EP2276455A2 - Utilisation d'inhibiteurs de kif13a et d'ap-1 pour inhiber la mélanogénèse - Google Patents

Utilisation d'inhibiteurs de kif13a et d'ap-1 pour inhiber la mélanogénèse

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EP2276455A2
EP2276455A2 EP09750022A EP09750022A EP2276455A2 EP 2276455 A2 EP2276455 A2 EP 2276455A2 EP 09750022 A EP09750022 A EP 09750022A EP 09750022 A EP09750022 A EP 09750022A EP 2276455 A2 EP2276455 A2 EP 2276455A2
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EP
European Patent Office
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inhibitor
kinesin
subunit
nucleic acid
composition according
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP09750022A
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German (de)
English (en)
Inventor
Graça RAPOSO
Cédric DELEVOYE
Danièle TENZA
Ilse Hurbain
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Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut Curie
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut Curie
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Publication date
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Priority claimed from FR0852696A external-priority patent/FR2930152A1/fr
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    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.

Definitions

  • the present invention provides compositions for reducing the synthesis of melanin pigments in melanocytes and uses thereof.
  • pigmentation results from the synthesis and distribution of melanin pigments, especially in the skin, hair and fur and the pigment epithelium of the iris.
  • the color of the skin, hair and eyes depend mainly on the types of pigments present and their concentrations. This pigmentation is regulated by many internal or external factors, for example, exposure to ultraviolet.
  • Melanins are macromolecules produced by melanocytes by addition or condensation of monomers formed from tyrosine (eumelanin) or tyrosine and cysteine (pheomelanin).
  • the mechanism of melanin synthesis, or melanogenesis, is particularly complex and involves different enzymes, the main ones being tyrosinase and tyrosine-associated protein (Tyrp-1).
  • these enzymes catalyze, in particular, the conversion of tyrosine to DOPA (dihydroxyphenylalanine) and then to DOPAquinone. From this molecule, two metabolic pathways will allow the synthesis of either eumelanin or pheomelanin.
  • melanosomes are among the first cellular organelles to be described morphologically (Seiji et al., 1963), their protein composition and biogenesis remain relatively unknown.
  • Stage I corresponds to a compartment delimited by a membrane with a variable quantity of intraluminal membranes.
  • Stage II is an ellipsoidal structure with characteristic striations of a protein nature. These striations play an important role in the concentration of melanin, in the elimination of toxic synthetic intermediates and in facilitating the transfer of melanin to keratinocytes (Seiji et al., 1963). Melanin is detected from stage III and in the form of electron-dense deposits along the striations.
  • Stage IV is an electron-dense structure in which internal striations are no longer visible. This stage corresponds to the mature melanosome ready to be transferred to the keratinocytes (Van
  • the "pigmented" mature melanosome (stage III and IV) is obtained by adding key enzymes of melanin synthesis and effectors necessary for its transport to the periphery (Raposo et al., 2001) .
  • the enzymes involved in melanogenesis are therefore synthesized in the Golgi apparatus and transferred to pre-melanosomes.
  • the mechanisms involved in this transfer are still relatively unknown.
  • This type of transfer requires, in particular, the participation of adaptive protein complexes (APs) which are heterotetramers whose role is to recruit the enzymes into the transport vesicles.
  • AP-I to AP-4 There are four of these complexes.
  • the inventors have previously demonstrated that the AP-3 complex is involved in the transfer of tyrosinase to melanosomes.
  • AP-3 deficiency does not abolish pigmentation and does not affect Tyrp-1 trafficking.
  • the AP-I adapter complex was able to interact with amino acid sequences of the tyrosinase and Tyrp-1 cytosolic domains without elucidating the exact function of this complex in melanogenesis (Theos and al., 2005).
  • Kif13A a kinesin, named Kif13A, is able to interact with an AP-I subunit. This interaction was observed in cell lines lacking a melanosome. The existence of such interaction in melanocyte lineages as well as its role in melanogenesis are therefore not determined.
  • Malfunction of melanocytes may cause pigmentation abnormalities. Hypopigmentation can be caused by depigmenting diseases, especially albinism and vitiligo. Conversely, local hyperpigmentations may result from certain melanocytic disorders such as idiopathic melasmas or hyperactivity and benign melanocyte proliferation causing, for example, senile pigment spots (actinic lentigo). Hyperpigmentation can also be of accidental origin and caused for example by photosensitization or post-injury healing. These hyperpigmentations can be treated with depigmenting substances administered topically. A depigmenting molecule acts on the melanocytes of the epidermis and interferes with one or more stages of melanogenesis.
  • depigmenting substances include hydroquinone and its derivatives, ascorbic acid and its derivatives, placental extracts, kojic acid, arbutin, iminophenols (WO 99/22707), the combination of carnitine and quinone (DE 19806947), amide derivatives of amino phenol (FR 2 772 607), and benzothiazole derivatives (WO 99/24035).
  • WO 99/25819 discloses oligonucleotides used to increase pigmentation by regulating the expression of tenascin to treat vitiligo and other depigmenting diseases and FR 2 804 960 discloses antisense oligonucleotides for regulating the expression of expression of tyrosinase or Tyrp-1 to treat hyperpigmentations.
  • the object of the present invention is to provide novel non-toxic, non-irritating, non-allergenic depigmenting agents having specific action on melanogenesis and stable in formulations suitable for topical administration.
  • the present invention relates, first of all, to a pharmaceutical or cosmetic composition
  • a pharmaceutical or cosmetic composition comprising at least one kinesin inhibitor interacting with the AP-I adapter complex, in particular Kif13A, an inhibitor of a subunit of the AP-1 adapter complex.
  • said inhibitor is an inhibitor of kinesin Kif13A.
  • said inhibitor is an inhibitor of a subunit of the AP-I adapter complex.
  • said inhibitor is an inhibitor of the interaction between a subunit of the AP-I adapter complex or the AP-I complex and a kinesin interacting with it, in particular kinesin Kif13A.
  • said inhibitor is a small molecule, an aptamer, an antibody, a nucleic acid or a dominant negative peptide.
  • said inhibitor is an aptamer, an antibody, a nucleic acid or a dominant negative peptide.
  • the present invention relates to a pharmaceutical or cosmetic composition
  • a pharmaceutical or cosmetic composition comprising at least one nucleic acid comprising or consisting of a sequence capable of specifically hybridizing with a gene or mRNA encoding a subunit of the AP-I adapter complex. or for a kinesin interacting with the AP-I adapter complex, in particular Kif13A, and decreasing or suppressing the expression of this protein.
  • said at least one nucleic acid comprises or consists of a sequence capable of hybridizing specifically with a gene or mRNA encoding a kinesin interacting with the AP-I adapter complex, in particular Kif13A. , and decrease or suppress the expression of this protein.
  • said at least one nucleic acid comprises or consists of a sequence capable of hybridizing specifically with a gene or mRNA coding for a subunit of the AP-I adapter complex and of decreasing or to suppress the expression of this protein.
  • said nucleic acid is an antisense oligonucleotide or RNAi, preferably siRNA.
  • Said nucleic acid may have a sequence of 15 to 50 nucleotides, preferably 15 to 30 nucleotides.
  • said nucleic acid comprises a sequence selected from SEQ ID Nos. 1 to 6 and 11 to 24.
  • the composition may further comprise one or more other active substances, preferably selected from the group consisting of ellagic acid; arbutin; resorcinol; vitamin C; pantothenate; kojic acid; placental extracts; molecules interfering directly or indirectly with melanotropin (MSH), its receptor or adrenocorticotropic hormone (ACTH); polyols such as glycerin, glycol or propylene glycol; vitamins ; keratolytic and / or desquamating agents such as salicylic acid; alpha-hydroxy acids such as lactic acid or malic acid; ascorbic acid; retinoic acid; retinaldehyde; retinol; palmitate, propionate or acetate; anti-glycation agents and / or antioxidants such as tocopherol, thiotaurine, hypotaurine, aminoguanidine, thiamine pyrophosphate, pyridoxamine, lysine, histidine, arginine,
  • the present invention relates to the use of a pharmaceutical or cosmetic composition according to the present invention for the preparation of a medicament for the treatment or prevention of a pigment disorder.
  • the pigmentary disorder is hyperpigmentation.
  • the present invention relates to the use of a pharmaceutical or cosmetic composition according to the present invention as a cosmetic agent.
  • the cosmetic agent is a depigmenting agent.
  • Figure IA shows the results obtained by Western-blot experiments on melanocyte cell lysates transfected with siRNA-control, si-AP-1 RNA
  • siRNA-AP-3 siRNA-Kif13A
  • siRNA-Kif13A siRNA-AP-3 ( ⁇ 3A) or siRNA-Kif13A.
  • the primary antibody used is an anti-Kif13A.
  • Figure 1B presents the results of the immunoprecipitations with an anti-
  • Figure 1C presents the results obtained by Western-blot experiments on melanocyte protein extracts transfected with an siRNA-control or a siRNA.
  • FIG. 2 shows a diagram showing the percentage of melanin in melanocytes transfected with siRNA-control or siRNA-Kif13A.
  • the amount of melanin in melanocytes transfected with siRNA-control is considered to be 100%.
  • the amount of melanin was determined by measuring the optical density of the cell lysate at a wavelength of 492 nm.
  • Figure 3 shows electron micrographs of melanocyte sections transfected with siRNA-control or siRNA-Kif13A.
  • Figure 4 shows the results obtained by Western-blot experiments on melanocyte protein extracts transfected with siRNA-control or siRNA- ⁇ lA.
  • the expression of the ⁇ 1 and ⁇ -adaptin subunits of the AP-I complex is here quantitatively evaluated using the level of expression of ⁇ -tubulin as a reference.
  • FIGS. 5A and 5B show diagrams showing the percentages of white cells, that is to say melanocytes not containing pigmented mature melanosome, among the melanocytes transfected with siRNA-control, siRNA- ⁇ lA or siRNA.
  • ⁇ -adaptin FIG. 5A
  • siRNA- ⁇ -adaptin FIG. 5B
  • Figure 6 shows a diagram showing the percentage of melanin in melanocytes transfected with siRNA-control, siRNA- ⁇ lA or the combination of siRNA- ⁇ -adaptin and siRNA- ⁇ lA.
  • the amount of melanin in melanocytes transfected with siRNA-control is considered to be 100%.
  • the amount of melanin was determined by measuring the optical density of the cell lysate at a wavelength of 492 nm.
  • Figure 7 shows electron micrographs of melanocyte sections transfected with siRNA-control and siRNA- ⁇ lA. The Roman numerals in the photos correspond to the maturation stages of the melanosomes present in the cell.
  • melanin pigment synthesis can be decreased by means of a subunit inhibitor of the AP-I adapter complex or an inhibitor of an kinesin interacting with AP-I, in particular by means of a nucleic acid blocking the expression of a subunit of the AP-I adapter complex or a kinesin interacting with AP-I in the melanocytes.
  • a nucleic acid blocking the expression of a subunit of the AP-I adapter complex or a kinesin interacting with AP-I in the melanocytes.
  • the present invention relates, first of all, to a pharmaceutical or cosmetic composition
  • a pharmaceutical or cosmetic composition comprising at least one kinesin inhibitor interacting with the AP-I adapter complex, in particular Kif13A, a subunit inhibitor of AP-I adapter complex, or an inhibitor of the interaction between a subunit of the AP-I adapter complex or the AP-I complex and a kinesin interfering therewith.
  • API refers to the AP-I adapter complex that is involved in the trans-Golgi network. It should not be confused with the transcription factor of the same name which consists of proteins encoded by genes members of jun and fos families.
  • the AP-I adapter complex is composed of 4 subunits: ⁇ , ⁇ 1, ⁇ 1 and ⁇ 1, and activation of any one of these subunits is sufficient to destabilize the complex and render it inoperative (Braun, 2007).
  • said inhibitor is an inhibitor of a kinesin interacting with AP-I, in particular kinesin Kif13A.
  • the present invention relates to any type of inhibitor of a kinesin interacting with AP-I, in particular Kif 13 A.
  • the inhibitor may be any molecule capable of decreasing the activity or the expression of kinesin.
  • the inhibitor may be, but is not limited to, a small molecule, aptamer, antibody, nucleic acid or dominant negative peptide.
  • small molecule refers to a molecule of less than 1,000 daltons, including organic or inorganic compounds.
  • the small molecule inhibitors of kinesin include, but are not limited to, acepromazine, chlorfenethazine, chlorpromazine, N-methyl chlorpromazine, cyamemazine, fluphenazine, mepazine, methotrimeprazine, methoxypromazine, nor chlorpromazine, perazine , perphenazine, phenothiazine, prochlorperazine, promethazine, propiomazine, putaperazine, thiethylperazine, thiopropazate, thioridazine, trifluoperazine, triflupromazine and the inhibitory molecules described in patent applications and patents WO 01/98278 , WO 02/057244, WO 02/079169, WO 02/057244, WO 02/056880, WO 03/050
  • the inhibitor is an aptamer, an antibody, a nucleic acid or a dominant negative peptide.
  • the term "dominant negative peptide" refers to a peptide comprising at least a portion of a kinesin interacting with AP-I and capable of suppressing or decreasing its activity.
  • the dominant negative peptide consists only of the part of the kinesin interacting with AP-I, that is to say the part corresponding to the tail of kinesin. This peptide is therefore capable of interacting with the AP-I complex but, in the absence of the corresponding to the head of kinesin, is unable to move along the microtubules and thus to fulfill its function.
  • Kif13A Several dominant peptides negative for kinesin Kif13A have already been described. In particular, a dominant negative peptide of Kif13A was obtained by expressing only the portion of the Kif13A protein corresponding to the tail of kinesin (Nakagawa et al., 2000).
  • the kinesin inhibitor is a nucleic acid comprising or consisting of a sequence capable of specifically hybridizing with a gene or mRNA encoding kinesin interacting with AP-I, in particular Kifl3A, and decrease or suppress the expression of this protein.
  • nucleic acids are more fully detailed below.
  • said inhibitor is an inhibitor of a subunit of the AP-I adapter complex.
  • the present invention relates to any type of inhibitor of one of the subunits of the AP-I adapter complex.
  • inhibitor of one of the AP-I adapter complex subunits is meant any molecule capable of decreasing the activity or expression of one of the AP-I adapter complex subunits.
  • the inhibitor may be, but is not limited to, a small molecule, aptamer, antibody, nucleic acid or dominant negative peptide.
  • the inhibitor is an aptamer, an antibody, a nucleic acid or a dominant negative peptide.
  • the inhibitors of the ⁇ and ⁇ l subunits are preferred.
  • small molecule refers to a molecule of less than 1,000 daltons, including organic or inorganic compounds.
  • the inhibitor may be an antibody specific for one of the AP-I subunits.
  • Several of these antibodies are commercially available, for example antibodies specific for the ⁇ subunit or the ⁇ 1 subunit (Sigma-Aldrich).
  • inhibitor it is also understood in the present application any molecule capable of reducing or preventing the attachment of a subunit of the AP-I adapter complex to the other subunits of the complex, that is to say any molecule capable of diminishing or preventing the formation of the AP-I complex.
  • the inhibitory molecule may be able to bind to one of the AP-I subunits and cause a a conformational change preventing the attachment of said subunit to one or more of the other AP-I subunits and thereby blocking the formation of the AP-I complex. It can also hide areas of interaction between subunits.
  • the AP-I adapter complex inhibitor is a nucleic acid comprising or consisting of a sequence capable of specifically hybridizing with a gene or mRNA encoding a complex subunit. AP-I adapter and decrease or suppress the expression of this protein. Such nucleic acids are more fully detailed below.
  • said inhibitor is an inhibitor of the interaction between a subunit of the AP-I adapter complex or the AP-I complex and a kinesin interacting with it, in particular kinesin Kif13A.
  • the present invention relates to any type of inhibitor of the interaction between a subunit of the AP-I adapter complex or the AP-I complex and a kinesin interacting therewith.
  • kinesin is Kif 13 A.
  • the subunit of AP-I is the ⁇ 1 subunit.
  • the kinesin Kif 13A tail interacts with the ⁇ 1 subunit of the AP-I complex (Nakagawa et al., 2000).
  • the inhibitor may be any molecule capable of diminishing or suppressing the interaction between kinesin and the AP-I complex.
  • the inhibitor may be, but is not limited to, a small molecule, aptamer or antibody.
  • the inhibitor is an antibody directed against the domain of the ⁇ 1 subunit interacting with Kif13A or against the tail domain of kinesin Kif13A interacting with the ⁇ 1 subunit. The antibody binds to one or the other molecule and thus blocks the interaction between Kif13A and the AP-I complex.
  • the inhibitor could also be a lure reproducing the domain of the ⁇ 1 subunit interacting with Kif13A or the tail domain of Kifl3A interacting with the ⁇ 1 subunit, this lure competing with Kifl3A or AP. -I for the interaction between these two elements.
  • antibody as used in the present invention includes monoclonal antibodies, chimeric antibodies, humanized antibodies, recombinant antibodies and fragments of said antibodies.
  • antibody fragment is meant, for example, the F (ab) 2, Fab, Fab 'or sFv fragments.
  • the antibody may be IgG, IgM, IgA, IgD or IgE, preferably IgG or IgM.
  • Antibody production methods are well known to those skilled in the art.
  • aptamer refers to a nucleic acid molecule or a peptide capable of specifically binding to a subunit of the AP-I complex or to a kinesin interacting with AP-I, in particular Kif13A.
  • the aptamers are nucleic acids, preferably RNAs, generally comprising between 5 and 120 nucleotides (Osborne et al., 1997). They can be selected in vitro according to a process known as SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment).
  • SELEX Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment
  • Polynucleotide oligonucleotide
  • nucleotide sequence refers to a sequence of deoxyribonucleotides and / or ribonucleotides.
  • RNAi refers to any single or double stranded RNA that interferes with a specific messenger RNA thereby leading to its degradation and decrease in its translation into protein.
  • This term encompasses small interfering RNAs (siRNAs), double-stranded RNAs (dsRNAs), single-stranded RNAs (ssRNAs), short hairpin RNAs (ssRNAs), DNA-directed RNAi (ddARNi) and microRNAs (miRNAs).
  • hybridizing herein means that Watson-Crick hydrogen bonds can be established between the complementary bases of two nucleic acid strands to form a duplex.
  • the term "specifically hybridizable” means herein that the nucleic acid used according to the invention is capable of hybridizing to a gene or transcript encoding an AP-I subunit or a kinesin interacting with AP-I under high stringency hybridization conditions.
  • Conditions of high stringency are widely described in the literature, for example in Sambrook et al., (1989), Maniatis et al., (1982 or one of his recent reissues) and in Ausubel et al, (1995), and these conditions can be adapted by those skilled in the art depending on the size of the nucleotide fragments, according to the appropriate teachings known.
  • conditions of high stringency are advantageously as follows.
  • Hybridization between the two strands is carried out in two stages: (a) prehybridization at 42 ° C. for 3 hours in phosphate buffer (20 mM, pH 7.5) containing 5 x SSC (1 x SSC corresponds to a solution 0.15 M NaCl / 0.015 M sodium citrate), 50% formamide, 7% sodium dodecyl sulfate (SDS), 1O x Denhardt's solution, 5% dextran sulfate and 1% salmon sperm DNA; (b) hybridization proper for 20 hours at a temperature dependent on the size of the probe (for example, 42 ° C for a probe of size greater than 100 nucleotides) followed by two 20-minute washes at 20 ° C.
  • the term "gene coding for a subunit of AP-I or for a kinesin interacting with AP-I” is used to designate the genomic sequence coding for one of the ⁇ subunits, ⁇ 1, ⁇ 1 and ⁇ l of AP-I or for a kinesin interacting with AP-I, in particular Kif13A. This term encompasses the 5 'non-coding region, the region containing the initiation codon, the coding region and the 3' non-coding region of the gene.
  • the term "gene encoding a subunit of AP-I” is used to designate the genomic sequence encoding one of the subunits ⁇ , ⁇ 1, ⁇ 1 and ⁇ 1 of AP-I. This term encompasses the 5 'non-coding region, the region containing the initiation codon, the coding region and the 3' non-coding region of the gene.
  • the term "gene encoding a kinesin interacting with AP-I” is used to designate the genomic sequence encoding a kinesin interacting with AP-I, in particular Kif13A. This term encompasses the 5 'non-coding region, the region containing the initiation codon, the coding region and the 3' non-coding region of the gene.
  • mRNA coding for a subunit of AP-I or for a kinesin interacting with AP-I is used to designate the ribonucleotide sequence resulting from the transcription of the gene coding for the corresponding protein. . This term includes the 3 'and 5' untranslated regions (3'-UTR and 5'-UTR), the exons and possibly the unspliced introns.
  • mRNA encoding an AP-1 subunit is used to designate the ribonucleotide sequence derived from the transcription of the gene encoding the corresponding protein.
  • mRNA encoding a kinesin interacting with AP-I is used to designate the ribonucleotide sequence derived from the transcription of the gene coding for the corresponding protein. More particularly, the term “mRNA encoding kinesin Kif13A” is used to designate the ribonucleotide sequence derived from the transcription of the gene encoding kinesin Kif13A.
  • Genomic sequences and proteins can be identified by their number in the GenelD database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/index.html).
  • GenelD input numbers for the subunits ⁇ , ⁇ 1, ⁇ 1 and ⁇ 1 of AP-I are respectively GenelD 164, GenelD 162, GenelD 1174, GeneID8907 and the GenelD entry number for kinesin Kifl3A of the being Human is GeneID63971.
  • the terms “melanin”, “melanin” and “melanin pigments” are used interchangeably here. They encompass the different pigments that can be synthesized in melanosomes, including eumelanin or pheomelanin.
  • composition refers in this document to a composition according to the invention comprising a pharmaceutically acceptable carrier and / or excipient.
  • composition refers in this document to a composition according to the invention comprising a cosmetically acceptable carrier and / or excipient.
  • pigmenting agent refers in this specification to an active agent capable of inhibiting or decreasing melanin synthesis in melanocytes and thereby bleaching the skin.
  • the inhibitors used according to the invention are capable, when introduced into a melanocyte, of inducing a decrease or a suppression of the expression or the activity of one or more subunits of AP-1 or of kinesin interacting with AP-I, in particular Kif13A, or of inducing a decrease or suppression of the interaction of a subunit of the AP-I adapter complex or the AP-I complex with a kinesin interacting with that in particular kinesin Kif13A, resulting in a significant decrease in the synthesis of melanin pigments.
  • the nucleic acids used according to the invention are capable, when introduced into a melanocyte, of inducing a decrease or a suppression of the expression of one or more AP-1 subunits. or a kinesin interacting with AP-I, in particular Kif13A, with a consequent significant decrease in the synthesis of melanin pigments.
  • the nucleic acids used according to the invention are capable, when introduced into a melanocyte, of inducing a decrease or a suppression of the expression of one or more PA subunits. -1, resulting in a significant decrease in the synthesis of melanin pigments.
  • the nucleic acids used according to the invention are capable, when introduced into a melanocyte, of inducing a decrease or a suppression of the expression of a kinesin interacting with AP-I, in particular Kif13A, resulting in a significant decrease in the synthesis of melanin pigments
  • These nucleic acids can act at the transcriptional or translational level.
  • the nucleic acids used according to the invention may be DNA, RNA or chimeric DNA / RNA molecules. They may be in single-stranded or duplex form or a mixture of both. They may optionally comprise at least one modified or non-natural nucleotide such as, for example, a nucleotide comprising a modified base, such as inosine, methyl-5-deoxycytidine, dimethylamino-5-deoxyuridine, deoxyuridine or diamino. -2,6-purine, bromo-5-deoxyuridine or any other modified base for hybridization.
  • a modified base such as inosine, methyl-5-deoxycytidine, dimethylamino-5-deoxyuridine, deoxyuridine or diamino.
  • nucleic acids used according to the invention may also be modified at the level of the internucleotide linkage, for example phosphorothioates, H-phosphonates or alkylphosphonates, or at the level of the backbone such as, for example, alpha-oligonucleotides, the 2 ' -O-alkyl ribose or PNA (Peptid Nucleic Acid) (M. Egholm et al, 1992).
  • PNA Peptid Nucleic Acid
  • these nucleic acids can be prepared by any method known to those skilled in the art such as, for example, chemical synthesis, library screening, in vivo transcription or recombinant DNA or amplification techniques.
  • the nucleic acid may be a phosphorothioates, H-phosphonates or alkylphosphonates, or at the level of the backbone such as, for example, alpha-oligonucleotides, the 2 ' -O-alkyl ribose
  • RNA interference is a phenomenon well known to those skilled in the art which makes it possible to specifically inhibit the expression of the target gene at the post-transcriptional level.
  • RNAi molecules to inhibit gene expression, for example, in WO 99/32619, US 20040053876, US 20040102408 and WO 2004/007718.
  • the RNAi molecule is a siRNA molecule in double-stranded form of about 15 to 50 nucleotides in length, preferably about 15 to 30 nucleotides.
  • the nucleic acid used to decrease or suppress AP-1 subunit or AP-I interacting kinesin expression in particular Kif113A
  • the nucleic acid used to decrease or suppress the expression of an AP-1 subunit is an antisense nucleic acid.
  • the nucleic acid used to decrease or suppress the expression of a kinesin interacting with AP-I, in particular Kif13A is an antisense nucleic acid.
  • This antisense nucleic acid may be complementary to all or part of a sense nucleic acid encoding an AP-1 subunit or a keasin interacting with AP-I.
  • the antisense nucleic acid may be complementary to all or part of a sense nucleic acid encoding an AP-1 subunit.
  • the antisense nucleic acid may be complementary to all or part of a sense nucleic acid encoding a kinesin interacting with AP-I. It may, for example, be complementary to an mRNA.
  • the antisense nucleic acid generally comprises a nucleotide sequence complementary to at least a portion of the transcript of an AP-1 subunit or an AP-I interacting kinesin, and selectively hybridizes to these nucleic acid sequences. transcribed by conventional Watson-Crick interactions.
  • the antisense nucleic acid generally comprises a nucleotide sequence complementary to at least a portion of the transcript of an AP-1 subunit. In another particular manner, the antisense nucleic acid generally comprises a nucleotide sequence complementary to at least a portion of the transcript of a kinesin interacting with AP-I.
  • the antisense-inhibiting nucleic acid (s) can therefore bind to the transcripts of a gene coding for the ⁇ , ⁇ 1, ⁇ 1 and ⁇ 1 subunits of AP-I or coding for a kinesin interacting with AP-I and, for example , block access to the translation machinery at the 5 'end of the transcript of interest when the latter is an mRNA, interfere with its translation into protein, and allow the deletion of the expression of the transcript of interest in vivo (Kumar et al, 1993).
  • the antisense-inhibiting nucleic acid (s) can bind to the transcripts of a gene coding for the subunits ⁇ , ⁇ 1, ⁇ 1 and ⁇ 1 of AP-I.
  • the antisense-inhibiting nucleic acid can bind to transcripts of a gene encoding a kinesin interacting with AP-I, in particular Kif113A.
  • AP-I a kinesin interacting with AP-I
  • Kif113A a kinesin interacting with AP-I
  • the antisense nucleic acid is complementary to an mRNA coding for an AP-I subunit or for a kinesin interacting with AP-I. especially Kifl 13A.
  • the antisense nucleic acid is complementary to an mRNA encoding an AP-1 subunit.
  • the antisense nucleic acid is complementary to an mRNA encoding a kinesin interacting with AP-I, in particular Kifl 13A.
  • the inhibitory nucleic acid may cover all or part of the coding sequence of the transcript of interest, or all or part of the 3 'or 5' non-coding sequence.
  • the antisense inhibitory nucleic acid is complementary to the ribosome binding sequence and translation initiation.
  • the inhibitory nucleic acid generally has a length of at least 10 ribonucleotides, for example, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 or 50 ribonucleotides in length, preferably 15 to 30 ribonucleotides in length.
  • An antisense nucleic acid used according to the invention can be synthesized by chemical synthesis methods or by recombinant DNA techniques known to those skilled in the art.
  • the DNA or antisense RNA can in particular be synthesized chemically, produced by in vitro transcription of linear matrices (for example, by PCR) or circular matrices (for example, from viral vectors or not), or produced by transcription in vivo from viral vectors or not.
  • the antisense nucleic acids can be modified to increase their stability, their resistance to nucleases, their specificity or their pharmacological properties.
  • an antisense nucleic acid may have modified nucleotides used to increase the stability of the duplexes formed between sense and antisense nucleic acids.
  • the inhibitory nucleic acid is of the ribozyme type.
  • Ribozymes are catalytic RNA molecules that possess a ribonuclease activity and are thus capable of cleaving single-stranded nucleic acids, such as mRNAs of which they are complementary.
  • Transcription specific ribozymes encoding an AP-I subunit or an AP-I interacting kinesin can be designed, synthesized and produced according to methods well known to those skilled in the art (see, for example, Fanning and Symonds, 2006).
  • the ribozyme generally has two distinct regions.
  • the first region has a certain specificity for the transcript of interest, that of a gene encoding an AP-1 subunit.
  • the first region has a certain specificity for the transcript of interest, that of a gene encoding a kinesin interacting with AP-1, in particular Kif113A.
  • Various types of ribozymes can be used as per examples are hammerhead ribozymes or circular ribozymes, hairpin ribozymes or lasso ribozymes.
  • interfering RNA or antisense nucleic acids used according to the invention can be administered in the form of precursors or DNA molecules coding for them.
  • the nucleic acid used according to the invention is generally from 15 to 50 nucleotides in length, preferably from 15 to 30 nucleotides in length.
  • the nucleic acid is capable of hybridizing specifically to a gene or transcript encoding a subunit of the AP-I complex or for a kinesin interacting with AP-I, in particular Kif113A.
  • the nucleic acid is capable of hybridizing specifically to a gene or transcript encoding a subunit of the AP-I complex.
  • the nucleic acid is capable of hybridizing specifically to a gene or transcript coding for a kinesin interacting with AP-I, in particular Kif113A. It is nevertheless understood that the nucleic acid according to the invention does not need to have a complementarity of 100% with the target sequence to hybridize specifically.
  • a nucleic acid having a degree of complementarity of at least about 90% is able to hybridize specifically.
  • the degree of complementarity between the nucleic acid of the invention and the target sequence is 95, 96, 97, 98, 99 or 100%.
  • the nucleic acid used according to the invention comprises or consists of one or more sequences capable of specifically hybridizing with a gene or mRNA coding for a subunit of the AP-I adapter complex or for kinesin Kifl3A.
  • the nucleic acid comprises or consists of one or more sequences chosen from the sequences SEQ ID No. 1 to 6 and 11 to 24.
  • the nucleic acid used according to the invention comprises or consists of in one or more sequences capable of specifically hybridizing with a gene or mRNA encoding a subunit of the AP-I adapter complex.
  • the nucleic acid comprises or consists of one or more sequences selected from SEQ ID No.
  • the nucleic acid comprises or consists of one or more sequences capable of to hybridize specifically with a gene or mRNA coding for the AP-I ⁇ - ⁇ -adaptin subunit.
  • the nucleic acid used according to the invention comprises or consists of one or more sequences capable of hybridizing specifically with a gene or mRNA encoding kinesin Kif13A.
  • the nucleic acid comprises or consists of one or more sequences chosen from the sequences SEQ ID No. 1 to 4.
  • the nucleic acid used according to the invention comprises or consists of a double-stranded interfering RNA molecule formed by one of the following pairs: SEQ ID Nos. 1 and 2, SEQ ID Nos. 3 and 4, SEQ ID Nos. 5 and 6, SEQ ID Nos. 11 and 12, SEQ ID Nos. 13 and 14, SEQ ID Nos. 15 and 16, SEQ ID Nos. 17 and 18, SEQ ID Nos. 19 and 20, SEQ ID Nos. 21 and 22 and SEQ ID Nos. 23 and 24.
  • the nucleic acid used according to the invention comprises or consists of a double-stranded interfering RNA molecule formed by one of the following pairs: SEQ ID Nos.
  • the nucleic acid used according to the invention comprises or consists of a double-stranded interfering RNA molecule formed by one of the following pairs: SEQ ID Nos. 5 and 6, SEQ ID Nos. 11 and 12, SEQ ID Nos. 13 and 14, SEQ ID Nos. 15 and 16, SEQ ID Nos. 17 and 18, SEQ ID Nos. 19 and 20, SEQ ID Nos. 21 and 22 and SEQ ID Nos. 23 and 24.
  • the present invention relates to a pharmaceutical or cosmetic composition
  • a pharmaceutical or cosmetic composition comprising at least one inhibitor of a subunit of the AP-I adapter complex, an inhibitor of a kinesin interacting with the AP-I adapter complex, in particular Kifl 13A, or an inhibitor the interaction between a subunit of the AP-I adapter complex or the AP-I complex and a kinesin interacting therewith, in particular any inhibitor as defined in the present application.
  • the present invention relates to a pharmaceutical or cosmetic composition
  • a pharmaceutical or cosmetic composition comprising at least one nucleic acid comprising or consisting of a sequence capable of specifically hybridizing with a gene or mRNA coding for a subunit of the AP-I adapter complex. or for a kinesin interacting with the AP-I adapter complex, in particular Kif113A, and decreasing or suppressing the expression of this protein, as described in the present application.
  • the pharmaceutical or cosmetic composition comprises at least one nucleic acid comprising or consisting of a sequence capable of hybridizing specifically with a gene or an mRNA encoding a subunit of the AP-I adapter complex and of reduce or eliminate the expression of this protein, as described in the present application.
  • the pharmaceutical or cosmetic composition comprises at least one nucleic acid comprising or consisting of a sequence capable of hybridizing specifically with a gene or mRNA encoding a kinesin interacting with the AP adapter complex
  • kinesin is kinesin Kif13A.
  • the composition is a pharmaceutical or cosmetic composition whose formulation is suitable for topical administration.
  • the inhibitor used in the composition is present in an effective amount.
  • an effective amount is an amount to achieve a decrease or suppression of the expression or activity of a subunit of the AP-I adapter complex or a interacting kinesin with the AP-I adapter complex, in particular Kif13A, or a decrease or suppression of the interaction between a subunit of the AP-I adapter complex or the AP-I complex and a kinesin interacting therewith.
  • the nucleic acid used in the composition is present in an effective amount, for example, ranging from 0.00001% to 10% and preferably from 0.0003% to 3%. % (w / w) of the total weight of the composition.
  • the term "effective amount” as used in the present application is an amount of inhibitor used according to the invention to achieve a significant decrease in melanin synthesis.
  • the term "effective amount” as used in the present application is an amount of nucleic acid used according to the invention to obtain a significant decrease in melanin synthesis. This decrease may, in particular, result in a visible change in the color of the skin.
  • composition according to the invention may comprise several inhibitors whose type and target may be identical or different. It may comprise inhibitors of either a subunit of the AP-I adapter complex, or of a kinesin interacting with the AP-I adapter complex, in particular Kif133A, or of the interaction between a subunit of the complex AP-I adapter or the AP-I complex and a kinesin interacting therewith.
  • this composition may comprise inhibitors of a similar nature (for example only nucleic acids) or different (for example aptamers, antibodies and / or nucleic acids).
  • this composition may comprise several nucleic acids comprising a sequence capable of hybridizing specifically with a gene or an mRNA coding for a subunit of the AP-I adapter complex or for a kinesin interacting with the AP-I adapter complex, in particular KifI 13A, and decreasing or suppressing the expression of this protein, as described in the present application.
  • the composition may comprise a plurality of nucleic acids comprising a sequence capable of specifically hybridizing with a gene or mRNA encoding a subunit of the AP-I adapter complex and of decreasing or eliminating the expression protein, as described in the present application. It may also comprise a combination of several inhibitory nucleic acids targeting either the same AP-1 subunit or different AP-1 subunits.
  • the composition may comprise a plurality of nucleic acids comprising a sequence capable of hybridizing specifically with a gene or mRNA encoding a kinesin interacting with the AP-I adapter complex, in particular KifI 13A, and of reduce or eliminate the expression of this protein, as described in the present application. It may also comprise a combination of several nucleic acid inhibitors targeting either the same kinesin interacting with AP-I, or different kinesins interacting with AP-I.
  • composition according to the invention may also comprise one or more additional active substances intended to enhance the desired effects, for example ellagic acid; arbutin; resorcinol; vitamin C; pantothenate; kojic acid; placental extracts; molecules interfering directly or indirectly with melanotropin (MSH), its receptor or adrenocorticotropic hormone (ACTH); polyols such as glycerin, glycol or propylene glycol; vitamins ; keratolytic and / or desquamating agents such as salicylic acid; alpha-hydroxy acids such as lactic acid or malic acid; ascorbic acid; retinoic acid; retinaldehyde; retinol; palmitate, propionate or acetate; anti-glycation agents and / or antioxidants such as tocopherol, thiotaurine, hypotaurine, aminoguanidine, thiamine pyrophosphate, pyridoxamine, lysine, histidine, arginine
  • composition according to the invention may be in any galenical form normally used for topical application, especially in the form of an aqueous, aqueous-alcoholic or oily solution, an oil-in-water or water-in-oil or multiple emulsion, a gel aqueous or oily, a liquid anhydrous product, pasty or solid, an oil dispersion in a polymeric phase such as nanospheres and nanocapsules or better lipid vesicles of ionic and / or nonionic type as described in French patent FR 2534487.
  • composition according to the invention may comprise at least one inhibitor, preferably an inhibitory nucleic acid, described in the present application, encapsulated in a liposome.
  • liposome is intended to denote, according to the present invention, small artificially manufactured vesicles consisting of lamellae of phospholipids separated from each other by aqueous compartments. They have a structure very close to that of cell membranes, which allows them to merge with them by releasing the active ingredient (s) they contain.
  • the liposomes that may be used according to the invention may be multilamellar liposomes or MLVs (MultiLamellar Vesicle), small unilamellar liposomes or SUVs (Small Unilamellar Vesicle), or large unilamellar liposomes or LUVs (Large Unilamellar Vesicle).
  • the liposome may also be a nonionic liposome whose wall is no longer composed of phospholipids but nonionic lipids.
  • the composition according to the invention may be more or less fluid and have the appearance of a white or colored cream, an ointment, a milk, a lotion, a serum, a paste or of a foam. It can optionally be applied to the skin in the form of an aerosol. It may also be in pulverulent solid form or not, for example in stick form. It can still be in the form of patches, pencils, brushes and applicators allowing a localized application on the spots of the face or hands. It can be used as a care product and / or as a makeup product.
  • the composition according to the invention may also contain the usual adjuvants in the cosmetic and dermatological fields, such as hydrophilic or lipophilic gelling agents, hydrophilic or lipophilic active agents, preservatives, antioxidants, solvents, perfumes, fillers, filters, pigments, odor absorbers and dyestuffs.
  • the amounts of these various adjuvants are those conventionally used in the fields under consideration.
  • These adjuvants may be introduced into the fatty phase, into the aqueous phase, into the lipid vesicles and / or into the nanoparticles.
  • the proportion of the fatty phase can range from 5 to 80% by weight, and preferably from 5 to 50% by weight relative to the total weight of the composition.
  • the oils, emulsifiers and co-emulsifiers used in the composition in emulsion form are chosen from those conventionally used in the field under consideration.
  • the emulsifier and the co-emulsifier are present in the composition in a proportion ranging from 0.3% to 30% by weight, and preferably from 0.5% to 20% by weight relative to the total weight of the composition. composition.
  • oils which can be used in combination with the inhibitors according to the invention, in particular with the nucleic acids according to the invention mention may be made of mineral oils such as liquid petrolatum; vegetable oils such as avocado oil or soybean oil; oils of animal origin such as lanolin; synthetic oils such as perhydrosqualene; silicone oils such as cyclomethicone and fluorinated oils such as perfluoropolyethers. It is also possible to use fatty alcohols such as cetyl alcohol, fatty acids or waxes such as carnauba wax or ozokerite as fat.
  • emulsifiers and coemulsifiers examples include, for example, fatty acid and polyethylene glycol esters such as PEG-20 stearate and fatty acid and glycerol esters such as than glyceryl stearate.
  • hydrophilic gelling agents that can be used in combination with the inhibitors, in particular the nucleic acids, according to the invention, it is possible to use, for example, carboxyvinyl polymers (carbomer), acrylic copolymers such as copolymers of acrylates / alkylacrylates, polyacrylamides , polysaccharides, natural gums and clays.
  • carboxyvinyl polymers carboxyvinyl polymers (carbomer)
  • acrylic copolymers such as copolymers of acrylates / alkylacrylates, polyacrylamides , polysaccharides, natural gums and clays.
  • lipophilic gelling agents it is possible to use, for example, modified clays such as bentones, metal salts of fatty acids, hydrophobic silica or polyethylenes.
  • the present invention also relates to the use of a composition according to the invention as a cosmetic agent.
  • the cosmetic agent is a depigmenting agent.
  • the present invention relates to a pharmaceutical or cosmetic composition
  • a pharmaceutical or cosmetic composition comprising at least one inhibitor of a subunit of the AP-I adapter complex, a inhibitor of a kinesin interacting with the AP-I adapter complex, in particular
  • the inhibitor may be, but is not limited to, a small molecule, an aptamer, an antibody, a nucleic acid or a dominant negative peptide.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising at least one nucleic acid comprising a sequence capable of hybridizing specifically with a gene or an mRNA coding for a subunit of the AP-I adapter complex or for a interacting kinesin. with the AP-I adapter complex, in particular Kif13A, and to decrease or suppress the expression of this protein, for the treatment of pigment disorders.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition comprising at least one nucleic acid comprising a sequence capable of specifically hybridizing with a gene or mRNA encoding a subunit of the AP-I adapter complex and reducing or eliminating the expression of this protein, for the treatment of pigment disorders.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising at least one nucleic acid comprising a sequence capable of hybridizing specifically with a gene or mRNA encoding a kinesin interacting with the AP-I adapter complex, in particular Kifl 13 A, and decrease or suppress the expression of this protein, for the treatment of pigment disorders.
  • the present invention also relates to the use of a pharmaceutical composition according to the invention, for the preparation of a medicament for the treatment or prevention of a pigment disorder.
  • the present invention also relates to a cosmetic or pharmaceutical method for depigmenting and / or bleaching human skin or treating or preventing a pigmentary disorder consisting in applying to the skin depigmenting a cosmetic or pharmaceutical composition according to the invention .
  • the pigmentary disorders to be treated may be hyperpigmentations or hypopigmentations. In the case of local hyperpigmentations, these can result from certain melanocytic disorders and are characterized by an accumulation of melanin.
  • the pigmentary disorder to be treated may be hyperpigmentation such as, for example, idiopathic melasma (not associated with pregnancy or taking oral contraceptives), melasma (also called chloasma or pregnancy mask), actinic lentigo (also called senile lentigo, senile stain, age task or solar lentigo), acne pigmentary sequelae, post-inflammatory pigmentations due to abrasion, burn, scarring, dermatitis and / or contact allergy, pigmentations due to the dermatitis of the meadows, pigmentations due to poison ivy (also called Poison Ivy plant), ephelids (also called freckles), nevi such as congenital giant nevi, Becker's
  • Hyperpigmentations may be hyperpigmentations with genetic determinism or hyperpigmentations of metabolic or medicinal origin. They may be of accidental origin and caused for example by photosensitization or post-injury healing.
  • the pigment disorder can also result in hypopigmentation, such as vitiligo.
  • the pigment disorder to be treated is hyperpigmentation.
  • the hyperpigmentation is a melasma, an idiopathic melasma or an actinic lentigo.
  • the treatment aims to depigment the hyperpigmented areas and thus reduce or eliminate the visible symptoms associated with these specific pigment disorders.
  • the purpose of the treatment may be to standardize the color of the skin by depigmenting the residual pigmented areas.
  • the aim of prevention is to prevent the appearance of hyperpigmented areas and, in the case of hypopigmentation, to avoid the appearance of skin color disparities.
  • the human melanocyte line MNT-I is maintained in culture as previously described (Raposo et al., 2001).
  • a polyclonal antibody anti rabbit ⁇ -tubulin (ab6046, Abcam ®);
  • Reagents other than the antibodies used in this example are listed below:
  • PFA Paraformaldehyde
  • BSA bovine serum albumin
  • siRNA Kifl3A sense GGCGGGUAGCGAAAGAGUA dTdT
  • siRNA AP-I ⁇ L A sense GGCAUCAAGUAUCGGAAGA dTdT
  • siRNA AP-3 ( ⁇ 3A) sense GGCUGAUCUUGAAGGUUUA dTdT
  • Ixio 6 cells were seeded in a culture dish of 10 cm for two days, then washed twice with PBS preheated before being placed in culture in 4 ml of OptiMEM medium (Invitrogen ®) in an oven for 40 min.
  • OptiMEM medium Invitrogen ®
  • a solution was obtained by mixing 10 ⁇ l of 20 ⁇ M siRNA with 840 ⁇ l of OptiMem medium and incubating this mixture for 20 min at room temperature.
  • a solution B was obtained by mixing 50 L of Oligofectamine TM (Invitrogen ®) with 150 .mu.l of OptiMEM medium and incubating this mixture for 20 min at room temperature.
  • Solutions A and B were then mixed and left for 20 min at room temperature.
  • the cells were washed twice with PBS, and then incubated with 200 ⁇ l of lysis buffer (50 Mm Tris, 150 mM NaCl, 10 Mm EDTA, 1% Triton, 1% protease inhibitor, pH 8) per well on ice for 15 min. The cells were then scraped, centrifuged (15,000 rpm, 4 ° C) and the supernatants were collected. The amount of total protein was measured by the "BCA Protein Assay" kit (Pierce ® ). 10 ⁇ g of each supernatant was deposited on a gel and the migration took place for 35 min at 200 V.
  • lysis buffer 50 Mm Tris, 150 mM NaCl, 10 Mm EDTA, 1% Triton, 1% protease inhibitor, pH 8
  • the gel was then transferred to a PVDF membrane (Millipore ® ) for 1 hour at 30 V. Then, the membrane was saturated with PBS / 0.1% Tween / 5% BSA for 1 hour at room temperature, incubated for 45 min with the primary antibody diluted in WB buffer (PBS / 0.1% Tween), rinsed 3 times 10 min. with WB buffer, incubated for 45 min with the corresponding secondary antibody coupled to HRP diluted in WB buffer and rinsed 3 times 10 min in WB buffer. HRP activity was then revealed using the ECL kit "western blotting detection reagents" (Amersham ® ). Fluorescence microscopy
  • the cells previously seeded on glass slides were washed twice with preheated PBS and then fixed for 10 minutes in a solution of PBS / 4% PFA. After two washes at room temperature with PBS, excess unreacted PFA was neutralized by treatment with 50 mM Glycine / PBS for 10 minutes. The nonspecific binding sites were then saturated by two washes of 3 minutes with PBS supplemented with 2 mg / ml of BSA and the cells were permeabilized with permeabilization buffer (PBS / 2% BSA / 0.05% saponin). ).
  • the coverslips were then contacted with 25 ⁇ l of primary antibody diluted in permeabilization buffer for 45 minutes at room temperature and the excess of antibody was removed by two washes of 3 minutes with the permeabilization buffer.
  • the coverslips were then incubated for 45 minutes at room temperature with 25 ⁇ l of secondary antibody diluted in permeabilization buffer. After two washes of 3 minutes with the permeabilization buffer followed by washing with PBS, the slides were mounted on microscope slides with 15 ⁇ L of mounting medium (ProLong ® GoId Antifade Reagent with DAPI, Invitrogen ® ) allowing to attenuate the loss of fluorescence during the observation.
  • mounting medium ProLong ® GoId Antifade Reagent with DAPI, Invitrogen ®
  • the melanocyte cells were cultured in flasks of 75 cm 2 until confluent, then lysed in lysis buffer (50 mm Tris, 150 mM NaCl, 10 mm EDTA, 1% Triton, 1% protease inhibitor, pH 7 , 3) for 20 minutes at 4 ° C. The cells were then scraped and centrifuged (15000 rpm, 4 ° C) and the supernatants were collected. The beads coupled to the agarose G protein were washed in the lysis buffer and 20 ⁇ l of these beads were incubated with the lysates for 1 hour at 4 ° C. under rotation.
  • lysis buffer 50 mm Tris, 150 mM NaCl, 10 mm EDTA, 1% Triton, 1% protease inhibitor, pH 7 , 3
  • the cells were then scraped and centrifuged (15000 rpm, 4 ° C) and the supernatants were collected.
  • the beads coupled to the agarose G protein were
  • the lysates were then centrifuged at 4000 rpm and the supernatants were collected and then incubated with washed beads which had been incubated for 1 h with 1 ⁇ g of rabbit antibody (Kifl3A control) or mouse anti-CD9 ( ⁇ control AP-1 adaptin). Immunoprecipitation is then carried out by centrifuging the lysates at 4000 rpm and bringing the supernatants into contact with 20 ⁇ l of washed beads previously incubated for 2 h at 4 ° C. under rotation with 1 ⁇ g of rabbit antibody (Kifl3a control).
  • the melanocyte cells previously seeded in 6-well dishes and treated with "control" siRNAs and siRNA-Kifl3A or siRNA- ⁇ lA were fixed either with a mixture of 2% PFA and 2% glutaraldehyde (conventional microscopy) or a mixture 2% PFA and 0.5% glutaraldehyde (immunolabeling) in 0.2 M phosphate buffer pH 7.4 for 4 hours at room temperature.
  • the cell pellets were first coated in 10% gelatin. After solidification at 4 ° C., 1 mm 3 blocks were cut and infused in 2.3M sucrose for 2 hours. The cell blocks were frozen on their support and ultrafine frozen sections were made with an ultracryo micro volume (Leica ® , Austria). Sections recovered on electron microscopy grids were immunostained with anti-Tyrpl and anti-Pmell7 antibodies. These antibodies were visualized with protein A coupled to colloidal gold particles. The sections were contrasted and embedded in a mixture of uranyl acetate and methylcellulose before observation under an electron microscope (Phillips CM120, FEI Company ® ). Imaging was performed with a KeenView camera (SIS ® , Germany). Quantification of melanin
  • the cells were washed twice in PBS and incubated with 150 ⁇ l of melanine buffer (50 mM Tris, 2 mM EDTA, 150 Mm NaCl, 1% protease inhibitor, pH 7 4). They were then scraped and grouped in a single fraction before being sonicated for 20 seconds at maximum intensity. 10 ⁇ L were then taken to quantify the proteins (with the BCA Protein Assay kit, Pierce) and 200 ⁇ g of proteins were removed and centrifuged at 15,000 rpm for 15 min at 4 ° C. The supernatant was removed and the pellet washed with 500 ⁇ l of an ethanol / ether solution (1: 1). Finally, the pellet was solubilized with 230 ⁇ l of a 2 M NaOH / 20% DMSO solution at 55 ° C. Once solubilized, 200 ⁇ L was taken to measure the optical density at 492 nm.
  • melanine buffer 50 mM Tris, 2 mM EDTA, 150 Mm NaC
  • Quantification was performed on cells prepared for immunofluorescence using an epifluorescence microscope. The cells were observed in phase contrast and the presence (black) or absence (white) of pigmented mature melanosomes was quantified.
  • the relative amount of melanin in melanocytes transfected with siRNA-Kif13A compared to the amount present in cells transfected with siRNA control was determined by measuring the optical density of the cell lysate at a wavelength of 492 nm ( Figure 2).
  • the results presented in Figure 2 show that the use of siRNA-Kifl3A made it possible to obtain a reduction in the amount of melanin synthesized of the order of 40% compared to the cells transfected with the siRNA-control.
  • Electron microcopy observations were performed on melanocytes transfected with siRNA-Kif13A or siRNA-control either by conventional electron microscopy (FIG. 3) or with immunolabeling with anti-Tyrpl antibodies (data not shown). .
  • melanocytes transfected with siRNA-control contained numerous melanosomes with large amounts of melanin (black in Figure 3).
  • melanocytes transfected with RNsi-Kifl3A contained little or no pigments.
  • melanocytes containing pigmented mature melanosomes the amount of melanocytes containing pigmented mature melanosomes and the proportion of mature melanosomes (stage III or IV) in the melanocytes.
  • FIGS. 5A, 5B and 6 show the results obtained on the melanocytes transfected with a siRNA control, an siRNA-1 ⁇ A, an siRNA- ⁇ -adaptin or an siRNA-1 ⁇ A and siRNA- ⁇ -adaptin combination. The results presented in FIGS.
  • FIG. 5A and 5B show that the use of siRNA-1 ⁇ A, siRNA- ⁇ -adaptin (FIG. 5A) or both simultaneously (FIG. 5B) made it possible to significantly increase the proportion of white cells among the transfected melanocytes, compared with those transfected with the siRNA-control. This increase reached even 24% for cells transfected with siRNA-l ⁇ A alone.
  • FIG. 6 shows that transfection of siRNA-1 ⁇ A, siRNA- ⁇ -adaptin or both simultaneously made it possible to significantly reduce the amount of melanin synthesized in the cells by comparison. with those transfected with siRNA-control. This decrease could reach more than 40% in cells transfected with siRNA-l ⁇ A.
  • melanocytes transfected with the siRNA-control contained numerous melanosomes with large amounts of melanin (black in Figure 7). In contrast, melanocytes transfected with siRNA- ⁇ lA contained little or no pigment.
  • the inventors have therefore demonstrated that the subunit-specific siRNAs of the AP-I adapter complex have a significant effect on the production of melanin pigments and can therefore be effectively used as depigmenting agents.

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Abstract

La présente invention concerne de nouvelles compositions pharmaceutiques ou cosmétiques comprenant au moins un inhibiteur d'une sous-unité du complexe adaptateur AP-1, d'une kinésine interagissant avec AP-1, en particulier Kif13A, ou de l'interaction entre une sous- unité du complexe adaptateur AP-1 et ladite kinésine, ainsi que leur utilisation pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement de troubles pigmentaire et comme agent dépigmentant.

Description

Nouvelles compositions inhibant la mélanogenèse et leurs utilisations
La présente invention concerne des compositions permettant de réduire la synthèse de pigments mélaniques dans les mélanocytes et les utilisations de celles-ci.
Arrière-plan technologique de l'invention
Chez l'Homme, la pigmentation résulte de la synthèse et de la distribution des pigments mélaniques notamment dans la peau, les cheveux et poils et l'épithélium pigmentaire de l'iris. Ainsi, la couleur de la peau, des cheveux et des yeux dépendent principalement des types de pigments présents et de leurs concentrations. Cette pigmentation est régulée par de nombreux facteurs internes ou externes, comme par exemple, l'exposition aux ultra-violets.
Les mélanines sont des macromolécules produites par les mélanocytes par addition ou condensation de monomères formés à partir de tyrosine (eumélanine) ou de tyrosine et de cystéine (phéomélanine). Le mécanisme de synthèse des mélanines, ou mélanogenèse, est particulièrement complexe et met en jeu différentes enzymes dont les principales sont la tyrosinase et la protéine associée à la tyrosine (« tyrosinase-related-protein » ou Tyrp-1). Durant la mélanogenèse, ces enzymes catalysent notamment la conversion de la tyrosine en DOPA (dihydroxyphénylalanine) puis en DOPAquinone. A partir de cette molécule, deux voies métaboliques vont permettre la synthèse soit d'eumélanine soit de phéomélanine.
La mélanogenèse a lieu dans des organites intracellulaires spécialisés contenues dans les mélanocytes : les mélanosomes. Bien que les mélanosomes soient parmi les premiers organites cellulaires à être décrits morphologiquement (Seiji et al, 1963), leur composition protéique et leur biogénèse demeurent relativement méconnues.
La maturation du mélanosome peut être segmentée en quatre stades sur la base de critères morphologiques. Le stade I correspond à un compartiment délimité par une membrane avec une quantité variable de membranes intraluminales. Le stade II est une structure de forme ellipsoïdale avec des striations caractéristiques de nature protéique. Ces striations joueraient un rôle important dans la concentration de mélanine, dans l'élimination d'intermédiaires de synthèse toxiques et en facilitant le transfert de la mélanine aux kératinocytes (Seiji et al., 1963). La mélanine est détectée à partir du stade III et sous la forme de dépôts denses aux électrons le long des striations. Le stade IV est une structure dense aux électrons dans laquelle les striations internes ne sont plus visibles. Ce stade correspond au mélanosome mature prêt à être transféré aux kératinocytes (Van
Den Bossche et al, 2006).
Lors du processus de biogenèse, le mélanosome mature "pigmenté" (stade III et IV) est obtenu par addition d'enzymes clefs de la synthèse de mélanine et d'effecteurs nécessaires à son transport vers la périphérie (Raposo et al., 2001). Les enzymes impliquées dans la mélanogenèse sont donc synthétisées dans l'appareil de Golgi puis transférées dans les pré-mélanosomes. Les mécanismes impliqués dans ce transfert sont encore relativement méconnus. Ce type de transfert nécessite notamment la participation de complexes protéiques adaptateurs (AP pour « adaptor protein ») qui sont des hétérotétramères ayant pour rôle de recruter les enzymes dans les vésicules de transport. Il existe quatre de ces complexes, nommés AP-I à AP-4. Les inventeurs ont précédemment démontré que le complexe AP-3 était impliqué dans le transfert de la tyrosinase vers les mélanosomes. Cependant, la déficience en AP-3 n'abolit pas la pigmentation et n'affecte pas le trafic de la Tyrp-1. Ils ont également observé que le complexe adaptateur AP-I était capable d'interagir avec des séquences d'acides aminés des domaines cytosoliques de la tyrosinase et de Tyrp-1 sans pour autant élucider la fonction exacte de ce complexe dans la mélanogenèse (Theos et al., 2005). Parallèlement à cela, il a également été démontré qu'une kinésine, nommée Kifl3A, était capable d'interagir avec une sous-unité de AP-I (Nakagawa et al., 2000). Cette interaction a été observée dans des lignées cellulaires ne possédant pas de mélanosome. L'existence d'une telle interaction dans les lignées mélanocytaires ainsi que son rôle dans la mélanogenèse ne sont donc pas déterminés.
Un dysfonctionnement des mélanocytes peut entraîner des anomalies de pigmentation. Une hypopigmentation peut être engendrée par des maladies dépigmentantes, en particulier l'albinisme et le vitiligo. A l'inverse, des hyperpigmentations locales peuvent résulter de certains troubles mélanocytaires tels que les mélasmas idiopathiques ou l'hyperactivité et la prolifération mélanocytaire bénigne provoquant, par exemple, des taches pigmentaires séniles (lentigo actiniques). Les hyperpigmentations peuvent également être d'origine accidentelle et causées par exemple par une photosensibilisation ou une cicatrisation post-lésionnelle. Ces hyperpigmentations peuvent être traitées au moyen de substances dépigmentantes administrées par voie topique. Une molécule dépigmentante agit au niveau des mélanocytes de l'épiderme et interfère avec une ou des étapes de la mélanogenèse. Les substances dépigmentantes connues sont notamment l'hydroquinone et ses dérivés, l'acide ascorbique et ses dérivés, des extraits placentaires, l'acide kojique, l'arbutine, les iminophénols (WO 99/22707), l'association de carnitine et de quinone (DE 19806947), les dérivés amides d'amino-phénol (FR 2 772 607), et les dérivés de benzothiazole (WO 99/24035).
Ces substances peuvent présenter différents inconvénients dus notamment à leur instabilité, la nécessité de les utiliser à des concentrations élevées, leur action non spécifique ou encore leurs propriétés toxiques, irritantes ou allergisantes. Ainsi, des substances dépigmentantes efficaces et inoffensives pour traiter ou prévenir l'hyperpigmentation par voie topique sont particulièrement recherchées en cosmétologie et en dermatologie. Ces dernières années, de nouvelles approches pour traiter des maladies dues à un dysfonctionnement des mélanocytes sont apparues. L'utilisation d'oligonucléotides antisens a notamment été envisagée. En effet, le document WO 99/25819 décrit des oligonucléotides utilisés pour augmenter la pigmentation en régulant l'expression de la ténascine pour traiter le vitiligo et d'autres maladies dépigmentantes et le document FR 2 804 960 décrit des oligonucléotides antisens permettant de réguler l'expression de la tyrosinase ou de la Tyrp-1 pour traiter des hyperpigmentations.
Résumé de l'invention
L'objectif de la présente invention est de fournir de nouveaux agents dépigmentants non toxiques, non irritants, non allergisants, ayant une action spécifique sur la mélanogenèse et stable dans les formulations appropriées pour une administration par voie topique.
La présente invention concerne, tout d'abord, une composition pharmaceutique ou cosmétique comprenant au moins un inhibiteur d'une kinésine interagissant avec le complexe adaptateur AP-I, en particulier Kifl3A, un inhibiteur d'une sous-unité du complexe adaptateur AP-I, ou un inhibiteur de l'interaction entre une sous-unité du complexe adaptateur AP-I ou le complexe AP-I et une kinésine interagissant avec celui-ci. Dans un premier mode préféré de l'invention, ledit inhibiteur est un inhibiteur de la kinésine Kifl3A. Dans un deuxième mode préféré de l'invention, ledit inhibiteur est un inhibiteur d'une sous-unité du complexe adaptateur AP-I. Dans un troisième mode préféré de l'invention, ledit inhibiteur est un inhibiteur de l'interaction entre une sous-unité du complexe adaptateur AP-I ou le complexe AP-I et une kinésine interagissant avec celui-ci, en particulier la kinésine Kifl3A. De manière particulière, ledit inhibiteur est une petite molécule, un aptamère, un anticorps, un acide nucléique ou un peptide dominant négatif. De préférence, ledit inhibiteur est un aptamère, un anticorps, un acide nucléique ou un peptide dominant négatif.
Dans un mode préféré, la présente invention concerne une composition pharmaceutique ou cosmétique comprenant au moins un acide nucléique comprenant ou consistant en une séquence capable de s'hybrider spécifiquement avec un gène ou un ARNm codant pour une sous-unité du complexe adaptateur AP-I ou pour une kinésine interagissant avec le complexe adaptateur AP-I, en particulier Kifl3A, et de diminuer ou supprimer l'expression de cette protéine. Dans un premier mode préféré de l'invention, ledit au moins un acide nucléique comprend ou consiste en une séquence capable de s'hybrider spécifiquement avec un gène ou un ARNm codant pour une kinésine interagissant avec le complexe adaptateur AP-I, en particulier Kifl3A, et de diminuer ou supprimer l'expression de cette protéine. Dans un deuxième mode préféré de l'invention, ledit au moins un acide nucléique comprend ou consiste en une séquence capable de s'hybrider spécifiquement avec un gène ou un ARNm codant pour une sous-unité du complexe adaptateur AP-I et de diminuer ou supprimer l'expression de cette protéine. De préférence, ledit acide nucléique est un oligonucléotide anti-sens ou un ARNi, de préférence un ARNsi. Ledit acide nucléique peut présenter une séquence de 15 à 50 nucléotides, de préférence de 15 à 30 nucléotides. Dans un mode de réalisation préféré, ledit acide nucléique comprend une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID No. 1 à 6 et 11 à 24.
La composition peut comporter en outre une ou plusieurs autres substances actives, de préférence choisies parmi le groupe composé par l'acide ellagique ; l'arbutine ; le résorcinol ; la vitamine C ; le pantothénate ; l'acide kojique ; des extraits placentaires ; des molécules interférant directement ou indirectement avec la mélanotropine (MSH), son récepteur ou l'hormone adrénocorticotropique (ACTH) ; des polyols tels que la glycérine, le glycol ou le propylène glycol ; des vitamines ; des agents kératolytiques et/ou desquamants tels que l'acide salicylique ; des alpha-hydroxyacides tels que l'acide lactique ou l'acide malique; l'acide ascorbique ; l'acide rétinoïque ; le rétinaldéhyde ; le rétinol ; le palmitate, le propionate ou l'acétate ; des agents anti-glycation et/ou antioxydants tels que le tocophérol, la thiotaurine, l'hypotaurine, l'aminoguanidine, le pyrophosphate de thiamine, la pyridoxamine, la lysine, l'histidine, l'arginine, la phénylalanine, la pyridoxine, l'adénosine triphosphate ; des agents anti- inflammatoires; des agents apaisants et leurs mélanges ; des filtres solaires chimiques ou physiques et des acides désoxyribonucléiques ou ribonucléiques, et les dérivés de ceux-ci. De manière préférée, cette composition est adaptée pour une utilisation topique.
Dans un autre aspect, la présente invention concerne l'utilisation d'une composition pharmaceutique ou cosmétique selon la présente invention pour la préparation d'un médicament destiné au traitement ou à la prévention d'un trouble pigmentaire. De manière préférée, le trouble pigmentaire est une hyperpigmentation.
Dans un autre aspect, la présente invention concerne l'utilisation d'une composition pharmaceutique ou cosmétique selon la présente invention comme agent cosmétique. De préférence, l'agent cosmétique est un agent dépigmentant.
Brève description des dessins
La figure IA présente les résultats obtenus par des expériences de Western-blot sur des lysats cellulaires de mélanocytes transfectés avec un ARNsi-contrôle, un ARN si- AP-I
(μlA), un ARNsi-AP-3 (β3A) ou un ARNsi-Kifl3A. L'anticorps primaire utilisé est un anti-Kifl3A.
La figure IB présente les résultats des immunoprécipitations avec un anticorps anti-
Kifl3A ou avec un anticorps anti-γ-adaptine (AP-I) réalisées à partir de lysats cellulaires de mélanocytes. L'anticorps primaire utilisé pour la révélation du Western-blot est un anti-
Kifl3A. La figure IC présente les résultats obtenus par des expériences de Western-blot sur des extraits protéiques de mélanocytes transfectés avec un ARNsi-contrôle ou un ARNsi-
Kifl3A. Les niveaux d'expression de la kinésine Kifl3A et de la sous-unité μlA du complexe AP-I sont ici évalués quantitativement en utilisant l'expression de la β-tubuline comme référence. La figure 2 montre un diagramme présentant le pourcentage de mélanine dans les mélanocytes transfectés avec un ARNsi-contrôle ou un ARNsi-Kifl3A. La quantité de mélanine dans les mélanocytes transfectés avec l' ARNsi-contrôle est considérée comme étant égale à 100%. La quantité de mélanine a été déterminée par mesure de la densité optique du lysat cellulaire à une longueur d'onde de 492 nm. La figure 3 montre des photos en microscopie électronique de coupes de mélanocytes transfectés avec un ARNsi-contrôle ou avec un ARNsi-Kifl3A.
La figure 4 présente les résultats obtenus par des expériences de Western-blot sur des extraits protéiques de mélanocytes transfectés avec un ARNsi-contrôle ou un ARNsi-μlA. L'expression des sous-unités μl et γ-adaptine du complexe AP-I est ici évaluée quantitativement en utilisant le niveau d'expression de la β-tubuline comme référence.
Les figures 5A et 5B montrent des diagrammes présentant les pourcentages de cellules blanches, c'est-à-dire des mélanocytes ne contenant pas de mélanosome mature pigmenté, parmi les mélanocytes transfectés avec un ARNsi-contrôle, un ARNsi-μlA ou un ARNsi-γ-adaptine (Figure 5A) ou avec la combinaison d'un ARNsi-γ-adaptine et d'un ARNsi-μlA (Figure 5B). Ces mesures ont été effectuées par comptage direct en microscopie optique (contraste de phase).
La figure 6 montre un diagramme présentant le pourcentage de mélanine dans les mélanocytes transfectés avec un ARNsi-contrôle, un ARNsi-μlA ou la combinaison d'un ARNsi-γ-adaptine et d'un ARNsi-μlA. La quantité de mélanine dans les mélanocytes transfectés avec l' ARNsi-contrôle est considérée comme étant égale à 100%. La quantité de mélanine a été déterminée par mesure de la densité optique du lysat cellulaire à une longueur d'onde de 492 nm. La figure 7 montre des photos en microscopie électronique de coupes de mélanocytes transfectés avec un ARNsi-contrôle et avec un ARNsi-μlA. Les chiffres romains sur les photos correspondent aux stades de maturation des mélanosomes présents dans la cellule.
Description détaillée de l'invention Les inventeurs ont démontré, de manière surprenante, que la synthèse de pigments mélaniques pouvait être diminuée au moyen d'un inhibiteur d'une sous-unité du complexe adaptateur AP-I ou d'un inhibiteur d'une kinésine interagissant avec AP-I, en particulier au moyen d'un acide nucléique bloquant l'expression d'une sous-unité du complexe adaptateur AP-I ou d'une kinésine interagissant avec AP-I dans les mélanocytes. Ils ont en effet observé qu'un tel acide nucléique était non seulement capable de perturber le transport des enzymes de la mélanogenèse de l'appareil de Golgi vers les pré- mélanosomes, bloquant ainsi la maturation de ces organites, mais également de diminuer l'expression des enzymes de la mélanogenèse. Les inventeurs ont ainsi révélé que ce type d'acide nucléique permettait de diminuer ou d'inhiber la synthèse de mélanine dans les mélanocytes en agissant sur différentes étapes de la mélanogenèse et constituait donc de nouveaux agents de dépigmentation particulièrement efficaces.
La présente invention concerne, tout d'abord, une composition pharmaceutique ou cosmétique comprenant au moins un inhibiteur d'une kinésine interagissant avec le complexe adaptateur AP-I, en particulier Kifl3A, un inhibiteur d'une sous-unité du complexe adaptateur AP-I, ou un inhibiteur de l'interaction entre une sous-unité du complexe adaptateur AP-I ou le complexe AP-I et une kinésine intergissant avec celui-ci.
Le terme « AP-I » utilisé dans le présent document se réfère au complexe adaptateur AP-I qui intervient dans le réseau trans-Golgi. Il ne doit pas être confondu avec le facteur de transcription du même nom qui est constitué de protéines codées par des gènes membres des familles jun et fos. Le complexe adaptateur AP-I est composé de 4 sous-unités : γ, βl, σl et μl et Pinactivation d'une seule quelconque de ces sous-unités est suffisante pour déstabiliser le complexe et le rendre inopérant (Braun, 2007).
Dans un premier mode préféré de l'invention, ledit inhibiteur est un inhibiteur d'une kinésine interagissant avec AP-I, en particulier de la kinésine Kifl3A.
La présente invention concerne tout type d'inhibiteur d'une kinésine interagissant avec AP-I, en particulier de Kif 13 A. L'inhibiteur peut être toute molécule capable de diminuer l'activité ou l'expression de la kinésine. L'inhibiteur peut être, sans y être limité, une petite molécule, un aptamère, un anticorps, un acide nucléique ou un peptide dominant négatif.
Le terme « petite molécule » fait référence à une molécule de moins de 1 000 daltons, notamment des composés organiques ou inorganiques. Les petites molécules inhibitrices de kinésine comprennent, sans y être limité, l'acepromazine, la chlorfenethazine, la chlorpromazine, la N-methyl chlorpromazine, la cyamemazine, la fluphenazine, la mepazine, la methotrimeprazine, la methoxypromazine, la nor chlorpromazine, la perazine, la perphenazine, la phenothiazine, la prochlorperazine, la promethazine, la propiomazine, la putaperazine, la thiethylperazine, le thiopropazate, la thioridazine, la trifluoperazine, la triflupromazine ainsi que les molécules inhibitrices décrites dans les demandes de brevet et brevets WO 01/98278, WO 02/057244, WO 02/079169, WO 02/057244, WO 02/056880, WO 03/050122, WO 03/050064, WO 03/049679, WO 03/049678, WO 03/049527, WO 03/079973, US 6,890,933, WO 2008/070739, WO 2006/060737, WO 2006/119146 et US 6,777,200.
Selon un mode de réalisation, l'inhibiteur est un aptamère, un anticorps, un acide nucléique ou un peptide dominant négatif. Tel qu'utilisé ici, le terme « peptide dominant négatif » se réfère à un peptide comprenant au moins une partie d'une kinésine interagissant avec AP-I et capable de supprimer ou de diminuer son activité. De manière préférée, le peptide dominant négatif est constitué uniquement de la partie de la kinésine interagissant avec AP-I, c'est-à-dire la partie correspondant à la queue de la kinésine. Ce peptide est donc capable d'interagir avec le complexe AP-I mais, en absence de la partie correspondant à la tête de la kinésine, est incapable de se déplacer le long des microtubules et ainsi de remplir sa fonction.
Plusieurs peptides dominants négatifs pour la kinésine Kifl3A ont déjà été décrits. Notamment, un peptide dominant négatif de Kifl3A a été obtenu en exprimant uniquement la partie de la protéine Kifl3A correspondant à la queue de la kinésine (Nakagawa et al., 2000).
Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, l'inhibiteur de la kinésine est un acide nucléique comprenant ou consistant en une séquence capable de s'hybrider spécifiquement avec un gène ou un ARNm codant pour kinésine interagissant avec AP-I, en particulier Kifl3A, et de diminuer ou supprimer l'expression de cette protéine. De tels acides nucléiques sont plus amplement détaillés ci-dessous.
Dans un deuxième mode préféré de l'invention, ledit inhibiteur est un inhibiteur d'une sous-unité du complexe adaptateur AP-I. La présente invention concerne tout type d'inhibiteur d'une des sous-unités du complexe adaptateur AP-I. Par inhibiteur d'une des sous-unités du complexe adaptateur AP-I est entendu toute molécule capable de diminuer l'activité ou l'expression d'une des sous-unités du complexe adaptateur AP-I. L'inhibiteur peut être, sans y être limité, une petite molécule, un aptamère, un anticorps, un acide nucléique ou un peptide dominant négatif. De préférence, l'inhibiteur est un aptamère, un anticorps, un acide nucléique ou un peptide dominant négatif. Notamment, les inhibiteurs des sous-unités γ et μl sont préférés.
Le terme « petite molécule » fait référence à une molécule de moins de 1 000 daltons, notamment des composés organiques ou inorganiques.
Plusieurs peptides dominants négatifs pour une sous-unité du complexe adaptateur AP-I ont déjà été décrits. Notamment, un mutant dominant négatif de la sous-unité μl a été obtenu en introduisant une mutation dans la poche liant la tyrosine et est décrit dans Wonderlich et al (2008, J. Biol. Chem., Vol. 283, 3011-3022).
L'inhibiteur peut être un anticorps spécifique d'une des sous-unités de AP-I . Plusieurs de ces anticorps sont disponibles commercialement, par exemple des anticorps spécifiques de la sous-unité γ ou de la sous-unité βl (Sigma- Aldrich). Par inhibiteur, il est également entendu dans la présente demande toute molécule capable de diminuer ou d'empêcher la fixation d'une sous-unité du complexe adaptateur AP-I sur les autres sous-unités du complexe, c'est-à-dire toute molécule capable de diminuer ou empêcher la formation du complexe AP-I. Par exemple, la molécule inhibitrice peut être capable de se fixer sur une des sous-unités de AP-I et de provoquer un changement de conformation empêchant la fixation de ladite sous-unité avec l'une ou plusieurs des autres sous-unités de AP-I et ainsi bloquer la formation du complexe AP-I . Elle peut également masquer des domaines d'interaction entre les sous-unités.
Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, l'inhibiteur du complexe adaptateur AP-I est un acide nucléique comprenant ou consistant en une séquence capable de s'hybrider spécifiquement avec un gène ou un ARNm codant pour une sous-unité du complexe adaptateur AP-I et de diminuer ou supprimer l'expression de cette protéine. De tels acides nucléiques sont plus amplement détaillés ci-dessous.
Dans un troisième mode préféré de l'invention, ledit inhibiteur est un inhibiteur de l'interaction entre une sous-unité du complexe adaptateur AP-I ou le complexe AP-I et une kinésine interagissant avec celui-ci, en particulier la kinésine Kifl3A. La présente invention concerne tout type d'inhibiteur de l'interaction entre une sous-unité du complexe adaptateur AP-I ou le complexe AP-I et une kinésine interagissant avec celui-ci. De préférence, la kinésine est Kif 13 A. De préférence, la sous-unité de AP-I est la sous-unité βl. La queue de la kinésine Kif 13 A interagit avec la sous-unité βl du complexe AP-I (Nakagawa et al., 2000). L'inhibiteur peut être toute molécule capable de diminuer ou de supprimer l'interaction entre la kinésine et le complexe AP-I. L'inhibiteur peut être, sans y être limité, une petite molécule, un aptamère ou un anticorps. De préférence, l'inhibiteur est un anticorps dirigé contre le domaine de la sous-unité βl interagissant avec Kifl3A ou contre le domaine de la queue de la kinésine Kifl3A interagissant avec la sous-unité βl. L'anticorps se fixe sur l'une ou l'autre des molécules et bloque ainsi l'interaction entre Kifl3A et le complexe AP-I. Par ailleurs, l'inhibiteur pourrait également être un leurre reproduisant le domaine de la sous-unité βl interagissant avec Kifl3A ou le domaine de la queue de la kinésine Kifl3A interagissant avec la sous-unité βl, ce leurre entrant en compétition avec Kifl3A ou AP-I pour l'interaction entre ces deux éléments.
Le terme « anticorps », tel qu'utilisé dans la présente invention, inclut les anticorps monoclonaux, les anticorps chimères, les anticorps humanisés, les anticorps recombinants et les fragments desdits anticorps. Par fragment d'anticorps, on entend par exemple les fragments F(ab)2, Fab, Fab' ou sFv. Selon un mode de réalisation particulier, l'anticorps peut être un IgG, IgM, IgA, IgD ou IgE, de préférence un IgG ou un IgM. Les méthodes de production d'anticorps sont bien connues de l'homme du métier.
Le terme « aptamère » tel qu'utilisé ici désigne une molécule d'acide nucléique ou un peptide capable de se lier de manière spécifique à une sous-unité du complexe AP-I ou à une kinésine interagissant avec AP-I, en particulier Kifl3A. De manière préférée, les aptamères sont des acides nucléiques, de préférence des ARN, comprenant généralement entre 5 et 120 nucléotides (Osborne et al., 1997). Ils peuvent être sélectionnés in vitro selon un procédé connu sous le nom de SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment). Dans la présente description, les termes « acide nucléique », « séquence nucléique»,
« polynucléotide », « oligonucléotide », « séquence nucléotidique », sont employés indifféremment et se réfèrent à un enchaînement de désoxyribonucléotides et/ou de ribonucléotides.
Le terme « ARNi » ou « ARN interfèrent » utilisé dans le présent document se réfère à tout ARN, simple ou double brin, qui interfère avec un ARN messager spécifique conduisant ainsi à sa dégradation et à la diminution de sa traduction en protéine. Ce terme englobe les petits ARN interférents (ARNsi), les ARN bicaténaires (ARNdb), les ARN monocaténaires (ARNsb), les ARN courts à épingle à cheveux (ARNsh), les ARNi ADN- dirigés (ddARNi) et les micro ARN (ARNmi). Le terme « s'hybrider » signifie dans le présent document que des liaisons hydrogène de type Watson-Crick peuvent s'établir entre les bases complémentaires de deux brins d'acide nucléique pour former un duplexe. Le terme « capable de s'hybrider spécifiquement » signifie dans le présent document que l'acide nucléique utilisé selon l'invention est capable de s'hybrider sur un gène ou un transcrit codant pour une sous-unité de AP-I ou pour une kinésine interagissant avec AP-I dans des conditions d'hybridation de forte stringence. Les conditions de forte stringence sont largement décrites dans la littérature, par exemple dans Sambrook et al., (1989), Maniatis et al, (1982 ou l'une de ses récentes rééditions) et dans Ausubel et al, (1995), et ces conditions peuvent être adaptées par l'homme du métier en fonction de la taille des fragments nucléotidiques, selon les enseignements appropriés connus. A titre illustratif, des conditions de forte stringence sont avantageusement les suivantes. L'hybridation entre les deux brins (notamment ADN- ADN, ARN-ARN ou ADN-ARN) est réalisée en deux étapes : (a) préhybridation à 42°C pendant 3 heures en tampon phosphate (20 mM, pH 7,5) contenant 5 x SSC (1 x SSC correspond à une solution 0,15 M NaCl / 0,015 M citrate de sodium), 50 % de formamide, 7 % de sodium dodécyl sulfate (SDS), 1O x solution de Denhardt, 5 % de dextran sulfate et 1 % d'ADN de sperme de saumon ; (b) hybridation proprement dite pendant 20 heures à une température dépendante de la taille de la sonde (par exemple, 42°C pour une sonde de taille supérieure à 100 nucléotides) suivie de deux lavages de 20 minutes à 200C avec une solution 2 x SSC / 2 % SDS, un lavage de 20 minutes à 200C avec une solution 0,1 x SSC / 0,1 % SDS. Le dernier lavage est effectué avec une solution 0,1 x SSC / 0,1 % SDS pendant 30 minutes à 600C pour une sonde de taille supérieure à 100 nucléotides.
Dans le cadre de la présente invention, le terme « gène codant pour une sous-unité de AP-I ou pour une kinésine interagissant avec AP-I » est utilisé pour désigner la séquence génomique codant pour l'une des sous-unités γ, βl, σl et μl de AP-I ou pour une kinésine interagissant avec AP-I, en particulier Kifl3A. Ce terme englobe la région 5' non codante, la région contenant le codon d'initiation, la région codante et la région 3' non codante du gène. Le terme « gène codant pour une sous-unité de AP-I » est utilisé pour désigner la séquence génomique codant pour l'une des sous-unités γ, βl, σl et μl de AP-I. Ce terme englobe la région 5' non codante, la région contenant le codon d'initiation, la région codante et la région 3' non codante du gène. Le terme « gène codant pour une kinésine interagissant avec AP-I » est utilisé pour désigner la séquence génomique codant pour une kinésine interagissant avec AP-I, en particulier Kifl3A. Ce terme englobe la région 5' non codante, la région contenant le codon d'initiation, la région codante et la région 3' non codante du gène.
Dans le cadre de la présente invention, le terme « ARNm codant pour une sous-unité de AP-I ou pour une kinésine interagissant avec AP-I » est utilisé pour désigner la séquence ribonucléotidique issue de la transcription du gène codant pour la protéine correspondante. Ce terme englobe les régions en 3' et en 5' non traduites (3'-UTR et 5'- UTR), les exons et, éventuellement, les introns non épissés. Le terme « ARNm codant pour une sous-unité de AP-I » est utilisé pour désigner la séquence ribonucléotidique issue de la transcription du gène codant pour la protéine correspondante. Le terme « ARNm codant pour une kinésine interagissant avec AP-I » est utilisé pour désigner la séquence ribonucléotidique issue de la transcription du gène codant pour la protéine correspondante. Plus particulièrement, le terme « ARNm codant pour la kinésine Kifl3A » est utilisé pour désigner la séquence ribonucléotidique issue de la transcription du gène codant pour la kinésine Kifl3A.
Les séquences génomiques et les protéines peuvent être identifiées par leur numéro dans la base de données GenelD (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/index.html). Ainsi les numéros d'entrée GenelD pour les sous-unités γ, βl, σl et μl de AP-I sont respectivement GenelD 164, GenelD 162, GenelD 1174, GeneID8907 et le numéro d'entrée GenelD pour la kinésine Kifl3A de l'être humain est GeneID63971. Les termes « mélanine », « mélanines » et « pigments mélaniques » sont ici utilisés indifféremment. Ils englobent les différents pigments susceptibles d'être synthétisés dans les mélanosomes, dont l'eumélanine ou la phéomélanine.
Le terme « composition pharmaceutique » se réfère, dans ce document, à une composition selon l'invention comprenant un support et/ou excipient pharmaceutiquement acceptable.
Le terme « composition cosmétique » se réfère, dans ce document, à une composition selon l'invention comprenant un support et/ou excipient cosmétiquement acceptable.
Le terme « agent dépigmentant » se réfère dans cette description à un agent actif capable d'inhiber ou de diminuer la synthèse de mélanine dans les mélanocytes et ainsi de blanchir la peau.
Les inhibiteurs utilisés selon l'invention sont capables, lorsqu'ils sont introduits dans un mélanocyte, d'induire une diminution ou une suppression de l'expression ou de l'activité d'une ou plusieurs sous-unités d'AP-1 ou d'une kinésine interagissant avec AP-I, en particulier Kifl3A, ou d'induire une diminution ou suppression de l'interaction d'une sous-unité du complexe adaptateur AP-I ou du complexe AP-I avec une kinésine interagissant avec celui-ci, en particulier la kinésine Kifl3A, avec pour conséquence une baisse significative de la synthèse des pigments mélaniques.
Selon un mode préféré, les acides nucléiques utilisés selon l'invention sont capables, lorsqu'ils sont introduits dans un mélanocyte, d'induire une diminution ou une suppression de l'expression d'une ou plusieurs sous-unités d'AP-1 ou d'une kinésine interagissant avec AP-I, en particulier Kifl3A, avec pour conséquence une baisse significative de la synthèse des pigments mélaniques. Selon un mode de réalisation particulier, les acides nucléiques utilisés selon l'invention sont capables, lorsqu'ils sont introduits dans un mélanocyte, d'induire une diminution ou une suppression de l'expression d'une ou plusieurs sous- unités d'AP-1, avec pour conséquence une baisse significative de la synthèse des pigments mélaniques. Selon un autre mode de réalisation particulier, les acides nucléiques utilisés selon l'invention sont capables, lorsqu'ils sont introduits dans un mélanocyte, d'induire une diminution ou une suppression de l'expression d'une kinésine interagissant avec AP-I, en particulier Kifl3A, avec pour conséquence une baisse significative de la synthèse des pigments mélaniques Ces acides nucléiques peuvent agir au niveau transcriptionnel ou traductionnel.
Par « diminution » de l'expression est entendue, par exemple, une diminution de 30, 50, 70, 80, 90 ou 95% du produit de l'expression du gène. Les acides nucléiques utilisés selon l'invention peuvent être de l'ADN, de l'ARN ou des molécules chimériques ADN/ARN. Ils peuvent être sous forme simple brin ou en duplexe ou en un mélange des deux. Ils peuvent comprendre éventuellement au moins un nucléotide modifié ou non naturel tel que, par exemple, un nucléotide comportant une base modifiée, telle que l'inosine, la méihyl-5-désoxycytidine, la diméihylarnino-5- désoxyuridine, la désoxyuridine, la diamino-2,6-purine, la bromo-5-désoxyuridine ou toute autre base modifiée permettant l'hybridation. Les acides nucléiques utilisés selon l'invention peuvent également être modifiés au niveau de la liaison internucléotidique comme par exemple les phosphorothioates, les H-phosphonates ou les alkyl-phosphonates, ou au niveau du squelette comme par exemple les alpha- oligonucléotides, les 2'-O-alkyl ribose ou les PNA (Peptid Nucleic Acid) (M. Egholm et al, 1992). Ces acides nucléiques peuvent être préparés par toutes méthodes connues de l'homme du métier telles que, par exemple, la synthèse chimique, le criblage de banques, la transcription in vivo ou des techniques d'ADN recombinant ou d'amplification. Dans un mode particulier de réalisation de l'invention, l'acide nucléique peut être un
ADN qui, lorsqu'il est introduit dans une cellule induit la production d'un ARN interfèrent (ddRNAi) permettant l'inhibition de l'expression d'un gène cible dans la cellule. Cette technologie est connue de l'homme du métier sous le nom d'interférence ARN ADN- dirigé. Dans un autre mode de réalisation préféré, l'acide nucléique est un ARN, de préférence un ARN interfèrent (ARNi). Ces ARN peuvent être des ARN naturels, synthétiques ou produits par des techniques de recombinaison. Ils peuvent également contenir des nucléotides modifiés ou des modifications chimiques leur permettant, par exemple, d'augmenter leur résistance aux nucléases et ainsi d'augmenter leur durée de vie dans la cellule. L'interférence par l'ARN est un phénomène bien connu de l'homme du métier qui permet d'inhiber de manière spécifique l'expression du gène cible au niveau post-transcriptionnel. De nombreux brevets et demandes de brevet ont décrit l'utilisation de molécules d'ARNi pour inhiber l'expression génique, par exemple, dans les documents WO 99/32619, US 20040053876, US 20040102408 et WO 2004/007718. De manière préférée, la molécule d'ARNi est une molécule d'ARNsi sous forme double brin d'environ 15 à 50 nucléotides de longueur, de préférence d'environ 15 à 30 nucléotides.
Dans un mode de réalisation alternatif de la présente invention, l'acide nucléique utilisé pour diminuer ou supprimer l'expression d'une sous-unité d'AP-1 ou d'une kinésine interagissant avec AP-I, en particulier Kifl l3A, est un acide nucléique antisens. De manière particulière, l'acide nucléique utilisé pour diminuer ou supprimer l'expression d'une sous-unité d'AP-1 est un acide nucléique antisens. D'une autre manière particulière, l'acide nucléique utilisé pour diminuer ou supprimer l'expression d'une kinésine interagissant avec AP-I, en particulier Kifl 13 A, est un acide nucléique antisens. Cet acide nucléique antisens peut être complémentaire de tout ou partie d'un acide nucléique sens codant pour une sous-unité d'AP-1 ou une kinésine interagissant avec AP-I. De manière particulière, l'acide nucléique antisens peut être complémentaire de tout ou partie d'un acide nucléique sens codant pour une sous-unité d'AP-1. D'une autre manière particulière, l'acide nucléique antisens peut être complémentaire de tout ou partie d'un acide nucléique sens codant pour une kinésine interagissant avec AP-I. Il peut, par exemple être complémentaire d'un ARNm. L'acide nucléique antisens comprend généralement une séquence nucléotidique complémentaire d'au moins une partie du transcrit d'une sous-unité d'AP-1 ou d'une kinésine interagissant avec AP-I, et s'hybride de manière sélective à ces transcrits par des interactions de type Watson-Crick classiques. De manière particulière, l'acide nucléique antisens comprend généralement une séquence nucléotidique complémentaire d'au moins une partie du transcrit d'une sous-unité d'AP-1. D'une autre manière particulière, l'acide nucléique antisens comprend généralement une séquence nucléotidique complémentaire d'au moins une partie du transcrit d'une kinésine interagissant avec AP-I. Le ou les acides nucléiques inhibiteurs de type antisens peuvent donc se fixer aux transcrits d'un gène codant pour les sous-unités γ, βl, σl et μl de AP-I ou codant pour une kinésine interagissant avec AP-I et, par exemple, bloquer l'accès à la machinerie cellulaire de traduction à l'extrémité 5' du transcrit d'intérêt lorsque ce dernier est un ARNm, gêner sa traduction en protéine, et permettre la suppression de l'expression du transcrit d'intérêt in vivo (Kumar et al, 1993). De manière particulière, le ou les acides nucléiques inhibiteurs de type antisens peuvent se fixer aux transcrits d'un gène codant pour les sous-unités γ, βl, σl et μl de AP-I. D'une autre manière particulière, le ou les acides nucléiques inhibiteurs de type antisens peuvent se fixer aux transcrits d'un gène codant pour une kinésine interagissant avec AP-I, en particulier Kifl l3A. De tels polynucléotides ont été par exemple décrits dans le brevet EP 0 092 574. De manière préférée, l'acide nucléique antisens est complémentaire d'un ARNm codant pour une sous- unité de AP-I ou pour une kinésine interagissant avec AP-I, en particulier Kifl l3A. De manière particulière, l'acide nucléique antisens est complémentaire d'un ARNm codant pour une sous-unité de AP-I. D'une autre manière particulière, l'acide nucléique antisens est complémentaire d'un ARNm codant pour une kinésine interagissant avec AP-I, en particulier Kifl l3A. Lorsque l'acide nucléique inhibiteur est de type antisens, il peut couvrir toute ou partie de la séquence codante du transcrit d'intérêt, ou toute ou partie de la séquence non codante en 3' ou en 5'. De préférence, l'acide nucléique inhibiteur antisens est complémentaire de la séquence de fixation du ribosome et d'initiation de la traduction. L'acide nucléique inhibiteur a généralement une longueur d'au moins 10 ribonucléotides, par exemple, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ou 50 ribonucléotides de long, de préférence de 15 à 30 ribonucléotides de long.
Un acide nucléique antisens utilisé selon l'invention peut être synthétisé par des méthodes de synthèse chimique ou par des techniques d'ADN recombinant connues de l'homme du métier. L'ADN ou PARN antisens peut notamment être synthétisé chimiquement, produit par transcription in vitro de matrices linéaires (par exemple, par PCR) ou circulaires (par exemple, à partir de vecteurs viraux ou non), ou produit par transcription in vivo à partir de vecteurs viraux ou non. Les acides nucléiques antisens peuvent être modifiés pour augmenter leur stabilité, leur résistance aux nucléases, leur spécificité ou encore leurs propriétés pharmaco logiques. Par exemple, un acide nucléique antisens peut comporter des nucléotides modifiés utilisés pour augmenter la stabilité des duplexes formés entre les acides nucléiques sens et antisens.
Selon un autre mode de réalisation, l'acide nucléique inhibiteur est de type ribozyme. Les ribozymes sont des molécules d'ARN catalytiques qui possèdent une activité ribonucléase et sont ainsi capables de cliver des acides nucléiques simple-brin, tels que des ARNm dont ils sont complémentaires. Des ribozymes spécifiques des transcrits codant pour une sous-unité de AP-I ou pour une kinésine interagissant avec AP-I peuvent être conçus, synthétisés et produits selon des méthodes bien connues de l'homme du métier (voir, par exemple, Fanning and Symonds, 2006). Le ribozyme présente généralement deux régions distinctes. Une première région qui présente une certaine spécificité pour le transcrit d'intérêt, celui d'un gène codant pour une sous-unité de AP-I ou pour une kinésine interagissant avec AP-I, et est donc capable de se lier à ce dernier, alors que la deuxième région confère au ribozyme son activité catalytique de clivage, ligation et épissage du transcrit d'intérêt. De manière particulière, la première région présente une certaine spécificité pour le transcrit d'intérêt, celui d'un gène codant pour une sous-unité de AP-I. D'une autre manière particulière, la première région présente une certaine spécificité pour le transcrit d'intérêt, celui d'un gène codant pour une kinésine interagissant avec AP- 1, en particulier Kifl l3A. Divers types de ribozymes peuvent être utilisés comme par exemples les ribozymes à tête de marteau ou ribozymes circulaires, les ribozymes en épingles à cheveux ou les ribozymes en lasso.
Les ARN interférents ou les acides nucléiques antisens utilisés selon l'invention peuvent être administrés sous la forme de précurseurs ou de molécules d'ADN codant pour ceux-ci.
L'acide nucléique utilisé selon l'invention a généralement une longueur de 15 à 50 nucléotides de long, de préférence de 15 à 30 nucléotides de long.
Dans la présente invention, l'acide nucléique est capable de s'hybrider spécifiquement à un gène ou transcrit codant pour une sous-unité du complexe AP-I ou pour une kinésine interagissant avec AP-I, en particulier Kifl l3A. Selon un mode de réalisation, l'acide nucléique est capable de s'hybrider spécifiquement à un gène ou transcrit codant pour une sous-unité du complexe AP-I. Selon un autre mode de réalisation, l'acide nucléique est capable de s'hybrider spécifiquement à un gène ou transcrit codant pour une kinésine interagissant avec AP-I, en particulier Kifl l3A. Il est néanmoins entendu que l'acide nucléique selon l'invention n'a pas besoin de présenter une complémentarité de 100% avec la séquence cible pour s'hybrider spécifiquement. En particulier, un acide nucléique présentant un degré de complémentarité au moins égal à 90 % environ est capable de s'hybrider spécifiquement. De préférence, le degré de complémentarité entre l'acide nucléique de l'invention et la séquence cible est égal à 95, 96, 97, 98, 99 ou 100%.
Dans un mode de réalisation préféré, l'acide nucléique utilisé selon l'invention comprend ou consiste en une ou plusieurs séquences capables de s'hybrider spécifiquement avec un gène ou un ARNm codant pour une sous-unité du complexe adaptateur AP-I ou pour la kinésine Kifl3A. De préférence, l'acide nucléique comprend ou consiste en une ou plusieurs séquences choisies parmi les séquences SEQ ID No. 1 à 6 et 11 à 24. Dans un mode de réalisation particulier, l'acide nucléique utilisé selon l'invention comprend ou consiste en une ou plusieurs séquences capables de s'hybrider spécifiquement avec un gène ou un ARNm codant pour une sous-unité du complexe adaptateur AP-I. De préférence, l'acide nucléique comprend ou consiste en une ou plusieurs séquences choisies parmi les séquences SEQ ID No. 5, 6 et 11 à 24. De manière tout particulièrement préférée, l'acide nucléique comprend ou consiste en une ou plusieurs séquences capables de s'hybrider spécifiquement avec un gène ou un ARNm codant pour la sous-unité μlA ou γ-adaptine de AP-I. Dans un autre mode de réalisation particulier, l'acide nucléique utilisé selon l'invention comprend ou consiste en une ou plusieurs séquences capables de s'hybrider spécifiquement avec un gène ou un ARNm codant pour la kinésine Kifl3A. De préférence, l'acide nucléique comprend ou consiste en une ou plusieurs séquences choisies parmi les séquences SEQ ID No. 1 à 4.
Dans un mode de réalisation tout particulièrement préféré, l'acide nucléique utilisé selon l'invention comprend ou consiste en une molécule d'ARN interfèrent double brin formée par l'un des couples suivants : SEQ ID Nos. 1 et 2, SEQ ID Nos. 3 et 4, SEQ ID Nos. 5 et 6, SEQ ID Nos. 11 et 12, SEQ ID Nos. 13 et 14, SEQ ID Nos. 15 et 16, SEQ ID Nos. 17 et 18, SEQ ID Nos. 19 et 20, SEQ ID Nos. 21 et 22 et SEQ ID Nos. 23 et 24. Dans un mode de réalisation particulier, l'acide nucléique utilisé selon l'invention comprend ou consiste en une molécule d'ARN interfèrent double brin formée par l'un des couples suivants : SEQ ID Nos. 1 et 2 et SEQ ID Nos. 3 et 4. Dans un autre mode de réalisation particulier, l'acide nucléique utilisé selon l'invention comprend ou consiste en une molécule d'ARN interfèrent double brin formée par l'un des couples suivants : SEQ ID Nos. 5 et 6, SEQ ID Nos. 11 et 12, SEQ ID Nos. 13 et 14, SEQ ID Nos. 15 et 16, SEQ ID Nos. 17 et 18, SEQ ID Nos. 19 et 20, SEQ ID Nos. 21 et 22 et SEQ ID Nos. 23 et 24.
La présente invention concerne une composition pharmaceutique ou cosmétique comprenant au moins un inhibiteur d'une sous-unité du complexe adaptateur AP-I, un inhibiteur d'une kinésine interagissant avec le complexe adaptateur AP-I, en particulier Kifl l3A, ou un inhibiteur de l'interaction entre une sous-unité du complexe adaptateur AP-I ou le complexe AP-I et une kinésine interagissant avec celui-ci, en particulier un quelconque inhibiteur tel que défini dans la présente demande.
Selon un mode préféré, la présente invention concerne une composition pharmaceutique ou cosmétique comprenant au moins un acide nucléique comprenant ou consistant en une séquence capable de s'hybrider spécifiquement avec un gène ou un ARNm codant pour une sous-unité du complexe adaptateur AP-I ou pour une kinésine interagissant avec le complexe adaptateur AP-I, en particulier Kifl 13 A, et de diminuer ou supprimer l'expression de cette protéine, tel que décrit dans la présente demande. Dans un mode de réalisation particulier, la composition pharmaceutique ou cosmétique comprend au moins un acide nucléique comprenant ou consistant en une séquence capable de s'hybrider spécifiquement avec un gène ou un ARNm codant pour une sous-unité du complexe adaptateur AP-I et de diminuer ou supprimer l'expression de cette protéine, tel que décrit dans la présente demande. Dans un autre mode de réalisation particulier, la composition pharmaceutique ou cosmétique comprend au moins un acide nucléique comprenant ou consistant en une séquence capable de s'hybrider spécifiquement avec un gène ou un ARNm codant pour une kinésine interagissant avec le complexe adaptateur AP-
1 et de diminuer ou supprimer l'expression de cette protéine, tel que décrit dans la présente demande. De manière préférée, la kinésine est la kinésine Kifl3A.
De manière préférée, la composition est une composition pharmaceutique ou cosmétique dont la formulation est adaptée à une administration topique. L'inhibiteur utilisé dans la composition est présent en une quantité efficace. Selon le type d'inhibiteur utilisé, une quantité efficace est une quantité permettant d'obtenir une diminution ou une suppression de l'expression ou de l'activité d'une sous-unité du complexe adaptateur AP-I ou d'une kinésine interagissant avec le complexe adaptateur AP-I, en particulier Kifl 13 A, ou une diminution ou une suppression de l'interaction entre une sous-unité du complexe adaptateur AP-I ou le complexe AP-I et une kinésine interagissant avec celui-ci.
Selon le mode préféré où l'inhibiteur est un acide nucléique, l'acide nucléique utilisé dans la composition est présent en une quantité efficace, par exemple, allant de 0,00001% à 10% et de préférence de 0,0003% à 3% (p/p) du poids total de la composition. Le terme « quantité efficace » tel qu'utilisé dans la présente demande est une quantité d'inhibiteur utilisé selon l'invention permettant d'obtenir une diminution significative de la synthèse de mélanine. Selon un mode préféré, le terme « quantité efficace » tel qu'utilisé dans la présente demande est une quantité d'acide nucléique utilisé selon l'invention permettant d'obtenir une diminution significative de la synthèse de mélanine. Cette diminution peut, notamment, se traduire par un changement visible de la couleur de la peau. Cette diminution peut, par exemple, être de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ou 50 % de la quantité de mélanine présente dans des cellules non traitées. Elle peut être mesurée par l'une des méthodes décrites dans les exemples ou connues de l'homme du métier. La composition selon l'invention peut comprendre plusieurs inhibiteurs dont le type et la cible peuvent être identiques ou différentes. Elle peut comprendre des inhibiteurs soit d'une sous-unité du complexe adaptateur AP-I, soit d'une kinésine interagissant avec le complexe adaptateur AP-I, en particulier Kifl l3A, soit de l'interaction entre une sous- unité du complexe adaptateur AP-I ou le complexe AP-I et une kinésine interagissant avec celui-ci. Elle peut comprendre des inhibiteurs de nature similaire (par exemple uniquement des acides nucléiques) ou différentes (par exemple des aptamères, des anticorps et/ou des acides nucléiques). Selon un mode préféré, cette composition peut comprendre plusieurs acides nucléiques comprenant une séquence capable de s'hybrider spécifiquement avec un gène ou un ARNm codant pour une sous-unité du complexe adaptateur AP-I ou pour une kinésine interagissant avec le complexe adaptateur AP-I, en particulier Kifl l3A, et de diminuer ou supprimer l'expression cette protéine, tels que décrits dans la présente demande. Elle peut également comprendre une combinaison de plusieurs acides nucléiques inhibiteurs ciblant soit une même sous-unité d'AP-1, soit des sous-unités d'AP-1 différentes, soit une même kinésine interagissant avec AP-I, soit différentes kinésines interagissant avec AP-I. Dans un mode de réalisation particulier, la composition peut comprendre plusieurs acides nucléiques comprenant une séquence capable de s'hybrider spécifiquement avec un gène ou un ARNm codant pour une sous-unité du complexe adaptateur AP-I et de diminuer ou supprimer l'expression cette protéine, tels que décrits dans la présente demande. Elle peut également comprendre une combinaison de plusieurs acides nucléiques inhibiteurs ciblant soit une même sous-unité d'AP-1, soit des sous-unités d'AP-1 différentes. Dans un autre mode de réalisation particulier, la composition peut comprendre plusieurs acides nucléiques comprenant une séquence capable de s'hybrider spécifiquement avec un gène ou un ARNm codant pour une kinésine interagissant avec le complexe adaptateur AP-I, en particulier Kifl l3A, et de diminuer ou supprimer l'expression cette protéine, tels que décrits dans la présente demande. Elle peut également comprendre une combinaison de plusieurs acides nucléiques inhibiteurs ciblant soit une même kinésine interagissant avec AP-I, soit différentes kinésines interagissant avec AP-I.
La composition selon l'invention peut également comprendre en outre une ou plusieurs substances actives additionnelles visant à renforcer les effets recherchés, par exemple, l'acide ellagique ; l'arbutine ; le résorcinol ; la vitamine C ; le pantothénate ; l'acide kojique ; des extraits placentaires ; des molécules interférant directement ou indirectement avec la mélanotropine (MSH), son récepteur ou l'hormone adrénocorticotropique (ACTH) ; des polyols tels que la glycérine, le glycol ou le propylène glycol ; des vitamines ; des agents kératolytiques et/ou desquamants tels que l'acide salicylique ; des alpha-hydroxy acides tels que l'acide lactique ou l'acide malique; l'acide ascorbique ; l'acide rétinoïque ; le rétinaldéhyde ; le rétinol ; le palmitate, le propionate ou l'acétate ; des agents anti-glycation et/ou antioxydants tels que le tocophérol, la thiotaurine, l'hypotaurine, l'aminoguanidine, le pyrophosphate de thiamine, la pyridoxamine, la lysine, l'histidine, l'arginine, la phénylalanine, la pyridoxine, l'adénosine triphosphate ; des agents anti-inflammatoires; des agents apaisants et leurs mélanges ; des filtres solaires chimiques ou physiques et des acides désoxyribonucléiques ou ribonucléiques, et les dérivés de ceux- ci. La composition selon l'invention peut se présenter sous toute forme galénique normalement utilisée pour une application topique notamment sous forme d'une solution aqueuse, hydroalcoolique ou huileuse, d'une émulsion huile dans eau ou eau dans huile ou multiple, d'un gel aqueux ou huileux, d'un produit anhydre liquide, pâteux ou solide, d'une dispersion d'huile dans une phase polymérique telle que les nanosphères et les nanocapsules ou mieux des vésicules lipidiques de type ionique et/ou non-ionique tels que décrit dans le brevet français FR 2534487.
En particulier, la composition selon l'invention peut comprendre au moins un inhibiteur, de préférence un acide nucléique inhibiteur, décrit dans la présente demande, encapsulé dans un liposome.
Par « liposome », on entend désigner selon la présente invention des petites vésicules fabriquées artificiellement et constituées de lamelles de phospholipides, séparées les unes des autres par des compartiments aqueux. Ils ont une structure très proche de celle des membranes cellulaires, ce qui leur permet de fusionner avec elles en libérant le ou les principes actifs qu'ils contiennent. Les liposomes utilisables selon l'invention peuvent être des liposomes multilamellaires ou MLV (MultiLamellar Vesicle), des petits liposomes unilamellaires ou SUV (Small Unilamellar Vesicle), ou des gros liposomes unilamellaires ou LUV (Large Unilamellar Vesicle). Le liposome peut également être un liposome non ionique dont la paroi n'est plus constituée de phospholipides mais de lipides non ioniques. La composition selon l'invention peut être plus ou moins fluide et avoir l'aspect d'une crème blanche ou colorée, d'une pommade, d'un lait, d'une lotion, d'un sérum, d'une pâte ou d'une mousse. Elle peut éventuellement être appliquée sur la peau sous forme d'aérosol. Elle peut également se présenter sous forme solide pulvérulent ou non, par exemple sous forme stick. Elle peut encore se présenter sous la forme de patchs, de crayons, de pinceaux et d'applicateurs autorisant une application localisée sur les taches du visage ou des mains. Elle peut être utilisée comme produit de soin et/ou comme produit de maquillage.
De façon connue, la composition selon l'invention peut contenir également les adjuvants habituels dans les domaines cosmétique et dermatologique, tels que les gélifiants hydrophiles ou lipophiles, les actifs hydrophiles ou lipophiles, les conservateurs, les antioxydants, les solvants, les parfums, les charges, les filtres, les pigments, les absorbeurs d'odeur et les matières colorantes. Les quantités de ces différents adjuvants sont celles classiquement utilisées dans les domaines considérés. Ces adjuvants, selon leur nature, peuvent être introduits dans la phase grasse, dans la phase aqueuse, dans les vésicules lipidiques et/ou dans les nanoparticules.
Lorsque la composition cosmétique ou dermatologique de l'invention est une émulsion, la proportion de la phase grasse peut aller de 5 à 80% en poids, et de préférence de 5 à 50% en poids par rapport au poids total de la composition. Les huiles, les émulsionnants et les co-émulsionnants utilisés dans la composition sous forme d'émulsion sont choisis parmi ceux classiquement utilisés dans le domaine considéré. L'émulsionnant et le co-émulsionnant sont présents, dans la composition, en une proportion allant de 0,3% à 30% en poids, et de préférence de 0,5% à 20% en poids par rapport au poids total de la composition.
Comme huiles utilisables en association avec les inhibiteurs selon l'invention, en particulier avec les acide nucléiques selon l'invention, on peut citer les huiles minérales telles que l'huile de vaseline ; les huiles d'origine végétale telles que l'huile d'avocat ou l'huile de soja ; les huiles d'origine animale telles que la lanoline ; les huiles de synthèse telles que la perhydrosqualène ; les huiles siliconées telles que le cyclométhicone et les huiles fluorées telles que les perfluoropolyéthers. On peut aussi utiliser comme matière grasses des alcools gras comme l'alcool cétylique, des acides gras ou encore des cires telles que la cire de Carnauba ou l'ozokérite.
Comme émulsionnants et coémulsionnants utilisables en association avec les acides nucléiques selon l'invention, on peut citer par exemple des esters d'acide gras et de polyéthylène glycol tels que le stéarate de PEG- 20 et les esters d'acide gras et de glycérine tels que le stéarate de glycéryle.
Comme gélifiants hydrophiles utilisables en association avec les inhibiteurs, en particulier les acides nucléiques, selon l'invention, on peut utiliser, par exemple, les polymères carboxyvinyliques (carbomer), les copolymères acryliques tels que les copolymères d'acrylates/alkylacrylates, les polyacrylamides, les polysaccharides, les gommes naturelles et les argiles. Comme gélifiants lipophiles, on peut utiliser, par exemple, les argiles modifiées comme les bentones, les sels métalliques d'acides gras, la silice hydrophobe ou les polyéthylènes. La présente invention concerne aussi l'utilisation d'une composition selon l'invention, comme agent cosmétique. Selon un mode de réalisation préférée, l'agent cosmétique est un agent dépigmentant.
La présente invention concerne une composition pharmaceutique ou cosmétique comprenant au moins un inhibiteur d'une sous-unité du complexe adaptateur AP-I, un inhibiteur d'une kinésine interagissant avec le complexe adaptateur AP-I, en particulier
Kifl l3A, ou un inhibiteur de l'interaction entre une sous-unité du complexe adaptateur AP-I ou le complexe AP-I et une kinésine interagissant avec celui-ci, pour une utilisation dans le traitement de troubles pigmentaires. Selon un mode particulier, l'inhibiteur peut être, sans y être limité, une petite molécule, un aptamère, un anticorps, un acide nucléique ou un peptide dominant négatif.
Selon un mode préféré, la présente invention concerne une composition pharmaceutique comprenant au moins un acide nucléique comprenant une séquence capable de s'hybrider spécifiquement avec un gène ou un ARNm codant pour une sous- unité du complexe adaptateur AP-I ou pour une kinésine interagissant avec le complexe adaptateur AP-I, en particulier Kifl 13 A, et de diminuer ou supprimer l'expression de cette protéine, pour le traitement de troubles pigmentaires. De manière particulière, la présente invention concerne une composition pharmaceutique comprend au moins un acide nucléique comprenant une séquence capable de s'hybrider spécifiquement avec un gène ou un ARNm codant pour une sous-unité du complexe adaptateur AP-I et de diminuer ou supprimer l'expression de cette protéine, pour le traitement de troubles pigmentaires. D'une autre manière particulière, la présente invention concerne une composition pharmaceutique comprend au moins un acide nucléique comprenant une séquence capable de s'hybrider spécifiquement avec un gène ou un ARNm codant pour une kinésine interagissant avec le complexe adaptateur AP-I, en particulier Kifl 13 A, et de diminuer ou supprimer l'expression de cette protéine, pour le traitement de troubles pigmentaires.
La présente invention concerne également l'utilisation d'une composition pharmaceutique selon l'invention, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement ou à la prévention d'un trouble pigmentaire. La présente invention a également pour objet un procédé cosmétique ou pharmaceutique de dépigmentation et/ou de blanchiment de la peau humaine ou de traitement ou prévention d'un trouble pigmentaire consistant à appliquer sur la peau à dépigmenter une composition cosmétique ou pharmaceutique selon l'invention.
Les troubles pigmentaires à traiter peuvent être des hyperpigmentations ou des hypopigmentations. Dans le cas des hyperpigmentations locales, celles-ci peuvent résulter de certains troubles mélanocytaires et se caractérisent par une accumulation de mélanine. Le trouble pigmentaire à traiter peut être une hyperpigmentation telle que par exemple un mélasma idiopathique (non associé à une grossesse ou à la prise de contraceptifs oraux), un mélasma (aussi appelé chloasma ou masque de grossesse), un lentigo actinique (aussi appelé lentigo sénile, tâche sénile, tâche de vieillesse ou lentigo solaire), des séquelles pigmentaires d'acné, des pigmentations post-inflammatoires dues à une abrasion, une brûlure, une cicatrice, une dermatose et/ou une allergie de contact, des pigmentations dues à la dermite des prés, des pigmentations dues au lierre vénéneux (aussi appelé plante Poison Ivy), des éphélides (aussi appelés tâches de rousseur), des naevus tels que le naevus géant congénital, le naevus de Becker ou le naevus de Spitz. Les hyperpigmentations peuvent être des hyperpigmentations à déterminisme génétique ou des hyperpigmentations d'origine métabolique ou médicamenteuse. Elles peuvent être d'origine accidentelle et causées par exemple par une photosensibilisation ou une cicatrisation post-lésionnelle. Le trouble pigmentaire peut également se traduire par une hypopigmentation, tels que le vitiligo. Dans un mode de réalisation préférée, le trouble pigmentaire à traiter est une hyperpigmentation. De préférence, l'hyperpigmentation est un mélasma, un mélasma idiopathique ou un lentigo actinique.
Dans le cas d'une hyperpigmentation, le traitement a pour but de dépigmenter les zones hyperpigmentées et ainsi de diminuer ou de supprimer les symptômes visibles associés à ces troubles pigmentaires spécifiques.
Dans le cas d'une hypopigmentation, le traitement peut avoir pour but d'uniformiser la couleur de la peau en dépigmentant les zones pigmentées résiduelles.
La prévention a pour but, dans le cas d'une hyperpigmentation, d'éviter l'apparition de zones hyperpigmentées et, dans le cas d'une hypopigmentation, d'éviter l'apparition de disparités de couleur de peau.
Les exemples qui suivent sont présentés dans un but illustratif et non limitatif.
Exemples Matériels et Méthodes
Cellules, Anticorps et Réactifs
La lignée mélanocytaire humaine MNT-I est maintenue en culture comme décrit précédemment (Raposo et al, 2001).
Les anticorps utilisés dans cet exemple sont listés ci-dessous :
- Anticorps polyclonal de lapin anti β-tubuline (ab6046, Abcam®) ;
- Anticorps polyclonal de lapin anti-μlA (sous-unité de AP-I) (Dr. Linton Traub, Université de Pittsburg) ;
- Anticorps monoclonal de souris anti-γ-adaptine (clone 100/3 ; SIGMA®) ; - Anticorps monoclonal de souris anti-Tyrpl (Tyrosinase related protein-1) issu du surnageant de culture TA99 (Mel-5) (American Type Culture Collection, Manassas, VA) ;
- Anticorps polyclonal anti-tyrosinase (abl5175, Abcam®) ;
- Anticorps monoclonal anti-Pmel 17 (HMB50, Labvision®) ; - Anticorps polyclonal de lapin anti-Kifl3A (Bethyl Laboratories, Montgomery, US) ;
- Anticorps polyclonal de lapin et monoclonal de souris Anti-Peroxidase de raifort (HRP) (Jackson Immunoreserach®); et
- Anticorps de lapin Anti- souris couplé au Texas Red (Invitrogen®).
Les réactifs autres que les anticorps utilisés dans cet exemple sont listés ci-dessous :
- Protéine-A couplée à des particules d'or colloïdal (Centre de microscopie cellulaire de l'université d'Utrecht, Pays-Bas) ;
- Protéine G Agarose (Invitrogen®, référence catalogue 15920-010)
- Kit pour western blot contenant des gels NuPAGE Bis-Tris 4-12%, des gels NuPAGE 3- 8% Tris- Acétate, du tampon MES-SDS de migration et de transfert (Invitrogen®) ;
- Kit ECL « western blotting détection reagents » (Amersham®) pour la révélation de l'activité de la HRP sur membranes PVDF (Millipore®) ;
- Paraformaldéhyde (PFA) et sérum albumine bovine (BSA) (Sigma®) ;
- Saponine (Carlo Erba Réactifs®) ; et - Milieu de montage des lamelles de microscopie de fluorescence « ProLong® GoId Antifade Reagent » avec DAPI (Invitrogen®).
Séquences des ARN interférents
SEQ ID N0I ARNsi Kifl3A sens GGCGGGUAGCGAAAGAGUA dTdT
SEQ ID N°2 ARNsi Kifl3A anti-sens UACUCUUUCGCUACCCGCC dAdG
SEQ ID N°5 ARNsi AP-I μlA sens GGCAUCAAGUAUCGGAAGA dTdT
SEQ ID N°6 ARNsi AP-I μlA anti-sens UCUUCCGAUACUUGAUGCC dTdT
SEQ ID N°7 ARNsi AP-3 (β3A) sens GGCUGAUCUUGAAGGUUUA dTdT
SEQ ID N°8 ARNsi AP-3 (β3A) anti-sens UAAACCUUCAAGAUCAGCC dTdT
SEQ ID N°9 ARNsi contrôle sens UUCUCCGAACGUGUCACGU dTdT SEQ ID N0IO ARNsi contrôle anti-sens ACGUGACACGUUCGGAGAA dTdT SEQ ID N° 19 ARNsi γ-adaptine sens ACCGAAUUAAGAAAGUGGU dTdT
SEQ ID N°20 ARNsi γ-adaptine anti-sens ACCACUUUCUUAAUUCGGU dTdT
Interférence par V ARN
IxIO6 cellules ont été ensemencées dans une boîte de culture de 10 cm pendant deux jours, puis lavées deux fois avec du PBS préchauffé avant d'être mises en culture dans 4 mL de milieu OptiMem (Invitrogen®) dans une étuve pendant 40 min.
Une solution A a été obtenue en mélangeant 10 μL d'ARNsi à 20 μM avec 840 μL de milieu OptiMem et en incubant ce mélange durant 20 min à température ambiante. Une solution B a été obtenue en mélangeant 50 μL d'Oligofectamine™ (Invitrogen®) avec 150 μL de milieu OptiMem et en incubant ce mélange durant 20 min à température ambiante.
Les solutions A et B ont ensuite été mélangées et laissées 20 min à température ambiante.
Puis, ce mélange a été déposé sur les cellules qui ont été conservées à l'étuve durant 4 heures. 5 mL de milieu complet à 40 % de sérum de veau fœtal (SVF) ont ensuite été ajoutés sur les cellules. 24 heures plus tard, les cellules ont été récupérées et ensemencées dans des plaques de 6 puits avec une concentration de 1,5x105 cellules/puits. Ce même protocole a été répété le lendemain en adaptant les volumes.
Western-Blot
Suite à l'interférence par l'ARN, les cellules ont été lavées deux fois avec du PBS, puis incubées avec 200 μL de tampon de lyse (50 Mm Tris, 150 mM NaCl, 10 Mm EDTA, 1 % de Triton, 1 % d'inhibiteur de protéases, pH 8) par puits sur la glace pendant 15 min. Les cellules ont été ensuite grattées, centrifugées (15000 rpm, 4°C) et les surnageants ont été collectés. La quantité de protéines totales a été mesurée par le kit « BCA Protein Assay » (Pierce®). 10 μg de chaque surnageant ont été déposés sur un gel et la migration a eu lieu pendant 35 min à 200 V. Le gel a ensuite été transféré sur une membrane PVDF (Millipore®) pendant 1 heure à 30 V. Puis, la membrane a été saturée en tampon PBS / 0,1% Tween / 5 % BSA durant 1 heure à température ambiante, incubée 45 min avec l'anticorps primaire dilué dans du tampon WB (PBS / 0,1 % Tween), rincée 3 fois 10 min avec du tampon WB, incubée 45 min avec l'anticorps secondaire correspondant couplé à la HRP dilué dans du tampon WB et rincée 3 fois 10 min dans du tampon WB. L'activité HRP a ensuite été révélée à l'aide du kit ECL « western blotting détection reagents » (Amersham®). Microscopie de fluorescence
Les cellules préalablement ensemencées sur lamelles de verre (0,5x105 cellules/lamelle) ont été lavées deux fois avec du PBS préchauffé puis fixées durant 10 minutes dans une solution de PBS / 4% PFA. Après deux lavages à température ambiante avec du PBS, l'excès de PFA n'ayant pas réagi a été neutralisé par un traitement avec 50 mM Glycine / PBS pendant 10 minutes. Les sites de fixation non spécifiques ont ensuite été saturés par deux lavages de 3 minutes avec du PBS additionné de 2 mg/mL de BSA et les cellules ont été perméabilisées avec un tampon de perméabilisation (PBS / 2% BSA / 0,05% Saponine). Les lamelles ont alors été mises en contact avec 25 μL d'anticorps primaire dilué dans du tampon de perméabilisation pendant 45 minutes à température ambiante et l'excès d'anticorps a été éliminé par deux lavages de 3 minutes avec le tampon de perméabilisation. Les lamelles ont ensuite été incubées 45 minutes à température ambiante avec 25 μl d'anticorps secondaire dilué dans du tampon de perméabilisation. Après deux lavages de 3 minutes avec le tampon de perméabilisation suivis d'un lavage avec du PBS, les lamelles ont été montées sur des lames de microscope avec 15 μL de milieu de montage (ProLong® GoId Antifade Reagent avec DAPI, Invitrogen®) permettant d'atténuer la perte de fluorescence lors de l'observation.
Immunoprécipitation
Les cellules mélanocytaires ont été cultivées en flacons de 75cm2 jusqu'à confluence, puis lysées en tampon de lyse (50 Mm Tris, 150 mM NaCl, 10 Mm EDTA, 1 % de Triton, 1 % d'inhibiteur de protéases, pH 7,3) pendant 20 min à 4°c. Les cellules ont été ensuite grattées et centrifugées (15000 rpm, 4°C) et les surnageants ont été collectés. Les billes couplées à la protéine G agarose ont été lavées dans le tampon de lyse et 20 μL de ces billes ont été incubées avec les lysats pendant 1 h à 4°c sous rotation. Les lysats ont ensuite été centrifugés à 4000 rpm et les surnageants ont été collectés puis incubés avec des billes lavées qui avaient été préalablement incubées pendant 1 h avec 1 μg d'anticorps de lapin (contrôle Kifl3A) ou de souris anti-CD9 (contrôle γ-adaptine d'AP-1). L 'immunoprécipitation est ensuite réalisée en centrifugeant les lysats à 4000 rpm et en mettant en contact les surnageants avec 20 μL de billes lavées préalablement incubées pendant 2 h à 4°c sous rotation avec 1 μg d'anticorps de lapin (contrôle Kifl3a), anticorps anti-Kifl3a (Kifl3a), anticorps de souris anti-CD9 (contrôle γ-adaptine d'AP-1) ou d'anticorps de souris anti-γ-adaptine (γ-adaptine d'AP-1). Les lysats ont ensuite été centrifugés à 4000 rpm, les surnageants collectés et déposés sur gel pour une analyse par Western-Blot.
Microscopie électronique
Les cellules mélanocytaires préalablement ensemencées dans des boîtes à 6 puits et traitées avec des ARNsi « contrôle » et ARNsi-Kifl3A ou ARNsi-μlA ont été fixées soit avec un mélange de PFA 2% et de glutaraldéhyde 2% (microscopie conventionelle) soit un mélange de PFA 2% et de glutaraldéhyde 0,5% (immunomarquages) dans un tampon phosphate 0.2 M pH 7,4 pendant 4 heures à température ambiante.
Microscopie conventionnelle : Après plusieurs lavages dans un tampon cacodylate de sodium 0,2M, les cellules ont été fixées avec une solution d'acide osmique 2% (OsO4) pendant 45 min. Après rinçage avec de l'eau distillée, les cellules ont été déshydratées avec des concentrations croissantes d'éthanol puis enrobées dans de la résine Epon 812. Après polymérisation pendant 48 heures à 600C, des coupes ultrafines ont été réalisées, contrastées avec de l'acétate d'uranyl 4% pendant 5 min et observées au microscope électronique (Phillips CM120, FEI Company®). La prise d'images a été effectuée avec une caméra KeenView (SIS®, Allemagne). Immunomarquages : Après plusieurs lavages dans un tampon phosphate 0,2 M contenant de la glycine 0.1 M, les cellules ont été préparées pour l'ultracryomicrotomie comme décrit précédemment dans le document Raposo et al. (1997).
En bref, les culots de cellules ont, tout d'abord, été enrobés dans de la gélatine à 10%. Après solidification à 4°C, des blocs de 1 mm3 ont été découpés et infusés dans du sucrose 2,3M durant 2h. Les blocs de cellules ont été congelés sur leur support et des coupes congelées ultrafines ont été réalisées avec un ultracryo micro tome (Leica®, Autriche). Les coupes récupérées sur des grilles de microscopie électronique, ont été immunomarquées avec des anticorps anti-Tyrpl et anti-Pmell7. Ces anticorps ont été visualisés avec de la protéine A couplée à des particules d'or colloïdal. Les coupes ont été contrastées et enrobées dans un mélange d'acétate d'uranyl et de méthylcellulose avant observation au microscope électronique (Phillips CM120, FEI Company®). La prise d'images a été effectuée avec une caméra KeenView (SIS®, Allemagne). Quantification de la Mélanine
Après l'interférence par l'ARN, les cellules ont été lavées deux fois dans du PBS et incubées avec 150 μL de tampon Mélanine (50 mM Tris, 2 mM EDTA, 150 Mm NaCl, 1% d'inhibiteur de protéases, pH 7,4). Elles ont ensuite été grattées et regroupées en une seule fraction avant d'être soniquées pendant 20 s à intensité maximale. lOμL ont ensuite été prélevés pour quantifier les protéines (avec le kit BCA Protein Assay, Pierce) et 200 μg de protéines ont été prélevés et centrifugés à 15000 rpm durant 15 min à 4°C. Le surnageant a été éliminé et le culot lavé avec 500 μL d'une solution éthanol / éther (1 :1). Enfin, le culot a été solubilisé avec 230 μL d'une solution 2 M NaOH / 20% DMSO à 55°C. Une fois solubilisé, 200μL ont été prélevés afin de mesurer la densité optique à 492 nm.
Quantification des cellules blanches
La quantification a été réalisée sur cellules préparées pour l'immuno fluorescence grâce à un microscope à épifluorescence. Les cellules ont été observées en contraste de phase et la présence (noir) ou l'absence (blanc) de mélanosomes matures pigmentés a été quantifiée.
Exemple 1
Des expériences de Western-blot sur des lysats cellulaires de mélanocytes transfectés avec un ARNsi-AP-1 (μlA), un ARNsi-Kifl3A et un ARNsi-AP-3 (β3A) ont permis de démontrer que l'expression de Kifl3A n'est pas perturbée par l'inactivation de AP-I ou AP-3 (Figure IA). En revanche, dans les mélanocytes transfectés avec l'ARNsi-Kifl3A, l'expression de Kifl3A a été totalement supprimée (figures IA et IC) alors que l'expression de la sous-unité μlA d'AP-1 n'a pas été perturbée. Ces résultats montrent donc l'efficacité et la spécificité des ARNsi pour l'inactivation de cette protéine dans les mélanocytes.
De plus, des expériences d'immunoprécipitations menées sur des mélanocytes ont permis de démontrer que la protéine Kifl3A co-précipite avec la sous-unité γ-adaptine d'AP-1 et donc que l'interaction entre Kifl3A et AP-I observée précédemment dans des lignées cellulaires non mélanocytaires (Nakagawa et al., 2000) existe également dans les lignées mélanocytaires (Figure IB).
La quantité relative de mélanine dans les mélanocytes transfectés avec l'ARNsi- Kifl3A par rapport à la quantité présente dans les cellules transfectées avec l'ARNsi- contrôle a été déterminé par mesure de la densité optique du lysat cellulaire à une longueur d'onde de 492 nm (Figure 2). Les résultats présentés sur la figure 2 montrent que l'utilisation d'ARNsi-Kifl3A a permis d'obtenir une diminution de la quantité de mélanine synthétisée de l'ordre de 40% par rapport aux cellules transfectées avec l'ARNsi-contrôle.
Des observations en microcopie électronique ont été effectuées sur des mélanocytes transfectées avec de l'ARNsi-Kifl3A ou de l'ARNsi-contrôle soit en microscopie électronique conventionnelle (Figure 3) soit avec un immunomarquage avec des anticorps anti-Tyrpl (données non montrées).
Les expériences de microscopie électronique conventionnelle ont permis de démontrer que les mélanocytes transfectés avec l'ARNsi-contrôle contenaient de nombreux mélanosomes présentant d'importantes quantités de mélanine (en noir sur la figure 3). En revanche, les mélanocytes transfectés avec lΑRNsi-Kifl3A ne contenaient pas ou peu de pigments.
Dans les cellules transfectées avec l'ARNsi-contrôle, l' immunomarquage a révélé de nombreux mélanosomes matures de stade III ou IV concentrant des protéines Tyrpl . En revanche, les cellules transfectées avec l'ARNsi-Kifl3A, aucun mélanosome mature n'a été visible et l'enzyme Tyrpl était dispersée dans structures vésiculaires aux caractéristiques d'endosomes.
Ainsi, l'inactivation de la kinésine Kifl3A perturbe le transfert des enzymes de la mélanogenèse dans les pré-mélanosomes et bloque ainsi la maturation de ces organites qui sont, dès lors, incapables d'assurer la synthèse de mélanine
Conclusion
Les résultats obtenus par ces expériences ont permis tout d'abord d'observer que l'utilisation d'ARNsi spécifique permet d'inactiver la kinésine Kifl3A dans les mélanocytes.
Les résultats obtenus démontrent également que l'utilisation d'un ARNsi spécifique de la kinésine Kifl3A permet de diminuer de manière significative :
- la quantité de mélanine produite dans les mélanocytes,
- la quantité de mélanocytes contenant des mélanosomes matures pigmentés et - la proportion de mélanosomes matures (stade III ou IV) dans les mélanocytes.
Par ces expériences, les inventeurs ont donc démontré que les ARNsi spécifiques d'une kinésine interagissant avec AP-I, et en particulier de la kinésine Kifl3A, ont un effet significatif sur la production de pigments mélaniques et peuvent donc être efficacement utilisés comme agents dépigmentants. Exemple 2
Les expériences de Western blot sur des mélanocytes transfectés (Figure 4) ont permis de démontrer que l'expression de la sous-unité μlA de AP-I est fortement diminuée dans les mélanocytes transfectés avec l'ARNsi-μlA en comparaison de ceux transfectés avec l'ARNsi-contrôle. Cette baisse d'expression a entraîné également une diminution de l'expression d'une autre sous unité de AP-I, la γ-adaptine, avec pour conséquence de déstabiliser le complexe adaptateur AP-I. Ces résultats confirment donc que l'inactivation d'une seule sous-unité de AP-I suffit pour déstabiliser complètement ce complexe. Il a, de plus, été observé de manière surprenant que dans les cellules transfectés avec l'ARNsi-μlA et donc déficientes en AP-I, l'expression de la tyrosinase, enzyme clef de la mélanogenèse a été fortement diminuée, de même que l'expression de l'enzyme Tyrp-1 bien que de façon moins importante.
Ces résultats démontrent donc que l'inactivation d'une seule sous-unité de AP-I suffit pour déstabiliser et inactiver le complexe adaptateur mais perturbe également l'expression des principales enzymes de la mélanogenèse.
La quantification des cellules blanches, c'est-à-dire des cellules ne contenant pas de mélanosome mature pigmenté, parmi les mélanocytes transfectés, a été effectuée par comptage direct en microscopie optique (contraste de phase) (figures 5A et 5B) et le pourcentage de mélanine dans ces cellules par rapport à la quantité présente dans les cellules transfectées avec l'ARNsi-contrôle a été déterminé par mesure de la densité optique du lysat cellulaire à une longueur d'onde de 492 nm (Figure 6). Les figures 5A, 5B et 6 présentent les résultats obtenus sur les mélanocytes transfectés avec un ARNsi- contrôle, un ARNsi-lμA, un ARNsi-γ-adaptine ou une combinaison ARNsi-lμA et ARNsi-γ-adaptine. Les résultats présentés sur les figures 5A et 5B montrent que l'utilisation d'ARNsi-lμA, d' ARNsi-γ-adaptine (Figure 5A) ou des deux simultanément (Figure 5B) a permis d'augmenter de manière significative la proportion de cellules blanches parmi les mélanocytes transfectés, par comparaison avec ceux transfectés avec l'ARNsi-contrôle. Cette augmentation a atteint même 24% pour les cellules transfectées avec l'ARNsi-lμA seul. Ces résultats ont été confirmés par ceux présentés sur la figure 6 où il apparaît que la transfection d'ARNsi-lμA, d' ARNsi-γ-adaptine ou des deux simultanément a permis de diminuer notablement la quantité de mélanine synthétisée dans les cellules par comparaison avec celles tranfectées avec l'ARNsi-contrôle. Cette diminution a pu atteindre plus de 40% dans les cellules tranfectées avec l'ARNsi-lμA. Ces résultats démontrent donc que l'inactivation d'une ou plusieurs sous-unités du complexe AP-I par un ou plusieurs ARNsi permet de diminuer de manière significative la synthèse de mélanine dans les mélanocytes.
Des observations en microcopie électronique ont été effectuées sur des mélanocytes transfectés avec de l'ARNsi-μlA ou de l'ARNsi-contrôle soit en microscopie conventionnelle (Figure 7) soit avec un immunomarquage avec des anticorps anti-Tyrpl
(données non montrées).
Les expériences de microscopie électronique conventionnelle ont permis de démontrer que les mélanocytes transfectés avec l'ARNsi-contrôle contenaient de nombreux mélanosomes présentant d'importantes quantités de mélanine (en noir sur la figure 7). En revanche, les mélanocytes transfectés avec l'ARNsi-μlA ne contenaient pas ou peu de pigments.
Dans les cellules transfectées avec l'ARNsi-contrôle, l' immunomarquage a révélé de nombreux mélanosomes matures de stade III ou IV concentrant des protéines Tyrpl . En revanche, les cellules transfectées avec l'ARNsi-μlA, dans lesquelles le complexe adaptateur AP-I a donc été inactivé, ne contenaient que des mélanosomes immatures de stade I ou IL Aucun mélanosome mature n'a été visible dans ces cellules. L'enzyme Tyrpl était toujours détectée par l'anticorps mais n'a été présente que dans des structures vésiculaires avec des caractéristiques d'endosomes et dépourvues de pigment. Ces observations indiquent donc que l'inactivation du complexe AP-I perturbe le transfert des enzymes de la mélanogenèse dans les pré-mélanosomes et bloque ainsi la maturation de ces organites qui sont, dès lors, incapables d'assurer la synthèse de mélanine.
Conclusion
Les résultats obtenus par ces expériences ont permis tout d'abord d'observer que l'utilisation d' ARNsi spécifique permet d'inactiver le complexe AP-I dans les mélanocytes. Il a de plus été démontré que l'inactivation d'une seule sous-unité du complexe adaptateur AP-I suffit pour déstabiliser et donc inactiver ledit complexe. Les résultats obtenus démontrent également que l'utilisation d'un ARNsi spécifique d'une sous-unité du complexe adaptateur AP-I permet de diminuer de manière significative :
- la quantité de mélanine produite dans les mélanocytes,
- la quantité de mélanocytes contenant des mélanosomes matures pigmentés et
- la proportion de mélanosomes matures (stade III ou IV) dans les mélanocytes. Par ces expériences, les inventeurs ont donc démontré que les ARNsi spécifiques d'une sous-unité du complexe adaptateur AP-I ont un effet significatif sur la production de pigments mélaniques et peuvent donc être efficacement utilisés comme agents dépigmentants.
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Claims

Revendications
1. Composition pharmaceutique ou cosmétique comprenant au moins un inhibiteur de la kinésine Kifl3A, un inhibiteur d'une sous-unité du complexe adaptateur AP-I, et/ou un inhibiteur de l'interaction entre une sous-unité du complexe adaptateur AP-I ou le complexe AP-I et la kinésine Kifl3A.
2. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que ledit inhibiteur est un inhibiteur de la kinésine Kifl3A.
3. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que ledit inhibiteur est un inhibiteur d'une sous-unité du complexe adaptateur AP-I .
4. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que ledit inhibiteur est un inhibiteur de l'interaction entre une sous-unité du complexe adaptateur AP-I ou le complexe AP-I et la kinésine Kifl3A.
5. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que ledit inhibiteur est une petite molécule, un aptamère, un anticorps, un acide nucléique ou un peptide dominant négatif.
6. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que ledit inhibiteur est un aptamère, un anticorps, un acide nucléique ou un peptide dominant négatif.
7. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que ledit inhibiteur est un acide nucléique comprenant une séquence capable de s'hybrider spécifiquement avec un gène ou un ARNm codant pour une sous-unité du complexe adaptateur AP-I ou pour la kinésine Kifl3A et de diminuer ou supprimer l'expression de ladite protéine.
8. Composition selon la revendication 7, caractérisée en ce que ledit acide nucléique est un oligonucléotide anti-sens ou un ARNi, de préférence un ARNsi.
9. Composition selon la revendication 5 à 8, caractérisée en ce que ledit acide nucléique présente une séquence de 15 à 50 nucléotides, de préférence de 15 à 30 nucléotides.
10. Composition selon l'une quelconque des revendications 5 à 9, caractérisée en ce que ledit acide nucléique comprend une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID No. 1 à 6 et 11 à 24.
11. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisée en ce 5 qu'elle comporte en outre une ou plusieurs autres substances actives, de préférence choisies parmi le groupe composé par l'acide ellagique ; l'arbutine ; le résorcinol ; la vitamine C ; le pantothénate ; l'acide kojique ; des extraits placentaires ; des molécules interférant directement ou indirectement avec la mélanotropine (MSH), son récepteur ou l'hormone adrénocorticotropique (ACTH) ; des polyols tels que la glycérine, le
10 glycol ou le propylène glycol ; des vitamines ; des agents kératolytiques et/ou desquamants tels que l'acide salicylique ; des alpha- hydroxyacides tels que l'acide lactique ou l'acide malique; l'acide ascorbique ; l'acide rétinoïque ; le rétinaldéhyde ; le rétinol ; le palmitate, le propionate ou l'acétate ; des agents anti-glycation et/ou antioxydants tels que le tocophérol, la thiotaurine, l'hypotaurine, l'aminoguanidine, le
15 pyrophosphate de thiamine, la pyridoxamine, la lysine, l'histidine, l'arginine, la phénylalanine, la pyridoxine, l'adénosine triphosphate ; des agents anti- inflammatoires; des agents apaisants et leurs mélanges ; des filtres solaires chimiques ou physiques et des acides désoxyribonucléiques ou ribonucléiques, et les dérivés de ceux-ci.
20 12. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, caractérisée en ce qu'elle est adaptée pour une administration par voie topique.
13. Utilisation d'une composition pharmaceutique selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement ou à la prévention d'un trouble pigmentaire.
25 14. Utilisation selon la revendication 13, caractérisée en ce que le trouble pigmentaire est une hyperpigmentation.
15. Utilisation d'une composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, comme agent cosmétique.
16. Utilisation selon la revendication 15, caractérisée en ce que ledit agent cosmétique est 30 un agent dépigmentant.
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