CN1345328A - 将核苷酸从固相载体上切下 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种将核酸分子从它结合的固相载体上切割下来的方法,其中,在所述核酸分子的预定位点上掺入了非常规核苷酸,所述方法包括在所述非常规核苷酸位点选择性地切断所述核酸分子。该核酸分子可以是含有核酸(核苷酸序列)和另一有不同化学性质的分子组分的嵌合分子。本发明在这方面还提供了一种包含核苷酸接头序列的嵌合分子(或结构),该序列包含在预定位点上的可选择性切断的非常规核苷酸,该嵌合分子与可能是亲和结合基团或报道基团的官能团相连。本发明能用于许多应用中,例如分子生物方法如核酸合成、延伸和测序,核酸分离或基于亲和力的分离或试验中。

Description

将核苷酸从固相载体上切下
本发明涉及从固相载体上切下核苷酸和含有核苷酸的分子或结构。
目前，在生物化学/生物技术以及相关领域里，在许多共同采用的步骤中常常需要将生物的或化学物质(如分子)结合到固相载体上(即将其固定)，随后又需要将其从载体上切割下来。值得注意的是，发现这中可逆的固定在本领域所知的许多分离、纯化和切割步骤中都要使用，例如细胞的分离(如免疫磁性分离法)、亲和层析等。固定，具体而言寡核苷酸或核苷酸的固定也常用于许多分子生物过程和常用的技术中，如测序、体外延伸、cDNA的制备、模板的制备、基于DNA的试验、诱变过程等等，还有核苷酸的纯化，也采取在固相上进行。这可能便于操作，增加样品产量，使自动化成为可能等，并且在固相上进行操作的能力常被认为是有益的。
但是，固定会引起它本身的问题。因而，许多现今使用的固定系统依靠一对亲和结合伙伴之间的结合，以实现所需物质载体的连接。例如，这可基于抗体-抗原结合对，如固定化抗体与细胞表面抗原或者需要固定的蛋白或其他分子的结合。在分子生物学中，核苷酸或寡核苷酸的结合常常通过生物素-链酶亲和素(或亲和素)连接，即固定的蛋白(链酶亲和素或亲和素)与生物素化分子(如生物素化的寡核苷酸)的结合而实现。
这些连接可能难于逆转(断裂)，导致结合的分子难于被释放。例如，这些连接之间的断裂可能需要苛刻的条件如高pH或高盐条件，和/或高温，这可能对结合的分子有害。
可用于亲和结合的其他形式的连接/结合(如基于共价结合的连接)也可能难于断裂(如核酸结合到与固相载体共价结合的固定化寡核苷酸捕捉探针上，不易于从载体上再切割下来)。
常用的现有固定化系统另一个缺点是，被固定分子的切割常导致一部分“固定连接物”仍旧与该分子连接，如结合伙伴或其一部分(例如生物素)或连接臂的一部分。这会妨碍被固定分子的后续处理或下游加工，如核酸的克隆或其他操作，或者细胞的生存活性研究、蛋白构像的研究、进一步纯化等等。
因此，本领域仍需要改进固定的方法和接下来的生物或化学物质的释放方法。本发明寻求满足这种需要。
因此发展了一种固定方法，该方法的基础包括被固定的分子，即含有一选择性切割位点的核苷酸序列，该位点由一个通常不存在于该核苷酸序列中的核苷酸提供，用对该核苷酸有特异性的酶不难将该位点选择性地切断。通过在该特异性位点选择性地切断此核苷酸序列，切割固定的分子可容易地实现。因而，这个新颖的方法可使核苷酸或含有核苷酸的分子能在准确的位点以可预知的方式有效地从固相载体上切割下来。
由于该切割性能依赖于核苷酸的存在，本发明的新颖方法特别适用于核酸(如任何核苷酸序列)的固定和核酸/核苷酸序列处理和制备过程。但是，本方法还可以用于含有能掺入这样一个可解切割位点的核苷酸的任何物质或分子，如其他与核酸偶联的蛋白或有机分子。
一方面，本发明因此提供一种从核酸分子所结合的固相载体上将其切割下来的方法，其中将一个非常规的核苷酸掺入所述核酸分子的预定位点，所述方法包括在所述非常规核苷酸位点选择性切下所述核酸分子。
核酸分子可以是任何核苷酸序列(不论是核糖核酸或是脱氧核糖核酸序列，即DNA或RNA，或者它们的任何修饰)，或者是任何含有或掺有核苷酸序列的分子。因而这些分子不仅包括那些单独由核酸组成的分子，还包括那些包含核酸组分和其他组分(如蛋白或肽等其他分子组分)的嵌合分子，或者另外一些有机分子、标记物、伙伴(即一对亲和结合伙伴的其中一个)、酶底物等如任何其他的分子或生物或化学物质。
术语“核酸分子”包括含有核酸(核苷酸序列)的结构和其他具有与对核酸分子不同化学性质的的分子组分(如蛋白、脂肪、碳水化合物、生物小分子、无机分子、放射性标记等)。
术语“非常规核苷酸”指通常不加到核酸分子中的核苷酸，即在给定的核苷酸序列(核酸分子)范围中，该核苷酸对于该序列不是天然的。因而，例如，由于尿嘧啶碱基(本文用“U”表示)通常不出现在DNA中而在RNA中，因此含有尿嘧啶的核苷酸是非常规的核苷酸。同样，在DNA序列中，含有核糖的核苷酸是非常规核苷酸(相反，在RNA中脱氧核糖核苷酸是非常规的)。其他非常规核苷酸是通常不是天然的修饰的核苷酸，例如，化学衍生的核苷酸。因而，在DNA核苷酸序列中，一个非常规核苷酸将是除A、T、C、或G之外的核苷酸(但A、T、C或G的修饰包括在非常规核苷酸中)，在RNA序列中，非常规核苷酸将是除A、U、C或G之外的核苷酸(但同样也包括它们的修饰)。
因此，非常规核苷酸包括那些具有“非常规”碱基的核苷酸，这些碱基可能是常规碱基(DNA的A、T、C或G；RNA的A、U、C或G)的修饰、衍生物或类似物。另外，也包括非天然(有意地修饰)核苷酸、天然形式的核苷酸。例如，尿嘧啶和次黄嘌呤是天然的碱基，但出于本发明的需要，当它们相应的核苷酸加入到DNA中时，这些核苷酸是非常规核苷酸。
“非天然”修饰的核苷酸包括烷基化的核苷酸和烷基羟基化修饰的核苷酸，或者其他的化学修饰物或衍生物。代表性的例子包括N-7-甲基鸟嘌呤、8-氧代鸟嘌呤、脱氧尿苷、脱氧肌苷、脱氧5，6-二羟基硫胺(从OsO4处理的DNA得到)、5′，6′-二羟素(5′，6′-dihydroxythine)、脱氧3′-甲基腺苷和3′-甲基腺苷。其他非常规核苷酸可包括在损伤DNA中所见的其他碱基，例如，开环嘧啶的衍生物和其他氧化产物(见如Sancer和Sancar，(1988)Annu.Rev.Biochem.，57，29-67)。
掺入的非常规核苷酸向其掺入的核酸分子提供了一个选择性切割位点。因此，该非常规核苷酸是可以加入到核苷酸序列上的核苷酸，例如能参与聚合酶反应的核苷酸，并且该核苷酸能与天然(通常出现的)核苷酸特异性地配对并能被选择性地切割。
术语“选择性切割”或“选择性可切割”等指核酸分子可特异性地在非常规核苷酸的位点而非其他位点上被切割。因此，切割可以是“定向的”(directed)，或换句话说，受控制的切割可发生在一个选定的位点上。一以这样的方式可将一个或多个这样的选择性位点掺入，根据选择，可将一个或超过一个的非常规核苷酸掺入(核酸分子)。
但是，可以理解，在生物系统中，不能一直保证切割的绝对特异性，因此，应允许该系统中有一些“容忍性”。在非常规核苷酸位点之外的位点发生的微量或可忽略的非特异性切割是可以容忍。所需的是切割主要地仅发生在非常规核苷酸位点。
这些选择性切割可以通过使用对具体非常规核苷酸有特异性的酶而实现。(术语“特异性”在本文中指酶和它们的相应底物之间的关系，反过来说，该底物被相应的酶所识别)。所需的是酶识别非常规核苷酸而不是其他核苷酸(即在核酸分子中存在的常规核苷酸)，并以可区别方式在非常规核苷酸位点切割。
这样的特异性酶通常可以是对特殊的碱基或特殊的碱基组具有特异性的DNA糖基化酶。存在只能识别一种碱基或特殊的碱基组并在其位点起作用的糖基化酶。这样的酶被认为参与了DNA碱基切除修复过程，并能识别和区分正常的和不正确的(即不正确碱基配对)或缺损(损伤)的碱基。DNA糖基化酶通过断裂N-糖苷键将所识别的具体碱基从DNA的脱氧核糖-磷酸骨架上切割下来而起作用。此反应产生的脱碱基位点(脱嘌呤/脱嘧啶)不稳定，主要在高pH和高温中易于解离。然而，已有获得脱碱基位点的许多切割方法，包括那些使用化学试剂或酶来断裂核苷酸序列的磷酸二酯键的方法。这些将在下面进一步讨论。这提供了一种本发明的选择性切割的机理。
已研究过许多这样的酶，并在文献中有所描述到(见Cleaver和Layher，(1995)Cell，80，825-827；和Sancar和Sancar，supra)。任何这样的酶及它们相应的底物非常规核苷酸可以用于本发明。
但是，本发明并不限于使用酶来获得选择性切割，还可以采用任何合适的切割机制或系统。例如，在一DNA核苷酸序列中加入一个核糖核苷酸对诸如高pH和某离子(如Mg2+和Mn2+)等的条件敏感的话，就可提供用这些简单的处理进行选择性裂解的位点，而只由脱氧核糖核苷酸(如dT、C、G、A、U)组成的序列不受这种处理的影响。因此，核糖而不是脱氧核糖的存在提供了在一个位置选择性裂解的方法。下面的实施例3描述了这样一种裂解系统在cDNA合成方法中的应用。
在本发明的较佳实施例中，核酸分子是DNA分子，非常规核苷酸是U，选择性裂解是使用尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG，也称为尿嘧啶N-糖基化酶或UNG)来实现。这可以是一个天然酶或是一种修饰酶，以及天然和修饰的多种UDG酶，这些在本领域中是熟知的，并在文献中有所描述(见如Cleaver和Layher，同上，和US-A-5035996；US-A-5536649和Longo等人，Gene(1990)，93，125-128，这些文献描述了UDG在控制PCR遗留物污染的应用，以及提供了UDG酶的来源；还有WO92/01814，该文描述了用其他的糖基化酶以及UDG和非常规核苷酸进行的PCR遗留物控制，该文还描述了不同UDG酶的范围及可用于本发明的酶的来源)。已知两种热稳定性(Koulis，A.等人，FEMS Microbiology Letters(1996，143，267-271；Kaboev，O.K.等人，Letters(1981)132(2)，337-340)和热不稳定性的形式(HKTM UNG，EpiCentre Technologies Inc.)。UDG可以市售得到，如从Amersham Life Sciences，UK，Boehringer Mannheim，Germane and EpiCentreTechnologies Inc.，USA得到。
具有所需特性的糖基化酶可以从天然来源中分离得到。例如，在低温下(如4℃)具有改进活性的酶可以选自冷环境中的生物体(如北极虾)。
已鉴定并克隆了糖基化酶基因(J.Biol.Chem.，1984，(259)：13723-13729[大肠杆菌]，和J.Boil.Chem.，1989，264：9911-9914[人])。其他可得到的糖基化酶也可代替UDG使用。它们包括：次黄嘌呤-DNA糖基化酶、3-甲基腺嘌呤-DNA糖基化酶I、3-甲基腺嘌呤-DNA糖基化酶II、羟基甲基尿嘧啶-DNA糖基化酶和氨甲基-嘧啶DNA糖基化酶。示范性的糖基化酶和相应的底物列于下表。
           DNA糖基化酶
酶                  DNA底物含有尿嘧啶-DNA糖基化酶    尿嘧啶Hx-DNA糖基化酶        次黄嘌呤(Hx)3-mA DNA糖基化酶I     3-甲基腺嘌呤(3-mA)3-mA DNA糖基化酶II    3-甲基腺嘌呤，7-甲基-鸟嘌呤或3-甲基鸟嘌呤FaPy DNA糖基化酶      氨甲基-嘧啶(FaPy)分子5，6-HTDNA糖基化酶    5，6-水合胸腺嘧啶(5，6-HT)分子Urea DNA糖基化酶      脲分子PD DNA糖基化酶       嘧啶二聚物(PD)5-HmU DNA糖基化酶    5-羟基甲基尿嘧啶(5-HmU)5-HmC DNA糖基化酶    5-羟基甲基胞嘧啶(5-HmC)
将非常规核苷酸掺入预定的位点和裂解。简单地说，掺入(及此后的裂解)的位点可以是预选的(或受控的或定向的)，这样裂解能够在核酸分子的准确位点和所需部位发生。可将非常规核苷酸掺到该核酸分子的指定位置。
如上所述，本发明方法可用于涉及核酸分子固定的方法中。
另一方面。本发明因此提供了一种可逆地固定核酸分子的方法，所述方法包括：
(a)将非常规核苷酸掺入所述核酸分子的预定位点上；
(b)使所述核酸分子结合于固相载体；然后
(c)在所述非常规核苷酸位点上选择性地裂解所述核酸分子。
选择性裂解步骤(c)导致核酸分子从载体上切割。
能理解步骤(a)和(b)可以按顺序或同时进行。因此例如，可将非常规核苷酸在核酸分子结合到载体上后掺到该核酸分子中，例如连接一核苷酸或含有非常规核苷酸的核苷酸序列。或者，如下面更详细的描述，在核酸分子与固相载体结合之前，通过固相合成、酶促或化学偶联或其他结合反应(如亲和结合)将非常规核苷酸掺入此核酸分子中。还如下面更详细的描述，某些方法可允许“结合”和“掺入”同时发生，例如使用含有非常规核苷酸的固定化引物序列通过引物延伸形成该核酸分子。
在本发明方法中，非常规核苷酸可以方便地作为多核苷酸或寡核苷酸序列的一部分而被导入或掺入到核酸分子中。
这个核苷酸序列可以看做是系链或者“接头序列”，它由核苷酸组成，并在一个或多个部位掺入了该非常规核苷酸，这些位点可以是邻接的或非邻接的。这个“接头序列”可以是4-100个核苷酸长度，例如，5-50和便利地为10-30或12-21，以及可以完全由非常规核苷酸组成，或者可根据选择，在不同部位包括一个或多个非常规核苷酸。
用于这方面的多核苷酸和寡核苷酸序列的合成方法在本领域中熟知的，并在文献中有所描述，而且任何已知的方法都可以使用。非常规核苷酸可以以任何方便的方法掺入到该接头中，例如，通过使用适当的核苷酸进行固相合成，或酶促反应，如用聚合酶将所提供的核苷酸掺入到接头中。或者非常规核苷酸可以用特异性的酶(如转移酶)将其掺入到接头中，例如，末端脱氧核苷转移酶能增加一个单核苷酸，如从相应的NTP(在此为UTP)前体上得到UMP。
同样，可以以已知的和在文献中描述的任何方便或理想的方式，将接头序列导入核酸分子，例如，通过连接反应，或者以模板导向的聚合酶催化链延伸反应的引物形式导入，其中，所述引物(即接头)被掺入链延伸反应产物中。换句话说，本发明的核酸分子可以是一种引物延伸产物。这将在下面进一步讨论。
将核酸分子偶联于其他分子的方法在本领域中也是熟知的，并将在下面作详细的讨论。
固相载体可以是任何熟知的载体或基质，这些载体或基质目前已被广泛用或提议使用于固定、分离等。它们可以采取颗粒、片、凝胶、过滤器、膜或微量滴定条带、试管或平板、纤维或毛细管的形式，也可方便地由聚合材料如琼脂糖、纤维素、海藻酸盐、聚四氟乙烯、乳胶或聚苯乙烯制得。生物芯片可以用作固相载体，以提供如文献中所述的微型试验系统(如Nilsson等人，Anal.Biochem.(1995)，224，400-408)。一般来说，颗粒性材料，尤其是珠子是较佳的，特别是聚合珠子，其广泛的范围在本领域中是周知的。为有助于操作和分离，磁性(“磁的”)珠子是较佳的。较佳的是，这些磁性颗粒是超顺磁性以避免剩磁以及随后的凝结(clump)，并且有利的是，这些磁性颗粒的优点是单个分散性可提供均一的动力学和分离。Sintef在EP-A-106873描述了这些超顺磁性、单分散性颗粒的制备。
Dynal AS(Oslo，Norway)出售的DYNABEADS型单分散性聚合超顺磁性珠特别适合用于本发明。
只要非常规核苷酸是能接近而被被切割的，可将核酸分子以任何便利的方法(如物理的或化学的方法)附着于或结合于固相载体。这些方法可以包括，例如，通过静电(如氢键、捕捉)，或通过载体表面上的某基团和“接头”或核苷酸分子5′端的功能性结合基团之间的共价结合而实现。还可将核酸分子直接或间接地结合到其他分子上，其他分子本身可以通过上述任一方法连接于固相不溶载体上。
在文献中描述了将核酸结合到固相载体上的方法，以及修饰或修改固相载体的表面以运载或结合核苷酸序列的方法(综述可参，见如Greg T.Hermanson的Bioconjugate Technoloques，Academic Press，Inc.1996 ISBN0-12-34-2335，第17章，Nucleic Acid and Oligonucleotide Modification and Conjugate，以及MohammedAslam和Alastair Dent的Bioconjugation-Protein Coupling Technoloques for theBiomedical Sciences，Macmillan Reference Ltd.，1998 ISBN 0-333-583752，第7章，The Preparation of Protein-Nucleic Acid Conjugates)。
寡核苷酸与磁珠的结合已有描述，如在EP-A-0640626中。
除了定向、共价、偶联之外，核酸可以通过亲和结合配对被间接结合到固相载体上，一个结合伙伴在固相载体上，另一个结合伙伴在被固定的核酸分子上。生物素-链酶亲和素(或亲和素)系统作为固定核酸和易于得到的生物素化核苷酸的手段，如同携带链酶亲和素的固相载体，在分子生物学中是熟知的。例如，包被链酶亲和素的磁珠可从Dynal AS(Oslo，Norway)得到，包被有链酶亲和素的试管和微孔平板可从Roche Molecule Biochemicals得到。其他不同的亲和结合伙伴可以用来代替生物素/链酶亲和素，例如，抗原/半抗原和抗体，酶和底物等。这方面市售可得到的产物的范围还包括，例如可从Roche Molecular Biochemicals购得携带抗洋地黄毒苷抗体的磁珠、抗荧光素抗体和抗生物素抗体。核酸分子中还可以掺入一个核苷酸序列(靶定向位点)，该序列被载体上携带的特异性DNA结合探针识别，如与乳糖操纵子结合的乳糖抑制物Lac I。
通过引物掺入非常规核苷酸是本发明的较佳实施例。如上所述，这提供了一个容易的方法掺入非常规核苷酸，和制备将被固定的核酸分子；该核酸分子是在链延伸反应中通过引物延伸形成的，非常规核苷酸掺入到该引物中而被提供。这仅仅涉及包括引物序列中的非常规核苷酸(NTP)，如在合成的DNA引物中的一个或多个限定的位置上用非常规核苷酸代替常规核苷酸。这种方法形成了本发明许多用途的基础。
引物延伸反应可以是本领域熟知的任何此类反应，如一种简单的线性延伸反应，可以是DNA或RNA合成。因此，不仅涉及从DNA模板合成DNA，而且还涉及从RNA模板(反转录)合成DNA、从DNA模板和RNA等。还有基于引物延伸机理的体外延伸反应，不论是否是指数式延伸，如PCR及其改良法等。引物延伸反应形成了今天所用的许多分子生物学方法的基础。因而，核酸分子可以是PCR产物、测序产物、cDNA合成产物或模板产生的产物等。
为了方便，可以采用一接头序列(如引物)，该序列提供了固定于固相载体上的手段。这些手段可以是亲和结合伙伴之一(如生物素)，它们能与相应的可能由固相载体提供的另一伙伴结合；或者这些手段可以是能够进行化学偶联反应的功能性基团，如氨基或可与羧基反应的末端核苷，或者是固相载体上CNBr激活的羟基。
掺入了非常规核苷酸的生物素化多核苷酸或寡核苷酸形成了本发明一个特别优选方面，但本发明的这一方面也包括作为固定手段的掺入了非常规核苷酸的聚核苷酸和寡核苷酸。
在本发明的PCR(或类似)实施例中，PCR反应可以在引物固定于固相载体上之前或之后进行；可采用已结合于固相载体上的PCR引物，而不是仅仅作为固定的手段。
因此，本发明范围还包括将掺入了非常规核苷酸的固定的聚核苷酸或寡核苷酸。较佳的是，这些固定的聚核苷酸或寡核苷酸结合于磁珠上，较佳的是经由末端连接，较佳的是5′末端连接。
可通过实施例描述本发明代表性的PCR反应，从而显示本发明的优点。
一个或几个位置的dTMP被替换成dUMP的生物素化合成寡核苷酸(如生物素-GTAATACGACTCACTAUAGGGC)可用PCR，并以含dTMP寡核苷酸相同的方式掺入到dsDNA产物中。接下来进行PCR和结合于固相载体时，内部的dUMP位点是UDG作用的目标。然后该脱碱基位点在高温或高pH下可被切割，从固相载体上释放出PCR产物。或者，热变性先释放出非生物素化的互补链，留下与固相载体连接的生物素化链。然后，UDG切断DNA单链并释放它，并允许两条链能分开地收集和纯化。当需要有义或反义链用作杂交探针或制备cDNA扣除库时，这可能是有用的。
类似的方法可以用其他非常规核苷酸/切割系统，和/或其他引物延伸反应如基于测序引物的反应来进行。
本发明另一重要的应用是cDNA的制备。现在本领域建立了采用能与所需mRNA结合的寡核苷酸捕捉探针分离mRNA以进行cDNA合成的方法。然后，该结合的捕捉探针可以作为引物用于接下来以反转录酶进行的cDNA合成反应(见如Dynal AS的EP-A-0444119，该文描述了基于固相载体的这种cDNA合成方法)。这种捕捉探针/引物可以构成本发明的“接头序列”。
为了分离总mRNA，通常将寡dT捕捉探针/引物结合于所有mRNA上都有的聚A尾上。这种寡dT可能适用于本发明来掺入将一个或多个非常规核苷酸(如U)。优点是，可以使用聚dU或寡dU，这居于使操作简单化的优点。
必须注意的是，对于mRNA的聚(A)尾，聚(dU)碱基对强于聚(dT)碱基对，因为聚(dU)碱基增强了mRNA捕捉，从而提供了显著的使用优点。
因此，另外较佳的方面，本发明提供了含有固定于固相载体手段的寡dU或聚dU，该手段优选生物素；或结合于固相载体(优选磁珠)的方法。
因此，本发明的一个较佳实施例是从固相载体上取得cDNA产物。
可将带有寡(dT)的固定在固相载体上的mRNA模板复制到cDNA上。在这种反转录反应过程中，产生的cDNA经寡(dT)引物共价结合于固相载体上。因此用目前的方法释放cDNA是困难的。通过将dUMP掺入寡(dT)中(如5′TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTU)，产生一个UDG作用的靶位点。接下来用高温或高pH切割该脱碱基位点，使cDNA从固相载体上释放出来。或者，导入多个靶位点(如5′UUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUU)。进行反转录之后，在用UDG切断释放结合的cDNA产物之前，可以方便地或有利地通过RNA酶(如RNA酶H)消化或其他方法(如高pH)去除RNA链。
除了基于引物延伸的方法以外，本发明方法还可以与其他体外扩增方法，如连接酶链反应(LCR)和Qβ复制酶系统(WO87/06240)联用。因此，核酸分子还可以通过其他的方法(如连接反应)形成。非常规核苷酸可以包含在一个或多个LCR反应中连接的寡核苷酸中；因而LCR寡核苷酸可以作为本发明的接头序列。
在本发明上述的实施例中，核酸分子主要是DNA分子或DNA-RNA分子。但是，能理解其他形式的结构也是可能的，例如，一端固定的“接头序列”在另一端连接于另一DNA序列、RNA序列、RNA-DNA序列或双链DNA。因此，不同形式的只“含核酸的”核酸分子是可能的。根据本领域熟知的技术，这种核酸分子可以常规或方便的方式制得。例如，RNA-DNA结构可以用寡核苷酸合成仪容易地合成。或者，RNA和DNA可以用RNA连接酶(该酶也能将DNA连接于DNA以及将RNA连接于RNA)连接起来。单独的dNTP或rNTP可以用合适的聚合酶(如突变DNA聚合酶如T7 DNA聚合酶)将其导入到一核苷酸链中〔Sausa和Padilla(1995)EMBO J.14，4609-4621〕。
另外，如上所述，其他结构或核酸分子的嵌合形式也是可能的。
因此，核酸分子可方便地包含偶联于一蛋白质(或肽或多肽)的接头序列，该序列可能是抗体或其片段(包括抗体衍生物和合成的抗体如单链抗体)、酶或受体蛋白或其他一些结合蛋白或其结合部分或其片段〔如链酶亲和素、A蛋白、G蛋白、L蛋白，或它们的片段或任何实际上知道的序列，合成的或修饰的(如原生修饰的)亲和结合蛋白如抗体、外源凝集素等〕。或者，接头序列偶联于酶底物、受体的伙伴、抗原/半抗原或其片段等。有利的是，该嵌合核酸分子的“第二”组分是一种亲和结合基团，即一对亲和结合伙伴中的一个。
这些嵌合的核酸分子可用于任何基于亲和结合的固相载体方法或步骤中，例如，用于细胞或蛋白质或其他分子的分离和纯化方法种或试验中。
本发明另一方面提供了一种结合于固相载体，随后从该载体上切下来的结构的制备方法，所述方法包括将核苷酸序列掺入所述结构中，该核苷酸序列在预定位点包含能被选择性切断的非常规核苷酸。
另一方面，本发明还提供了一种嵌合分子(或结构)，该分子包括一核苷酸接头序列，该接头序列含有在预定位点可选择性切断的非常规核苷酸，该序列与官能团偶联，优选亲和结合基团或报道基团。
有利的是，在这样一种嵌合分子中，接头序列还可以是固定的(即结合于固相载体上)或者是如上所述它含有固定于固相载体的手段。
官能团可以是任何具有可用于试验和分离步骤的性能的基团，如结合活性或可检测性，或信号产生活性。有利的是，如上所述，该官能团是亲和结合基团。这种亲和结合基团可以是如上所述的亲和结合蛋白或其衍生物，或者是具有亲和结合性能的伙伴(如半抗原/抗原或生物素或有机分子)，或者是实际上正在开发的新一代亲和结合基团，如合成抗体或嵌合抗体或其他抗体衍生物或抗体模拟物(如单链抗体或其衍生物)或随机文库或展示产生的结合分子。或者，该官能团可以是一种报道基团。本文所指的官能团包括任何能提供可检测信号的基团，或者参与信号产生反应的基团。因此，一个基团可以包括酶底物，或者标记物，如放射性标记物。
本发明还包括其本身还具有报道基团(如标记物)的亲和结合基团结构。这可以是本领域周知的或文献中描述的任何标记物，如放射性标记物或其他一些可检测标记物(如有色的、产生色素的、生色的、荧光的或化学发光的标记物)，或者是酶标记物。
代表性的官能团将包括能被任选地标记的抗体或结合蛋白(如链酶亲和素)；酶，如辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酯酶(AP)；酶底物，如肽，它可能是所研究的酶的底物(如HIV蛋白酶或酪氨酸激酶的磷酸化位点)；或者是用于酶试验的真正(indeed)底物(如睾酮或其他一些生物分子)；碳水化合物；脂肪；半抗原(如小的有机分子)；以及标记物。
在这样的结构中，接头序列较佳的是寡或多dU序列，较佳地携带作为固定手段的生物素基团。
较佳的官能团是抗体或其片段或衍生物，或者是半抗原。
将核苷酸序列偶联到其他分子上的方法在本领域中是周知的，这些结构可以按照Hermanson(同上)和Aslam和Dent(同上)描述的方法制备。在R.Helmuth(1990)PCR Protocols：A Guide to Methods and Application，第15章，AcademicPress，Inc.和Y.M.Dennis Lo.等人，(1990)PCR Protocols：A Guide to Methods andApplication，第14章，Academic Press，Inc.中还描述了偶联寡核苷酸(可能被修饰)于其他分子的步骤和方法的一般性指导(guidance)。
众所周知，“修饰的”寡核苷酸可以在合成期间通过将另外的化学基团连接到该寡核苷酸上而制得，例如，报道基团，如标记物(如荧光标记物如TAMRA、罗丹明或任何其他已知的荧光标记物)。这样的化学基团还可以是如上所述的亲和结合伙伴，如提供与抗体结合的靶子的半抗原〔如洋地黄毒苷、雌二醇或二硝基苯酚(DNP)〕，或者是生物素(与链酶亲和素/亲和素结合)，或者可以是报道基团和与抗体结合的抗原/半抗原(如荧光素)。许多这样的修饰寡核苷酸能从市场上得到，如从Oswell Reserch Products Ltd.、Southampton UK得到。如上所述，在本发明的嵌合分子中，单个寡核苷酸可以携带一个以上的附加“化学基团”(或“修饰单位”)，如固定化的部分(即固定化的手段)如生物素和亲和结合基团(如半抗原)或者报道基团(如标记物)。例如，本发明的嵌合分子可以采用在5′端携带一个生物素分子、在3′端携带一个氨基的寡核苷酸的形式，该氨基可以用来标记，如同它提供一种手段使氨基活性分子结合到寡核苷酸上一样。或者，寡核苷酸在其3′端可携带半抗原，如洋地黄毒苷。为了进行标记，可以通过抗洋地黄毒苷抗体将洋地黄毒苷偶联到酶上〔如辣根过氧化物酶(HRP)〕。
该结构可以用在使用众所周知的标准技术的分离步骤中。因此，就抗体的官能团而言，该结构可用于与任何需要分离的目标物质，如细胞或蛋白质相结合。不管是结合于该目标物质之前还是之后，该结构的固定化都使有利于目标物质的分离，接着根据本发明，可通过切断接头序列使目标物质释放。
例如，在蛋白质纯化过程中，可将所述蛋白质的亲和结合基团(即配体)通过本发明的寡核苷酸“接头”序列偶联于固相载体。在这个结构中，本发明的嵌合分子因此包括固定化的手段、可切断的“接头序列”和对所需目标蛋白质的亲和捕捉配体。
典型的亲和捕捉配体包括为了纯化甲状腺素结合蛋白质的L-甲状腺素〔Pensky和Marshall(1996)Arch.Biochem.Biophys.135：304〕；捕捉叶酸结合蛋白质的叶酸〔Salter等人，(1972)FEBS Lett.20：302〕和捕捉脂蛋白(HDL和LDL)的胆甾醇半琥珀酸〔Wichman(1979)Biochem.J.181：691〕。在每一种情况中，所述配体将从载体上切断下来，使该蛋白质和结合的伙伴的得以收集。所述配体还可以是小分子(如L-赖氨酸)、蛋白质(如A蛋白)、碳水化合物〔如D(+)蜜二糖〕或外源凝集素(如伴刀豆球蛋白A)。核苷酸伙伴特别有利于酶的纯化，因为三分之一的酶需要核苷酸作为辅酶，因而提供了纯化的手段〔Barker等人，(1972)J.Boil.Chem.247：7235〕。为了减少空间干扰，可以通过使用可切断的寡核苷酸接头序列与伙伴之间的间隔臂来提高配体-蛋白质相互作用。例如，核苷酸配体常通过碱基连接而被固定，连接的碱基如腺苷5′单磷酸酯的N-6与第8、9或第11位原子的间隔臂(商品目录第A3019号，Sigma-Aldrich公司)之间的连接〔Chaffotte等人，(1977)Eur.J.Biochem.78：309〕。
在试验中可以运用相似的或类似的机制，如酶联免疫吸附试验(ELISA)，或本领域周知的其他试验原理。
本发明提供的从固相载体上切下抗体-酶复合物的能力使其能用于ELISA中。通常在ELISA试验中，每孔仅有一个伙伴(即试验目标物)能被检测和定量。但是，通过改进可用多种复合方法检测几种配体。例如，使用对各个伙伴有特异性的抗体，在ELISA板的孔中可以同时捕获两个或多个伙伴(在这里指试验目标物)。然后加入对第一个伙伴有特异性的连接酶的第二抗体，或者通过本发明可切断接头序列的其他检测方法，如使用聚(dU)。接下来孔中的操作和通常的一样，通过使用可切断的接头将酶从复合物分离并洗掉。这样允许将对第二个伙伴有特异性的第二个第二抗体加到孔中，并进行和第一步一样的酶试验。整个过程可以重复进行几次，从而使该ELISA试验具有多重性。
本发明可逆固定化方法在细胞分离过程中的运用代表了一个较佳的和有利的方面。
所以，本发明在这方面提供了一种从样品中分离靶细胞的方法，所述方法包括通过上述嵌合分子方法使所述靶细胞结合到固相载体上，其中所述官能团是亲和结合基团，它能特异性地与所述细胞结合。这种方式的细胞分离可以通过切断所述核苷酸接头序列而从固相载体上释放出来。
更具体而言，本发明在这方面因此包括：
(a)通过亲和结合配体使所述靶细胞结合到固相载体上，该配体能与细胞特异性地结合，所述结合伙伴和所述载体之间的连接物包括含有在预定位点上可选择性切断的非常规核苷酸的核苷酸序列；
(b)将结合有细胞的载体与样品分离；和
(c)通过选择性地在所述非常规核苷酸位点外切断所述核苷酸序列而将靶细胞从载体上释放。
术语“细胞”在这里包括所有的原核生物(包括古细菌)和真核生物细胞以及其他能生存的或于包膜的生物体(如病毒和支原体)，以及亚细胞组分(如细胞器)。代表性的“细胞”包括所有哺乳动物和非哺乳动物类型的细胞、植物细胞(包括藻类)、原生质体、真菌、细菌(包括蓝藻细菌，又称绿藻)、支原体、原生动物、病毒(包括噬菌体)以及细胞器。
样品可以是含有这些细胞的材料，包括食物和相关的产品、临床的和环境的样品。因此，样品可以是生物样品，它含有病毒或细胞物质，包括所有的原核生物或真核生物细胞、病毒、噬菌体、支原体、原生质体和细胞器。这些生物物质可以包括所有的哺乳动物和非哺乳动物类型的细胞、植物细胞、藻类(包括蓝藻)、真菌、细菌、原生动物等。代表性的样品包括全血和血液制品(如血浆或白细胞层)、尿、粪便、脑脊髓液或其他体液、组织、细胞培养物、细胞悬浮夜等，还包括环境样品如土壤、水，或者食物样品。
样品还可以包括相对纯的或部分纯的起始材料，如从其他细胞分离过程中得到的半纯制品。
在使用DNA糖基化酶进行酶切割来释放结合的细胞时，在一些情况下可能需要避免过激的切断条件(如高温和/或pH)，这些条件通常用来切割糖基化酶作用产生的脱碱基位点。因此，为了在有利于活细胞的更接近生理的情况下进行切断，可将DNA糖基化酶用于细胞解离方案中，该方案是基于在生理条件下进行酶切断联合用机械压力断裂被酶消化(即降解)的核苷酸接头。这种机械压力可以从外部提供，如搅拌、混合、移液、搅动等，但是单单施加在接头(即细胞和固相载体的连接)上的机械压力也许就够了。
然而，如果需要，还可以用其他的方法来提高DNA糖基化酶作用产生的脱碱基位点的切断，包括使用“切断试剂”(如化学试剂或酶)，例如可在脱碱基位点切断的核酸外切酶III或大肠杆菌核酸内切酶IV。这也使得温和的切断过程能被采用。这些切断方法在下面的实施例中将进一步阐述。
特别有利的是，在细胞分离过程中使用“冷适应”或“冷耐受”的酶，它们能在低温下(如4℃)很好地起作用，这有利于细胞分离和操作，例如，采用上述从冷环境生物(如北极虾)得到的酶。
本发明的一个主要优点是允许现成的多重性(ready multiplexing)。更具体而言，本发明具有在一种或多种(实际上是很多种)类型接头存在下选择性切断其他一种类型“连接”的能力。这种能力在许多领域有巨大的潜能。因此，可将不同的非常规核苷酸掺入不同的核酸分子中，如掺入用来产生核酸分子的不同的接头序列中，这样形成多个核酸分子，每一个核酸分子(或每一分子群或“类型”等)含性质不同于非常规核苷酸/接头序列。这意味着可通过使用对具体非常规核苷酸有特异性的适当的切断系统(即糖基化酶)，可在不同的核酸分子/接头序列的存在下选择性地切割其中一个核酸分子(如接头序列)。因此，这开辟了固定于固相载体上(可以相同或不同)不同核酸分子(或不同“类型”或“群”的分子)多样性的可能性，以及通过存在的可选择性切割的非常规核苷酸(如可选择性解离的接头序列)可使各种分子(或“类型”或“群”)从固相载体上选择性地解离下来。换句话说，“不同”的接头序列(在非常规核苷酸性质上不同)代表不同“系链(tether)”或连接系统，这些序列可以用来将不同的核酸分子系住或连接到固相载体上。因而这允许每一个这样的接头序列在其他接头序列的存在下能被选择性地切断，从而允许通过各个所述接头序列而结合的分子(即核酸分子)选择性解离下来。
因而，本发明的实施方式一般理解为提供了选择性地使多种不同核酸分子从其所结合的固相载体上解离下来的方法，其中，每个所述核酸分子在预定位点掺入了一个非常规核苷酸，每个不同的核酸分子掺入了不同的非常规核苷酸，所述方法包括在所述非常规核苷酸的位点上选择性地切断每个所述核酸分子。
因而根据选择，可将一个或多个核酸分子(即一个或多个不同类型)选择性地解离下来。
如上所述，对于每个所述不同核酸分子，固相载体可以相同或不同，每个不同的核酸分子的选择性切断可分开地进行(如以不同的等份，或空间分离)或依次进行。
如上所述，不同的“核酸分子”可以是不同类型或群体的核酸分子。本文所用的术语“多样性”指两个或多个。
类似地，本发明还提供了可逆性固定化多个不同核酸分子的方法(如上所述)，其中，将不同的非常规核苷酸掺入每个不同的核酸分子中。
由于多样性允许被不同亲和力分子(即不同亲和结合基团)结合的靶物质可选择性地释放，所以这种方式的多样性可以用在基于亲和力的分离或试验领域中。因而，就细胞分离而言，可让几种不同类型细胞通过一含有亲和交联于(或其他一些亲和结合基团)本发明可切割接头序列的结构，结合到固相载体(如珠子)上。每种类型抗体(即每种亲和结合基团)可以有不同的可切断接头序列(如聚U、甲基腺嘌呤等)。可将整群细胞与载有抗体的磁珠混合物一起培育，通过可选择性切割的尾(接头)与磁珠结合。因而，使用者得以进行细胞类型(如“A”型细胞)的选择性解离，即通过加入对“A”型细胞所结合的抗体连接的接头序列(称为系链“1”)有特异性的糖基化酶来解离，同时不会解离其他任何类型细胞(如“B”型细胞)，直到加入对其他接头序列(如系链“2”)有特异性的糖基化酶。这对于珍贵的细胞样品和仅能得到有限数量的细胞来说具有吸引力。例如，CD4细胞可在同一试管中与CD8+一起纯化，然后每种细胞群可进而通过加入糖基化酶1、2等来解离。
此多样性方法能进一步应用在PCR产物分离或纯化领域中。因而，可将例如，特异性接头序列加到每个生物素化的PCR引物中。作为代表性的例子，可在正向和反向PCR引物中各掺入不同的非常规核苷酸。例如，引物T3可以掺入U，引物T7可掺入甲基腺嘌呤(MA)，即T3U和T7MA。延伸和结合到链酶亲和素珠子上后，变性以将两条链分开，然后用UDG或甲基腺嘌呤(MA)糖基化酶使PCR产物的各条链解离。这样就简化了每条链纯化所必须准备的分离纯化试管。
或者，为了比较基因表达水平，可以一起纯化多种逆转录-聚合酶链式反应应物。换句话说，适用针对不同基因的逆转录引物，可以比较不同基因的表达水平或模式，这些引物每个具有不同的非常规核苷酸，这些核苷酸使每种不同的逆转录产物可被选择性地切割。作为这样一种方法的代表性例子，应该正视这样的试验(如GAPDH试验)，它具有)生物素化的含U(如GAPDH-FU)正向(或反向的引物。因而对感兴趣的mRNA试验(如p53)有生物素p53-FMA。PCR反应将将一荧光脱氧核苷酸掺到GAPDH和p53的二种PCR产物中，这两种产物在含有结合了生物素的固相载体〔如链酶亲和素珠(如Dynal ASA，Norway公司提供的M-280 Dynabeads)〕的同一试管中被一起纯化。经过洗涤等步骤后，去除了未掺入的核苷酸，随后加入UDG并分析从珠子中释放出来的荧光物量，测定GAPDH的PCR产物量。同样，在加入甲基腺嘌呤糖基化酶后可测定p53的PCR产物的量。
对此多重方法的唯一限制是不同糖基化酶的数量。在有十种糖基化酶和四种荧光核苷酸的情况下，通过多重方法(multiplexing)可以测定从同一试管的珠子中释放出来的40种不同PCR产物。
此多重方法的进一步应用可能有赖于测序，特别是有赖于多个序列反应产物的纯化。
本发明提供了几种测序反应产物一起纯化的可能性。通过使用不同的测序引物掺入了不同非常规核苷酸使这成为可能。为了便于纯化，可以提供有固定化的手段的不同的引物，这些手段可以相同或不同，但方便的是相同的，如生物素(结合于携带有链酶亲和素的固相载体如珠子上)。例如，可采用以下存在有几种形式的生物素化T3测序引物，如(1)序列(T3U)中某处含有一个尿嘧啶，或者(2)序列(T3MA)中含有一个甲基腺嘌呤等。第一步测序反应使用引物T3U，第二步分离反应使用引物T3MA。测序反应结束后，将第一反应产物和第二反应产物混合并在链酶亲和素珠上纯化。洗涤后，加入UDG使反应物质1释放，然后该反应产物可以被“阅读”(如加到测序凝胶上)，再加入甲基腺嘌呤糖基化酶使反应2释放，然后阅读。显然可能释放的测序反应产物的数目只受不同的糖基化酶的数目的限制。这种多重方法有利于高通量测序试验室。在含有珠载-测序反应产物的混合物的96孔平板中，将UDG加到所有的96孔中以取得96孔中的第一反应产物，然后将甲基腺嘌呤糖基化酶加到同样的96孔中，以取得96孔中的第二反应产物，以此类推。所需的产物就仅仅是T3U和UDG、T3MA和甲基腺嘌呤糖基化酶等。不需要对这种纯的测序反应产物作任何变动，仅仅从珠子上释放出DNA即可。
实施本发明方法所需的组分或手段通常可以以试剂盒的方式方便地提供。
所以，本发明另一方面提供了用于上述本发明方法的试剂盒，所述试剂盒包括：
(a)将非常规核苷酸导入核酸分子的手段；和
(b)选择性切断所述非常规核苷酸的手段。
手段(a)通常可以是含有所述非常规核苷酸的寡核苷酸序列(如上述接头序列)，较佳的是引物。
手段(b)通常可以是DNA糖基化酶。
该试剂盒可以额外包括另一组分(如固相载体)，或者固定于固相载体上的手段。较佳的是，该试剂盒可以包括含有固定到固相载体上的手段，优选生物素的寡du或聚dU；或者是结合于固相载体，优选磁珠上的寡dU或聚dU。
本发明的使用和应用包括：
1.为了克隆的目的(如文库的制备)，或者为了制备用生物芯片(基因芯片)进行杂交方案的探针，可在固相载体上制备cDNA的第一和第二链，然后通过选择性切断释放它们，并在加样之前去除未掺入的dNTP，进行测序反应。
2.可从同一双链cDNA制品中制备有义和反义链探针，简化了该过程。
3.反向扣除杂交是可能的，将第一cDNA链从载体上取出，并与固相载体上固定的mRNA杂交。
4.可克隆DNA(如PCR产物)，一个主要的优点是，因为通常在5′端有一个能抑制连接的生物素。
5.可能容易地通过基于亲和结合的固相载体方法〔如免疫磁性分离法(IMS)〕分离得到细胞，其方式是只有最少的“外来”物质保持与细胞结合而细胞容易地从载体上释放下来。这在分离用于治疗的细胞和/或随后刺激细胞中有特殊用途。例如，用于治疗的T细胞(如刺激后再导入患者体的)可以通过IMS分离，刺激(也包括IMS过程的刺激)，然后将其从IMS载体上解离下来，再导入。
6.不难将可切割的核苷酸连接或偶联到正在发展的新一代亲和结合分子〔如单链抗体及其衍生物(如对互补位的最小化)，或者由肽文库产生的分子〕，偶联方式是将可切断位点尽可能靠近亲和结合位点。这使得发生切割护留下尽可能少的结合于被分离物(即亲和结合基团的结合“伙伴”)的“外来”物质。
本发明现在将结合附图进一步更详细地描述下列的非限制性实施例。这些图中：
图1显示用UDG处理dTMP或dUMP寡核苷酸引物释放的％DNA。
图2显示在存在UDG或不存在UDG的情况下dUMPPCR引物产物的释放〔CPM释放的(000′s)〕。
实施例1从固相载体上取得cDNA产物方法
1.用Dynabeads聚5′TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTU或多5′UUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUU〔按Jakobaen，K.S.等人，In Advance inBiomagnetic Separation，Ed.Uhlén，M.Eaton Publishing，(1994)pp61-71所述〕捕捉、洗涤和制备1μg的mRNA，或者根据Dynal的说明书来进行mRNA的捕捉。
2.用50微升1X反转录缓冲液(Life Technologies，Inc.)洗涤mRNA和珠的混合物两次
3.将含有200单位的Super Script II反转录酶的20微升反转录反应物混合在含有500nM dNTP的33p dATP(3000mCi/mmol)、100mM的DTT和2.5mM的MgCl2的1X反转录酶缓冲液中(Life Technologies，Inc.)。
4.37℃培育20分钟，42℃培育20分钟，55℃培育20分钟。
5.37℃培育15分钟。加入1微升RNA酶H，70℃培育10分钟。
6.用50微升UDG反应缓冲液(10mM Tris-HCl，pH8.9，50mM的KCl和25mM的MgCl2)洗涤两次。
7.在20微升的UDG反应缓冲液中加入1单位尿嘧啶-DNA糖基化酶(Boehringer mannheim)，37℃培育10分钟。
8.95℃培育3分钟，以在脱碱基位点切下DNA。
9.使用磁铁，收集含有释放的DNA的上清液。结果
图1显示，当UDG和寡(dTU)培育时，标记的第一cDNA链释放与寡(dT)相比有显著的增加。大约有80％的cDNA释放，而寡dT则少于20％。
实施例2从M-280链酶亲和素珠中取得PCR产物方法
1.进行PCR，该反应包括含有内在dUMP的生物素化引物(如生物素-GTAATACGACTCACTAUAGGGC)和具有合适模板的未修饰的PCR引物，以及反应组分(当适用与同样的未修饰引物相当的生物素化的和含dUMP的PCR引物时，不需作任何的改变)。
2.可用Centricon-50旋转柱(Amicon Inc.)根据制造者的说明书去除未掺入的生物素化引物。
3.将纯化的PCR产物(100ng-5μg)固定于100微升M-280链酶亲和素珠(Dynal)上，磁珠置于100微升B&W缓冲液〔2M HCl，10mM Tris-HCl(pH7.5)和1mM的EDTA〕中。固定的条件是50℃旋转3个小时。
4.进行实施例1步骤6-9。
5.收集释放的双链或单链PCR产物，用于下游的应用如克隆。结果
图2显示放射性标记的生物素化PCR产物从M-280链酶亲和素珠上的释放。bioT3U是生物素-AATTAACCCTCACUAAAGGG，bioT7U是生物素-GTAATACGACTCACTAUAGGGC。在UDG的存在下PCR产物的释放量比不存在UDG时大大增加。
实施例3用核糖核苷作为非常规核苷酸从固相载体上取得cDNA产物
1.用所述Dynabeads寡5′生物素TTTTTTTTTrUTTTTTTTTT(Jakobsen等人，1994)捕捉、洗涤和制备1μg的mRNA。
2-4.如实施例1。
5.切断含有寡核苷酸的RNA(rU)，通过加入两批20微升100mM NaOH释放结合的cDNA。
6.使用磁铁，收集含有释放的cDNA的上清液。
7.如有必要，加入40微升100mM HCl或合适体积的1M Tris-HCl缓冲溶液(pH7)中和碱性。
实施例4用核糖核苷作为非常规核苷酸从固相载体上取得cDNA产物
1-4.如实施例3。
5.切断含有寡核苷酸的RNA(rU)，加入10微升25mM的MgCl2或MnCl2溶液(使最终的Mg2+或Mn2+浓度至少为10mM)释放结合的cDNA。94℃加热5分钟。
6.使用磁铁，收集含有释放的cDNA的上清液。
实施例5用核酸外切酶III切断脱嘌呤位点方法
步骤1-7和实施例1一样。
8.加入150单位核酸外切酶III(Promega Crop.USA)，37℃培育30分钟。
9.使用磁铁，收集含有释放的cDNA的上清液。
注意：
核酸外切酶属于脱碱基位点切断酶类，统称AP核酸酶〔Lindahl和Anderson(1972)Biochemistry 11：3618-3623〕。核酸外切酶III还含有能破坏双链DNA(如PCR产物，但不是ssDNA)的双链特异性DNA酶活性。因此，较佳的是，在本实施例中，用核酸外切酶III只切割所述单链DNA的脱碱基位点。另一合适的切割脱碱基位点的酶是大肠杆菌核酸内切酶IV〔Demple和Harrison，(1994)Annu.Rev.Biochem.63：915-948〕，该酶可替换本实施例中的核酸外切酶III。实施例6接头的切断和细胞纯化
1.用Dynabeads CD4的生物素-polyU-抗-CD4进行细胞分离(如CellSeparation and protein purification，Technical Handbook，2nd edition，Dynal所述)。
2.将花结相比悬浮于100毫升细胞培养液中。
3.加入100单位的UDG(Roche Molecular Biochemicals)和1500单位的核酸外切酶III。
4.37℃培育45-60分钟。
5.用磁性分离器去除释放的珠子。
6.收集含有所述细胞的上清液。
实施例7接头的切断和蛋白质纯化方法
1.用PBS洗涤1×107组织培养细胞3次。
2.在含有50μg/ml TLCK和TPCK以及200μg/ml PMSF的1ml的2％Triton X-100中裂解所述细胞。
3.用40微升Dynabesds-可切断接头-亲和分子〔如Dynabeads-poly(dU)-8-碳间隔基-腺苷5′单磷酸酯)培育该细胞裂解物。
4.用磁铁收集珠子并用PBS洗涤3次。
5.将珠子重悬在40微升UDG反应缓冲液中(10mM的Tros-HCl，pH8.9，50mM的KCl和25mM的MgCl2)。
6.加入2个单位的尿嘧啶-DNA糖基化酶(Boehringer Mannheim)。
7.37℃培育30分钟。
8.加入15个单位的核酸外切酶III(Promega Corp.USA)，37℃培育30分钟。
9.使用磁铁，收集含有释放的蛋白质和伙伴的上清液。

Claims (28)

1.一种将核酸分子从它结合的固相载体上切割下来的方法，其中，在所述核酸分子的预定位点上掺入非常规核苷酸，所述方法包括在所述非常规核苷酸位点选择性地切断所述核酸分子。
2.一种可逆地固定核酸分子的方法，其特征在于，所述方法包括：
(a)在所述核酸分子的预定位点掺入非常规核苷酸；
(b)将所述核酸分子结合到固相载体上；步骤(a)和(b)可按顺序或同时进行；接着
(c)在所述非常规核苷酸位点选择性地切断所述核酸分子。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中，所述核酸分子是包含核酸组分和其他非核酸组分的嵌合分子。
4.如权利要求1到3中任一项所述的方法，其中，所述非常规核苷酸是尿嘧啶、次黄嘌呤、核糖核苷酸、N-7甲基鸟嘌呤、8-氧化鸟嘌呤、脱氧尿苷、脱氧肌苷、脱氧5，6-二羟基硫胺、5′，6′-二羟素、脱氧3′-甲基腺苷或3′-甲基腺苷。
5.如权利要求1到4中任一项所述的方法，其中，通过酶作用实现所述选择性切断。
6.如权利要求5所述的方法，其中，使用DNA糖基化酶实现所述选择性切断。
7.如权利要求1到6中任一项所述的方法，其中，所述核酸分子包括DNA，所述非常规核苷酸是尿嘧啶(U)，以及使用尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)实现所述选择性切断。
8.如权利要求1到7中任一项所述的方法，其中，将所述非常规核苷酸作为接头序列的一部分掺入所述核酸分子中。
9.如权利要求8所述的方法，其中，所述接头序列是引物。
10.如权利要求1到9中任一项所述的方法，其中，所述核酸分子是引物延伸产物。
11.如权利要求1到10中任一项所述的方法，其中，所述载体是磁珠。
12.如权利要求8到11中任一项所述的方法，其中，所述接头序列含有固定到固相载体上的手段。
13.如权利要求10到12中任一项所述的方法，其中，所述核酸分子是cDNA，或者是体外延伸反应或测序反应的产物。
14.如权利要求8、11或12中任一项所述的方法，其中，所述核酸分子包含偶联于蛋白质、酶底物、受体伙伴、抗原或半抗原，或者它们的片段的接头序列，或者偶联于亲和结合基团或报道基团上的接头序列。
15.一种结合到固相载体上随后被切断下来的结构的制备方法，所述方法包括将一核苷酸接头序列掺入所述结构中，该接头序列包含在预定位点上能选择性切断的非常规核苷酸。
16.一种嵌合分子，所述分子包括含有在预定位点可选择性切断的非常规核苷酸的核苷酸接头序列，该序列偶联于一官能团上。
17.如权利要求16所述的嵌合分子，其中，所述官能团是亲和结合基团或报道基团。
18.如权利要求15所述的方法，或者如权利要求16或17所述的嵌合分子，其中，所述接头序列是固定的，或者含有固定到固相载体上的手段。
19.如权利要求16到18中任一项所述的嵌合分子，其中，所述亲和结合基团是抗体或其片段或其衍生物，或者是半抗原。
20.一种从样品中分离靶细胞的方法，所述方法包括使用权利要求16到19中任一项所述的嵌合分子使靶细胞结合到固相载体上，其中，所述官能团是能特异性地与所述细胞结合的亲和结合基团。
21.如权利要求1到14中任一项所述的方法，其中，使多个不同核酸分子或嵌合分子附着或结合到固相载体上，每个所述不同核酸分子掺入了不同的非常规核苷酸。
22.用于权利要求1到14中任一项所述方法的试剂盒，所述试剂盒包括：
(a)将非常规核苷酸导入核酸分子的手段；和
(b)进行所述非常规核苷酸选择性切断的手段。
23.掺入了非常规核苷酸的聚核苷酸或寡核苷酸，所述聚核苷酸或寡核苷酸固定在固相载体上，或者含有固定化的手段。
24.如权利要求23所述的聚核苷酸或寡核苷酸，其中，所述聚核苷酸或寡核苷酸是聚dU或寡dU。
25.如权利要求23所述的聚核苷酸或寡核苷酸，其中，所述聚核苷酸或寡核苷酸是引物。
26.如权利要求23到25中任一项所述的聚核苷酸或寡核苷酸，其中，所述固定化手段是生物素。
27.如权利要求23到25中任一项所述的聚核苷酸或寡核苷酸，其中，所述固相载体包括磁珠。
28.如权利要求23和25到27中任一项所述的多种寡核苷酸或聚核苷酸，其中，每个不同的寡核苷酸或聚核苷酸掺入了不同的非常规核苷酸。
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