras minúsculas a, u, g, c, t se refieren a 2'-desoxi-A, 2'-desoxi-U, 2'-desoxi-G, 2'-desoxi-C y desoxitimidina (dT = T = t), respectivamente. El subrayado se refiere a sustituido con 2'-OMe, por ejemplo, U. La letra minúscula f se refiere a sustitución con 2'-desoxi-2'-fluoro, por ejemplo fU es 2'-desoxi-2'-fluoro-U. N es A, C, G, U, U, a, c, g, u, t o un nucleótido modificado, invertido o modificado químicamente.

Los ejemplos de moléculas de iARN de esta invención dirigidas contra ARNm de GST-rc se muestran en la tabla 5. Tabla 5: secuencias de moléculas de iARN contra GST-rc

Clave para la tabla 5: las letras mayúsculas A, G, C y U se refieren a ribo-A, ribo-G, ribo-C y ribo-U, respectivamente. Las letras minúsculas a, u, g, c, t se refieren a 2'-desoxi-A, 2'-desoxi-U, 2'-desoxi-G, 2'-desoxi-C y desoxitimidina (dT = T = t), respectivamente. El subrayado se refiere a sustituido con 2'-OMe, por ejemplo, U. La letra minúscula f se refiere a sustitución con 2'-desoxi-2'-fluoro, por ejemplo fU es 2'-desoxi-2'-fluoro-U. N es A, C, G, U, U, a, c, g, u, t o un nucleótido modificado, invertido o modificado químicamente.

Los ejemplos de moléculas de iARN de esta invención dirigidas contra ARNm de GST-rc se muestran en la tabla 6.

Tabla 6: secuencias de moléculas de iARN contra GST-rc

Clave para la tabla 6: las letras mayúsculas A, G, C y U se refieren a ribo-A, ribo-G, ribo-C y ribo-U, respectivamente. Las letras minúsculas a, u, g, c, t se refieren a 2'-desoxi-A, 2'-desoxi-U, 2'-desoxi-G, 2'-desoxi-C y desoxitimidina (dT = T = t), respectivamente. El subrayado se refiere a sustituido con 2'-OMe, por ejemplo, U. La letra minúscula f se refiere a sustitución con 2'-desoxi-2'-fluoro, por ejemplo fU es 2'-desoxi-2'-fluoro-U. N es A, C, G, U, U, a, c, g, u, t o un nucleótido modificado, invertido o modificado químicamente.

En algunas realizaciones, esta divulgación proporciona una gama de moléculas de ácido nucleico, en la que: a) la molécula tiene una cadena sentido del polinucleótido y una cadena antisentido del polinucleótido; b) cada cadena de la molécula tiene desde 15 hasta 30 nucleótidos de longitud; c) una región contigua de desde 15 hasta 30 nucleótidos de la cadena antisentido es complementaria a una secuencia de un ARNm que codifica para GST-rc; d) al menos una porción de la cadena sentido es complementaria a al menos una porción de la cadena antisentido, y la molécula tiene una región de dúplex de desde 15 hasta 30 nucleótidos de longitud.

En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico puede tener una región contigua de desde 15 hasta 30 nucleótidos de la cadena antisentido que es complementaria a una secuencia de un ARNm que codifica para GST-rc que está ubicada en la región de dúplex de la molécula.

En realizaciones adicionales, la molécula de ácido nucleico puede tener una región contigua de desde 15 hasta 30 nucleótidos de la cadena antisentido que es complementaria a una secuencia de un ARNm que codifica para GST-rc.

En determinadas realizaciones, cada cadena de la molécula de ácido nucleico puede tener de desde 18 hasta 22 nucleótidos de longitud. La región de dúplex de la molécula de ácido nucleico puede tener 19 nucleótidos de longitud.

En formas alternativas, la molécula de ácido nucleico puede tener una cadena sentido del polinucleótido y una cadena antisentido del polinucleótido que están conectadas como una única cadena, y forman una región de dúplex conectada en un extremo mediante un bucle.

Algunas realizaciones de una molécula de ácido nucleico de esta divulgación pueden tener un extremo romo. En determinadas realizaciones, una molécula de ácido nucleico puede tener una o más proyecciones en 3'.

Esta invención proporciona una gama de moléculas de ácido nucleico que son moléculas de iARN activas para el silenciamiento génico. Las moléculas de ácido nucleico de la invención pueden ser un ARNbc, un ARNip, un micro-ARN o un ARNhc activos para el silenciamiento génico, así como un ARN dirigido a ADN (ARNdA), ARN de interacción con piwi (ARNiP) o un ARNip asociado con repetición (ARNipar). Las moléculas de ácido nucleico pueden ser activas para inhibir la expresión de GST-rc.

Las realizaciones de esta invención proporcionan además moléculas de ácido nucleico que tienen una CI50 para la Las realizaciones adicionales de esta invención proporcionan moléculas de ácido nucleico que tienen una CI50 para la atenuación génica de GST-rc de menos de 50 pM.

Esta invención contempla además composiciones que contienen una o más de las moléculas de ácido nucleico de la invención, junto con un portador farmacéuticamente aceptable. En determinadas realizaciones, el portador puede ser una molécula lipídica o un liposoma.

Los compuestos y composiciones de esta invención son útiles en métodos para prevenir o tratar una enfermedad asociada con GST-rc, administrando un compuesto o una composición a un sujeto que lo necesita.

Los usos en los métodos de esta invención pueden utilizar los compuestos de la invención para prevenir o tratar un tumor maligno. El tumor maligno puede presentarse en diversas enfermedades, por ejemplo, cánceres asociados con la expresión de GST-rc, cánceres provocados por células que expresan KRAS mutado, sarcomas, fibrosarcoma, histiocitoma fibroso maligno, liposarcoma, rabdomiosarcoma, leiomiosarcoma, angiosarcoma, sarcoma de Kaposi, linfangiosarcoma, sarcoma sinovial, condrosarcoma, osteosarcoma, carcinomas, tumor cerebral, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de esófago, cáncer de estómago, cáncer de duodeno, cáncer de apéndice, cáncer colorrectal, cáncer rectal, cáncer de hígado, cáncer de páncreas, cáncer de vesícula biliar, cáncer de vías biliares, cáncer de ano, cáncer de riñón, cáncer de uretra, cáncer de vejiga urinaria, cáncer de próstata, cáncer de testículo, cáncer de útero, cáncer de ovario, cáncer de piel, leucemia, linfoma maligno, tumores malignos epiteliales y tumores malignos no epiteliales.

Moléculas de P21 e iARN

p21 es una proteína que regula el ciclo celular que está codificada por el gen CDKN1A y pertenece a la familia CIP/KIP. Esta proteína tiene la función de inhibir la progresión del ciclo celular en la fase G1 y la fase G2/M inhibiendo el efecto de un complejo de ciclina-CDK a través de la unión al complejo. Específicamente, el gen p21 experimenta activación por p53, uno de los genes supresores de tumores. Se ha notificado que tras la activación de p53 debido al daño del ADN o similar, p53 activa p21 de manera que se detiene el ciclo celular en la fase G1 y la fase G2/M.

p21 se sobreexpresa en una variedad cánceres humanos incluyendo carcinomas de próstata, de cuello uterino, de mama y de células escamosas y, en muchos casos, la regulación por incremento de p21 se correlaciona positivamente con el grado, invasividad y agresividad del tumor. Véase, por ejemplo, Chang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, vol. 97, n.° 8, págs. 4291-96. Además, se ha notificado que la regulación por incremento de p21 está asociada con tumorigenicidad y mal pronóstico en muchas formas de cánceres, incluyendo cánceres de células de cerebro, próstata, ovario, mama y esófago. Véase, por ejemplo, Winters et al., Breast Cancer Research, 2003, vol. 5, n.° 6, págs. R242-R249. Además, la enfermedad puede ser enfermedades asociadas con la edad, incluyendo aterosclerosis, enfermedad de Alzheimer, amiloidosis y artritis. Véase, por ejemplo, Chang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, vol. 97, n.° 8, págs. 4291-96.

p21 está presente en diversos animales incluyendo humanos. La información de secuencia para CDKN1A humano (p21) se encuentra en: NM_000389.4, NM_078467.2, NM_001291549.1, NM_001220778.1, NM_001220777.1 (NP_001207707.2, NP 001278478.1, NP 001207706.1, NP 510867.1, NP 000380.1).

El ARNm de p21 diana humano se divulga con el número de registro de GenBank NM_000389.4 (CDKN1A) y tiene 2175 pares de bases de longitud.

Un experto en la técnica entenderá que una secuencia notificada puede cambiar a lo largo del tiempo y sabrá incorporar cualquier cambio necesario en las moléculas de ácido nucleico en el presente documento en consecuencia.

Las realizaciones de esta invención pueden proporcionar composiciones y métodos para el silenciamiento génico de la expresión de p21 usando moléculas de ácido nucleico pequeñas. Los ejemplos de moléculas de ácido nucleico incluyen moléculas activas en interferencia de ARN (moléculas de iARN ), moléculas de ARN de interferencia pequeño (ARNip), micro-ARN (miARN) y ARN en horquilla corto (ARNhc), así como ARN dirigido a ADN (ARNdA), ARN de interacción con piwi (ARNiP) y ARNip asociado con repetición (ARNipar). Tales moléculas son capaces de mediar la interferencia de ARN contra la expresión génica de p21.

La composición y métodos divulgados en el presente documento también pueden usarse en el tratamiento de diversas clases de tumores malignos en un sujeto.

Las moléculas de ácido nucleico y métodos de esta invención pueden usarse para regular por disminución la expresión de genes que codifican para p21.

Las composiciones y métodos de esta invención pueden incluir una o más moléculas de ácido nucleico que, independientemente o en combinación, pueden modular o regular la expresión de proteína p21 y/o genes que codifican enfermedades, estados o trastornos asociados con p21, tal como tumor maligno.

Las composiciones y métodos de esta invención se describen con referencia a las secuencias a modo de ejemplo de p21. Un experto habitual en la técnica entenderá que diversos aspectos y realizaciones de la invención se refieren a cualquier gen, secuencia o variante de p21 relacionados, tales como genes homólogos y variantes de transcripto, y polimorfismo, incluyendo polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) asociado con cualquier gen de p21.

En algunas realizaciones, las composiciones y métodos de esta invención pueden proporcionar una molécula de ácido nucleico de interferencia pequeña bicatenaria (ARNip) que regula por disminución la expresión de un gen de p21, por ejemplo, CDKN1A humano.

Una molécula de iARN de esta invención puede dirigirse contra p21 y cualquier secuencia homóloga, por ejemplo, usando secuencias complementarias o incorporando pares de bases no canónicas, por ejemplo, apareamientos erróneos y/o pares de bases oscilantes, que pueden proporcionar secuencias diana adicionales.

En los casos en los que se identifican apareamientos erróneos, pueden usarse pares de bases no canónicas, por ejemplo, apareamientos erróneos y/o bases oscilantes, para generar moléculas de ácido nucleico que se dirigen contra más de una secuencia genética.

Por ejemplo, pares de bases no canónicas tales como pares de bases UU y CC pueden usase para generar moléculas de ácido nucleico que son capaces de dirigirse contra secuencias para diferentes dianas de p21 que comparten homología de secuencia. Por tanto, una molécula de iARN puede dirigirse contra una secuencia de nucleótidos conservada entre genes homólogos, y puede usarse una única molécula de iARN para inhibir la expresión de más de un gen.

En algunos aspectos, las composiciones y métodos de esta invención incluyen moléculas de iARN que son activas contra ARNm de p21, en las que la molécula de iARN incluye una secuencia complementaria a cualquier ARNm que codifica para una secuencia de p21.

En algunas realizaciones, una molécula de iARN de esta divulgación puede tener actividad contra ARN de p21, en la que la molécula de iARN incluye una secuencia complementaria a un ARN que tiene una secuencia que codifica para p21 variante, por ejemplo, un gen mutante de p21 conocido en la técnica por asociarse con tumor maligno.

En realizaciones adicionales, una molécula de iARN de esta invención puede incluir una secuencia de nucleótidos que puede interactuar con una secuencia de nucleótidos de un gen de p21 y mediar el silenciamiento de la expresión génica de p21.

Las moléculas de ácido nucleico para inhibir la expresión de p21 pueden tener una cadena sentido y una cadena antisentido, en las que las cadenas forman una región de dúplex. Las moléculas de ácido nucleico pueden tener uno o más de los nucleótidos en la región de dúplex modificados o modificados químicamente, incluyendo tales modificaciones tal como se conocen en la técnica. Cualquier nucleótido en una proyección del ARNip también puede modificarse o modificarse químicamente.

En algunas realizaciones, los nucleótidos modificados o químicamente modificados preferidos son 2'-desoxinucleótidos. En realizaciones adicionales, los nucleótidos modificados o químicamente modificados pueden incluir nucleótidos sustituidos con 2'-O-alquilo, nucleótidos sustituidos con 2'desoxi-2'-fluoro, nucleótidos de fosforotioatos, nucleótidos bloqueados, o cualquier combinación de los mismos.

En determinadas realizaciones, una estructura preferida puede tener una cadena antisentido que contiene desoxinucleótidos en una pluralidad de posiciones, siendo la pluralidad de posiciones una de las siguientes: cada una de las posiciones 4, 6 y 8, desde el extremo 5' de la cadena antisentido; cada una de las posiciones 3, 5 y 7, desde el extremo 5' de la cadena antisentido; cada una de las posiciones 1,3, 5 y 7, desde el extremo 5' de la cadena antisentido; cada una de las posiciones 3-8, desde el extremo 5' de la cadena antisentido; y cada una de las posiciones 5-8, desde el extremo 5' de la cadena antisentido. Cualquiera de estas estructuras pueden combinarse con uno o más nucleótidos sustituidos con 2'-desoxi-2'-fluoro en la región de dúplex.

Las moléculas de ácido nucleico de esta invención pueden inhibir la expresión del ARNm de p21 con una CI50 ventajosa de menos de aproximadamente 200 pM. Además, las moléculas de ácido nucleico pueden inhibir la expresión de los niveles de ARNm de p21 en al menos el 25% in vivo, tras una única administración.

En esta invención se contemplan composiciones farmacéuticas que pueden contener uno o más ARNip tal como se describe en el presente documento, en combinación con un portador farmacéuticamente aceptable. Puede usarse cualquier portador adecuado, incluyendo los conocidos en la técnica, así como moléculas lipídicas, nanopartículas lipídicas o liposomas, cualquiera de las cuales pueden encapsular las moléculas de ARNip.

la expresión de p21, métodos que incluyen administrar a un sujeto que lo necesita una composición que contiene uno o más de los ARNip. Las enfermedades que van a tratarse pueden incluir tumor, cáncer, cáncer provocado por células que expresan KRAS mutado, sarcoma y carcinoma malignos, entre otros.

Los ejemplos de moléculas de iARN de esta invención dirigidas contra ARNm de p21 se muestran en la tabla 7. Tabla 7: secuencias de moléculas de iARN contra p21

Clave para la tabla 7: las letras mayúsculas A, G, C y U se refieren a ribo-A, ribo-G, ribo-C y ribo-U, respectivamente. Las letras minúsculas a, g, c, t representan 2'-desoxi-A, 2'-desoxi-G, 2'-desoxi-C y timidina, respectivamente. mU es 2'-metoxi-U.

Los ejemplos de moléculas de iARN de esta invención dirigidas contra ARNm de p21 se muestran en la tabla 8. Tabla 8: secuencias de moléculas de iARN contra p21

Clave para la tabla 8: las letras mayúsculas A, G, C y U se refieren a ribo-A, ribo-G, ribo-C y ribo-U, respectivamente. Las letras minúsculas a, u, g, c, t se refieren a 2'-desoxi-A, 2'-desoxi-U, 2'-desoxi-G, 2'-desoxi-C y desoxitimidina (dT = T = t), respectivamente. El subrayado se refiere a sustituido con 2'-OMe, por ejemplo, U. N es A, C, G, U, U, a, c, g, u, t o un nucleótido modificado, invertido o modificado químicamente.

Las realizaciones de esta invención abarcan moléculas de ARNip de las tablas 1-8 que se modifican o modifican químicamente según los ejemplos anteriores.

En algunas realizaciones, esta divulgación proporciona una gama de moléculas de ácido nucleico, en las que a) la molécula tiene una cadena sentido del polinucleótido y una cadena antisentido del polinucleótido; b) cada cadena de la molécula tiene desde 15 hasta 30 nucleótidos de longitud; c) una región contigua de desde 15 hasta 30 nucleótidos de la cadena antisentido es complementaria a una secuencia de un ARNm que codifica para p21; y d) al menos una porción de la cadena sentido es complementaria a al menos una porción de la cadena antisentido, y la molécula tiene una región de dúplex de desde 15 hasta 30 nucleótidos de longitud.

En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico puede tener una región contigua de desde 15 hasta 30 nucleótidos de la cadena antisentido que es complementaria a una secuencia de un ARNm que codifica para p21 y está ubicada en la región de dúplex de la molécula.

En realizaciones adicionales, la molécula de ácido nucleico puede tener una región contigua de desde 15 hasta 30 nucleótidos de la cadena antisentido que es complementaria a una secuencia de un ARNm que codifica para p21.

En aspectos adicionales, una molécula de ácido nucleico de esta invención puede tener cada cadena de la molécula que tiene desde 18 hasta 22 nucleótidos de longitud. Una molécula de ácido nucleico puede tener una región de dúplex de 19 nucleótidos de longitud.

En determinadas realizaciones, una molécula de ácido nucleico puede tener una cadena sentido del polinucleótido y la cadena antisentido del polinucleótido que están conectadas como una única cadena, y forman una región de dúplex conectada en un extremo mediante un bucle.

Las moléculas de ácido nucleico de esta invención pueden tener un extremo romo y pueden tener una o más proyecciones en 3'.

Las moléculas de ácido nucleico de esta invención pueden ser moléculas de iARN que son activas para el silenciamiento génico, por ejemplo, un ARNbc que es activo para el silenciamiento génico, un ARNip, un micro-ARN, o un ARNhc activos para el silenciamiento génico, así como un ARN dirigido a ADN (ARNdA), un a Rn de interacción con piwi (ARNiP) y un ARNip asociado con repetición (ARNipar).

Esta invención proporciona una gama de moléculas de ácido nucleico que son activas para inhibir la expresión de p21. En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico puede tener una CI50 para la atenuación génica de p21 de menos de 100 pM.

En realizaciones adicionales, la molécula de ácido nucleico puede tener una CI50 para la atenuación génica de p21 de menos de 50 pM.

Esta invención contempla además composiciones que contienen una o más moléculas de ácido nucleico de la invención y un portador farmacéuticamente aceptable. El portador puede ser una molécula lipídica o un liposoma.

Los compuestos y composiciones de esta invención son útiles en métodos para prevenir o tratar una enfermedad asociada con p21, administrando un compuesto o una composición a un sujeto que lo necesita.

En aspectos adicionales, esta invención incluye composiciones para su uso en métodos para tratar una enfermedad asociada con la expresión de p21, administrando a un sujeto que lo necesita una composición que contiene una o más moléculas de ácido nucleico de la invención. La enfermedad puede ser un tumor maligno, que puede presentarse en una enfermedad tal como cánceres asociados con la expresión de p21, entre otros.

Los usos en los métodos de esta invención pueden utilizar los compuestos de la invención para prevenir o tratar un tumor maligno. El tumor maligno puede presentarse en diversas enfermedades, por ejemplo, cánceres asociados con la expresión de p21, cánceres provocados por células que expresan KRAS mutado, sarcomas, fibrosarcoma, histiocitoma fibroso maligno, liposarcoma, rabdomiosarcoma, leiomiosarcoma, angiosarcoma, sarcoma de Kaposi, linfangiosarcoma, sarcoma sinovial, condrosarcoma, osteosarcoma, carcinomas, tumor cerebral, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de esófago, cáncer de estómago, cáncer de duodeno, cáncer de apéndice, cáncer colorrectal, cáncer rectal, cáncer de hígado, cáncer de páncreas, cáncer de vesícula biliar, cáncer cáncer de útero, cáncer de ovario, cáncer de piel, leucemia, linterna maligno, tumores malignos epiteliales y tumores malignos no epiteliales.

Las realizaciones de esta invención pueden proporcionar moléculas de iARN que pueden usarse para regular por disminución o inhibir la expresión de un gen y/o la proteína.

Las moléculas de iARN de esta divulgación pueden usarse individualmente o en combinación con otros ARNip para modular la expresión de uno o más genes.

Las moléculas de iARN de esta divulgación pueden usarse individualmente, o en combinación, o junto con otros fármacos conocidos para prevenir o tratar enfermedades, o mejorar síntomas de estados o trastornos.

Las moléculas de iARN de esta invención pueden usarse para modular o inhibir la expresión de un gen de una manera específica de secuencia.

Las moléculas de iARN de esta divulgación pueden incluir una cadena guía para que una serie de nucleótidos contiguos sean al menos parcialmente complementarios a un ARNm humano.

Las realizaciones de esta invención pueden incluir composiciones para su uso en métodos para prevenir, tratar o mejorar los síntomas de una enfermedad o estado en un sujeto que necesita las mismas.

En algunas realizaciones, los métodos para prevenir, tratar o mejorar los síntomas de un tumor maligno en un sujeto pueden incluir administrar al sujeto una molécula de iARN de esta invención para modular la expresión de un gene en el sujeto u organismo.

También se divulgan en el presente documento métodos para regular por disminución la expresión de un gen en una célula u organismo, poniendo en contacto la célula u organismo con una molécula de iARN de esta invención.

Moléculas de iARN dirigidas contra Hsp47

En algunas realizaciones, esta invención puede proporcionar una gama de moléculas de iARN y composiciones para modular la expresión de proteína de choque térmico 47 (Hsp47), una chaperona molecular específico de colágeno para el transporte intracelular y la maduración.

Algunos ejemplos de ARNip contra Hsp47 se proporcionan en el documento US 8.710.209.

Hsp47 o una secuencia genética homóloga de la misma se divulga, por ejemplo, con el n.° de registro de GenBank. AB010273 (humano), X60676 (ratón) o M69246 (rata, gp46).

Los agentes para suprimir Hsp47 se han divulgado para inhibir la fibrosis. Véase, por ejemplo, el documento US 8.173.170 B2. Sin embargo, existe información limitada en relación con el efecto de la inhibición de Hsp47 sobre el desarrollo, progresión y crecimiento de tumores malignos.

En algunas realizaciones, cada cadena de una molécula de ARNip de esta invención puede tener desde 15 hasta 60 nucleótidos de longitud, o desde 15 hasta 40 nucleótidos de longitud, o desde 19 hasta 25 nucleótidos de longitud. En determinadas realizaciones, esta invención proporciona una composición farmacéutica que contiene moléculas de iARN para tratar un tumor maligno que son moléculas de iARN dirigidas contra Hsp47.

Los ejemplos de moléculas de iARN de esta divulgación dirigidas contra ARNm de Hsp47 se muestran en la tabla 9. Tabla 9: secuencias de moléculas de iARN contra Hsp47

Clave para la tabla 9: las letras mayúsculas A, G, C y U se refieren a ribo-A, ribo-G, ribo-C y ribo-U, respectivamente. La d minúscula representa “desoxi”.

En la tabla 9, la cadena antisentido de cualquiera de las moléculas de iARN dirigidas contra Hsp47 puede tener alternativamente desoxinucleótidos en una pluralidad de posiciones, siendo la pluralidad de posiciones una de las siguientes: cada una de las posiciones 4, 6 y 8, desde el extremo 5' de la cadena antisentido; cada una de las posiciones 3, 5 y 7, desde el extremo 5' de la cadena antisentido; cada una de las posiciones 1, 3, 5 y 7, desde el extremo 5' de la cadena antisentido; cada una de las posiciones 3-8, desde el extremo 5' de la cadena antisentido; y cada una de las posiciones 5-8, desde el extremo 5' de la cadena antisentido.

Los ejemplos adicionales de moléculas de iARN de esta divulgación dirigidas contra ARNm de Hsp47 se muestran en la tabla 10.

Tabla 10: secuencias de molécula de iARN y control contra Hsp47

Clave para la tabla 10: designaciones: rX representa ribonucleótidos, mXrepresenta ribonucleótidos 2'-O-Metilo, 25rX representa ribonucleótidos con enlaces 2'-5', C3 representa un espaciador 1,3-propanodiol, idAB representa 1,2-didesoxi-D-ribosa invertida, P representa un grupo fosfato en el extremo terminal 3'.

En la tabla 10, la cadena antisentido de cualquiera de las moléculas de iARN dirigidas contra Hsp47 puede tener alternativamente desoxinucleótidos en una pluralidad de posiciones, siendo la pluralidad de posiciones una de las siguientes: cada una de las posiciones 4, 6 y 8, desde el extremo 5' de la cadena antisentido; cada una de las posiciones 3, 5 y 7, desde el extremo 5' de la cadena antisentido; cada una de las posiciones 1, 3, 5 y 7, desde el cada una de las posiciones 5-8, desde el extremo 5' de la cadena antisentido.

Moléculas de iARN dirigidas contra MCL1

En algunas realizaciones, esta invención puede proporcionar una gama de moléculas de iARN y composiciones para modular la expresión del gen de leucemia de células mielógenas 1 (MCL1) de Homo sapiens, variante de transcripto 2, ARNm.

MCL1 se divulga, por ejemplo, con el n.° de registro NM_182763.2 (humano).

Los ejemplos de moléculas de iARN de esta divulgación dirigidas contra ARNm de MCL1 se muestran en la tabla 11. Tabla 11: secuencias de moléculas de iARN contra MCL1

Clave para la tabla 11: las letras mayúsculas A, G, C y U se refieren a ribo-A, ribo-G, ribo-C y ribo-U, respectivamente. La d minúscula representa “desoxi”.

En la tabla 11, la cadena antisentido de cualquiera de las moléculas de iARN dirigidas contra MCL1 puede tener alternativamente desoxinucleótidos en una pluralidad de posiciones, siendo la pluralidad de posiciones una de las siguientes: cada una de las posiciones 4, 6 y 8, desde el extremo 5' de la cadena antisentido; cada una de las posiciones 3, 5 y 7, desde el extremo 5' de la cadena antisentido; cada una de las posiciones 1, 3, 5 y 7, desde el extremo 5' de la cadena antisentido; cada una de las posiciones 3-8, desde el extremo 5' de la cadena antisentido; y cada una de las posiciones 5-8, desde el extremo 5' de la cadena antisentido.

Moléculas de iARN dirigidas contra ARAF

En algunas realizaciones, esta invención puede proporcionar una gama de moléculas de iARN y composiciones para modular la expresión del gen de serina/treonina cinasa proto-oncogénica A-Raf (ARAF) de Homo sapiens, variante de transcripto 1, ARNm.

ARAF se divulga, por ejemplo, con el n.° de registro NM_001654.4 (humano).

Los ejemplos de moléculas de iARN de esta divulgación dirigidas contra ARNm de ARAF se muestran en la tabla 12. Tabla 12: secuencias de moléculas de iARN contra ARAF

Clave para la tabla 12: las letras mayúsculas A, G, C y U se refieren a ribo-A, ribo-G, ribo-C y ribo-U, respectivamente. La d minúscula representa “desoxi”.

En la tabla 12, la cadena antisentido de cualquiera de las moléculas de iARN dirigidas contra ARAF puede tener siguientes: cada una de las posiciones 4, 6 y 8, desde el extremo 5' de la cadena antisentido; cada una de las posiciones 3, 5 y 7, desde el extremo 5' de la cadena antisentido; cada una de las posiciones 1, 3, 5 y 7, desde el extremo 5' de la cadena antisentido; cada una de las posiciones 3-8, desde el extremo 5' de la cadena antisentido; y cada una de las posiciones 5-8, desde el extremo 5' de la cadena antisentido.

Interferencia de ARN

En general, los ARNip pueden tener desde aproximadamente 21 hasta aproximadamente 23 nucleótidos de longitud e incluyen una región de dúplex de pares de bases de aproximadamente 19 nucleótidos de longitud.

La iARN implica un complejo de endonucleasa conocido como complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC). Un ARNip tiene una cadena antisentido o guía que entra en el complejo RISC y media la escisión de una diana de ARN monocatenario que tiene una secuencia complementaria a la cadena antisentido del dúplex de ARNip. La otra cadena del ARNip es la cadena pasajera. La escisión del ARN diana tiene lugar en medio de la región complementaria a la cadena antisentido del dúplex de ARNip Véase, por ejemplo, Elbashir et al., Genes & Development, 2001, vol. 15, págs. 188-200.

Tal como se usa en el presente documento, el término “cadena sentido” se refiere a una secuencia de nucleótidos de una molécula de ARNip que es parcial o completamente complementaria a al menos una porción de una cadena antisentido correspondiente de la molécula de ARNip. La cadena sentido de una molécula de ARNip puede incluir una secuencia de ácido nucleico que tiene homología con una secuencia de ácido nucleico diana.

Tal como se usa en el presente documento, el término “cadena antisentido” se refiere a una secuencia de nucleótidos de una molécula de ARNip que es parcial o completamente complementaria a al menos una porción de una secuencia de ácido nucleico diana. La cadena antisentido de una molécula de ARNip puede incluir una secuencia de ácido nucleico que es complementaria a al menos una porción de una cadena sentido correspondiente de la molécula de ARNip.

Las moléculas de iARN pueden regular por disminución o atenuar la expresión génica mediante mediación de interferencia de ARN de una manera específica de secuencia. Véase, por ejemplo, Zamore et al., Cell, 2000, vol. 101, págs. 25-33; Elbashir et al., Nature, 2001, vol. 411, págs. 494-498; Kreutzer et al., documento W02000/044895; Zemicka-Goetz et al., documento W02001/36646; Fire et al., documento W01999/032619; Plaetinck et al., documento W02000/01846; Mello et al., documento W02001/029058.

Tal como se usa en el presente documento, los términos “ inhibir”, “regular por disminución” o “reducir” con respecto a la expresión génica significa que la expresión del gen, o el nivel de las moléculas de ARNm que codifican para una o más proteínas, o la actividad de una o más de las proteínas codificadas se reduce por debajo de la observada en ausencia de una molécula de iARN o ARNip de esta invención. Por ejemplo, el nivel de expresión, nivel de ARNm, o nivel de actividad de proteína codificada puede reducirse en al menos el 1%, o al menos el 10%, o al menos el 20%, o al menos el 50%, o al menos el 90%, o más del observado en ausencia de una molécula de iARN o ARNip de esta invención.

Las moléculas de iARN también pueden usarse para atenuar la expresión génica viral, y por tanto afectan a la replicación viral.

Las moléculas de iARN pueden elaborarse a partir de cadenas separadas de polinucleótidos: una cadena sentido o cadena pasajera, y una cadena antisentido o cadena guía. Las cadenas guía y pasajera son al menos parcialmente complementarias. La cadena guía y la cadena pasajera pueden formar una región de dúplex que tiene desde aproximadamente 15 hasta aproximadamente 49 pares de bases.

En algunas realizaciones, la región de dúplex de un ARNip puede tener 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 ó 49 pares de bases.

En determinadas realizaciones, una molécula de iARN puede ser activa en un complejo RISC, con una longitud de región de dúplex activa contra RISC.

En realizaciones adicionales, una molécula de iARN puede ser activa como un sustrato de Dicer, que va a convertirse en una molécula de iARN que puede ser activa en un complejo RISC.

En algunos aspectos, una molécula de iARN puede tener porciones de secuencia guía y pasajera complementarias en extremos opuestos de una molécula larga, de manera que la molécula puede formar una región de dúplex con las porciones de secuencia complementarias, y las cadenas se unen en un extremo de la región de dúplex mediante ligadores nucleotídicos o no nucleotídicos. Por ejemplo, una disposición en horquilla, o una disposición en tallo y bucle. Las interacciones de los ligadores con las cadenas pueden ser enlaces covalentes o interacciones no covalentes.

nucleotídico que une la región sentido del ácido nucleico a la región antisentido del ácido nucleico. Un ligador nucleotídico puede ser un ligador de > 2 nucleótidos de longitud, por ejemplo aproximadamente 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 nucleótidos de longitud. El ligador nucleotídico puede ser un aptámero de ácido nucleico. Por “aptámero” o “aptámero de ácido nucleico”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula de ácido nucleico que se une específicamente a una molécula diana en la que la molécula de ácido nucleico tiene una secuencia que incluye una secuencia reconocida por la molécula diana en su entorno natural. De manera alternativa, un aptámero puede ser una molécula de ácido nucleico que se une a una molécula diana, en el que la molécula diana no se une de manera natural a un ácido nucleico. Por ejemplo, el aptámero puede usarse para unirse a un dominio de unión a ligando de una proteína, impidiendo así la interacción del ligando que se produce de manera natural con la proteína. Véase, por ejemplo, Gold et al., Annu Rev Biochem, 1995, vol. 64, págs. 763-797; Brody et al., J. Biotechnol., 2000, vol. 74, págs.

5-13; Hermann et al., Science, 2000, vol. 287, págs. 820-825.

Los ejemplos de un ligador no nucleotídico incluyen un nucleótido abásico, poliéter, poliamina, poliamida, péptido, hidrato de carbono, lípido, polihidrocarburo, u otros compuestos poliméricos, por ejemplo, polietilenglicoles tales como los que tienen desde 2 hasta 100 unidades de etilenglicol. Algunos ejemplos se describen en Seela et al., Nucleic Acids Research, 1987, vol. 15, págs. 3113-3129; Cload et al., J. Am. Chem. Soc., 1991, vol. 113, págs. 6324-6326; Jaeschke et al., Tetrahedron Lett., 1993, vol. 34, págs. 301; Arnold et al., documento W01989/002439; Usman et al., documento W01995/00673 1; Dudycz et al., documento W01995/011910, y Ferentz et al., J. Am. Chem. Soc., 1991, vol. 113, págs. 4000-4002.

Una molécula de iARN puede tener una o más proyecciones de la región de dúplex. Las proyecciones, que son regiones de cadena sencilla de bases no emparejadas, pueden tener desde uno hasta ocho nucleótidos de longitud, o más largas. Una proyección puede ser una proyección en el extremo 3', en la que el extremo 3' de una cadena tiene una región de cadena sencilla de desde uno hasta ocho nucleótidos. Una proyección puede ser una proyección en el extremo 5', en la que el extremo 5' de una cadena tiene una región de cadena sencilla de desde uno hasta ocho nucleótidos.

Las proyecciones de una molécula de iARN pueden tener la misma longitud o pueden ser de longitudes diferentes.

Una molécula de iARN puede tener uno o más extremos romos, en la que la región de dúplex termina sin proyección, y las cadenas es emparejan por bases con respecto al extremo de la región de dúplex.

Una molécula de iARN de esta divulgación puede tener uno o más extremos romos o puede tener una o más proyecciones o puede tener una combinación de un extremo romo y un extremo en proyección.

Un extremo 5' de una cadena de una molécula de iARN puede estar en un extremo romo o puede estar en una proyección. Un extremo 3' de una cadena de una molécula de iARN puede estar en un extremo romo o puede estar en una proyección.

Un extremo 5' de una cadena de una molécula de iARN puede estar en un extremo romo, mientras que el extremo 3' está en una proyección. Un extremo 3' de una cadena de una molécula de iARN puede estar en un extremo romo, mientras que el extremo 5' está en una proyección.

En algunas realizaciones, ambos extremos de una molécula de iARN son extremos romos.

En realizaciones adicionales, ambos extremos de una molécula de iARN tienen una proyección.

Las proyecciones en los extremos 5' y 3 pueden tener diferentes longitudes.

En determinadas realizaciones, una molécula de iARN puede tener un extremo romo en la que el extremo 5' de la cadena antisentido y el extremo 3' de la cadena sentido no tienen ningún nucleótido en proyección.

En realizaciones adicionales, una molécula de iARN puede tener un extremo romo en la que el extremo 3' de la cadena antisentido y el extremo 5' de la cadena sentido no tienen ningún nucleótido en proyección.

Una molécula de iARN puede tener apareamientos erróneos en el apareamiento de bases en la región de dúplex.

Cualquier nucleótido en una proyección de una molécula de iARN puede ser un desoxirribonucleótido o un ribonucleótido.

Uno o más desoxirribonucleótidos puede estar en el extremo 5', en el que el extremo 3' de la otra cadena de la molécula de iARN puede no tener una proyección o puede no tener una proyección de desoxirribonucleótidos.

Uno o más desoxirribonucleótidos puede estar en el extremo 3', en el que el extremo 5' de la otra cadena de la molécula de iARN puede no tener una proyección o puede no tener una proyección de desoxirribonucleótidos.

En algunas realizaciones, uno o más, o todos los nucleótidos de proyección de una molécula de iARN pueden ser 2'-desoxirribonucleótidos.

Moléculas de iARN de sustrato de Dicer

En algunos aspectos, una molécula de iARN puede tener una longitud adecuada como sustrato de Dicer, que puede procesarse para producir una molécula de iARN activa contra RISC. Véase, por ejemplo, Rossi et al., documento US2005/0244858.

Un ARN bicatenario (ARNbc) que es un sustrato de Dicer puede tener una longitud suficiente de manera que se procesa mediante Dicer para producir una molécula de iARN activa, y puede incluir además una o más de las siguientes propiedades: (i) el ARNbc sustrato de Dicer puede ser asimétrico, por ejemplo, teniendo una proyección en 3' en la cadena antisentido, y (ii) el ARNbc sustrato de Dicer puede tener un extremo 3' modificado en la cadena sentido para dirigir la orientación de la unión de Dicer y el procesamiento de ARNbc para dar una molécula de iARN activa.

En determinadas realizaciones, la cadena más larga en un ARNbc sustrato de Dicer puede tener 24-30 nucleótidos de longitud.

Un ARNbc sustrato de Dicer puede ser simétrico o asimétrico.

En algunas realizaciones, un ARNbc sustrato de Dicer puede tener una cadena sentido de 22-28 nucleótidos y una cadena antisentido de 24-30 nucleótidos.

En determinadas realizaciones, un ARNbc sustrato de Dicer puede tener una proyección en el extremo 3' de la cadena antisentido.

En realizaciones adicionales, un ARNbc sustrato de Dicer puede tener una cadena sentido 25 nucleótidos de longitud, y una cadena antisentido de 27 nucleótidos de longitud, con una proyección en 3' de 2 bases. La proyección puede tener 1,2 ó 3 nucleótidos de longitud. La cadena sentido también puede tener 5'-fosfato.

Un ARNbc sustrato de Dicer asimétrico puede tener dos desoxirribonucleótidos en el extremo 3' de la cadena sentido en lugar de dos de los ribonucleótidos.

La cadena sentido de un ARNbc sustrato de Dicer puede tener desde aproximadamente 22 hasta aproximadamente 30, o desde aproximadamente 22 hasta aproximadamente 28; o desde aproximadamente 24 hasta aproximadamente 30; o desde aproximadamente 25 hasta aproximadamente 30; o desde aproximadamente 26 hasta aproximadamente 30; o desde aproximadamente 26 hasta 29; o desde aproximadamente 27 hasta aproximadamente 28 nucleótidos de longitud.

La cadena sentido de un ARNbc sustrato de Dicer puede tener 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ó 30 nucleótidos de longitud.

En determinadas realizaciones, un ARNbc sustrato de Dicer puede tener cadenas sentido y antisentido que tienen al menos aproximadamente 25 nucleótidos de longitud, y no más de aproximadamente 30 nucleótidos de longitud. En determinadas realizaciones, un ARNbc sustrato de Dicer puede tener cadenas sentido y antisentido que tienen de 26 a 29 nucleótidos de longitud.

En determinadas realizaciones, un ARNbc sustrato de Dicer puede tener cadenas sentido y antisentido que tienen 27 nucleótidos de longitud.

Las cadenas sentido y antisentido de un ARNbc sustrato de Dicer pueden tener la misma longitud, es decir, tener extremos romos, o diferentes longitudes, es decir, tener proyecciones, o pueden tener un extremo romo y una proyección.

Un ARNbc sustrato de Dicer puede tener una región de dúplex de 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26 ó 27 nucleótidos de longitud.

La cadena antisentido de un ARNbc sustrato de Dicer puede tener cualquier secuencia que se hibrida con al menos una porción de la secuencia de la cadena sentido en condiciones biológicas, tales como dentro del citoplasma de una célula eucariota.

Un sustrato de Dicer con una cadena sentido y una antisentido puede unirse mediante una tercera estructura, tal como un grupo ligador o un oligonucleótido ligador. El ligador conecta las dos cadenas del ARNbc, por ejemplo, de manera Las cadenas sentido y antisentido de un sustrato de Dicer son en general complementarias, pero pueden tener apareamientos erróneos en el apareamiento de bases.

En algunas realizaciones, un ARNbc sustrato de Dicer puede ser asimétrico de manera que la cadena sentido tenga 22-28 nucleótidos y la cadena antisentido tenga 24-30 nucleótidos.

Una región de una de las cadenas, particularmente la cadena antisentido, del ARNbc sustrato de Dicer puede tener una longitud de secuencia de al menos 19 nucleótidos, en la que estos nucleótidos están en la región de 21 nucleótidos adyacente al extremo 3' de la cadena antisentido y son suficientemente complementarios a una secuencia de nucleótidos del ARN producido a partir del gen diana.

Una cadena antisentido de un ARNbc sustrato de Dicer puede tener desde 1 hasta 9 ribonucleótidos en el extremo 5', para proporcionar una longitud de 22-28 nucleótidos. Cuando la cadena antisentido tiene una longitud de 21 nucleótidos, entonces pueden añadirse 1-7 ribonucleótidos, o 2-5 ribonucleótidos, o 4 ribonucleótidos en el extremo 3'. Los ribonucleótidos añadidos pueden tener cualquier secuencia.

Una cadena sentido de un ARNbc sustrato de Dicer puede tener 24-30 nucleótidos. La cadena sentido puede ser sustancialmente complementaria con la cadena antisentido para hibridarse a la cadena antisentido en condiciones biológicas.

Métodos para usar moléculas de ¡ARN

Las moléculas de ácido nucleico y moléculas de iARN de esta invención pueden suministrarse a una célula o tejido mediante aplicación directa de las moléculas, o con las moléculas combinadas con un portador o un diluyente.

Las moléculas de ácido nucleico y moléculas de iARN de esta invención pueden suministrarse o administrarse a una célula, tejido, órgano o sujeto mediante aplicación directa de las moléculas con un portador o diluyente, o cualquier otro vehículo de administración que actúa para ayudar, promover o facilitar la entrada en una célula, por ejemplo, secuencias virales, material viral o formulaciones lipídicas o liposómicas.

Las moléculas de ácido nucleico y moléculas de iARN de esta invención pueden complejarse con lípidos catiónicos, envasados dentro de liposomas, o suministrados de otra manera a células o tejidos diana. El ácido nucleico o los complejos de ácido nucleico pueden administrarse localmente a tejidos relevantes ex vivo o in vivo a través de aplicación dérmica, aplicación transdérmica o inyección directas.

Los sistemas de administración pueden incluir, por ejemplo, geles acuosos y no acuosos, cremas, emulsiones, microemulsiones, liposomas, pomadas, disoluciones acuosas y no acuosas, lociones, aerosoles, bases hidrocarbonadas y polvos, y pueden contener excipientes tales como solubilizantes y potenciadores de la permeación.

Las composiciones y métodos de esta divulgación pueden incluir un vector de expresión que incluye una secuencia de ácido nucleico que codifica para al menos una molécula de iARN de esta invención de una manera que permita la expresión de la molécula de ácido nucleico.

Las moléculas de ácido nucleico y moléculas de iARN de esta invención pueden expresarse a partir de unidades de transcripción insertadas en vectores de ADN o ARN. Los vectores recombinantes pueden ser plásmidos de ADN o vectores virales. Pueden usarse vectores virales que proporcionen la expresión transitoria de moléculas de ácido nucleico.

Por ejemplo, el vector puede contener secuencias que codifican para ambas cadenas de una molécula de iARN de un dúplex, como una única molécula de ácido nucleico que es autocomplementaria y por tanto forma una molécula de iARN. Un vector de expresión puede incluir una secuencia de ácido nucleico que codifica para dos o más moléculas de ácido nucleico.

Una molécula de ácido nucleico puede expresarse dentro de células a partir de promotores eucariotas. Los expertos en la técnica comprenden que cualquier ácido nucleico puede expresarse en células eucariotas a partir del vector de ADN/ARN apropiado.

En algunos aspectos, un constructo viral puede usarse para introducir un constructo de expresión en una célula, para la transcripción de un constructo de ARNbc codificado por el constructo de expresión.

Pueden administrarse formulaciones lipídicas a animales mediante inyección intravenosa, intramuscular, o intraperitoneal, o por vía oral o mediante inhalación u otros métodos tal como se conocen en la técnica.

Se conocen y pueden usarse formulaciones farmacéuticamente aceptables para administrar oligonucleótidos.

Métodos para tratar una enfermedad

Los ejemplos de enfermedades incluyen cáncer, sarcomas, fibrosarcoma, histiocitoma fibroso maligno, liposarcoma, rabdomiosarcoma, leiomiosarcoma, angiosarcoma, sarcoma de Kaposi, linfangiosarcoma, sarcoma sinovial, condrosarcoma, osteosarcoma y carcinomas.

En determinados aspectos, los usos en los métodos de esta invención pueden utilizar los compuestos de la invención para prevenir o tratar tumores y cánceres malignos en cualquier órgano o tejido, incluyendo, por ejemplo, tumor cerebral, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de esófago, cáncer de estómago, cáncer de duodeno, cáncer colorrectal, cáncer de hígado, cáncer de páncreas, cáncer de vesícula biliar, cáncer de vías biliares, cáncer de riñón, cáncer de uretra, cáncer de vejiga, cáncer de próstata, cáncer de testículo, cáncer de útero, cáncer de ovario, cáncer de piel, leucemia, linfoma maligno, tumores malignos epiteliales y tumores malignos no epiteliales.

Ejemplo de protocolo para atenuación génica in vitro

Un día antes de la transfección, se sembraron células en una placa de 96 pocillos a 2 x 103 células por pocillo con 100 |il de DMEM (# de cat. de Hyclone SH30243.01) que contenía FBS al 10% y se cultivaron en una incubadora a 37°C que contenía una atmósfera humidificada del 5% de CO² en aire. Antes de la transfección, se cambió el medio a 90 |il de medio de suero reducido Opti-MEM I (# de cat. de Life Technologies 31985-070) que contenía FBS al 2%. Luego, se mezclaron 0,2 |il de Lipofectamine RNAiMax (# de cat. de Life Technologies 13778-100) con 4,8 |il de Opti-MEM I durante 5 minutos a temperatura ambiente. A continuación, se mezcló 1 |il de ARNip con 4 |il de Opti-MEM I y se combinaron con la disolución de LF2000, y se mezclaron suavemente, sin vórtex. Después de 5 minutos a temperatura ambiente, se incubó la mezcla durante 10 minutos adicionales a temperatura ambiente para permitir que se formaran los complejos ARN-RNAiMax. Además, se añadieron los 10 |il de complejos ARN-RNAiMax a un pocillo, y se agitó suavemente la placa a mano. Se incubaron las células en una incubadora a 37°C que contenía una atmósfera humidificada del 5% de CO2 en aire durante 2 horas. Se cambió el medio a medio de suero reducido Opti-MEM I recién preparado que contenía FBS al 2%. 24 horas después de la transfección, se lavaron las células con PBS enfriado con hielo una vez. Se lisaron las células con 50 |il de tampón de lisis Cell-to-Ct (# de cat. de Life Technologies 4391851 C) durante 5-30 minutos a temperatura ambiente. Se añadieron 5 |il de disolución de parada, y se incubó durante 2 minutos a temperatura ambiente. Se midió el nivel de ARNm mediante RT-qPCR con TAQMAN inmediatamente. Pudieron congelarse las muestras a -80°C y someterse a ensayo más tarde.

Ejemplo de protocolo para determinar estabilidad en suero

Se incubó ARNip 0,2 mg/ml con suero humano al 10% a 37°C. En determinados puntos de tiempo (0, 5, 15 y 30 min), se tomaron alícuotas de 200 |il de muestra y se extrajeron con 200 |il de disolvente de extracción (cloroformo: fenol:alcohol isoamílico =24:25:1). Se agitó con vórtex la muestra y se centrifugó a 13.000 rpm durante 10 min a TA, luego se transfirió la disolución de la fase superior y se filtró con un filtro de 0,45 |im. Se transfirió el filtrado a un vial de inyección de HPLC de 300 |il. Para CL-EM, la fase móvil fue MPA: HFIP 100 mM TEA 7 mM en H²O, MPB: el 50% de metanol el 50% de acetonitrilo. La columna: Waters Acquity OST 2,1 x 50 mm, 1,7 |im.

Ejemplos

Ejemplo 1: se encontró que los ARNip de esta invención dirigidos contra GST-rc eran activos para el silenciamiento génico in vitro. Se encontró que las actividades dependientes de la dosis de los ARNip de GST-rc para la atenuación génica presentaban una CI50 por debajo de aproximadamente 250 picomolar (pM), y tan bajas como 1 pM.

Se realizó la transfección in vitro en una línea de células A549 para determinar la eficacia de atenuación génica de ARNip. Se observó atenuación génica dependiente de la dosis para ARNm de GST-rc con los ARNip de la tabla 1, tal como se muestra en la tabla 13.

Tabla 13: atenuación génica dependiente de la dosis para ARNm de GST-rc en una línea de células A549

Tal como se muestra en la tabla 13, las actividades de los ARNip de GST-rc de la tabla 1 estaban en el intervalo de Ejemplo 2: la estructura de los ARNip de GST-rc de esta invención que tienen desoxinucleótidos ubicados en la región semilla de la cadena antisentido del ARNip proporcionó un aumento inesperado y ventajoso de la actividad de atenuación génica in vitro.

Se realizó la transfección in vitro en una línea de células A549 para determinar la eficacia de atenuación génica para los ARNip de GST-rc basados en la estructura BU2' (SEQ ID NO.: 131 y 157). Se observó atenuación génica dependiente de la dosis de ARNm de GST-rc con los ARNip de GST-rc basados en la estructura BU2' tal como se muestra en la tabla 14.

Tabla 14: atenuación génica dependiente de la dosis de ARNm de GST-rc en una línea de células A549 para los ARNip de GST-rc basados en la estructura BU2'

Tal como se muestra en la tabla 14, las actividades de los ARNip de GST-rc basados en la estructura BU2' que tenía tres desoxinucleótidos en la región semilla de la cadena antisentido se aumentaron sorprendente e inesperadamente en hasta 6 veces, en comparación con un ARNip de GST-rc sin desoxinucleótidos en la región de dúplex.

Estos datos muestras que los ARNip de GST-rc que tenían una estructura con tres desoxinucleótidos ubicados en las posiciones 3, 5 y 7, o en las posiciones 4, 6 y 8 en la región semilla de la cadena antisentido proporcionaron un aumento sorprendente de la actividad de atenuación génica en comparación con un ARNip de GST-rc sin desoxinucleótidos en la región de dúplex.

Las actividades mostradas en la tabla 14 para los ARNip de GST-rc que tenían tres desoxinucleótidos en la región semilla de la cadena antisentido estaban en el intervalo de 5 a 8 pM, lo que es excepcionalmente adecuado para muchos usos, incluyendo como agente farmacológico que va a usarse in vivo.

Ejemplo 3: la estructura de los ARNip de GST-rc de esta invención que tenía desoxinucleótidos ubicados en la región semilla de la cadena antisentido del ARNip proporcionó un aumento inesperado y ventajoso de la actividad de atenuación génica in vitro.

Se realizó la transfección in vitro en una línea de células A549 para determinar la eficacia de atenuación génica para los ARNip de GST-rc basados en la estructura A9' (SEQ ID NO.: 183 y 195). Se observó atenuación génica dependiente de la dosis de ARNm de GST-rc con los ARNip de GST-rc basados en la estructura A9', tal como se muestra en la tabla 15.

Tabla 15: atenuación génica dependiente de la dosis de ARNm de GST-rc en una línea de células A549 para los ARNip de GST-rc basados en la estructura A9'

Tal como se muestra en la tabla 15, las actividades de los ARNip de GST-rc basados en la estructura A9' que tenía de tres a seis desoxinucleótidos en la región semilla de la cadena antisentido se aumentaron sorprendentemente en hasta 24 veces, en comparación con un ARNip de GST-rc sin desoxinucleótidos en la región de dúplex.

Estos datos muestran que los ARNip de GST-rc que tenían una estructura con de tres a seis desoxinucleótidos ubicados en las posiciones 4, 6 y 8, o en las posiciones 1, 3, 5 y 7, o en las posiciones 3-8, o en las posiciones 5-8, o en las posiciones 3, 5 y 7 en la región semilla de la cadena antisentido proporcionaron un aumento inesperado de la actividad de atenuación génica en comparación con un ARNip de GST-rc sin desoxinucleótidos en la región de dúplex.

La actividad mostrada en la tabla 15 para los ARNip de GST-rc que tenían de tres a seis desoxinucleótidos en la región semilla de la cadena antisentido estaba en el intervalo de 1 a 15 pM, lo que es excepcionalmente adecuado para muchos usos, incluyendo como agente farmacológico que va a usarse in vivo.

Ejemplo 4: la estructura de los ARNip de GST-rc que tenía desoxinucleótidos ubicados en la región semilla de la cadena antisentido del ARNip proporcionó un aumento inesperado y ventajoso de la actividad de atenuación génica in vitro.

Se realizó la transfección in vitro en una línea de células A549 para determinar la eficacia de atenuación génica para los ARNip de GST-rc basados en la estructura B13' (SEQ ID NO.:207 y 222). Se observó atenuación génica dependiente de la dosis del ARNm de GST-rc con los ARNip de GST-rc basados en la estructura B13', tal como se muestra en la tabla 16.

Tabla 16: atenuación génica dependiente de la dosis del ARNm de GST-rc en una línea de células A549 para los ARNip de GST-rc basados en la estructura B13'

Tal como se muestra en la tabla 16, la actividad de un ARNip de GST-rc basado en la estructura B13' que tiene tres desoxinucleótidos en la región semilla de la cadena antisentido se aumentó inesperadamente en comparación con un ARNip de GST-rc sin desoxinucleótidos en la región de dúplex.

Estos datos muestran que los ARNip de GST-rc que tenían una estructura con tres desoxinucleótidos ubicados en las posiciones 4, 6 y 8 en la región semilla de la cadena antisentido proporcionaron un aumento inesperado de la actividad de atenuación génica en comparación con un ARNip de GST-rc sin desoxinucleótidos en la región de dúplex.

La actividad mostrada en la tabla 16 para los ARNip de GST-rc que tenían tres desoxinucleótidos en la región semilla de la cadena antisentido estaba en el intervalo picomolar a 11 pM, lo que es excepcionalmente adecuado para muchos usos, incluyendo como agente farmacológico que va a usarse in vivo.

Ejemplo 5: la estructura de los ARNip de GST-rc que tenían desoxinucleótidos ubicados en la región semilla de la cadena antisentido del ARNip proporcionó un aumento inesperado y ventajoso de la actividad de atenuación génica in vitro.

Se realizó la transfección in vitro en una línea de células A549 para determinar la eficacia de atenuación génica para los ARNip de GST-rc basados en la estructura B4' (SEQ ID NO.:261 y 273). Se observó atenuación génica dependiente de la dosis del ARNm de GST-rc con los ARNip de GST-rc basados en la estructura B4', tal como se muestra en la tabla 17.

Tabla 17: atenuación génica dependiente de la dosis del ARNm de GST-rc en una línea de células A549 para los ARNip de GST-rc basados en la estructura B4'

___________________________________________

Tal como se muestra en la tabla 17, las actividades de los ARNip de GST-rc basados en la estructura B4' que tenía seis desoxinucleótidos en la región semilla de la cadena antisentido se aumentaron inesperadamente en más de dos veces, en comparación con un ARNip de GST-rc sin desoxinucleótidos en la región de dúplex.

Estos datos muestran que los ARNip de GST-rc que tenían una estructura con seis desoxinucleótidos ubicados en las posiciones 3-8 en la región semilla de la cadena antisentido proporcionaron un aumento sorprendente de la actividad de atenuación génica en comparación con un ARNip de GST-rc sin desoxinucleótidos en la región de dúplex.

La actividad mostrada en la tabla 17 para un ARNip de GST-rc que tenía seis desoxinucleótidos en la región semilla de la cadena antisentido estaba en el intervalo picomolar a 113 pM, lo que es excepcionalmente adecuado para muchos usos, incluyendo como agente farmacológico que va a usarse in vivo.

Ejemplo 6: la estructura de los ARNip de GST-rc que tenía desoxinucleótidos ubicados en la región semilla de la cadena antisentido del ARNip proporcionó un aumento inesperado y ventajoso de la actividad de atenuación génica in vitro.

Se realizó la transfección in vitro en una línea de células A549 para determinar la eficacia de atenuación génica para los ARNip de GST-rc basados en la estructura B2' (SEQ ID NO.:237 y 249). Se observó atenuación génica dependiente de la dosis del ARNm de GST-rc con los ARNip de GST-rc basados en la estructura B2', tal como se muestra en la tabla 18.

Tabla 18: atenuación génica dependiente de la dosis del ARNm de GST-rc en una línea de células A549 para los ARNip de GST-rc basados en la estructura B2'

Tal como se muestra en la tabla 18, las actividades de los ARNip de GST-rc basados en la estructura B2' que tenía de tres a cuatro desoxinucleótidos en la región semilla de la cadena antisentido se aumentaron sorprendentemente en hasta 4 veces, en comparación con un ARNip de GST-rc sin desoxinucleótidos en la región de dúplex.

Estos datos muestran que los ARNip de GST-rc que tenían una estructura con de tres a cuatro desoxinucleótidos ubicados en las posiciones 5-8, o en las posiciones 1, 3, 5 y 7, o en las posiciones 3, 5 y 7 en la región semilla de la cadena antisentido proporcionaron un aumento inesperado de la actividad de atenuación génica en comparación con un ARNip de GST-rc sin desoxinucleótidos en la región de dúplex.

Las actividades mostradas en la tabla 18 para los ARNip de GST-rc que tenían de tres a cuatro desoxinucleótidos en la región semilla de la cadena antisentido estaban en el intervalo de 30-100 pM, lo que es excepcionalmente adecuado para muchos usos, incluyendo como agente farmacológico que va a usarse in vivo.

Ejemplo 7: la estructura de los ARNip de GST-rc que contenía uno o más nucleótidos sustituidos con 2'-desoxi-2'-fluoro proporcionó un aumento inesperado de la actividad de atenuación génica in vitro.

Se realizó la transfección in vitro en una línea de células A549 para determinar la eficacia de atenuación génica para los ARNip de GST-rc basados en la estructura BU2' (SEQ ID NO.:131 y 157). Se observó atenuación génica dependiente de la dosis del ARNm de GST-rc con los ARNip de GST-rc basados en la estructura BU2', tal como se muestra en la tabla 19.

ARNip de GST-rc basados en la estructura BU2'

Tal como se muestra en la tabla 19, las actividades de los ARNip de GST-rc basados en la estructura BU2' que tenía uno o más 2'-F-desoxinucleótidos se aumentaron sorprendentemente en hasta 10 veces, en comparación con un ARNip de GST-n: sin 2'-F-desoxinucleótidos.

Estos datos muestran que los ARNip de GST-rc que tienen una estructura con uno o más 2'-F-desoxinucleótidos proporcionaron un aumento inesperado de la actividad de atenuación génica en comparación con un ARNip de GST-rcsin ningún 2'-F-desoxinucleótido.

Las actividades mostradas en la tabla 19 para los ARNip de GST-rc que tienen uno o más 2'-F-desoxinucleótidos estaban en el intervalo de 3 a 13 pM, lo que es excepcionalmente adecuado para muchos usos, incluyendo como agente farmacológico que va a usarse in vivo.

Ejemplo 8: la estructura de los ARNip de GST-rc que contenía uno o más nucleótidos sustituidos con 2'-desoxi-2'-fluoro proporcionó un aumento inesperado de la actividad de atenuación génica in vitro.

Se realizó la transfección in vitro en una línea de células A549 para determinar la eficacia de atenuación génica para los ARNip de GST-rc basados en la estructura B13' (SEQ ID NO.:207 y 222). Se observó atenuación génica dependiente de la dosis del ARNm de GST-rc con los ARNip de GST-rc basados en la estructura B13', tal como se muestra en la tabla 20.

Tabla 20: atenuación génica dependiente de la dosis del ARNm de GST-rc en una línea de células A549 para los ARNip de GST-rc basados en la estructura B13'

Tal como se muestra en la tabla 20, la actividad de un ARNip de GST-rc basado en la estructura B13' que tenía tres 2'-F-desoxinucleótidos ubicados en posiciones no de proyección se aumentó sorprendentemente en aproximadamente 3 veces, en comparación con un ARNip de GST-k sin 2'-F-desoxinucleótidos.

Estos datos muestran que los ARNip de GST-rc que tenían una estructura con uno o más 2'-F-desoxinucleótidos proporcionaron un aumento inesperado de la actividad de atenuación génica en comparación con un ARNip de GST-rc sin un 2'-F-desoxinucleótido.

La actividad mostrada en la tabla 20 para los ARNip de GST-rc que tenían uno o más 2'-F-desoxinucleótidos estaba en el intervalo picomolar a 6 pM, lo que es excepcionalmente adecuado para muchos usos, incluyendo como agente farmacológico que va a usarse in vivo.

Ejemplo 9: modelo de ratón con cáncer de pulmón ortotópico A549. Los ARNip de GST-rc de esta invención pueden presentar una reducción profunda de tumores de cáncer de pulmón ortotópico in vivo. En este ejemplo, un ARNip de GST-rc proporcionó potencia de atenuación génica in vivo cuando se administró en una formulación liposomal a los tumores de cáncer de pulmón ortotópico en ratones atímicos desnudos.

En general, un modelo de tumor ortotópico puede presentar relevancia clínica directa para la eficacia y potencia farmacológicas, así como una capacidad predictiva mejorada. En el modelo de tumor ortotópico, se implantan células tumorales directamente en la misma clase de órgano del que se originaron las células.

pesos finales del tumor primario medidos en la necropsia para el grupo de tratamiento y el grupo de control con vehículo.

La figura 1 muestra inhibición del tumor de cáncer de pulmón ortotópico in vivo para un ARNip de GST-rc basado en la estructura BU2 (SEQ ID NO.:61 y 126). Se utilizó un modelo de ratón con cáncer de pulmón ortotópico A549 con una dosis relativamente baja a 2 mg/kg del ARNip dirigido contra GST-rc.

El ARNip de GST-rc mostró una eficacia de inhibición del tumor de pulmón significativa e inesperadamente ventajosa en este estudio de seis semanas. Tal como se muestra en la figura 1, después de 43 días, el ARNip de GST-rc mostró una eficacia de inhibición del tumor marcadamente ventajosa, con una reducción significativa de pesos promedio finales del tumor de 2,8 veces en comparación con el control.

Para este estudio, se usaron ratones nu/nu macho NCr de 5-6 semanas de edad. Se mantuvieron los animales de experimentación en un entorno con filtración HEPA durante el periodo experimental. Se almacenaron las formulaciones de ARNip a 4°C antes de su uso, y se calentaron hasta temperatura ambiente 10 minutos antes de la inyección en el ratón.

Para este modelo ortotópico de cáncer de pulmón humano A549, en el día de la implantación ortotópica quirúrgica (SOI), se extirparon los tumores originales a partir del sitio subcutáneo de animales que portan xenoinjerto de tumor A549 y se colocaron en medio RPMI-1640. Se retiraron los tejidos necróticos y se cortaron los tejidos viables en fragmentos de 1,5-2 mm3. Se anestesió a los animales con inhalación de isoflurano y se esterilizó la zona quirúrgica con yodo y alcohol. Se realizó una incisión transversal de aproximadamente 1,5 cm de longitud en la parte izquierda de la pared torácica del ratón usando un par de tijeras quirúrgicas. Se realizó una incisión intercostal entre la tercera y la cuarta costilla y se expuso el pulmón izquierdo. Se trasplantó un fragmento de tumor A549 a la superficie del pulmón con una sutura quirúrgica 8-0 (nailon). Se cerró la pared torácica con una sutura quirúrgica 6-0 (seda). Se volvió a inflar el pulmón mediante punción intratorácica usando una jeringa de 3 cc con una aguja 25 G X 1 A para extraer el aire restante en la cavidad torácica. Se cerró la pared torácica con una sutura de seda quirúrgica 6-0. Todos los procedimientos de la intervención descrita anteriormente se realizaron con un microscopio de aumento 7 x bajo campanas de flujo laminar con filtración HEPA.

Tres días después de la implantación del tumor, se dividieron aleatoriamente los ratones que portan tumor en grupos con diez ratones por grupo. Para el grupo de interés, se inició el tratamiento de los diez ratones tres días después de la implantación del tumor.

Para el grupo de interés, la formulación era (lípido ionizable:colesterol:DOPE:DOPC:DPPE-PEG-2K:DSPE-PEG-2K), una composición liposomal. Los liposomas encapsularon el ARNip de GST-rc.

Para el punto final del estudio, se sacrificaron los ratones de experimentación cuarenta y dos días después del inicio del tratamiento. Se escindieron los tumores primarios y se pesaron sobre una balanza electrónica para su análisis posterior.

Para una estimación de la toxicidad del compuesto, el peso corporal medio de los ratones en los grupos tratado y de control se mantuvo dentro del intervalo normal durante todo el periodo del experimento. No se detectaron otros síntomas de toxicidad en los ratones.

Ejemplo 10: los ARNip de GST-rc de esta invención presentaron una reducción profunda de tumores de xenoinjerto de cáncer in vivo. Los ARNip de GST-rc proporcionaron potencia de atenuación génica in vivo cuando se administraron en una formulación liposomal a los tumores de xenoinjerto de cáncer.

La figura 2 muestra la eficacia de inhibición del tumor para un ARNip de GST-rc (SEQ ID NO.: 156 y 182). Se utilizó un modelo de xenoinjerto de cáncer con una dosis relativamente baja a 0,75 mg/kg de ARNip dirigido contra GST-rc.

El ARNip de GST-rc mostró una eficacia de inhibición del tumor significativa e inesperadamente ventajosa en el plazo de unos pocos días después de la administración. Después de 36 días, el ARNip de GST-rc mostró una eficacia de inhibición del tumor marcadamente ventajosa, con una reducción de volumen del tumor de 2 veces en comparación con el control.

Tal como se muestra en la figura 3, el ARNip de GST-rc demostró una eficacia de inhibición del tumor significativa e inesperadamente ventajosa en el día del punto final. En particular, se redujo el peso del tumor en más de 2 veces.

Se administró el ARNip de GST-rc en dos inyecciones (días 1 y 15) de una formulación liposomal que tenía la composición (lípido ionizable:colesterol:DOPE:DoPC:DPPE-PEG-2K) (25:30:20:20:5).

Para el modelo de xenoinjerto de cáncer, se obtuvo una línea de células A549 de ATCC. Se mantuvieron las células Se dividieron las células 48 h antes de la inoculación de manera que las células estaban en crecimiento de fase logarítmica cuando se recogieron. Se tripsinizaron ligeramente las células con tripsina-EDTA y se recogieron a partir del cultivo tisular. Se contó el número de células viables y se determinó en un hemocitómetro en presencia de azul trípano (sólo se cuentan las células viables). Se volvieron a suspender las células hasta una concentración de 5 x 107/ml en medios sin suero. Luego se mezcló bien la suspensión celular con BD Matrigel descongelado en hielo a una razón de 1:1 para la inyección.

Los ratones eran ratones hembra atímicos desnudos (nu/nu) de Charles River Laboratory, inmunodeprimidos, de 6-8 semanas de edad, 7-8 ratones por grupo.

Para la preparación del modelo de tumor, se inoculó a cada ratón por vía subcutánea en el costado derecho con 0,1 ml de un inóculo de 2,5 x 106 de células A549 usando una aguja y jeringa 25 G, un inóculo por ratón. No se anestesió a los ratones para la inoculación.

Para las mediciones y aleatorización de los volúmenes de tumor, se midió el tamaño del tumor hasta el 0,1 mm más cercano. Se calcularon los volúmenes del tumor usando la fórmula: volumen del tumor =longitud x anchura2/2. Una vez que los tumores establecidos alcanzaron aproximadamente 120 - 175 mm3, el volumen promedio del tumor era de aproximadamente 150 mm3, se asignaron los ratones a los diversos grupos de control con vehículo y de tratamiento de manera que los volúmenes medios del tumor en los grupos tratados estaban dentro del 10% del volumen medio del tumor en el grupo de control con vehículo, idealmente, el % de CV de volumen del tumor era menos del 25%. En el mismo día, se administraron artículos de prueba y vehículo de control según la pauta posológica. Se monitorizaron los volúmenes del tumor tres veces durante la semana 1, dos veces durante el resto de semanas, incluyendo el día de terminación del estudio.

Para la administración de la dosificación, en el día de la dosificación, se sacaron los artículos de prueba de un congelador a -80°C y se descongelaron en hielo. Antes de aplicarse a las jeringas, se invirtió a mano el frasco que contenía la formulación unas pocas veces. Se dosificaron todos los artículos de prueba a 0,75 mg/kg mediante i.v., q2w X 2, a 10 ml/kg.

Para determinar el peso corporal, se pesaron los ratones al 0,1 g más cercano. Se monitorizaron los pesos corporales y se registraron diariamente en el plazo de 7 días tras la dosificación de la primera dosis. Se monitorizaron y registraron los pesos corporales dos veces durante semanas a lo largo del resto de semanas, incluyendo el día de terminación del estudio.

Para la recogida de tumores, a los 28 días tras la primera dosificación, se midió el volumen del tumor, y se disecó el tumor para la medición del peso, y se almacenó para el estudio de biomarcadores PD. Se registró el peso del tumor.

Ejemplo 11: los ARNip de GST-rc de esta invención demostraron un aumento de la muerte de células cancerosas por apoptosis de células cancerosas in vitro. Los ARNip de GST-rc proporcionaron atenuación génica de GST-rc, que dio como resultado la regulación por incremento de PUMA, un biomarcador para la apoptosis y asociado con la pérdida de viabilidad celular.

Los ARNip de GST-k de SEQ ID NO.:156 y 182 que contenían una combinación de desoxinucleótidos en la región semilla, un desoxinucleótido sustituido con 2'-F y ribonucleótidos sustituidos con 2'-OMe, proporcionaron un aumento inesperado de la apoptosis de las células cancerosas.

Se midió el nivel de expresión de PUMA para el ARNip de GST-rc de SEQ ID NO.:156 y 182 tal como se muestra en la figura 4. En la figura 4, la expresión de PUMA se aumentó mucho desde los 2-4 días después de la transfección del ARNip de GST-rc.

Estos datos muestran que la estructura de los ARNip de GST-rc que contenía una combinación de desoxinucleótidos en la región semilla, un desoxinucleótido sustituido con 2'-F y ribonucleótidos sustituidos con 2'-OMe proporcionó un aumento inesperado de la apoptosis de las células cancerosas.

El protocolo para el biomarcador de PUMA fue de la siguiente manera. Un día antes de la transfección, se sembraron células en una placa de 96 pocillos a 2 x 103 células por pocillo con 100 |il de DMEM (# de cat. de Hyclone SH30243.01) que contenía FBS al 10% y se cultivaron en una incubadora a 37°C que contenía una atmósfera humidificada del 5% de CO² en aire. Al siguiente día, antes de la transfección, se reemplazó el medio con 90 |il de medio de suero reducido Opti-MEM I (# de cat. de Life Technologies 31985-070) que contenía FBS al 2%. Luego, se mezclaron 0,2 |il de Lipofectamine RNAiMax (# de cat. de Life Technologies 13778-100) con 4,8 |il de Opti-MEM I durante 5 minutos a temperatura ambiente. Se mezcló 1 |il del ARNip de GST-rc (conc. original 1 |iM) con 4 |il de Opti-MEM I y se combinaron con la disolución de RNAiMAX, y luego se mezclaron suavemente. Se incubó la mezcla durante 10 minutos a temperatura ambiente para permitir que se formaran los complejos ARN-RNAiMax. Se añadieron 10 |il de complejos ARN-RNAiMax por pocillo hasta una concentración final del ARNip 10 nM. Se incubaron las células durante 2 horas y 3, 4 y 6 días tras la transfección, se lavaron las células con PBS enfriado con hielo una vez y luego se lisaron con 50 |il de tampón de lisis Cell-to-Ct (# de cat. de Life Technologies 4391851 C) durante 5-30 minutos a temperatura ambiente. Se añadieron 5 |il de disolución de parada, y se incubaron durante 2 minutos a temperatura ambiente. Se midieron los niveles de ARNm de PUMA (b Bc 3, # de cat. Hs00248075, Life Technologies) mediante qPCR con TAQMAN.

Ejemplo 12: los ARNip de GST-rc de esta invención pueden presentar una profunda reducción de tumores de xenoinjerto de cáncer in vivo. Los ARNip de GST-rc pueden proporcionar potencia de atenuación génica in vivo cuando se administran en una formulación liposomal a los tumores de xenoinjerto de cáncer.

La figura 5 muestra la eficacia de inhibición del tumor para un ARNip de GST-rc (SEQ ID NO.:61 y 126). Se observó atenuación génica dependiente de la dosis del ARNm de GST-rc in vivo con el ARNip dirigido contra GST-rc. Se utilizó un modelo de xenoinjerto de cáncer con una dosis relativamente baja de 0,75 mg/kg del ARNip dirigido contra GST-rc.

El ARNip de GST-rc mostró eficacia de inhibición del tumor significativa e inesperadamente ventajosa en un plazo de unos pocos días después de la administración. Tal como se muestra en la figura 5, el tratamiento con un ARNip de GST-n: dio como resultado una reducción significativa de la expresión del ARNm de GST-rc 4 días después de la inyección en una formulación lipídica. A la mayor dosis de 4 mg/kg, se detectó una reducción significativa de aproximadamente el 40% 24 horas después de la inyección.

Se administró el ARNip de GST-rc en una única inyección de 10 ml/kg de una formulación liposomal que tenía la composición (lípido ionizable:colesterol:DOPE:DOPC:DPPE-PEG-2K) (25:30:20:20:5).

Para el modelo de xenoinjerto de cáncer, se obtuvo una línea de células A549 de ATCC. Se mantuvieron las células en RPMI-1640 complementado con suero bovino fetal al 10% y 100 U/ml de penicilina y estreptomicina 100 |ig/ml. Se dividieron las células 48 h antes de la inoculación de manera que las células estuvieran en crecimiento de fase logarítmica cuando se recogieron. Se tripsinizaron ligeramente las células con tripsina-EDTA y se recogieron del cultivo tisular. Se contó el número de células viables y se determinó en un hemocitómetro en presencia de azul trípano (sólo se cuentan las células viables). Se volvieron a suspender las células hasta una concentración de 4 x 107/ml en medio RPMI sin suero. Luego se mezcló bien la suspensión celular con BD Matrigel descongelado en hielo a una razón de 1:1 para la inyección.

Los ratones eran ratones hembra atímicos desnudos (nu/nu) de Charles River Laboratory, inmunodeprimidos, de 6-8 semanas de edad, 3 ratones por grupo.

Para la preparación del modelo de tumor, se inoculó a cada ratón por vía subcutánea en el costado derecho con 0,1 ml de un inóculo de 2 x 106 de células A549 usando una aguja y jeringa 25 G, un inóculo por ratón. No se anestesió a los ratones para la inoculación.

Para las mediciones y aleatorización de los volúmenes de tumor, se midió el tamaño del tumor hasta el 0,1 mm más cercano. Se calcularon los volúmenes del tumor usando la fórmula: volumen del tumor =longitud x anchura2/2. Se monitorizaron los volúmenes de tumor dos veces a la semana. Una vez que los tumores establecidos alcanzaron aproximadamente 350 - 600 mm3, se asignaron los ratones a los grupos con puntos de tiempo variados. En el mismo día, se administraron artículos de prueba según la pauta posológica.

Para la administración de la dosificación, en el día en el que los tumores establecidos alcanzaron aproximadamente 350 - 600 mm3, se sacaron los artículos de prueba del frigorífico a 4°C. Antes de aplicarse a los jeringas, se invirtió a mano el frasco que contenía la formulación unas pocas veces para tener una disolución homogénea.

Para determinar el peso corporal, se pesaron los ratones al 0,1 g más cercano. Se monitorizaron y registraron los pesos corporales dos veces durante semanas a lo largo del resto de semanas, incluyendo el día de terminación del estudio.

Para la recogida de tumores, se sacrificaron los animales mediante una sobredosis de CO² y se disecaron los tumores a las 0, 24, 48, 72, 96 (opcional) y 168 horas tras la dosificación. En primer lugar se pesaron los tumores en húmedo y después se separaron en tres partes para la KD, la distribución y el análisis de biomarcadores. Se ultracongelaron las muestras en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80°C hasta que estaban listas para procesarse.

Ejemplo 13: los ARNip de GST-rc de esta invención inhibieron los tumores de xenoinjerto de cáncer de páncreas in vivo. Los ARNip de GST-rc proporcionaron potencia de atenuación génica in vivo cuando se administraron en una formulación liposomal a los tumores de xenoinjerto de cáncer de páncreas.

En este modelo de xenoinjerto, se inoculó a cada ratón por vía subcutánea en el costado derecho con 0,1 ml de un inóculo de 2,5 x 106 de células PANC-1. Se usaron ratones atímicos desnudos hembra de Charles River de 6 a 8 alcanzaron aproximadamente 150 - 250 mm3 (volumen promedio del tumor en aproximadamente 200 mm3), se asignaron los ratones a los diversos grupos de control con vehículo y de tratamiento de manera que los volúmenes medios del tumor en los grupos tratados estaban dentro del 10% del volumen medio del tumor en el grupo de control con vehículo. En el mismo día, se administraron artículos de prueba y vehículo de control según la pauta posológica. Se monitorizaron los volúmenes del tumor tres veces durante la semana 1, dos veces durante el resto de semanas, incluyendo el día de terminación del estudio.

La figura 6 muestra la eficacia de inhibición del tumor para un ARNip de GST-rc (SEQ ID NO.:61 y 126). Tal como se muestra en la figura 6, se obtuvo una respuesta a la dosis con dosis que oscilaban desde 0,375 mg/kg hasta 3 mg/kg de ARNip dirigido contra GST-rc. El ARNip de GST-rc mostró eficacia de inhibición del tumor significativa e inesperadamente ventajosa en el plazo de unos pocos días después de la administración. Por tanto, el ARNip de GST-n: demostró eficacia de inhibición del tumor significativa e inesperadamente ventajosa en el punto final.

Los ARNip de GST-rc se administraron en una formulación liposomal que tenía la composición (lípido ionizable:colesterol:DOPE:DOPC:DPPE-PEG-2K) (25:30:20:20:5).

Ejemplo 14: los ARNip de GST-rc de esta invención presentaron un aumento de la estabilidad en suero.

La figura 7 muestra la incubación en suero humano y la detección del ARNip restante en diversos puntos de tiempo mediante HPLS/CL-EM. Tal como se muestra en la figura 7, la semivida (ty2) en suero tanto para la cadena sentido (figura 7, parte superior) como la cadena antisentido (figura 7, parte inferior) de un ARNip de GST-rc (SEQ ID NO.:61 y 126) era de aproximadamente 100 minutos.

Ejemplo 15: los ARNip de GST-rc de esta invención presentaron estabilidad mejorada en formulación en plasma.

La figura 8 muestra la incubación de formulación en plasma y la detección del ARNip restante en diversos puntos de tiempo. Tal como se muestra en la figura 8, la semivida (ty2) en plasma de una formulación de ARNip de GST-rc (SEQ ID NO.:61 y 126) era significativamente mayor de 100 horas.

Se preparó el ARNip de GST-rc en una formulación liposomal que tenía la composición (lípido ionizante:colesterol:DOPE:DOPC DPPE-PEG-2K) (25:30:20:20:5). El tamaño promedio z para las nanopartículas liposomales era de 40,0 nm, y el ARNip estaba encapsulado al 91%.

Se incubó la formulación en suero humano al 50% en PBS durante 40 min, 1,5 h, 3 h, 24 h y 96 h. Se determinó la cantidad del ARNip de GST-rc mediante un ensayo basado en ELISA.

Ejemplo 16: los ARNip de GST-rc de esta invención presentaron efectos inespecíficos reducidos por la cadena pasajera.

Para el ARNip de GST-rc (SEQ ID NO.: 156 y 182), la figura 9 muestra que la atenuación génica in vitro para la cadena guía era aproximadamente exponencial, en comparación con un control con secuencia reorganizada al azar que no presentó ningún efecto. Se midió la CI50 de este ARNip a 5 pM. La figura 10 muestra la atenuación génica in vitro para la cadena pasajera del mismo ARNip de GST-rc. Tal como se muestra en la figura 10, la atenuación génica inespecífica de la cadena pasajera para el ARNip de GST-rc se redujo mucho, en más de 100 veces.

Para los ARNip de GST-rc (SEQ ID NO.:187 y 199), (SEQ ID NO.:189 y 201) y (SEQ ID NO.:190 y 202), la figura 11 muestra que las atenuaciones génicas in vitro para las cadenas guía eran aproximadamente exponenciales. Se midieron las CI50 de estos ARNip a 6, 7 y 5 pM, respectivamente. Tal como se muestra en la figura 12, las atenuaciones génicas in vitro para las cadenas pasajeras de estos ARNip de GST-rc se redujeron significativamente en al menos 10 veces. Todos estos ARNip de GST-rc tenían desoxinucleótidos en la región semilla de la región de dúplex, sin otras modificaciones en la región de dúplex.

Para los ARNip de GST-rc (SEQ ID NO.:217 y 232), la figura 13 muestra que la atenuación génica in vitro para la cadena guía de este ARNip de GST-rc muy activo era aproximadamente exponencial. Se midió la CI50 de este ARNip a 11 pM. Tal como se muestra en la figura 14, la atenuación génica in vitro para la cadena pasajera de este ARNip de GST-rc se redujo significativamente en más de 100 veces. Este ARNip de GST-rc tenía desoxinucleótidos en la región semilla de la región de dúplex, sin otras modificaciones en la región de dúplex.

Se determinaron los efectos inespecíficos usando el plásmido indicador de expresión psiCHECK-2 que codifica el gen de luciferasa de Renilla (sistema de ensayo de indicador de luciferasa dual, Promega, # de cat.:E1960). La concentración de ARNip fue normalmente 50 pM. Protocolo: día 1, se sembraron células HeLa a de 5 a 7,5 x 103/100 ul/pocillo. Día 2, cotransfección con confluencia celular de aproximadamente el 80%. Día 3, células recogidas para la medición de actividad de luciferasa. Se midió la actividad de luciferasa usando el sistema de ensayo de El vector psiCHECK-2 permitió la monitorización de los cambios en la expresión de un gen diana fusionado con el gen indicador de luciferasa de Renilla. Se clonaron los constructos de ARNip en la región de clonación múltiple y se cotransfectó el vector con el ARNip en células HeLa. Si un ARNip específico se une al ARNm diana e inicia el proceso de la iARN, el ARNm de luciferasa de Renilla:constructo fusionados se escindirá y se degradará posteriormente, disminuyendo la señal de luciferasa de Renilla.

Por ejemplo, los insertos plasmídicos para los ARNip con la estructura BU2' eran tal como sigue:

Inserto plasmídico de PsiCHECK-2 (F):

SEQ ID NO.: 451

ctcgag gggcaacTGAAGCCTTTTGAGACCCTGcTgTcccag gcggccgc

Inserto plasmídico de PsiCHECK-2 (R):

SEQ ID NO.: 452

ctcgag cTgggacagCAGGGTCTCAAAAGGCTTCagTTgccc gcggccgc

Ejemplo 17: los ARNip de GST-rc de esta invención presentaron efectos inespecíficos similares a miARN ventajosamente reducidos, que son el silenciamiento génico inespecífico involuntario dependiente de la semilla. Para los ARNip de GST-rc (SEQ ID NO.:156 y 182), (SEQ ID NO.:187 y 199), (SEQ ID NO.:189 y 201), (SEQ ID NO.:190 y 202) y (SEQ ID NO.:217 y 232), se encontró que la actividad inespecífica que imita el miARN era esencialmente despreciable. El silenciamiento génico inespecífico involuntario dependiente de la semilla para estos ARNip de GST-rc era al menos de 10 veces a 100 veces menor que la actividad específica de la cadena guía.

Para someter a prueba los efectos inespecíficos relacionados con miARN, se introdujeron en la región correspondiente a la 3'UTR del ARNm de luciferasa de una a cuatro repeticiones de secuencias diana apareadas con semillas complementarias a la región que contiene la semilla completa, las posiciones 1-8 del extremo 5' de la cadena antisentido, pero no a la región no semilla restante, las posiciones 9-21, para determinar la eficacia de los efectos inespecíficos involuntarios dependientes de la semilla. Se usaron insertos plasmídicos que imitaban un miARN con apareamiento completo en la región semilla y apareamientos erróneos (abombamientos) en la región no semilla. Por ejemplo, los insertos plasmídicos para los ARNip con la estructura BU2' eran tal como sigue:

Inserto plasmídico de PsiCHECK-2 (Fmi1):

SEQ ID NO.: 453

ctcgag gggcaacTCTACGCAAAACAGACCCTGcTgTcccag gcggccgc

Inserto plasmídico de PsiCHECK-2 (Fmi2):

SEQ IDNO.: 454

ctcgag gggcaacTCTACGCAAAACAGACCCTGcT CTACGCAAAACAGACCCTGcT gTcccag gcggccgc

Inserto plasmídico de PsiCHECK-2 (Fmi3):

SEQ ID NO.: 455

ctcgag gggcaacTCTACGCAAAACAGACCCTGcT CTACGCAAAACAGACCCTGcT CTACGCAAAACAGACCCTGcT gTcccag gcggccgc

Inserto plasmídico de PsiCHECK-2 (Fmi4):

SEQ IDNO.: 456

ctcgag gggcaacTCTACGCAAAACAGACCCTGcT CTACGCAAAACAGACCCTGcT CTACGCAAAACAGACCCTGcT CTACGCAAAACAGACCCTGcT gTcccag gcggccgc

Las realizaciones descritas en el presente documento no son limitativas y un experto en la técnica puede apreciar someterse a prueba sin experimentación excesiva para la identificación de moléculas de ácido nucleico con actividad de iARN mejorada.

Ejemplo 18: se encontró que los ARNip de esta invención contra p21 eran activos para el silenciamiento génico in vitro. Se encontró que las actividades dependientes de la dosis de los ARNip de p21 para la atenuación génica presentaban una CI50 por debajo de aproximadamente 3 picomolar (pM), y tan baja como 1 pM.

Se realizó la transfección in vitro en una línea de células A549 para determinar la eficacia de atenuación génica del ARNip. Se observó la atenuación génica dependiente de la dosis para el ARNm de p21 con los ARNip de la tabla 7, tal como se muestra en la tabla 21.

Tabla 21: Atenuación génica dependiente de la dosis para el ARNm de p21 en una línea de células A549

Tal como se muestra en la tabla 21, las actividades de los ARNip de p21 de la tabla 7 estaban en el intervalo de 0,3­ 10 pM, lo que es adecuado para muchos usos, incluyendo como agente farmacológico que va a usarse in vivo.

Ejemplo 19: la estructura de los ARNip de p21 de esta invención que tenía desoxinucleótidos ubicados en la región semilla de la cadena antisentido del ARNip proporcionó un aumento inesperado y ventajoso de la actividad de atenuación génica.

Se realizó la transfección in vitro en una línea de células A549 para determinar la eficacia de atenuación génica para los ARNip de p21 basados en la estructura 1735' (SEQ ID NO.:341 y 355). Se observó atenuación génica dependiente de la dosis de ARNm de p21 con los ARNip de p21 basados en la estructura 1735' tal como se muestra en la tabla 22.

Tabla 22: atenuación génica dependiente de la dosis del ARNm de p21 en una línea de células A549 para los ARNip de p21 basados en la estructura 1735'

Tal como se muestra en la tabla 22, las actividades de los ARNip de p21 basados en la estructura 1735' que tenía tres desoxinucleótidos en la región semilla de la cadena antisentido se aumentaron sorprendente e inesperadamente en hasta 300 veces, en comparación con un ARNip de p21 sin desoxinucleótidos en la región de dúplex.

Estos datos muestran que los ARNip de p21 que tenían una estructura con desoxinucleótidos en la región semilla de la cadena antisentido proporcionaron un aumento sorprendente de la actividad de atenuación génica en comparación con un ARNip de p21 sin desoxinucleótidos en la región de dúplex.

Las actividades mostradas en la tabla 22 para los ARNip de p21 que tenían tres desoxinucleótidos en la región semilla de la cadena antisentido estaban en el intervalo de 0,001 a 0,1 pM, lo que es excepcionalmente adecuado para muchos usos, incluyendo como agente farmacológico que va a usarse in vivo.

Ejemplo 20: los ARNip de p21 de esta invención pueden presentar una profunda reducción de tumores de xenoinjerto de cáncer in vivo. Los ARNip de p21 pueden proporcionar potencia de atenuación génica in vivo cuando se administran en una formulación liposomal a los tumores de xenoinjerto de cáncer.

La figura 15 muestra la eficacia de inhibición del tumor para un ARNip de p21 (SEQ ID NO.:341 y 355, en la que N =U). Se utilizó un modelo de xenoinjerto de cáncer con una dosis relativamente baja a 0,75 mg/kg de ARNip dirigido contra p21.

unos pocos días después de la administración. Después de 30 días, el ARNip de p21 mostró una eficacia de inhibición del tumor marcadamente ventajosa, con una reducción de volumen del tumor de más de 2 veces en comparación con el control.

Se administró el ARNip de p21 a una dosificación de 0,75 mg/kg en cuatro inyecciones de 10 ml/kg (días 1, 8, 15 y 22) de una formulación liposomal que tenía la composición (lípido ionizable:colesterol:DOPE:DOPC:DPPE-PEG-2K) (25:30:20:20:5).

Para el modelo de xenoinjerto de cáncer, se obtuvo una línea de células A549 de ATCC. Se mantuvieron las células en medio de cultivo complementado con suero bovino fetal al 10% y 100 U/ml de penicilina y estreptomicina 100 |ig/ml. Se dividieron las células 48 h antes de la inoculación de manera que las células estuvieran en crecimiento de fase logarítmica cuando se recogieron. Se tripsinizaron ligeramente las células con tripsina-EDTA y se recogieron del cultivo tisular. Se contó el número de células viables y se determinó en un hemocitómetro en presencia de azul trípano (sólo se cuentan las células viables). Se volvieron a suspender las células hasta una concentración de 5 x 107/ml en medios sin suero. Luego se mezcló bien la suspensión celular con BD Matrigel descongelado en hielo a una razón de 1:1 para la inyección.

Los ratones eran ratones hembra atímicos desnudos (nu/nu) de Charles River Laboratory, inmunodeprimidos, de 6-8 semanas de edad, 7-8 ratones por grupo.

Para la preparación del modelo de tumor, se inoculó a cada ratón por vía subcutánea en el costado derecho con 0,1 ml de un inóculo de 2,5 x 106 de células A549 usando una aguja y jeringa 25 G, un inóculo por ratón. No se anestesió a los ratones para la inoculación.

Para las mediciones y aleatorización de los volúmenes de tumor, se midió el tamaño del tumor hasta el 0,1 mm más cercano. Se calcularon los volúmenes del tumor usando la fórmula: volumen del tumor = longitud x anchura2/2. Una vez que los tumores establecidos alcanzaron aproximadamente 120 - 175 mm3, el volumen promedio del tumor era de aproximadamente 150 mm3, se asignaron los ratones a los diversos grupos de control con vehículo y de tratamiento de manera que los volúmenes medios del tumor en los grupos tratados estaban dentro del 10% del volumen medio del tumor en el grupo de control con vehículo, idealmente, el % de CV de volumen del tumor era menos del 25%. En el mismo día, se administraron artículos de prueba y vehículo de control según la pauta posológica. Se monitorizaron los volúmenes del tumor tres veces durante la semana 1, dos veces durante el resto de semanas, incluyendo el día de terminación del estudio.

Para la administración de la dosificación, en el día de la dosificación, se sacaron los artículos de prueba de un congelador a -80°C y se descongelaron en hielo. Antes de aplicarse a las jeringas, se invirtió a mano el frasco que contenía la formulación unas pocas veces. Se dosificaron todos los artículos de prueba a 0,75 mg/kg mediante i.v.

Para determinar el peso corporal, se pesaron los ratones al 0,1 g más cercano. Se monitorizaron los pesos corporales y se registraron diariamente en el plazo de 7 días tras la dosificación de la primera dosis. Se monitorizaron y registraron los pesos corporales dos veces durante semanas a lo largo del resto de semanas, incluyendo el día de terminación del estudio.

Para la recogida de tumores, a los 28 días tras la primera dosificación, se midió el volumen del tumor, y se disecó el tumor para la medición del peso, y se almacenó para el estudio de biomarcadores PD. Se registró el peso del tumor.

Las realizaciones descritas en el presente documento no son limitativas y un experto en la técnica puede apreciar fácilmente que combinaciones específicas de las modificaciones descritas en el presente documento pueden someterse a prueba sin experimentación excesiva para la identificación de moléculas de ácido nucleico con actividad de iARN mejorada.

Ejemplo 21: se preparan ARNip de esta invención dirigidos contra MCL1 y se encuentra que son activos para el silenciamiento génico in vitro. Se encuentra que las actividades dependientes de la dosis de los ARNip de MCL1 para la atenuación génica presentan una CI50 por debajo de aproximadamente 100 picomolar (pM).

Se realiza transfección in vitro en una línea de células A549 para determinar la eficacia de atenuación génica del ARNip. Se observa atenuación génica dependiente de la dosis para el ARNm de MCL1 con los ARNip de la tabla 11.

Ejemplo 22: se preparan ARNip de esta invención dirigidos contra ARAF y se encuentra que son activos para el silenciamiento génico in vitro. Se encuentra que las actividades dependientes de la dosis de los ARNip de ARAf para la atenuación génica presentan una CI50 por debajo de aproximadamente 100 picomolar (pM).

Se realiza transfección in vitro en una línea de células A549 para determinar la eficacia de atenuación génica del ARNip. Se observa atenuación génica dependiente de la dosis para el ARNm de ARAF con los ARNip de la tabla 12.

Claims (14)

1. Molécula de ácido nucleico, en la que:

a) la molécula tiene una cadena sentido del polinucleótido y una cadena antisentido del polinucleótido; b) cada cadena de la molécula tiene desde 15 hasta 30 nucleótidos de longitud;

c) una región contigua de desde 15 hasta 30 nucleótidos de la cadena antisentido es complementaria a una secuencia de un ARNm;

d) al menos una porción de la cadena sentido es complementaria a al menos una porción de la cadena antisentido,

y la molécula tiene una región de dúplex de desde 15 hasta 30 nucleótidos de longitud,

en la que uno o más de los nucleótidos en la región de dúplex en las posiciones de 3 a 8 desde el extremo 5' de la cadena antisentido son desoxinucleótidos,

en la que la cadena antisentido tiene desoxinucleótidos en una pluralidad de posiciones, siendo la pluralidad de posiciones una de las siguientes:

cada una de las posiciones 4, 6 y 8, desde el extremo 5' de la cadena antisentido;

cada una de las posiciones 3, 5 y 7, desde el extremo 5' de la cadena antisentido;

cada una de las posiciones 1, 3, 5 y 7, desde el extremo 5' de la cadena antisentido;

cada una de las posiciones 3-8, desde el extremo 5' de la cadena antisentido;

cada una de las posiciones 5-8, desde el extremo 5' de la cadena antisentido; y

la molécula es una molécula de iARN activa para modular la expresión del ARNm.

2. Molécula según la reivindicación 1, en la que:

I) la molécula es activa para inhibir la expresión de un gen seleccionado de genes que codifican para proteínas, proto-oncogenes, oncogenes, genes supresores de tumores y genes de señalización de células; II) el ARNm es un ARNm humano; o

III) el ARNm es un ARNm humano que expresa cualquier miembro o submiembro de la familia humana de proteínas que incluye SRY, beta-globina, RAS, GST citosólica, GST mitocondrial, GST MAPEG, GST-rc, p16, p21, p53, albúmina sérica, colágeno de tipo VII, complemento C3, apolipoproteína B, fenilalanina hidroxilasa, factor VIII, huntingtina, proteína de retinoblastoma RB1, CFTR, titina, utrofina y distrofina.

3. Molécula según la reivindicación 1, en la que:

I) la molécula tiene una CI50 para la atenuación génica del ARNm de menos de 100 pM;

II) la molécula tiene una CI50 para la atenuación génica del ARNm de menos de 50 pM;

III) la molécula tiene una CI50 para la atenuación génica del ARNm de menos de 10 pM; o

IV) una única administración de la molécula inhibe el ARNm en al menos el 25% in vivo.

4. Molécula según la reivindicación 1, en la que cada cadena de la molécula tiene desde 18 hasta 22 nucleótidos de longitud, o en la que la región de dúplex tiene 19 nucleótidos de longitud.

5. Molécula según la reivindicación 1, en la que:

I) la cadena sentido del polinucleótido y la cadena antisentido del polinucleótido están conectadas como una única cadena, y forman una región de dúplex conectada en un extremo mediante un bucle;

II) la molécula tiene un extremo romo;

IV) uno o más de los nucleótidos en la región de dúplex se modifican o se modifican químicamente, opcionalmente en la que los nucleótidos modificados o químicamente modificados son nucleótidos sustituidos con 2'-O-alquilo, nucleótidos sustituidos con 2'-desoxi-2'-fluoro, nucleótidos de fosforotioatos, nucleótidos bloqueados o cualquier combinación de los mismos.

6. Molécula según la reivindicación 1, en la que:

I) la secuencia de bases de la cadena antisentido es SEQ ID NO.:157 y la secuencia de bases de la cadena sentido es SEQ ID NO.:131;

II) la cadena antisentido es SEQ ID NO.:182 y la cadena sentido es SEQ ID NO.:156;

III) la secuencia de bases de la cadena antisentido es SEQ ID NO.:195 y la secuencia de bases de la cadena sentido es SEQ ID NO.:183;

IV) la cadena antisentido es SEQ ID NO.:205 y la cadena sentido es SEQ ID NO.:193;

V) la cadena antisentido es SEQ ID NO.:357 y la cadena sentido es SEQ ID NO.:343; o

VI) la cadena antisentido es SEQ ID NO.:356 y la cadena sentido es SEQ ID NO.:342.

7. Composición farmacéutica que comprende la molécula según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y un portador farmacéuticamente aceptable, opcionalmente en la que el portador comprende una molécula lipídica o un liposoma.

8. Célula que comprende la molécula según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

9. Composición según la reivindicación 7, para su uso en un método para prevenir, tratar o mejorar una enfermedad en un sujeto que lo necesita mediante silenciamiento génico, comprendiendo el método administrar al sujeto dicha composición.

10. Composición según la reivindicación 9 para su uso según la reivindicación 9, en la que la enfermedad es tumor, cáncer, sarcoma o carcinoma malignos.

11. Composición según la reivindicación 7, para su uso en la prevención, la mejora o el tratamiento de una enfermedad o un estado en un sujeto que lo necesita.

12. Composición según la reivindicación 7, para su uso en terapia médica.

13. Composición según la reivindicación 7, para su uso en el tratamiento del cuerpo de un humano o animal.

14. Uso de la composición según la reivindicación 7, para preparar o fabricar un medicamento para prevenir, mejorar o tratar una enfermedad o un estado en un sujeto que lo necesita.