KR20170061345A - 유전성 난청 검출용 ｐｎａ 프로브 및 이를 이용한 유전성 난청 검출방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 유전성 난청 검출용 PNA(Peptide Nucleic Acid) 프로브 및 이를 이용한 유전성 난청 검출방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 유전성 난청 검출용 PNA 프로브 및 이를 이용한 유전성 난청 검출방법을 통해 난청과 관련된 유전자 또는 그 변이체를 신속 간단하게 판별할 수 있으며, 유전성 난청의 주요한 원인이 되는 GJB2, SLC26A4, 12S rRNA, CDH23 및 TMPRSS3 유전자의 돌연변이 11개를 이용하여 유전성 난청을 조기에 진단하고 비증후군성 난청 및 위험도를 진단하는데 활용될 수 있을 것으로 기대된다.
Description
본 발명은 유전성 난청 검출용 PNA(Peptide Nucleic Acid) 프로브 및 이를 이용한 유전성 난청 검출방법에 관한 것이다.
난청은 현재 발견되는 신생아의 선천성 질환 중 발병률이 높은 질환의 하나로 1,000명의 신생아당 0.9명부터 5.9명까지 보고되고 있으며, 신생아 난청은 높은 비중을 차지하고 있음에도 불구하고, 출생 시 발견되지 못하고 2세 이후에 이르러서야 발견, 진단되는 경향이 있다.
출생 후 첫 3년이 언어발달에 가장 중요한 시기이므로, 2세 이전에 난청이 발견되어 치료되지 않는다면 이후 언어 재활의 어려움과 더불어 평생 장애인으로 남는 후유증이 발생한다. 따라서 이의 예방을 위해 유전성 난청과 같이 영아 또는 소아들의 청각장애를 조기에 발견하고 적절한 재활치료를 해 주기 위한 신생아 난청선별검출의 필요성이 대두되었다.
한편, 신생아 난청 선별 검사는 자동청성뇌간반응검사(AABR) 또는 자동이음향방사검사(AOAE) 등의 기기를 통해서 시행되고 있지만, 이러한 기기를 통한 물리적 검사는 선천성 난청 진단시에만 유용하며, 비증후군성 유전성 난청 진단은 불가능한 단점이 있다. 따라서 비증후군성 유전성 난청 진단을 위해서 신생아의 유전자 검출이 필수적이라고 할 수 있다.
현재까지 유전자 돌연변이 검출 방법은 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR) 결과물의 직접적인 염기서열 분석법 (Direct sequencing), 제한효소절편길이다양성 분석법 (PCR-RFLP), 라인 프로브 분석법 (Line Probe assay), 제한효소절편질량다양성 분석법 (PCR-RFMP) 및 multiplex PCR 방법과 DNA 칩을 이용한 검출 방법이 있다.
유전성 난청 진단 방법으로는 DNA 칩(chip)이나 PCR을 통한 DNA 서열분석(sequencing) 위주로 진행되어 왔으나, DNA 칩 기술은 새로운 변이가 발견되면 칩 자체를 새롭게 제작해야 하는 제약이 있다. 따라서 대한민국 공개특허공보 2012-0067384호에 개시된 것과 같은 유전성 난청을 저렴하고 정확하게 진단하는 기술이 필요하다.
최근 프로브를 이용한 검출방법은 감도(sensitivity)와 특이성(specificity)이 높아 각광받고 있다. 하지만, 복잡한 디자인 방식의 프로브 검출은 값이 비싸고 사용상의 불편함이 있다. 따라서 보다 간편한 디자인을 통해 신속하게 정확성이 높은 검출이 가능한 기술의 개발이 절실히 요구되는 상황이다.
상기와 같은 문제점의 해결을 위하여 본 발명에서는 유전성 난청 검출을 위한 PNA 프로브와 프라이머 쌍(primer pair)을 설계하여 제공하고자 하였다.
또한, 상기 PNA 프로브와 프라이머 쌍을 이용하여 증폭되고, 혼성화된 검체 시료로부터 난청과 관련된 유전자의 변이를 검출하는 방법을 제공하고자 하였다.
본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 11로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 서열을 포함하는 유전성 난청 검출용 PNA 프로브에 관한 것이다.
또한 본 발명은 서열번호 12 내지 서열번호 31로 이루어진 군에서 선택되는 유전성 난청 검출용 프라이머 쌍에 있어서,
정방향 프라이머로 서열번호 12, 역방향 프라이머로 서열번호 13의 염기서열;
정방향 프라이머로 서열번호 14, 역방향 프라이머로 서열번호 15의 염기서열;
정방향 프라이머로 서열번호 16, 역방향 프라이머로 서열번호 17의 염기서열;
정방향 프라이머로 서열번호 18, 역방향 프라이머로 서열번호 19의 염기서열;
정방향 프라이머로 서열번호 20, 역방향 프라이머로 서열번호 21의 염기서열;
정방향 프라이머로 서열번호 22, 역방향 프라이머로 서열번호 23의 염기서열;
정방향 프라이머로 서열번호 24, 역방향 프라이머로 서열번호 25의 염기서열;
정방향 프라이머로 서열번호 26, 역방향 프라이머로 서열번호 27의 염기서열;
정방향 프라이머로 서열번호 28, 역방향 프라이머로 서열번호 29의 염기서열; 또는
정방향 프라이머로 서열번호 30, 역방향 프라이머로 서열번호 31의 염기서열;인 프라이머 쌍(primer pair)에 관한 것이다.
또한 본 발명은 상기 PNA 프로브 및 프라이머 쌍을 포함하는 유전성 난청 검출용 조성물에 관한 것이다.
또한 본 발명은 a) 검체 시료로부터 gDNA를 추출하는 단계; b) GJB2, SLC26A4, 12S rRNA 및 TMPRSS3로 이루어진 군에서 선택되는 유전자 또는 그 변이체를 증폭시킬 수 있는 정방향 및 역방향 프라이머 쌍을 이용하여 상기 유전자 또는 그 변이체를 증폭시키고, 상기 유전자 또는 그 변이체와 혼성화할 수 있는 PNA 프로브와 혼성화시키는 단계; 및 c) 상기 b)단계에서 혼성화된 반응물의 융해곡선을 분석하여 상기 유전자 또는 그 변이체를 검출하는 단계;를 포함하는 유전성 난청 검출방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 유전성 난청 검출용 PNA 프로브 및 이를 이용한 유전성 난청 검출방법을 통해 난청과 관련된 유전자 또는 그 변이체를 신속 간단하게 판별할 수 있으며, 유전성 난청의 주요한 원인이 되는 GJB2, SLC26A4, 12S rRNA 및 TMPRSS3 유전자의 돌연변이 11개를 이용하여 유전성 난청을 조기에 진단하고 비증후군성 난청 및 위험도를 진단하는데 활용될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 유전성 난청 검출을 위한 증폭과 PNA FMCA를 위한 PCR 조건이다.
도 2는 난청 관련 유전자의 야생형(wild-type) 및 돌연변이 개체의 융해곡선이다.
도 2는 난청 관련 유전자의 야생형(wild-type) 및 돌연변이 개체의 융해곡선이다.
본 발명의 용어 "프로브"란, 유전자 또는 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하는데, 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있고, 보다 용이하게 검출하기 위하여 라벨링 될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 "혼성화"는 상보적인 단일가닥 핵산들이 이중-가닥 핵산을 형성하는 것을 의미한다. 혼성화는 2개의 핵산 가닥 간의 상보성이 완전할 경우(perfect match) 일어나거나 또는 일부 부정합(mismatch) 염기가 존재하여도 일어날 수 있다. 혼성화에 필요한 상보성의 정도는 혼성화 조건에 따라 달라질 수 있으며, 특히 온도에 의하여 조절될 수 있다.
본 발명의 '핵산'은 검출하고자 하는 핵산서열을 의미하며, 혼성화, 어닐링 또는 증폭 조건 하에서 프라이머 또는 프로브와 어닐링 또는 혼성화된다.
본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 11로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 서열을 포함하는 유전성 난청 검출용 PNA 프로브에 관한 것이다.
PNA(Peptide Nucleic Acid)는 LNA(Locked nucleic acid), MNA(Mopholino nucleic acid)처럼 유전자 인식 물질의 하나로, 인공적으로 합성하며 기본 골격이 폴리아미드(polyamide)로 구성되어 있다. PNA는 친화도(affinity)와 선택성 (selectivity)이 매우 우수하며, 핵산분해효소에 대한 안정성이 높아 현존하는 제한효소(restriction enzyme)로 분해되지 않는다. 또한 열/화학적으로 물성 및 안정성이 높아 보관이 용이하고 쉽게 분해되지 않는 장점이 있다. 또한 DNA-DNA 결합력 보다 PNA-DNA 결합력이 매우 우수하여 1개의 핵산 불일치(nucleotide mismatch)에도 10~15℃ 가량 융해온도(Tm) 차이가 난다. 이러한 결합력의 차이를 이용하여 SNP(single nucleotide polymorphism) 및 InDel(insertion/deletion) 핵산 변화를 검출할 수 있게 된다.
PNA 프로브의 핵산과 이에 상보적으로 결합하는 DNA의 차이에 따라서도 Tm값의 변화를 나타내어 이를 이용한 응용기술의 개발이 용이하다. PNA 프로브는 TaqMan 프로브의 수화(hydrolysis) 반응과는 다른 혼성화(hybridization) 반응을 이용하여 분석하며, 비슷한 역할을 하는 프로브로는 분자 표지 프로브(molecular beacon probe), 스콜피온 프로브(scorpion probe)가 있다.
혼성화 반응의 분석 방법으로는 형광융해곡선분석(Fluorescence Melting Curve Analysis, FMCA)를 이용하며, 형광융해곡선분석은 PCR 반응 종료 후 생성된 산물과 투입한 프로브 간의 결합력 차이를 융해온도로 구분하여 분석한다. 다른 SNP 검출 프로브와는 다르게 프로브 디자인이 매우 간편하여 SNP를 포함하는 11~18 mer의 염기서열을 이용하여 제작한다. 따라서 원하는 융해온도를 갖는 프로브를 설계하기 위해서는 PNA 프로브의 길이에 따라 Tm값을 조절할 수 있으며, 같은 길이의 PNA 프로브라도 probe에 변화를 주어 Tm 값을 조절할 수 있다. PNA는 DNA보다 결합력이 우수하여 기본적인 Tm값이 높기 때문에 DNA보다 짧은 길이로 design이 가능하여 가깝게 이웃한 SNP라도 detection이 가능하다. 기존의 HRM method는 Tm값의 차이가 약 0.5℃로 매우 작아 추가적인 분석프로그램이나 세밀한 온도변화가 요구되고 2개 이상의 SNP가 나타날 경우 분석이 어렵게 되는 반면, PNA 프로브는 probe sequence 이외의 SNP에 대해서는 영향을 받지 않아 분석이 가능하다.
본 발명에서 상기 PNA 프로브는 제한되지는 않으나 GJB2, SLC26A4, 12S rRNA, CDH23 및 TMPRSS3로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 유전자와 혼성화(hybridization)할 수 있다.
본 발명에서 상기 PNA 프로브는 제한되지는 않으나 상기 GJB2 유전자의 V37I, 235delC, 299-300delAT, R143W, SLC26A4 유전자의 T410M, L676Q, H723R, IVS7-2A>G, 12S rRNA 유전자의 1555A>G, CDH23유전자의 P240L 및 TMPRSS3유전자의 A306T로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 유전자 변이체와 혼성화할 수 있다.
또한 본 발명에서 상기 PNA 프로브는 제한되지는 않으나 리포터 또는 소광자가 결합되어 있을 수 있다. 본 발명의 리포터 및 소광자가 포함된 PNA 프로브는 표적핵산과 혼성화 된 후 형광 신호가 발생하며, 온도가 올라감에 따라 프로브의 적정 융해 온도에서 표적핵산과 빠르게 융해되어 형광 신호가 소광되며, 이러한 온도 변화에 따른 상기 형광 신호로부터 얻어진 고 해상도의 융해곡선 분석을 통하여 표적핵산의 유무를 검출할 수 있다.
본 발명에 있어서, "PNA 프로브(probe)"는 표적핵산이 존재하는 경우 표적핵산에 우선적으로 결합하여 예상된 융해온도(Tm) 값을 보이며, 표적핵산이 없는 경우 내부컨트롤에 결합하여 예상보다 낮은 융해온도(Tm) 값을 보이는 것을 특징으로 할 수 있으며, 내부컨트롤과 표적핵산 융해곡선 차이를 이용하여 위양성 및 위음성 시그널을 구분할 수 있다. PNA 프로브는 TaqMan probe의 hydrolysis method와는 다른 hybridization method를 이용하여 분석하며, 비슷한 역할을 하는 probe로는 molecular beacon probe, scorpion probe가 있다.
본 발명의 프로브는 양 말단에 리포터와 리포터 형광을 소광할 수 있는 소광자의 형광 물질이 결합할 수 있으며, 인터컬레이팅(intercalating) 형광 물질을 포함할 수 있다. 상기 리포터는 FAM(6-carboxyfluorescein), HEX, Texas red, JOE, TAMRA, CY5, CY3, Alexa680 로 구성되는 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으며, 상기 소광자는 TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1, BHQ2 또는 Dabysyl을 사용하는 것이 바람직하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 인터컬레이팅 형광 물질은 아크리딘 호모다이머(Acridine homodimer) 및 이의 유도체, 아크리딘 오렌지(Acridine Orange) 및 이의 유도체, 7-아미노액티노마이신 D(7-aminoactinomycin D, 7-AAD) 및 이의 유도체, 액티노마이신 D(Actinomycin D) 및 이의 유도체, 에이씨엠에이(ACMA, 9-amino-6-chloro-2-methoxyacridine) 및 이의 유도체, 디에이피아이(DAPI) 및 이의 유도체, 디하이드로에티듐(Dihydroethidium) 및 이의 유도체, 에티듐 브로마이드(Ethidium bromide) 및 이의 유도체, 에티듐 호모다이머-1(EthD-1) 및 이의 유도체, 에티듐 호모다이머-2(EthD-2) 및 이의 유도체, 에티듐 모노아자이드(Ethidium monoazide) 및 이의 유도체, 헥시디움 아이오다이드(Hexidium iodide) 및 이의 유도체, 비스벤지마이드(bisbenzimide, Hoechst 33258) 및 이의 유도체, 호에크스트 33342(Hoechst 33342) 및 이의 유도체, 호에크스트 34580(Hoechst 34580) 및 이의 유도체, 하이드로옥시스티바미딘(hydroxystilbamidine) 및 이의 유도체, 엘디에스 751(LDS 751) 및 이의 유도체, 프로피디움 아이오다이드(Propidium Iodide, PI)와 이의 유도체 및 사이다이스(Cy-dyes) 유도체로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
또한 본 발명은 서열번호 12 내지 서열번호 31로 이루어진 군에서 선택되는 유전성 난청 검출용 프라이머 쌍에 있어서,
정방향 프라이머로 서열번호 12, 역방향 프라이머로 서열번호 13의 염기서열;
정방향 프라이머로 서열번호 14, 역방향 프라이머로 서열번호 15의 염기서열;
정방향 프라이머로 서열번호 16, 역방향 프라이머로 서열번호 17의 염기서열;
정방향 프라이머로 서열번호 18, 역방향 프라이머로 서열번호 19의 염기서열;
정방향 프라이머로 서열번호 20, 역방향 프라이머로 서열번호 21의 염기서열;
정방향 프라이머로 서열번호 22, 역방향 프라이머로 서열번호 23의 염기서열;
정방향 프라이머로 서열번호 24, 역방향 프라이머로 서열번호 25의 염기서열;
정방향 프라이머로 서열번호 26, 역방향 프라이머로 서열번호 27의 염기서열;
정방향 프라이머로 서열번호 28, 역방향 프라이머로 서열번호 29의 염기서열; 또는
정방향 프라이머로 서열번호 30, 역방향 프라이머로 서열번호 31의 염기서열;인 프라이머 쌍(primer pair)에 관한 것이다.
또한 본 발명은 상기 PNA 프로브 및 상기 프라이머 쌍을 포함하는 유전성 난청 검출용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 조성물은 제한되지는 않으나 하나 이상의 상기 프라이머 쌍, 상기 PNA 프로브 및 FMCA 버퍼를 포함할 수 있다. 예를 들어, 서열번호 1의 PNA 프로브와 서열번호 12/13의 프라이머 쌍은 난청 관련 유전자인 GJB2의 V37I 변이체, 서열번호 2내지 3의 PNA 프로브와 서열번호 14/15의 프라이머 쌍은 GJB2 또는 그 변이체(235delC, 299delAT), 서열번호 4의 PNA 프로브와 16/17의 프라이머 쌍은 CDH23 또는 그 변이체(P240L), 서열번호 5의 PNA 프로브와 서열번호 18/19의 프라이머 쌍은 SLC26A4 또는 그 변이체(T410M), 서열번호 6의 PNA 프로브와 서열번호 20/21의 프라이머 쌍은 SLC26A4 또는 그 변이체(L676Q), 서열번호 7의 PNA 프로브와 서열번호 22/23의 프라이머 쌍은 SLC26A4 또는 그 변이체(H723R), 서열번호 8의 PNA 프로브와 서열번호 24/25의 프라이머 쌍은 SLC26A4 또는 그 변이체(IVS7-2A>G), 서열번호 9의 PNA 프로브와 서열번호 26/27의 프라이머 쌍은 12S rRNA 또는 그 변이체(1555A>G), 서열번호 10의 PNA 프로브와 서열번호 30/31의 프라이머 쌍은 TMPRSS3 또는 그 변이체(A306T) 및 서열번호 11의 PNA 프로브와 서열번호 28/29의 프라이머 쌍은 GJB2 또는 그 변이체(R143W)의 검출용 PCR 조성물이 될 수 있다.
또한 본 발명은 a) 검체 시료로부터 gDNA를 추출하는 단계; b) GJB2, SLC26A4, 12S rRNA 및 TMPRSS3로 이루어진 군에서 선택되는 유전자 또는 그 변이체를 증폭시킬 수 있는 정방향 및 역방향 프라이머 쌍을 이용하여 상기 유전자 또는 그 변이체를 증폭시키고, 상기 유전자 또는 그 변이체와 혼성화할 수 있는 PNA 프로브와 혼성화시키는 단계; 및 c) 상기 b)단계에서 혼성화된 반응물의 융해곡선을 분석하여 상기 유전자 또는 그 변이체를 검출하는 단계;를 포함하는 유전성 난청 검출방법에 관한 것이다.
본 발명의 유전성 난청 검출에서 사용될 수 있는 시료는 DNA 또는 RNA이며, 상기 분자는 이중가닥 또는 단일가닥 형체일 수 있다. 초기물질로서 핵산이 이중가닥인 경우, 두 가닥을 단일 가닥으로, 또는 부분적인 단일-가닥 형태로 만드는 것이 바람직하다. 가닥들을 분리하는 것으로 알려진 방법들은, 열, 알카리, 포름아미드, 우레아 및 글리콕살 처리, 효소적 방법(예, 헬리카아제 작용) 및 결합 단백질을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 가닥 분리는 80 내지 105℃의 온도로 열처리하여 달성될 수 있다.
본 발명의 검출방법은 타겟 DNA 또는 RNA가 존재하는 경우 타겟에 우선적으로 결합하여 예상된 융해온도(Tm) 값을 보이며, 타겟이 없는 경우 즉, 돌연변이의 경우, 융해온도(Tm) 값의 차이가 발생하는 것을 특징으로 하며, 이를 이용하여 유전성 난청을 검출할 수 있다.
본 발명에서 상기 유전자의 변이체는 제한되지는 않으나 상기 GJB2 유전자의 V37I, 235delC, 299-300delAT, R143W, SLC26A4 유전자의 T410M, L676Q, H723R, IVS7-2A>G, 12S rRNA 유전자의 1555A>G 및 TMPRSS3유전자의 A306T로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
유전적인 원인에 의한 난청의 경우 다른 증상과의 동반여부에 따라 증후군성 난청과 비증후군성 난청으로 구분할 수 있으며, 비증후군성 난청의 경우 상염색체 열성 유전의 양상이 약 80%를 차지하고 있으며, 약 15~20%는 상염색체 우성 유전이, 나머지 2% 미만이 X염색체와 미토콘드리아에 존재하는 유전자에 의한 것이다. 비증후군성 난청으로 나타나는 유전성 난청의 경우 복잡한 유전적 이형성을 보이고 있는데 지금까지 인간의 염색체에서 120군데 이상이 관련이 있는 것으로 보고가 되었고, 이 중 41개의 유전자가 원인 유전자로 밝혀졌다. 이 가운데 GJB2, GJB6 및 SCL26A4 유전자들이 많은 집단에 유전성 난청의 주요 원인 인자로 보고되고 있다. 또한, 미토콘드리아 12S rRNA 유전자의 돌연변이가 전체 환자 중 0.9%의 빈도를 나타내었다.
본 발명에서 상기 PNA 프로브는 제한되지는 않으나 서열번호 1 내지 서열번호 11로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 서열일 수 있다.
본 발명에서 상기 프라이머 쌍은 제한되지는 않으나
정방향 프라이머로 서열번호 12, 역방향 프라이머로 서열번호 13의 염기서열;
정방향 프라이머로 서열번호 14, 역방향 프라이머로 서열번호 15의 염기서열;
정방향 프라이머로 서열번호 16, 역방향 프라이머로 서열번호 17의 염기서열;
정방향 프라이머로 서열번호 18, 역방향 프라이머로 서열번호 19의 염기서열;
정방향 프라이머로 서열번호 20, 역방향 프라이머로 서열번호 21의 염기서열;
정방향 프라이머로 서열번호 22, 역방향 프라이머로 서열번호 23의 염기서열;
정방향 프라이머로 서열번호 24, 역방향 프라이머로 서열번호 25의 염기서열;
정방향 프라이머로 서열번호 26, 역방향 프라이머로 서열번호 27의 염기서열;
정방향 프라이머로 서열번호 28, 역방향 프라이머로 서열번호 29의 염기서열; 또는
정방향 프라이머로 서열번호 30, 역방향 프라이머로 서열번호 31의 염기서열; 일 수 있다.
본 발명에서 상기 검체 시료는 제한되지는 않으나 인간의 객담, 혈액, 타액 또는 소변으로부터 유래된 DNA 시료일 수 있다.
본 발명에서 '검체 시료'는 다양한 시료를 포함하며, 바람직하게는, 본 발명의 방법을 이용하여 생물시료(bio-sample)를 분석한다. 식물, 동물, 인간, 균류, 박테리아 및 바이러스 기원의 생물시료가 분석될 수 있다. 포유류 또는 인간 기원의 시료를 분석하는 경우, 상기 시료는 특정 조직 또는 기관으로부터 유래될 수 있다. 조직의 대표적인 예로는, 결합, 피부, 근육 또는 신경 조직이 포함된다. 기관의 대표적인 예로는, 눈, 뇌, 폐, 간, 비장, 골수, 흉선, 심장, 림프, 혈액, 뼈, 연골, 췌장, 신장, 담낭, 위, 소장, 고환, 난소, 자궁, 직장, 신경계, 선 및 내부 혈관이 포함된다. 분석되는 생물시료는 생물학적 근원으로부터 나온 어떠한 세포, 조직, 유체액(fluid), 또는 본 발명에 의하여 잘 분석될 수 있는 어떠한 다른 매질(medium)도 포함하며, 이는 인간, 동물, 인간 또는 동물의 소비를 위하여 제조된 음식으로부터 얻은 시료가 포함된다. 또한, 분석되는 생물시료는 체액 시료를 포함하며, 이는 혈액, 혈청, 혈장, 림프, 모유, 소변, 분변, 안구 유액, 타액, 정액, 뇌 추출물(예컨대, 뇌 분쇄물), 척수액, 충수, 비장 및 편도선 조직 추출물이 포함되나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 융해곡선 제한되지는 않으나 분석은 FMCA(Fluorescence Melting Curve Analysis; 형광융해곡선분석) 방법으로 수행할 수 있다.
본 발명의 융해곡선 분석은 타겟 DNA 또는 RNA와 프로브로 형성되는 이중쇄 핵산의 융해온도를 해석하는 방법이다. 이러한 방법은 예컨대, Tm 해석, 또는 상기 이중쇄의 융해 곡선의 해석에 의해 행해지기 때문에, 융해곡선 분석이라고 불리고 있다. 검출 목적의 변이를 포함하는 검출 대상 서열에 상보적인 프로브를 이용하여, 검출 시료의 표적 단일쇄 DNA와 상기 프로브와의 하이브리드(이중쇄 DNA)를 형성시킨다. 계속해서, 이 하이브리드 형성체에 가열 처리를 실시하고, 온도 상승에 따른 하이브리드의 해리(융해)를 흡광도 등의 시그널의 변동에 의해 검출한다. 그리고, 이 검출 결과에 기초하여 Tm값을 결정함으로써, 점돌연변이의 유무를 판단하는 방법이다. Tm값은 하이브리드 형성체의 상동성이 높을수록 높고, 상동성이 낮을수록 낮아진다. 이 때문에, 점돌연변이를 포함하는 검출 대상 서열과 그것에 상보적인 프로브와의 하이브리드 형성체에 대해서 미리 Tm값(평가 기준값)을 구해 두고, 검출 시료의 표적 단일쇄 DNA와 상기 프로브와의 Tm값(측정값)을 측정하여, 측정값이 평가 기준값과 동일한 정도이면, 매치, 즉 표적 DNA에 돌연변이가 존재한다고 판단할 수 있고, 측정값이 평가 기준 값보다 낮으면, 미스매치, 즉 타겟 DNA에 변이가 존재하지 않는다고 판단할 수 있다.
본 발명의 형광융해곡선 분석은 형광물질을 사용하여 융해곡선을 분석하는 방법으로, 보다 구체적으로, 형광물질을 포함하는 프로브를 이용하여 융해곡선을 분석할 수 있다. 형광물질은 리포터 및 소광자일 수 있으며, 인터컬레이팅 형광물질일 수 있다.
본 발명에서 상기 증폭은 제한되지는 않으나 실시간 중합효소연쇄반응(real-time PCR) 방법으로 수행할 수 있다.
본 발명의 실시간 PCR 방법은, 형광물질이 PCR 과정에서 이중가닥 (double strand) DNA 사슬에 결합(interchelating)되도록 하고 PCR 산물의 증폭과 함께, 온도를 높여 주어 DNA 이중 가닥을 풀어줌으로써 DNA 이중 가닥 사이에 존재하는 형광물질의 양이 줄어들게 되는 융해곡선의 패턴, 특히 DNA가 융해(변성)되는 온도(Tm)를 분석하여 정상 대조군과 돌연변이 사이에서 염기서열의 변이 유무를 분석할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 어떤 의미로든 본 발명의 범위가 이들 예로만 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 게놈 DNA (genomic DNA)
DNA는 HeLa Genomic DNA(New England BioLabs, 영국)에서 구입하였으며, 인위적 DNA 변이는 Bioneer사(한국)에서 합성하여 사용하였다. 합성된 난청 관련 유전자 변이는 표 1과 같다.
[표 1]
실시예 2: PNA 프로브 고안
본 발명에서 GJB2, SLC26A4, 12S rRNA, CDH23 및 TMPRSS3 유전자 내 특정 위치의 돌연변이 유무 검출용 표적 프로브는 표 2의 서열번호 1 내지 11과 같다.
본 발명에서 사용한 모든 PNA 프로브(FAM, HEX, Texas Red-labeled, Cy5, Dabcyl)는 파나진(Panagene, 한국)에서 HPLC 정제 방법을 통해 합성하였으며, 합성된 모든 프로브의 순도는 질량분석법을 이용하여 확인하였으며, 표적핵산과의 더 효과적인 결합을 위해 프로브의 불필요한 이차구조는 피하였다.
[표 2]
실시예 3: 프라이머 고안
5개의 유전자의 11개 돌연변이를 검출하기 위해 5개의 프라이머 세트를 구성하였으며, 해당 염기서열과 융해온도(Tm) 그리고 PCR 산물 크기를 표 3에 나타내었다.
[표 3]
실시예 4: 난청 유전자 염기변이에 따른 융해곡선 분석
상기에서 합성한 이중가닥 DNA 및 PNA 프로브를 이용한 융해곡선 분석을 위한 PCR은 CFX96™ Real-Time 시스템 (BIO-RAD, USA)을 이용하여 수행하였다. PCR의 조건은 도 1과 같다. 총 볼륨이 20㎕ 이 되도록 1X qPCR PreMix(시선바이오머티리얼스, 한국), 0.05 μM forward primer 및 0.5 μM reverse primer에 0.5μM PNA 프로브, 2㎕ human gDNA(15ng/㎕) 또는 인공 합성된 target DNA(Bioneer, 한국)를 첨가한 다음 실시간 PCR을 실시하였다. 4개의 PNA 프로브는 하나의 튜브 또는 웰(well)에 각 PCR 프라이머와 함께 첨가되었으며 멀티플렉스(multiplex)로 진행하였다. 멀티플렉스 조합은 표 4와 같이 프라이머 세트와 프로브를 첨가하여 수행하였다.
[표 4]
실시간 PCR(real-time PCR)은 95℃에서 10분간 변성시킨 다음, 95℃에서 30초, 58℃에서 45초 및 74℃에서 45초 동안 차례로 반응시켰다. 상기 과정을 40 회 반복하였고, 실시간으로 형광(fluorescence)을 측정하였다.
이후, 95℃에서 5분간 변성 단계를 거친 다음 75℃에서 1분, 55℃에서 1분 및 45℃에서 30초간 혼성화 반응시키고, 20℃에서 85℃까지 1℃씩 상승시키며 형광을 측정하는 융해곡선 분석을 수행하였다. 각 단계 사이마다 5초간 정지 상태를 유지하였다 (도 1).
Human gDNA를 주형으로 하여 PCR 수행 후, 융해곡선 분석을 수행한 결과, 완전한 혼성화를 보이는 야생형(wild type)과 불일치(mismatch)하는 돌연변이형(mutant type)의 융해온도 차이가 발생하는 것을 확인하였다(도 2).
도 2의 11개 융해곡선 중에 Set1은 좌측으로부터 GJB2:V37I, GJB2:299delAT, CDH23:P240L, GJB2:235delC이고, Set2는 좌측으로부터 SLC26A4:T410M, SLC26A4:L676Q, SLC26A4:H723R, SLC26A4:IVS7-2A>G이고, Set3는 좌측으로부터 12S rRNA:1555A>G, GJB2:R143W, TMPRSS3:A306T의 순이다. 또한 붉은색 선은 돌연변이형, 푸른색은 야생형을 의미한다.
PNA 형광융해곡선분석(FMCA)을 통해 얻어진 융해온도는 표 5에 표시하였다. 표 5의 각 다중분석(멀티플렉스, multiplex)용 세트 A, B 및 C에서 사용되는 형광물질과 프로브의 조합과 그에 따른 돌연변이형 및 야행형의 융해온도는 아래와 같다.
[표 5]
상기 11 가지 돌연변이를 각각의 염기서열 분석을 통해 확인하기 위해서는 최소 9 가지 이상의 중합효소연쇄반응(PCR) 산물을 제조하여 염기서열을 분석해야 한다. 그러나, 본 발명에서 구성한 상기 표 5의 다중분석 구성을 통해 3 개의 반응 튜브 또는 96 웰-플레이트(well-plate) 3 개의 웰 만으로도 돌연변이에 대한 정확도 높은 분석이 가능하여 증폭시약의 소모량을 줄일 수 있으며, 96 웰-플레이트 기준으로 한 번에 분석하는 검체의 수도 8개 검체에서 32개 검체로 4배 증가되는 활용성이 높다. 또한, 본 발명은 염기서열 분석에 비해 DNA 검체 사용량(요구량)이 1/3 수준으로 감소하게 되는데 DNA 검체는 혈액으로부터 분리하게 되므로 채혈량의 감소 효과가 있다. 따라서, 상기로부터 본 발명의 방법은 기존의 방법에 비하여 현저히 향상된 효과가 있음을 알 수 있었다.
상기 결과로부터, 유전성 난청 변이의 융해온도 및 융해곡선 분석을 이용하여 유전성 난청을 효율적으로 검출할 수 있었다. 결과적으로 본 발명의 PNA 프로브 및 프라이머 쌍을 이용하여 유전성 난청을 편리하고 신속하게 높은 정확성으로 확인할 수 있음을 발견하여 본 발명을 완성하였다.
이상으로, 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
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<213> Artificial Sequence
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ccacaacgag gatc 14
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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tgcagggtcc ata 13
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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catgtctccg gta 13
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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tccgcacggc ct 12
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<213> Artificial Sequence
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<220>
<223> TMPRe8-F
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<220>
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<400> 31
acccagatgt accattgaac gtg 23
Claims (13)
- 서열번호 1 내지 서열번호 11로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 서열을 포함하는 유전성 난청 검출용 PNA 프로브.
- 제 1항에 있어서,
상기 PNA 프로브는 GJB2, SLC26A4, 12S rRNA, CDH23 및 TMPRSS3로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 유전자와 혼성화(hybridization)하는 것을 특징으로 하는 유전성 난청 검출용 PNA 프로브. - 제 1항에 있어서,
상기 PNA 프로브는 GJB2 유전자의 V37I, 235delC, 299-300delAT, R143W, SLC26A4 유전자의 T410M, L676Q, H723R, IVS7-2A>G, 12S rRNA 유전자의 1555A>G, CDH23유전자의 P240L 및 TMPRSS3유전자의 A306T로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 유전자 변이체와 혼성화하는 것을 특징으로 하는 유전성 난청 검출용 PNA 프로브. - 제 1항에 있어서,
상기 PNA 프로브는 리포터 또는 소광자가 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 유전성 난청 검출용 PNA 프로브. - 서열번호 12 내지 서열번호 31로 이루어진 군에서 선택되는 유전성 난청 검출용 프라이머 쌍에 있어서,
정방향 프라이머로 서열번호 12, 역방향 프라이머로 서열번호 13의 염기서열;
정방향 프라이머로 서열번호 14, 역방향 프라이머로 서열번호 15의 염기서열;
정방향 프라이머로 서열번호 16, 역방향 프라이머로 서열번호 17의 염기서열;
정방향 프라이머로 서열번호 18, 역방향 프라이머로 서열번호 19의 염기서열;
정방향 프라이머로 서열번호 20, 역방향 프라이머로 서열번호 21의 염기서열;
정방향 프라이머로 서열번호 22, 역방향 프라이머로 서열번호 23의 염기서열;
정방향 프라이머로 서열번호 24, 역방향 프라이머로 서열번호 25의 염기서열;
정방향 프라이머로 서열번호 26, 역방향 프라이머로 서열번호 27의 염기서열;
정방향 프라이머로 서열번호 28, 역방향 프라이머로 서열번호 29의 염기서열; 또는
정방향 프라이머로 서열번호 30, 역방향 프라이머로 서열번호 31의 염기서열;인 프라이머 쌍(primer pair). - 제 1항 내지 제 4항으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 한 항의 PNA 프로브 및 제 5항의 프라이머 쌍을 포함하는 유전성 난청 검출용 조성물.
- a) 검체 시료로부터 gDNA를 추출하는 단계;
b) GJB2, SLC26A4, 12S rRNA 및 TMPRSS3로 이루어진 군에서 선택되는 유전자 또는 그 변이체를 증폭시킬 수 있는 정방향 및 역방향 프라이머 쌍을 이용하여 상기 유전자 또는 그 변이체를 증폭시키고, 상기 유전자 또는 그 변이체와 혼성화할 수 있는 PNA 프로브와 혼성화시키는 단계; 및
c) 상기 b)단계에서 혼성화된 반응물의 융해곡선을 분석하여 상기 유전자 또는 그 변이체를 검출하는 단계;
를 포함하는 유전성 난청 검출방법. - 제 7항에 있어서,
상기 유전자의 변이체는 GJB2 유전자의 V37I, 235delC, 299-300delAT, R143W, SLC26A4 유전자의 T410M, L676Q, H723R, IVS7-2A>G, 12S rRNA 유전자의 1555A>G 및 TMPRSS3유전자의 A306T로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 검출방법. - 제 7항에 있어서,
상기 PNA 프로브는 서열번호 1 내지 서열번호 11로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 서열인 것을 특징으로 하는 검출방법. - 제 7항에 있어서,
상기 프라이머 쌍은
정방향 프라이머로 서열번호 12, 역방향 프라이머로 서열번호 13의 염기서열;
정방향 프라이머로 서열번호 14, 역방향 프라이머로 서열번호 15의 염기서열;
정방향 프라이머로 서열번호 16, 역방향 프라이머로 서열번호 17의 염기서열;
정방향 프라이머로 서열번호 18, 역방향 프라이머로 서열번호 19의 염기서열;
정방향 프라이머로 서열번호 20, 역방향 프라이머로 서열번호 21의 염기서열;
정방향 프라이머로 서열번호 22, 역방향 프라이머로 서열번호 23의 염기서열;
정방향 프라이머로 서열번호 24, 역방향 프라이머로 서열번호 25의 염기서열;
정방향 프라이머로 서열번호 26, 역방향 프라이머로 서열번호 27의 염기서열;
정방향 프라이머로 서열번호 28, 역방향 프라이머로 서열번호 29의 염기서열; 또는
정방향 프라이머로 서열번호 30, 역방향 프라이머로 서열번호 31의 염기서열;
인 것을 특징으로 하는 검출방법. - 제 7항에 있어서,
상기 검체 시료는 인간의 객담, 혈액, 타액 또는 소변으로부터 유래된 DNA 시료인 것을 특징으로 하는 검출방법. - 제 7항에 있어서,
상기 융해곡선 분석은 FMCA(Fluorescence Melting Curve Analysis; 형광융해곡선분석) 방법으로 수행하는 것을 특징으로 하는 검출방법. - 제 7항에 있어서,
상기 증폭은 실시간 중합효소연쇄반응(real-time PCR) 방법으로 수행하는 것을 특징으로 하는 검출방법.
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