KR20020013517A - 고상 지지체로부터 핵산의 절단 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 비표준 뉴클레오티드가 분자내의 미리-결정된 부위에 혼입되어있는 핵산 분자를 상기 비표준 뉴클레오티드 부위에서 선택적으로 절단하는 것을 포함하는, 상기 핵산 분자가 부착된 고상 지지체로부터 상기 핵산 분자를 분리하는 방법을 제공한다. 핵산 분자는 핵산 (뉴클레오티드 서열) 및 상이한 화학적 성질의 다른 분자 성분을 포함하는 키메라 분자일 수도 있다. 또한, 본 발명의 이러한 측면은 친화성 결합기 또는 리포터 기일 수도 있는 관능기에 결합된 선택적으로 절단가능한 비표준 뉴클레오티드를 미리 결정된 부위에 포함하는 뉴클레오티드 링커 서열을 포함한 키메라 분자 (또는 구조물)를 제공한다. 본 발명은 여러가지 용도, 예를 들어 핵산 합성, 증폭 또는 서열분석, 핵산 단리와 같은 분자 생물학 방법에서 또는 친화성에 기초한 분리 또는 분석 방법에 유용성을 갖는다.

Description

고상 지지체로부터 핵산의 절단 {Cleavage of Nucleic Acid from Solid Supports}
본 발명은 고상 지지체로부터 핵산 및 핵산 함유 분자 또는 구조물의 절단에 관한 것이다.
오늘날, 생화학/생물공학 및 관련 분야에서의 일반적인 처리에서 통상 사용되는 많은 절차에서, 생물학적 또는 화학적 실재물 (entity) (예를 들어, 생체분자)을 고상 지지체에 결합 (다시말해서, 고정)시킨 다음, 연속하여 상기 지지체로부터 그것을 분리시키는 것이 종종 바람직하다. 이러한 가역적 고정은 특히 당 기술분야에 공지된 많은 분리, 정제 및 단리 절차, 예를 들어 세포의 단리 (예, 면역자기 분리), 친화성 크로마토그래피 등에서 사용되어 왔다. 고정, 특히 올리고뉴클레오티드 및 핵산의 고정은 많은 분자 생물학적 절차 및 통상적으로 사용되는 많은 기술, 예를 들어 고체 상에서 사용하기에 적합한 서열분석, 시험관내 증폭, cDNA 제조, 주형 (template) 제조, DNA 기초 분석, 돌연변이유발 절차 등, 뿐만 아니라 핵산 정제에서 종종 사용되고 있다. 이는 취급을 수월하게 하고, 시료 처리량을 증가시키고, 자동화 등을 가능하게 할 수도 있으며, 고체 상에서 절차를 수행하는 능력은 종종 장점으로 여겨진다.
그러나, 고정은 자체의 문제점을 가질 수도 있다. 즉, 오늘날 사용되는 많은 고정 체계는, 한 쌍의 친화성 결합 파트너 사이에서의 결합에 의존하여 목적하는 실재물을 지지체에 연결시킨다. 예를 들면, 이것은 항체-항원 결합 쌍, 예를 들어 세포-표면 항원에 대한 고정 항체 결합, 또는 고정시키고자 하는 단백질 또는 다른 분자를 기초로 할 수도 있다. 분자 생물학에서, 핵산 또는 올리고뉴클레오티드의 결합(binding)은 통상 바이오틴-스트렙타비딘 (또는 아비딘) 연쇄 (linkage), 바이오틴화 분자 (예, 바이오틴화 올리고뉴클레오티드)와 고정된 단백질 (스트렙타비딘 또는 아비딘)의 결합에 의해 달성된다.
이러한 연쇄는 파기(붕괴)가 어려울 수도 있고, 따라서 결합된 부분을 방출하는데 곤란함이 있다. 즉, 예를 들면 연쇄의 붕괴는 결합 부분에 해로울 수도 있는 가혹한 조건, 예를 들어 높은 pH 또는 염 농도, 및/또는 고온을 필요로 할 수도 있다.
친화성 결합 대신에 사용할 수도 있는 다른 형태의 연쇄/결합, 예를 들어 공유 결합을 기초로 한 연쇄도 또한 붕괴가 어려울 수도 있다 (예를 들어, 고정된 올리고뉴클레오티드와 핵산의 결합은 고상 지지체에 공유 결합된 프로브를 포획하며, 따라서 지지체로부터 쉽게 방출될 수 없다).
통상 사용되는 선행 기술 고정 체계의 다른 단점은 고정된 부분의 분리에 의해서도, "고정 연쇄"의 일부가 문제의 부분, 예를 들어 결합 리간드 또는 그의 일부, 예컨대 바이오틴, 또는 링커 팔의 일부에 여전히 결합되어 남아있다는 것이다. 이는 이후의 조작 또는 고정된 부분의 하류 공정, 예를 들어 클로닝 또는 핵산의 기타 조작, 또는 세포의 생존율 연구, 단백질의 입체 형태 연구, 추가의 정제 등을방해할 수도 있다.
그 결과, 당 기술분야에서, 생물학적 또는 화학적 실재물의 고정 및 그 이후의 방출을 위한 개선된 방법이 계속적으로 요구되고 있다. 본 발명은 이러한 요구를 해결하기 위한 것이다.
즉, 선택적으로 절단가능한 부위를 함유하는 뉴클레오티드 서열을 고정되는 부분에 포함시키는 것을 기초로 하여, 고정 방법이 개발되어 왔다. 이러한 부위는 통상 뉴클레오티드 서열에는 존재하지 않고, 예를 들어 그 뉴클레오티드의 존재에 대해 특이적인 효소를 사용하여 쉽게 절단될 수 있는 뉴클레오티드에 의해 제공된다. 이어서 뉴클레오티드 서열을 특이적 부위에서 선택적으로 절단함으로써 고정된 부분의 분리를 쉽게 달성할 수도 있다. 이러한 신규의 방법은 핵산 또는 핵산을 함유하는 분자를 효율적으로 예측가능한 방식으로 정확한 부위에서 고상 지지체로부터 절단할 수 있도록 한다.
절단가능성이 뉴클레오티드의 존재에 의존하기 때문에, 본 발명의 신규 방법은 핵산 (다시말해서, 임의의 뉴클레오티드 서열)의 고정 및 핵산/뉴클레오티드 서열 조작 및 제조 절차와 관련하여 사용하기에 특히 적합하다. 그러나, 이 방법은 이러한 절단가능한 부위가 혼입될 수도 있는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 어떠한 실재물 또는 분자, 예를 들어 단백질 또는 기타 유기 분자와 같은 기타 부분과 핵산과의 접합체에 적용될 수도 있다.
한가지 측면에서, 본 발명은 비표준 (unconventional) 뉴클레오티드가 핵산 분자내의 미리 결정된 부위에 혼입되어져 있는 핵산 분자를, 이것이 부착되어진 고상 지지체로부터 분리시키는 방법을 제공하며, 이 방법은 상기 비표준 뉴클레오티드의 부위에서 상기 핵산 분자를 선택적으로 절단하는 것을 포함한다.
핵산 분자는 임의의 뉴클레오티드 서열 (리보- 또는 데옥시리보뉴클레오티드 서열, 다시말해서 DNA 또는 RNA, 또는 이들의 변형체) 또는 뉴클레오티드 서열을 함유하거나 혼입한 임의의 분자일 수도 있다. 따라서, 핵산(들) 단독으로 구성된 분자 뿐만 아니라 핵산 성분과 다른 성분, 예를 들어 단백질 또는 펩티드와 같은 다른 분자 성분, 또는 일부 다른 유기 분자, 표지, 리간드 (즉, 한쌍의 친화성 결합 파트너의 하나), 효소 기질 등, 예를 들어 임의의 다른 분자, 또는 생물학적 또는 화학적 실재물을 포함하는 키메라 분자가 포함된다.
용어 "핵산 분자"는 핵산 (뉴클레오티드 서열) 및 핵산과는 상이한 화학적 특성의 다른 분자 성분 (예, 단백질, 지질, 탄수화물, 작은 유기 분자, 무기 분자, 방사능 마커 등)을 포함하는 구조물을 포함한다.
용어 "비표준 뉴클레오티드"란 그것이 혼입된 핵산 분자에서 통상 발생하지 않는 뉴클레오티드를 의미하며, 다시말해서 주어진 뉴클레오티드 서열 (핵산 분자)의 구성에서 뉴클레오티드가 그 서열에 고유한 것이 아닌 뉴클레오티드를 말한다. 즉, 예를 들면, DNA의 구성에서, 우라실 염기 (이하, "U")를 함유하는 뉴클레오티드는 비표준 뉴클레오티드인데, 그 이유는 U가 통상 DNA에서 발생하지 않고 RNA에서 발생하기 때문이다. 유사하게, DNA의 구성에서, 리보스 함유 뉴클레오티드는 비표준 뉴클레오티드이다 (역으로, 데옥시리보뉴클레오티드는 RNA에서 일반적이지 않다). 다른 비표준 뉴클레오티드는 자연에서 통상 발생하지 않는 변형된 뉴클레오티드, 예를 들어 화학적 유도체화된 뉴클레오티드이다. 따라서, DNA 뉴클레오티드 서열의 구성에서 비표준 뉴클레오티드는 A, T, C 또는 G이외의 임의의 뉴클레오티드이고 (그러나, A, T, C 또는 G의 변형은 비표준 뉴클레오티드로서 포함된다), RNA의 구성에서 비표준 뉴클레오티드는 A, U, C 또는 G 이외의 임의의 뉴클레오티드이다 (그러나, 그의 변형은 포함된다).
따라서, 비표준 뉴클레오티드는, 표준 염기 (DNA에 대해 A, T, C, G; RNA에 대해 A, U, C, G)의 변형, 유도체 또는 유사체일 수도 있는 "비표준" 염기를 갖는 것을 포함한다. "비천연적" (다시말해서, 고의로 변형된) 뉴클레오티드 이외에도, 뉴클레오티드의 천연 형태가 포함된다. 예를 들어, 우라실 및 하이포잔틴은 천연 염기이지만, 본 발명의 목적을 위해서 그들의 상응하는 뉴클레오티드는 DNA에 혼입될 때 비표준 뉴클레오티드이다.
"비천연적" 변형 뉴클레오티드는 알킬화 뉴클레오티드 및 알킬히드록실화에 의해 변형된 뉴클레오티드, 또는 임의의 다른 화학적 변형 또는 유도체를 포함한다. 대표적인 예는 N-7 메틸구아닌, 8-옥소구아닌, 데옥시우리딘, 데옥시이노신, 데옥시 5,6-디히드록시티민 (OSO4처리된 DNA에서 유래), 5'6'-디히드록시틴, 데옥시 3'-메틸아데노신 및 3'-메틸아데노신을 포함한다. 다른 비표준 뉴클레오티드는 손상된 DNA에서 발생하는 것으로 관찰되는 기타 염기, 예를 들어 개환된 피리미딘으로부터의 유도체 및 기타 산화 생성물을 포함할 수도 있다 [예를 들어, Sancar and Sancar (1988) Annu.Rev.Biochem. 57, 29-67].
혼입된 비표준 뉴클레오티드는 그것이 혼입된 핵산 분자를 선택적으로 절단하기 위한 부위를 제공한다. 즉, 비표준 뉴클레오티드는, 뉴클레오티드 서열내에 혼입될 수 있는 것, 예를 들어 폴리머라제 반응에 참여할 수 있고 천연 (정상적으로 발생하는)뉴클레오티드와 특이적으로 쌍을 이룰 수 있으며 선택적으로 절단가능한 것이다.
용어 "선택적 절단" 또는 "선택적으로 절단가능한" 등은, 핵산 분자가 다른 부위가 아닌 비표준 뉴클레오티드의 부위에서 특이적으로 절단될 수 있는 것을 의미한다. 즉, 절단은 "위치지정"될 수 있거나, 또는 다른 표현으로는 선택된 부위에서 제어된 절단이 일어날 수 있다. 이러한 방식으로 하나 이상의 선택적 부위가 선택에 따라 혼입될 수도 있고, 하나 또는 하나 이상의 비표준 뉴클레오티드가 혼입될 수도 있다.
그러나, 임의의 생물학적 체계에서와 같이, 절단의 절대 특이성이 항상 보장될 수 없고, 따라서 체계에서 일부 "허용"이 인정되는 것으로 이해된다. 즉, 비표준 뉴클레오티드(들)가 아닌 부위에서 약간 또는 무시할 수 있는 정도의 비특이적 절단이 발생할 경우가 허용될 수도 있다. 필요한 것은 절단이 비표준 뉴클레오티드(들)의 부위에서만 실질적으로 일어나는 것이다.
편리하게는, 이러한 선택적 절단은 문제의 특정한 비표준 뉴클레오티드에 대해 특이적인 효소를 사용함으로써 효소에 의해 달성할 수 있다. (본 명세서에서의 용어 "특이적"은 효소와 그의 상응하는 기질 사이의 관계를 나타내고, 역으로 기질은 상응하는 효소에 의해 인식된다). 필요한 것은, 효소가 식별가능한 방식으로다른 뉴클레오티드 (다시말해서, 핵산 분자에 존재하는 표준 뉴클레오티드)가 아닌 비표준 뉴클레오티드를 인식하고 이것을 절단하는 것이다.
이러한 특이적 효소는 전형적으로 특정한 염기 또는 특정한 염기들에 대해 특이성을 갖는 DNA 글리코실라제일 수도 있다. 즉, 글리코실라제 효소는 단지 하나 또는 특정한 군의 염기를 인식하고 그곳에서 작용한다. 이러한 효소는 염기 절제 DNA 복구 과정에 연관되는 것으로 생각되고, 정상 및 부적절한 염기 (즉, 부적절한 염기쌍 결합 (base pairing)) 또는 결함 (손상된) 염기를 인식하고 이들을 구별할 수 있다. DNA 글리코실라제는 N-글리코시드 결합을 파괴함으로써 DNA의 데옥시리보스-포스페이트 주쇄로부터 인식된 특정한 염기(들)를 절단함으로써 작용한다. 이 반응에 의해 발생된 염기제거 (abasic) (푸린 제거/피리미딘 제거) 부위는 불안정하고, 주로 높은 pH 또는 고온에 의해 쉽게 절단될 수 있다. 그러나, 뉴클레오티드 서열의 포스포디에스테르 결합을 파괴하는 화학 시약 또는 효소를 사용하는 방법을 포함한 일련의 염기제거 부위의 절단 방법을 이용할 수 있다. 이들은 이하에서 더욱 논의된다. 이는 본 발명에 따른 선택적 절단을 위한 메카니즘을 제공한다.
이러한 많은 효소들이 연구되어 왔으며 문헌 [예를 들어, Cleaver and Layher, (1995) Cell, 80, 825-827; 및 Sancar and Sancar, 상동 참조]에 기재되어 있다. 이러한 효소는 비표준 뉴클레오티드로서 그의 상응하는 기질과 함께 본 발명에서 사용될 수 있다.
그러나, 본 발명은 선택적 절단을 달성하기 위한 효소의 사용에 한정되지 않으며, 절단을 위해 임의의 적절한 메카니즘 또는 체계를 사용할 수도 있다. 즉, 예를 들면, DNA 뉴클레오티드 서열내에 혼입된 리보-뉴클레오티드는 높은 pH, 및 Mg2+및 Mn2+과 같은 이온과 같은 조건에 민감하며, 이러한 처리에 의해 단순히 달성되는 선택적 절단을 위한 부위를 제공할 수도 있다. 단지 데옥시리보뉴클레오티드 (예를 들어, dT, C, G, A, U)만으로 구성된 서열은 이러한 처리에 의해 영향을 받지 않는다. 따라서, 데옥시리보스 대신에 리보스가 존재하는 것은 하나의 위치에서 선택적으로 절단하는 방법을 제공한다. 하기 실시예 3은 cDNA 합성 방법에서 이러한 절단 체계의 유용성을 설명한다.
본 발명의 바람직한 구현양태에서, 핵산 분자는 DNA 분자이고, 비표준 뉴클레오티드는 U이며, 우라실 DNA 글리코실라제 (UDG) 효소 (또한, 우라실 N-글리코실라제 또는 UNG로서 공지됨)를 사용하여 선택적 절단이 달성된다. 이것은 천연 효소 또는 변형된 효소 및 각종 UDG 효소일 수도 있으며, 천연 및 변형 효소 모두가 당 기술분야에 공지되어 있고, 문헌 [예를 들어, Cleaver and Layher, 상기 문헌, 및 US-A-5,035,996; US-A-5,536,649 및 Longo 등, Gene (1990), 93, 125-128 (이 문헌들은 PCR에서의 전달 오염을 조절함에 있어서 UDG의 용도를 설명하고 있고 UDG 효소를 위한 공급원을 제공한다); 및 또한 WO92/01814 (이 문헌은 다른 글리코실라제 효소 뿐만 아니라 UDG 및 비표준 뉴클레오티드를 사용하는 PCR 전달 조절을 설명하고 있고 또한 상이한 UDG 효소의 범위 및 본 발명에서 사용될 수 있는 그들의 공급원을 설명하고 있다) 참조]에 기재되어 있다. 열안정성 형태 [Koulis,A 등,FEMS Microbiology Letters (1996) 143, 267-271; Kaboev, O.K. 등, Letters (1981) 132(2), 337-340] 및 열불안정성 형태 (HKTMUNG, 에피센터 테크놀로지스 인코포레이티드(EpiCentre Technologies Inc.)가 모두 공지되어 있다. UDG는 아머샴 라이프 사이언시스(Amersham Life Sciences) (영국), 뵈링거 만하임(Boehringer Mannheim) (독일) 및 에피센터 테크놀로지스 인코포레이티드 (미국)로부터 구입가능하다.
목적하는 성질을 가진 글리코실라제 효소는 천연 공급원으로부터 단리될 수도 있다. 즉, 예를 들면, 저온, 예를 들어 4 ℃에서 개선된 활성을 가진 효소는 한랭환경 유기체, 예를 들어 북극 새우로부터 선택될 수도 있다.
글리코실라제 유전자가 동정되고 클로닝되었다 [J.Biol.Chem., 1984, (259): 13723-13729 [이. 콜라이 (E.coli)], 및 J.Biol.Chem., 1989, 264: 9911-9914 [인간]]. UDG 대신에, 사용가능한 다른 글리코실라제가 이용될 수 있다. 이들은 하이포잔틴-DNA 글리코실라제, 3-메틸아데닌-DNA 글리코실라제 I, 3-메틸아데닌-DNA 글리코실라제 II, 히드록시메틸 우라실-DNA 글리코실라제 및 포름아미도-피리미딘 DNA 글리코실라제를 포함한다. 일례의 글리코실라제 및 상응하는 기질을 하기 표에 나타낸다.
DNA 글리코실라제
효소 DNA 기질에 함유된 성분
우라실-DNA 글리코실라제 우라실
Hx DNA 글리코실라제 하이포잔틴 (Hx)
3-mA DNA 글리코실라제 I 3-메틸아데닌 (3-mA)
3-mA DNA 글리코실라제 II 3-메틸아데닌, 7-메틸-구아닌 또는
3-메틸구아닌
FaPy DNA 글리코실라제 포름아미도-피리미딘 (FaPy) 잔기
5,6-HT DNA 글리코실라제 5,6-수화된 티민 (5,6-HT) 잔기
우레아 DNA 글리코실라제 우레아 잔기
PD DNA 글리코실라제 피리미딘 이량체(PD)
5-HmU DNA 글리코실라제 5-히드록시메틸 우라실 (5-HmU)
5-HmC DNA 글리코실라제 5-히드록시메틸 시토신 (5-HmC)
비표준 뉴클레오티드는 미리 결정된 부위에서 혼입되고 절단된다. 이것은 단순히, 핵산 분자내의 정확한 부위 및 원하는 위치에서 절단이 일어날 수 있도록 혼입 부위 (따라서 절단 부위)가 미리 선택 (또는 제어되거나 위치지정)될 수 있음을 의미한다. 핵산 분자의 한정된 위치(들)에서 비표준 뉴클레오티드가 혼입될 수도 있다.
상기 언급된 바와 같이, 본 발명의 방법은 핵산 분자와 연관된 고정 방법에서 유용성을 갖는다.
다른 측면에서, 본 발명은,
(a) 비표준 뉴클레오티드를 미리 결정된 부위에서 상기 핵산 분자내에 혼입하고;
(b) 상기 핵산 분자를 고상 지지체에 결합시키고; 이어서
(c) 상기 비표준 뉴클레오티드 부위에서 상기 핵산 분자를 선택적으로 절단하는 것을 포함하는,
핵산 분자를 가역적으로 고정하는 방법을 제공한다.
선택적 절단 단계 (c)에 의해 지지체로부터 핵산 분자가 분리된다.
단계 (a) 및 (b)는 순서대로 또는 동시에 수행될 수 있는 것으로 이해된다. 따라서, 예를 들면, 비표준 뉴클레오티드는, 예를 들어 뉴클레오티드 또는 상기 비표준 뉴클레오티드를 함유하는 뉴클레오티드 서열을 라이게이션시킴으로써, 고상 지지체에 결합된 후에 핵산 분자내에 혼입될 수도 있다. 대안적으로, 비표준 뉴클레오티드는, 이하 상세히 설명되는 바와 같이, 고상 지지체에 결합하기 전에 고체상 합성, 효소, 또는 화학적 결합이나 기타 결합 반응 (예, 친화성 결합)에 의해 핵산 분자내에 혼입될 수도 있다. 또한, 이하에서 더욱 상세히 설명되는 바와 같이, 프라이머 연장에 의해 핵산 분자를 형성하기 위해서는, 특정한 방법에 의해, 예를 들어 비표준 뉴클레오티드를 함유하는 고정된 프라이머 서열을 사용함으로써 "혼입" 및 "결합"이 동시에 일어나도록 할 수 있다.
편리하게, 본 발명의 방법에서 비표준 뉴클레오티드(들)는 핵산 분자내에 도입하거나 혼입된 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 서열의 일부로서 도입할 수도 있다.
이러한 뉴클레오티드 서열은, 뉴클레오티드로 구성되고 하나 이상의 위치에서 비표준 뉴클레오티드를 포함하는 테터(tether)로서 또는 "링커 서열"로서 고려될 수 있으며, 이들은 연속적이거나 비연속적일 수 있다. 이러한 "링커 서열"은 예를 들어 4 내지 100 뉴클레오티드 길이, 예를 들어 5 내지 50 및 편리하게는 10내지 30 또는 12 내지 21의 길이일 수도 있고, 완전히 비표준 뉴클레오티드로 구성될 수 있거나 또는 선택에 따라서 상이한 위치에서 하나 이상의 비표준 뉴클레오티드를 포함할 수도 있다.
이러한 점에서 사용을 위해 폴리- 및 올리고뉴클레오티드 서열을 합성하는 절차는 당 기술분야에 공지되어 있고 문헌에 기재되어 있으며, 임의의 공지된 방법이 사용될 수도 있다. 비표준 뉴클레오티드는 임의의 편리한 방식, 예를 들어 적절한 뉴클레오티드를 사용한 고체상 합성에 의해, 또는 효소, 예를 들면 폴리머라제 효소를 사용하여 대략적으로 제공된 뉴클레오티드의 혼입에 의해 편리한 방식으로 링커내에 혼입할 수도 있다. 대안적으로, 비표준 뉴클레오티드는 특이한 효소, 예를 들어 트랜스퍼라제 효소, 예컨대 상응하는 NTP (이 경우에 UTP) 전구체로 부터 UMP와 같은 모노뉴클레오티드를 첨가할 수 있는 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제를 사용하여 링커내에 혼입할 수도 있다.
유사하게, 링커 서열은 문헌에 공지되고 설명된 임의의 편리하거나 원하는 방식으로, 예를 들어 라이게이션에 의해 핵산 분자내에 도입할 수 있거나, 또는 주형-위치지정된 폴리머라제-촉매화 사슬 연장 반응을 위한 프라이머의 형태로 핵산 분자내에 도입할 수도 있으며, 이때 프라이머 (다시말해서 링커)는 사슬 연장 반응 생성물내에 혼입되어진다. 다시말해서, 본 발명의 핵산 분자는 프라이머-연장 생성물일 수도 있다. 이는 이하에서 더욱 언급된다.
다른 분자에 핵산을 결합하기 위한 방법은 또한 당 기술분야에 공지되어 있으며, 이하에서 더욱 상세히 언급된다.
고상 지지체는 현재 널리 사용되거나 고정, 분리 등을 위해 제안되어진 공지된 지지체 또는 기질일 수도 있다. 이들은 입자, 시트, 겔, 필터, 막 또는 마이크로타이터 스트립, 관 또는 판, 섬유 또는 모세관의 형태를 가질 수 있으며, 중합체 물질, 예를 들어 아가로스, 셀룰로스, 알기네이트, 테플론, 라텍스 또는 폴리스티렌으로 만들 수도 있다. 예를 들어 문헌 [Nilsson 등, Anal.Biochem. (1995), 224, 400-408]에 기재된 바와 같이 소형 실험 시스템을 제공하기 위해 바이오칩을 고상 지지체로서 사용할 수도 있다. 입상 물질, 특히 비이드가 일반적으로 바람직하며, 특히 넓은 범위가 당 기술분야에 공지되어 있는 중합체 비이드가 바람직하다. 조작 및 분리를 돕기 위하여, 자화될 수 있는 ("자석") 비이드가 바람직하다. 바람직하게는, 이러한 자석 입자는 자기 잔류 및 그에 따른 뭉침을 피하기 위해 초상자기성이고, 유리하게는 균일한 속도 및 분리를 제공하기 위해 단분산성이다. 초상자기 단분산성 입자의 제조는 신테프 (Sintef)에 의해 EP-A-106873호에 기재되어 있다.
다이날 AS (Dynal AS) (노르웨이 오슬로)사가 DYNABEADS로 시판하는 단분산성 중합체 초상자석 비이드가 본 발명에 따라 사용하기 위해 특히 적절하다.
핵산 분자는 비표준 뉴클레오티드(들)가 쉽게 절단될 수 있는 한, 임의의 편리한 수단, 예를 들어 물리적 또는 화학적 수단으로 고상 지지체에 결합시키거나부착시킬 수도 있다. 이것은 예를 들어 정전기, 예컨대 수소 결합, 포획, 또는 더욱 편리하게는 공유 결합에 의한 수단을 포함할 수 있으며, 예를 들어 지지체 표면 상의 기와 핵산 분자의 5' 말단에 있는 "링커" 또는 작용성 결합기 사이의 공유 결합에 의해 달성할 수도 있다. 핵산 분자는 상기-언급된 임의의 수단에 의하여 그 스스로 고상의 불용성 지지체에 결합될 수도 있는 다른 분자에 직접적 또는 간접적으로 결합할 수도 있다.
고상 지지체에 핵산을 결합하는 방법은 문헌에 기재되어 있으며, 뉴클레오티드 서열을 보유하거나 결합하기 위해 고상 지지체의 표면을 변형시키거나 변화시키는 방법이 있다. (개략적인 검토를 위하여, 예를 들면 문헌 [그레그 티.헤르만슨 (Greg T.Hermanson)에 의한 생접합 기술 (Bioconjugate Techniques), Academic Press, Inc. 1996 ISBN 0-12-34 2335, 제 17 장, 핵산 및 올리고뉴클레오티드 변형 및 접합] 및 문헌 [모하매드 아슬램 및 알라스테르 덴트 (Mohammed Aslam and Alastair Dent)에 의한 생체의료 과학을 위한 생체접합-단백질 결합 기술 (Bioconjugation-Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences), Macmillan Reference Ltd., 1998 ISBN 0-333-583752, 제 7 장, 단백질-핵산 접합체의 제조]를 참조한다).
자석 비이드에 대한 올리고뉴클레오티드의 결합은 예를 들어 EP-A-0640626에 기재되어 있다.
직접적인 공유 결합 이외에, 핵산은 친화성 결합 쌍에 의해 간접적으로 고상 지지체에 결합될 수도 있으며, 이때 결합 파트너의 하나는 고상 지지체 상에 있고다른 하나는 고정시키고자 하는 핵산 분자 상에 있다. 바이오틴-스트렙타비딘 (아비딘) 체계의 사용은 핵산을 고정시키는 수단으로서 분자생물학에서 공지되어 있으며, 스트렙타비딘을 포함하는 고상 지지체와 같이 바이오티닐화 뉴클레오티드를 쉽게 이용할 수 있다. 예를 들면, 스트렙타비딘이 코팅된 자석 비이드는 노르웨이 오슬로의 다이날 AS로부터 구입가능하고, 스트렙타비딘이 코팅된 관 및 마이크로웰 플레이트는 로슈 몰레큘 바이오케미칼스 (Roche Molecule Biochemicals)로부터 구입가능하다. 상이한 친화성 결합 파트너, 예를 들어 항원/합텐 및 항체, 효소 및 기질 등을 바이오틴/스트렙타비딘 대신에 사용할 수도 있다. 이러한 점에서 통상적으로 입수가능한 제품의 범위, 예를 들어 로슈 몰레큘라 바이오케미칼스의 항-디그옥시게닌 항체 포함하는 자기 입자, 항-플루오레세인 항체 및 항-바이오틴 항체가 존재한다. 핵산 분자는 또한 지지체상에 포함된 특정 DNA 결합 프로브에 의해 인식되는 뉴클레오티드 서열 (표적 부위), 예를 들어 lac 오페론에 결합하는 lac 억제인자 LacI를 혼입할 수도 있다.
프라이머에 의한 비표준 뉴클레오티드의 혼입은 본 발명에 따른 바람직한 구현양태를 나타낸다. 상기 언급된 바와 같이, 이는 비표준 뉴클레오티드를 혼입하고 고정시키고자 하는 핵산 분자를 제조하기 위한 쉬운 방법을 제공하며; 핵산 분자는 사슬-연장 반응에서 프라이머를 연장시킴으로써 형성되고, 프라이머에 혼입된 비표준 뉴클레오티드가 제공된다. 이는 단순히 프라이머 서열에 있는 비표준 뉴클레오티드 (NTP)를 포함하는 것, 예를 들어 합성 DNA 프라이머에서 하나 이상의 한정된 위치에 있는 표준 뉴클레오티드를 비표준 뉴클레오티드로 대체하는 것과 연관된다. 이러한 절차는 본 발명의 다수의 용도를 위한 기초를 형성한다.
프라이머 연장 반응은 당 기술분야에 공지된 반응, 예를 들어 단순한 선형 연장 반응일 수도 있으며, 이러한 DNA 또는 RNA 합성이다. 따라서, DNA 주형으로부터의 DNA 합성이 포함될 뿐만 아니라 RNA 주형으로부터의 DNA 합성 (역전사), DNA 주형으로부터의 RNA 합성 등이 있다. 또한, 지수적이든 아니든 간에, 프라이머-연장 원리를 기초로 한 시험관내 증폭 반응, 예를 들어 PCR 및 그의 변형이 포함된다. 프라이머 연장 반응은 오늘날 사용되는 다수의 분자 생물학적 절차의 기초를 형성한다. 즉, 핵산 분자는 PCR 생성물, 서열분석 생성물, cDNA 합성 생성물 또는 주형-발생 생성물 등일 수도 있다.
편리를 위하여, 고상 지지체에 고정 수단을 제공하는 링커 서열 (예, 프라이머)을 사용할 수도 있다. 이러한 수단은, 고상 지지체 상에 제공될 수도 있고 상응하는 결합 파트너에 결합할 수 있는 친화성 결합 파트너, 예를 들어 바이오틴이거나, 또는 화학 결합 반응을 겪을 수 있는 관능기, 예를 들어 고상 지지체상의 카르복실기 또는 CNBr-활성화 히드록실기와 상호작용할 수도 있는 아미노기 또는 말단 뉴클레오시드일 수도 있다.
비표준 뉴클레오티드를 혼입한 바이오틴화 폴리- 또는 올리고뉴클레오티드는 본 발명에 따른 특히 바람직한 측면을 형성하지만, 본 발명의 이러한 측면은 임의의 고정 수단이 제공되고 비표준 뉴클레오티드를 혼입하는 폴리- 또는 올리고뉴클레오티드를 또한 포함한다.
본 발명의 PCR (또는 유사한) 구현양태에서, 프라이머를 고상 지지체상에 고정하기 전 또는 후에 PCR 반응을 수행할 수도 있다; 고정 수단이 단순히 제공되는 것 보다는 고상 지지체에 이미 결합된 PCR 프라이머를 사용할 수도 있다.
따라서, 비표준 뉴클레오티드를 혼입한 고정 폴리- 또는 올리고뉴클레오티드가 본 발명의 범위에 포함된다. 바람직하게는, 이러한 고정 폴리- 또는 올리고뉴클레오티드가 바람직하게는 말단-부착을 통해 자석 비이드에 결합되고, 바람직하게는 이들은 5'-말단에 부착된다.
일례로, 본 발명의 장점을 가진 대표적인 PCR 반응이 설명될 수도 있다.
하나 또는 여러 위치에서 dTMP를 대체하는 dUMP를 가진 합성 올리고뉴클레오티드 (예, 바이오틴-GTAATACGACTCACTAUAGGGC)를 PCR에 사용할 수 있고, dTMP 함유 올리고뉴클레오티드와 동일한 방식으로 dsDNA 생성물내에 혼입시킨다. PCR 및 고상 지지체에 결합시킨 후에, 내부 dUMP 부위가 UDG 활성을 위한 표적이 된다. 이어서, 고온 또는 높은 pH에 의해 염기제거 부위를 절단할 수 있고 고상 지지체로부터 PCR 생성물을 방출한다. 대안적으로, 비-바이오틴화 상보 스트랜드를 먼저 열 변성에 의해 방출시켜, 고상 지지체에 고정된 바이오틴화 스트랜드를 남긴다. 단일 스트랜드 DNA를 UDG로 절단하여 그것을 방출하고, 양쪽 스트랜드를 별도로 수집하고 정제할 수 있다. 이는 혼성화 프로브 또는 cDNA 서브트랙션 (subtraction) 라이브러리 제조를 위해 센스 및 안티센스 스트랜드가 요구될 때 유용할 수 있다.
다른 비표준 뉴클레오티드/절단 체계, 및/또는 다른 프라이머 연장 반응, 예를 들어 서열분석 프라이머-기초 반응을 사용하여 유사한 절차를 수행할 수도 있다.
본 발명의 다른 중요한 용도는 cDNA의 제조에서이다. 이제 목적하는 mRNA에 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 포획 프로브를 사용함으로써 cDNA 합성을 위한 mRNA를 단리하는 것을 당 기술분야에서 확립하였다. 이어서, 역전사효소를 사용하는 연속 cDNA 합성 반응에서 결합된 포획 프로브를 프라이머로서 사용할 수도 있다 (예를 들어, 고체상을 기초로 한 cDNA 합성 연구를 기재하고 있는 다이날(Dynal) AS의 EP-A-0444119 참조). 이러한 포획 프로브/프라이머는 본 발명의 "링커 서열"을 구성할 수도 있다.
전체 mRNA를 단리하기 위하여, 통상적으로 올리고 dT 포획 프로브/프라이머를 사용하여 모든 mRNA 상에 존재하는 폴리 A 테일에 결합시킬 수 있다. 이러한 올리고 dT는 하나 이상의 비표준 뉴클레오티드, 예를 들어 U를 혼입함으로써 본 발명에 따른 용도를 위해 변형시킬 수도 있다. 유리하게는, 폴리- 또는 올리고 dU를 사용할 수도 있다. 이것은 제조가 간단하다는 장점을 갖는다.
올리고 (dU) 염기쌍 결합은 mRNA의 폴리 (A) 테일에 대해 올리고 (dT)보다 더욱 강하고, 이것은 올리고 (dU) 염기쌍 결합이 mRNA 포획을 향상시키기 때문에 올리고 (dU)의 사용에 특별한 장점이 된다는 것을 주목해야 한다.
따라서, 본 발명의 추가의 바람직한 측면은 고상 지지체에 대한 고정 수단, 바람직하게는 바이오틴을 제공하거나 또는 고상 지지체, 바람직하게는 자석 비이드에 결합된 올리고- 또는 폴리 dU를 제공한다.
고상 지지체로부터 cDNA 생성물의 제거는 본 발명의 바람직한 구현양태를 나타낸다.
올리고 (dT)를 포함하는 고상 지지체상에 고정된 mRNA 주형을 cDNA내로 복제할 수 있다. 이러한 역전사 반응 동안에, 생성된 cDNA는 올리고 (dT) 프라이머를 통해 고상 지지체에 공유 결합되어진다. 따라서, 일반적인 방법을 사용한 cDNA의 방출이 곤란하다. 올리고 (dT)내에 dUMP를 혼입함으로써 (예를 들어, 5'TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTU), UDG 활성을 위한 표적인 부위가 생성된다. 고온 또는 높은 pH에 의한 염기제거 부위의 절단은 고상 지지체로부터 cDNA를 방출시킨다. 대안적으로, 다수의 표적 부위를 도입할 수 있다 (예를 들어, 5'UUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUU). 역전사 후에, UDG 절단에 의해 결합 cDNA 생성물을 방출하기에 앞서서, RNase H와 같은 RNase 절단 또는 임의의 기타 수단, 예컨대 높은 pH에 의하여 RNA 스트랜드를 제거하는 것이 편리하거나 유리할 수도 있다.
프라이머 연장 기초 방법 이외에, 본 발명의 방법은 다른 시험관내 증폭 방법, 예컨대 리가아제 사슬 반응 (LCR) 및 Qβ 복제효소 체계 (WO 87/06240)와 연관시킬 수도 있다. 즉, 예를 들어 라이게이션과 같은 기타 수단에 의해 핵산 분자를 형성할 수도 있다. 비표준 뉴클레오티드(들)가 LCR 반응에서 라이게이션된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드에 포함될 수도 있으며; LCR 올리고뉴클레오티드가 본 발명에 따른 링커 서열로서 작용할 수도 있다.
본 발명의 상기에 기재된 구현양태에서, 핵산 분자는 원칙적으로 DNA 분자 또는 DNA-RNA 분자일 수도 있다. 그러나, 다른 형태의 구조물, 예를 들어 한 말단에 고정 수단을 제공하고 다른 말단에서 예를 들어 추가의 DNA 서열, RNA 서열, RNA-DNA 서열 또는 이중 스트랜드 DNA에 연결되는 "링커 서열"도 가능한 것으로 이해된다. 즉, 오로지 "핵산-함유" 핵산 분자의 다양한 형태가 가능하다. 이러한 핵산 분자는 당 기술분야에 공지된 기술에 따라 임의의 통상적이거나 편리한 방식으로 제조할 수 있다. 예를 들어, 올리고뉴클레오티드 합성기를 사용하여 RNA-DNA 구조물을 쉽게 합성할 수 있다. 대안적으로, RNA 리가아제를 사용하여 RNA 및 DNA를 결합시킬 수도 있다 (이는 또한 DNA를 DNA에, RNA를 RNA에 결합시킨다). 적절한 폴리머라제 효소, 예를 들어 T7 DNA 폴리머라제와 같은 변이 DNA 폴리머라제를 사용하여 각각의 dNTP 또는 rNTP를 뉴클레오티드 사슬내에 효소에 의해 도입할 수도 있다 [Sausa and Padilla (1995) EMBO J. 14, 4609-4621].
또한, 상기 언급된 바와 같이, 핵산 분자의 다른 구조물 또는 키메라 형태도 가능하다.
따라서, 핵산 분자는 편리하게는 단백질 (또는 펩티드 또는 폴리펩티드), 예를 들어 항체 또는 그의 단편 (항체 유도체 및 단일 사슬 항체와 같은 합성 항체 포함), 효소 또는 수용체 단백질 또는 일부 기타 결합 단백질 또는 그의 결합 부분 또는 단편 (예, 스트렙타비딘, 단백질 A, 단백질 G, 단백질 L, 또는 그의 단편 또는 임의의 공지된 합성 또는 변형 (예를 들어, 유전학적으로 변형된) 친화성 결합 단백질, 예컨대 항체, 렉틴 등)에 결합된 링커 서열을 포함할 수도 있다. 대안적으로, 링커 서열은 효소 기질, 수용체 리간드, 항체/합텐 또는 그의 단편 등에 결합시킬 수도 있다. 따라서, 유리하게는, 키메라 핵산 분자의 "두번째" 성분은 친화성 결합 기, 다시말해서 친화성 결합 파트너의 하나이다.
이러한 키메라 핵산 분자는 친화성 결합을 기초로 한 고체상 방법 또는 절차, 예를 들어 세포 또는 단백질 또는 기타 분자의 분리 및 정제 절차에서 또는 분석시험에서 유용성을 갖는다.
본 발명의 추가의 측면은, 선택적으로 절단할 수 있는 비표준 뉴클레오티드를 미리-결정된 부위에 포함한 뉴클레오티드 서열을 구조물내에 혼입시키는 것을 포함하는, 고상 지지체에 결합시키고 이어서 이로부터 절단하기 위한 구조물을 제조하는 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 미리 결정된 부위에 선택적으로 절단가능한 비표준 뉴클레오티드를 포함하고, 관능기, 바람직하게는 친화성 결합기 또는 리포터 기에 결합된 뉴클레오티드 링커 서열을 포함하는 키메라 분자 (또는 구조물)을 제공한다.
유리하게는, 이러한 키메라 분자에서, 링커 서열이 상기 언급된 바와 같이 고정되거나 (다시말해서, 고상 지지체에 결합) 또는 링커 서열에 고상 지지체에 대한 고정 수단을 제공한다.
관능기는 예를 들어 결합 활성 또는 검출가능하거나 분석 또는 분리 절차에서 유용한 시그날-제공 활성과 같은 성질을 가진 임의의 기일 수도 있다. 유리하게는, 상기 언급된 바와 같이, 관능기는 친화성 결합기이다. 이러한 친화성 결합기는 상기 언급된 바와 같은 친화성 결합 단백질 또는 그의 유도체일 수도 있거나, 또는 예를 들어 합텐/항원 또는 바이오틴 또는 임의의 유기 분자와 같은 친화성 결합 성질을 나타내는 리간드일 수도 있거나, 또는 개발되어진 새로운 세대의 친화성 결합기, 예를 들어 합성 또는 키메라 항체 또는 기타 항체 유도체 및 항체 모의체(예컨대 단일 사슬 항체 또는 그들의 유도체) 또는 임의의 랜덤 라이브러리 또는 랜덤 디스플레이에 의해 생성된 결합 분자일 수도 있다. 대안적으로, 이것은 리포터 기일 수도 있다. 본 명세서에서, 이것은 검출가능한 시그날을 제공하거나 또는 시그날-발생 반응에 참여할 수 있는 기를 포함하는 것으로 정의된다. 즉, 기는 예를 들어 효소 기질, 또는 마커 또는 표지, 예를 들어 방사능 표지를 포함할 수도 있다.
본 발명은 또한 친화성 결합 기에 리포터 기, 예를 들어 표지가 제공된 구조물을 포함한다. 이것은 당 기술분야에 공지되거나 문헌에 기재된 표지, 예를 들어 방사능 표지 또는 일부 기타 검출가능한 표지, 예를 들어 착색, 안료, 색소, 형광 또는 화학발광 표지, 또는 효소 마커일 수도 있다.
대표적인 관능기는 항체 또는 결합 단백질, 예컨대 임의로 표지화될 수도 있는 스트렙타비딘; 효소, 예를 들어 고추냉이 퍼옥시다제 (HRP) 또는 알칼리성 포스파타제 (AP); 효소 기질, 예를 들어 연구 하에 있는 효소용 기질일 수도 있는 펩티드, 예를 들어 HIV 프로테이나제 또는 티로신 키나아제 인산화 부위; 또는 효소 분석을 위한 기질 (예, 테스토스테론 또는 일부 기타 생체분자); 탄수화물; 지질; 합텐 (예, 작은 유기 분자) 및 표지를 포함한다.
이러한 구조물에서, 링커 서열은 바람직하게는 올리고- 또는 폴리- dU 서열, 바람직하게는 고정을 위한 수단으로서 바이오틴 기를 보유하는 서열이다.
바람직한 관능기는 항체 또는 그의 단편 또는 유도체, 또는 합텐이다.
뉴클레오티드 서열을 다른 분자에 결합시키기 위한 방법이 당 기술분야에 공지되어 있으며, 이러한 구조물은 예를 들어 상기 헤르만슨 (Hermanson)의 문헌 및 상기 아슬램 및 덴트의 문헌 (Aslam and Dent)에 기재된 방법에 따라 제조할 수도 있다. 올리고뉴클레오티드 (변형될 수도 있음)를 다른 분자에 결합시키기 위한 절차 및 방법에 대한 일반적 지침은 문헌 [R.Helmuth (1990) PCR 프로토콜: A Guide to Methods and Application, 제 15 장, Academic Press, Inc. 및 Y.M.Dennis Lo. 등 (1990) PCR 프로토콜: A Guide to Methods and Application, 제 14 장, Academic Press, Inc.]에서 찾아볼 수 있다.
또다른 화학 기, 예를 들어 리포터 기, 예컨대 형광 표지와 같은 표지 (예, TAMRA, 로다민 또는 기타 공지된 형광 표지)를 합성 동안에 올리고뉴클레오티드에 부착시킴으로써 "변형된" 올리고뉴클레오티드를 제조할 수도 있음이 공지되어 있다. 이러한 화학 기는 상기 언급된 바와 같은 친화성 결합 파트너, 예를 들어 항체와의 결합을 위한 표적을 제공하는 디그옥시게닌, 에스트라디올 또는 디니트로페놀 (DNP)와 같은 합텐, 또는 바이오틴 (스트렙타비딘/아비딘과 결합) 또는 항체와의 결합을 위한 리포터 기 및 항원/합텐 양쪽 모두일 수도 있는 실재물, 예를 들어 플루오레세인일 수도 있다. 많은 변형된 올리고뉴클레오티드가 예를 들어 오스웰 리서치 프러덕츠 리미티드 (Oswell Research Products Ltd.)(영국 사우쓰앰프턴 소재)로부터 통상적으로 입수가능하다. 상기 설명된 바와 같이, 본 발명의 키메라 분자에서, 단일 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 추가의 "화학기" (또는 "변형된 단위"), 예를 들어 고정 부분 (즉, 고정을 위한 수단), 예컨대 바이오틴 및 친화성 결합기 (예, 합텐), 또는 리포터기 (예, 표지)를 보유할 수도 있다. 예를 들면,본 발명의 키메라 분자는 5' 말단에 바이오틴 분자를 보유하고 3' 말단에 아미노기를 보유하는 올리고뉴클레오티드의 형태를 취할 수도 있고, 이때 아미노기는 올리고뉴클레오티드에 아미노-반응성 분자를 부착시키는 수단을 제공하기 때문에 예를 들어 표지화를 위해 사용할 수도 있다. 대안적으로, 그의 3' 말단에서 올리고뉴클레오티드는 디그옥시게닌과 같은 합텐을 보유할 수도 있다. 표지화를 위하여, 디그옥시게닌을 항-디그옥시게닌 항체를 통해 고추냉이 퍼옥시다제 (HRP)와 같은 효소에 결합시킬 수도 있다.
공지된 일반적 기술을 사용한 분리 절차에서 구조물을 사용할 수도 있다. 즉, 예를 들면, 항체 관능기의 경우에, 분리시키고자 하는 표적 실재물, 예를 들어 세포 또는 단백질에 결합시키기 위해 구조물을 사용할 수도 있다. 표적 실재물에 결합하기 전 또는 후에 구조물을 고정하는 것은 표적 실재물의 분리를 용이하게 하고, 그 후에 본 발명에 따라 링커 서열을 절단함으로써 표적 실재물이 방출될 수도 있다.
예를 들면, 단백질 정제 절차에서, 문제의 단백질을 위한 친화성 결합 기 (즉, 리간드)가 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드 "링커"서열을 통해 고상 지지체에 결합될 수도 있다. 이러한 구조물에서, 본 발명의 키메라 분자는 고정을 위한 수단, 절단가능한 "링커 서열", 및 목적하는 표적 단백질을 위한 친화성 포획 리간드를 포함한다.
일례의 친화성 포획 리간드는 티록신-결합 단백질을 정제하기 위하여 L-티록신을 포함하고 [Pensky and Marshall (1969) Arch. Biochem. Biophys. 135:304],폴레이트-결합 단백질을 포획하기 위하여 엽산을 포함하고 [Salter 등, (1972) FEBS Lett. 20:302], 지질단백질 (HDL 및 LDL)을 포획하기 위하여 콜레스테릴 헤미숙시네이트를 포함한다 [Wichman (1979) Biochem. J. 181:691]. 각각의 경우에, 리간드가 지지체로부터 절단되어 단백질 및 부착된 리간드의 수집을 가능하게 한다. 리간드는 L-리신과 같은 작은 분자, 단백질 A에서와 같은 단백질, D(+) 멜리비오스와 같은 탄수화물 또는 콘카나발린 A와 같은 렉틴일 수도 있다. 모든 효소의 1/3이 정제를 위한 수단을 제공하는 뉴클레오티드 조효소를 필요로 하기 때문에, 뉴클레오티드 리간드가 특히 효소 정제를 위해 선호된다 [Barker 등, (1972) J.Biol.Chem. 247:7235]. 입체 장해를 감소시키기 위하여, 절단가능한 올리고뉴클레오티드 링커 서열과 리간드 사이의 스페이서 팔을 사용하여 리간드-단백질 상호작용을 증대시킬 수도 있다. 예를 들면, 뉴클레오티드 리간드는, 종종, 아데노신 5' 모노포스페이트에 대한 N-6와 같은 염기를 통해 8, 9 또는 11개 원자의 스페이서 팔에 부착됨으로써 고정된다 (목록 번호 A3019, 시그마-알드리치 컴퍼니 (Sigma-Aldrich Company)) [Chaffotte 등, (1977) Eur.J.Biochem. 78:309].
유사한 원리가 분석, 예를 들어 ELISA 분석, 또는 당 기술분야에 공지된 다른 분석 원리에 사용될 수도 있다.
본 발명이 제공하는 고상 지지체로부터 항체-효소 복합체를 절단하는 능력은 ELISA 분석에서 유용성을 갖는다. 통상, ELISA와 같은 분석에서, 단지 하나의 리간드 (즉, 분석 표적)가 검출되어, 각 웰에서 정량될 수 있다. 그러나, 변형은 다중화 접근법에 의해 몇 개의 리간드가 검출될 수 있도록 한다. 예를 들면, 각각의리간드에 대해 특이적인 항체를 사용하는 것과 동시에 2개 이상의 리간드 (이 경우에 분석 표적)를 ELISA 플레이트의 웰에서 포획할 수도 있다. 첫번째 리간드에 대해 특이적인 제 2의 항체를 첨가하여 효소에 연결시킬 수도 있거나, 본 발명에 따른 절단가능한 링커 서열, 예컨대 폴리 (dU)를 통한 다른 검출 방법을 사용할 수도 있다. 전형적으로 웰을 처리한 다음, 효소를 복합체로부터 분리하고 절단가능한 링커를 사용하여 세척할 수도 있다. 이에 의해 두번째 리간드에 대해 특이적인 두번째 제2의 항체를 웰에 첨가할 수 있고, 처음에서와 같이 효소 분석을 수행할 수 있다. 전체 공정을 수회 반복하여 ELISA 분석을 다중화할 수도 있다.
세포 단리 절차에서 본 발명의 가역적인 고정 방법의 사용은 바람직하고 유리한 측면을 나타낸다.
따라서, 본 발명의 이러한 측면은, 상기 정의된 키메라 분자에 의하여 고상 지지체에 상기 표적 세포를 결합시키는 것을 포함하는, 시료로부터 표적 세포를 분리하는 방법을 제공하며, 여기에서 상기 관능기는 상기 세포에 특이적으로 결합하는 친화성 결합 기이다. 상기 뉴클레오티드 링커 서열을 절단함으로써 고상 지지체로부터 이러한 방식으로 분리된 세포가 방출될 수도 있다.
따라서, 더욱 특별하게는, 본 발명의 이러한 측면은
(a) 상기 표적 세포에 특이적으로 결합하는 친화성 결합 파트너에 의해 상기 표적 세포를 고상 지지체에 결합시키고, 상기 결합 파트너와 상기 지지체 사이의 연쇄는 선택적으로 절단가능한 비표준 뉴클레오티드를 미리 결정된 부위에 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함하며;
(b) 시료로부터 지지체-결합된 세포를 분리하고;
(c) 상기 비표준 뉴클레오티드 부위에서 상기 뉴클레오티드 서열을 선택적으로 절단함으로써 지지체로부터 상기 표적 세포를 방출하는 것을 포함한다.
본 명세서에서 용어 "세포"란, 모든 진핵 (고세균 포함) 및 원핵 세포, 바이러스 및 마이코플라즈마와 같은 기타 생존가능하거나 막-외피의 실재물, 및 세포소기관과 같은 세포하 성분을 포함하기 위해 사용된다. 따라서, 대표적인 "세포"는 모든 유형의 포유류 및 비-포유류 동물 세포, 조류를 포함한 식물 세포, 원형질체, 진균, 남색세균 (남조류)을 포함한 세균, 마이코플라즈마, 프로토조아, 박테리오파지를 포함한 바이러스, 및 세포소기관을 포함한다.
시료는 예를 들어 식품 및 같은 계통의 제품, 임상 및 환경 시료를 포함하여, 이러한 세포를 함유하는 임의의 물질일 수도 있다. 즉, 시료는 생물학적 시료일 수도 있고, 이는 모든 진핵 또는 원핵 세포, 바이러스, 박테리오파지, 마이코플라즈마, 원형질체 및 세포소기관을 포함한 임의의 바이러스 또는 세포 물질을 함유할 수도 있다. 이러한 생물학적 물질은 모든 유형의 포유류 및 비-포유류 동물 세포, 식물 세포, 남조류를 포함한 조류, 진균, 세균, 원생동물 등을 포함할 수도 있다. 따라서, 대표적인 시료는 완전 혈액 및 혈액-유래 물질, 예컨대 혈장 또는 피막, 뇨, 분변, 뇌척수액 또는 임의의 기타 체액, 조직, 세포 배양물, 세포 현탁물 등을 포함하고, 또한 토양, 물 또는 식품 시료와 같은 환경 시료를 포함한다.
시료는 또한 비교적 순수하거나 부분적으로 정제된 출발 물질, 예컨대 다른 세포 분리 방법에 의해 수득되는 반-순수 제제를 포함할 수도 있다.
결합된 세포를 방출하기 위하여 DNA 글리코실라제를 사용한 효소 절단이 사용되는 경우에, 일부 상황에서 글리코실화 작용에 의해 발생되는 염기제거 부위를 절단하기 위해 통상적으로 사용되는 더욱 공격적인 절단 조건 (예를 들어, 고온 및/또는 높은 pH)을 피하는 것이 바람직할 수도 있다. 즉, 생체 세포에 적합한 더욱 생리적인 조건하에서 절단을 달성하기 위해서는, 생리적인 조건하의 효소에 의한 절단과 효소에 의해 절단된 (즉, 분해된) 뉴클레오티드 링커를 파괴하기 위한 기계적 응력과의 조합을 근거로 하여 세포 분리 프로토콜에서 DNA 글리코실라제를 사용할 수도 있다. 이러한 기계적 응력은 외부적으로, 예를 들면 교반, 혼합, 피펫팅 또는 휘저음 등에 의해 제공될 수 있지만, 단순히 연결된 실재물, 즉 세포 및 고상 지지체에 의한 연쇄 상에서 기대되는 기계적 응력으로 충분할 수도 있다.
그러나, 원한다면, DNA 글리코실라제 작용에 의해 발생되는 염기제거 부위의 절단을 증대시키기 위해, 화학 시약 또는 효소, 예를 들어 염기제거 부위에서 절단되는 엑소뉴클레아제 III 또는 이. 콜라이 엔도뉴클레아제 IV와 같은 "절단 시약"의 사용을 포함하는 추가의 방법이 사용될 수도 있다. 이는 또한 온화한 절단 절차가 채택될 수 있도록 한다. 이러한 절단 방법은 이하 실시예에서 더욱 예시화된다.
세포 분리 및 취급에 도움이 되는 낮은 온도 (예, 4 ℃)에서도 잘 작용할 수 있는 "한랭적응" 또는 "내한성"효소, 예를 들어 상기 언급된 바와 같은 북극 새우와 같은 한랭 환경 유기체의 효소를 사용하는 것이 세포 분리 절차를 위해 특히 유리할 수도 있다.
본 발명의 주요 장점은 다중화를 용이하게 할 수 있다는 것이다. 더욱 특별하게는, 본 발명은 하나 이상의 (사실상 많은) 다른 유형의 존재하에서 하나의 유형의 "연쇄"를 선택적으로 절단하는 능력을 제공한다. 이러한 능력은 많은 분야에서 실질적인 잠재력을 갖는다. 즉, 각각(또는 각각의 개체군 또는 분자의 "유형", 등) 비표준 뉴클레오티드/링커 서열의 특성이 상이한, 다수의 핵산 분자를 형성하기 위하여, 상이한 비표준 뉴클레오티드들을 상이한 핵산 분자, 예를 들어 핵산 분자를 생성하기 위해 사용되는 상이한 링커 서열내에 혼입할 수도 있다. 이것은, 하나의 핵산 분자 (예, 링커 서열)를 특정한 비표준 뉴클레오티드에 특이적인 적절한 절단 체계 (즉, 글리코실라제 효소)를 사용하여, (상이한 핵산 분자/링커의 존재하에서) 선택적으로 절단할 수 있음을 의미하는 것이다. 따라서, 이것은 다수의 상이한 핵산 분자 (또는 분자의 상이한 "유형" 또는 "개체군")가 고상 지지체(동일하거나 상이할 수도 있음) 상에 고정되고, 각각의 이러한 분자 (또는 "유형" 또는 "개체군")가 선택적으로 절단가능한 비표준 뉴클레오티드, 예를 들어 선택적으로 분리가능한 링커 서열의 존재에 의해 고상 지지체로부터 선택적으로 분리될 수 있는 가능성을 열어놓는다. 다시말해서, "상이한" 링커 서열 (비표준 뉴클레오티드의 성질이 상이함)은 상이한 핵산 분자를 고상 지지체에 구속하거나 부착시키기 위해 사용될 수도 있는 상이한 "테터(tether)" 또는 연쇄 체계의 범위를 나타낸다. 이어서, 이는 각각의 링커 서열이 다른 것들의 존재하에 선택적으로 절단되도록 하고, 이에 의해 각각의 상기 링커 서열을 통해 부착된 부분 (즉, 핵산 분자)을 선택적으로 분리할 수 있다.
본 발명의 이러한 구현양태는, 일반적 의미에서, 상이한 핵산 분자들이 부착된 고상 지지체로부터 다수의 상이한 핵산 분자를 선택적으로 분리시키는 방법을 제공하는 것으로 이해될 수 있으며, 이때 비표준 뉴클레오티드가 각각의 상기 핵산 분자에서 미리 결정된 부위에 혼입되고, 각각의 상이한 핵산 분자는 상이한 비표준 뉴클레오티드를 혼입하며, 상기 방법은 상기 비표준 뉴클레오티드의 부위에서 상기 각각의 핵산 분자를 선택적으로 절단하는 것을 포함한다.
따라서, 다수의 핵산 분자의 하나 또는 그 이상 (즉, 하나 이상의 상이한 유형)이 선택에 따라 선택적으로 분리될 수 있다.
상기 언급된 바와 같이, 고상 지지체는 각각의 상기 상이한 핵산 분자에 대해 동일하거나 상이할 수도 있으며, 각각의 상이한 핵산 분자의 선택적 절단은 따로따로 (예를 들어, 상이한 분취액에서, 또는 공간적으로 분리되어) 일어나거나 연속적으로 일어날 수 있다.
상기에 또한 언급된 바와 같이, 상이한 "핵산 분자"는 핵산 분자의 상이한 유형 또는 개체군일 수도 있다. 여기에서 사용된 용어 "다수"란 2 이상을 의미한다.
유사하게, 본 발명은, 상이한 비표준 뉴클레오티드가 각각의 상이한 핵산 분자내에 혼입되어 있는, 다수의 상이한 핵산 분자를 가역적으로 고정 (상기 정의된 바와 같음)시키는 방법을 제공한다.
이러한 방식으로 다중화하는 것은, 상이한 친화성 부분 (다시말해서, 상이한 친화성 결합 기)에 의해 결합된 표적이 선택적으로 방출되도록 할 수 있기 때문에,친화성 기초 분리 또는 분석 분야에서 유용하게 적용될 수 있다. 즉, 예를 들어 세포 분리 상황에서, 본 발명에 따라, 절단 링커 서열에 결합된 친화성 기 (또는 일부 다른 친화성 결합기)를 포함하는 구조물을 통해 여러 개의 상이한 세포 유형이 고상 지지체에 결합될 수도 있다. 각각의 항체 유형 (즉, 각각의 친화성 결합 기)은 상이한 절단가능한 링커 서열 (예, 폴리 U, 메틸 아데닌 등)을 가질 수도 있다. 이어서, 세포의 전체 개체군을 항체-비이드 혼합물과 인큐베이션하고 선택적으로 절단가능한 태그 (즉, 링커)를 통해 비이드에 결합시킬 수도 있다. 사용자는, 다른 링커 서열 (예를 들어, 테터 "2")에 대해 특이적인 글리코실라제가 첨가될 때까지 임의의 다른 세포 유형 (예, 세포 유형 "B")이 분리되지 않도록 하면서, 항체 결합 세포 유형 "A"가 부착된 링커 서열 (테터 "1"로 명명)에 대해 특이적인 글리코실라제를 첨가함으로써, 분리할 세포 유형 (예를 들어, 세포 유형 "A"로 명명)을 선택할 수 있다. 이는 세포 시료가 정확하고 단지 제한된 수의 세포만이 이용될 경우에 흥미를 끌 수 있다. 예를 들면, 동일한 관에서 CD4- 세포를 CD8+와 정제할 수 있고, 이어서 각각의 세포 개체군을 글리코실라제 1, 2 등의 첨가에 의해 차례로 분리한다.
다중화 접근법의 추가의 적용은 PCR 생성물 분리 또는 정제 분야에 존재한다. 즉, 예를 들면, 각각의 바이오틴화 PCR 프라이머에 특정한 링커를 첨가할 수도 있다. 대표적인 예로서, 정방향 및 역방향 PCR 프라이머는 각각 상이한 비표준 뉴클레오티드를 혼입할 수 있다. 예를 들면, 프라이머 T3은 U를 혼입할 수 있고,프라이머 T7은 메틸 아데닌 (MA)을 혼입할 수 있다 (다시말해서, T3U및 T7MA). 증폭 및 스트렙타디빈 비이드에 대한 결합 후에, 변성에 의해 스트랜드를 분리하고, 글리코실라제 UDG 또는 메틸 아데닌 (MA) 글리코실라제를 사용하여 각각의 PCR 생성물 스트랜드를 차례로 분리할 수도 있다. 이는 정제된 각각의 스트랜드에 대해 별도의 정제 관을 제조해야 하는 것을 간편화한다.
대안적으로, 다중 RT-PCR 반응물은 유전자 발현 수준을 비교하는 동시에 정제할 수 있다. 다시말해서, 각각 상이한 비표준 뉴클레오티드를 가진, 상이한 유전자의 RT 프라이머를 사용하여, 상이한 유전자의 발현 수준 또는 패턴을 비교할 수도 있으며, 이는 각각의 상이한 RT 생성물이 상대적으로 절단될 수 있도록 한다. 이러한 방법의 대표적 예로서, 예를 들면 GAPDH에 대한 분석으로 U를 함유하는 정방향 (또는 역방향) 바이오틴화 프라이머 (예, GAPDH-FU)를 사용하는 분석을 생각할 수 있다. 이어서, 목적하는 mRNA, 예를 들어 p53에 대한 분석에서 바이오틴 p53-FMA을 사용한다. PCR 반응은 형광 데옥시뉴클레오티드를 GAPDH 및 p53 PCR 생성물 양쪽 모두에 혼입시키고, 이들은 모두 바이오틴-결합 고상 지지체, 예를 들어 스트렙타비딘-비이드 (예, 다이날 ASA로부터의 M-280 다이나비이드(Dynabeads), 노르웨이)를 함유하는 동일한 관에서 함께 정제할 수 있다. 혼입되지 않은 뉴클레오티드를 제거하기 위해 세척 등을 수행한 후에, UDG를 첨가하고, 비이드로부터 형광 방출량을 분석함으로써 GAPDH PCR 생성물의 양을 측정할 수 있다. 유사하게, 메틸 아데노신 글리코실라제의 첨가 후에 p53을 측정할 수 있다.
이러한 다중화 접근법에 대한 유일한 제한은 상이한 글리코실라제의 수이다. 10개의 글리코실라제 효소 및 4개의 형광 뉴클레오티드의 경우에, 다중화에 의해, 동일한 비이드 관으로부터 40개의 상이한 PCR 생성물의 방출을 측정하는 것이 가능하다.
다중화 접근법의 또 다른 적용은, 서열분석 및 특히 다수 서열 반응의 정제에 존재할 수 있다.
본 발명은 여러 개의 서열분석 반응이 함께 정제될 가능성을 제공한다. 이는 상이한 비표준 뉴클레오티드를 혼입한 상이한 서열분석 프라이머를 사용함으로써 가능해진다. 정제를 용이하게 하기 위하여, 상이한 프라이머들에 동일하거나 상이할 수 있지만 편리하게는 동일한 고정 수단, 예를 들어 바이오틴 (스트렙타비딘-보유 고상 지지체, 예를 들어 비이드에 결합됨)을 제공할 수도 있다. 예를 들면, 여러 개의 형태, 예컨대 (1) 서열 어딘가에 우라실을 갖는 형태 (T3U) 또는 (2) 서열에 메틸 아데닌을 갖는 형태 (T3MA)등으로 존재하는 바이오틴화 T3 서열분석 프라이머를 사용할 수도 있다. 첫번째 서열분석 반응은 프라이머 T3U을 사용하고 두번째 별개의 반응은 프라이머 T3MA을 사용한다. 서열분석 반응이 완결된 후에, 첫번째 및 두번째 반응물을 함께 혼합하고 스트렙타비딘 비이드상에서 정제한다. 세척 후에, UDG를 첨가하여 반응 1의 방출을 일으키고, 이어서 반응을 "판독"할 수도 있으며 (예를 들어, 서열분석 겔 상에 로딩), 메틸 아데닌 글리코실라제의 첨가에의해 반응 2를 방출시킨 다음 판독한다. 분명하게, 방출될 수 있는 서열분석 반응의 수는 이용가능한 상이한 글리코실라제의 수에 의해서만 한정된다. 이러한 다중화 접근법은 고처리량 서열분석 실험실에서 선호될 수 있다. 비이드-서열분석 반응 혼합물을 함유하는 96-웰 플레이트에서, 처음의 96개 반응을 제거하기 위해 모든 96-웰에 UDG를 첨가할 수 있고, 이어서 96개 반응의 두번째 배치를 제거하기 위해 동일한 96 웰에 메틸아데닌 글리코실라제를 첨가할 수 있으며, 계속 같은 방식이다. 요구되는 생성물은 간단히 T3U및 UDG, T3MA및 메틸 아데닌 글리코실라제 등이다. 정제의 서열분석 반응에 대해서는 어떠한 변화도 일어나는 것이 필요하지 않으며, 단지 비이드로부터 DNA가 방출된다.
본 발명의 방법을 수행하기 위해 필요한 성분, 또는 수단은 키트의 형태로 편리하게 제공될 수도 있다.
따라서, 본 발명의 추가의 측면은 상기 정의된 바와 같이 본 발명에서 사용하기 위한 키트를 제공하며, 상기 키트는
(a) 핵산 분자내에 비표준 뉴클레오티드를 도입하기 위한 수단; 및
(b) 상기 비표준 뉴클레오티드의 선택적 절단을 위한 수단을 포함한다.
수단 (a)는 편리하게는 상기 비표준 뉴클레오티드를 함유하는 올리고뉴클레오티드 서열, 예를 들어 상기 기재된 바와 같은 링커 서열, 바람직하게는 프라이머일 수도 있다.
수단 (b)는 편리하게는 DNA 글리코실라제 효소일 수도 있다.
키트는 고상 지지체와 같은 추가의 성분, 또는 고상 지지체에 고정하기 위한 수단을 추가로 포함할 수도 있다. 바람직하게는, 키트는 고상 지지체에 고정하기 위한 수단, 바람직하게는 바이오틴이 제공되거나, 또는 고상 지지체, 바람직하게는 자석 비이드에 결합된 올리고- 또는 폴리 dU를 포함할 수도 있다.
본 발명의 용도 및 적용은 다음을 포함한다:
1. 라이브러리 제조와 같은 클로닝 목적 또는 혼성화, 예를 들어 바이오칩 (유전자 칩)과의 혼성화 프로토콜에서 사용하기 위한 프로브 제조, 서열분석 반응 후에, 그러나 로딩하기 전에, 혼입되지않은 dNTP의 제거를 위해, 첫번째 및 두번째 스트랜드 cDNA를 고상 지지체 상에서 형성한 다음, 이어서 선택적 절단함으로써 방출시킬 수 있다.
2. 동일한 ds cDNA 제조물로부터 센스 및 안티센스 스트랜드 프로브 모두를 제조하여, 방법을 단순화할 수 있다.
3. 역 서브트랙션 혼성화가 가능하고, 첫번째 스트랜드 cDNA을 지지체로부터 제거하고 고상 지지체상에서 고정된 mRNA와 혼성시킬 수 있다.
4. PCR 생성물과 같은 DNA를 클로닝할 수 있으며, 이때 통상 5' 말단에 라이게이션을 억제하는 바이오틴 분자가 존재하기 때문에 매우 이롭다.
5. 세포에 부착 채로 남아있는 최소의 "외래" 물질 내에서 지지체로부터 세포가 쉽게 방출될 수 있는 방식으로, 친화성 결합에 기초한 고상 지지체 절차 (예를 들어, 면역자기 분리 (IMS))에 의해 세포를 쉽게 분리할 수 있다. 이것은 치료법에서 사용을 위해 및/또는 이후의 자극을 위해 세포를 분리하는데 있어서 특별히적용될 수 있다. 즉, 예를 들면, 치료법을 위한 T-세포 (예를 들어, 환자내로 연속하여 재도입하기 위해)를 IMS에 의해 단리하고, 자극 (예를 들면 IMS와 연관된 절차에 의해)한 다음, 재도입을 위해 IMS 지지체로부터 분리할 수 있다.
6. 절단 부위가 친화성 결합 부위에 가능한 한 근접하게 위치되는 방식으로, 절단가능한 뉴클레오티드 서열을, 발생하는 새로운 세대의 친화성 결합 분자 (예, 단일 사슬 항체 또는 그의 유도체 (예를 들면 파라토프로 최소화됨), 또는 펩티드 라이브러리-발생 분자)에 쉽게 결합 또는 접합시킬 수 있다. 이는, 분리된 실재물 (즉, 친화성 결합기를 위한 결합 "파트너")에 부착된 "외래" 물질을 가능한 한 적게 남기면서, 절단이 일어날 수 있도록 한다.
본 발명은, 첨부된 도면을 참조로 하면서, 이하 비-제한적 실시예에서 더욱 상세히 설명된다.
도 1은 UDG로 처리된 dTMP 또는 dUMP 올리고뉴클레오티드 프라이머에서 방출되는 DNA (%)를 나타내는 그래프이다.
도 2는 UDG의 존재 또는 부재하에서 dUMP PCR 프라이머-생성물 (방출량 CPM (×1000))의 방출량을 나타내는 그래프이다.
실시예 1
고상 지지체로부터 cDNA 생성물의 제거
방법
1. 문헌 [Jakobsen, K.S. 등, In Advances in Biomagnetic Separation, Ed.Uhlen, M.Eaton Publishing, (1994) pp.61-71]에 기재된 다이나비이드(Dynabeads) 올리고 5'TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTU 또는 5'UUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUU를 사용하거나 또는 mRNA 포획을 위한 다이날 (Dynal)의 지시에 따라서 1㎍ mRNA를 포획하고, 세척하고, 제조한다.
2. mRNA 및 비이드 복합체를 50㎕ 1 × 역전사 완충액 (라이프 테크놀로지스 인코포레이티드)중에서 2회 세척한다.
3. 500 nM dNTP,33P dATP (3000mCi/밀리몰), 100 mM DTT 및 2.5 mM MgCl2(라이프 테크놀로지스 인코포레이티드)를 함유하는 1 ×역전사효소 완충액에, 200 유닛의 수퍼 스트립트 II 역전사효소를 함유하는 20㎕ 역전사 반응물을 혼합한다.
4. 37 ℃에서 20 분, 42 ℃에서 20분 및 55 ℃에서 20 분동안 인큐베이션한다.
5. 1㎕의 RNase H와 함께 37 ℃에서 15 분동안, 이어서 70 ℃에서 10분동안 인큐베이션한다.
6. 50㎕ UDG 반응 완충액 (10 mM Tris-HCl, pH 8.9, 50 mM KCl 및 25 mM MgCl2)으로 2회 세척한다.
7. 1 유닛 우라실-RNA 글리코실라제 (뵈링거 만하임)를 20㎕ UDG 반응 완충액에 첨가하고, 37 ℃에서 10분동안 인큐베이션한다.
8. 염기제거 부위에서 DNA를 절단하기 위해 95 ℃에서 3분동안 인큐베이션한다.
9. 자석을 적용하고, 방출된 DNA를 함유하는 상층액을 수집한다.
결과
도 1은 UDG를 올리고(dT)에 비해 올리고(dTU)와 함께 인큐베이션할 때, 방출되는 표지된 첫번째 스트랜드 cDNA의 현저한 증가를 나타낸다. 각각 20 % 미만에 비해 대략 80 %의 cDNA가 방출된다.
실시예 2
M-280 스트렙타비딘 비이드로부터 PCR 생성물의 제거
방법
1. 적절한 주형 및 반응 성분을 사용하여, 바이오틴-GTAATACGACTCACTAUAGGGC와 같은 내부 dUMP를 가진 하나의 바이오틴화 프라이머 및 비변형된 PCR 프라이머를 함유하는 PCR을 수행한다 (동일한 비변형된 프라이머에 비해, 바이오틴화 및 dUMP 함유 PCR 프라이머를 사용할 때에는 변화시킬 필요가 없다).
2. 제조업자의 지시에 따라 센트리콘 (Centricon)-50 회전 컬럼 (아미콘 인코포레이티드)을 사용하여 혼입되지 않은 바이오틴화 프라이머를 제거할 수 있다.
3. 100㎕ B & W 완충액 (2M NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 7.5) 및 1 mM EDTA)중에서 50 ℃에서 3 시간동안 회전시키면서, 100㎕ M-280 스트렙타비딘 자석 비이드 (다이날) 상에 정제된 PCR 생성물 (100 ng-5 ㎍)을 고정시킨다.
4. 상기 실시예 1의 단계 6 내지 9를 진행한다.
5. 방출된 이중 또는 단일 스트랜드 PCR 생성물을 수집하고, 클로닝과 같은 하류 용도에서 사용한다.
결과
도 2는 M-280 스트렙타비딘 비이드로부터 방사능표지된 바이오틴화 PCR 생성물의 방출을 나타낸다. 바이오T3U는 바이오틴-AATTAACCCTCACUAAAGGG이고, 바이오T7U는 바이오틴-GTAATACGACTCACTAUAGGGC이다. UDG가 존재하지 않을 때에 비해 UDG의 존재하에서 상당히 증가된 양의 PCR 생성물이 방출된다.
실시예 3
비표준 뉴클레오티드로서 리보뉴클레오티드를 사용하는, 고상 지지체로부터 cDNA 생성물의 제거
1. 문헌 [Jakobsen 등, 1994, 상동]에 기재된 바와 같이, 다이나비이드 올리고 5' 바이오틴 TTTTTTTTTrUTTTTTTTTT을 사용하여 1㎍ mRNA를 포획하고, 세척하고, 제조한다.
2.- 4. 실시예 1에서와 같다.
5. RNA (rU) 함유 올리고뉴클레오티드를 절단하고, 다량의 20㎕ 100 mM NaOH을 2회 첨가하여 부착된 cDNA를 방출시킨다.
6. 자석을 적용하고, 방출된 cDNA을 함유하는 상층액을 수집한다.
7. 필요하다면, 40㎕의 100 mM HCl 또는 적절한 부피의 Tris-HCl의 1M 완충액 (pH 7)을 첨가하여 알칼리를 중화시킨다.
실시예 4
비표준 뉴클레오티드로서 리보뉴클레오티드를 사용하는, 고상 지지체로부터 cDNA 생성물의 제거
1.- 4. 상기 실시예 3에서와 같다.
5. RNA (rU) 함유 올리고뉴클레오티드를 절단하고, 최종 Mg2+또는 Mn2+농도가 10 mM 이상이 되도록 10㎕의 25 mM MgCl2또는 MnCl2용액을 첨가함으로써, 부착된 cDNA를 방출시킨다. 94 ℃에서 5 분동안 가열한다.
6. 자석을 적용하고, 방출된 cDNA를 함유하는 상층액을 수집한다.
실시예 5
푸린 제거 부위를 절단하기 위한 엑소뉴클레아제 III의 사용
방법
1.- 7. 실시예 1에서 기재된 것과 동일하다.
8. 150 유닛의 엑소뉴클레아제 III (프로메가 코포레이션 (Promega Corp.), 미국)을 첨가하고, 37 ℃에서 30 분동안 인큐베이션한다.
9. 자석을 적용하고, 방출된 cDNA를 함유하는 상층액을 수집한다.
주의. 엑소뉴클레아제 III은 AP 뉴클레아제 [Lindahl 및 Anderson (1972) Biochemistry 11: 3618-3623]로서 일괄적으로 공지된 염기제거 부위 절단 효소 부류에 속한다. 엑소뉴클레아제 III은 또한, PCR 생성물과 같은 이중 스트랜드 DNA를 파괴하지만 ssDNA는 파괴하지 않는, 이중 스트랜드 특이적 DNas 활성을 함유한다. 따라서, 이 실시예에 기재된 것과 같은 단일 스트랜드 DNA에서만 엑소뉴클레아제 III으로 염기제거 부위를 절단하는 것이 바람직하다. 염기제거 부위를 절단하기 위한 다른 적절한 효소는 이. 콜라이 엔도뉴클레아제 IV [Demple andHarrison, (1994) Annu.Rev.Biochem. 63:915-948]이고, 이는 이 실시예에서 엑소뉴클레아제 III을 대신할 수 있다.
실시예 6
링커 절단 및 세포 정제
1. 다이나비이드 CD4에 대해 기재된 것과 같은 바이오틴-폴리U-항-CD4로 세포 단리를 수행한다 (Cell separation and protein purification, Technical Handbook, 제 2 판, Dynal).
2. 로제트화 세포를 100 ㎖의 세포 배양 배지에 재현탁시킨다.
3. 100 유닛의 UDG (로슈 몰레큘러 바이오케미칼스) 및 1500 유닛의 엑소뉴클레아제 III를 첨가한다.
4. 37 ℃에서 45 - 60 분동안 인큐베이션한다.
5. 자기 분리기를 사용하여 방출된 비이드를 제거한다.
6. 세포를 함유하는 상층액을 수집한다.
실시예 7
링커 절단 및 단백질 정제
방법
1. PBS중에서 1 × 107조직 배양액 세포를 3회 세척한다.
2. 50 ㎍/㎖ TLCK 및 TPCK와 200 ㎍/㎖ PMSF를 함유하는 1 ㎖ 2% 트리톤 X-100 중에서 세포를 용혈시킨다.
3. 세포 용해물을 40 ㎕의 다이나비이드-절단가능한 링커-친화성 분자 (예, 다이나비이드-폴리(dU)-8-탄소 스페이서-아데노신 5' 모노포스페이트)와 함께 인큐베이션한다.
4. 자석을 사용하여 비이드를 수집하고 PBS로 3회 세척한다.
5. 40 ㎕의 UDG 반응 완충액 (10 mM Tris-HCl, pH 8.9, 50 mM KCl 및 25 mM MgCl2)에 비이드를 재현탁시킨다.
6. 2 유닛의 우라실-DNA 글리코실라제 (뵈링거 만하임)를 첨가한다.
7. 37 ℃에서 30 분동안 인큐베이션한다.
8. 15 유닛의 엑소뉴클레아제 III (프로메가 코포레이션, 미국)을 첨가하고, 37 ℃에서 30분동안 인큐베이션한다.
9. 자석을 사용하여 방출된 단백질 및 리간드를 함유하는 상층액을 수집한다.

Claims (28)

  1. 비표준 뉴클레오티드가 분자내의 미리 결정된 부위에 혼입되어 있는 핵산 분자를 상기 비표준 뉴클레오티드 부위에서 선택적으로 절단하는 것을 포함하는, 상기 핵산 분자가 부착된 고상 지지체로부터 상기 핵산 분자를 분리하는 방법.
  2. (a) 비표준 뉴클레오티드를 핵산 분자내의 미리 결정된 부위에 혼입시키고,
    (b) 상기 핵산 분자를 고상 지지체에 결합시키는데, 여기서 단계 (a) 및 (b)는 순서대로 또는 동시에 수행하며, 이어서
    (c) 상기 비표준 뉴클레오티드 부위에서 상기 핵산 분자를 선택적으로 절단하는 것을 포함하는, 핵산 분자를 가역적으로 고정시키는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 핵산 분자가 핵산 성분 및 다른 비핵산 성분을 포함한 키메라 분자인 방법.
  4. 제1항 내지 제3항중 어느 한 항에 있어서, 비표준 뉴클레오티드가 우라실, 하이포잔틴, 리보뉴클레오티드, N-7 메틸구아닌, 8-옥소구아닌, 데옥시우리딘, 데옥시이노신, 데옥시 5,6-디히드록시티민, 5',6'-디히드록시틴, 데옥시 3'-메틸아데노신 또는 3'-메틸아데노신인 방법.
  5. 제1항 내지 제4항중 어느 한 항에 있어서, 상기 선택적 절단을 효소에 의해 달성하는 것인 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 선택적 절단을 DNA 글리코실라제 효소를 사용하여 달성하는 것인 방법.
  7. 제1항 내지 제6항중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 분자가 DNA를 포함하고, 상기 비표준 뉴클레오티드가 우라실(U)이며, 선택적 절단을 우라실 DNA 글리코실라제 효소 (UDG)를 사용하여 달성하는 것인 방법.
  8. 제1항 내지 제7항중 어느 한 항에 있어서, 상기 비표준 뉴클레오티드를 링커 서열의 일부로서 상기 핵산 분자내에 혼입시키는 것인 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 링커 서열이 프라이머인 방법.
  10. 제1항 내지 제9항중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 분자가 프라이머 연장 생성물인 방법.
  11. 제1항 내지 제10항중 어느 한 항에 있어서, 상기 지지체가 자석 비이드인 방법.
  12. 제8항 내지 제11항중 어느 한 항에 있어서, 상기 링커 서열에 고상 지지체에 고정시키는 수단이 제공되는 것인 방법.
  13. 제10항 내지 제12항중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 분자가 cDNA, 또는 시험관내 증폭 반응 또는 서열분석 반응의 생성물인 방법.
  14. 제8항, 제11항 또는 제12항에 있어서, 상기 핵산 분자가 단백질, 효소 기질, 수용체 리간드, 항원 또는 합텐, 또는 이들의 단편에 결합되거나 친화성 결합기 또는 리포터 기에 결합된 링커 서열을 포함하는 것인 방법.
  15. 선택적으로 절단할 수 있는 비표준 뉴클레오티드를 미리 결정된 부위에 포함하는 뉴클레오티드 링커 서열을 구조물내에 혼입시키는 것을 포함하는, 고상 지지체에 결합시키고, 이후에 이로부터 절단해 내기 위한 구조물의 제조 방법.
  16. 관능기에 결합되고 선택적으로 절단가능한 비표준 뉴클레오티드를 미리 결정된 부위에 포함하는 뉴클레오티드 링커 서열을 포함한 키메라 분자.
  17. 제16항에 있어서, 상기 관능기가 친화성 결합기 또는 리포터 기인 키메라 분자.
  18. 제15항 내지 제17항중 어느 한 항에 있어서, 상기 링커 서열이 고정되거나 또는 상기 링커 서열에 고상 지지체에 고정하기 위한 수단이 제공되는 것인 방법 또는 키메라 분자.
  19. 제16항 내지 제18항중 어느 한 항에 있어서, 상기 친화성 결합기가 항체 또는 그의 단편 또는 그의 유도체, 또는 합텐인 키메라 분자.
  20. 제16항 내지 제19항중 어느 한 항에 기재되고, 여기서 상기 관능기가 표적 세포에 특이적으로 결합하는 친화성 결합기인 키메라 분자에 의해 상기 세포를 고상 지지체에 결합시키는 것을 포함하는, 시료로부터 표적 세포를 분리하는 방법.
  21. 제1항 내지 제14항, 제18항 또는 제20항중 어느 한 항에 있어서, 각각 상이한 비표준 뉴클레오티드를 혼입하고 있는 다수의 상이한 핵산 분자 또는 키메라 분자를 고상 지지체에 부착시키거나 결합시키는 것인 방법.
  22. (a) 비표준 뉴클레오티드를 핵산 분자 내에 도입시키기 위한 수단; 및
    (b) 상기 비표준 뉴클레오티드를 선택적으로 절단하기 위한 수단
    을 포함하는, 제1항 내지 제14항중 어느 한 항에 기재된 방법에 사용하기 위한 키트.
  23. 고상 지지체 상에 고정되거나 고정 수단을 보유하는, 비표준 뉴클레오티드를 혼입하고 있는 폴리- 또는 올리고뉴클레오티드.
  24. 제23항에 있어서, 폴리- 또는 올리고 dU인 폴리- 또는 올리고뉴클레오티드.
  25. 제23항에 있어서, 프라이머인 폴리- 또는 올리고뉴클레오티드.
  26. 제23항 내지 제25항중 어느 한 항에 있어서, 상기 고정 수단이 바이오틴인 폴리- 또는 올리고뉴클레오티드.
  27. 제23항 내지 제25항중 어느 한 항에 있어서, 상기 고상 지지체가 자석 비이드를 포함하는 폴리- 또는 올리고뉴클레오티드.
  28. 각각의 상이한 올리고- 또는 폴리뉴클레오티드가 상이한 비표준 뉴클레오티드를 혼입하고 있는, 제23항 및 제25항 내지 제27항중 어느 한 항에 기재된 다수의 올리고- 또는 폴리뉴클레오티드.
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