KR20160134094A - 펩티드핵산을 이용한 항체 의존성 세포 독성에 관여하는 항체 Fc 감마 리셉터의 유전자형 판별방법 - Google Patents

펩티드핵산을 이용한 항체 의존성 세포 독성에 관여하는 항체 Fc 감마 리셉터의 유전자형 판별방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 항체 치료제로 사용되는 항체 의존성 세포 독성(antibody-dependent cellular cytotoxicity, ADCC)에 관여하는 항체 Fc 감마 리셉터의 유전자형 판별방법에 관한 것으로, 더욱 구체적으로는 블로커-펩티드핵산(blocker-Peptide Nucleic Acid)을 사용하여 항체 의존성 세포 독성에 관여하는 항체 Fc 감마 리셉터(Fc gamma receptor, FCGR) 유전자인 FCGR2B 및 FCGR3B의 간섭 현상을 억제하고, 상기 FCGR 유전자형마다 서로 다른 융해온도를 나타내는 형광-펩티드핵산 프로브를 사용함으로써, FCGR2A 또는 FCGR3A 유전자의 유전자형을 판별하기 위한 블로커-펩티드핵산 프로브, 형광 펩티드핵산 프로브, 프라이머 쌍 및 이를 이용하는 항체 Fc 감마 리셉터의 FCGR2A 또는 FCGR3A 유전자형 판별방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 FCGR2/3A(FCGR2A 또는 FCGR3A) 유전자형 판별용 블로커-펩티드핵산, 형광 펩티드핵산 프로브 및 프라이머 쌍을 이용하면, FCGR2A 또는 FCGR3A 유전자 또는 그 변이체를 간단하고 신속하게 판별할 수 있으므로 FCGR2A 또는 FCGR3A 유전자의 특정 서열(FCGR2A 단백질의 131번째 아미노산; FCGR3A 단백질의 158번째 아미노산을 코딩하는 염기서열)의 유전자형에 따른 항체 의존성 세포 독성(antibody-dependent cellular cytotoxicity, ADCC) 효율을 정확하게 판별할 수 있는 효과가 있다.

Description

펩티드핵산을 이용한 항체 의존성 세포 독성에 관여하는 항체 Fc 감마 리셉터의 유전자형 판별방법{Method for Discriminating Antibody-dependent Cellular cytotoxicity(ADCC) Related Antibody Fc gamma receptor(FCGR) Genotype Using Peptide Nucleic Acids}
본 발명은 항체 치료제로 사용되는 항체 의존성 세포 독성(antibody-dependent cellular cytotoxicity, ADCC)에 관여하는 항체 Fc 감마 리셉터의 유전자형 판별방법에 관한 것으로, 더욱 구체적으로는 블로커-펩티드핵산(blocker-Peptide Nucleic Acid)을 사용하여 항체 의존성 세포 독성에 관여하는 항체 Fc 감마 리셉터(Fc gamma receptor, FCGR) 유전자인 FCGR2B 및 FCGR3B의 간섭 현상을 억제하고, 상기 FCGR 유전자형마다 서로 다른 융해온도를 나타내는 형광-펩티드핵산 프로브를 사용함으로써, FCGR2A 또는 FCGR3A 유전자의 유전자형을 판별하기 위한 블로커-펩티드핵산 프로브, 형광 펩티드핵산 프로브, 프라이머 쌍 및 이를 이용하는 항체 Fc 감마 리셉터의 FCGR2A 또는 FCGR3A 유전자형 판별방법에 관한 것이다.
항체(antibody)는 인체 내에서 외부로부터 들어온 항원(antigen)과 결합하여 항원의 작용을 방해하거나, 항원을 제거하기 위하여 만들어진 면역단백질이며, 상기 항체의 특성을 이용하여 면역세포 신호전달 체계에 관여하는 단백질 항원이나 암세포 표면에서 발현되는 표지 인자를 표적으로 하는 단클론항체(monoclonal antibody)를 인체에서 부작용을 최소화할 수 있도록 개량하여 제조된 질병의 개선 및 치료 효과를 나타낼 수 있는 재조합 바이오의약품을 항체의약품이라 한다.
의약품으로서 항체의 작용은 항원과 결합하여 항원의 작용을 저해하는 직접적인 방식과, 항원과 결합한 항체의 Fc 감마 부위와 Fc 감마 수용체(Fc gamma receptor, FCGR)를 가지는 효과세포(자연살해세포, 대식세포 등)에 의한 간접적인 항원제거 방식이 있다. 최근 개발 중인 항체 치료제의 경우, 항원과의 결합으로 인한 항원의 작용을 막음과 동시에 항체의 Fc 감마 부위를 효과세포가 인식하여 공격 및 제거하는 기전으로 약제의 효과를 높이고 있으며, 이러한 기전을 항체 의존성 세포 독성(antibody-dependent cellular cytotoxicity, ADCC)이라고 한다.
최근 ADCC와 관련된 연구로, Fc 감마 부위 수용체의 유전자형에 따라 Fc 감마와 Fc 감마 수용체의 결합력에 영향을 주는 것으로 밝혀졌으며, 항체 기반 치료제의 효율이 환자의 Fc 감마 수용체인 FCGR2A 단백질의 131번째 아미노산과 FCGR3A 단백질의 158번째 아미노산의 아미노산 서열의 다양성에 따라 달라진다는 다수의 연구가 발표되었다. 일 예로 유방암 치료제인 허셉틴(trastuzumab)의 경우 전임상 연구에서 FCGR2A 131 H/H 혹은 FCGR3A 158 V/V 유전자형에서 항체 의존성 세포독성이 유의적인 차이를 보이며 증가하였다는 연구가 2008년에 Musolino 등에 의하여 보고되었다.
ADCC에 효율에 영향을 주는 FCGR 유전자는 3개 클라스(class)의 유사 유전자인 FCGR1, FCGR2 및 FCGR3이 있으며, 1번 염색체의 동일 부위에 위치하고 있다. 각 FCGR 유전자는 특이 세포마다 발현하는 양상이 다르며, FCGR2/3A(FCGR2A 또는 FCGR3A)의 경우 수지상세포와 같은 항원제시세포와 대식세포 및 B-세포에서 주로 발현되는 것으로 알려져 있으며, 항체의약품의 ADCC에 주요 인자로 확인된다. 또한, FCGR의 서브타입(subtype)으로 FCGR1A, FCGR1B, FCGR1C, FCGR2A, FCGR2B1, FCGR2B2, FCGR2B3, FCGR2C, FCGR3A 및 FCGR3B 등이 있으며, 대항 유전자 사이의 유사도는 99%에 가까울 정도로 유사하다. 이러한 유사도는 유전자 검사에 있어 특이도를 저하시키는 원인이 되며, 특히 민감도 특정 서열만을 아날로그적으로 선별하는 방식인 중합효소 연쇄반응법(PCR), 실시간중합효소연쇄반응법(Real-time PCR)을 사용한 분석에서 문제점을 나타내고 있다.
최근 PCR, Real-time PCR 및 Sanger sequencing 방법으로 FCGR3A의 유전자형을 광범위하게 조사한 연구 결과에 따르면, 유전자형의 빈도(allele frequency)가 평형을 이룬다는 하디-바인베르크(Hardy-Weinberg equilibrium) 이론에 부합하지 않는 것으로 알려졌으며, 이는 유전자형 분석과정에서 유사 유전자의 간섭 현상으로 인한 양성 위양성 및 음성 위양성이 그 원인으로 해석하고 있다.
일반적으로, 펩티드핵산(Peptide Nucleic Acid, PNA)은 핵산 염기가 인산 결합이 아닌 펩티드 결합으로 연결된 유사 DNA로 1991년에 Nielsen 등에 의해 처음으로 합성되었다. PNA는 자연계에서는 발견되지 않고 인공적으로 화학적인 방법으로 합성된다. PNA는 상보적인 염기 서열의 천연 핵산과 혼성화(hybridization) 반응을 통해 이중가닥을 형성한다. 길이가 같은 경우 PNA/DNA 이중가닥은 DNA/DNA 이중가닥보다, PNA/RNA 이중가닥은 DNA/RNA 이중가닥보다 안정하다. 또한, PNA는 단일 염기 부정합(single base mismatch) 때문에 이중 가닥이 불안정해지는 정도가 크기 때문에 SNP(single nucleotide polymorphism)를 검출하는 능력이 천연 핵산보다 더 뛰어나다. PNA는 화학적으로 안정할 뿐만 아니라 핵산분해효소(nuclease)나 단백질분해효소(protease)에 의해 분해되지 않아 생물학적으로도 안정하다. 또한, PNA는 LNA(Locked Nucleic Acid), MNA(Mopholino Nucleic Acid)처럼 유전자 인식 물질의 하나로서, 기본 골격이 폴리아미드(polyamide)로 구성되어 있다. PNA는 친화도(affinity)와 선택성(selectivity)이 매우 우수하고, 열/화학적으로 물성 및 안정성이 높아 보관이 용이하고 쉽게 분해되지 않는 장점이 있다. 또한, DNA-DNA 결합력보다 PNA-DNA 결합력이 매우 우수하여, PNA는 1개의 뉴클레오티드 부정합(mismatch)에도 융해온도(Tm)가 10~15℃ 가량 차이가 난다. 상기와 같은 PNA의 결합력의 차이를 이용하여 표적핵산의 SNP를 검출할 수 있다.
이러한 기술적 배경 하에서, 본 발명자들은 간편·신속·정확하게 항체 Fc 감마 리셉터(Fc gamma receptor, FCGR) 유전자형을 판별할 수 있는 방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, 블로커-펩티드핵산 프로브로 FCGR2B 및 FCGR3B 유전자의 증폭을 억제하고, 프라이머 쌍과 형광-펩티드핵산 프로브로 FCGR2A 또는 FCGR3A 유전자만을 특이적으로 증폭시켜 FCGR2B 및 FCGR3B의 검출에 따른 위양성 문제를 해결하고, 상기 형광 펩티드핵산 프로브를 이용한 혼성화를 통해 얻은 융해곡선을 분석하여, FCGR 관련 유전자 변이를 효율적으로 판별할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 FCGR2/3A(FCGR2A 또는 FCGR3A) 유전자형 판별용 프라이머 쌍, 블로커-펩티드핵산 프로브, 형광 펩티드핵산 프로브 및 이를 포함하는 조성물 또는 키트를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 프라이머 쌍 및 블로커-펩티드핵산 프로브를 이용하여 증폭된 FCGR2/3A(FCGR2A 또는 FCGR3A) 유전자 영역에 상기 형광 펩티드핵산 프로브의 혼성화에 따른 FCGR2/3A(FCGR2A 또는 FCGR3A) 유전자형에 맞는 Tm값을 얻어 FCGR2/3A(FCGR2A 또는 FCGR3A) 유전자형을 판별하는 방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 서열번호 5 또는 서열번호 6으로 표시되는 서열을 가지는 항체 Fc 감마 리셉터의 FCGR2A 또는 FCGR3A 유전자형 판별용 블로커-펩티드핵산 프로브를 제공한다.
본 발명은 또한, 서열번호 7 또는 서열번호 8로 표시되는 서열을 가지는 항체 Fc 감마 리셉터의 FCGR2A 또는 FCGR3A 유전자형 판별용 형광 펩티드핵산 프로브를 제공한다.
본 발명은 또한, 서열번호 1과 서열번호 2; 및 서열번호 3과 서열번호 4로 표시되는 서열로 구성된 군에서 선택되는 서열을 가지는 항체 Fc 감마 리셉터의 FCGR2A 또는 FCGR3A 유전자형 판별용 프라이머 쌍을 제공한다.
본 발명은 또한, 서열번호 5 또는 서열번호 6으로 표시되는 서열을 가지는 블로커-펩티드핵산 프로브; 서열번호 7 또는 서열번호 8로 표시되는 서열을 가지는 형광 펩티드핵산 프로브; 및 서열번호 1과 서열번호 2; 및 서열번호 3과 서열번호 4로 표시되는 서열로 구성된 군에서 선택되는 서열을 가지는 프라이머 쌍을 포함하는 항체 Fc 감마 리셉터의 FCGR2A 또는 FCGR3A 유전자형 판별용 조성물 및 키트를 제공한다.
본 발명은 또한, 서열번호 5 또는 서열번호 6으로 표시되는 서열을 가지는 블로커-펩티드핵산 프로브; 및 서열번호 7 또는 서열번호 8로 표시되는 서열을 가지는 형광 펩티드핵산 프로브를 이용하는 것을 특징으로 하는 항체 Fc 감마 리셉터의 FCGR2A 또는 FCGR3A 유전자형 판별방법을 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 검체 시료로부터 표적핵산을 분리하여, 표적핵산과 상보적으로 결합하는 서열번호 5 또는 서열번호 6으로 표시되는 서열을 가지는 블로커-펩티드핵산 프로브와 서열번호 1과 서열번호 2; 및 서열번호 3과 서열번호 4로 표시되는 서열로 구성된 군에서 선택되는 서열을 가지는 프라이머 쌍을 이용하여 상기 표적핵산을 증폭시키고, 상기 표적핵산과 혼성화할 수 있는 서열번호 7 또는 서열번호 8로 표시되는 서열을 가지는 형광 펩티드핵산 프로브와 혼성화시키는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계에서 혼성화된 반응물의 융해곡선 분석을 통해 항체 Fc 감마 리셉터의 FCGR2A 또는 FCGR3A 유전자형을 판별하는 단계를 포함하는 항체 Fc 감마 리셉터의 FCGR2A 또는 FCGR3A 유전자형 판별방법을 제공한다.
본 발명에 따른 FCGR2/3A(FCGR2A 또는 FCGR3A) 유전자형 판별용 블로커-펩티드핵산, 형광 펩티드핵산 프로브 및 프라이머 쌍을 이용하면, FCGR2A 또는 FCGR3A 유전자 또는 그 변이체를 간단하고 신속하게 판별할 수 있으므로 FCGR2A 또는 FCGR3A 유전자의 특정 서열(FCGR2A 단백질의 131번째 아미노산; FCGR3A 단백질의 158번째 아미노산을 코딩하는 염기서열)의 유전자형에 따른 항체 의존성 세포 독성(antibody-dependent cellular cytotoxicity, ADCC) 효율을 정확하게 판별할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 FCGR2/3A(FCGR2A 또는 FCGR3A) 유전자형을 결정하는 단일염기다형성(SNP) 판별 기술의 필요성을 설명하기 위한 개념도이다.
도 2는 FCGR2/3A(FCGR2A 또는 FCGR3A) 유전자형을 결정하는 단일염기다형성(SNP) 판별방법의 표준 분석법의 문제점을 설명하기 위한 도표이다.
도 3은 형광-펩티드핵산을 사용한 결합온도 결정법(melting temperature analysis)의 기술적 특징을 설명하기 위한 개념도이다.
도 4는 펩티드핵산을 이용한 FCGR2/3A(FCGR2A 또는 FCGR3A) 유전자형을 결정하는 단일염기다형성(SNP) 판별방법 및 유사 유전자의 증폭억제를 위한 블로커-펩티드핵산의 기술적 특징을 설명하기 위한 모식도이다.
도 5는 펩티드핵산을 이용한 FCGR2A 유전자형을 결정하는 단일염기다형성(SNP) 판별방법을 설명하기 위한 모식도이다.
도 6은 펩티드핵산을 이용한 FCGR3A 유전자형을 결정하는 단일염기다형성(SNP) 판별방법을 설명하기 위한 모식도이다.
도 7은 FCGR2/3A(FCGR2A 또는 FCGR3A) 유전자형을 결정하는 단일염기다형성(SNP) 판별을 위한 real-time PCR의 반응조건을 설명하기 위한 모식도이다.
도 8은 FCGR2/3A(FCGR2A 또는 FCGR3A) 유전자형을 결정하는 단일염기다형성(SNP) 판별을 위한 real-time PCR의 반응조건을 나타내는 도식이다.
도 9는 FCGR2/3A(FCGR2A 또는 FCGR3A) 유전자형을 결정하는 단일염기다형성(SNP) 판별용 펩티드핵산의 FCGR2/3A(FCGR2A 또는 FCGR3A) 유전자 내 결합위치와 유전자형에 따른 각각의 프로브에 대한 서로 다른 혼성화 정도를 탐지해 내는 것을 나타낸 모식도이다.
도 10은 FCGR2A의 유전자형을 결정하는 단일염기다형성(SNP) 판별결과 및 동일 샘플의 염기서열 분석결과를 비교분석한 것을 나타낸 것이다.
도 11은 FCGR3A의 유전자형을 결정하는 단일염기다형성(SNP) 판별결과 및 동일 샘플의 염기서열 분석결과를 비교분석한 것을 나타낸 것이다.
도 12는 FCGR2/3A(FCGR2A 또는 FCGR3A)의 유형별 유전자형을 결정하는 단일염기다형성(SNP) 판별결과를 나타낸 것이다.
도 13은 FCGR2/3A(FCGR2A 또는 FCGR3A)의 유전자형을 결정하는 단일염기다형성(SNP) 다중 동시분석의 판별결과를 나타낸 것이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명은, 도 1에 나타난 바와 같이, FCGR2/3A(FCGR2A 또는 FCGR3A) 유전자의 특정 서열(FCGR2A 단백질의 131번째 아미노산; FCGR3A 단백질의 158번째 아미노산을 코딩하는 염기서열)의 유전자형에 따라 항체 의존성 세포 독성(antibody-dependent cellular cytotoxicity, ADCC) 효율이 상이할 수 있다.
또한, 도 2에 나타난 바와 같이, FCGR2A 또는 FCGR3A 유전자형을 판별하는 과정에서 표준 유전자 분석방법인 생거 염기서열 분석법(Sanger sequencing)을 이용할 경우, 유사 유전자(FCGR2/3B(FCGR2B 및 FCGR3B))의 간섭으로 위양성 문제가 발생할 소지가 있다. 따라서 정확한 FCGR2/3A(FCGR2A 또는 FCGR3A) 유전자형을 결정하는 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)의 판별을 위해서 FCGR2/3A(FCGR2A 또는 FCGR3A) 유전자형 판별용 형광 펩티드핵산 프로브를 디자인하고, 상기 프로브를 이용한 혼성화를 통해 얻은 융해곡선을 분석하여, FCGR 유전자 변이를 효율적으로 판별하고자 하였다.
여기서, FCGR2/3A(FCGR2A 또는 FCGR3A)를 선택적으로 증폭할 수 있도록 유사 유전자(FCGR2/3B(FCGR2B 및 FCGR3B))의 증폭을 억제하는 블로커-펩티드핵산과, FCGR2/3A(FCGR2A 또는 FCGR3A)의 다형성 부위의 서열차이를 확인할 수 있는 형광-펩티드핵산을 이용한 FCGR2/3A의 유전자형을 결정하는 단일염기다형성(SNP) 판별방법을 이용하였다.
본 발명의 용어 '염기변이'는 표적핵산의 염기서열에 변이가 일어난 것으로, 단일염기다형성(SNP)뿐만 아니라, 염기의 치환, 결실 또는 삽입되어 변이가 일어난 것을 포함하는 것을 특징으로 하며, 본 발명의 펩티드핵산 프로브는 표적핵산의 1개 내지 4개의 염기가 치환, 결실 또는 삽입되어 변이가 일어난 것을 융해곡선 분석을 통해 분석할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 생거 염기서열 분석법(Sanger sequencing)을 이용하여 FCGR2/3A(FCGR2A 또는 FCGR3A) 유전자형의 분석을 수행하였다. 그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, FCGR2/3A(FCGR2A 또는 FCGR3A) 서열의 분석과 동시에 FCGR2/3B(FCGR2B 또는 FCGR3B) 유전자 서열도 중복되어 나타나는 것을 확인하였다. 이러한 FCGR2/3B(FCGR2B 또는 FCGR3B) 유전자의 간섭으로 인한 중복은 FCGR2A 유전자의 131번째 아미노산과 FCGR3A 유전자의 158번째 아미노산의 유전자형 분석에 영향을 미치는 것을 확인하였다.
본 발명의 다른 실시예에서는 FCGR2/3A(FCGR2A 또는 FCGR3A) 유전자의 유사 유전자인 FCGR2/3B(FCGR2B 또는 FCGR3B)의 증폭 억제용 블로커-펩티드핵산 프로브를 제작하고 이를 검증하였다. 그 결과, 도 10 및 11에 나타난 바와 같이, 제작된 블로커-펩티드핵산 프로브를 이용한 PCR 반응물을 생거 염기서열 분석법(Sanger sequencing) 수행 시 FCGR2/3B(FCGR2B 또는 FCGR3B) 유전자의 간섭이 감소하는 것을 확인하였다.
본 발명의 또 다른 실시예에서는 Real-time PCR을 사용한 FCGR2A 유전자형 분석을 수행하였다. 그 결과, 도 5에 도시화된 판별방법 및 도 7 및 8의 PCR 조건으로 실험한 결과, 도 12에 나타난 바와 같이, FCGR2A 131H 유전자형에서 59℃의 융해 피크(melting peak)를, FCGR2A 131R 유전자형에서 48℃의 융해 피크(melting peak)를, 그리고 FCGR2A 131R/H 헤테로 타입(hetero type)에서 48℃와 59℃를 모두 가지는 융해 피크(melting peak)를 확인하였다.
본 발명의 또 다른 실시예에서는 Real-time PCR을 사용한 FCGR3A 유전자형 분석을 수행하였다. 그 결과, 도 6에 도식화된 판별방법 및 도 7 및 8의 PCR 조건으로 실험한 결과, 도 12에 나타난 바와 같이, FCGR3A 158V 유전자형에서 68℃의 융해 피크(melting peak)를, FCGR3A 158F 유전자형에서 50℃의 융해 피크(melting peak)를, 그리고 FCGR3A 158V/F 헤테로 타입(hetero type)에서 68℃와 50℃를 모두 가지는 융해 피크(melting peak)를 확인하였다.
본 발명의 또 다른 실시예에서는 Real-time PCR을 사용한 FCGR2/3A(FCGR2A 또는 FCGR3A) 유전자형의 다중 및 동시분석을 수행하였다. 그 결과, 도 13에 나타난 바와 같이, HEX 형광에서의 FCGR2A 유전자의 131번째 아미노산을 코딩하는 유전자형 및 FAM 형광에서의 FCGR3A 유전자의 158번째 아미노산을 코딩하는 유전자형의 동시 분석이 가능하였다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서, 서열번호 5 또는 서열번호 6으로 표시되는 서열을 가지는 항체 Fc 감마 리셉터의 FCGR2A 또는 FCGR3A 유전자형 판별용 블로커-펩티드핵산 프로브에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 항체 Fc 감마 리셉터의 FCGR2A 또는 FCGR3A 유전자형 판별용 블로커-펩티드핵산 프로브는 FCGR2B 유전자 또는 FCGR3B 유전자의 증폭을 억제시키는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 '블로커-펩티드핵산 프로브'는 인공합성 DNA로 DNA 또는 RNA와 특이적으로 결합하며, 그 결합력이 높고 DNA와 결합 후 중합효소(polymerase)의 진행을 방해하는 성질을 가지고 있어, 중합효소 연쇄 반응에 첨가하여 표적핵산의 증폭을 방해하는 역할을 하며, PNA(Peptide nucleic acids) 또는 LNA(Locked nucleic acid)를 표적핵산과 상보적으로 결합할 수 있도록 합성하여 사용할 수 있다.
본 명세서에서 '블로커-펩티드핵산 프로브'는 '블로커-펩티드핵산' 또는 '블로커(blocker)'와 혼용해서 사용할 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서, 서열번호 7 또는 서열번호 8로 표시되는 서열을 가지는 항체 Fc 감마 리셉터의 FCGR2A 또는 FCGR3A 유전자형 판별용 형광 펩티드핵산 프로브에 관한 것이다.
본 발명의 형광 펩티드핵산 프로브는 표적 핵산과 염기변이를 가지는 표적 핵산의 융해온도(Tm) 차이를 위해, 표적핵산의 염기변이 위치가 형광 펩티드핵산 프로브의 가운데 부분(center position)에 오도록 디자인하는 것이 바람직하다. 염기변이 부분이 프로브의 가운데 부분에 위치하면, 프로브의 구조적 차이를 만들게 되고, 형광 펩티드핵산 프로브는 루프(loop)를 형성하면서 결합하게 되어, 이런 구조적 차이로 인해 융해온도(Tm)차이가 크게 나타난다.
상기와 같은 이유로, 본 발명의 형광 펩티드핵산 프로브가 16개 내지 17개 범위 내의 염기서열을 포함하는 경우에는, 8번째 내지 9번째 위치 중 하나 이상의 위치에 단일염기다형성(SNP) 부위에 상응하는 서열을 가지는 것이 바람직하다. 이러한 펩티드핵산은 염기서열의 가운데 부분에 FCGR2/3A(FCGR2A 또는 FCGR3A)의 유전자형을 결정하는 단일염기다형성(SNP) 판별부위에 상응하는 서열을 포함하여 구조적인 변형을 가질 수 있고, 이를 통해 완전한 혼성화(perfect match)를 이루는 표적 핵산과의 융해온도(Tm) 차이를 더욱 크게 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 항체 Fc 감마 리셉터의 FCGR2A 또는 FCGR3A 유전자형 판별용 형광 펩티드핵산 프로브는 리포터 또는 소광자가 결합되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 리포터는 FAM(6-carboxyfluorescein), Texas red, HEX(2',4',5',7',-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), JOE, CY3 및 CY5로 구성되는 군에서 선택되는 1개 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 바람직하게는 FAM 또는 HEX를 사용하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 소광자는 TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1, BHQ2 및 Dabcyl으로 구성되는 군에서 선택되는 1개 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 바람직하게는 Dabcyl을 사용하는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 형광 펩티드핵산 프로브는 TaqMan 프로브의 가수분해법(hydrolysis method)과는 다른 혼성화 방법(hybridization method)를 이용하여 분석하며, 유사한 역할을 하는 프로브로는 분자 비컨 프로브(molecular beacon probe), 스코피온 프로브(scorpion probe) 등이 있다.
본 발명의 펩티드핵산의 염기서열 길이는 특별히 제한되지는 않지만, FCGR2/3A(FCGR2A 또는 FCGR3A)의 유전자형을 결정하는 단일염기다형성(SNP)을 포함하는 9~17mer 길이로 제작할 수 있으며, 바람직하게는 블로커-펩티드핵산 프로브의 길이는 14∼16mer이고, 형광 펩티드핵산 프로브의 길이는 11∼13mer일 수 있다. 형광 펩티드핵산 프로브의 길이를 조절하여 원하는 Tm값을 가지도록 프로브를 디자인할 수 있고, 같은 길이의 형광 펩티드핵산 프로브라도 염기서열에 변화를 주어 Tm 값을 조절하는 것도 가능하다.
또한, 펩티드핵산(PNA)은 DNA보다 결합력이 우수하여 기본적인 Tm값이 높기 때문에 DNA보다 짧은 길이로 디자인이 가능하여 가깝게 이웃한 SNP라도 검출이 가능하다. 기존의 HRM(High resolution melting) 방법에 의하면 Tm값의 차이가 약 0.5℃로 매우 적어서 추가적인 분석프로그램이나 세밀한 온도 변화 또는 보정을 필요로 하고, 이 때문에 2개 이상의 SNP가 나타날 경우에는 분석이 어려웠지만, 본 발명에 따른 형광 펩티드핵산 프로브는 프로브 서열과 SNP에 대해서는 영향을 받지 않아 간편하게 분석이 가능하다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 서열번호 1과 서열번호 2; 및 서열번호 3과 서열번호 4로 표시되는 서열로 구성된 군에서 선택되는 서열을 가지는 항체 Fc 감마 리셉터의 FCGR2A 또는 FCGR3A 유전자형 판별용 프라이머 쌍에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 항체 Fc 감마 리셉터의 FCGR2A 또는 FCGR3A 유전자형 판별용 프라이머 쌍은 FCGR2A 유전자 또는 FCGR3A 유전자를 증폭시키는 데 이용되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 서열번호 5 또는 서열번호 6으로 표시되는 서열을 가지는 블로커-펩티드핵산 프로브; 서열번호 7 또는 서열번호 8로 표시되는 서열을 가지는 형광 펩티드핵산 프로브; 및 서열번호 1과 서열번호 2; 및 서열번호 3과 서열번호 4로 표시되는 서열로 구성된 군에서 선택되는 서열을 가지는 프라이머 쌍을 포함하는 항체 Fc 감마 리셉터의 FCGR2A 또는 FCGR3A 유전자형 판별용 조성물 및 키트에 관한 것이다.
본 발명의 키트는 버퍼, DNA 중합효소 조인자 및 데옥시리보뉴클레오타이드-5-트리포스페이트와 같은 타겟 증폭 PCR 반응(예컨대, PCR 반응)을 실시하는데 필요한 시약을 선택적으로 포함할 수 있다. 또한, 상기 키트는 다양한 폴리뉴클레오타이드 분자, 역전사효소, 버퍼 및 시약, 및 DNA 중합효소 활성을 억제하는 항체를 포함할 수 있다. 아울러, 상기 키트는 특정 반응에서 사용되는 시약의 최적량은, 본 명세서에 개시사항을 습득한 당업자에 의해서 용이하게 결정될 수 있다. 전형적으로, 상기 키트는 앞서 언급된 구성성분들을 포함하는 별도의 포장 또는 컴파트먼트(compartment)로 제작될 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 서열번호 5 또는 서열번호 6으로 표시되는 서열을 가지는 블로커-펩티드핵산 프로브; 및 서열번호 7 또는 서열번호 8로 표시되는 서열을 가지는 형광 펩티드핵산 프로브를 이용하는 것을 특징으로 하는 항체 Fc 감마 리셉터의 FCGR2A 또는 FCGR3A 유전자형 판별방법에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, (a) 검체 시료로부터 표적핵산을 분리하여, 표적핵산과 상보적으로 결합하는 서열번호 5 또는 서열번호 6으로 표시되는 서열을 가지는 블로커-펩티드핵산 프로브와 서열번호 1과 서열번호 2; 및 서열번호 3과 서열번호 4로 표시되는 서열로 구성된 군에서 선택되는 서열을 가지는 프라이머 쌍을 이용하여 상기 표적핵산을 증폭시키고, 상기 표적핵산과 혼성화할 수 있는 서열번호 7 또는 서열번호 8로 표시되는 서열을 가지는 형광 펩티드핵산 프로브와 혼성화시키는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계에서 혼성화된 반응물의 융해곡선 분석을 통해 항체 Fc 감마 리셉터의 FCGR2A 또는 FCGR3A 유전자형을 판별하는 단계를 포함하는 항체 Fc 감마 리셉터의 FCGR2A 또는 FCGR3A 유전자형 판별방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 검체 시료는 인간의 객담, 혈액, 타액 또는 소변으로부터 유래된 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서 '시료'는 다양한 시료를 포함하며, 바람직하게는, 본 발명의 방법을 이용하여 동물(인간 포함) 기원의 생물시료(biosample)가 분석될 수 있다. 포유류 또는 인간 기원의 시료를 분석하는 경우, 상기 시료는 특정 조직 또는 기관으로부터 유래될 수 있다. 조직의 대표적인 예로는, 결합, 피부, 근육 또는 신경 조직이 포함된다. 기관의 대표적인 예로는, 눈, 뇌, 폐, 간, 비장, 골수, 흉선, 심장, 림프, 혈액, 뼈, 연골, 췌장, 신장, 담낭, 위, 소장, 고환, 난소, 자궁, 직장, 신경계, 선 및 내부 혈관이 포함된다. 분석되는 생물시료는 생물학적 근원으로부터 나온 어떠한 세포, 조직, 유체액(fluid), 또는 본 발명에 의하여 잘 분석될 수 있는 어떠한 다른 매질(medium)도 포함하며, 이는 인간, 동물, 인간 또는 동물의 소비를 위하여 제조된 음식으로부터 얻은 시료가 포함된다. 또한, 분석되는 생물시료는 체액 시료를 포함하며, 이는 혈액, 혈청, 혈장, 림프, 모유, 소변, 분변, 안구 유액, 타액, 정액, 뇌 추출물(예컨대, 뇌 분쇄물), 척수액, 충수, 비장 및 편도선 조직 추출물이 포함되나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 표적핵산은 FCGR2A 유전자 또는 FCGR3A 유전자인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 '표적 핵산', '합성 DNA' 또는 '인공합성 올리고'는 판별하고자 하는 유전자형의 핵산 서열(SNP 포함)을 의미하며, 생리ㆍ생화학적 기능을 가지는 단백질을 코딩하는 '표적 유전자'의 핵산 서열의 특정 부위를 포함하고, 혼성화, 어닐링 또는 증폭 조건 하에서 프라이머 또는 프로브와 어닐링 또는 혼성화된다.
시료의 표적핵산은 DNA 또는 RNA이며, 상기 분자는 이중가닥 또는 단일가닥 형체일 수 있다. 초기물질로서 핵산이 이중가닥인 경우, 두 가닥을 단일 가닥으로, 또는 부분적인 단일-가닥 형태로 만드는 것이 바람직하다. 가닥들을 분리하는 것으로 알려진 방법들은, 열, 알카리, 포름아미드, 우레아 및 글리콕살 처리, 효소적 방법(예: 헬리카아제 작용) 및 결합 단백질을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 가닥 분리는 80 내지 105℃의 온도로 열처리하여 달성될 수 있다. 상술한 처리의 일반적인 방법은 Joseph Sambrook et al,, Molecular Cloning, 2001에 개시되어 있다.
본 발명에 있어서, 상기 융해곡선 분석은 FMCA(Fluorescence Melting Curve Analysis; 형광융해곡선분석) 방법으로 수행하는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 증폭은 실시간 PCR(Real-Time Polymerase Chain Reaction)방법으로 수행하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 블로커-펩티드핵산 프로브는 FCGR2B 및/또는 FCGR3B유전자의 증폭을 억제시키는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 블로커-펩티드핵산 프로브는 FCGR2B 및/또는 FCGR3B 유전자와 완전히 혼성화(perfect match)를 이루면 FCGR2B 및/또는 FCGR3B 유전자의 증폭산물이 생성되지 않고, FCGR2B 및/또는 FCGR3B와 불완전 혼성화(mismatch)를 이루면 표적핵산의 증폭산물이 생성되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 '혼성화'는 상보적인 단일가닥 핵산들이 이중-가닥 핵산을 형성하는 것을 의미한다. 혼성화는 2개의 핵산 가닥 간의 상보성이 완전할 경우(perfect match) 일어나거나 또는 일부 부정합(mismatch) 염기가 존재하여도 일어날 수 있다. 혼성화에 필요한 상보성의 정도는 혼성화 조건에 따라 달라질 수 있으며, 특히 온도에 의하여 조절될 수 있다.
본 발명의 리포터 및 소광자가 포함된 형광 펩티드핵산 프로브는 표적핵산과 혼성화된 후 형광 신호가 발생하며, 온도가 올라감에 따라 프로브의 적정 융해 온도에서 표적 핵산과 빠르게 융해되어 형광 신호가 소광되며, 이러한 온도 변화에 따른 상기 형광 신호로부터 얻어진 고해상도의 융해곡선 분석(Fluorescence Melting Curve Analysis; FMCA)을 통하여 표적 핵산의 염기 변성(SNP 포함) 유무를 검출할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 생거 염기서열 분석법(Sanger sequencing)을 이용한 FCGR2/3A(FCGR2A 또는 FCGR3A) 유전자형의 분석
표 1의 서열번호 1 및 2, 또는 서열번호 3 및 4로 표시된 프라이머를 사용하여 PCR 증폭 후 산물을 디렉트 생거 염기서열 분석법(Direct Sanger sequencing)을 통하여 염기서열분석을 수행하였으며, 유사 유전자의 증폭억제를 위한 블로커-펩티드핵산은 사용하지 않았다.
그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, FCGR2/3A(FCGR2A 또는 FCGR3A) 서열의 분석과 동시에 FCGR2/3B(FCGR2B 또는 FCGR3B) 유전자 서열도 중복되어 나타나는 것을 확인하였다. 이러한 FCGR2/3B(FCGR2B 또는 FCGR3B) 유전자의 간섭으로 인한 중복은 FCGR2A 유전자의 131번째 아미노산과 FCGR3A 유전자의 158번째 아미노산의 유전자형 분석에 영향을 미치는 것을 확인하였다.
하기 표 1은 FCGR2/3A(FCGR2A 또는 FCGR3A) 유전자형 판별용 프라이머 서열을 나타낸 것이다. 표 1에서 O는 링커 및 K는 라이신(lysine)을 나타낸 것이다.
프라이머 이름 서열(5'3') 서열번호
FCGR2A_F CAGGAGGGAGAAACCATCA 서열번호1
FCGR2A_R ACTGTGGTTTGCTTGTGGGA 서열번호2
FCGR3A_F CATCATAATTCTGACTTCTACATTCC 서열번호3
FCGR3A_R GTGGCACATGTCTCACCTTG 서열번호4
실시예 2: FCGR2/3A(FCGR2A 또는 FCGR3A) 유전자의 유사 유전자인 FCGR2/3B(FCGR2B 또는 FCGR3B)의 증폭 억제용 블로커-펩티드핵산 프로브의 제작 및 검증
특이 유전자인 FCGR2/3A(FCGR2A 또는 FCGR3A)만을 증폭하고, FCGR2/3A(FCGR2A 또는 FCGR3A)와 유사 정도가 높은 FCGR2/3B(FCGR2B 또는 FCGR3B) 유전자의 증폭억제를 위하여 유사 유전자의 블로커-펩티드핵산 프로브를 제작하였으며, 표 2에 나타난 바와 같이, FCGR2B 특이 블로커-펩티드핵산 프로브는 서열번호 5와 같으며, FCGR3B 특이 블로커-펩티드핵산 프로브는 서열번호 6과 같게 제작하였다. 또한, 도 4에 나타난 바와 같이, 펩티드핵산을 이용한 FCGR2/3A(FCGR2A 또는 FCGR3A) 유전자형을 결정하는 단일염기다형성(SNP) 판별을 위해서 형광-펩티드핵산을 제작하여 유전자 서열을 분석하였다.
그 결과, 도 10 및 11에 나타난 바와 같이, 제작된 블로커-펩티드핵산 프로브를 이용한 PCR 반응물을 생거 염기서열 분석법(Sanger sequencing) 수행 시 FCGR2/3B(FCGR2B 또는 FCGR3B) 유전자의 간섭이 감소하는 것을 확인하였다.
하기 표 2는 FCGR2/3A(FCGR2A 또는 FCGR3A) 유전자형 판별용 프로브 서열을 나타낸 것이다. 표 2에서 O는 링커 및 K는 라이신(lysine)을 나타낸 것이다.
프로브 이름 서열(5'3') 서열번호
FCGR2A_B K-AACCATCGTGCTGA-K 서열번호5
FCGR3A_B K-TGACTTCCACATTCCA-K 서열번호6
FCGR2A_S Dabcyl-CTCCCGTTTGGAT-O-K (HEX) 서열번호7
FCGR3A_S Dabcyl-GGCTTGTTGGGA-O-K (FAM) 서열번호8
실시예 3: Real-time PCR을 사용한 FCGR2A 유전자형 분석
유사 유전자 블로커-펩티드핵산과 FCGR2A의 131번째 아미노산을 코딩하는 유전자의 유전자형 분석이 가능한 형광-펩티드핵산 프로브를 사용하여 FCGR2A 유전자의 유전자형을 분석하였다. PCR은 CFX96™ Real-Time 시스템(BIO-RAD 사, 미국)을 이용하여 수행하였으며, 모든 실험 조건은 단일가닥 표적핵산을 생성하기 위해 비대칭 PCR(asymmetric PCR)을 이용하였다. 비대칭 PCR의 조건은 다음과 같다; 총 볼륨이 20㎕이 되도록 1X 시선바이오 리얼타임 FMCA™ 버퍼(SeaSunBio Real-Time FMCA™ buffer, 시선바이오, 한국), 2.5mM MgCl2, 200μM dNTPs, 1.0 U Taq polymerase, 0.05μM forward primer 및 0.5μM reverse primer(asymmetric PCR, 표 1)에 0.5㎕ 블로커-펩티드핵산 프로브(서열번호 5)와 0.5㎕ 형광-프로브(서열번호 7), 1㎕ 표준세포 대조군 DNA를 첨가한 다음 리얼타임 PCR을 수행하였다. 여기서, 도 5는 펩티드핵산을 이용한 FCGR2A의 유전자형을 결정하는 단일염기다형성(SNP) 판별과 유사 유전자인 FCGR2B의 증폭을 억제하는 방법의 원리와 그로 인하여 측정된 형광-펩티드핵산의 유전자형에 따른 융해곡선의 온도 차이를 설명하기 위한 모식도이다.
또한, 도 7에 나타난 바와 같이, FCGR2/3A의 유전자형을 결정하는 단일염기다형성(SNP) 판별 방법은 DNA 샘플 중 FCGR2/3A 유전자를 Forward/Reverse 프라이머 쌍을 이용하여 PCR 증폭하는 단계, 상기 증폭된 산물(FCGR2/3A(FCGR2A 또는 FCGR3A) DNA)에 펩티드핵산을 혼성화(hybridization)시키는 단계; 상기 혼성화시킨 산물의 온도를 높이면서 온도별 융해곡선을 얻는 단계; 및 상기 얻은 융해곡선의 융해온도로부터 FCGR2/3A(FCGR2A 또는 FCGR3A)의 유전자형을 결정하는 단일염기다형성(SNP)을 판별하는 단계로 구성되어 있다. 혼성화에 따른 분석방법으로는 FMCA(Fluorescence Melting Curve Analysis)를 이용할 수 있고, 상기 FMCA는 PCR 반응이 끝나고 난 후 만들어진 산물과 첨가된 프로브 간의 결합력의 차이를 Tm으로 구분하여 분석하는 것이다. 예를 들어, 일반적인 real-time PCR 장치를 이용하여, 1℃ 증가시킬 때 마다 형광의 세기를 측정함으로써 Tm값을 수득할 수 있었다.
그 결과, 도 5에 도시화된 판별방법 및 도 7 및 8의 PCR 조건으로 실험한 결과, 도 12에 나타난 바와 같이, FCGR2A 131H 유전자형에서 59℃의 융해 피크(melting peak)를, FCGR2A 131R 유전자형에서 48℃의 융해 피크(melting peak)를, 그리고 FCGR2A 131R/H 헤테로 타입(hetero type)에서 48℃와 59℃를 모두 가지는 융해 피크(melting peak)를 확인하였다.
실시예 4: Real-time PCR을 사용한 FCGR3A 유전자형 분석
유사 유전자 블로커-펩티드핵산과 FCGR3A 유전자 158번째 아미노산을 코딩하는 유전자형 분석이 가능한 형광-펩티드핵산 프로브를 사용하여 FCGR3A 유전자의 유전자형을 분석하였다. PCR 조건은 실시예 3에서 진행한 조건과 동일하게 수행하였다. 다만, FCGR3A 특이적인 블로커-펩티드핵산 프로브(서열번호 6)와 형광-프로브(서열번호 8)를 첨가하여, 리얼타임 PCR을 수행하였다.
도 6은 펩티드핵산을 이용한 FCGR3A의 유전자형을 결정하는 단일염기다형성(SNP) 판별과 유사 유전자인 FCGR3B의 증폭을 억제하는 방법의 원리와 그로 인하여 측정된 형광-펩티드핵산의 유전자형에 따른 융해곡선의 온도 차이를 설명하기 위한 모식도이다.
또한, 도 7에 나타난 바와 같이, FCGR2/3A의 유전자형을 결정하는 단일염기다형성(SNP) 판별방법은 DNA 샘플 중 FCGR2/3A 유전자를 Forward/Reverse 프라이머 쌍을 이용하여 PCR 증폭하는 단계, 상기 증폭된 산물(FCGR2/3A(FCGR2A 또는 FCGR3A) DNA)에 펩티드핵산을 혼성화(hybridization)시키는 단계; 상기 혼성화시킨 산물의 온도를 높이면서 온도별 융해곡선을 얻는 단계; 및 상기 얻은 융해곡선의 융해온도로부터 FCGR2/3A(FCGR2A 또는 FCGR3A)의 유전자형을 결정하는 단일염기다형성(SNP)을 판별하는 단계로 구성되어 있다. 혼성화에 따른 분석방법으로는 FMCA(Fluorescence Melting Curve Analysis)를 이용할 수 있고, 상기 FMCA는 PCR 반응이 끝나고 난 후 만들어진 산물과 첨가된 프로브 간의 결합력의 차이를 Tm으로 구분하여 분석하는 것이다. 예를 들어, 일반적인 real-time PCR 장치를 이용하여, 1℃ 증가시킬 때 마다 형광의 세기를 측정함으로써 Tm값을 수득할 수 있었다.
그 결과, 도 6에 도시화된 판별방법 및 도 7 및 8의 PCR 조건으로 실험한 결과, 도 12에 나타난 바와 같이, FCGR3A 158V 유전자형에서 68℃의 융해 피크(melting peak)를, FCGR3A 158F 유전자형에서 50℃의 융해 피크(melting peak)를, 그리고 FCGR3A 158V/F 헤테로 타입(hetero type)에서 68℃와 50℃를 모두 가지는 융해 피크(melting peak)를 확인하였다.
실시예 5: Real-time PCR을 사용한 FCGR2/3A(FCGR2A 또는 FCGR3A) 유전자형의 다중 및 동시분석
유사 유전자 블로커-펩티드핵산 2 종과 FCGR2A 유전자 131번째 아미노산을 코딩하는 유전자형 분석이 가능한 형광-펩티드핵산 프로브, FCGR3A 유전자 158번 아미노산의 유전자형 분석이 가능한 형광-펩티드핵산 프로브를 동시에 사용하여 FCGR2/3A(FCGR2A 또는 FCGR3A) 유전자의 유전자형을 동시에 분석하였다. PCR 조건은 실시예 3에서 진행한 조건과 동일하게 수행하였다. 상기와 같이 두 개 이상의 형광-펩티드핵산 프로브를 포함하는 경우, 각각의 PNA는 서로 다른 형광 리포터를 가짐으로써 각기 다른 유전자의 유전자형을 동시에 판별할 수 있다(표 1, 표 2).
그 결과, 도 13에 나타난 바와 같이, HEX 형광에서의 FCGR2A 유전자의 131번째 아미노산을 코딩하는 유전자형 및 FAM 형광에서의 FCGR3A 유전자의 158번째 아미노산을 코딩하는 유전자형의 동시 분석이 가능하였다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Seasunbiomaterials <120> Method for Discriminating Antibody-dependent Cellular cytotoxicity(ADCC) Related Antibody Fc gamma receptor(FCGR) Genotype Using Peptide Nucleic Acids <130> P15-B095 <160> 8 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FCGR2A_F <400> 1 caggagggag aaaccatca 19 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FCGR2A_R <400> 2 actgtggttt gcttgtggga 20 <210> 3 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FCGR3A_F <400> 3 catcataatt ctgacttcta cattcc 26 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FCGR3A_R <400> 4 gtggcacatg tctcaccttg 20 <210> 5 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FCGR2A_B <400> 5 aaccatcgtg ctga 14 <210> 6 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FCGR3A_B <400> 6 tgacttccac attcca 16 <210> 7 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FCGR2A_S <400> 7 ctcccgtttg gat 13 <210> 8 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FCGR3A_S <400> 8 ggcttgttgg ga 12

Claims (18)

  1. 서열번호 5 또는 서열번호 6으로 표시되는 서열을 가지는 항체 Fc 감마 리셉터의 FCGR2A 또는 FCGR3A 유전자형 판별용 블로커-펩티드핵산 프로브.
  2. 제1항에 있어서, FCGR2B 유전자 또는 FCGR3B 유전자의 증폭을 억제시키는 항체 Fc 감마 리셉터의 FCGR2A 또는 FCGR3A 유전자형 판별용 블로커-펩티드핵산 프로브.
  3. 서열번호 7 또는 서열번호 8로 표시되는 서열을 가지는 항체 Fc 감마 리셉터의 FCGR2A 또는 FCGR3A 유전자형 판별용 형광 펩티드핵산 프로브.
  4. 제3항에 있어서, 리포터 또는 소광자가 결합되어 있는 항체 Fc 감마 리셉터의 FCGR2A 또는 FCGR3A 유전자형 판별용 형광 펩티드핵산 프로브.
  5. 제4항에 있어서, 상기 리포터는 FAM(6-carboxyfluorescein), Texas red, HEX(2',4',5',7',-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), JOE, CY3 및 CY5로 구성되는 군에서 선택되는 1개 이상인 것을 특징으로 하는 항체 Fc 감마 리셉터의 FCGR2A 또는 FCGR3A 유전자형 판별용 형광 펩티드핵산 프로브.
  6. 제4항에 있어서, 상기 소광자는 TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1, BHQ2 및 Dabcyl으로 구성되는 군에서 선택되는 1개 이상인 것을 특징으로 하는 항체 Fc 감마 리셉터의 FCGR2A 또는 FCGR3A 유전자형 판별용 형광 펩티드핵산 프로브.
  7. 서열번호 1과 서열번호 2; 및 서열번호 3과 서열번호 4로 표시되는 서열로 구성된 군에서 선택되는 서열을 가지는 항체 Fc 감마 리셉터의 FCGR2A 또는 FCGR3A 유전자형 판별용 프라이머 쌍.
  8. 제7항에 있어서, FCGR2A 유전자 또는 FCGR3A 유전자를 증폭시키는 데 이용되는 항체 Fc 감마 리셉터의 FCGR2A 또는 FCGR3A 유전자형 판별용 프라이머 쌍.
  9. 서열번호 5 또는 서열번호 6으로 표시되는 서열을 가지는 블로커-펩티드핵산 프로브; 서열번호 7 또는 서열번호 8로 표시되는 서열을 가지는 형광 펩티드핵산 프로브; 및 서열번호 1과 서열번호 2; 및 서열번호 3과 서열번호 4로 표시되는 서열로 구성된 군에서 선택되는 서열을 가지는 프라이머 쌍을 포함하는 항체 Fc 감마 리셉터의 FCGR2A 또는 FCGR3A 유전자형 판별용 조성물.
  10. 서열번호 5 또는 서열번호 6으로 표시되는 서열을 가지는 블로커-펩티드핵산 프로브; 서열번호 7 또는 서열번호 8로 표시되는 서열을 가지는 형광 펩티드핵산 프로브; 및 서열번호 1과 서열번호 2; 및 서열번호 3과 서열번호 4로 표시되는 서열로 구성된 군에서 선택되는 서열을 가지는 프라이머 쌍을 포함하는 항체 Fc 감마 리셉터의 FCGR2A 또는 FCGR3A 유전자형 판별용 키트.
  11. 서열번호 5 또는 서열번호 6으로 표시되는 서열을 가지는 블로커-펩티드핵산 프로브; 및 서열번호 7 또는 서열번호 8로 표시되는 서열을 가지는 형광 펩티드핵산 프로브를 이용하는 것을 특징으로 하는 항체 Fc 감마 리셉터의 FCGR2A 또는 FCGR3A 유전자형 판별방법.
  12. 다음 단계를 포함하는 항체 Fc 감마 리셉터의 FCGR2A 또는 FCGR3A 유전자형 판별방법:
    (a) 검체 시료로부터 표적핵산을 분리하여, 표적핵산과 상보적으로 결합하는 서열번호 5 또는 서열번호 6으로 표시되는 서열을 가지는 블로커-펩티드핵산 프로브와 서열번호 1과 서열번호 2; 및 서열번호 3과 서열번호 4로 표시되는 서열로 구성된 군에서 선택되는 서열을 가지는 프라이머 쌍을 이용하여 상기 표적핵산을 증폭시키고, 상기 표적핵산과 혼성화할 수 있는 서열번호 7 또는 서열번호 8로 표시되는 서열을 가지는 형광 펩티드핵산 프로브와 혼성화시키는 단계; 및
    (b) 상기 (a) 단계에서 혼성화된 반응물의 융해곡선 분석을 통해 항체 Fc 감마 리셉터의 FCGR2A 또는 FCGR3A 유전자형을 판별하는 단계.
  13. 제12항에 있어서, 상기 검체 시료는 인간의 객담, 혈액, 타액 또는 소변으로부터 유래된 것을 특징으로 하는 항체 Fc 감마 리셉터의 FCGR2A 또는 FCGR3A 유전자형 판별방법.
  14. 제12항에 있어서, 상기 표적핵산은 FCGR2A 유전자 또는 FCGR3A 유전자인 것을 특징으로 하는 항체 Fc 감마 리셉터의 FCGR2A 또는 FCGR3A 유전자형 판별방법.
  15. 제12항에 있어서, 상기 융해곡선 분석은 FMCA(Fluorescence Melting Curve Analysis; 형광융해곡선분석) 방법으로 수행하는 것을 특징으로 하는 항체 Fc 감마 리셉터의 FCGR2A 또는 FCGR3A 유전자형 판별방법.
  16. 제12항에 있어서, 상기 증폭은 실시간 PCR(Real-Time Polymerase Chain Reaction)방법으로 수행하는 것을 특징으로 하는 항체 Fc 감마 리셉터의 FCGR2A 또는 FCGR3A 유전자형 판별방법.
  17. 제12항에 있어서, 상기 블로커-펩티드핵산 프로브는 FCGR2B 및/또는 FCGR3B유전자의 증폭을 억제시키는 것을 특징으로 하는 항체 Fc 감마 리셉터의 FCGR2A 또는 FCGR3A 유전자형 판별방법.
  18. 제12항에 있어서, 상기 블로커-펩티드핵산 프로브는 FCGR2B 및/또는 FCGR3B유전자와 완전히 혼성화(perfect match)를 이루면 FCGR2B 및/또는 FCGR3B 유전자의 증폭산물이 생성되지 않고, FCGR2B 및/또는 FCGR3B와 불완전 혼성화(mismatch)를 이루면 표적핵산의 증폭산물이 생성되는 것을 특징으로 하는 항체 Fc 감마 리셉터의 FCGR2A 또는 FCGR3A 유전자형 판별방법.
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