JPH07270425A - ターミナルトランスフェラーゼによる３’−ｒｎａ標識方法 - Google Patents

ターミナルトランスフェラーゼによる３’−ｒｎａ標識方法

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JPH07270425A
JPH07270425A JP7038869A JP3886995A JPH07270425A JP H07270425 A JPH07270425 A JP H07270425A JP 7038869 A JP7038869 A JP 7038869A JP 3886995 A JP3886995 A JP 3886995A JP H07270425 A JPH07270425 A JP H07270425A
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 従来の技術の不利な点を解消する、非放射活
性マーカー基をRNA分子に導入する方法を提供する。 【構成】 本発明は、非放射活性標識されたデオキシヌ
クレオチドを核酸に導入する方法、及び非放射活性マー
カー基を有する少なくとも１つのデオキシヌクレオチド
をその3'- 末端に有するRNA 分子に関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、非放射活性標識デオキ
シヌクレオチドを核酸に導入する方法、及び非放射活性
マーカー基を有する少なくとも１つのデオキシヌクレオ
チドをその3'- 末端に含むRNA 分子に関する。
【０００２】
【従来の技術】RNA-DNA ハイブリッドは、DNA-DNA ハイ
ブリッドよりも安定であるため、標識RNA 分子はハイブ
リダイゼーションプローブとしてよく使用される(Sriva
stava,R.A.K. and Schonfeld, G.(1991) BioTechniques
11, 584-587)。非放射活性標識RNA プローブの製造の
ためのよく知られた方法は、標識ヌクレオチドをRNA ポ
リメラーゼの基質として使用するインビトロ転写である
(Langer, P.R., Waldrop, A.A. and Ward, D.C. (198
1), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 6633-6637;Holtk
e, H.-J. and Kessler, C. (1990) Nucleic Acid Res.
18, 5843-5841) 。インビトロ転写においては、ビオチ
ニル化ジヌクレオチドをイニシエーターオリゴヌクレオ
チドとして使用することにより、RNA をその5'末端にお
いて標識することが可能である(Pitulle, C., Kleineid
am, R.G., Sproat, B. and Krupp, G.(1992) Gene 112,
101-105)。
【０００３】それに対し、既に存在しているRNA 分子に
おいては、ポリヌクレオチドキナーゼ及び [γ32P]-ATP
を使用した、即ち放射活性による酵素的な5'末端標識を
有するものとしてしか得られない(Richardson, C.C. (1
981) In Boyer, P.D. (ed.)The Enzymes, Academic Pre
ss, New York, Vol. XIV, pp. 299-314) 。ビオチンを
使用した化学的なRNA 分子の3'末端標識化は、von Brok
er et al.(Nucleic Acids Res. 5 (1978), 363-384)及
びSodja and Davidson (Nucleic Acids Res. 5 (1978),
385-401) により記載されている。この方法において
は、ビオチンは多段階反応においてNH2(CH5)NH2 スペー
サーあるいはシトクロムC を介してRNA の3'- 末端リボ
ース糖に結合される。この反応は、過ヨウ素酸による糖
の酸化、得られるジアルデヒドとスペーサーもしくはシ
トクロムC のNH2 基とのシッフ塩基の生成を伴う反応、
その後のBH4-による還元、及びスペーサーまたはシトク
ロムC へのビオチンの共有結合による結合を含む。この
標識方法は長く時間がかかるものであり、実際には使用
されていない。
【０００４】放射活性による酵素的なRNA の3'末端標識
化が、ポリ(A) ポリメラーゼ及びT4RNA リガーゼを使用
して行われている。ポリ(A) ポリメラーゼは、 [α32P]
-ATPをRNA 分子の3'末端に結合するのに使用される(Win
ter, G. and Brownlee, G.G.(1978) Nucleic Acids Re
s. 5, 3129-3139)。T4 RNAリガーゼは、[5'-32P]-pCpを
RNA 分子の3'末端に結合するのに使用される(Uhlenbec
k, O.C. and Gumport,R.I. (1982) In Boyer, P.D. (e
d.) The Enzymes, Academic Press, New York,Vol. XV,
p. 31-58)。T4 RNAリガーゼは、ビオチン、テトラメチ
ルローダミン及びP1-(6-アミノヘキシ-1- イル)-P2-(5'
- アデノシン) ピロホスフェートのフルオレセイン誘導
体によるRNA の非放射活性標識化にも使用することがで
きる(Richardson, R.W. and Gumport, R.I. (1983) Nuc
leic Acids Res. 11, 6167-6184)。
【０００５】しかし、RNA リガーゼ及びポリ(A) ポリメ
ラーゼを使用したRNA 分子の3'末端へのヌクレオチドの
結合は少なからぬ問題を有している。RNA リガーゼの場
合、異なる種類の基質を使用することによるRNA の3'-
標識化の２つの可能性が基本的にあり、即ち、単一のヌ
クレオチドで標識するか、3'- 標識オリゴヌクレオチド
を結合することにより標識するかである。単一のヌクレ
オチドで標識する場合、このヌクレオチドは3'及び5'位
置にリン酸を有していなければならず、即ちpNp の形態
でなければならない。非放射活性マーカー基を有するそ
のようなヌクレオチドを、T4 RNAリガーゼを使用してRN
A 分子に結合することは知られていない。従って、非放
射活性マーカー基は、T4 RNAリガーゼを使用してRNA の
3'- ヒドロキシル末端上に直接スペーサーとともに移す
ことができるのみである（上記Richardson及びGumport
を参照）。ヌクレオチド塩基(nucleotide base) に結合
したマーカー基を有するヌクレオチドをRNA 分子の3'末
端に結合することは知られていない。
【０００６】さらに、単一のヌクレオチドを基質として
使用した場合、反応サイクル当たり単一の基質分子のみ
しか結合できないので、結合ヌクレオチドの数を変化さ
せ、これにより標識化の強度を変化させることはできな
い。3'- 標識オリゴヌクレオチドをT4リガーゼの基質と
して使用した場合、例えばハイブリダイゼーション実験
を阻害し得るような余分な配列も結合される。さらに、
T4リガーゼによる基質分子のRNA への効率的な結合のた
めには例えば約12時間というような長いインキュベーシ
ョン期間が必要であり、これは非常に加水分解に感受性
の高いRNA の有意な分解を引き起しかねない。
【０００７】ポリ(A) ポリメラーゼによるRNA 分子の3'
末端への効率的な標識化は、A 以外の塩基が前記酵素に
許容される程度は極めて低いので、ATP 及びATP 誘導体
の使用に限定される。オリゴヌクレオチドは、受容体分
子としては極めて効率の低いものである。ポリ(A) ポリ
メラーゼによるRNA 分子の3'末端へのオリゴリボヌクレ
オチドの結合は知られていない。非放射活性標識された
ヌクレオチドを結合することは不可能である。
【０００８】Roychoudhury及びKosselの刊行物(Eur. J.
Biochem. 22 (1971), 310-320) においては、3'末端に
２つのリボヌクレオチド単位を有するオリゴデオキシヌ
クレオチドが、ターミナルデオキシヌクレオチジルトラ
ンスフェラーゼによるdATP分子の結合のための核酸受容
体分子として働くことができることを記載している。し
かしながら、非常に高いATP 濃度においても、核酸受容
体分子の3'末端の２つのリボヌクレオチドの存在により
反応速度がかなり減じられてしまう。
【０００９】Feixの刊行物(FEBS Letters 18 (1971), 2
80-282) においては、オリゴリボヌクレオチドA6が、タ
ーミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼに
よるdCTP分子の3'末端への結合のための核酸受容体分子
として働くことができることが記載されている。しか
し、dCTPは、デオキシリボ核酸受容体分子と比較して、
リボ核酸受容体分子には極めて低い効率で取り込まれる
ことが判明した。同じ著者の後の刊行物(Feix, Bioche
m. Biophys. Res. Comm. 46 (1972), 2141-2147)は、リ
ボ核酸受容体分子は、ターミナルデオキシヌクレオチジ
ルトランスフェラーゼによるデオキシヌクレオチドの結
合のためのプライマーとしては無視できる程度の活性を
示すことを記載している。
【００１０】従って、現状の技術では、既に存在するRN
A 分子を１または数個の非放射活性マーカー基を有する
ものとして、簡単なやり方により与える方法は知られて
いない。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】従って本発明の目的
は、現在の技術の不利な点や困難性を少なくとも部分的
に解消する、非放射活性マーカー基をRNA 分子に導入す
る方法を提供することであった。特に、本発明の目的
は、非放射活性マーカー基を有する異なるヌクレオチド
のRNA 分子への効率的で迅速な導入を可能とする方法を
提供することであった。
【００１２】
【課題を解決するための手段】この目的は、非放射活性
マーカー基を有するヌクレオチドを核酸に導入する方法
により達成され、該方法は、少なくとも１つの非放射活
性標識されたデオキシヌクレオチドを、ターミナルデオ
キシヌクレオチジルトランスフェラーゼ(EC 2.7.7.31)
により、少なくとも１つの3'- 末端リボヌクレオチドを
有する核酸受容体分子の3'- 末端に結合することを特徴
とする。
【００１３】驚くべきことに、本発明の方法は、非放射
活性マーカー基が、短時間での簡単な酵素反応により、
3'- 末端リボヌクレオチドを有する核酸受容体分子の3'
- 末端に結合することを可能とする。反応は効率よく進
行し、所望される場合には異なっていてもよい数個のマ
ーカーを単一の反応サイクル内で核酸受容体分子中に導
入することができる。該方法の別の利点は、試薬、即ち
ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ
並びに非放射活性マーカー基を有するデオキシヌクレオ
チドが市販品として入手可能な物質であることである。
【００１４】ターミナルデオキシヌクレオチジルトラン
スフェラーゼ（ヌクレオシドトリホスフェート：DNA デ
オキシヌクレオチジルエキソトランスフェラーゼあるい
はＴｄＴとも称される）は哺乳類の骨髄及び胸腺に存在
する酵素であり（例えば、Kung, P.C., Gottlieb, P.D.
and Baltimore, D., J. Biol. Chem. 251 (1976), 239
9-2404; Ratcliff, R.L., The Enzyme 14a (1981), 105
-118参照）、例えばBoehringer Mannheim GmbH、マンハ
イム、ドイツから、約60,000 U/mg の比活性のものが入
手可能である。哺乳類組織（特に子ウシ胸腺）から単離
されたTdT 並びに組換えDNA 技術により製造されたTdT
が本発明の方法に適している。
【００１５】１または数個のデオキシヌクレオチドを一
本鎖または二本鎖DNA の3'末端に結合するためにターミ
ナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ(TdT)
を使用すること、及びオリゴデオキシリボヌクレオチド
をビオチン修飾もしくはジゴキシゲニン修飾ヌクレオチ
ドで標識するために使用することは知られている（例え
ば、Deng, G.R. and Wu, R. (1983) Methods Enzymol.
100, 96-116; Hayes,F.N., Mitchell, V.E., Ratcliff,
R.L., Schwarts, A.W. and Williams, D.L.(1966) Bio
chemistry 5, 3625-3629; Roychoudhury, R., Jay, E.
and Wu, R. (1976) Nucleic Acids Res. 3, 863-877; K
umar, A., Tchen, P., Roullet, F. and Cohen, J. (19
88) Anal. Biochem. 169, 376-382; Riley, L.K., Mars
hall,M.E. and Coleman, M.S. (1986) DNA 5, 333-337;
Schmitz, G.G., Walter, T.,Seibl, R. and Kessler,
C. (1991) Anal. Biochem. 192, 222-231 を参照）。し
かしながら、非放射活性マーカー基を有するデオキシヌ
クレオチドは、非標識あるいは放射活性標識されたデオ
キシヌクレオチドと比較して、ずっと低い程度でしかTd
T により受け入れられない。
【００１６】それ故、少なくとも１つの3'- 末端リボヌ
クレオチドを有する核酸受容体分子を使用した場合に、
非放射活性標識マーカー基を有するデオキシヌクレオチ
ドがTdT に対し完全に基質として受け入れられることは
非常に驚くべきことであった。
【００１７】本発明の方法における核酸受容体分子また
はプライマーは、基質分子、即ち一般にはデオキシリボ
ヌクレオチドトリホスフェートが、ピロリン酸の開裂と
ホスホジエステル結合の形成により結合する核酸であ
る。この核酸は、その3'末端において少なくとも１つの
遊離の3'ヒドロキシル基を有するリボース糖を有し、所
望の化学的または／及び酵素的に合成された核酸、例え
ば3'- 末端リボヌクレオチドは別として任意のヌクレオ
チド単位、特にデオキシリボヌクレオチドまたは／及び
リボヌクレオチド単位を含み得る、細胞内においてイン
ビボで生産された核酸であってよい。但し、核酸受容体
分子は、その3'末端において少なくとも２つ、特に少な
くとも３つのリボース糖を有していることが好ましい。
50％より多くの、そして実質的にリボヌクレオチド単位
のみからなる核酸分子、即ちRNA 分子が特に好ましく、
特にインビボで生産されたものが好ましい。
【００１８】本発明の方法のための核酸受容体分子の最
小の長さは３ヌクレオチドであり、好ましくは８ヌクレ
オチド、特に好ましくは12ヌクレオチドである。核酸受
容体分子の最大の長さは実際に任意であり、数千の長さ
の核酸、例えば2000〜3000塩基のものを何等困難なく使
用することができる。さらに本発明の方法における核酸
受容体分子は、一本鎖分子の形態にあり、安定な著しい
２次構造（例えばヘアピン構造）をその3'末端に有して
いないことが好ましい。例えばmRNA分子を本発明の方法
の核酸受容体分子として使用することができる。
【００１９】本発明の方法においては、デオキシヌクレ
オチド及び即ち特に2'- デオキシヌクレオシドトリホス
フェートまたは／及び2',3'-デオキシヌクレオチドトリ
ホスフェートが基質として核酸に結合される。2'- デオ
キシヌクレオシドトリホスフェートが基質として使用さ
れる場合は、受容体核酸の3'末端がいくつかのヌクレオ
チドで延長され得るが、2',3'-デオキシヌクレオシドト
リホスフェートが結合すると3'-H- 末端となり、鎖が終
結する。
【００２０】前記非放射活性標識されたデオキシヌクレ
オチド中のヌクレオチド塩基は、天然塩基のアデニン、
グアニン、シトシン、チミン、ウラシル、あるいはイノ
シン、シュードウラシル、フルオロウラシル等のような
塩基類縁体であってもよい。デオキシヌクレオチドの具
体例は、例えばビオチン-dUTP 及びジゴキシゲニン-dUT
P である。
【００２１】本発明の方法においては、非放射活性標識
されたデオキシヌクレオチドを単独で使用するか、ある
いは非標識（あるいは例えば放射活性標識された）デオ
キシヌクレオチドと非放射活性標識されたデオキシヌク
レオチドの組合せを基質として使用することができる。
受容体核酸分子に数個のマーカー基を導入することを意
図している場合は、非標識デオキシヌクレオチドと標識
デオキシヌクレオチドの組合せの使用が好ましい。
【００２２】本発明の方法は、好ましくは非放射活性標
識されたデオキシヌクレオチドをRNA 分子の3'末端に結
合することによる、種々の種類のRNA 分子中にマーカー
基を酵素的に導入するための、新規で効率的な方法も提
供する。細胞から単離されたインビボで生成されたRNA
分子の集団、例えばmRNA分子がRNA 分子として好ましく
使用される。
【００２３】非放射活性標識マーカー基を有するヌクレ
オチドの好ましい例は、蛍光、化学発光もしくはＮＭＲ
活性マーカー基、または／及び反応相手に対して高親和
性結合をすることができるマーカー基を有するヌクレオ
チドである。反応相手と高親和性結合をすることができ
るマーカー基、例えばアビジンもしくはストレプトアビ
ジンと結合できるビオチンまたはビオチン誘導体、また
は特異抗体と結合できるハプテンが特に好ましい。ジゴ
キシゲニン修飾またはビオチン修飾ヌクレオチドは特に
好ましい。しかし、例えばフルオレセイン、ローダミ
ン、クマリン、その他の蛍光団またはその他のハプテン
により修飾されたデオキシヌクレオチドのような、他の
非放射活性標識デオキシヌクレオチドも使用することが
できる。適当なマーカー基の他の例は、"Non-radioacti
ve Labeling and Detection of Biomolecules", C. Kes
sler ed., Springer Verlag 1992, 特にp. 6;p. 28に見
られる。
【００２４】TdT は、単一の修飾2',3'-ジデオキシヌク
レオチドを核酸受容体分子の3'末端に結合するのに使用
し得る。一方、１または数種の異なる修飾2'- デオキシ
ヌクレオシドトリホスフェート、例えばジゴキシゲニン
-dUTP またはビオチン-dUTPを使用して数個のデオキシ
ヌクレオチドをそのようなRNA 分子に結合することも可
能である。多数のデオキシヌクレオチドの結合が、例え
ば非標識及び標識2'-デオキシヌクレオチドトリホスフ
ェート、例えばジゴキシゲニン-dUTP 及びdATPの混合物
を使用して達成できる。
【００２５】適当な反応条件を使用して、本発明の方法
は、非放射活性マーカー基を有するデオキシヌクレオチ
ドで核酸受容体分子の3'- 末端標識化を行う間の単一の
反応サイクルにおいて数個の標識を単一の核酸受容体分
子に導入することを可能とする。好ましくは20までの標
識が結合され、これにより非常に高い感度での標識され
た核酸の検出が可能となる。２〜10のマーカー基が好ま
しく導入される。マーカー基は同一のものでも異なるも
のでもよい。好ましくは、反応サイクル当たり全体で20
0 までの (非標識及び標識) デオキシヌクレオチドが結
合され、特に好ましくは反応サイクル当たり１〜50デオ
キシヌクレオチドである。
【００２６】反応混合物中の核酸受容体分子の濃度は、
好ましくは0.1 μmol/l 〜20μmol/l であり、特に好ま
しくは0.5 μmol/l 〜10μmol/l である。デオキシヌク
レオチドの濃度は、好ましくは反応混合物中0.1 〜2.0
mmol/lである。単一のヌクレオチドを受容体核酸の3'末
端に結合することを意図する場合には、2',3'-ジデオキ
シヌクレオチドが基質として使用され、その結合により
鎖が終結される。少ない数のヌクレオチドを結合させる
ためには、１または数種の標識2'- デオキシヌクレオチ
ドが基質として使用される。大きい数（例えば＞10）の
ヌクレオチドを結合させるためには、１または数種の非
標識2'- デオキシヌクレオチド及び１または数種の標識
2'- デオキシヌクレオチドの混合物が基質として使用で
き、この場合の非標識及び標識基質分子のモル比は好ま
しくは２：１〜20：１、特に好ましくは５：１〜15：１
の範囲にある。
【００２７】公知のRNA 末端標識法と比較した場合の、
本発明の方法の特筆すべき利点は、好ましくは10分〜２
時間、特に好ましくは20分〜１時間、最も好ましくは約
30分という短時間の間に反応を実施し得ることである。
さらに、市販のTdT 調製物は一定の残留RNアーゼ活性を
含み得るので、反応はRNアーゼ阻害剤、例えばRNA シン
(RNAsin)の存在下に行うのが好ましい。
【００２８】一方、実質的にRNアーゼを含まないTdT を
使用することも好ましい。TdT 調製物からの残留RNアー
ゼ活性の除去は周知の方法（例えば、Sambrook et al.,
Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2nd editi
on (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, US
A, p. B17-B19 参照) で、アガロース-5'-(4- アミノフ
ェニルホスホリル)-ウリジン-2'-(3')ホスフェート上で
のアフィニティークロマトグラフィーにより、マカロイ
ド(macaloid)への吸着により、あるいはヨード酢酸塩の
存在下に加熱することにより実施することができる。本
発明の方法を実施するのにはTdT が特に好ましく、これ
は機能試験において、例えば４μg のMS2-RNA をTdT を
含む50μl の試験バッファー中で４時間37℃でインキュ
ベートしたときに、50 U/ml 、好ましくは500 U/ml TdT
までの濃度でRNA バンドの測定可能な変化を示さない。
【００２９】さらに反応は、6.0 〜7.5 のpH値、及び２
〜10 mmol/l の、特にZn2+、Co2+、Mg2+あるいはMn2+で
ある２価金属の濃度において行われるのが好ましい。反
応混合物について特に好ましい条件は、10〜200 μl の
最終容量中、20〜200 pmol核酸受容体分子、５〜50 U T
dT (1U TdTは、(dT)6 を核酸受容体として使用して37℃
において60分間で1 nmol dAMP の酸不溶性生成物中への
取り込みを生起する酵素活性である) 、100 〜300 mmol
/lカコジル酸カリウム、５〜50 mmol/l トリス/HCl pH
6.6 、0.05〜0.5 mg/ml ウシ血清アルブミン、２〜10 m
mol/lCoCl2 及び0.1 〜2.0 mmol/lデオキシヌクレオチ
ドである。反応は37℃で約30分間行われる。3'末端への
単一のヌクレオチドの結合は、例えば、0.5 mmol/lの2'
3'- デオキシヌクレオチド、例えばジゴキシゲニン-11-
ddUTP あるいはビオチン-16-ddUTP を使用して達成する
ことができる。小さい数のヌクレオチド（例えば５ま
で）のヌクレオチドを結合するためには、0.5 mmol/lの
標識2'- デオキシヌクレオチド、例えばジゴキシゲニン
-11-dUTPもしくはビオチン-16-dUTP、あるいはジゴキシ
ゲニン-11-dUTP及びジゴキシゲニン-11-ddUTP の組合せ
(それぞれ0.25 mmol/l)を使用することができる。大き
い数のヌクレオチド（例えば＞10）のヌクレオチドを結
合するためには、例えば、0.45 mmol/l の非標識2'- デ
オキシヌクレオチド、例えばdATPと、0.05 mmol/l の標
識2'- デオキシヌクレオチド、例えばジゴキシゲニン-1
1-dUTPを含む混合物を使用することができる。さらに約
40U RNアーゼ阻害剤を混合物に加えるか、測定可能なRN
アーゼ活性のないTdT を使用することが好ましい。反応
はEDTAを添加することにより停止できる。
【００３０】本発明のさらに好ましい態様においては、
既に標識された核酸受容体分子を出発物質、例えば5'-
末端標識受容体分子として使用することができる。標識
は、放射活性標識の場合はポリヌクレオチドキナーゼと
[γ32P]-ATPとによりリボ核酸の5'末端に導入すること
ができ、あるいは非放射活性標識の場合は、例えば適当
に修飾されたホスホルアミダイト、例えばビオチン−ア
ミダイト(Applied Biosystems)を使用した化学合成によ
り、もしくはAminolink II (Applied Biosystems) を導
入した後、標識と結合することにより(G.H. Keller and
M.H. Manak, DNA Probes, Stockton Press. 1989, p13
6 ff) 導入できる。この方法により、その5'末端並びに
3'末端に標識を有するRNA 分子を製造することができ
る。5'及び3'末端に異なる２種の非放射活性標識を有す
る分子の製造は特に好ましく、例えば、5'末端にビオチ
ン残基を有し、3'末端に１または数個のジゴキシゲニン
残基を有するRNA 分子あるいはその逆のRNA 分子であ
る。
【００３１】本発明の方法のまた別の特別な利点は、例
えばポリ(A) ポリメラーゼとは対照的に、ターミナルデ
オキシヌクレオチジルトランスフェラーゼは全てのヌク
レオチド（例えば、dATP、dGTP、dCTP、dTTP、dUTP、dI
TP）及び対応する2',3'-ジデオキシ類縁体を基質として
受容することである。
【００３２】本発明の別の主題は、その3'末端領域に少
なくとも１つのデオキシヌクレオチドを有するRNA 分子
であって、前記デオキシヌクレオチドが非放射活性マー
カー基を有しておりその標識はデオキシヌクレオチドの
ヌクレオチド塩基に共有結合により結合しているもので
あるRNA 分子である。そのような分子は、公知の酵素的
RNA 標識法、例えばポリ(A) ポリメラーゼあるいはT4リ
ガーゼで標識することによっては生成できない。上出の
Richardson及びGumport により記載された、RNA リガー
ゼによるRNA の非放射活性標識化においては、そのβリ
ン原子にアミノヘキシル残基が非放射活性標識とともに
結合したADP が使用される。RNA リガーゼはこのアミノ
ヘキシル残基をRNA の3'ヒドロキシル末端に転移させ、
AMP を放出する。その結果、アミノヘキシルスペーサー
を介してリン酸残基に標識が末端結合される。これに対
し、本発明の方法により結合された標識は、結合したヌ
クレオチドのヌクレオチド塩基に共有結合により結合す
る。本発明の方法の利点は、RNA の3'末端が依然として
利用可能であるということであり、これは第２の配列の
結合のために、あるいは別のヌクレオチドのターミナル
トランスフェラーゼによる結合のために使用でき、即ち
数個のマーカー基を導入することができ、これにより感
度が増大するということである。本発明のRNA 分子は好
ましくは少なくとも２つ、最も好ましくは２〜10の非放
射活性マーカー基を有するものである。
【００３３】本発明のRNA 分子中の非放射活性標識デオ
キシヌクレオチドは、好ましくはジゴキシゲニン標識、
あるいはビオチン標識デオキシヌクレオチドである。さ
らに、RNA 分子はその5'末端にさらに標識を有している
ことが好ましい。本発明はさらに、本発明の方法の生成
物の、分子生物学研究及び医薬の分野での、例えば核酸
分析対象物の検出のためのプローブとしての使用、cDNA
分子の製造のための鋳型としての使用、あるいは核酸の
単離と精製における使用、RNA 分子の配列決定における
使用、そしてアンチセンス核酸の製造のための使用に関
する。
【００３４】好ましい応用は、試料液体中の明確にされ
た標的配列を有する核酸分析対象物の検出である。核酸
分子に対する試験の特異性は、標的配列に相補的な核酸
配列とのハイブリダイゼーションにより達成される。従
って、そのようなハイブリッドが直接あるいは間接的に
同定されることが、標的配列の存在を示すことになる。
これらの試験方法における問題は、標的DNA の量が少な
いことが多いことである。それにもかかわらずバックグ
ラウンドを上回る明確なシグナルを得るためには、種々
の増幅方法を使用することができ、即ち、標的配列の増
幅、シグナルの増幅、あるいは増幅の両方の種類の組合
せである。
【００３５】シグナル増幅の１つの可能性は、P. Duck
らがBioTechniques 9 (1990), 142-147 に記載した「サ
イクリングプローブ(cycling probe) 」法であり、該方
法は以下の段階を含む。 (a) 試料液体を、DNA 分析対象物の部分に相補的な標識
されたRNA 分子に、分析対象物が存在する場合に標識さ
れたRNA 分子とのハイブリダイゼーションを可能とする
条件下で接触させ、(b) 試料液体を、RNA-DNA ハイブリ
ッドが存在する場合に、ハイブリッド中のRNA 分子の分
解と分解されたRNA フラグメントの放出とが起こるよう
な条件下でRNアーゼH で処理し、(c) 必要であれば段階
(a) 及び(b) を１回または数回反復し、(d) 分解された
RNA フラグメントまたは／及び分解されていないRNA 分
子を測定することによってDNA 分析対象物の存在または
不存在を検出する。 このサイクリングプローブ法は、図解的には以下のよう
に示される。
【００３６】
【化１】
【００３７】標的配列の特定の部分に相補的なRNA 分子
は、検出されるべきDNA とRNA-DNAハイブリッドを形成
する。RNアーゼH の作用は、これらのハイブリッドのそ
れぞれのRNA 部分を分解するだけであり、フラグメント
はより低いメルト温度のために標的配列から拡散除去さ
れる。この手段により、その後のハイブリダイゼーショ
ン及び分解サイクルにDNA が使用できる。RNA 分子が標
的DNA に対してモル過剰である場合は、これらの２つの
反復可能な段階により増幅サイクルが得られる。DNA 標
的配列が存在しない場合は、RNA-DNA ハイブリッドは形
成され得ず、RNA 分子はRNアーゼH により分解されな
い。
【００３８】このように、RNA 分子の分解生成物あるい
は当初に使用したRNA 分子の量の減少のいずれかを検出
することができる。前もって標識されたRNA 分子の分解
生成物の検出には通常ゲル電気泳動法を使用する。この
場合、サイクリングプローブ混合物中の標的DNA の存在
は、標識RNA 分解生成物の移動の速度の増加、あるいは
完全なRNA を示すバンドの強度の減少から推測される。
【００３９】互いに分離できる２つの異なる非放射活性
標識を有する本発明のRNA 分子の使用は、このシステム
をさらに展開したものを示すものである。２つの標識の
第１のものは好ましくはRNA 分子の5'末端領域に位置し
ており、RNA を固相に結合するのに使用できるものであ
り、分析対象物は、好ましくはRNA 分子の3'末端領域に
位置する第２の標識を測定することにより検出できる。
また、当然ながら第１の標識がRNA 分子の3'末端領域に
位置し、第２の標識が5'末端領域に位置してもよい。こ
の点注意すべきことは、この場合の標識は、いちばん先
端（即ち、5'あるいは3'位置）に限定されないことであ
る。例えば、RNA 分子の場合、5'末端の２番目または／
及び３番目のヌクレオチドと、3'末端の数個のヌクレオ
チドが標識されていてもよい。
【００４０】そして分析対象物は、固相上の第２の標識
のシグナルの減少を測定し、または／及び液相中もしく
は第２の標識に高い親和性で結合できる第２の固相上の
第２の標識のシグナルの増加を測定することにより検出
できる。このような２つの分離可能な標識の好ましい例
は、ビオチン及びジゴキシゲニンまたはその他のハプテ
ンあるいは２つの異なるハプテン、例えばジゴキシゲニ
ン及びフルオレセインである。ビオチン標識は、ストレ
プトアビジンを被覆した固相に結合でき、ハプテン標識
は抗＜ハプテン＞抗体で被覆された固相に結合できる。
個々の反応段階のための手順は以下の図に示した。
【００４１】
【化２】
【００４２】この手順においては、一方で時間のかから
ないゲル電気泳動法を必要とし、他方では放射活性物質
の使用を避けることができる。この方法の原理は、標的
DNAの存在下においては、RNアーゼH がハイブリダイゼ
ーションの後にRNA 分子の分解により２つの標識の分離
を生起するという事実に基づくものである。これらの２
つの標識の１つが適当な表面に結合される場合には、分
離が完了したとき、固相上の他方の標識の数の減少また
は／及び上清中でのその増加を検出することができる。
DNA 標的配列が存在しない場合は、両方の標識は一緒に
結合されたままで残存し、そして適当な表面に結合して
RNA 分解生成物は検出されない。分光測光により分析で
きる検出反応、及び試験形態としてマイクロタイタープ
レート(MTP) を選択することにより、定量的な結果及び
高い試料の処理量を得ることが可能となる。
【００４３】インビボで生成されたRNA の、例えばビオ
チン標識による、その後の標識が可能であり、このよう
な方法で標識されたRNA 分子は核酸分析対象物の検出に
プローブとして使用できることも、本発明の方法を核酸
の検出に使用することの利点である。さらに本発明のRN
A は、サイクリングプローブ法におけるその使用に加え
て、その他の核酸検出方法、例えば直接のハイブリダイ
ゼーションあるいはサンドウィッチハイブリダイゼーシ
ョンにおいてもプローブとして使用できる。
【００４４】本発明のRNA 分子の別の用途は、特定のDN
A 配列の単離である。即ち、本発明のプローブは特定の
核酸を「釣り上げる(fish out)」ために製造することが
でき、この場合プローブは例えばビオチン標識によりス
トレプトアビジン被覆固相に結合され、「釣り上げられ
た」DNA 配列とのハイブリダイゼーションの後に例えば
アルカリ分解により分解されることができる。この手段
により、「釣り上げられた」DNA は溶液中にあることに
なり、その後の実験に使用できる。
【００４５】本発明のRNA の使用の別の可能性は、RNA
を単離し精製することである。即ち、非放射活性修飾さ
れたヌクレオチドを単離されたRNA 分子の3'末端に結合
することにより、これらは適当な固相（例えばストレプ
トアビジン被覆、抗ジゴキシゲニン抗体被覆）に結合す
ることによって精製され得る。一連の同一のヌクレオチ
ドを結合することにより（例えばＧまたはＣテイル）、
マーカー基を導入することなくこのテイルによりRNA 自
身を特異的に精製することができる。さらに、Ｇまたは
Ｃテイルは、対応する相補的プライマーを使用したcDNA
合成を可能とし、この構築物は従来使用されていたポリ
(A) テイル及びオリゴ(dT)プライマーによる構築物より
も安定である。
【００４６】従って、cDNA合成のための相補的プライマ
ーを結合するために、テイルを有する未知の配列の単離
されたRNA を得ることができ、そのテイルは標識を導入
するとにより観察することができ、このテイルに相補的
なオリゴヌクレオチドはcDNA合成のためのプライマーと
することができる。この方法を改変したものにおいて
は、１種のヌクレオチド（例えばdCTP）による短いテイ
リング時間とその後の相補的ヌクレオチド（例えばdGT
P）の増加させた濃度によるテイリングにより形成され
たポリＣ−ポリＧテイルの再生したもの(refolding)
を、追加のプライマーを使用せずに逆転写酵素によりcD
NAストランドを合成するのに使用することができる。
【００４７】引き去る(subtractive) 、あるいは差を示
す(differential)ハイブリダイゼーションによる特定の
RNA 配列の改良された単離も可能である。即ち、対照RN
A を固相に結合でき、その後のTdT を使用した改変（例
えばビオチン標識あるいはジゴキシゲニン標識ヌクレオ
チドによる）により、調べられるべきRNA をより安定な
cDNAに転写でき（文献に記載されている標準的な方法の
逆である）、これは結合されたRNA とハイブリダイズし
て差を示す配列の位置を決定することができる。
【００４８】本発明の方法は、RNA 結合タンパクの精製
にも使用することができる。このためには、結合するタ
ンパクに含まれるRNA は3'末端標識され、その後にタン
パクに結合するのに使用されたものであり、RNA 複合体
及び従ってタンパクはその後の固相への結合により単離
できる。さらに別な用途の可能性はRNA 配列決定であ
る。3'末端からの塩基特異的開裂による配列決定に前も
って必要なものは、配列決定されるRNA の3'末端にただ
１つのヌクレオチドを結合することにより満足される。
さらに、標識されたRNA は固定化することができ、従っ
てチェーンターミネーション法により固相配列決定を行
うことが可能である。
【００４９】別の用途は、医薬の製造におけるものであ
り、例えばアンチセンス技術のためのもので、本発明の
3'- 修飾RNA 分子は診断用及び治療用に使用され得る。
最後に、本発明はまた実質的にRNアーゼを含まず、デオ
キシヌクレオチド、特に非放射活性標識されたデオキシ
ヌクレオチドをRNA 分子に結合するために使用されるタ
ーミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼに
関する。
【００５０】実質的にRNアーゼを含まないターミナルデ
オキシヌクレオチジルトランスフェラーゼは、デオキシ
ヌクレオチドをRNA 分子の3'末端に結合するための試薬
キットの構成物とすることができる。ターミナルトラン
スフェラーゼは、50% グリセロールバッファー、pH 6.5
中、10〜50×103 U/mlの容量活性で存在するのが好まし
い。バッファーのその他の成分は、好ましくはチオール
試薬、例えば１〜10 mmol/l の濃度の2-メルカプトエタ
ノール、150 〜250 mmol/lの濃度のNaCl、150〜250 mmo
l/lの濃度のカコジル酸ナトリウム及び0.1 〜２ mmol/l
の濃度のEDTAである。ターミナルトランスフェラーゼ
は、このようなバッファー系中、-20 ℃で安定である。
以下の実施例及び図面により本発明をさらに説明する。
【００５１】
【実施例】
〔実施例１〕 RNA 分子の非放射活性標識化 非放射活性標識ヌクレオチドのテイルのRNA の3'末端へ
の結合のための条件は以下の通りである。１μg オリゴ
リボヌクレオチド(TdT 1: 121 pmolに対応する5'-CGCCG
CGUCGCAGAAGAUCUCAAUC-3')を、最終容量30μl で、200
mmol/lのカコジル酸カリウム、25 mmol/l のトリス/HCl
(pH 6.6) 、0.25 mg/mlウシ血清アルブミン、5 mmol/l
CoCl2及び0.5 mmol/lのデオキシヌクレオチドトリホス
フェート中の25 U TdT (Boehringer Mannheim)とともに
37℃で30分間インキュベートした。0.5 mmol/lのジゴキ
シゲニン (DIG)-11-ddUTP またはビオチン-16-ddUTP を
使用して１つだけのヌクレオチドのオリゴヌクレオチド
の3'末端への結合を行った。0.5 mmol/lのDIG-11-dUTP
もしくはビオチン-16-dUTPまたはDIG-11-dUTP 及びDIG-
16-ddUTPの組合せ（それぞれ0.25 mol/l) を短いテイル
に使用した。より長いテイルには、0.45 mmol/l のdATP
及び0.05 mmol/l のDIG-11-dUTP を含むヌクレオチドの
混合物を使用した。TdT がある程度の残留RNアーゼ活性
も含み得るので、40 UのRNアーゼ阻害剤(Boehringer Ma
nnheim) を加えた。EDTAの添加により反応を停止した。
その後のエタノール沈降のためのキャリアとしてグリコ
ーゲンを添加した。
【００５２】１μg のMS2-RNA 、E. coli からのtRNAま
たはインビトロ転写物の混合物(300-1600 塩基、RNA 分
子量マーカーIII)（すべてBoehringer Mannheim からの
もの) を上記したものと類似の反応でTdT 及び0.5 mmol
/lのDIG-dUTPによりテイルを付加した。
【００５３】TdT 反応の前に、分子分析のために、 (γ
32P)ATP 及びポリヌクレオチドキナーゼにより、オリゴ
ヌクレオチドの5'末端を放射活性標識した。3'テイリン
グ反応の後、生成物を12% ポリアクリルアミド-8M 尿素
配列決定ゲル上で分離し、その後オートラジオグラフィ
ーにより分析した。非放射活性標識の取り込みの検出
を、抗-DIG- アルカリホスファターゼまたはストレプト
アビジンアルカリホスファターゼ、及びニトロブルーテ
トラゾリウム塩、及び5-ブロモ-4- クロロ-3- インドリ
ルホスフェートを、Schmitz ら (Anal. Biochem. 192
(1991), 222-231)が記載した比色免疫アッセイに使用し
て行った。
【００５４】5'-(32P)オリゴリボヌクレオチドTdT 1 の
テイリング反応の結果を図１に示す。レーン１は非放射
活性標識なしのリボヌクレオチドTdT 1 を示し、レーン
２はDIG-ddUTP による標識化を示し、レーン３はDIG-dU
TPによる15分間の標識化を示し、レーン４はDIG-dUTPに
よる30分間の標識化を示し、レーン５はビオチン-dUTP
による標識化を示す。４までのDIG-デオキシヌクレオチ
ドをDIG-dUTPを使用したテイリング反応において結合す
ることができた。ビオチン-dUTP では殆どの生成物が１
〜４の修飾ヌクレオチドを含み、いくつかの生成物にお
いては５番目のヌクレオチドも結合された。ビオチン-d
dUTP（示していない）またはDIG-ddUTP（レーン１）に
よる標識化は単一のヌクレオチドの付加を生起した。
【００５５】dATP及びDIG-dUTPのヌクレオチド混合物に
よる標識化では約50ヌクレオチドまでのテイル長が得ら
れた。テイリング反応は約30分間のインキュベートの後
に完了し、その後の２時間、生成物のパターンは同じの
ままであった。別の実験のシリーズを図２に示す。ここ
では、3'末端をDIG で標識されたオリゴヌクレオチド及
びポリヌクレオチドを1:10の連続希釈物として膜に塗布
した。図2aは、種々のヌクレオチド組成: 1. 0.5 mmol/l のDIG-ddUTP 2. 0.25 mmol/lのDIG-ddUTP 及び0.25 mmol/l のDIG-dU
TP 3. 0.5 mmol/l のDIG-dUTP 4. 0.05 mmol/lのDIG-dUTP及び0.45 mmol/l のdATP とともにTdT が存在する反応の後の、標識オリゴリボヌ
クレオチドTdT 1 の検出の感度を示す。
【００５６】図2bは、0.5 mmol/lのDIG-dUTPでテイリン
グされたより長いRNA 分子の検出限界を示す(MWM: イン
ビトロ転写物からなる分子量マーカー) 。図2aから判る
ように、25塩基の長さを有する標識オリゴリボヌクレオ
チドTdT1 の検出の限界は、テイリング反応に使用した
ヌクレオチドまたはヌクレオチド混合物に依存する。単
一のDIG 分子の付加のみを可能とするDIG-ddUTP の場合
の検出限界は1 ngであった。DIG-ddUTP 及びDIG-dUTPの
等モル混合物 (それぞれ0.25 mmol/l)またはDIG-dUTPを
唯一のヌクレオチドとして添加すること (これにより４
までのDIG 分子の付加が可能となる) により、感度は10
0 pgまで増加される。1:9 のモル比のDIG-dUTP及びdATP
でテイリングされたオリゴリボヌクレオチドは10 pg
(1.2 fmol)の感度を示す。
【００５７】図2bから、300 〜1600ヌクレオチドの長さ
を有するインビトロ生産されたRNA転写物(RNA-MWM) 、
E. coli からの天然tRNA及びウィルスMS2-RNA もTdT 及
びビオチン-dUTP またはDIG-dUTPによりテイリングされ
得ることが判る。このためには、それぞれの場合におい
て、RNA の１μg をTdT 及び0.5 mmol/l DIG-dUTP と、
上記した条件下にインキュベートした。酵素と標識ヌク
レオチドの間の複合体の誤った陽性シグナルを除去する
ため、混合物をプロテイナーゼK で処理した。取り込ま
れなかったヌクレオチドは反応生成物を沈降させること
により除去し、そして生成物を連続希釈物として膜に塗
布した。TdT により結合されたDIG-dUMP残基は上記した
ようにして検出した。唯一のヌクレオチドとしてのDIG-
dUTPでテイリングされたRNA 分子の検出限界を測定し
た。100 pg (3.9 fmol) tRNA、1 ng(3.9 fmol) のイン
ビトロ合成転写物、及び10 ng (8.5 fmol) MS2-RNAを検
出できることが判明した。感度の相違はおそらく、RNA
分子、特に3'ヒドロキシル末端の領域における２次構造
に起因するものであろう。
【００５８】〔実施例２〕5'- ビオチン (BIO)で化学的
に、及びTdT により3'-DIGで標識されたRNA オリゴヌク
レオチド"HBV1" (5' BIO-cgccgcgucgcagaagaucucaauc-
(DIG)1-4-3') の1ngまたは10 ng を、それぞれ30μl の
容量中で、異なる量の検出すべきDNA オリゴヌクレオチ
ド、"DHBV1" (5'-TTGAGATCTTCTGCGACGCGG-3': HBV1に相
補的な配列) 、"MM1DHBV1" (5'-TTGAGATCTTATGCGACGCGG
-3':中央塩基ミスマッチを有するHBV1に相補的な配列)
、及び"MM3DHBV1" (5'-TTGAGATCTCACGCGACGCGG-3': ３
つの中央塩基ミスマッチを有するHBV1に相補的な配列)
と、以下の条件下にインキュベートした。
【００５９】 1 ng または 10 ng 5'-BIO-HBV1-DIG テイル-3' 可変 検出すべきDNA オリゴヌクレオチド 10 mmol/l HEPES pH 8.0 30 mmol/l NaCl 1 mmol/l MnCl2 40 U 胎盤からのRNアーゼ阻害剤(Boehringer Mannheim) 7 μg ウシ血清アルブミン(BSA) (Boehringer Mannheim、 分子生物学用品質) 1 μg tRNA (Boehringer Mannheim 、E. coli からの全tRNA) 4 U RNアーゼH (Boehringer Mannheim)
【００６０】混合物に30μl の鉱油を重ね、56℃で３時
間インキュベートした。次に、180μl の希釈バッファ
ー(10 mmol/l HEPES pH 8.0 、30 mmol/l NaCl、1 mmol
/l MnCl2) で反応混合物の全容量を210 μl とした。上
相を形成する30μl の鉱油はその後の操作を妨げなかっ
た。洗浄バッファー(PBS, 0.5% (V/V) Tween 20)で予備
洗浄したストレプトアビジン(SA)被覆マイクロタイター
プレート(MTP)(Boehringer Mannheim)へ、下部水性相か
ら100 μl をピペットで２回取り、相補的なDNA オリゴ
ヌクレオチドの存在下でのRNA オリゴヌクレオチドの分
解を以下のように検出した。
【００６１】SA-MTPを振盪しながら37℃で１時間インキ
ュベートし（Well-Warm 1, DenleyInstruments GmbH Co
mpany) 、RNA に結合したビオチンがストレプトアビジ
ンに結合できるようにした。結合を完了した後、それぞ
れの場合において２つのウェルの内容物（上清）を二重
測定に従いプールし、下記のように抗ジゴキシゲニン抗
体で被覆したマイクロタイタープレート(<DIG>-MTP) 中
での検出に使用した。SA-MTPはそれぞれ200 μl の洗浄
バッファーで５回洗浄した。次に、100 μl の<DIG>-ペ
ルオキシダーゼ(POD) ポリ抱合体希釈物（抱合体バッフ
ァー中：100 mmol/l リン酸Na pH 7.5, 0.9% NaCl, 1%
Rafulon F4JまたはBSA フラクションV、ジエチルピロ
カーボネートで処理、濾過により殺菌、+4℃で貯蔵) を
それぞれに加え、同じ条件下に再度インキュベートし
た。５回洗浄することにより、結合していない抱合体を
除去した。その後、ウェル当たり100 μl の基質溶液
(2,2'-アジノ- ジ-[3-エチルベンズチアゾリンスルホネ
ート(6)]、ABTS) を加えた。呈色反応は振盪しながら37
℃で行った。変換されたABTSの「光学密度」を、ELISA
リーダー(SLT) により405 nmで測定し、ブランク値(ABT
S のみ) を差し引いた後に二重測定の平均を計算した。
DNA オリゴヌクレオチドを含んでいない混合物を陰性対
照とした。
【００６２】上清中の分解されたRNA 分子の検出を<DIG
>-MTP 中で行った。SA-MTP中でのインキュベーションの
後に得た上清をこれに使用した。それぞれの場合におい
て、洗浄バッファーで予備洗浄した<DIG>-MTP 中へ、90
μl を２回ピペットで取り、検出のためのその後の段階
をSA-MTPについて記載したように行った。
【００６３】検出の感度 それぞれの場合において、0.1 pgから100 pgの間のDNA
オリゴヌクレオチド"DHBV1" の1:10連続希釈物を、1 ng
のRNA オリゴヌクレオチドHBV1を使用する検出反応に使
用した。SA-MTP中の検出により、図３にグラフとして示
した値が得られた。「光学密度」（相対単位）と、検出
すべきDNA の量（混合物あたりpg) との間の関係をそこ
に示した。陰性対照("DHBV1"なしの混合物) の測定値
は、水平な線として表した。
【００６４】標的DNA が増加するにつれて、より多くの
RNA オリゴヌクレオチドが反復されるハイブリダイゼー
ション及び分解により分解された。この分解は、得られ
たシグナルの減少に反映されている。1 pg (0.121 fmo
l) のDNA オリゴヌクレオチドがそのような混合物によ
り検出できる。混合物あたり10μg の子ウシ胸腺DNA の
添加も、前記曲線に相当する形を与えた。
【００６５】<DIG>-MTP での上清中における検出は、シ
グナルとDNA の量の間の逆の依存性を示した。即ち、シ
グナルはDNA の増加する量とともに増大した。得られた
値はSA-MTPにおいて得られた値よりも低かったので、10
ng の5'-BIO-HBV1-DIG-テイル-3' を検出反応に使用し
た。シグナルのDNA の量に対する依存性はSA-MTP及び<D
IG>-MTP 中での検出について図４にグラフとして示し
た。これは「光学密度」（相対単位）の検出すべきDNA
の量（調製物あたりpg) に対する依存性を示している。
<DIG>-MTP についての陰性対照("DHBV1"なしの混合物)
の測定値は、水平な線として表した。SA-MTPは陰性対照
及び0.1 〜100 pgの"DHBV1" の混合物について測定でき
る範囲を越える値を与えた。<DIG>-MTP における検出
は、SA-MTPにおける検出よりも約100 分の１の低い感度
を示した。
【００６６】検出の特異性 "HBV1"に完全に相補的なもの("DHBV1") 、中央に１つの
塩基ミスマッチを有するもの("MM1DHBV1")、あるいは３
つの塩基ミスマッチを有するもの("MM3DHBV1")のいずれ
かである３種の異なるDNA オリゴヌクレオチドに基づい
て特異性を調べた。両方のオリゴヌクレオチドが完全に
相補的な場合は、対応するDNA オリゴヌクレオチドのみ
がこれらの反応条件下で検出できた（図５）。「光学密
度」（相対単位）の、検出すべきDNA の量（混合物あた
りpg) に対する依存性がそこに示されている。陰性対照
(DNAオリゴヌクレオチドなしの混合物) についての測定
値は、水平な線として表した。
【００６７】他の実験から導かれるように、特異性はス
トリンジェントハイブリダイゼーション条件に基づくも
のであった。しかしこれらは、そのような条件下でもRN
アーゼH がなお活性であるように選択されたものであ
る。インキュベーション温度を下げた場合、あるいはイ
ンキュベーションバッファー中のイオン強度を減少させ
た場合でも"MM1DHBV1"を検出することができ、ストリン
ジェンシーをさらに減じた場合"MM3DHBV1"を検出でき
た。この方法により測定した感度は図３に示した感度に
対応する。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、合成オリゴリボヌクレオチドによる標
識化反応のオートラジオグラムを示す。
【図２】図２は、標識RNA 分子の検出の感度を示す。
【図３】図３は、サイクリングプローブ反応におけるDN
A オリゴヌクレオチドの検出の感度を示す。
【図４】図４は、ストレプトアビジン被覆及び抗ジゴキ
シゲニン被覆マイクロタイタープレートを使用したサイ
クリングプローブ反応におけるDNA オリゴヌクレオチド
の検出の感度を示す。
【図５】図５は、種々のDNA オリゴヌクレオチドの検出
の特異性を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ヴィオラ ローズメイヤー ドイツ連邦共和国 82431 リード／フォ ーヘル フォン−フェルセン−シュトラー セ ４番地

Claims (32)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 非放射活性マーカー基を有するヌクレオ
    チドを核酸に導入する方法であって、少なくとも１つの
    非放射活性標識されたデオキシヌクレオチドを、ターミ
    ナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ(EC 2.
    7.7.31) により、少なくとも１つの3'- 末端リボヌクレ
    オチドを有する核酸受容体分子の3'-末端に結合する前
    記方法。
  2. 【請求項２】 リボ核酸を核酸受容体分子として使用す
    る請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】 2'- デオキシヌクレオシドトリホスフェ
    ートまたは／及び2',3'-ジデオキシヌクレオシドトリホ
    スフェートをデオキシヌクレオチドとして使用する請求
    項１または２に記載の方法。
  4. 【請求項４】 蛍光、化学発光もしくはＮＭＲ活性マー
    カー基、または／及び反応相手に対して高親和性結合を
    することができるマーカー基を有するデオキシヌクレオ
    チドを使用する請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
  5. 【請求項５】 ジゴキシゲニン−またはビオチン−標識
    デオキシヌクレオチドを使用する請求項４に記載の方
    法。
  6. 【請求項６】 既にマーカー基を有する核酸受容体分子
    を使用する請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
  7. 【請求項７】 5'- 末端の領域において標識された核酸
    受容体分子を使用する請求項６に記載の方法。
  8. 【請求項８】 反応をRNアーゼ阻害剤の存在下に行う請
    求項１〜７のいずれかに記載の方法。
  9. 【請求項９】 実質的にRNアーゼを含まないターミナル
    デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼにより反応
    を行う請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
  10. 【請求項１０】 6.0 〜7.5 のpH値において反応を行う
    請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
  11. 【請求項１１】 ２〜10 mmol/l の２価金属濃度におい
    て反応を行う請求項１〜10のいずれかに記載の方法。
  12. 【請求項１２】 10分〜２時間の間反応を行う請求項１
    〜11のいずれかに記載の方法。
  13. 【請求項１３】 反応の１サイクル当たり20までの非放
    射活性標識されたデオキシヌクレオチドを結合する請求
    項１〜12のいずれかに記載の方法。
  14. 【請求項１４】 反応の１サイクル当たり２〜10の非放
    射活性標識されたデオキシヌクレオチドを結合する請求
    項13に記載の方法。
  15. 【請求項１５】 マーカー基をRNA 分子に導入する方法
    であって、マーカー基を有する少なくとも１つのデオキ
    シヌクレオチドを、ターミナルデオキシヌクレオチジル
    トランスフェラーゼ(EC 2.7.7.31) により、RNA 分子の
    3'- 末端に結合する前記方法。
  16. 【請求項１６】 非放射活性マーカー基を有する少なく
    とも１つのデオキシヌクレオチドを結合する請求項15に
    記載の方法。
  17. 【請求項１７】 インビボで生産されたRNA 分子の集合
    を使用する請求項15または16に記載の方法。
  18. 【請求項１８】 その3'末端領域において、非放射活性
    マーカー基を有する少なくとも１つのデオキシヌクレオ
    チドを含むRNA 分子であって、該マーカーは前記デオキ
    シヌクレオチドのヌクレオチド塩基に共有結合している
    前記RNA 分子。
  19. 【請求項１９】 非放射活性標識されたデオキシヌクレ
    オチドがジゴキシゲニン−またはビオチン−標識デオキ
    シヌクレオチドである請求項18に記載のRNA分子。
  20. 【請求項２０】 RNA 分子が、その3'末端領域において
    少なくとも２つの非放射活性マーカー基を有する請求項
    18または19に記載のRNA 分子。
  21. 【請求項２１】 RNA 分子が、その5'- 末端領域におい
    てさらに標識を有する請求項19または20に記載のRNA 分
    子。
  22. 【請求項２２】 核酸分析対象物の検出のためのプロー
    ブとしての、請求項18〜21のいずれかに記載のRNA 分子
    または請求項１〜17のいずれかに記載された方法により
    製造されたRNA 分子の使用。
  23. 【請求項２３】 (a) 試料液体を、DNA 分析対象物の部
    分に相補的な標識されたRNA 分子に、分析対象物が存在
    する場合に標識されたRNA 分子とのハイブリダイゼーシ
    ョンを可能とする条件下で接触させ、(b) 試料液体を、
    RNA-DNA ハイブリッドが存在する場合に、ハイブリッド
    中のRNA 分子の分解と分解されたRNA フラグメントの放
    出とが起こるような条件下でRNアーゼH で処理し、(c)
    必要であれば段階(a) 及び(b) を１回または数回反復
    し、(d) 分解されたRNA フラグメントまたは／及び分解
    されていないRNA 分子を測定することによってDNA 分析
    対象物の存在または不存在を検出する段階を含む、サイ
    クリングプローブ方法における請求項21に記載の使用。
  24. 【請求項２４】 RNA 分子が、互いに分離可能な２種の
    異なる非放射活性標識を有する請求項23に記載の使用。
  25. 【請求項２５】 １つの標識がRNA 分子の5'- 末端領域
    に位置し、他方がRNA 分子の3'- 末端領域に位置する請
    求項24に記載の使用。
  26. 【請求項２６】 cDNA分子の生産のための鋳型として
    の、請求項18〜21のいずれかに記載のRNA 分子または請
    求項１〜17のいずれかに記載された方法により製造され
    たRNA 分子の使用。
  27. 【請求項２７】 核酸の単離及び精製における、請求項
    18〜21のいずれかに記載のRNA 分子または請求項１〜17
    のいずれかに記載された方法により製造されたRNA 分子
    の使用。
  28. 【請求項２８】 RNA 配列決定における、請求項18〜21
    のいずれかに記載のRNA 分子または請求項１〜17のいず
    れかに記載された方法により製造されたRNA分子の使
    用。
  29. 【請求項２９】 薬剤の製造のための、請求項18〜21の
    いずれかに記載のRNA 分子または請求項１〜17のいずれ
    かに記載された方法により製造されたRNA 分子の使用。
  30. 【請求項３０】 アンチセンス核酸の製造のための、請
    求項29に記載の使用。
  31. 【請求項３１】 RNアーゼ活性を実質的に有していない
    ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラー
    ゼ。
  32. 【請求項３２】 請求項31に記載のターミナルデオキシ
    ヌクレオチジルトランスフェラーゼを含む、デオキシヌ
    クレオチドをRNA 分子の3'末端に結合させるための試薬
    キット。
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