JP7027303B2 - メラニン産生を抑制するrna複合体 - Google Patents
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Description
本願は2015年7月27日付け出願の米国仮出願第62/197,370号(その全体を参照により本明細書に組み入れることとする)の利益を主張するものである。
メラノサイト(メラニン形成細胞)による過剰なメラニン産生は、黒皮症および加齢斑(age spots)を含む種々の皮膚色素沈着関連障害に関連している。黒皮症においては、メラニンの過剰産生は、表皮層に存在するメラノサイトにおいて黒色沈着を生成する。黒皮症は、女性の皮膚に生じる主要な難治性疾患の1つである。黒皮症は、妊婦、および経口もしくはパッチ避妊薬を服用しているまたはホルモン補充療法を受けている女性にしばしば生じる。
本発明は、特定の態様において、チロシナーゼを抑制し、メラニン産生の低減ならびに黒皮症および加齢斑を含む色素沈着関連障害の治療に有用なRNA複合体を、提供する。本発明は、特定の態様において、そのようなRNA複合体を含む医薬組成物ならびにそのようなRNA複合体および医薬組成物の使用方法を提供する。
総論
本発明は、特定の態様において、チロシナーゼ発現を抑制し、したがって、メラニン産生の低減に有用であり、過剰なメラニン産生に関連した色素沈着関連障害、例えば黒皮症および加齢斑の治療に有用である、非対称RNA複合体(例えば、asiRNAまたはlasiRNA)を提供する。幾つかの実施形態においては、RNA複合体は、トランスフェクションビヒクルを必要とすることなく細胞を透過することができるように化学修飾される。幾つかの実施形態においては、RNA複合体は、表1、表2、表4、表5および表6に列挙されているRNA複合体である。特定の態様においては、そのようなRNA複合体を含む医薬組成物ならびにそのようなRNA複合体および医薬組成物の使用方法を本発明で提供する。
便宜上、本明細書、実施例および添付の特許請求の範囲で用いられる特定の用語をここに集める。
本発明は、特定の態様において、チロシナーゼmRNAを標的とし、細胞によるチロシナーゼ発現を抑制するRNA複合体を提供する。チロシナーゼは、メラニン産生を制御する律速酵素であるオキシダーゼである。ヒトチロシナーゼmRNAの核酸配列はNCBIアクセッション番号NM 000372で入手可能であり、図13に記載されている。
特定の態様においては、本発明で提供するRNA複合体と医薬上許容される担体とを含む医薬組成物を本発明で提供する。特定の実施形態においては、医薬組成物は局所送達用に製剤化される。幾つかの実施形態においては、医薬組成物はクリーム剤またはローション剤である。幾つかの実施形態においては、医薬組成物は更に、第2の皮膚美白剤(例えば、ヒドロキノン、アルブチン、トレチノイン、コウジ酸、アゼライン酸またはトラネキサム酸)を含む。特定の実施形態においては、医薬組成物はトランスフェクションビヒクルを含まない。幾つかの実施形態においては、医薬組成物は送達ビヒクル(例えば、リポソーム、カチオン性重合体、細胞透過性ペプチド(CPP)、タンパク質トランスダクションドメイン(PTD)、抗体および/またはアプタマー)を含む。幾つかの実施形態においては、該組成物は、本明細書に記載されている複数(例えば、2以上)のRNA複合体の組み合わせを含む。
特定の態様においては、本発明で提供するRNA複合体と細胞(例えば、メラノサイト)を接触させることを含む、該細胞によるチロシナーゼ発現の抑制方法を本発明で提供する。幾つかの実施形態においては、RNA複合体は修飾RNA複合体であり、トランスフェクションビヒクルの非存在下、細胞をRNA複合体と接触させる。幾つかの実施形態においては、送達ビヒクル(例えば、リポソーム、カチオン性重合体、細胞透過性ペプチド(CPP)、タンパク質トランスダクションドメイン(PTD)、抗体および/またはアプタマー)の存在下、細胞をRNA複合体と接触させる。幾つかの実施形態においては、細胞はヒト対象の皮膚に存在する。幾つかの実施形態においては、対象は、過剰なメラニン産生に関連した皮膚色素沈着障害(例えば、黒皮症または加齢斑)を有する。幾つかの実施形態においては、対象は女性である。幾つかの実施形態においては、対象は妊娠しており、または経口もしくはパッチ避妊薬を服用しており、またはホルモン補充療法を受けている。
高い効率でチロシナーゼを抑制する非対称短鎖干渉RNA(asiRNA)を同定するために、62個のasiRNAを合成し、スクリーニングした。スクリーニングしたasiRNAの核酸配列を表1に示す。
ヒトGAPDH-フォワード 5'-GAG TCA ACG GAT TTG GTC GT-3' (配列番号125);
ヒトGAPDH-リバース 5'-GAC AAG CTT CCC GTT CTC AG-3' (配列番号126);
ヒトチロシナーゼ-フォワード: 5'-GGA TCT GGT CAT GGC TCC TT-3' (配列番号127);
ヒトチロシナーゼ-リバース: 5'-GTC AGG CTT TTT GGC CCT AC-3' (配列番号128)。
実施例1で選択した6つのasiRNAに化学修飾を施し、修飾asiRNAの細胞送達を他の送達ビヒクルの非存在下で試験した。後記のとおり、該修飾の幾つかはasiRNAの安定性およびエンドサイトーシスを改善した。そのような細胞透過性asiRNA(cp-asiRNA)は送達ビヒクルの非存在下で細胞内に送達される能力を有する。
チロシナーゼタンパク質の抑制およびメラニン産生の抑制に関するcp-asiTYR(4)-1の有効性を試験した。非特異的効果を試験するために、チロシナーゼmRNA配列に対する配列相補性を欠く突然変異cp-asiTYR(cp-asiTYR(シード突然変異)と称される)も試験した。cp-asiTYR(シード突然変異)の配列を表3に示す。
MNT-1細胞の色を明るくするcp-asiRNA(4)-1の能力を試験した。
cp-asiRNAの細胞毒性を試験するために、ヒトメラノーマ細胞株であるMNT-1、およびヒトケラチノサイト細胞株であるHaCaTをcp-asiTYR#4-1およびヒドロキノンで処理した。
異なる鎖長、および異なる数の2'-O-メチル化修飾を有する種々の潜在的cp-asiTYR構造体を合成し、チロシナーゼ発現を抑制するそれらの能力に関して試験した(表4)。
20% ウシ胎仔血清(Gibco)、100μg/mlペニシリン/ストレプトマイシン、10% 200mM HEPES(Welgene)および10% ダルベッコ改変イーグル培地(Welgene)を含む最小必須培地(Welgene)でMNT-1細胞を培養した。処理の1日前に、6.5×104個のMNT-1細胞を12ウェルプレート内に播いた。処理の直前に、MNT-1細胞を1×DPBSバッファー(Gibco)で洗浄し、ついでOPTI-MEMバッファー中、1μM、0.6μM、0.3μMおよび0.1μMのcp-asiTYR(4)21AS-1およびcp-asiTYR(4)19AS-7の存在下で24時間インキュベートし、その時点でOPTI-MEM培地を血清含有培地と交換した。
asiRNAまたはlasiRNAとPepfect6(PF6)細胞透過性ペプチドとの組合せを、別のトランスフェクション試薬を使用せずに、チロシナーゼmRNAおよびタンパク質レベルの抑制に関して試験した。
チロシナーゼ発現およびメラニンレベルをcp-asiTYR#4-1処理3-D皮膚モデルにおいて分析した。この研究においては、再構築皮膚モデルであるMEL-300-B(MatTek)を使用した。cp-asiTYR#4-1での処理の24時間前に、MEL-300-BをEPI-100-NMM-113培地において安定化した。アニーリングのために、DEPC処理水に溶解したcp-asiTYR#4-1を95℃で2分間および37℃で1時間インキュベートした。cp-asiTYR#4-1を培地に直接添加することにより、MEL-300-Bサンプルをcp-asiTYR#4-1で毎日13日間処理した(最終濃度 = 5μM)。図14(a)に示されているとおり、対照として、他のMEL-300-Bサンプルをコウジ酸(KA)(Sigma、最終2%)で処理した。サンプルを第14日に回収し、光学顕微鏡を使用してサンプル中のメラノサイトを分析した。図14(c)において認められるとおり、cp-asiTYR#4-1処理は、処理された再構築皮膚モデルサンプルにおけるメラノサイトのレベルを低下させた。各サンプルにおけるメラニンレベルを、フォンタナ-マッソン(Fontana-Massons)染色を用いて分析した。図14(c)に示されているとおり、ci-asiTYR#4-1処理は、処理された再構築皮膚モデルサンプルにおけるメラニンのレベルを低下させた。
本明細書中に挙げられている全ての刊行物、特許および特許出願を、各個の刊行物、特許または特許出願が参照により本明細書に組み入れられると具体的かつ個別に示されている場合と同様に、それらの全体を参照により本明細書に組み入れることとする。矛盾する場合には、本明細書における定義を含む本出願が優先する。
当業者は、本明細書に記載されている本発明の特定の実施形態に対する多数の均等物を認識し、または通常の実験のみを行ってそれらを確認しうるであろう。そのような均等物も以下の特許請求の範囲に含まれると意図される。
本発明は以下の態様も提供する。
[1] チロシナーゼmRNA配列に対する配列相補性を有する少なくとも19ヌクレオチド(nt)長のアンチセンス鎖と、アンチセンス鎖に対する配列相補性を有する15~17nt長のセンス鎖とを含むRNA複合体であって、アンチセンス鎖およびセンス鎖が複合体を形成しており、アンチセンス鎖の5'末端とセンス鎖の3'末端が平滑末端を形成している、RNA複合体。
[2] アンチセンス鎖が19~21nt長である、上記[1]記載のRNA複合体。
[3] アンチセンス鎖が19nt長である、上記[1]記載のRNA複合体。
[4] アンチセンス鎖が20nt長である、上記[1]記載のRNA複合体。
[5] アンチセンス鎖が21nt長である、上記[1]記載のRNA複合体。
[6] アンチセンス鎖が少なくとも24nt長である、上記[1]記載のRNA複合体。
[7] アンチセンス鎖が24~121nt長である、上記[6]記載のRNA複合体。
[8] アンチセンス鎖が31nt長である、上記[1]記載のRNA複合体。
[9] センス鎖が15nt長である、上記[1]~[8]のいずれか記載のRNA複合体。
[10] センス鎖が16nt長である、上記[1]~[8]のいずれか記載のRNA複合体。
[11] センス鎖が17nt長である、上記[1]~[8]のいずれか記載のRNA複合体。
[12] アンチセンス鎖が、表1、表2、表4および表5に列挙されているアンチセンス鎖配列から選択される配列を有する、上記[1]および[9]~[11]のいずれか記載のRNA複合体。
[13] センス鎖が、表1、表2、表4、表5および表6に列挙されているセンス鎖配列から選択される配列を有する、上記[1]~[8]および上記[12]のいずれか記載のRNA複合体。
[14] センス鎖が配列番号7の配列を有し、アンチセンス鎖が配列番号8の配列を有する、上記[1]記載のRNA複合体。
[15] センス鎖が配列番号17の配列を有し、アンチセンス鎖が配列番号18の配列を有する、上記[1]記載のRNA複合体。
[16] センス鎖が配列番号19の配列を有し、アンチセンス鎖が配列番号20の配列を有する、上記[1]記載のRNA複合体。
[17] センス鎖が配列番号33の配列を有し、アンチセンス鎖が配列番号34の配列を有する、上記[1]記載のRNA複合体。
[18] センス鎖が配列番号87の配列を有し、アンチセンス鎖が配列番号88の配列を有する、上記[1]記載のRNA複合体。
[19] センス鎖が配列番号89の配列を有し、アンチセンス鎖が配列番号90の配列を有する、上記[1]記載のRNA複合体。
[20] センス鎖が配列番号125の配列を有し、アンチセンス鎖が配列番号126の配列を有する、上記[1]記載のRNA複合体。
[21] RNA複合体が細胞によるチロシナーゼ発現を抑制できる、上記[1]~[20]のいずれか記載のRNA複合体。
[22] 細胞がA375細胞、MNT-1細胞またはメラノサイトである、上記[21]記載のRNA複合体。
[23] 細胞がメラノサイトである、上記[22]記載のRNA複合体。
[24] RNA複合体が細胞によるメラニン産生を抑制できる、上記[1]~[23]のいずれか記載のRNA複合体。
[25] 細胞がMNT-1細胞またはメラノサイトである、上記[24]記載のRNA複合体。
[26] RNA複合体が化学修飾を含む、上記[1]~[25]のいずれか記載のRNA複合体。
[27] RNA修飾が2'-O-メチル化ヌクレオシド、ホスホロチオアート結合またはコレステロール部分である、上記[26]記載のRNA複合体。
[28] RNA複合体がコレステロール部分を含む、上記[27]記載のRNA複合体。
[29] コレステロール部分がセンス鎖の3'末端に結合している、上記[28]記載のRNA複合体。
[30] RNA複合体が2'-O-メチル化ヌクレオシドを含む、上記[27]~[29]のいずれか記載のRNA複合体。
[31] 2'-O-メチル化ヌクレオシドがセンス鎖の3'末端に位置する、上記[30]記載のRNA複合体。
[32] センス鎖の3'末端領域が複数の2'-O-メチル化ヌクレオシドを含む、上記[30]記載のRNA複合体。
[33] 2'-O-メチル化ヌクレオシドがアンチセンス鎖の3'末端に位置する、上記[30]記載のRNA複合体。
[34] アンチセンス鎖の3'末端領域が複数の2'-O-メチル化ヌクレオシドを含む、上記[30]記載のRNA複合体。
[35] 2'-O-メチル化ヌクレオシドがセンス鎖の3'末端およびアンチセンス鎖の3'末端に位置する、上記[30]記載のRNA複合体。
[36] センス鎖の3'末端領域が複数の2'-O-メチル化ヌクレオシドを含み、アンチセンス鎖の3'末端領域が複数の2'-O-メチル化ヌクレオシドを含む、上記[30]記載のRNA複合体。
[37] RNA複合体がホスホロチオアート結合を含む、上記[27]~[36]のいずれか記載のRNA複合体。
[38] RNA複合体のセンス鎖におけるリボヌクレオチド間の結合の少なくとも25%がホスホロチオアート結合である、上記[37]記載のRNA複合体。
[39] RNA複合体のセンス鎖におけるリボヌクレオチド間の結合の少なくとも50%がホスホロチオアート結合である、上記[37]記載のRNA複合体。
[40] RNA複合体のセンス鎖におけるリボヌクレオチド間の結合の少なくとも75%がホスホロチオアート結合である、上記[37]記載のRNA複合体。
[41] RNA複合体のセンス鎖におけるリボヌクレオチド間の結合の全てがホスホロチオアート結合である、上記[37]記載のRNA複合体。
[42] RNA複合体のアンチセンス鎖におけるリボヌクレオチド間の結合の少なくとも25%がホスホロチオアート結合である、上記[38]~[41]のいずれか記載のRNA複合体。
[43] RNA複合体のセンス鎖におけるリボヌクレオチド間の結合の少なくとも50%がホスホロチオアート結合である、上記[38]~[41]のいずれか記載のRNA複合体。
[44] RNA複合体のセンス鎖におけるリボヌクレオチド間の結合の少なくとも75%がホスホロチオアート結合である、上記[38]~[41]のいずれか記載のRNA複合体。
[45] RNA複合体のセンス鎖におけるリボヌクレオチド間の結合の全てがホスホロチオアート結合である、上記[38]~[41]のいずれか記載のRNA複合体。
[46] RNA複合体が、表2、表4または表5に列挙されている修飾RNA複合体である、上記[26]記載のRNA複合体。
[47] RNA複合体が送達ビヒクルの非存在下で細胞の細胞膜を透過できる、上記[26]~[46]のいずれか記載のRNA複合体。
[48] 細胞がA375細胞、MNT-1細胞またはメラノサイトである、上記[47]記載のRNA複合体。
[49] RNA複合体が細胞毒性ではない、上記[1]~[48]のいずれか記載のRNA複合体。
[50] 上記[1]~[49]のいずれか記載のRNA複合体と細胞を接触させることを含む、細胞によるチロシナーゼ発現の抑制方法。
[51] 細胞がメラノサイトである、上記[50]記載の方法。
[52] 細胞がヒト対象の皮膚に存在する、上記[50]または[51]記載の方法。
[53] 上記[1]~[49]のいずれか記載のRNA複合体と細胞を接触させることを含む、細胞によるメラニン産生の抑制方法。
[54] 細胞がメラノサイトである、上記[53]記載の方法。
[55] 細胞がヒト対象の皮膚に存在する、上記[53]または[54]記載の方法。
[56] 上記[1]~[49]のいずれかのRNA複合体を対象に投与することを含む、対象の皮膚におけるメラニン産生を低下させる方法。
[57] 対象が、過剰なメラニン産生に関連した皮膚色素沈着障害を有する、上記[56]記載の方法。
[58] 皮膚色素沈着障害が黒皮症または加齢斑である、上記[57]記載の方法。
[59] RNA複合体を対象の皮膚に局所投与することを含む、上記[56]~[58]のいずれか記載の方法。
[60] 対象がRNA複合体を自己投与する、上記[56]~[59]のいずれか記載の方法。
[61] 第2の皮膚美白剤を対象に投与することを更に含む、上記[56]~[60]のいずれか記載の方法。
[62] 第2の皮膚美白剤がヒドロキノン、アルブチン、トレチノイン、コウジ酸、アゼライン酸およびトラネキサム酸から選択される、上記[61]記載の方法。
[63] 上記[1]~[49]のいずれか記載のRNA複合体を対象に投与することを含む、対象における過剰なメラニン産生に関連した皮膚色素沈着障害の治療方法。
[64] 皮膚色素沈着障害が黒皮症または加齢斑である、上記[63]記載の方法。
[65] RNA複合体を対象の皮膚に局所投与することを含む、上記[63]~[64]のいずれか記載の方法。
[66] 対象がRNA複合体を自己投与する、上記[63]~[65]のいずれか記載の方法。
[67] 第2の皮膚美白剤を対象に投与することを更に含む、上記[63]~[66]のいずれか記載の方法。
[68] 第2の皮膚美白剤がヒドロキノン、アルブチン、トレチノイン、コウジ酸、アゼライン酸およびトラネキサム酸から選択される、上記[67]記載の方法。
[69] 上記[1]~[49]のいずれか記載のRNA複合体と医薬上許容される担体とを含む医薬組成物。
[70] 該組成物が局所送達用に製剤化されている、上記[69]記載の医薬組成物。
[71] 医薬組成物がクリーム剤またはローション剤である、上記[70]記載の医薬組成物。
[72] 医薬組成物が第2の皮膚美白剤を更に含む、上記[69]~[71]のいずれか記載の医薬組成物。
[73] 第2の皮膚美白剤がヒドロキノン、アルブチン、トレチノイン、コウジ酸、アゼライン酸およびトラネキサム酸から選択される、上記[72]記載の医薬組成物。
[74] 上記[69]~[73]のいずれか記載の医薬組成物を対象に投与することを含む、対象の皮膚におけるメラニン産生を低下させる方法。
[75] 対象が、過剰なメラニン産生に関連した皮膚色素沈着障害を有する、上記[74]記載の方法。
[76] 皮膚色素沈着障害が黒皮症または加齢斑である、上記[75]記載の方法。
[77] 医薬組成物を対象の皮膚に局所投与することを含む、上記[74]~[76]のいずれか記載の方法。
[78] 対象が医薬組成物を自己投与する、上記[74]~[77]のいずれか記載の方法。
[79] 上記[69]~[73]のいずれか記載の医薬組成物を対象に投与することを含む、対象における過剰なメラニン産生に関連した皮膚色素沈着障害の治療方法。
[80] 皮膚色素沈着障害が黒皮症または加齢斑である、上記[79]記載の方法。
[81] 医薬組成物を対象の皮膚に局所投与することを含む、上記[79]~[80]のいずれか記載の方法。
[82] 対象が医薬組成物を自己投与する、上記[79]~[81]のいずれか記載の方法。
Claims (4)
- チロシナーゼmRNA配列に対する配列相補性を有し、かつ、長さが21ヌクレオチド(nt)長のアンチセンス鎖であって、UUCAUCUCCUGUCAGCU*U*C*U*G又はUUCAUCUCCUGUCAGCmU*mU*mC*mU*mGであるアンチセンス鎖と、アンチセンス鎖に対する配列相補性を有し、かつ、長さが16nt長のセンス鎖であって、GCUGACAGGAGAUG*A*A*コレステロールであるセンス鎖とを含むRNA複合体であって、アンチセンス鎖およびセンス鎖が複合体を形成しており、アンチセンス鎖の5'末端とセンス鎖の3'末端が平滑末端を形成しており、ここで*はホスホロチオアート結合を示し、mは2'-O-メチルRNAを示し、かつ、前記RNA複合体は送達ビヒクルの非存在下で細胞の細胞膜を透過することができる、前記RNA複合体。
- アンチセンス鎖がUUCAUCUCCUGUCAGCU*U*C*U*Gである、請求項1に記載のRNA複合体。
- RNA複合体が細胞毒性ではない、請求項2に記載のRNA複合体。
- 請求項3に記載のRNA複合体と細胞を接触させることを含む、in vitroでの細胞によるチロシナーゼ発現の抑制方法であって、細胞がメラノサイトであってよい、方法。
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