KR100809679B1 - 혼성화된 핵산의 검출 및 신호 증폭 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 핵산 전달효소(TdT : Terminal deoxynucleotidyl transferase)를 이용하여 혼성화된 표적핵산의 3'-말단에만 특정한 신호를 증폭할 수 있는 물질들을 부착시켜 줌으로써, 유전자 분석용 칩 위에 고정된 핵산의 혼성화를 검출하거나 검출감도를 증가시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 의하면, 표적핵산에만 반응을 일으키는 특정한 핵산 전달효소를 이용하여 표적핵산에만 특정신호를 내는 물질을 붙여줌으로써, 표적핵산과 프로브핵산 사이의 혼성화에 대한 선택적 특이성을 높일 수 있다. 또한, 특정신호를 유발하는 물질들을 다수로 붙여줌으로써, 혼성화된 표적핵산과 혼성화되지 않은 단일가닥 핵산 프로브들 사이의 시그널차이를 증폭하여 핵산의 혼성화 검출감도을 증가시킬 수 있다.

Description

혼성화된 핵산의 검출 및 신호 증폭 방법{A method for detection and signal amplification of hybridized nucleic acid}
도 1은 핵산 전달효소 TdT를 이용하여, 혼성화된 DNA의 검출 선택성을 향상시키는 원리를 나타내는 도면이고,
도 2는 핵산전달효소 TdT를 이용하여 혼성화된 핵산만을 신호 증폭 후, 스캐너나 혹은 CCD를 이용하여 검출하는 방법에 관한 도면이고,
도 3은 슬라이드 글라스위에 고정된 프로브 DNA와 표적 DNA의 혼성화 반응 후, TdT 효소반응을 실시하여 표적 DNA에 형광염료인 TMR(tetramethylrhodamine)이 붙은 결과를 스캐너로 이미지 분석한 결과를 나타내는 사진이고,
도 4는 표적 DNA와 혼성화된 프로브, 및 표적 DNA와 혼성화되지 않은 프로브 각각에 TdT 효소반응을 실시하였을 때, 무게 변화를 나타내는 SPR(surface plasmon resonance) 결과이다.
본 발명은 혼성화된 핵산(hybridized nucleic acid)의 검출 및 신호증폭 방법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 혼성화된 표적핵산에만 반응을 일으키는 핵산 전달효소를 이용하여 표적핵산의 3'-말단에만 특정신호를 내는 물질을 붙여줌으로써 표적핵산과 프로브핵산 사이의 혼성화를 검출할 뿐 아니라, 특정신호를 유발하는 물질들을 다수로 붙여줌으로써 유전자 분석용 칩의 기판 위에 고정화된 핵산의 혼성화 신호를 증폭시키는 방법에 관한 것이다.
현재의 유전자분석용 칩에서 주로 쓰이는 검출방법은 형광 염료가 붙은 표적핵산을 프로브 핵산과 반응시킨 후 형광스캐너로 형광 염료의 신호를 읽어내는 방법이다 (참조 : 미국특허 제 6,197,499 호, 미국특허 제 6,141,096 호, 미국특허 제 5,631,734 호). 이를 위해서는 반드시 표적핵산에 형광염료를 붙여주는 선행 작업이 필요하다. 표적핵산에 형광염료를 붙일 때 주로 쓰이는 방법으로는 cDNA를 효소중합반응(PCR) 과정에 형광염료가 붙어있는 유전자 모노머(dNTP)를 적당량 첨가하는 방법이 있고(참조 : 미국특허 제 5,405,747 호), 다른 하나로는 프로브 핵산과 표적핵산이 혼성화 반응을 하여 생기는 이중가닥의 유전자를 인지할 수 있는 인터칼레이터(intercalator) 또는 그루브 바인더(groove binder)를 사용하는 방법이 있다(참조 : 미국특허 제 5,734,058 호). 전자의 경우는 cDNA가 증폭되는 과정에서 형광염료가 무작위적으로 첨가되므로 붙여주는 형광염료의 수를 제어하기가 어렵다는 단점을 가진다. 후자는 전자보다는 비교적 정량성이 있으나, 현재 개발된 인터칼레이터 또는 그루브 바인더가 핵산의 단일가닥과 이중가닥을 선택적으로 구별할 수 없다는 단점으로 인하여, 유전자분석용 칩에서 혼성화된 프로브 핵산과 혼성화되지 않은 프로브 핵산을 명확하게 구별하기 힘들다는 단점을 가지고 있다.
한편，핵산의　3'-말단을　표지화시키는　방법（3'-end labeling）에는，핵 산　전달효소　TdT(terminal deoxynucleotidyl transferase)를 사용하여　리보뉴클레오티드（3'-terminal ribonucleotide）를　가진　핵산의 3'-말단에 비방사성　물질로　표지된　dNTP를 부착시키는　방법（참조　：미국　특허　제　5,573,913호），그리고　poly(A) 폴리머라제를　사용하여 RNA의　3'-말단에　리보뉴클레오티드(ATP　유도체（analog)　+　시아닌（cyanine)）를　부착시키는　방법（참조　：　미국특허　제　6,201,112호）이　보고되고　있으나，　이들　모두는　유전자　분석용　칩이　아닌　벌키　용액（bulky solution)상에서 수행된다.
상술한　기술　배경　하에，　핵산에 대한 표지화(labeling)의 정량적인 제어가 가능하고 단일가닥 핵산과 이중가닥 핵산간의 구별능력을 최대화할 수 있는, 새로운 유전자 분석용 칩에 이용가능한 표지화 방법에 대한 필요성이 끊임없이 대두되었다.
이에, 본 발명자들은 핵산 전달효소를 이용하여 혼성화된 표적핵산의 3'-말단에만 특정한 신호를 유발하는 물질을 부착시켜 줌으로써, 특정 신호유발물질에 의한 표지화의 정량적 제어가 가능하고, 표적 핵산과 프로브 핵산 사이의 혼성화 반응에 의한 이중가닥 핵산에 대한 선택성을 높이며, 특정 신호유발물질의 다수 부착이 가능하여 혼성화된 핵산의 신호를 증폭할 수 있어 그의 검출 감도를 크게 증가시킴을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
결국, 본 발명의 목적은 핵산 전달효소를 이용하여 혼성화된 표적핵산에만 특정한 신호를 유발하는 물질을 부착시킴으로써, 유전자 분석용 센서 소자의 기판 위에 고정화된 핵산의 혼성화를 검출하거나 그 검출신호를 증폭시키는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 ① 유전자 분석용 센서 소자의 기판에 프로브 핵산을 부착시키는 단계; ② 상기 프로브 핵산과 표적 핵산을 혼성화시키는 단계; 및 ③ 핵산 전달효소를 이용하여 혼성화된(hybridized) 표적핵산의 3'-말단에만 특정 신호유발물질을 부착시키는 단계를 포함하는 핵산의 혼성화 검출 및 신호 증폭 방법을 제공한다.
본 발명에서, ② 단계 및 ③ 단계를 순차적으로 또는 동시에 수행할　수도　있는데，　동시　수행의　경우　기판에　고정화된　핵산　프로브는 10-mer 내지 25-mer인　것이　바람직하다．
본 발명에서, 유전자 분석용 센서 소자의 기판은 고체 지지체로서 유리, 석영, 실리콘, 플라스틱, 폴리프로필렌, 폴리카보네이트 또는 활성화된 아크릴아마이드 등이며, 바람직하게는 덴드리머(dendrimer), 폴리머(polymers), 다공성 매체(porous media) 또는 막(membranes) 등으로 코팅되어 있다.
본 발명에서, 프로브 핵산 또는 표적 핵산은 DNA, RNA 또는 PNA(peptide nucleic acid) 일 수 있다.
본 발명에서, 핵산 전달효소란 표적핵산의 3'-말단에 핵산을 전달하여 연장시킬 수 있는 효소를 의미하며, 바람직하게는 핵산의 3'-OH에 dNTP 또는 올리고뉴클레오티드를 붙여주는 TdT(Terminal deoxynucleotidyl transferase) 또는 라이게 이즈(ligase)인 것을 특징으로 한다.
본 발명에서, 특정 신호유발물질로는 dNTP, 올리고뉴클레오티드, 비방사성 물질이 표지된(non-radioactively labeled) dNTP 또는 올리고뉴클레오티드 등의 핵산을 단독으로 또는 함께 사용할 수 있다. 여기서, 비방사성 물질의 표지는 dNTP 또는 올리고뉴클레오티드에 당업계에 잘 알려진 방법으로 형광염료를 붙여주는 것이 바람직하다. 또한, dNTP 와 비방사성 물질이 표지된 dNTP를 함께 사용하는 경우에는 dNTP와 비방사성 물질이 표지된 dNTP를 1:1 - 10:1의 비율로 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명에서, 특정 신호유발물질로서 상기 dNTP 또는 비방사성 물질이 표지된 dNTP 대신에, 비방사성 물질이 표지된 ddNTP(non-radioactively labeled ddNTP)만을 사용할 수 있으며, 이 경우 핵산의 연장반응을 제어함으로써 유전자 발현을 정량화하는 것이 가능하다.
본 발명에서, 핵산의 혼성화 검출은 신호유발물질의 종류에 따라 형광 검출법, 전기화학적 방법, 질량 변화를 이용한 검출법, 전하량 변화를 이용한 검출법 또는 광학적 성질의 차이를 이용한 검출법 등과 같은 당업계에 잘 알려진 혼성화 검출방법에 의해 수행될 수 있다.
본 발명에 따르면, 핵산전달효소를 이용하여 혼성화된 표적핵산과 혼성화되지 않은 프로브핵산을 선택적으로 구별하여 검출할 수 있을 뿐만 아니라, 이들 사이의 시그널차이를 증폭하여 핵산의 혼성화 검출감도 및 정확성, 선택성을 높일 수 있다. 또한, 효소반응을 여러번 반복하여 혼성화된 표적핵산의 신호증폭을 극대화 함으로써 기존검출방법에서 사용되던 고가의 형광스캐너 대신 저가의 CCD를 이용한 시스템에서도 관측이 가능하다. 또한, 반응과정이 핵산 전달효소와 dNTP를 첨가하고 37℃를 유지하기만 하면 될 정도로 간단하므로 향후 진단이나 분석시 많이 쓰이리라 예상되는 Lab-on-a-chip 시스템에서 유전자 표지화시 간편하게 사용 가능할 것으로 보인다.
이하, 첨부도면을 참조하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다.
도 1은 핵산 전달효소 TdT를 이용하여, 혼성화된 DNA의 검출 선택성을 향상시키는 원리를 나타내는 도면이다. 도 1에서, (A)는 DNA 프로브 고정후에 표적 DNA가 혼성화된 칩 표면을 나타내며, (B)는 TdT 효소반응 후 표적 DNA의 3'-OH에만 특정신호를 내는 물질을 붙여준 후의 칩 표면을 나타낸다.
먼저 프로브 핵산을 5'-말단을 이용하여 칩(chip)상에 고정화시키고 표적핵산과 혼성화 반응을 시키면 그림에서와 같이 표적 핵산의 3'-OH가 유리(free) 상태로 노출되게 된다. 핵산 전달효소 TdT는 DNA 또는 RNA의 3'-OH를 선택적으로 인지하여 dNTP를 3'-OH에 붙여주는 작용을 하는 효소이므로, 혼성화 반응이 종결된 유전자 분석용 센서에 TdT 효소 반응을 시키면 3'-OH가 있는 표적 핵산에만 선택적으로 dNTP를 붙이게 된다. 이때 넣어주는 dNTP에는 형광염료 등의 신호유발물질을 미리 붙여둠으로써 효소반응이 끝나면 표적핵산이 있는 부분에서만 형광 등에 의한 신호가 나타난다. 이를 검출함으로써 유전자 분석용 센서상에 존재하는 수많은 프로브 핵산중에서 어느 프로브 핵산에 표적 핵산이 결합하였는지를 알아내는 것이다. 즉, 혼성화된 표적핵산의 3'-말단에만 특정한 신호를 내는 물질을 붙여주어, 단일가닥으로 존재하는 프로브 핵산과의 시그널차이를 높였다.
도 2는 핵산전달효소를 이용하여 혼성화된 핵산만을 신호 증폭 후, 스캐너 혹은 CCD를 이용하여 검출하는 방법에 관한 도면이다. TdT 효소반응을 여러번 반복하여 혼성화된 표적핵산의 신호증폭을 극대화함으로써 기존검출방법에서 사용되던 고가의 형광스캐너 뿐만 아니라, 저가의 CCD를 이용한 시스템에서도 관측이 가능하다.
본 발명의 상술한 방법은 표적 핵산에 붙여주는 신호유발물질에 따라, 현재 많이 사용되고 있는 형광 검출법(참조 : 미국특허 제 6197499 호, 미국특허 제 6141096 호), 전기화학적 검출법(참조 : 미국특허 제 6,096,273호, 미국특허 제 6,090,933호, Anal. Chem., Vol. 70, pp. 4670-4677, 1998), 질량 변화를 이용한 검출법(참조 : 미국특허 제 6238871호, 참조 : 미국특허 제 6043031호, Science, Vol. 288, pp. 316-318, 2000), 전하량 변화를 이용한 검출법 또는 광학적 성질의 차이를 이용한 검출법 (참조 : 미국특허 제 6,252,236 호) 등 핵산의 혼성화에 의해 단일가닥, 이중가닥을 구별하는 다른 모든 검출 방법에 효과적으로 적용될 수 있다. 예컨대, 신호유발물질이 dNTP 또는 올리고뉴클레오티드인 경우에는 질량변화를 이용한 검출법으로 핵산의 혼성화를 검출할 수 있다.
위에서 제시한 검출방법 이외에도, 본 발명은 혼성화 반응 유무에 따라 단일가닥의 핵산과 이중가닥의 핵산이 구별되는 모든 핵산 분석 방법에도 적용될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게서 자명할 것이다.
<실시예 1> 혼성화 반응 후, TdT 효소반응에 의한 표적 DNA의 형광신호증폭
실시예 1-1 : 프로브의 고정
알데하이드 기(aldehyde group)가 코팅되어 있는 슬라이드 글라스(SuperAldehyde substrates, TeleChem International, Inc., USA) 위에, 3'-말단에 아민(amine)기가 치환되어 있는 올리고머(15mer, 100pmole/μl)를 피펫(pippette)을 이용하여 0.5 μl씩 스폿팅하는 방법으로 프로브 DNA를 고정하였다. 스폿팅 이후에 슬라이드 글라스를 12시간이상 건조시키고, 25℃에서 세척하여 글라스 표면에 붙지 않고 남은 프로브 DNA와 스폿팅 용액(spotting solution)의 잔류물을 제거한 다음 다시 건조시켰다. 이때, 세척은 0.2% SDS(sodium dodecyl sulfide)로 5분간 두 번, 25℃ 증류수로 5분간 두 번, 95℃ 증류수로 5분간 두 번, 25℃ 소디움 보로하이드라이드(sodium borohydride)로 5분간 2번, 0.2% SDS로 1분간 3번, 25℃ 증류수로 1분간 두 번씩 헹구는 것으로 하였다.
실시예 1-2 : 표적 DNA의 혼성화 반응
실시예 1-1과 같은 방법으로 프로브가 고정화된 슬라이드 글라스에 100 pmol/μL 농도의 표적 DNA를 100 μL를 주입한 후 38℃에서 1시간동안 혼성화 반응을 하였다. 이때 혼성화 반응은 Hybridization Station(Genomic Solutions,Inc. USA) 내에서 수행하였다. 혼성화 반응 후 비혼성화된 표적 DNA를 제거하기 위해 25℃에서 2X SSC (0.2 % SDS포함)용액으로 5차례 씻어준 후 1X SSC 용액으로 수초간 세척하고 난 다음 상온에서 건조시켰다.
실시예 1-3 : TdT 효소 반응
실시예 1-2의 방법으로 표적DNA가 혼성화된 슬라이드 글라스에, TdT 효소(150 unit, Promega)와 TMR(tetramethylrhodamine) 형광염료가 붙어있는 dUTP(Tetramethylrhodamine-6-dUTP, ENZO Diagnostics, Inc., USA) 0.1 nmole 포함하는 1X TdT 반응용액(5X 용액의 조성 : 100 mM cacodylate buffer(pH 6.8), 1mM CoCl2, 0.1 mM DTT)에서 25℃에서 1시간동안 TdT 효소 반응을 시켰다.
TdT 효소 반응후 남아있는 과량의 TdT 효소와 TMR-6-dUTP를 제거하기 위하여, 25℃에서 2X SSC (0.2 % SDS포함)용액으로 3차례 세척한 후, 1X SSC 용액으로 수 초간 세척하여 상온에서 건조시켰다.
실시예 1-4 : 이미지 분석
실시예 1-3의 방법으로 TdT 효소반응을 거친 슬라이드 글라스를 Scanarray 5000(GSI lumonics)을 사용하여 형광 시그날을 분석하였다.
도 3은 슬라이드 글라스위에 고정된 프로브 DNA와 표적 DNA의 혼성화 반응 후 TdT 효소반응을 실시하여 표적 DNA에 형광염료인 TMR이 붙은 결과를 스캐너로 이미지 분석한 결과이다. 도 3에서, 각 도트들은 형광을 띄게 된 부분이며, 형광신호의 세기가 강해짐에 따라 흰색을 띄게 된다. 도 3에서 보여지듯이, 혼성화 반응 후 표적 DNA에 TdT 효소반응이 일어나서 형광염료가 잘 부착되었음을 알 수 있 었다.
<실시예 2> SPR(Surface Plasmon Resonance)을 이용한 TdT 효소반응의 측정
실시예 2-1 : 프로브의 고정
금(Gold) 박막위에 스트렙타비딘(streptavidine)이 코팅된 SA 칩(Sensor chip SATM, Biacore, Sweden)에, 바이오틴(Biotin)이 3'-말단에 부착된 프로브 핵산(15 mer)을 고정화 하였다. 이 때, 반응조건은 유속 30 μL/min, 주입한 프로브 핵산의 농도는 100 fmol/μL, 주입량은 30 μL였다. 혼성화된 프로브와 혼성화되지 않은 프로브가 같이 존재할 경우 혼성화된 DNA에만 TdT 효소가 반응을 일으킴을 증명하기 위해, 표적 DNA에 선택적으로 반응하는 프로브와 반응하지 않는 프로브 2종류를 각각 고정화하였다.
실시예 2-2 : 표적 DNA의 혼성화 반응
실시예 2-1과 같은 방법으로 프로브가 고정화된 칩에, 100 fmol/μL 농도의 표적핵산 60uL를 주입하고, 25℃에서 2분간 혼성화 반응을 시켰다.
실시예 2-3 : TdT 효소 반응
실시예 2-2의 방법으로 표적 DNA가 혼성화된 칩과 표적 DNA가 혼성화하지 않은 칩을 동일한 조건에서 실시예 1-3에서와 같이 TdT 효소 반응을 시키고, 반응 후 남아있는 과량의 TdT 효소와 TMR-6-dUTP를 제거하였다.
실시예 2-3 : SPR을 이용한 반응정도 측정
실시예 2-1, 2-2, 2-3에 나타난 전 과정동안 Biacore 3000(Biacore, Sweden) 을 이용하여 실시간으로 반응정도를 측정하였다.
도 4는 칩 위에 혼성화된 프로브와 혼성화되지 않은 프로브에 각각 TdT 효소반응을 실시하였을 때 차이를 보이는 SPR 결과 그래프이다. 그래프에서, 가로축은 시간(초)축이고, 세로축은 TdT 반응정도에 따라 TMR-6-dUTP가 표적 핵산에 붙음으로써 나타나는 무게변화에 따른 시그널(Response:RU)이다. 점선은 혼성화되지 않은 프로브를 사용하여 TdT 효소반응이 일어나지 않은 칩의 무게 변화를 나타내는 그래프이고, 실선은 혼성화된 프로브를 사용하여 TdT 효소반응이 일어난 칩의 무게 변화를 나타내는 그래프이다. 도 4에서 보여지듯이, 혼성화되지 않은 프로브를 사용한 칩은 TdT 효소 반응의 전후에 무게 변화가 거의 없는데 반하여, 혼성화된 프로브를 사용한 칩은 TdT 효소 반응의 전후에 무게가 크게 달라짐을 알 수 있었다.
실선의 경우, 1.2mm2 넓이의 칩에 심긴 프로브 핵산의 양은 227 fmole이고, 여기에 혼성화 반응한 표적 핵산의 양은 194 fmole이었다. TdT 효소반응 전후의 무게 변화는 964.6 pg이므로, 이로부터 표적 핵산에 붙은 TMR-6-dUTP의 양을 계산하면 1000 fmole이 된다. 따라서 표적 핵산 하나당 약 5.2 개의 TMR-6-dUTP가 붙게 됨을 알 수 있었다.
이상에서　상세히　설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 핵산 전달효소 TdT를 이용하여 혼성화된 표적 핵산의 3'-말단에만 특정　신호　유발의　물질을 붙여줌으로써, 유전자 분석용 센서 소자의 기판 위에 고정화된 핵산의 혼성화 검출 감도를 증가시키는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 혼성화된　표적 핵산의 3'-말단에만 선택적으로 반응하는 TdT 효소를 이용함으로써, 핵산의 혼성화 검출 감도 및 정확도를 높이는 한편, TdT 효소 반응을 여러 번 반복함으로써 혼성화된 표적 핵산의 신호를 크게 증폭하여 기존 검출방법에서 사용되던 고가의 형광스캐너 대신 저가의 CCD를 이용한 시스템에서도 검출이 가능하다는 장점을 가진다. 또한, 효소반응 과정이 핵산 전달효소 TdT와 dNTP를 첨가하고 37℃를 유지하기만 하면 될 정도로 간단하므로, Lab-on-a-chip 시스템에서 유전자 라벨링시 간편하게 사용될 수 있을 것이다.

Claims (12)

  1. ① 유전자 분석용 센서 소자의 기판에 프로브 핵산을 부착시키는 단계;
    ② 상기 프로브 핵산과 표적 핵산을 혼성화시키는 단계; 및
    ③ TdT(Terminal deoxynucleotidyl transferase)를 이용하여 혼성화된(hybridized) 표적핵산의 3'-말단에만 특정 신호유발물질을 부착시키는 단계를 포함하는 핵산의 혼성화 검출 및 신호 증폭 방법.
  2. 제 1항에 있어서, ② 단계 및 ③ 단계가 동시에 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 유전자 분석용 센서 소자의 기판은 유리, 석 영, 실리콘, 플라스틱, 폴리프로필렌, 폴리카보네이트 또는 활성화된 아크릴아마이드인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 유전자 분석용 센서 소자의 기판은 덴드리머(dendrimer), 폴리머(polymers), 다공성 매체(porous media) 또는 막(membranes)으로 코팅되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 프로브 핵산은 DNA, RNA 또는 PNA(peptide nucleic acid)인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 삭제
  7. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 특정 신호유발물질은 dNTP, 올리고뉴클레오티드, 비방사성 물질이 표지된(non-radioactively labeled) dNTP 또는 올리고뉴클레오티드, 혹은 이들의 혼합물인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 7항에 있어서, 비방사성 물질의 표지는 dNTP 또는 올리고뉴클레오티드에 형광염료를 붙여주는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 삭제
  10. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 핵산의 혼성화 검출은 형광 검출법, 전기화학적 방법, 질량 변화를 이용한 검출법, 전하량 변화를 이용한 검출법 또는 광학적 성질의 차이를 이용한 검출법에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 삭제
  12. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 특정 신호유발물질로서 비방사성 물질이 표지된 ddNTP(non-radioactively labeled ddNTP)를 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
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