CN102453761B - 一种磁珠与发光体共标记以检测遗传性耳聋的试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提出了一种磁珠与发光体共标记以检测遗传性耳聋的试剂盒。本发明的试剂盒包括针对GJB2(Cx26)基因、SLC26A4(PDS)基因和12S rRNA(MTRNR1)基因上的八个遗传性耳聋的基因位点的引物组合物和探针组合物，可用于准确判断相关位点为野生型、纯合突变型或者杂合突变型，以实现遗传性耳聋分子诊断。该引物组合物包含一些经发光体标记的引物。应用本发明的试剂盒可以通过荧光显微镜、微阵列激光扫描仪、价廉的设备或者肉眼观察进行检测。本发明提供的引物组、试剂组以及试剂盒可以用于遗传性耳聋的临床辅助诊断及筛查，实现遗传性耳聋的早期发现、提早预防以及产前指导，具有重大的商业价值和社会意义。

Description

一种磁珠与发光体共标记以检测遗传性耳聋的试剂盒

技术领域

本发明涉及生物检测相关领域，涉及一种检测遗传性耳聋的试剂盒，特别涉及一种磁珠与发光体共标记以检测遗传性耳聋的试剂盒。

背景技术

遗传性耳聋是通过遗传由父母传给其子女。不论父母方中的单方或者双方是耳聋患者还是健康携带者，耳聋基因都会通过父母向子女遗传。这种疾病通过常染色体显性、常染色体隐性、X-连锁隐性，或者线粒体遗传等方式遗传给下一代。大约0.1％的孩子生来具有深度耳聋，超过50％的语前耳聋患儿属于遗传因素致聋，通过对基因突变的识别不仅可用于遗传咨询、产前诊断和新生儿听力筛查，还可以帮助和提醒医生慎重使用特定种类的抗生素以避免造成携带基因突变的患者听力损伤甚至致聋。

近几年微阵列芯片技术的发展使得高通量地并行分析成千上万的分子相互作用成为可能。DNA微阵列芯片方法已被广泛使用，包括基因表达分析、突变分型、单核苷酸多态性(SNP)、短串联重复序列(STR)，对药物开发、疾病诊断和司法鉴定起到重要作用(Heller，Ann Rev Biomed Eng(2002)4：129-153；Stoughton，Ann Rev Biochem(2005)74：53-82；Hoheisel，Nat Rev Genet(2006)7：200-210)。固定于微阵列芯片的特定核苷酸探针，充当解码工具，通过空间上不同的位置把溶液中并行反应产生的多个靶标分子加以区别(Zhu et al.，Antimicrob Agents Chemother(2007)51：3707-3713)。这些探针甚至可以是通用探针，比如通用芯片上经过设计与人工合成的人造标签(Tag)序列或者相互补的序列(Gerrey et al.，J Mol Biol(1999)292：251-262；Li et al.，Hum Mutat(2008)29：306-314)。微阵列芯片方法与多重PCR结合在一起，可用于检测SNP与基因突变，包括碱基删除、插入、以及长片段缺失，适用于常规的遗传和诊断实验室开展。与此同时，蛋白芯片和化学芯片也已经发展成为蛋白质组学领域两个重要的工具(Xu and Lam，J Biomed Biotechnol(2003)5：257-266)。特定的蛋白质、抗体、小分子化合物、多肽及碳水化合物都可以固定在固体表面形成微阵列芯片，类似于DNA微阵列芯片。这些分子的微阵列芯片可以用于分析单一的分子组成或者复杂的分子组成。

待检样本和固定在微阵列芯片表面的探针之间的相互作用可以通过多种方法加以检测。通常情况下，微阵列芯片的检测方法有基于荧光、化学发光或酶连标记的光学检测方法，基于酶标记、二茂铁标记或其他电活性标记的电化学检测方法，以及基于表面等离子共振技术或微天平分析技术的无标记的检测方法(Sassolas et al.，ChemRev(2008)108：109-139)。当然，磁珠标记方法也被采用，其结果可以用基于电荷耦合器件(CCD)的相机、摄像机或低倍显微镜进行成像分析(Guo et al.，J Anal Sci(2007)23：1-4；Li et al.，supra；Shlyapnikov et al.，Anal Biochem(2010)399：125-131)，而且交叉反应和非特异性吸附能通过磁场或流体来快速地加以消除(Mulvaney et al.，Anal Biochem(2009)392：139-144)。理论上，上述发光方法与磁珠方法是可以进一步结合的，即将两者的优点进行组合，应该能提高芯片检测平台的灵敏度和特异性，这对基因突变检测尤其临床相关的检测非常有意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种磁珠与发光体共标记以检测遗传性耳聋的试剂盒。

本发明提供了辅助检测遗传性耳聋的引物组I，为如下(a)或(b)：

(a)由如下三种核苷酸序列的DNA组成的引物组：序列表的序列21自5’末端第23至42位核苷酸所示的DNA、序列表的序列22自5’末端第23至41位核苷酸所示的DNA和序列表的序列23所示的DNA；

(b)由如下三种核苷酸序列的DNA组成的引物组：序列表的序列21所示的DNA、序列表的序列22所示的DNA和序列表的序列23所示的DNA。

所述引物组I的(a)或(b)中，序列表的序列23所示DNA的5’末端可连接有生物素。所述引物组I的(a)或(b)中，所述序列表的序列23所示的DNA自5’末端第4位核苷酸可标记有荧光素Cy3。

本发明提供了辅助检测遗传性耳聋的试剂I，由所述引物组I和探针组I组成；所述探针组I为如下(a)或(b)或(c)：

(a)由如下两种核苷酸序列的DNA组成的探针组：序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA；

(b)由如下两种核苷酸序列的DNA组成的探针组：在序列表的序列1所示DNA的5’末端连接特异片段得到的DNA和在序列表的序列2所示DNA的5’末端连接所述特异片段得到的DNA；所述特异片段为5-30个脱氧核糖核苷酸T组成的DNA，优选为15个脱氧核糖核苷酸T组成的DNA；

(c)由如下两种核苷酸序列的DNA组成的探针组：在序列表的序列1所示DNA的5’末端连接特异片段得到的DNA和在序列表的序列2所示DNA的5’末端连接所述特异片段得到的DNA；所述特异片段为5-30个脱氧核糖核苷酸T组成的DNA，且5’末端第一位核苷酸修饰有氨基；所述特异片段优选为15个脱氧核糖核苷酸T组成的DNA，且5’末端第一位核苷酸修饰有氨基。

本发明提供的辅助检测遗传性耳聋的引物组II，为如下(a)或(b)：

(a)由如下三种核苷酸序列的DNA组成的引物组：序列表的序列24自5’末端第23至42位核苷酸所示的DNA、序列表的序列25自5’末端第23至40位核苷酸所示的DNA和序列表的序列26所示的DNA；

(b)由如下三种核苷酸序列的DNA组成的引物组：序列表的序列24所示的DNA、序列表的序列25所示的DNA和序列表的序列26所示的DNA。

所述引物组II的(a)或(b)中，序列表的序列26所示DNA的5’末端可连接有生物素。所述引物组II的(a)或(b)中，所述序列表的序列26所示的DNA自5’末端第6位核苷酸可标记有荧光素Cy3。

本发明提供的辅助检测遗传性耳聋的试剂II，由所述引物组II和探针组II组成；所述探针组II为如下(a)或(b)或(c)：

(a)由如下两种核苷酸序列的DNA组成的探针组：序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA；

(b)由如下两种核苷酸序列的DNA组成的探针组：在序列表的序列3所示DNA的5’末端连接特异片段得到的DNA和在序列表的序列4所示DNA的5’末端连接所述特异片段得到的DNA；所述特异片段为5-30个脱氧核糖核苷酸T组成的DNA，优选为15个脱氧核糖核苷酸T组成的DNA；

(c)由如下两种核苷酸序列的DNA组成的探针组：在序列表的序列3所示DNA的5’末端连接特异片段得到的DNA和在序列表的序列4所示DNA的5’末端连接所述特异片段得到的DNA；所述特异片段为5-30个脱氧核糖核苷酸T组成的DNA，且5’末端第一位核苷酸修饰有氨基；所述特异片段优选为15个脱氧核糖核苷酸T组成的DNA，且5’末端第一位核苷酸修饰有氨基。

本发明提供的辅助检测遗传性耳聋的引物组III，为如下(a)或(b)：

(a)由如下三种核苷酸序列的DNA组成的引物组：序列表的序列27自5’末端第25至42位核苷酸所示的DNA、序列表的序列28自5’末端第24至40位核苷酸所示的DNA和序列表的序列29所示的DNA；

(b)由如下三种核苷酸序列的DNA组成的引物组：序列表的序列27所示的DNA、序列表的序列28所示的DNA和序列表的序列29所示的DNA。

所述引物组III的(a)或(b)中，序列表的序列29所示DNA的5’末端可连接有生物素。所述引物组III的(a)或(b)中，所述序列表的序列29所示的DNA自5’末端第6位核苷酸可标记有荧光素Cy3。

本发明提供的辅助检测遗传性耳聋的试剂III，由所述引物组III和探针组III组成；所述探针组III为如下(a)或(b)或(c)：

(a)由如下两种核苷酸序列的DNA组成的探针组：序列表的序列5所示DNA和序列表的序列6所示DNA；

(b)由如下两种核苷酸序列的DNA组成的探针组：在序列表的序列5所示DNA的5’末端连接特异片段得到的DNA和在序列表的序列6所示DNA的5’末端连接所述特异片段得到的DNA；所述特异片段为5-30个脱氧核糖核苷酸T组成的DNA，优选为15个脱氧核糖核苷酸T组成的DNA；

(c)由如下两种核苷酸序列的DNA组成的探针组：在序列表的序列5所示DNA的5’末端连接特异片段得到的DNA和在序列表的序列6所示DNA的5’末端连接所述特异片段得到的DNA；所述特异片段为5-30个脱氧核糖核苷酸T组成的DNA，且5’末端第一位核苷酸修饰有氨基；所述特异片段优选为15个脱氧核糖核苷酸T组成的DNA，且5’末端第一位核苷酸修饰有氨基。

本发明提供的辅助检测遗传性耳聋的引物组IV，为如下(a)或(b)：

(a)由如下三种核苷酸序列的DNA组成的引物组：序列表的序列30自5’末端第25至43位核苷酸所示的DNA、序列表的序列31自5’末端第25至43位核苷酸所示的DNA和序列表的序列32所示的DNA；

(b)由如下三种核苷酸序列的DNA组成的引物组：序列表的序列30所示的DNA、序列表的序列31所示的DNA和序列表的序列32所示的DNA。

所述引物组IV的(a)或(b)中，序列表的序列32所示DNA的5’末端可连接有生物素。所述引物组IV的(a)或(b)中，所述序列表的序列32所示的DNA自5’末端第6位核苷酸可标记有荧光素Cy3。

本发明提供的辅助检测遗传性耳聋的试剂IV，由所述引物组IV和探针组IV组成；所述探针组IV为如下(a)或(b)或(c)：

(a)由如下两种核苷酸序列的DNA组成的探针组：序列表的序列7所示DNA和序列表的序列8所示DNA；

(b)由如下两种核苷酸序列的DNA组成的探针组：在序列表的序列7所示DNA的5’末端连接特异片段得到的DNA和在序列表的序列8所示DNA的5’末端连接所述特异片段得到的DNA；所述特异片段为5-30个脱氧核糖核苷酸T组成的DNA，优选为15个脱氧核糖核苷酸T组成的DNA；

(c)由如下两种核苷酸序列的DNA组成的探针组：在序列表的序列7所示DNA的5’末端连接特异片段得到的DNA和在序列表的序列8所示DNA的5’末端连接所述特异片段得到的DNA；所述特异片段为5-30个脱氧核糖核苷酸T组成的DNA，且5’末端第一位核苷酸修饰有氨基；所述特异片段优选为15个脱氧核糖核苷酸T组成的DNA，且5’末端第一位核苷酸修饰有氨基。

本发明提供的辅助检测遗传性耳聋的引物组V，为如下(a)或(b)：

(a)由如下三种核苷酸序列的DNA组成的引物组：序列表的序列33自5’末端第25至47位核苷酸所示的DNA、序列表的序列34自5’末端第24至43位核苷酸所示的DNA和序列表的序列35所示的DNA；

(b)由如下三种核苷酸序列的DNA组成的引物组：序列表的序列33所示的DNA、序列表的序列34所示的DNA和序列表的序列35所示的DNA。

所述引物组V的(a)或(b)中，序列表的序列35所示DNA的5’末端可连接有生物素。所述引物组V的(a)或(b)中，所述序列表的序列35所示的DNA自5’末端第6位核苷酸可标记有荧光素Cy3。

本发明提供的辅助检测遗传性耳聋的试剂V，由所述引物组V和探针组V组成；所述探针组V为如下(a)或(b)或(c)：

(a)由如下两种核苷酸序列的DNA组成的探针组：序列表的序列9所示DNA和序列表的序列10所示DNA；

(b)由如下两种核苷酸序列的DNA组成的探针组：在序列表的序列9所示DNA的5’末端连接特异片段得到的DNA和在序列表的序列10所示DNA的5’末端连接所述特异片段得到的DNA；所述特异片段为5-30个脱氧核糖核苷酸T组成的DNA，优选为15个脱氧核糖核苷酸T组成的DNA；

(c)由如下两种核苷酸序列的DNA组成的探针组：在序列表的序列9所示DNA的5’末端连接特异片段得到的DNA和在序列表的序列10所示DNA的5’末端连接所述特异片段得到的DNA；所述特异片段为5-30个脱氧核糖核苷酸T组成的DNA，且5’末端第一位核苷酸修饰有氨基；所述特异片段优选为15个脱氧核糖核苷酸T组成的DNA，且5’末端第一位核苷酸修饰有氨基。

本发明提供的辅助检测遗传性耳聋的引物组VI，为如下(a)或(b)：

(a)由如下三种核苷酸序列的DNA组成的引物组：序列表的序列36自5’末端第23至45位核苷酸所示的DNA、序列表的序列37自5’末端第23至43位核苷酸所示的DNA和序列表的序列38所示的DNA；

(b)由如下三种核苷酸序列的DNA组成的引物组：序列表的序列36所示的DNA、序列表的序列37所示的DNA和序列表的序列38所示的DNA。

所述引物组VI的(a)或(b)中，序列表的序列38所示DNA的5’末端可连接有生物素。所述引物组VI的(a)或(b)中，所述序列表的序列38所示的DNA自5’末端第5位核苷酸可标记有荧光素Cy3。

本发明提供的辅助检测遗传性耳聋的试剂VI，由所述引物组VI和探针组VI组成；所述探针组VI为如下(a)或(b)或(c)：

(a)由如下两种核苷酸序列的DNA组成的探针组：序列表的序列11所示DNA和序列表的序列12所示DNA；

(b)由如下两种核苷酸序列的DNA组成的探针组：在序列表的序列11所示DNA的5’末端连接特异片段得到的DNA和在序列表的序列12所示DNA的5’末端连接所述特异片段得到的DNA；所述特异片段为5-30个脱氧核糖核苷酸T组成的DNA，优选为15个脱氧核糖核苷酸T组成的DNA；

(c)由如下两种核苷酸序列的DNA组成的探针组：在序列表的序列11所示DNA的5’末端连接特异片段得到的DNA和在序列表的序列12所示DNA的5’末端连接所述特异片段得到的DNA；所述特异片段为5-30个脱氧核糖核苷酸T组成的DNA，且5’末端第一位核苷酸修饰有氨基；所述特异片段优选为15个脱氧核糖核苷酸T组成的DNA，且5’末端第一位核苷酸修饰有氨基。

本发明提供的辅助检测遗传性耳聋的引物组VII，为如下(a)或(b)：

(a)由如下三种核苷酸序列的DNA组成的引物组：序列表的序列39自5’末端第24至46位核苷酸所示的DNA、序列表的序列40自5’末端第24至45位核苷酸所示的DNA和序列表的序列41所示的DNA；

(b)由如下三种核苷酸序列的DNA组成的引物组：序列表的序列39所示的DNA、序列表的序列40所示的DNA和序列表的序列41所示的DNA。

所述引物组VII的(a)或(b)中，序列表的序列41所示DNA的5’末端可连接有生物素。所述引物组VII的(a)或(b)中，所述序列表的序列41所示的DNA自5’末端第4位核苷酸可标记有荧光素Cy3。

本发明提供的辅助检测遗传性耳聋的试剂VII，由所述引物组VII和探针组VII组成；所述探针组VII为如下(a)或(b)或(c)：

(a)由如下两种核苷酸序列的DNA组成的探针组：序列表的序列13所示DNA和序列表的序列14所示DNA；

(b)由如下两种核苷酸序列的DNA组成的探针组：在序列表的序列13所示DNA的5’末端连接特异片段得到的DNA和在序列表的序列14所示DNA的5’末端连接所述特异片段得到的DNA；所述特异片段为5-30个脱氧核糖核苷酸T组成的DNA，优选为15个脱氧核糖核苷酸T组成的DNA；

(c)由如下两种核苷酸序列的DNA组成的探针组：在序列表的序列13所示DNA的5’末端连接特异片段得到的DNA和在序列表的序列14所示DNA的5’末端连接所述特异片段得到的DNA；所述特异片段为5-30个脱氧核糖核苷酸T组成的DNA，且5’末端第一位核苷酸修饰有氨基；所述特异片段优选为15个脱氧核糖核苷酸T组成的DNA，且5’末端第一位核苷酸修饰有氨基。

本发明提供的辅助检测遗传性耳聋的引物组VIII，为如下(a)或(b)：

(a)由如下三种核苷酸序列的DNA组成的引物组：序列表的序列42自5’末端第23至43位核苷酸所示的DNA、序列表的序列43自5’末端第23至44位核苷酸所示的DNA和序列表的序列44所示的DNA；

(b)由如下三种核苷酸序列的DNA组成的引物组：序列表的序列42所示的DNA、序列表的序列43所示的DNA和序列表的序列44所示的DNA。

所述引物组VIII的(a)或(b)中，序列表的序列44所示DNA的5’末端可连接有生物素。所述引物组VIII的(a)或(b)中，所述序列表的序列44所示的DNA自5’末端第4位核苷酸可标记有荧光素Cy3。

本发明提供的辅助检测遗传性耳聋的试剂VIII，由所述引物组VIII和探针组VIII组成；所述探针组VIII为如下(a)或(b)或(c)：

(a)由如下两种核苷酸序列的DNA组成的探针组：序列表的序列15所示DNA和序列表的序列16所示DNA；

(b)由如下两种核苷酸序列的DNA组成的探针组：在序列表的序列15所示DNA的5’末端连接特异片段得到的DNA和在序列表的序列16所示DNA的5’末端连接所述特异片段得到的DNA；所述特异片段为5-30个脱氧核糖核苷酸T组成的DNA，优选为15个脱氧核糖核苷酸T组成的DNA；

(c)由如下两种核苷酸序列的DNA组成的探针组：在序列表的序列15所示DNA的5’末端连接特异片段得到的DNA和在序列表的序列16所示DNA的5’末端连接所述特异片段得到的DNA；所述特异片段为5-30个脱氧核糖核苷酸T组成的DNA，且5’末端第一位核苷酸修饰有氨基；所述特异片段优选为15个脱氧核糖核苷酸T组成的DNA，且5’末端第一位核苷酸修饰有氨基。

以上任一所述引物组或其组合或任一所述试剂或其组合均可用于制备辅助检测遗传性耳聋的试剂盒。

本发明提供的辅助检测遗传性耳聋的试剂盒，为如下任意一种：

(一)所述试剂盒包括引物组合物；所述引物组合物由所述的引物组I、所述的引物组II、所述的引物组III、所述的引物组IV、所述的引物组V、所述的引物组VI、所述的引物组VII和所述的引物组VIII组成；

(二)所述试剂盒包括试剂组合物；所述试剂组合物由所述的试剂I、所述的试剂II、所述的试剂III、所述的试剂IV、述的试剂V、所述的试剂VI、所述的试剂VII和所述的试剂VIII组成；

(三)所述试剂盒包括引物组合物；所述引物组合物由如下组分中的一种或几种组成：所述的引物组I、所述的引物组II、所述的引物组III、所述的引物组IV、所述的引物组V、所述的引物组VI、所述的引物组VII和所述的引物组VIII；

(四)所述试剂盒包括试剂组合物；所述试剂组合物由如下组分中的一种或几种组成：所述的试剂I、所述的试剂II、所述的试剂III、所述的试剂IV、所述的试剂V、所述的试剂VI、所述的试剂VII和所述的试剂VIII。

所述试剂盒具体包括基片、所述试剂组合物和颗粒；所述试剂组合物中的探针组固定于所述基片上，形成微阵列芯片；所述基片的材质为硅、玻璃、塑料、水凝胶、硝酸纤维或尼龙；所述颗粒为微球或磁性微球。

所述微阵列芯片上还可排列有阳性对照MC、阳性对照PC、阴性对照NC和阳性对照QC；所述阳性对照MC为序列表的序列17所示的DNA或在序列表的序列17所示DNA的5’末端连接特异片段得到的DNA；所述阳性对照PC为序列表的序列18所示的DNA或在序列表的序列18所示DNA的5’末端连接所述特异片段得到的DNA；所述阴性对照NC为序列表的序列19所示的DNA或在序列表的序列19所示DNA的5’末端连接所述特异片段得到的DNA；所述阳性对照QC为序列表的序列20所示的DNA或在序列表的序列20所示DNA的5’末端连接所述特异片段得到的DNA；所述特异片段为5-30个脱氧核糖核苷酸T组成的DNA，且5’末端第一位核苷酸修饰有氨基；所述特异片段优选为15个脱氧核糖核苷酸T组成的DNA，且5’末端第一位核苷酸修饰有氨基。

所述试剂盒还可包括序列表的序列46所示的DNA和如下DNA(A)或(B)：

(A)序列表的序列45自5’末端第23至41位核苷酸所示的DNA；

(B)序列表的序列45所示的DNA。

所述颗粒具体可为链霉亲和素包被的颗粒；序列表的序列46所示DNA的5’末端可连接有生物素，自5’末端第8位核苷酸可标记有荧光素Cy3；序列表的序列17所示DNA的3’末端可连接有生物素；序列表的序列20所示DNA的3’末端可连接荧光素HEX。

本发明提供的方法包括如下步骤：

a)将发光体标记的靶标分子耦联到颗粒上；

b)将此靶标分子与固定在微阵列芯片上的探针分子相结合；

c)检测靶标分子与探针分子之间的相互作用，这里所指的靶标分子包括多核苷酸，特定的蛋白多肽，抗体，小分子化合物，多肽和碳水化合物。

任何合适的发光体都可以在本发明中使用，比如荧光团、磷光团、或者发色团。荧光团可以是量子点、蛋白质(如绿色荧光蛋白)，或小分子荧光染料。而小分子荧光染料可以选择氧杂蒽衍生物(荧光素，罗丹明，俄勒冈绿，曙红组成的小组，得克萨斯红等)，青色素衍生物(青色素，吲哚碳花青，羰花青，部花青等)，萘衍生物(丹磺酰和普罗丹等)，香豆素衍生物，二唑衍生物，芘衍生物(级联蓝色等)，恶嗪衍生物(尼罗河红色，蓝色尼罗河，甲酚紫，恶嗪170等)，吖啶衍生物(二氨基吖啶，吖啶橙，吖啶黄等)，次甲基衍生物(金胺，结晶紫，孔雀石绿等)，CF染料，Alexa染料，四吡咯衍生物(卟吩，胆红素等)，级联黄色，天蓝色乙，吖啶橙，DAPI，Hoechst33258，吡罗昔康，奎宁。磷光团可以选择过渡金属化合物或各类稀土化合物。发色团可以选择视网膜染料，食品着色剂，织物染料(偶氮化合物)，番茄红素，β-胡萝卜素，花青素，叶绿素，血红蛋白，血蓝蛋白，矿物(孔雀石，紫水晶等)。靶标分子能直接或间接地被发光体标记，这里间接是指靶标分子与发光体之间有分子进行链接。对靶标分子进行某种合适的处理过程中，可以将发光体引入，标记到靶标分子上。

任何合适的颗粒都可以在本发明中使用，每个颗粒上可结合至少一个靶标分子。所述颗粒可为微颗粒或磁性微球。所述颗粒的直径可为0.1微米至10微米。所述颗粒可被标记基团或其它功能性基团的一种或几种修饰，例如荧光分子，银染试剂，化学发光试剂，电化学试剂，纳米粒子，量子点等。所述功能性基团可为化学功能团，如多核苷酸(poly-dT或poly-dA)、蛋白多肽、抗体、小分子化合物、多肽、碳水化合物、醛基，羟基，羧基，酯键，氨基，磺酸基或者巯基。所述功能性基团还可为链霉亲和素、中性链亲和素、亲和素。

除了被发光体所标记外，所述靶标分子可以进一步被修饰。修饰基团可为化学功能团、功能性基团、多核苷酸、蛋白多肽、抗体、小分子化合物、多肽或碳水化合物。所述化学功能团可为醛基、羟基、羧基、酯键、氨基、磺酸基、或巯基等。所述功能性基团可为链霉亲和素、中性链亲和素或亲和素等。所述多核苷酸可为poly-dT或poly-dA。

所述靶标分子可通过其上的修饰基团与所述颗粒上的功能性基团之间的相互作用耦联到颗粒上。如链霉亲和素与生物素之间的相互作用，中性链亲和素与生物素之间的相互作用，亲和素与生物素之间的相互作用，或者poly-dT/poly-dA之间的相互作用等。

所述多核苷酸(靶标分子)可为双链或单链。单链多核苷酸靶标至少存在部分序列与固定于微阵列芯片上的探针分子至少部分序列是完全或基本碱基互补配对。当然，单链多核苷酸靶标序列与固定于微阵列芯片上的探针分子也可以完全互补配对。

所述多核苷酸(靶标分子)可进行体外操作，这可能会产生单链或双链多核苷酸片段。所述体外操作可为物理方式，如激光、超声、加热、微波、压电、电泳、介电泳、固相吸附、过滤或流体力等。所述体外操作还可为酶切、PCR扩增、反转录、反转录PCR、等位基因特异性PCR(ASPCR)、单碱基延伸(SBE法)、等位基因特异性引物延伸(ASPE)、限制性酶切、链置换扩增(SDA)、转录介导的扩增(TMA)、连接酶反应(LCR)、基于核酸序列扩增(NASBA)、引物延伸、滚环扩增(RCA)、自主序列复制(3SR)、使用Q-Beta复制酶、切口平移或环介导等温扩增(LAMP)等。

所述双链多核苷酸靶标可以通过任何合适的方法变性为单链，例如化学反应、酶反应、或物理方式(比如加热)，或者组合几种方法。所述化学反应方法可为使用尿素、甲酰胺、甲醇、乙醇和氢氧化钠中的一种或几种。所述酶反应方法具体可为使用核酸外切酶和尿嘧啶-N-糖苷酶(UNG)。双链多核苷酸靶标还可以加热到30℃-95℃中合适温度进行热变性。

所述微阵列芯片上可至少包括两条探针。所述微阵列芯片上可包含多条寡核苷酸探针。所述微阵列芯片上的探针分子可能是多核苷酸，蛋白多肽，抗体，小分子化合物，多肽或者碳水化合物。

获得的单链靶标多核苷酸可能包括人工设计和优化的多核苷酸序列例如标签序列，还可包含通用标签阵列。这些标签序列与通用标签阵列上的寡核苷酸探针序列上互补配对或基本互补配对。

不同标签序列的Tm值之间的差异被设计在任何合适的范围内，如不超过5℃。一些实例中，标签序列相互之间没有交叉反应。某些应用中，标签序列与物种的基因组DNA之间的同源性很低。特别某些应用中，标签序列内没有发卡结构。某些应用中，标签序列是单链寡核苷酸或者被修饰的类似物。另外一些应用中，标签序列可以是锁核酸(LNA)，编码核酸(ZNA)或肽核酸(PNA)。另一些应用中，标签序列通过体外操作方式被引入到靶标多核苷酸中。

微阵列芯片可以由任意合适的技术方法制成。某些应用中，制成微阵列芯片技术方法包括用针点样，利用预制的掩膜板光刻合成，利用动态微镜光刻合成，喷墨印刷，微印章技术，电化学方法和微电极阵列方法。制备微阵列芯片的基地材料包括硅，玻璃，塑料，水凝胶，琼脂糖，硝酸纤维和尼龙。

固定于微阵列芯片上的探针分子包括多核苷酸，蛋白多肽，抗体，小分子化合物，多肽和碳水化合物。探针分子可以通过任何合适的方法结合到芯片上，例如原位合成，非特异性吸附，特异性结合，非特异性的化学连接，或者化学选择性连接。探针分子与微阵列芯片之间的结合可能是共价结合或者物理吸附。微阵列芯片的基底材料可以是任何合适的材料，比如硅，玻璃，塑料，水凝胶，琼脂糖，硝酸纤维和尼龙。微阵列芯片上的探针点可以是任何合适的尺寸。某些应用中，这些探针点直径上从约10微米到5000微米。另一些应用中，这些探针为单链寡核苷酸或者被修饰的类似物。另外一些应用中，寡核苷酸探针可以是锁核酸(LNA)，编码核酸(ZNA)或肽核酸(PNA)。靶标分子与探针分子之间的结合可能是非共价键，共价可逆或共价键不可逆。

包括磁力，介电力之类的外力可用于操纵颗粒或者微球，以提高杂交效率和效果。杂交结果可以用任何合适的方式进行检测，比如用微阵列芯片扫描仪，常规的图像捕获设备或者肉眼。某些应用中，微阵列芯片扫描仪通过荧光标记，化学发光标记或酶实现光学检测。另一些应用中，微阵列芯片扫描仪通过酶、二茂铁标记或其他电活性标记实现电化学检测。

还有一些应用中，微阵列芯片扫描仪通过表面等离子共振，磁力，巨磁阻效应或微天平技术实现非标记检测。另一些应用中，常规的图像捕获设备是平板扫描仪，照相/摄像机，或便携式设备。一些应用中，检测结果是由照相/摄像机纪录，无论是否加装镜头、放大镜或者显微镜。其他一些应用中，检测结果是由带有照相/摄像功能的便携式设备记录，例如手机、笔记本，同样无论是否加装镜头、放大镜或显微镜。

本发明可用于任何适当的用途。一方面，本发明提供了一种检测遗传信息的方法，该方法包括：a)将发光体标记的靶标分子耦联到颗粒上；b)将靶标分子与固定在微阵列芯片上的探针分子相结合；和c)检测靶标分子与探针分子之间的相互作用，这里所指的靶标分子包含了遗传信息，是多核苷酸，特定的蛋白多肽，抗体，小分子化合物，多肽或者碳水化合物。另一方面，本发明提供一种检测遗传信息的方法，它包括a)将发光体标记的双链靶标分子耦联到颗粒上；b)将颗粒上的靶标分子变成单链；c)将单链靶标分子与固定在微阵列芯片上的探针分子相结合，d)检测靶标分子与探针分子之间的相互作用，这里所指的靶标分子包含了遗传信息，是多核苷酸。

任何合适的遗传信息都可以利用本方法进行检测。例如遗传信息可以是基因突变，包括碱基替换，插入，删除及多碱基替换。一些应用中，遗传信息具有单核苷酸多态性(SNP)。另一些应用中，遗传信息是基因。另外一些应用中，遗传信息是遗传物质，包括多核苷酸，蛋白多肽，抗体，小分子化合物，多肽和碳水化合物。

含有或疑似含有遗传信息的靶标多核苷酸可在检测前扩增放大，发光体标记可以在此过程中直接引入，即产物将标记上发光体。例如，ASPCR可用于扩增放大遗传信息。任何合适的引物都能用于扩增放大含有或疑似含有遗传信息的靶标多核苷酸。一些应用中，ASPCR至少包括两条等位基因特异性引物和一条通用引物。另一些应用中，等位基因特异性引物和通用引物的序列显示在表2中，而通用引物中碱基已用荧光标记，以“*”记号标注。另外的实例中，等位基因特异性引物终止于多核苷酸序列的SNP/突变位点处。另一些应用中，等位基因特异性引物与野生型序列相比进一步引入了人工错配。一些应用中，等位基因特异性引物包含天然的核苷酸或类似物。一些应用中，等位基因特异性引物序列中包括一个标签序列。其他一些应用中，ASPCR使用的DNA聚合酶没有3’到5’的外切酶活性。

另一方面，本发明的组成包括对靶标分子进行发光体标记，并将耦联到颗粒上的靶标分子和固定于微阵列芯片上的探针分子进行结合反应，其中靶标分子包括多核苷酸，蛋白多肽，抗体，小分子化合物，多肽和碳水化合物。

一些应用中，包含标签序列的寡核苷酸探针的序列如表1所示。另一些应用中，通用标签阵列中至少包括表1中的两条标签序列。另一些应用中，通用标签阵列中至少包括表1中的四条标签序列。另一些应用中，通用标签阵列中至少包括表1中的八条标签序列。另一些应用中，通用标签阵列包括表1中的所有标签序列。

进一步提供的引物序列如表2中所示，但不包含标签序列和5’生物素标记的通用序列，而且引物序列不是全长的cDNA或全长的基因组DNA。一些应用中，引物基本上包含表2中所示的序列，同样不包含标签序列和5’生物素标记的通用序列。另一些应用中，引物包含表2中所示的序列，同样不包含标签序列和5’生物素标记的通用序列。另一些应用中，引物包含表2中所示的序列。

这里提供了用于ASPCR扩增遗传信息的一组引物，该组引物包含两条等位基因特异性引物和一条共同引物，具体的引物序列如在表2中所示。

另一个方面，本发明提供了一个用于检测遗传信息的试剂盒，该试剂盒包含通用标签阵列。该试剂盒包括一个说明手册。一些实例中，该试剂盒中的引物包含表2中所示序列，但不包含标签序列和5’生物素标记的通用序列，而且引物序列不是全长的cDNA或全长的基因组DNA。另一些实例中，该试剂盒包含了一组用于ASPCR扩增遗传信息的引物，该组引物包含两条等位基因特异性引物和一条共同引物，具体的引物序列如在表2中所示。

另一方面，本发明提供一个检测分子相互作用的试剂盒，含有发光体，颗粒，微阵列芯片，和固定于微阵列芯片上的探针分子。

本发明提出了一种基于微阵列芯片的方法，用于分析分子间相互作用，包括多核苷酸，蛋白多肽，抗体，小分子化合物，多肽和碳水化合物。该方法包括将发光体标记的靶标分子耦联到颗粒上，然后与固定于微阵列芯片上的探针分子相结合。尤其是与核酸片段相关的遗传分析可以实施。特定的基因，单核苷酸多态性或基因突变，如碱基删除，插入和多碱基替换，都可以鉴定。

本发明提供的引物组、试剂组以及试剂盒可以用于遗传性耳聋的筛查，实现早期发现、提早预防以及产前指导，具有重大的商业价值和社会意义。

附图说明

图1为用本发明的方法(该发明集成了发光体、颗粒与微阵列芯片)分析分子间相互作用的原理示意图。

图2为三类不同图像获取手段来检测微阵列实验结果，即明场下CCD器件(左图)，荧光显微镜(中图)，以及商用微阵列芯片扫描仪(右图)。

图3为用本发明的方法(该发明集成了发光体、颗粒与微阵列芯片)检测双链靶标多核苷酸的原理示意图。

图4为一个与遗传性耳聋相关的8个SNP/突变检测相对应的通用标签阵列排布描述；QC和BC代表阳性和阴性点样质控；PC和NC代表阳性和阴性杂交质控；MC是修饰在微球表面的基团与靶标分子结合的阳性质控。

图5为当本发明使用通用标签阵列、发光体、微颗粒相结合，对遗传性耳聋相关的8个SNP/突变进行检测时灵敏度评估，使用的是对这8个SNP/突变为野生型的模板。

图6为当本发明使用通用标签阵列和微颗粒或微珠相结合，对遗传性耳聋相关的8个SNP/突变进行检测时临床样品的检测结果。

具体实施方式

本发明开发了一种创新技术，该技术将微阵列芯片技术与颗粒以及发光体结合在一起，通过靶标分子与探针分子的结合，最终实现解码。一些应用中，该技术将微阵列芯片技术与颗粒以及发光体结合在一起，通过富集靶标多核苷酸，借助靶标分子与探针分子之间的杂交将颗粒耦联到微阵列芯片上的探针点上，并最终实现解码。一些应用中，该技术将微阵列芯片技术与颗粒以及发光体结合在一起，通过富集双链靶标多核苷酸片断，收获单链靶标多核苷酸片断，借助靶标分子与探针分子之间的杂交将颗粒耦联到微阵列芯片上的探针点上，并最终实现解码。除了拥有很好特异性和很高灵敏度之外，借助颗粒与发光体联合、或颗粒单独显示出来的结果，可以用合适的设备，甚至肉眼观察检测。以遗传性耳聋相关的SNP/突变检测为例，对该组合方法进行了验证，验证结果表明该方法用于遗传分析时具有特异性高，灵敏度高，性价比高的特点，这特别适合于临床样品的相关诊断和疾病相关遗传检测。

本发明并不限于实施例的描述过程中特定的方法，仪器设备，溶液、或者器材，因为这种方法，设备，溶液或器材都是可变的。也需要强调的是，文中使用的术语只是为了描述特定的实例，不是为了限制本发明的范围。

除非文中另有定义或文中另有明确规定，文中所有技术和科学术语与本发明所属领域的普通的技术人员的通常理解有相同的意思。虽然实践中任何与文中描述的方法和材料相类似的或等价的方法和材料都能被使用或者用于验证本发明，但目前使用了首选的方法和材料进行描述本发明。

文中所列的公开出版物均是作为参考文献进行引用，用于提供和描述特定的材料和方法。文中谈论到的出版物只是为了揭示在本发明的申请日之前的背景技术，这些背景技术不应解释为承认在先发明揭示了本发明。

A.本发明中涉及的定义如下：

术语“分子”指的是多核苷酸、蛋白多肽、抗体、小分子化合物、多肽或者碳水化合物。

术语“发光体”指的是化合物中的能呈现发光性质的原子或原子簇，包括荧光团、磷光团和发色团。

术语“颗粒”或“微颗粒”指的是粒径在约0.01微米至1000微米范围内的小颗粒。一些实例中，“颗粒”或“微颗粒”具有某些内在属性，比如磁性、荧光之类特性，可用来鉴定颗粒或者微颗粒是否划归为一组。术语“微球”指的是粒径在约0.01微米至1000微米范围内的粒子，通常是球状。一些实例中，微球上包含一种或多种识别标签，比如磁性、荧光之类特性，这些标签随着微球上的聚合物、玻璃、其它基质或包被之类成形而形成。术语“磁性微球”，指的是粒径在约0.01微米至1000微米范围内的粒子，通常在微球的聚合物、玻璃、基质或者包被中包含一个或多个磁性区域。术语“微球”或“磁性微球”并不排除球体以外的其它形状，其包含球状、扁平状等其它形状的粒子。

术语“微阵列芯片”指的是多核苷酸、多肽及化合物微阵列芯片。特定的多核苷酸、蛋白多肽、抗体、小分子化合物、多肽和碳水化合物都可以被固定在固相表面，形成微阵列芯片。

本发明将微阵列芯片技术与颗粒以及发光体相结合，通过靶标分子与探针分子之间的结合相互作用，最终实现靶标解码。术语“结合”指的是两个分子间的相互作用，结果是由于相互之间近距离接触而形成稳定的复合体。分子间的结合相互作用分为非共价键，共价可逆或共价键不可逆三种类型。能参与分子间的结合相互作用的分子包括多核苷酸、多肽、脂类、碳水化合物和小分子化合物，比如药物中小分子化合物。能够与其它分子形成稳定复合体的多肽通常被称为“受体”，而与之相结合的分子被称为“配体”。多核苷酸可与自身或其它分子形成稳定的复合体，例如DNA-蛋白质复合体，DNA-DNA复合体，DNA-RNA复合体。

术语“多肽”文中指的是蛋白质、蛋白质的片段或氨基酸多肽，可从自然界中分离，通过重组技术生产或者化学方法合成。多肽可能包含一个或多个修饰，比如转录后修饰(如糖基化修饰)或者其他修饰(如聚乙二醇修饰)。多肽中可能包含一个或多个非天然氨基酸(如一些侧链有修饰的氨基酸)。本发明中所涉及的多肽通常包含至少10个氨基酸。

术语“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“核酸”及“核酸分子”文中可相互替代，指的是由核苷酸形成的任何长度的聚合物，包含核糖核酸、脱氧核糖核酸以及类似物或混合物之类。该术语文中只指分子的一级结构。该术语文中包括三链、双链和单链的脱氧核糖核酸(DNA)，三链、双链和单链的核糖核酸(RNA)。该术语中的多核苷酸可以未经修饰，也可以进行修饰，例如烷基化，盖帽。术语“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“核酸”及“核酸分子”也包含多聚脱氧核糖核酸(包含2-脱氧-D-核糖)，多聚核糖核酸(包含D-核糖)，包括转运RNA(tRNA)，核糖体RNA(rRNA)，转录初级产物(hRNA)和信使RNA(mRNA)，无论是否经过剪接，包含任何类型的多核苷酸，其N端或C端为嘌呤或嘧啶，包含任何拥有类似核苷酸相连形成骨架的聚合物，例如酰胺类聚合物(比如肽核酸(PNA))，吗啉聚合物(可从Anti-Virals，Corvallis，Neugene等公司购买)，以及其他合成的序列特异性核酸聚合物，这些聚合物包含碱基可像DNA或者RNA那样实现碱基配对和碱基堆积。因而这些术语文中包含3’-脱氧-2’，5’-的DNA，寡核苷酸N3’到P5’磷酰胺酯，2’-O-烷基取代的RNA，DNA与RNA之间的形成的杂合体，PNA与DNA或者RNA之间形成的杂合体，也包含已知种类的修饰，例如标记，烷基化，盖帽，一个或者多个核苷酸被类似物替代，核苷酸之间的修饰，例如不带电的连接(举例如甲基磷酸，磷酸三脂，磷酰胺，氨基甲酸酯等)，带负电的连接(举例如硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯等等)，带正电的连接(举例如氨烷基亚磷酸脂，氨烷基磷酸三酯)，那些带有修饰件的聚合物，这类修饰件包括蛋白质(举例如酶(如核酸酶)，毒素，抗体，信号肽，多聚L-赖氨酸等等)，那些带有嵌插集团的聚合物，这些嵌插集团如吖啶，补骨脂素等，那些带有鳌合物的聚合物，这些鳌合物如金属，放射性金属，硼，氧化性金属等等，那些带有烷化集团的聚合物，那些带有修饰连接的聚合物，例如α异位核酸，还有未作修饰的多核苷酸或寡核苷酸。

值得注意的是，术语“核苷”和“核苷酸”文中不仅包含已知的嘌呤和嘧啶，而且包含已被修饰的杂环碱基。这些修饰包括甲基化嘌呤或嘧啶，酰基化嘌呤或嘧啶，或其他杂环化。被修饰核苷或核苷酸还包括对对糖结构的修饰，例如糖结构上的一个或多个羟基被卤素，脂肪基团所取代，或被醚，氨基之类功能化。术语“核苷酸单元”认为是包含了核苷和核苷酸。

术语“核酸探针”和“探针”文中可相互替代，指的是由文中已定义的多核苷酸组成的结构，该结构包含一段核酸序列，可与对应的靶标特异性地结合。探针的多核苷酸区域可由DNA、RNA或合成的核苷类似物组成。

术语“互补或配对”文中指的是两段核酸序列同源性大于等于50％。最好两段核酸序列同源性不低于60％，70％，80％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％。“互补或配对”也意味着两段核酸序列可在低、中或高严谨性的条件下进行杂交。序列同源性的比例可通过与相应的参照序列比对加以计算。

术语“实质上互补或配对”文中指的是两段核酸序列同源性大于等于90％。最好两段核酸序列同源性不低于95％，96％，97％，98％，99％或100％。“实质上互补或配对”也意味着两段核酸序列可在高严谨性的条件下进行杂交。序列同源性的比例可通过与相应的参照序列比对加以计算。

总的而言，杂合体的稳定性是离子浓度和温度的函数。通常情况下，杂交反应在较低严谨性的条件下进行，而随后的清洗是在较高严谨性的条件下进行。中等严谨性的杂交条件允许核酸分子，例如探针，结合到互补的核酸分子上。已杂交的核酸分子通常有不低于60％的序列同源性，包括不低于70％，75％，80％，85％，90％或95％的序列同源性。中等严谨性的杂交相当于在由50％甲酰胺，5x Denhardt’s溶液，5x SSPE，0.2％SDS组成的杂交液中进行42℃杂交反应，随后在由0.2x SSPE，0.2％SDS组成的清洗液中进行42℃清洗。高严谨性的杂交相当于在由50％甲酰胺，5x Denhardt’s溶液，5x SSPE，0.2％SDS组成的杂交液中进行42℃杂交反应，随后在由0.1x SSPE，0.1％SDS组成的清洗液中进行65℃清洗。低严谨性的杂交相当于在由10％甲酰胺，5xDenhardt’s溶液，6x SSPE，0.2％SDS组成的杂交液中进行22℃杂交反应，随后在由1x SSPE，0.2％SDS组成的清洗液中进行37℃清洗。50x Denhardt’s溶液由1％Ficoll，1％聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和1％牛血清白蛋白(BSA)组成。20x SSPE由3M氯化钠，0.2M磷酸二氢钠和0.025M EDTA组成。

另外，RNA或DNA能在特定的杂交条件下与其相应的互补链进行杂交，产生实质上的互补性。通常情况下，链长在14到25的多核苷酸至少有65％互补性，最好至少75％互补性，至少90％互补性更佳，特异性杂交就能实现。

术语“同源的”、“实质上同源的”和“实质上同源性”文中指的是氨基酸序列与相应的参考序列相比，至少有50％，60％，70％，80％或90％的一致性。序列同源性的比例可通过与相应的参照序列比对加以计算。

术语“多重”或者“多重检测”文中指的是利用多种捕获探针同时检测多种靶标序列的方法或其它分析方法。所用的每种捕获探针具有特定的检测特征，例如荧光特性(比如激发波长、发射波长、发射强度、半峰宽(FWHM)或荧光寿命)。

当然，本发明在文中描述的方面和实例包括“由……组成的”或“基本上由……组成的”方面和实例。

本发明的任何其它内涵、优点和特征将通过后续的说明及相应附图加以阐述说明。

B.发光体

“发光体”指的是化合物中的能呈现发光性质的原子或原子簇，存在无机和无机两种类型，包括荧光团、磷光团和发色团。荧光团可以是量子点、蛋白质(如绿色荧光蛋白)，或小分子荧光染料。而小分子荧光染料可以选择氧杂蒽衍生物(荧光素，罗丹明，俄勒冈绿，曙红组成的小组，得克萨斯红等)，青色素衍生物(青色素，吲哚碳花青，羰花青，部花青等)，萘衍生物(丹磺酰和普罗丹等)，香豆素衍生物，二唑衍生物，芘衍生物(级联蓝色等)，恶嗪衍生物(尼罗河红色，蓝色尼罗河，甲酚紫，恶嗪170等)，吖啶衍生物(二氨基吖啶，吖啶橙，吖啶黄等)，次甲基衍生物(金胺，结晶紫，孔雀石绿等)，CF染料，Alexa染料，四吡咯衍生物(卟吩，胆红素等)，级联黄色，天蓝色乙，吖啶橙，DAPI，Hoechst 33258，吡罗昔康，奎宁。磷光团可以选择过渡金属化合物或各类稀土化合物。发色团可以选择视网膜染料，食品着色剂，织物染料(偶氮化合物)，番茄红素，β-胡萝卜素，花青素，叶绿素，血红蛋白，血蓝蛋白，矿物(孔雀石，紫水晶等)。靶标分子能直接或间接地被发光体标记，这里间接是指靶标分子与发光体之间有分子进行链接。对靶标分子进行某种合适的处理过程中，可以将发光体引入，标记到靶标分子上。

C.微阵列芯片

作为一种高通量的检测技术，微阵列芯片技术能同时对成千上万的分子间相互作用进行分析，已对生物、医学和新药开发产生了深远的影响。DNA微阵列芯片技术已被广泛应用于基因表达分析、突变分型、单核苷酸多态性(SNP)和短串联重复序列(STR)。多肽微阵列芯片和化学微阵列芯片已经发展成为蛋白质组学领域两个重要的工具。化学微阵列芯片，作为一种组合库，也能用于先导化合物的鉴定，并优化这些先导化合物。在生物反恐领域，开发能监测环境中的多种生物战剂或化学战剂的微阵列芯片将引起执法机构的极大兴趣。

本发明的一些实例提供了一种分析分子间相互作用的方法。本发明的一些实例提供了一种多重分析靶标多核苷酸的方法。本发明技术上提高了基于微阵列芯片的检测方法的特异性和灵敏度，同时降低了应用于基因检测时的成本。

图1描述了将微阵列芯片与颗粒以及发光体集成在一起，用于分析分子间的相互作用的原理。用于分析的靶标分子包括多核苷酸、蛋白多肽、抗体、小分子化合物、多肽和碳水化合物。

微阵列芯片是一项复杂的技术，已广泛应用于分子生物学和医学领域。它能用于分析多种靶标分子，包括多核苷酸、蛋白多肽、抗体、小分子化合物、多肽和碳水化合物。微阵列芯片可通过多种技术来制作，包括使用尖头针点样技术，基于预制掩模版光刻技术，基于动态微镜装置光刻技术，喷墨点样技术，微接触印章技术和微电极阵列上电化学技术。对于标准的微阵列芯片技术而言，探针分子通过表面工程方法被固定在芯片基底材料的表面上，这些基底材料包括玻璃、硅、塑料、水凝胶、琼脂糖、硝酸纤维和尼龙。

DNA微阵列芯片是把DNA寡聚核苷酸探针的微尺度点排成阵列构成。探针是基因上的一个短片断或其他DNA片断，能在严谨条件下与互补的多核苷酸样品即靶标进行杂交。溶液中的靶标分子的检测及定量可通过检测已杂交到微阵列芯片上的荧光、银染或者化学发光标记的靶标分子来实现。由于微阵列芯片上包含成千上万条探针，一次微阵列芯片实验能并行完成多个遗传检测。

图2为三类不同图像获取手段来检测同一微阵列实验结果，即明场下CCD器件(左图)，荧光显微镜(中图)，以及商用微阵列芯片扫描仪(右图)。表明本发明对可见光检测和荧光扫描检测都适用。

文中所用的微阵列芯片上可包含两条或多条针对同一个靶标多核苷酸的探针。一些微阵列芯片的实例中，探针重复出现了多次，可能是2次，3次，4次，5次，6次，7次或者更多次。一些实例中，微阵列芯片上可包含两条或多条针对同一个靶标多核苷酸的不同探针。这些不同的探针可结合到同一个靶标多核苷酸的不同区域，无论区域之间是否有重叠。

任何能确定靶标多核苷酸水平的探针都可用于微阵列芯片。一些实例中，探针是寡核苷酸。当然检测靶标多核苷酸时，序列上的一定程度的变异是可以接受的。因而寡核苷酸序列或其互补序列可与相应的靶标多核苷酸序列上轻微的差别。对于本领域的技术人员而言，这种序列上的差异不会严重影响寡核苷酸探针确定靶标多核苷酸水平的能力。使用标准方法比对时，这些寡核苷酸序列上的变异具有较高的同源性。与靶标多核苷酸序列相比，本发明中所包含的寡核苷酸序列同源性至少为40％，也可能至少50％，60％，70％，80％，90％，95％或更高的同源性。一些实例中，寡核苷酸探针包含两部分，其中一部分用于检测靶标多核苷酸。探针的另一部分另作他用，例如用于固定寡核苷酸探针到基底材料上。另一些实例中，探针的另一部分包含非特异序列，比如poly-T或poly-dT，可用于增加探针上互补序列部分与基底材料表面之间的距离。

文中所述的寡核苷酸探针包括DNA、RNA、PNA、ZNA、LNA，及他们的组合，或其修饰之后的形式。该寡核苷酸探针也包括被修饰的寡核苷酸骨架。一些实例中，寡核苷酸探针至少包含连续的9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个或者更多个与全长或部分靶标多核苷酸互补或者相同的核苷酸序列。一条寡核苷酸探针可能包含两段或更多段互补序列。一些实例中，寡核苷酸探针的5’或3’末端有活性基团，比如氨基，用于将该探针连接到基底材料上。

一些实例中，探针是寡核苷酸。寡核苷酸探针可通过多种方式连接到微阵列芯片的基底材料上。这些方式包括但不限于已列出来的方式：(1)基于光刻技术的原位合成，例如Affymetrix公司生产的高密度寡核苷酸阵列；(2)在玻璃、硅、尼龙或硝酸纤维上进行中低密度的点样或者印制；(3)屏蔽选择性合成；(4)在尼龙或硝酸纤维形成的杂交膜上打点杂交。寡核苷酸也可通过液相非共价键地固定到基底材料上，可利用微孔、微管道或毛细管等结构形成液相环境。

众所周知，许多技术都可用来把多核苷酸耦联到固体载体上，比如玻璃基片。一种方法是将碱基的修饰物或类似物插入到进行扩增的多核苷酸中，这些碱基的修饰物或类似物包含能耦联到固体载体上的基团，比如氨基，氨基的衍生物，或者带正电荷的基团。该扩增产物加到固体载体比如玻璃基片上。由于该固体载体上包被了醛基或其他的活性基团，使其可与扩增产物上的活性基团形成共价键，使得扩增产物共价链接到固体载体上。扩增产物构成的微阵列芯片可通过使用Biodot点样仪(BioDot，Inc.Irvine，CA)和醛基玻片(CEL Associates，Houston，TX)制成。扩增产物能被点在醛基玻片上并按照文献上公布的流程进行后续处理(Schena et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1995)，93：10614-10619)。微阵列芯片可通过机械手点样印制到玻璃，尼龙(Ramsay，G.，Nature Biotechnol.(1998)，16：40-44)，聚丙烯(Matson，et al.，Anal Biochem.(1995)，224(1)：110-116)，硅(Marshall and Hodgson，NatureBiotechnol.(1998)，16：27-31)等固体载体上。制作微阵列芯片的其他方法包括电场下精确控制微量吸管(Marshall，and Hodgson，Nature Biotechnol.(1998)，16：27-31)，多核苷酸直接点样到带正电荷的固体载体上。

本发明方法可通过复杂的排布格式加以实施。这种复杂的分析方法可利用2，3，4，5，10，15，20，25，50，100，200，500，1000或更多条捕获探针，同时分析来自多个不同的靶标多核苷酸的扩增产物。一些实例中，这种复杂的分析方法用来分析没有进行扩增放大的靶标多核苷酸序列。适合复杂分析的方法，例如这里讨论的方法，允许从更小的样品中获取更多的信息。这种对更小样品的需求增加了研究人员为验证新方法或简化获取数据而从人群中获取更多个体的样品的能力，当然更小的微创技术也是必要的。

当不同的固体载体在复杂的分析方法中作为捕获探针耦联体的一部分而存在时，这些不同的固体载体就可以通过编码加以区分。任何编码方案都可以使用。从方便角度看，编码方案可利用一种或多种不同的荧光集团，例如荧光半导体纳米晶体。高密度的光谱编码方案也可以使用。

一种或多种不同光谱编码的捕获探针耦联体可以构建出来。每种捕获探针耦联体上都包含一种或多种不同的捕获探针，其被耦联到固体载体上，而该固体载体通过一个或者多个荧光半导体纳米晶体或荧光纳米颗粒获得特定的光谱编码。这些不同的耦联体可混合在一起分析，而不同的耦联体可对应不同的试验，那么不同的试验也可在耦联体混合的状态下完成。每个耦联体因其所具有的光谱特性可进行扫描分析，通过对其光谱特性的解码可鉴定出该耦联体中的固体载体和固定于其上的捕获探针。由于半导体纳米晶体，荧光纳米颗粒及其组合数目众多且可通过光谱特性加以区分，于是大量的捕获探针及相应的扩增产物就可同时进行分析研究。

D.粒子

本发明将颗粒，微颗粒或者微珠，最好是磁珠应用于基于微阵列芯片的分析中。颗粒或者珠子可通过各种不同的聚合物进行制备。这些聚合物包括但并不限于聚苯乙烯，交联聚苯乙烯，聚丙烯酸，聚乳酸，聚乙醇酸，聚乳酸/聚羟基乙酸共聚物，聚酸酐，聚甲基丙烯酸甲酯，乙烯/醋酸乙烯酯共聚物，聚硅氧烷，聚硅，乳胶，葡聚糖聚合物和环氧树脂。可以理解，这些聚合物在溶胀和孔隙方面具有不同的特性。颗粒或者珠子粒径在约10纳米到1毫米范围内，粒径在100纳米到10微米范围会更好。当这些颗粒悬浮在溶液中可通过常规的液体方面的技术对其加以操纵。术语“颗粒”，“珠子”，“球”，“微颗粒”，“微珠”和“微球”文中可相互替代。本发明中的微球可带有检测特性，这种检测特性包括磁性，荧光，光吸收，反射，散射等。

磁性颗粒适宜的化学成分可能是铁磁材料，包括稀土比如含有铁-钴，铁-铂，钐-钴，钕-铁-硼之类的材料。其他的磁性材料，例如氧化铁(Fe304)之类的超顺磁性材料也被使用。这些首选的磁性材料包括铁-钴材料都很容易被磁化，具有较强的磁化强度(约1.7特斯拉)，且不易被腐蚀。

由于颗粒的使用，昂贵的检测仪器对结果检测而言不是必需的。当微阵列芯片上探针点的尺寸超过0.03毫米时，结合到探针点上颗粒可用肉眼直接观察分析。另一种方式，当探针点的尺寸在0.01毫米到5毫米范围时，其对应的结果可用普通的相机/摄像机拍摄成像，或者通过一个适当放大倍率的显微镜来观察。当然如果颗粒被修饰，比如用荧光，化学发光和酶标记进行修饰，那么相对应的检测方法就可用于结果检测。例如用酶，二茂铁或其他的电活性标记对颗粒进行修饰，就可用电化学方法进行检测，也可以基于表面等离子共振或者微天平技术进行无标记检测。有可能的话，商用的荧光微阵列芯片扫描仪可用于检测荧光标记的颗粒或者带有自身荧光的颗粒。

E.靶标多核苷酸

核酸靶序列(或“靶标多核苷酸”)可以是单链，双链，或多条链，也可以是线性或圆形。一般单链的靶标多核苷酸，包括基因，rRNA基因，tRNA基因，hnRNA，小RNA，单链RNA病毒基因组和单链DNA或类病毒。这些多核苷酸可能包含内部互补序列和重要的二级结构。一般双链的靶标多核苷酸，包括基因组DNA，线粒体DNA，叶绿体DNA，双链RNA或双链DNA病毒的基因组，质粒，噬菌体，shRNA(小发夹RNA或短发夹RNA)，与siRNA(小干扰RNA)。靶标多核苷酸可以直接合成或从生物材料提取。靶标多核苷酸可以纯化，以消除或者减少不必需组成部分或进行浓缩，这样也有利于多核苷酸扩增。相反，如果靶标多核苷酸浓度过大，可先稀释。

经过样品采集和可选的核酸提取和纯化，该靶标多核苷酸或其部分组分，可以经过一个或多个操作过程。这些操作过程可以包括体外转录，标记，片段化，扩增和其他反应。处理前，mRNA可先用逆转录酶和引物反转录成cDNA。核酸扩增方法增加了序列拷贝数，同时可通过带标记的引物或带标记核苷酸的引入，将产物多核苷酸进行标记。有诸多扩增方法可用，包括聚合酶链反应(PCR)，转录介导扩增(TMA)，连接酶链反应(LCR)，自持续序列复制(3SR)，基于核酸序列的扩增(NASBA)，滚环复制(RCA)，环介导等温扩增(LAMP)，Q-Beta复制酶扩增，反转录，缺口翻译扩增，等等。特别指出，扩增过程可同步进行标记。

目前的检测设备和方法可以适用检测任何类型的核苷酸。这些核苷酸，AMP，GMP，CMP，UMP，ADP，GDP，CDP，UDP，ATP，GTP，CTP，UTP，dAMP，dGMP，dCMP，dTMP，dADP，dGDP，dCDP，dTDP，dATP，dGTP，dCTP和dTTP。

某些形式中，核酸靶序列并没有对序列进行直接标记。如果对核酸靶序列进行直接标记，或者将带标记的核酸靶序列引入，这个标记是不应该干扰的捕获探针结合能力以及检测相关报告基团。

如果是单链靶标多核苷酸，第一轮扩增形成了含有引物并与靶标多核苷酸互补的延伸物。如果靶标多核苷酸是单链RNA，先使用逆转录酶反转录成DNA，再进行复制扩增。用于PCR扩增的引物必须能与模板进行互补杂交，反复以3’进行延伸，产生相应长度的扩增产物。

靶标多核苷酸经由引物和聚合酶来扩增，可以复制靶标多核苷酸的全长或其中一部分。任何有聚合酶活性的酶类，都可能被用来复制的靶标多核苷酸，包括DNA聚合酶，RNA聚合酶，逆转录酶，具有多重活性聚合酶。聚合酶耐热或耐高温。另外，酶的混合物也可采用。这些酶包括：DNA聚合酶，比如DNA聚合酶I，Klenow片段，T4酶，T7酶，Tub酶，Taq酶，Tth酶，Pfx酶，Pfu酶，Tsp酶，Tfl酶，Tli酶，GB-DDNA聚合酶；RNA聚合酶，比如大肠杆菌，SP6，T3以及T7RNA聚合酶；反转录酶，如AMV，M-MuLV，MMLV，核糖核酸酶H减去MMLV，HIV-1和RAV2逆转录酶。这些酶都可以在市场上找到。多重活性聚合酶，包括RAV2酶和Tli(外切)聚合酶。耐热聚合酶，包括Tub酶，Taq酶，Tth酶，Pfx酶，Pfu酶，Tsp酶，Tfl酶，Tli酶和GB-DDNA聚合酶。

选择适宜的反应条件进行多核苷酸扩增，包括pH值，缓冲液，离子强度，存在一种或更多种的盐离子，反应物浓度和辅因子的浓度，如核苷酸，镁或其他金属离子，可选佐剂，温度，扩增聚合酶链反应的热循环程序，并可能部分取决于使用的聚合酶以及样品本身的性质。佐剂包括甲酰胺(通常约2-10％)，甘油(通常约5-10％)，和DMSO(通常约0.9-10％)。一些技巧可用于扩增过程，以最大限度地减少假阳性或错误结果。这些技巧，包括“降落”PCR技术，热启动技术，嵌套引物，或设计PCR引物使其一旦有引物二聚体就造成茎环结构以防止扩增。也有加速聚合酶链反应的技巧，例如，离心式PCR能促使更强的液体对流，还可以包括快速红外线加热和样品冷却。可采用一个或多个循环，用以扩增。使其中一个引物过量，可导致PCR扩增产物中这条引物的延伸物过量，而此延伸物最好正是待检测的目标。多种不同的引物可用于扩增样本内的不同区域的特定多核苷酸。

此法可多重同步进行，即多个不同的检测可以同时运行，使用不同的引物来针对不同的检测区域；这些检测区域可以是互不相关的靶标片段，来自不同的等位基因，不同的等位基因亚型，或者染色体重排。这意味着允许在一个样本(例如，cDNA文库中的特定基因)对多个靶标多核苷酸进行定量。通过一种独特的捕获序列或一个独特的标记，可以对样品中不同的多核苷酸产物进行区分。

扩增的靶标多核苷酸还可以进行后续相关处理。例如，在某些情况下，可以对它进行小片段化，减少环状结构形成和避免纠结多个捕获探针，从而有利于与多核苷酸阵列杂交。核酸片段化的方法很多，只要能产生合适的片段大小均可采用，以物理的、化学的和酶的方法为常见。

扩增的靶标多核苷酸可以耦合到颗粒上，通过直接连接，或多核苷酸/颗粒上的修饰功能基团。在一些具体形式中，靶标多核苷酸被修饰，如生物素化。在其他一些形式中，这些颗粒被修饰了功能基团，如链霉亲和素，中性亲和素，以及亲和素等。靶标多核苷酸可以通过这种修饰基团和颗粒上的功能基团来耦联。对于双链靶标多核苷酸，与颗粒耦合之后可以用变性方法来制备单链靶标多核苷酸；变性的方法，比如化学反应，酶或加热，或两者兼而有之。在一些具体形式中，化学变性方法采用尿素，甲酰胺，甲醇，乙醇，酶，或氢氧化钠。在一些具体形式中，酶法采用核酸外切酶和尿嘧啶N-糖苷酶。在其他一些具体形式中，双链靶核酸热变性采用30-95℃之间的合适温度。

对本发明的方法适合于对某一样品中的多个靶标多核苷酸进行分析。多个靶标多核苷酸可以经由多个扩增引物产生，或一套扩增引物产生，这些都是针对特定的核酸扩增靶序列进行特异性扩增。

样品可以是一个阳性对照，含有已知的靶标多核苷酸或相关成分。样品也可以是阴性对照，虽然并不期望含有靶标多核苷酸，但实际也可能含有，以用于测试，便于确认给定实验所用的试剂没有靶标多核苷酸，以及确认给定的试验条件是否产生假阳性，即无靶标多核苷酸情况下还有阳性信号。

样品可稀释，溶解，悬浮，提取或以其他方式处理，以获得或纯化靶标多核苷酸，方便后续核酸扩增或检测。如果样品含有细胞，这些细胞可以裂解或通透释放细胞内的多核苷酸。通透试剂也可用于裂解细胞，方便后续操作，比如聚合酶链反应。

F.遗传信息

本专利所指基于微阵列的分析方法可适用于检测任何遗传信息。例如，遗传信息可以是基因突变形式中的一种或几种，包括碱基替换，插入，删除，及插入删除等。某一种具体的情况，此遗传信息可以是单核苷酸多态性(SNP)。某一种具体的情况，此遗传信息可以是基因。某一种具体的情况，遗传信息是基因产物，包括蛋白质，抗体，小分子化合物，肽和碳水化合物。

该靶标等位基因可能存在单碱基替换，插入，或删除，或多个基替换，插入，或删除，或插入删除。此外，核苷酸也可能有修饰，包括重排，添加，替换或改变的嘌呤或嘧啶碱基的氢键形成，能影响各自互补的嘌呤嘧啶或功能。由此产生的改性核苷酸可以与其他改性的核苷酸形成互补配对，而不是通常的A、T、C、G或U。这些改性应该不影响核苷酸的功能。部分或全部多核苷酸残基都可以根据需要进行修改。

线粒体DNA(mtDNA)在有丝分裂和减数分裂期间都要经过复制分离，加之mtDNA突变率高，使得体细胞和生殖细胞中可以同时具有突变型和野生型mtDNA分子，称为异质性(heteroplasmy)。异质性细胞经过有丝分裂和减数分裂后，随机分配到两个子代细胞，突变型和野生型mtDNA的比例发生改变，分别向纯合突变型或纯合野生型漂变，再经过多次分裂后，细胞达到完全纯合，称为均质性(homoplasmy)。异质性和复制分离现象表明，即使核基因组完全相同的个体，如一卵双生，也可具有不同的细胞质基因型，从而表型有所不同。

典型的AT和GC碱基对之间由氢键来形成，即胸苷的N3-H及C4-OH和腺苷的N1-OH及C6-NH2分别形成氢键，胞苷的C2-OH，N3-NH2及C4-NH2和鸟苷的C2-NH2，N’-H及C6-OH分别形成氢键。因此，举例来说，鸟苷可以被改性，形成异鸟苷(2-氧-6-氨基-9-β-D-呋喃核糖嘌呤)，将不能有效地与胞嘧啶形成典型的氢键。然而，胞嘧啶改性，形成异胞嘧啶(1-β-D-呋喃核糖-2-氨基-4-氧嘧啶)，将不会有效地与鸟苷形成碱基对，而与异鸟苷则可以。

多态性区域，这里定义为遗传位点的一部分，至少包含一个多态性位点。而遗传位点是位于染色体上与基因，身体特征，表型性状相关的位置。多态性位点是在人群中存在并至少有两个替换性的序列位置。多态性区域此处定义指相对于多态性位点来说的，即该区域可能是相邻位点的5’端或位点的3’端，或者多态性区域可能包含多态性位点。多态性区域可以包括含有多态性位点的多核苷酸正义链和反义链，并且长度可能约100至5000个碱基对。例如，多态性区域可能是基因调控区域的全部或部份，如启动子，5’非编码区，3’非编码区，内含子，外显子等。多态性或等位的变种，可以是基因组DNA，cDNA，mRNA或多肽，其具有核苷酸或者氨基酸序列的多态性位点。多态性位点是序列变异所产生的位点，包括核苷酸替换(单核苷酸多态性或SNPs)，插入，删除，插入删除和微卫星。多态性位点可能会也可能不会导致基因表达，蛋白结构或蛋白功能的差异。

单体型此处定义为在染色体对的一条染色体上遗传多态性位点组合的表现类型。基因型则指多态性位点处的表现类型。

本领域人士应该知道，与多态性区域互补的寡核苷酸能够在一定严谨条件下与多态性位点区域杂交，并进行分析，如引物延伸的序列测定方法，限制性位点分析，核酸扩增方法，基于连接酶的测序方法，基于不匹配的序列测定方法，基于基因芯片的序列测定方法，等等。

G.用于靶标多核苷酸扩增的寡核苷酸引物

在某些方面，这个发明还体现在那些适用于聚合酶链反应(PCR)或其他核酸扩增方法寡核苷酸引物对上。运用已有的知识并结合此处所学，普通本领域人士就能够设计出合适的寡核苷酸引物对。运用这一方法设计的特异性寡核苷酸引物对系列见表2，这些特异性寡核苷酸引物对适用于扩增GJB2，SLC26A4和12S rRNA上多态性位点所在的多态性区域。其他适合扩增GJB2，SLC26A4和12S rRNA上多态性区域的寡核苷酸引物对，也可以运用类似方法设计出来并且可以避免多余的实验。

另一些方面，一个突变位点对应于至少两个等位基因特异性引物。其中一个等位基因特异性引物包含一段相同或互补的含有突变位点的突变型等位基因的目标片段。等位基因特异性引物与模板结合可终止在突变位点的3’端。为了提高分辨靶基因上野生型和突变型等位基因的能力，在等位基因特异性引物中可以引入人工错配。人工错配可以是天然的碱基，也可以是核苷酸类似物。该发明中的每个PCR引物对可以用于任何PCR方法。例如，该发明中的PCR引物被运用在美国的专利第4683195，4683202，4965188，5656493，5998143，6140054，WO 01/27327和WO 01/27329中涉及的方法，诸如此类的还有很多。本发明中的PCR引物对也可用在进行PCR反应任何商用仪器，例如Applied Biosystems公司提供的系统。

现有引物可包括任何合适的核酸类型，例如DNA，RNA，PNA或其衍生物。另外，这些引物可以包括一段核苷酸序列或其互补链，具体的见表2所示。

寡核苷酸引物可由任何适当的方法合成。例如，引物可以化学合成，也可以从天然来源中分离得到，也可以用重组的方法生产，或者多种方法结合使用。合成寡核苷酸也可以通过三酯法制备(Matteucci et al.，J.Am.Chem.Soc.，3：3185-3191(1981))。另外，自动合成可能是首选，例如，在一个Applied Biosynthesis DNA合成仪上使用氰乙基亚磷酰胺化学合成法。当然，引物最好是化学合成的。

在本发明中，适用于合成寡核苷酸引物的碱基可以从自然的核苷酸碱基中选择，如腺嘌呤，胞嘧啶，鸟嘌呤，尿嘧啶和胸腺嘧啶。它也可以从非自然或合成的核苷酸碱基中选择，如如8-羰基鸟嘌呤，6-巯基鸟嘌呤，4-乙酰胞苷，5-(羧基羟乙基)尿苷，2’-氧化甲基胞苷，5-羧基甲氨基-甲基-2-硫嘧啶，5-羧基甲氨基尿苷，二氢尿嘧啶核苷，2’-氧化甲基假尿苷，β-D-半乳糖苷-7-(4，5-顺式)-二羟-2-环戊烯，2’-氧化甲基鸟苷，肌苷，腺苷-异戊烯腺苷，1-甲基腺苷，1-甲基假尿苷，1-甲基鸟苷，1-甲基肌苷，2，2-二甲基鸟苷，2-甲基腺苷，2-甲基鸟苷，3-甲基胞苷，5-甲基胞苷，腺苷-甲基腺苷，7-甲基鸟苷，5-甲基氨甲基尿苷，5-甲氧基氨甲基-2-硫尿苷，β-D-甘露糖基-7-(4，5-顺式)-二羟-2-环戊烯，5-甲氧基羰甲基尿苷，5-甲氧基尿苷，2-甲硫基-N6-异戊烯腺苷，N-((9-.β.-D-呋喃核糖-2-甲基硫嘌呤-6-基)氨基甲酰)苏氨酸，N-((9-β-D-呋喃核糖基嘌呤-6-基)N-甲基氨基甲酰)苏氨酸，尿苷-5-氧乙酸甲酯，尿苷-5-氧乙酸，wybutoxosine，假尿苷，7-(4，5-顺式)-二羟-2-环戊烯，2-巯基胞苷，5-甲基-2-硫尿核苷，2-硫尿核苷，2-硫尿核苷，5-甲基尿苷，N-((9-β-D-呋喃核糖基嘌呤-6-基)氨基甲酰)苏氨酸，2’-氧化甲基-5-甲基尿苷，2’-氧化甲基尿嘧啶核苷，wybutosine和3-(3-氨基-3-羧丙基)尿苷。

同样的，寡核苷酸的化学类似物也可被利用(例如，寡核苷酸中的磷酸二酯键被修饰为磷酸甲酯，磷酸三酯，硫代磷酸酯，或氨基磷酸酯)。用3’端加帽”的方法可以保护寡核苷酸免受降解，因为在3’端加帽后，3’端的磷酸二酯键被抗核酸酶的键取代(Shaw et al.，Nucleic Acids Res.，19：747(1991))。在这种方式中，磷酰胺，磷酸酯和磷酸甲基键都充分体现其功能。在磷酸骨干进行更广泛的修饰已被证明能够增加稳定性，同时增强亲和力，及提高寡核苷酸细胞渗透力(Milligan et al.，J.Med.Chem.，36：1923(1993))。许多不同化学方法的运用可使整个磷酸骨架被新的键所取代。骨架类似物有很多，例如磷硫酰，二硫代磷酸酯，磷酸甲酯，氨基磷酸酯，硼烷磷酸酯，磷酸三酯，甲酰醛缩醇，3’-巯基甲酰醛缩醇，5’-巯基甲酰醛缩醇，5’-硫醚，碳酸盐，5’-N氨基甲酸酯，硫酸，磺酸，氨基磺酸，磺胺类，砜，亚硫酸钠，亚砜，硫化物，羟胺，亚甲基等。磷硫酰和磷酸甲酯修饰是常见的寡核苷酸修饰，因为它们应用于自动寡核苷酸的合成过程中。寡核苷酸可能是一个肽核酸，如Milligan描述的那样(Milligan et al.，J.Med.Chem.，36：1923(1993))。唯一的要求是，寡核苷酸引物序列应具有至少部分能与目标序列互补的一段序列。

靶标多核苷酸可能是双链，也可能是单链。在一些具体事例中，单链靶标多核苷酸的至少部分与固定在微阵列上的寡核苷酸探针完全或大体上互补。在其他事例中，单链靶标多核苷酸与固定在微阵列上的寡核苷酸探针是完全互补的。图3是发明示意图，是基于微阵列方法结合微粒以及发光体，用于检测靶标双链多核苷酸。

利用PCR、RT-PCR或其他相关方法，可将多核苷酸分子转换成生物素、地高辛等标记的多核苷酸片段，容易与颗粒表面基团耦联。通过耦联，溶液中的多核苷酸片段能得到富集。对双链多核苷酸片段，它们可以通过变性成为单链多核苷酸。通过靶标-探针杂交反应，颗粒能耦合到特定微阵列表面，它们本身或者对其进一步修饰，能方便地通过非昂贵的检测设备或商用芯片扫描仪的来读取结果。特定的基因，基因突变，如删除，插入，和插入删除等，能因此得到检测。

此发明允许任何方法来检测多核苷酸，这里更特指检测多态性位点。例如，等位基因特异性引物方法，引物延伸方法，基于连接酶的序列测定方法，基于不匹配的序列测定方法，或基于微阵列的序列测定方法。另外，限制性片段长度多态性(RFLP)，单链构象多态性检测(SSCP)，变性梯度(DGGE)凝胶电泳，变性高效液相色谱(DHPLC)，TaqMan PCR等，都可以使用。

等位基因特异性引物用于检测基因突变，分两种策略，一种是采用等位基因特异性探针阵列，另一种是采用通用标签微阵列。等位基因特异性PCR(ASPCR)也被称作扩增阻滞突变系统(ARMS)或PCR-序列特异性引物(PCR-SSP)方法，具有很高的突变位点分辨能力。ASPCR适合已知多态性位点的基因序列分析，采用的DNA聚合酶没有3’-5’外切酶活性，如果3’端特异性引物与模板不匹配，此引物不能延伸从而导致PCR反应被阻止。利用多重PCR技术，可以同时扩增多个多态性位点，然后用DNA芯片进行区分。多重PCR扩增可以在单个管子或不同的管子中进行。

采用通用阵列技术，标签序列结合在引物上，其PCR产物可以方便地与标签探针杂交。微阵列在这里只是作为一个解码工具。标签序列(Tag)是人工设计的并加以严格筛选，他们有相应的互补序列，即cTag等。每个标签序列及其互补标签序列的组合对应等位基因上的一个基因突变位点。不同标签序列之间的Tm值不大于5℃，并且标签序列相互之间或者与引物之间无交叉杂交，与物种基因组DNA同源性很低，并且没有发夹结构。基因或基因型是根据杂交信号以及微阵列上标签探针的位置来确定的。

图4为通用标签阵列的一个具体例子，与遗传性耳聋相关的8个SNP/突变检测相对应，其布局包括16种标签，并且每种标签水平重复5次。组成通用标签探针阵列的标签核苷酸序列如表1所示。在一些变化形式中，每个标签探针进行5’-氨基修饰，其中5’端还含有15聚胸苷的连接序列。QC和BC分别代表微阵列制作效果的阳性和阴性对照。PC和NC分别代表微阵列杂交过程的阳性和阴性对照。MC代表颗粒表面修饰基团与靶标多核苷酸耦联的阳性对照。这些考虑确保检测过程中的每个步骤以及最终结果是正确无误的。当然，针对特定的应用，人们可以使用更多或更少标签序列，以及水平复制的次数或不复制。这些标签序列是由生物信息学方法设计的。标签探针序列与靶标基因生物物种没有同源性。例如，如果靶标来源是人类，标签序列可以来自细菌序列。这种标签序列可以是单链寡核苷酸或肽核酸。

本发明所指的通用标签微阵列与普通芯片是不同的。对于常见的基因微阵列，探针序列可能是基因特异性的寡核苷酸或多态性位点特异性寡核苷酸，这样对不同的靶基因或多态性位点检测需要不同的探针类型。然而，通用标签微阵列是由专门设计的标签序列探针组成的，因此他们并不与基因特异性引物或等位基因特异性寡核苷酸直接相关。该标签序列可以作为同一物种基因突变或不同物种的基因突变的代码。利用此通用的阵列格式，可用于检测任何基因或基因型，即检测过程变成类似于解码过程。

H.试剂盒

本发明也提供一种试剂盒，用于检测分子相互作用，包含发光体，颗粒，微阵列和芯片上固定的探针分子。在某些方面，发明的试剂盒含有通用探针序列微阵列。对检测多态性位点来说，本发明的试剂盒包括一套等位基因特异性扩增引物和荧光标记的下游共用引物，如表2所示。本发明的试剂盒还可能包括例如聚合剂(比如耐高温的核酸聚合酶)，等等。本发明的试剂盒还可能包括用于核苷酸链延伸的试剂，诸如dATP，dTTP，dGTP，dCTP，dITP，及它们的类似物，只要能在耐热性核酸聚合酶催化下作为基质加入到核酸延伸链中即可。更具体的来说，试剂盒包括至少一对的寡核苷酸引物，聚合剂，链延伸用的核苷酸。本发明的试剂盒还可以包括缓冲液，容器，微孔板，使用说明书等。

下面的实施例是用来解释本发明，而不是对发明进行限制。

实施例1、应用本发明的试剂盒检测遗传性耳聋

以下以检测遗传性耳聋相关的8个SNP/突变的试剂盒为例，对本发明进行具体阐述。

一、微阵列芯片

通用标签阵列是由16个标签探针组成的矩阵，能与多重PCR产物进行杂交反应，另外还有用于质控微阵列制作效果的阳性对照(QC)和阴性对照(BC)，质控微阵列杂交过程的阳性对照(PC)和阴性对照(NC)，以及质控颗粒表面链霉亲和素与生物素化靶标多核苷酸耦联的阳性对照(MC)。阳性对照(QC)是一种一端标记HEX荧光、另一端氨基修饰的寡核苷酸探针，用于监察微阵列点制和阵列上固定的效果。阴性对照(BC)仅是阵列点制缓冲液，用于监测交叉污染的可能性。阴性对照(NC)是一种氨基修饰的寡核苷酸探针，理论上不会与溶液中的任何分子进行杂交，用于监测非特异性杂交的可能性。PC是一种氨基修饰的寡核苷酸探针，能与看家基因PCR产物杂交，用于监测PCR和杂交效果。MC是一种氨基修饰的生物素化寡核苷酸探针，能结合链霉亲和素涂层的颗粒，用于监测链霉亲和素与生物素化DNA片段的结合能力。

通用标签阵列的探针依格式进行设计：NH₂-TTTTTTTTTTTTTTT-TagX，其中X是一个1到16的序数。探针5’端有氨基修饰，接着是15聚胸苷(dT15)，再接着分别为表1所列Tag1到Tag16的序列。标签探针中Tag1到Tag16的核苷酸序列与扩增引物中的Tag1到Tag16的其核苷酸序列一一对应相同。通用标签阵列上的探针见表1。

表1通用标签阵列上的探针

将标签探针溶解在微阵列制备点样缓冲液中，印制在表面功能化修饰的玻璃片上，形成微阵列芯片。通用标签阵列排布对应于8个遗传性听力损失相关多态性位点，包含多态性位点c.35delG，c.176_191del16，c.235delC，以及c.299_300delAT在GJB2(Cx26)基因(NM_004004)上，自起始密码子至终止密码子为编码区(NM_004004.5，GI：195539329)。多态性位点c.2168A＞G和c.919-2A＞G在SLC26A4(PDS)基因(NM_000441)上，自起始密码子至终止密码子为编码区(NM_000441.1，GI：4505696)。多态性位点m.1494C＞T和m.1555A＞G在12S rRNA(MTRNR1，属于线粒体基因)基因上(NC_012920，GI：251831106)。以W或M为后缀的名称分别代表对应多态性位点的野生型或突变型。图4左边排列的是野生型探针，右边排列的是突变型探针，其中每个探针横向重复5次。

二、用于检测遗传性耳聋相关的8个SNP/突变的引物组合物

表2遗传性耳聋相关的8个SNP/突变及相应的引物

引物名称中，‘WT’后缀指等位基因特异性引物扩增时具体位点的野生型，‘MU’后缀指等位基因特异性引物扩增时具体位点的突变型，‘RB’后缀是指5’-末端生物素标记的共同引物，与野生型或突变型配对来扩增包含多态性位点的靶标等位基因，即针对每一个多态性位点的等位基因特异性引物分别可与共同引物配对。如表2所示，共同引物被荧光所标记，即引入了Cy3-dTTP，用“T*”来标识，其中“*”指荧光标记。‘PC-F’与‘PC-R’可扩增看家基因，用于PCR和杂交效果质控。

突变位点“c.35delG”指的是GJB2基因编码区自5’末端第35位核苷酸G的缺失，没有缺失的为野生型，缺失的为突变型；突变位点“c.176_191de116”指的是GJB2基因编码区自5’末端第176位到191位连续16个碱基的缺失，没有缺失的为野生型，缺失的为突变型；突变位点“c.235delC”指的是GJB2基因编码区自5’末端第235位核苷酸C的缺失，没有缺失的为野生型，缺失的为突变型；突变位点“c.299_300delAT”指的是GJB2基因编码区自5’末端第299位到第300位连续2个碱基AT的缺失，没有缺失的为野生型，缺失的为突变型；突变位点“c.2168A＞G”指的是SLC26A4基因编码区自5’末端第2168位核苷酸由A突变为G，该核苷酸为A的是野生型，为G的是突变型；突变位点“c.919-2A＞G”指的是SLC26A4基因上与其基因编码区自5’末端第919位核苷酸相邻的第7内含子内自3’末端开始第二个核苷酸由A突变为G，该核苷酸为A的是野生型，为G的是突变型；突变位点“m.1494C＞T”指的是线粒体基因12S rRNA上第1494位核苷酸由C突变为T，该核苷酸为C的是野生型，为T的是线粒体突变；突变位点“m.1555A＞G”指的是线粒体基因12S rRNA上第1555位核苷酸由A突变为G，该核苷酸为A的是野生型，为G的是线粒体突变。

每个多态性位点对应有两个等位基因特异性引物和共用的经荧光标记并生物素化的引物，而每个等位基因特异性引物序列有两部分组成，即位于5’端的标签序列和其后连接的包含或互补靶标多态性位点的核苷酸序列。每一等位基因特异性引物与共同引物配合，可以用来PCR扩增包含多态性位点的DNA片段。表2中Tag1至Tag16以及PC的含义与表1中探针中所包含的Tag1至Tag16以及PC的含义相同。

表2中针对8个SNP/突变的24条引物、‘PC-F’和‘PC-R’组成引物组合物。

三、链霉亲和素包被的颗粒

链霉亲和素包被的颗粒：MyOne Dynal磁珠，Invitrogen Dynal AS，Oslo，Norway。粒径为1微米。链霉亲和素包被的颗粒可用于捕捉生物素标记的DNA片段。

四、试剂盒的组装

试剂盒由步骤一的微阵列芯片、步骤二的引物组合物和步骤三的链霉亲和素包被的颗粒组成。发光体与磁珠辅助的微阵列分析方法可用于遗传性耳聋相关的多重基因突变分析，其过程是通过磁珠富集荧光标记的多重PCR产物，提取单链DNA片段，与通用标签微阵列杂交，同时将磁珠耦联到微阵列表面，最后用商用的荧光扫描仪和可见光检测办法获取图像，从而通用标签微阵列可以解码并得到基因突变分析结果。

五、试剂盒的应用

在检测者知情同意的情况下，检测如下样本：耳聋患者相关的血液样品、口腔拭子、干血斑样品和产前诊断样品，以及新生儿干血斑样品；各样本均获自解放军总医院。

1、多重等位基因特异性PCR

①提取各样本的基因组DNA。

②进行多重等位基因特异性PCR，得到荧光标记的PCR扩增产物。

PCR反应体系(20μL)：含有0.2mM dNTP，1×PCR缓冲液，2mM MgCl₂，1个单位的热启动DNA聚合酶(无3’到5’外切酶活性)，10ng基因组DNA，引物组合物中的每条引物0.2μM。

PCR扩增是在PTC-225热循环仪上进行的(MJ Research，Watertown，MA)，其扩增程序为：95℃持续15分钟；94℃持续30秒，以0.5℃/秒下降到55℃，55℃持续30秒，以0.2℃/秒上升至70℃，70℃持续45秒，重复这个过程10次；然后90℃持续30秒，以0.5℃/秒下降到55℃，55℃持续30秒，以0.2℃/秒上升至70℃，70℃持续45秒，重复这个过程22次；保持60℃保持10分钟，最后4℃保存。

2、单链DNA的提取

①依照供货商的说明书，先对磁珠进行预处理；

②然后取3μL预处理过的磁珠，加入到8μL PCR扩增产物中，孵育15分钟；

③再碱性变性处理，即用新鲜配置的NaOH溶液(浓度为0.1M)处理10分钟；

④最后，将溶液去除干净，并加入15μL杂交缓冲液(9×SSC，7.5×Denhardt’s，37.5％(体积百分含量)Formamide，0.15％(质量百分含量)SDS)，得到杂交混合物。

3、通用标签阵列杂交

①将制备好的杂交混合物加到微阵列芯片表面，50℃孵育1小时(如果采用磁力辅助来操纵磁珠，杂交时间可缩短到15分钟)；

②再在室温下用两种溶液各清洗一次(溶液I：1×PBS和0.2％(体积百分含量)吐温20；溶液II：0.03×SSC)；

③然后，用离心机甩干玻片。

④用商用荧光微阵列扫描仪扫描或用CCD相机拍摄微阵列芯片(甚至直接眼睛观察也可)。共焦扫描仪(LuxScan 10K，博奥，北京)的激光功率和光电倍增管(PMT)系数分别为90％和600，获得的图像由软件(SpotData，博奥)提取用于后续分析。

对一个已确定上述各个多态性位点基因型的血液基因组DNA进行分型，分型中采用不同量的基因组DNA，以测试试剂盒的灵敏度，分型结果完全正确，其扫描仪扫描的结果见图5。从图中可得出，对5ng以上基因组DNA，左侧所有的野生型特异性探针均呈阳性杂交信号，并且右侧所有突变型特异性探针均没有特异性信号。故此实施例中本试剂盒能检测5ng基因组DNA，而且经进一步测试发现对众多样品都具有重复性。

选择已确定上述各个多态性位点基因型的10种样品(分别为取自不同个体的血液基因组DNA)，其中包含纯合子和杂合子，来检验该试剂盒的分型结果特异性。其分型结果使用商业荧光微阵列扫描仪进行扫描，结果见图6(图片下方的标注为已确定的该样本的多态性位点类型，未提及的位点为野生型)。‘MU’和‘HET’后缀分别表示纯合子和杂合子。杂合子即同时包含多态性位点的野生型和突变型。对于线粒体的多态性位点m.1494C＞T和m.1555A＞G，’HOM’和’HET’后缀分别表示均质性和异质性突变状态。对比实际情况表明，本发明的试剂盒的检测结果都完全正确，即对每个样品的每个基因型的分型结果都正确。

另外，对耳聋患者志愿者相关的口腔拭子、干血斑、产前诊断样品，以及新生儿干血斑等众多样品都采用本试剂盒进行了分型检测。其分型结果经DNA测序验证均为100％正确，表明此平台具有高特异性并适用于临床检测。这些不同途径来源临床样品的成功检测，表明此平台也可应用于其他疾病的遗传诊断。

Claims (7)

1.辅助检测遗传性耳聋的试剂盒，包括引物组合物和磁性颗粒；

所述引物组合物由引物组I、引物组II、引物组III、引物组IV、引物组V、引物组VI、引物组VII和引物组VIII组成；

所述引物组I，为如下(a)或(b)：

(a)由如下三种核苷酸序列的DNA组成的引物组：序列表的序列21自5’末端第23至42位核苷酸所示的DNA、序列表的序列22自5’末端第23至41位核苷酸所示的DNA和序列表的序列23所示的DNA；

(b)由如下三种核苷酸序列的DNA组成的引物组：序列表的序列21所示的DNA、序列表的序列22所示的DNA和序列表的序列23所示的DNA；

所述(a)或(b)中，序列表的序列23所示DNA的5’末端连接有生物素；所述(a)或(b)中，所述序列表的序列23所示的DNA自5’末端第4位核苷酸标记有荧光素Cy3；

所述引物组II，为如下(a)或(b)：

(a)由如下三种核苷酸序列的DNA组成的引物组：序列表的序列24自5’末端第23至42位核苷酸所示的DNA、序列表的序列25自5’末端第23至40位核苷酸所示的DNA和序列表的序列26所示的DNA；

(b)由如下三种核苷酸序列的DNA组成的引物组：序列表的序列24所示的DNA、序列表的序列25所示的DNA和序列表的序列26所示的DNA；

所述(a)或(b)中，序列表的序列26所示DNA的5’末端连接有生物素；所述(a)或(b)中，所述序列表的序列26所示的DNA自5’末端第6位核苷酸标记有荧光素Cy3；

所述引物组III，为如下(a)或(b)：

(a)由如下三种核苷酸序列的DNA组成的引物组：序列表的序列27自5’末端第25至42位核苷酸所示的DNA、序列表的序列28自5’末端第24至40位核苷酸所示的DNA和序列表的序列29所示的DNA；

(b)由如下三种核苷酸序列的DNA组成的引物组：序列表的序列27所示的DNA、序列表的序列28所示的DNA和序列表的序列29所示的DNA；

所述(a)或(b)中，序列表的序列29所示DNA的5’末端连接有生物素；所述(a)或(b)中，所述序列表的序列29所示的DNA自5’末端第6位核苷酸标记有荧光素Cy3；

所述引物组IV，为如下(a)或(b)：

(a)由如下三种核苷酸序列的DNA组成的引物组：序列表的序列30自5’末端第25至43位核苷酸所示的DNA、序列表的序列31自5’末端第25至43位核苷酸所示的DNA和序列表的序列32所示的DNA；

(b)由如下三种核苷酸序列的DNA组成的引物组：序列表的序列30所示的DNA、序列表的序列31所示的DNA和序列表的序列32所示的DNA；

所述(a)或(b)中，序列表的序列32所示DNA的5’末端连接有生物素；所述(a)或(b)中，所述序列表的序列32所示的DNA自5’末端第6位核苷酸标记有荧光素Cy3；

所述引物组V，为如下(a)或(b)：

(a)由如下三种核苷酸序列的DNA组成的引物组：序列表的序列33自5’末端第25至47位核苷酸所示的DNA、序列表的序列34自5’末端第24至43位核苷酸所示的DNA和序列表的序列35所示的DNA；

(b)由如下三种核苷酸序列的DNA组成的引物组：序列表的序列33所示的DNA、序列表的序列34所示的DNA和序列表的序列35所示的DNA；

所述(a)或(b)中，序列表的序列35所示DNA的5’末端连接有生物素；所述(a)或(b)中，所述序列表的序列35所示的DNA自5’末端第6位核苷酸标记有荧光素Cy3；

所述引物组VI，为如下(a)或(b)：

(a)由如下三种核苷酸序列的DNA组成的引物组：序列表的序列36自5’末端第23至45位核苷酸所示的DNA、序列表的序列37自5’末端第23至43位核苷酸所示的DNA和序列表的序列38所示的DNA；

(b)由如下三种核苷酸序列的DNA组成的引物组：序列表的序列36所示的DNA、序列表的序列37所示的DNA和序列表的序列38所示的DNA；

所述(a)或(b)中，序列表的序列38所示DNA的5’末端连接有生物素；所述(a)或(b)中，所述序列表的序列38所示的DNA自5’末端第5位核苷酸标记有荧光素Cy3；

所述引物组VII，为如下(a)或(b)：

(a)由如下三种核苷酸序列的DNA组成的引物组：序列表的序列39自5’末端第24至46位核苷酸所示的DNA、序列表的序列40自5’末端第24至45位核苷酸所示的DNA和序列表的序列41所示的DNA；

(b)由如下三种核苷酸序列的DNA组成的引物组：序列表的序列39所示的DNA、序列表的序列40所示的DNA和序列表的序列41所示的DNA；

所述(a)或(b)中，序列表的序列41所示DNA的5’末端连接有生物素；所述(a)或(b)中，所述序列表的序列41所示的DNA自5’末端第4位核苷酸标记有荧光素Cy3；

所述引物组VIII，为如下(a)或(b)：

(a)由如下三种核苷酸序列的DNA组成的引物组：序列表的序列42自5’末端第23至43位核苷酸所示的DNA、序列表的序列43自5’末端第23至44位核苷酸所示的DNA和序列表的序列44所示的DNA；

(b)由如下三种核苷酸序列的DNA组成的引物组：序列表的序列42所示的DNA、序列表的序列43所示的DNA和序列表的序列44所示的DNA；

所述(a)或(b)中，序列表的序列44所示DNA的5’末端连接有生物素；所述(a)或(b)中，所述序列表的序列44所示的DNA自5’末端第4位核苷酸标记有荧光素Cy3。

2.辅助检测遗传性耳聋的试剂盒，包括试剂组合物、基片和磁性颗粒；所述试剂组合物中的探针组固定于所述基片上，形成微阵列芯片；所述基片的材质为硅、玻璃、塑料、水凝胶、硝酸纤维或尼龙；

所述试剂组合物由试剂组合物I、试剂组合物II、试剂组合物III、试剂组合物IV、试剂组合物V、试剂组合物VI、试剂组合物VII和试剂组合物VIII组成；

所述试剂组合物I，由引物组I和探针组I组成；

所述引物组I，为如下(a)或(b)：

(a)由如下三种核苷酸序列的DNA组成的引物组：序列表的序列21自5’末端第23至42位核苷酸所示的DNA、序列表的序列22自5’末端第23至41位核苷酸所示的DNA和序列表的序列23所示的DNA；

(b)由如下三种核苷酸序列的DNA组成的引物组：序列表的序列21所示的DNA、序列表的序列22所示的DNA和序列表的序列23所示的DNA；

所述(a)或(b)中，序列表的序列23所示DNA的5’末端连接有生物素；所述(a)或(b)中，所述序列表的序列23所示的DNA自5’末端第4位核苷酸标记有荧光素Cy3；

所述探针组I为如下(a)或(b)或(c)：

(a)由如下两种核苷酸序列的DNA组成的探针组：序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA；

(b)由如下两种核苷酸序列的DNA组成的探针组：在序列表的序列1所示DNA的5’末端连接特异片段得到的DNA和在序列表的序列2所示DNA的5’末端连接所述特异片段得到的DNA；所述特异片段为5-30个脱氧核糖核苷酸T组成的DNA；

(c)由如下两种核苷酸序列的DNA组成的探针组：在序列表的序列1所示DNA的5’末端连接特异片段得到的DNA和在序列表的序列2所示DNA的5’末端连接所述特异片段得到的DNA；所述特异片段为5-30个脱氧核糖核苷酸T组成的DNA，且5’末端第一位核苷酸修饰有氨基；

所述试剂组合物II，由引物组II和探针组II组成；

所述引物组II，为如下(a)或(b)：

(a)由如下三种核苷酸序列的DNA组成的引物组：序列表的序列24自5’末端第23至42位核苷酸所示的DNA、序列表的序列25自5’末端第23至40位核苷酸所示的DNA和序列表的序列26所示的DNA；

(b)由如下三种核苷酸序列的DNA组成的引物组：序列表的序列24所示的DNA、序列表的序列25所示的DNA和序列表的序列26所示的DNA；

所述(a)或(b)中，序列表的序列26所示DNA的5’末端连接有生物素；所述(a)或(b)中，所述序列表的序列26所示的DNA自5’末端第6位核苷酸标记有荧光素Cy3；

所述探针组II为如下(a)或(b)或(c)：

(a)由如下两种核苷酸序列的DNA组成的探针组：序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA；

(b)由如下两种核苷酸序列的DNA组成的探针组：在序列表的序列3所示DNA的5’末端连接特异片段得到的DNA和在序列表的序列4所示DNA的5’末端连接所述特异片段得到的DNA；所述特异片段为5-30个脱氧核糖核苷酸T组成的DNA；

(c)由如下两种核苷酸序列的DNA组成的探针组：在序列表的序列3所示DNA的5’末端连接特异片段得到的DNA和在序列表的序列4所示DNA的5’末端连接所述特异片段得到的DNA；所述特异片段为5-30个脱氧核糖核苷酸T组成的DNA，且5’末端第一位核苷酸修饰有氨基；

所述试剂组合物III，由引物组III和探针组III组成；

所述引物组III，为如下(a)或(b)：

(a)由如下三种核苷酸序列的DNA组成的引物组：序列表的序列27自5’末端第25至42位核苷酸所示的DNA、序列表的序列28自5’末端第24至40位核苷酸所示的DNA和序列表的序列29所示的DNA；

(b)由如下三种核苷酸序列的DNA组成的引物组：序列表的序列27所示的DNA、序列表的序列28所示的DNA和序列表的序列29所示的DNA；

所述(a)或(b)中，序列表的序列29所示DNA的5’末端连接有生物素；所述(a)或(b)中，所述序列表的序列29所示的DNA自5’末端第6位核苷酸标记有荧光素Cy3；

所述探针组III为如下(a)或(b)或(c)：

(a)由如下两种核苷酸序列的DNA组成的探针组：序列表的序列5所示DNA和序列表的序列6所示DNA；

(b)由如下两种核苷酸序列的DNA组成的探针组：在序列表的序列5所示DNA的5’末端连接特异片段得到的DNA和在序列表的序列6所示DNA的5’末端连接所述特异片段得到的DNA；所述特异片段为5-30个脱氧核糖核苷酸T组成的DNA；

(c)由如下两种核苷酸序列的DNA组成的探针组：在序列表的序列5所示DNA的5’末端连接特异片段得到的DNA和在序列表的序列6所示DNA的5’末端连接所述特异片段得到的DNA；所述特异片段为5-30个脱氧核糖核苷酸T组成的DNA，且5’末端第一位核苷酸修饰有氨基；

所述试剂组合物IV，由引物组IV和探针组IV组成；

所述引物组IV，为如下(a)或(b)：

(a)由如下三种核苷酸序列的DNA组成的引物组：序列表的序列30自5’末端第25至43位核苷酸所示的DNA、序列表的序列31自5’末端第25至43位核苷酸所示的DNA和序列表的序列32所示的DNA；

(b)由如下三种核苷酸序列的DNA组成的引物组：序列表的序列30所示的DNA、序列表的序列31所示的DNA和序列表的序列32所示的DNA；

所述(a)或(b)中，序列表的序列32所示DNA的5’末端连接有生物素；所述(a)或(b)中，所述序列表的序列32所示的DNA自5’末端第6位核苷酸标记有荧光素Cy3；

所述探针组IV为如下(a)或(b)或(c)：

(a)由如下两种核苷酸序列的DNA组成的探针组：序列表的序列7所示DNA和序列表的序列8所示DNA；

(b)由如下两种核苷酸序列的DNA组成的探针组：在序列表的序列7所示DNA的5’末端连接特异片段得到的DNA和在序列表的序列8所示DNA的5’末端连接所述特异片段得到的DNA；所述特异片段为5-30个脱氧核糖核苷酸T组成的DNA；

(c)由如下两种核苷酸序列的DNA组成的探针组：在序列表的序列7所示DNA的5’末端连接特异片段得到的DNA和在序列表的序列8所示DNA的5’末端连接所述特异片段得到的DNA；所述特异片段为5-30个脱氧核糖核苷酸T组成的DNA，且5’末端第一位核苷酸修饰有氨基；

所述试剂组合物V，由引物组V和探针组V组成；

所述引物组V，为如下(a)或(b)：

(a)由如下三种核苷酸序列的DNA组成的引物组：序列表的序列33自5’末端第25至47位核苷酸所示的DNA、序列表的序列34自5’末端第24至43位核苷酸所示的DNA和序列表的序列35所示的DNA；

(b)由如下三种核苷酸序列的DNA组成的引物组：序列表的序列33所示的DNA、序列表的序列34所示的DNA和序列表的序列35所示的DNA；

所述(a)或(b)中，序列表的序列35所示DNA的5’末端连接有生物素；所述(a)或(b)中，所述序列表的序列35所示的DNA自5’末端第6位核苷酸标记有荧光素Cy3；

所述探针组V为如下(a)或(b)或(c)：

(a)由如下两种核苷酸序列的DNA组成的探针组：序列表的序列9所示DNA和序列表的序列10所示DNA；

(b)由如下两种核苷酸序列的DNA组成的探针组：在序列表的序列9所示DNA的5’末端连接特异片段得到的DNA和在序列表的序列10所示DNA的5’末端连接所述特异片段得到的DNA；所述特异片段为5-30个脱氧核糖核苷酸T组成的DNA；

(c)由如下两种核苷酸序列的DNA组成的探针组：在序列表的序列9所示DNA的5’末端连接特异片段得到的DNA和在序列表的序列10所示DNA的5’末端连接所述特异片段得到的DNA；所述特异片段为5-30个脱氧核糖核苷酸T组成的DNA，且5’末端第一位核苷酸修饰有氨基；

所述试剂组合物VI，由引物组VI和探针组VI组成；

所述引物组VI，为如下(a)或(b)：

(a)由如下三种核苷酸序列的DNA组成的引物组：序列表的序列36自5’末端第23至45位核苷酸所示的DNA、序列表的序列37自5’末端第23至43位核苷酸所示的DNA和序列表的序列38所示的DNA；

(b)由如下三种核苷酸序列的DNA组成的引物组：序列表的序列36所示的DNA、序列表的序列37所示的DNA和序列表的序列38所示的DNA；

所述(a)或(b)中，序列表的序列38所示DNA的5’末端连接有生物素；所述(a)或(b)中，所述序列表的序列38所示的DNA自5’末端第5位核苷酸标记有荧光素Cy3；

所述探针组VI为如下(a)或(b)或(c)：

(a)由如下两种核苷酸序列的DNA组成的探针组：序列表的序列11所示DNA和序列表的序列12所示DNA；

(b)由如下两种核苷酸序列的DNA组成的探针组：在序列表的序列11所示DNA的5’末端连接特异片段得到的DNA和在序列表的序列12所示DNA的5’末端连接所述特异片段得到的DNA；所述特异片段为5-30个脱氧核糖核苷酸T组成的DNA；

(c)由如下两种核苷酸序列的DNA组成的探针组：在序列表的序列11所示DNA的5’末端连接特异片段得到的DNA和在序列表的序列12所示DNA的5’末端连接所述特异片段得到的DNA；所述特异片段为5-30个脱氧核糖核苷酸T组成的DNA，且5’末端第一位核苷酸修饰有氨基；

所述试剂组合物VII，由引物组VII和探针组VII组成；

所述引物组VII，为如下(a)或(b)：

(a)由如下三种核苷酸序列的DNA组成的引物组：序列表的序列39自5’末端第24至46位核苷酸所示的DNA、序列表的序列40自5’末端第24至45位核苷酸所示的DNA和序列表的序列41所示的DNA；

(b)由如下三种核苷酸序列的DNA组成的引物组：序列表的序列39所示的DNA、序列表的序列40所示的DNA和序列表的序列41所示的DNA；

所述(a)或(b)中，序列表的序列41所示DNA的5’末端连接有生物素；所述(a)或(b)中，所述序列表的序列41所示的DNA自5’末端第4位核苷酸标记有荧光素Cy3；

所述探针组VII为如下(a)或(b)或(c)：

(a)由如下两种核苷酸序列的DNA组成的探针组：序列表的序列13所示DNA和序列表的序列14所示DNA；

(b)由如下两种核苷酸序列的DNA组成的探针组：在序列表的序列13所示DNA的5’末端连接特异片段得到的DNA和在序列表的序列14所示DNA的5’末端连接所述特异片段得到的DNA；所述特异片段为5-30个脱氧核糖核苷酸T组成的DNA；

(c)由如下两种核苷酸序列的DNA组成的探针组：在序列表的序列13所示DNA的5’末端连接特异片段得到的DNA和在序列表的序列14所示DNA的5’末端连接所述特异片段得到的DNA；所述特异片段为5-30个脱氧核糖核苷酸T组成的DNA，且5’末端第一位核苷酸修饰有氨基；

所述试剂组合物VIII，由引物组VIII和探针组VIII组成；

所述引物组VIII，为如下(a)或(b)：

(a)由如下三种核苷酸序列的DNA组成的引物组：序列表的序列42自5’末端第23至43位核苷酸所示的DNA、序列表的序列43自5’末端第23至44位核苷酸所示的DNA和序列表的序列44所示的DNA；

(b)由如下三种核苷酸序列的DNA组成的引物组：序列表的序列42所示的DNA、序列表的序列43所示的DNA和序列表的序列44所示的DNA；

所述(a)或(b)中，序列表的序列44所示DNA的5’末端连接有生物素；所述(a)或(b)中，所述序列表的序列44所示的DNA自5’末端第4位核苷酸标记有荧光素Cy3；

所述探针组VIII为如下(a)或(b)或(c)：

(a)由如下两种核苷酸序列的DNA组成的探针组：序列表的序列15所示DNA和序列表的序列16所示DNA；

(b)由如下两种核苷酸序列的DNA组成的探针组：在序列表的序列15所示DNA的5’末端连接特异片段得到的DNA和在序列表的序列16所示DNA的5’末端连接所述特异片段得到的DNA；所述特异片段为5-30个脱氧核糖核苷酸T组成的DNA；

(c)由如下两种核苷酸序列的DNA组成的探针组：在序列表的序列15所示DNA的5’末端连接特异片段得到的DNA和在序列表的序列16所示DNA的5’末端连接所述特异片段得到的DNA；所述特异片段为5-30个脱氧核糖核苷酸T组成的DNA，且5’末端第一位核苷酸修饰有氨基。

3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述微阵列芯片上还排列有阳性对照MC、阳性对照PC、阴性对照NC和阳性对照QC；所述阳性对照MC为序列表的序列17所示的DNA或在序列表的序列17所示DNA的5’末端连接特异片段得到的DNA；所述阳性对照PC为序列表的序列18所示的DNA或在序列表的序列18所示DNA的5’末端连接所述特异片段得到的DNA；所述阴性对照NC为序列表的序列19所示的DNA或在序列表的序列19所示DNA的5’末端连接所述特异片段得到的DNA；所述阳性对照QC为序列表的序列20所示的DNA或在序列表的序列20所示DNA的5’末端连接所述特异片段得到的DNA；所述特异片段为5-30个脱氧核糖核苷酸T组成的DNA，且5’末端第一位核苷酸修饰有氨基。

4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述特异片段为15个脱氧核糖核苷酸T组成的DNA，且5’末端第一位核苷酸修饰有氨基。

5.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括序列表的序列46所示的DNA和如下DNA(A)或(B)：

(A)序列表的序列45自5’末端第23至41位核苷酸所示的DNA；

(B)序列表的序列45所示的DNA。

6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述磁性颗粒为链霉亲和素包被的磁性颗粒；序列表的序列46所示DNA的5’末端连接有生物素，自5’末端第8位核苷酸标记有荧光素Cy3；序列表的序列17所示DNA的3’末端连接有生物素；序列表的序列20所示DNA的3’末端连接荧光素HEX。

7.辅助检测遗传性耳聋的引物组VIII，为如下(a)或(b)：

(a)由如下三种核苷酸序列的DNA组成的引物组：序列表的序列42自5’末端第23至43位核苷酸所示的DNA、序列表的序列43自5’末端第23至44位核苷酸所示的DNA和序列表的序列44所示的DNA；

(b)由如下三种核苷酸序列的DNA组成的引物组：序列表的序列42所示的DNA、序列表的序列43所示的DNA和序列表的序列44所示的DNA；

所述(a)或(b)中，序列表的序列44所示DNA的5’末端连接有生物素；所述(a)或(b)中，所述序列表的序列44所示的DNA自5’末端第4位核苷酸标记有荧光素Cy3。