CN111172250A - 一种检测药物性耳聋基因的探针组合物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种检测药物性耳聋基因的探针组合物及其应用，所述探针组合物包括检测C1494T位点的第一双链检测探针，和检测A1555G位点的第二双链检测探针。本发明采用待测位点的杂交寡核苷酸与其互补寡核苷酸构成双链检测探针，进行待测位点的检测，结合高分辨率熔解曲线，根据双链检测探针的熔解曲线特征峰和Tm值的变化，实现了在一个反应体系中检测不同基因型的目的，结果直观明了，准确性高。

Description

一种检测药物性耳聋基因的探针组合物及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，属于基因检测技术领域，涉及一种检测药物性耳聋基因的探针组合物及其应用，尤其涉及一种检测药物性耳聋基因C1494T和A1555G突变的探针组合物、试剂盒、检测方法及其应用。
背景技术
目前，传染病是世界上最主要的致死原因之一，全世界每年有超过1700万人死于细菌感染。氨基糖苷类抗生素，因其具有良好的抗菌活性和广谱抗菌性，被广泛应用于治疗由革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌引起的感染。但近年来发现，不合理使用氨基糖苷类抗生素可造成耳毒性和肾毒性。
线粒体DNA 12S rRNA基因C1494T和A1555G突变的携带者，在使用氨基糖苷类抗生素如链霉素、庆大霉素、卡那霉素和西索米星等临床常用药后，可能会造成不同程度的听力损伤，甚至完全致聋。据报道，每一位氨基糖苷类药物性耳聋敏感者具有10～14位携带此突变的亲属。由于线粒体遗传属于母系遗传，因此携带此突变的女性患者的后代几乎都为突变基因的携带者。语前聋不仅使得患儿无法进行正常交流，而且阻碍了患儿的正常智力发育，给家庭、社会和国家均带来极大的负担。因此，对新生儿进行遗传性耳聋筛查，对预防耳聋具有重要的意义。
目前，临床采用的新生儿听力筛查方法主要包括耳声发射测试(OAE)、自动听性脑干反应测试(ABR)和声阻抗鼓室导抗测试。其中，耳声发射测试(OAE)是最常用的新生儿听力筛查方法之一，具有安全、快速、无创伤的特点，测试两耳仅需10分钟，但是不能检查出神经的功能异常引发的耳聋，造成假阴性，且由于OAE测试受外耳道和中耳的影响较大，当存在外耳道堵塞、中耳渗液或中耳腔羊水残留的情况时，可暂时性出现传导功能障碍，造成假阳性，因此，新生儿需要至少接受3次OAE筛查才能确定是否存在听力障碍。自动听性脑干反应测试(ABR)可以评估耳蜗、听神经和脑干听觉通路的功能，准确性高，但是在检查时需要服用安眠药，每例的测定时间需40分钟左右，操作相对繁琐，费用较高，主要用于重症监护病房新生儿的检测，假阳性率较高。声阻抗鼓室导抗测试能够客观检测中耳传音系统的功能，但是不能发现药物性耳聋。
由于临床常用的新生儿听力筛查方法存在假阳或假阴问题，且不能检出药物性耳聋和迟发性耳聋，需要采用基因检测的方法明确真正的病因。目前市面上针对耳聋基因的检测试剂盒种类较少，主要采用的检测方法包括测序法、基因芯片法、PCR-RFLP法和高分辨率熔解曲线法等。但是这些方法存在一定的局限性。测序法准确性高、对未知突变具有预测性，基因芯片通量高，但是它们都需要特定的仪器和试剂，成本高，不利于在欠发达地区推广应用；PCR-RFLP法需要先进行PCR扩增、再对扩增产物进行开盖处理，有可能产生污染而出现假阳性结果；高分辨率熔解曲线法检测得到的野生型和突变型的Tm值差异较小，容易造成误判，且难以实现在同一个反应体系中检测两个位点的效果。
CN109234380A公开了遗传性耳聋相关基因检测试剂盒及特异性引物组，所述试剂盒虽然可以检测33个遗传性耳聋相关基因的突变位点，包括药物性耳聋易感基因12S rRNA基因的m.A1555G、m.C1494T位点，但是它是基于测序平台开发的，需要先构建文库再进行测序和序列比对分析，操作繁琐、耗时较长、成本较高，容易造成交叉污染。
CN105349624A公开了一种遗传性耳聋基因检测试剂盒，CN102787169A公开了一种应用于检测线粒体DNA A1555G、C1494T突变的混合液及试剂盒和检测系统，这两篇专利均以Ct值进行结果判断，判读结果容易受样本浓度、纯度等因素的影响，准确性低，而且检测位点数受检测通道受制，操作相对较繁琐，结果欠直观。
CN102864232A公开的耳聋易感基因联合检测试剂盒利用多重PCR结合导流杂交技术，对四种常见耳聋易感基因(mtDNA、GJB2、GJB3和SLC26A4)的13个突变位点及其正常对照进行检测，但是该方法在PCR结束后，仍需要开盖取出产物进行杂交检测，操作相对繁琐，耗时较长，开盖操作容易产生污染。
现有的基因检测方法普遍存在操作繁琐、耗时较长、通量较低、易产生污染或价格昂贵的问题，因此，需要一种新的操作简便快捷、灵敏度特异性高、通量高、经济的检测方法，实现在同一反应体系中，同时检测药物性耳聋相关位点12S rRNA的C1494T、A1555G突变的目的。
发明内容
针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供了一种检测药物性耳聋基因的探针组合物及其应用，所述探针组合物与熔解曲线分析相互配合，实现了在一个反应体系中同时检测药物性耳聋相关位点12S rRNA的C1494T和A1555G突变的效果，结果准确可靠、直观明了，检测方法简便快捷、成本低、无污染，易于推广应用。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种检测药物性耳聋基因的探针组合物，所述探针组合物包括检测C1494T位点的第一双链检测探针，和检测A1555G位点的第二双链检测探针；
所述第一双链检测探针包括与C1494T位点杂交的第一杂交寡核苷酸，和与所述第一杂交寡核苷酸部分互补的第一互补寡核苷酸；
所述第二双链检测探针包括与A1555G位点杂交的第二杂交寡核苷酸，和与所述第二杂交寡核苷酸部分互补的第二互补寡核苷酸；
所述第一杂交寡核苷酸标记有荧光基团和淬灭基团；
所述第二杂交寡核苷酸标记有荧光基团和淬灭基团；
所述第一互补寡核苷酸或第二互补寡核苷酸的3’端标记有淬灭基团。
本发明中，与待测位点结合的第一杂交寡核苷酸和第二杂交寡核苷酸的5’和3’端均标记有荧光基团和淬灭基团，而只有在第一互补寡核苷酸或第二互补寡核苷酸其中之一的3’端标记有淬灭基团，这样设置的原因在于使得第一双链检测探针和第二双链检测探针的熔解曲线具有不同的方向，有利于采用相同荧光通道实现对不同基因型的同时检测，结果直观明了，减少了不同基因型之间的相互干扰。
在本发明的一个具体实施例中，第一杂交寡核苷酸和第二杂交寡核苷酸的5’和3’端均标记有荧光基团和淬灭基团，第一互补寡核苷酸的3’端不标记淬灭基团而第二互补寡核苷酸的3’端标记有淬灭基团；在低温条件下，第一杂交寡核苷酸和第一互补寡核苷酸结合形成双链结构，第一杂交寡核苷酸的5’端荧光基团发光，随着温度的升高，双链结构解链，使得第一杂交寡核苷酸的5’端荧光基团被其3’端淬灭基团淬灭，形成了荧光信号随着温度升高而降低的趋势，对荧光的变化量与温度进行对数分析后呈现正向的特征峰；在低温条件下，第二杂交寡核苷酸和第二互补寡核苷酸结合形成双链结构，第二杂交寡核苷酸的5’端荧光基团被第二互补寡核苷酸3’端淬灭基团淬灭，随着温度的升高，双链结构解链，使得第二杂交寡核苷酸的5’端荧光基团发光，虽然第二杂交寡核苷酸的3’端淬灭基团对其5’端荧光基团同样具有淬灭作用，但是由于距离较远，淬灭作用较第二互补寡核苷酸3’端淬灭基团弱，因此形成了荧光信号随着温度升高而增强的趋势，对荧光的变化量与温度进行对数分析后呈现倒置的特征峰。
优选地，所述第一杂交寡核苷酸包括如SEQ ID NO:1所示的核酸序列；
P1：SEQ ID NO:1：CCGCCCGTCACTCTCCTCAAGTAT；
所述第一互补寡核苷酸包括如SEQ ID NO:2所示的核酸序列；
P2：SEQ ID NO:2：ATACGTGAGTAGAGTGACTGGAGG；
所述第二杂交寡核苷酸包括如SEQ ID NO:3所示的核酸序列；
P3：SEQ ID NO:3：CCATGTTACGACTTGCCTCCTCTATATAAATG；
所述第二互补寡核苷酸包括如SEQ ID NO:4所示的核酸序列；
P4：SEQ ID NO:4：CATTGATATATAGGAGGCAAGTAGTAGCATGG。
本发明中，采用待测位点的杂交寡核苷酸与其互补寡核苷酸构成双链检测探针，进行待测位点的检测，结合高分辨率熔解曲线，根据双链检测探针的熔解曲线特征峰和Tm值的变化，实现了在一个反应体系中检测不同基因型的目的，结果直观明了，准确性高。
本发明中，如SEQ ID NO:1～2所示的寡核苷酸为部分互补的双链检测探针，用于检测C1494T位点，如SEQ ID NO:3～4所示的寡核苷酸为部分互补的双链检测探针，用于检测A1555G位点，发明人通过对双链检测探针的两条链进行碱基优化，形成了特征峰位置、方向和Tm值的显著不同的两条熔解曲线。
本发明中，正峰和负峰分别代表一个基因型，结果判读直观明了，不会误判；而目前其它的熔解曲线产品形成的熔解峰均为正峰，仅通过熔解峰的Tm值或△Tm判读基因型，存在的问题是野生型基因和突变基因型的Tm值太过接近，相互之间容易干扰，当模板的质量有异常、体系有偏差或更换了实验仪器的品牌型号时，Tm值或△Tm发生变化，给实验结果的判读带来较大的难度。
第二方面，本发明提供了一种检测药物性耳聋基因的试剂盒，所述试剂盒包括如第一方面所述的探针组合物，反应体系中第一杂交寡核苷酸和第二杂交寡核苷酸的终浓度为200～400nM，第一互补寡核苷酸和第二互补寡核苷酸的终浓度为400～800nM。
优选地，所述试剂盒还包括PCR扩增引物，反应体系中上游引物和下游引物的终浓度为400～600nM。
优选地，所述PCR扩增引物包括如SEQ ID NO:5～6所示的核酸序列；
P5：SEQ ID NO:5：TTAGTTGAACAGGGCCCTGAAG；
P6：SEQ ID NO:6：CCTAAGTGTAAGTTGGGTGCTTTG。
本发明中，采用如SEQ ID NO:5～6所示的引物对样本进行PCR扩增，获得的扩增产物包含了所要检测的两个位点。
优选地，所述试剂盒还包括酶混合液、dNTP混合液和PCR缓冲液。
优选地，所述酶混合液包括DNA聚合酶和/或UNG酶，DNA聚合酶例如可以是Taq DNA聚合酶，在反应体系中的终浓度为2～3U，UNG酶在反应体系中的终浓度为0.3～0.5U。
优选地，所述dNTP混合液包括dATP、dCTP、dGTP和dUTP，dNTP混合液是dATP、dCTP、dGTP和dUTP的等体积混合液，在反应体系中dATP、dCTP、dGTP和dUTP的终浓度均为200μM。
本发明中，采用UNG酶/dUTP防止PCR污染，原理为在扩增过程中以dUTP代替dTTP，从而得到含有dUTP的扩增产物，尿苷酶(UNG)能特异地破坏含有dUTP的核酸，使之不能作为扩增模板，但对天然的不含dUTP的核酸不起作用，故在扩增反应前加入UNG酶，破坏反应液中含有dUTP的核酸，随后将UNG酶灭活，再进行扩增，有效地防止了实验室内扩增产物的污染，避免假阳性的出现。
优选地，所述PCR缓冲液中含有Mg2+，反应体系中Mg2+的终浓度为1.5-9mM。
优选地，所述试剂盒还包括阴性质控品和/或阳性质控品。
优选地，所述阴性质控品包括C1494T和A1555G突变阴性的样本。
优选地，所述阳性质控品包括C1494T突变阳性的样本和/或A1555G突变阳性的样本。
第三方面，本发明提供了一种检测药物性耳聋基因的体系，所述体系包括如第一方面所述的探针组合物。
优选地，所述探针组合物中的第一杂交寡核苷酸和第二杂交寡核苷酸的浓度为200～400nM，例如可以是200nM、300nM或400nM。
优选地，所述探针组合物中的第一互补寡核苷酸和第二互补寡核苷酸的浓度为400～800nM，例如可以是400nM、500nM、600nM、700nM或800nM。
本发明中，将第一互补寡核苷酸或第二互补寡核苷酸的浓度设置为大于第一杂交寡核苷酸或第二杂交寡核苷酸的浓度，有利于第一或第二互补寡核苷酸跟第一或第二杂交寡核苷酸充分结合形成典型的特征峰，避免出现假阳性结果。
优选地，所述体系还包括PCR扩增引物和DNA模板。
优选地，所述PCR扩增引物包括如SEQ ID NO:5～6所示的核酸序列。
优选地，所述PCR扩增引物的浓度为400～600nM，例如可以是400nM、500nM或600nM。
优选地，所述DNA模板的用量为10～40ng，例如可以是10ng、20ng、30ng或40ng。
优选地，所述体系还包括酶混合液、dNTP混合液和PCR缓冲液。
优选地，所述酶混合液包括DNA聚合酶和/或UNG酶。
优选地，所述DNA聚合酶的浓度为2～3U，例如可以是2U、2.5U或3U。
优选地，所述UNG酶的浓度为0.3～0.5U，例如可以是0.3U、0.4U或0.5U。
优选地，所述dNTP混合液包括dATP、dCTP、dGTP和dUTP。
优选地，所述dNTP混合液的浓度为100～300μM，例如可以是100μM、200μM或300μM。
优选地，所述PCR缓冲液中含有Mg2+。
优选地，所述Mg2+的浓度为1.5～9mM，例如可以是1.5mM、2mM、2.5mM、3mM、3.5mM、4mM、4.5mM、5mM、5.5mM、6mM、6.5mM、7mM、7.5mM、8mM、8.5mM或9mM。
第四方面，本发明提供了一种检测药物性耳聋基因的方法，包括以下步骤：
采用如第一方面所述的探针组合物、如第二方面所述的试剂盒或如第三方面所述的体系对样本DNA进行荧光定量PCR，随后进行熔解曲线分析，根据熔解曲线的特征峰判断样本的药物性耳聋基因突变类型。
根据本发明，退火温度和退火时间对PCR扩增效率和扩增特异性具有显著的影响，退火温度偏低或退火时间过长会造成非特异性扩增，导致假阳性结果，退火温度偏高或退火时间过短会造成扩增效率偏低，导致灵敏度下降；本发明控制退火温度和退火时间，经过对比优化，确定最佳的反应条件为：
所述荧光定量PCR的条件为：
50℃预反应2～10min，90～95℃预变性5～10min；95℃变性10～30s，58～62℃退火30～90s，30～45个循环；72℃延伸5min；
所述熔解曲线分析的条件为：
95℃变性10～30s，30～45℃保持30～60s，检测温度范围为30～80℃，每步升高0.5℃，每秒升高1℃，采集1次荧光数据。
优选地，所述药物性耳聋基因突变类型的判断依据为：
同时出现一正一负的第一双链检测探针和第二双链检测探针的特征峰，判断样本不存在C1494T和A1555G突变；
正负峰之一消失，仅出现第二双链检测探针的特征峰，判断样本存在C1494T突变；
正负峰之一消失，仅出现第一双链检测探针的特征峰，判断样本存在A1555G突变。
本发明中，采用单通道双重探针扩增结合高分辨率熔解曲线，进行基因检测，两条双链探针在进行熔解曲解分析时，会形成不同的特异性熔解峰和Tm值；当目标模板存在时，荧光标记的杂交寡核苷酸与模板结合而被消耗，而不能与互补寡核苷酸结合，在进行熔解曲线分析时，该探针的特异性熔解峰消失；当目标模板不存在时，荧光标记的杂交寡核苷酸与其互补寡核苷酸结合，在进行熔解曲线分析时，该探针的特异性熔解峰和Tm值出现。
本发明根据特异性熔解峰方向、位置和Tm值的出现情况，判断某一基因或突变型是否存在，整个检测过程在一个反应体系中完成，简便快捷，闭管操作无污染，结果判读直观明了，抗干扰能力强，准确性高。
第五方面，本发明提供了一种如第一方面所述的探针组合物、如第二方面所述的试剂盒或如第三方面所述的体系在制备药物性耳聋基因诊断试剂中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明采用待测位点的双链检测探针进行目标位点的扩增，结合高分辨率熔解曲线，实现了对药物性耳聋基因线粒体DNA 12S rRNA基因的C1494T和A1555G突变进行分型检测；
(2)本发明的试剂盒以熔解曲线的正负峰及对应的Tm值来区分不同的基因型，比普通的熔解曲线仅依靠Tm值来区分基因型更直观，抗干扰能力更强；
(3)本发明的试剂盒不受设备荧光通道的限制，可以在同一个反应管同一个通道内同时完成两个位点的检测，检测体系固定在一个反应管中，闭管操作，避免了交叉污染和环境污染；
(4)本发明的检测方法具有高灵敏度、高特异性、高准确度、高精确度、操作简便的优点，结果判读直观、客观，对药物性耳聋的预防具有重要的现实意义。
附图说明
图1为阴性质控品的熔解曲线；
图2为C1494T阳性质控品的熔解曲线；
图3为A1555G阳性质控品的熔解曲线。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1试剂盒的组成
本实施例提供了一种检测药物性耳聋基因线粒体DNA 12S rRNA的C1494T和A1555G突变位点的试剂盒，包括检测C1494T位点的第一双链检测探针、检测A1555G位点的第二双链检测探针、PCR扩增引物、Taq DNA聚合酶、UNG酶、dNTP混合液(dATP、dCTP、dGTP和dUTP)、10×PCR缓冲液(含有Mg2+)、阴性质控品和阳性质控品；
其中，检测C1494T位点的第一双链检测探针由P1和P2杂交形成，P1的5’修饰有FAM、3’修饰有BHQ1，序列如SEQ ID NO:1所示，P2未修饰有荧光基团和淬灭基团，序列如SEQID NO:2所示；
检测A1555G位点的第二双链检测探针由P3和P4杂交形成，P3的5’修饰有FAM、3’修饰有BHQ1，序列如SEQ ID NO:3所示，P4的3’修饰有BHQ1，序列如SEQ ID NO:4所示；
PCR扩增引物包括上游引物F(SEQ ID NO:5)和下游引物R(SEQ ID NO:6)。
反应体系如表1所示；
表1 PCR反应体系
试剂名称 用量
10×PCR缓冲液 2.5μL
MgCl<sub>2</sub> 2.5mM
dNTP混合液 200μM
上游引物F 500nM
下游引物R 500nM
探针P1 400nM
探针P2 800nM
探针P3 200nM
探针P4 800nM
Taq DNA聚合酶 2.5U
UNG酶 0.3U
DNA模板 20ng
超纯水 补齐至25μL
实施例2 PCR反应条件
采用实施例1的试剂盒对样本进行PCR检测，从试剂盒中取出试剂置于室温融化并振荡混匀，2000rpm离心10s；设所需要的PCR反应管管数为n，n＝待检样本数+1管阴性质控品+2管阳性质控品，取一干净的1.5mL EP管，按每管取2×PCR反应液12.5nμL与10.5nμL超纯水的比例混匀；将现配PCR反应液以23μL/管分装n管；
向各PCR反应管中分别加入待检样本DNA、阴性质控品DNA和阳性质控品DNA各2μL，盖紧管盖，短暂离心后置于荧光定量PCR仪中并记录样本摆放顺序。
反应条件为50℃预反应2min，95℃预变性5min；95℃变性20s，62℃退火60s，35个循环；72℃延伸5min；
熔解曲线分析的条件为：
95℃变性20s，40℃保持45s，检测温度范围为30～80℃，每步升高0.5℃，每秒升高1℃，采集1次荧光数据，熔解曲线采用软件进行分析，分析时选择的荧光通道为FAM；
质控标准见表2，阴性质控品必须无扩增信号，即必须有一个正峰和一个负峰，否则本次实验无效；如出现除特征Tm值之外的峰值，纵轴荧光值(-dF/dT)值低于5(耶拿Toptical Gradient 96)，则为非特异性扩增产物，不影响对结果的判读。
表2质控标准
Figure BDA0002398698240000131
阴性质控品、C1494T阳性质控品和A1555G阳性质控品的熔解曲线分别如图1、图2和图3所示，阴性质控品的熔解曲线有一正一负的双峰，C1494T阳性质控品有一个负峰(Tm值为50-54℃)，A1555G阳性质控品有一个正峰(Tm值为56-61℃)。
实施例3临床样本中药物性耳聋基因型的检测
利用实施例1的试剂盒、采用实施例2的反应体系和反应条件，对100例临床样本进行检测，所有样本均采用金标准测序法进行测序验证，检测结果见表3，统计分析对比结果见表4。
表3临床样本中耳聋发生情况
Figure BDA0002398698240000141
Figure BDA0002398698240000151
Figure BDA0002398698240000161
Figure BDA0002398698240000171
Figure BDA0002398698240000181
表4本发明试剂盒检测结果和测序结果对比
Figure BDA0002398698240000182
Figure BDA0002398698240000191
表4中，测序结果阳性是指本发明试剂盒检测范围内基因型阳性或检测范围外其它基因型阳性的数量，测序结果阴性是指本发明试剂盒检测范围内基因型阴性的数量；本发明检测结果阳性是指本发明试剂盒检测范围内基因型阳性的数量，本发明检测结果阴性是指本发明试剂盒检测内基因型阴性和检测范围外其它基因型阳性或者阴性的数量。
由表4可知，与金标准测序结果对比，本发明的试剂盒检测100例临床样本的准确性为100％；对非本试剂盒检测范围的其他位点的突变阳性(GJB2：235delC纯合和A1438G纯合)和阴性样本，本试剂盒的检测结果均为阴性，阴性符合率为100％，特异性为100％。
本发明的试剂盒对100例临床样本的检测结果和金标准测序结果的对比分析统计见表5。
表5 100例临床样本各基因型测序结果和试剂盒检测结果符合情况统计
Figure BDA0002398698240000192
Figure BDA0002398698240000201
由表5可以看出100例临床样本中各耳聋基因型的分布情况，本试剂盒检测范围内的2种突变均存在，且试剂盒的检测准确性和特异性均为100％，本发明的试剂盒可满足药物性耳聋的临床筛查需求。
综上所述，本发明将单通道多重探针扩增与高分辨率溶解曲线相结合，构建的试剂盒和检测方法实现了对药物性耳聋基因线粒体DNA 12S rRNA基因的C1494T和A1555G突变进行分型检测，灵敏度高，可准确检测低至5ng的模板DNA样品(只需1滴血)，特异性好，有效避免了假阳性和假阴性结果的产生，准确性高，检测结果与测序结果完全一致，无污染体系，全密闭检测，无需开盖，一定程度上预防了交叉污染的发生，操作简单，易学易用，稳定性好，可靠性高。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 肇庆医学高等专科学校
<120> 一种检测药物性耳聋基因的探针组合物及其应用
<130> 20200302
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
ccgcccgtca ctctcctcaa gtat 24
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
atacgtgagt agagtgactg gagg 24
<210> 3
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
ccatgttacg acttgcctcc tctatataaa tg 32
<210> 4
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
cattgatata taggaggcaa gtagtagcat gg 32
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 5
ttagttgaac agggccctga ag 22
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 6
cctaagtgta agttgggtgc tttg 24

Claims (10)

1.一种检测药物性耳聋基因的探针组合物，其特征在于，所述探针组合物包括检测C1494T位点的第一双链检测探针，和检测A1555G位点的第二双链检测探针；
所述第一双链检测探针包括与C1494T位点杂交的第一杂交寡核苷酸，和与所述第一杂交寡核苷酸部分互补的第一互补寡核苷酸；
所述第二双链检测探针包括与A1555G位点杂交的第二杂交寡核苷酸，和与所述第二杂交寡核苷酸部分互补的第二互补寡核苷酸；
所述第一杂交寡核苷酸标记有荧光基团和淬灭基团；
所述第二杂交寡核苷酸标记有荧光基团和淬灭基团；
所述第一互补寡核苷酸或第二互补寡核苷酸的3’端标记有淬灭基团。
2.根据权利要求1所述的探针组合物，其特征在于，所述第一杂交寡核苷酸包括如SEQID NO:1所示的核酸序列；
优选地，所述第一互补寡核苷酸包括如SEQ ID NO:2所示的核酸序列；
优选地，所述第二杂交寡核苷酸包括如SEQ ID NO:3所示的核酸序列；
优选地，所述第二互补寡核苷酸包括如SEQ ID NO:4所示的核酸序列。
3.一种检测药物性耳聋基因的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1或2所述的探针组合物；
优选地，所述试剂盒还包括PCR扩增引物；
优选地，所述PCR扩增引物包括如SEQ ID NO:5～6所示的核酸序列。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括酶混合液、dNTP混合液和PCR缓冲液；
优选地，所述酶混合液包括DNA聚合酶和/或UNG酶；
优选地，所述dNTP混合液包括dATP、dCTP、dGTP和dUTP；
优选地，所述PCR缓冲液中含有Mg2+。
5.根据权利要求3或4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阴性质控品和/或阳性质控品；
优选地，所述阴性质控品包括C1494T和A1555G突变阴性的样本；
优选地，所述阳性质控品包括C1494T突变阳性的样本和/或A1555G突变阳性的样本。
6.一种检测药物性耳聋基因的体系，其特征在于，所述体系包括如权利要求1或2所述的探针组合物；
优选地，所述探针组合物中的第一杂交寡核苷酸和第二杂交寡核苷酸的浓度为200～400nM；
优选地，所述探针组合物中的第一互补寡核苷酸和第二互补寡核苷酸的浓度为400～800nM；
优选地，所述体系还包括PCR扩增引物和DNA模板；
优选地，所述PCR扩增引物包括如SEQ ID NO:5～6所示的核酸序列；
优选地，所述PCR扩增引物的浓度为400～600nM；
优选地，所述DNA模板的用量为10～40ng；
优选地，所述体系还包括酶混合液、dNTP混合液和PCR缓冲液；
优选地，所述酶混合液包括DNA聚合酶和/或UNG酶；
优选地，所述DNA聚合酶的浓度为2～3U；
优选地，所述UNG酶的浓度为0.3～0.5U；
优选地，所述dNTP混合液包括dATP、dCTP、dGTP和dUTP；
优选地，所述dNTP混合液的浓度为100～300μM；
优选地，所述PCR缓冲液中含有Mg2+；
优选地，所述Mg2+的浓度为1.5～9mM。
7.一种检测药物性耳聋基因的方法，其特征在于，包括以下步骤：
采用如权利要求1或2所述的探针组合物、如权利要求3-5任一项所述的试剂盒或如权利要求6所述的体系对样本DNA进行荧光定量PCR，随后进行熔解曲线分析，根据熔解曲线的特征峰判断样本的药物性耳聋基因突变类型。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述荧光定量PCR的条件为：
50℃预反应2～10min，90～95℃预变性5～10min；95℃变性10～30s，58～62℃退火30～90s，30～45个循环；72℃延伸5min；
优选地，所述熔解曲线分析的条件为：
95℃变性10～30s，30～45℃保持30～60s，检测温度范围为30～80℃，每步升高0.5℃，每秒升高1℃，采集1次荧光数据。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述药物性耳聋基因突变类型的判断依据为：
同时出现一正一负的第一双链检测探针和第二双链检测探针的特征峰，判断样本不存在C1494T和A1555G突变；
正负峰之一消失，仅出现第二双链检测探针的特征峰，判断样本存在C1494T突变；
正负峰之一消失，仅出现第一双链检测探针的特征峰，判断样本存在A1555G突变。
10.一种如权利要求1或2所述的探针组合物、如权利要求3-5任一项所述的试剂盒或如权利要求6所述的体系在制备药物性耳聋基因诊断试剂中的应用。
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