CN1166784C - 标记核糖核酸的方法和由此得到的标记的rna片段 - Google Patents

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    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/682—Signal amplification

Abstract

本发明涉及伴信号放大的标记核糖核酸(RNA)的方法，特征在于其包括：断裂RNA，将第一配体固定到位于所述RNA各片段的3’端和/或5’端的末端磷酸上，所述末端磷酸已在断裂过程中被释放，和将标记剂结合到所述第一配体上。本发明优选应用于医学诊断领域。

Description

标记核糖核酸的方法和由此 得到的标记的RNA片段
发明领域
本发明涉及一种伴信号放大的标记核糖核酸(RNA)的新方法。
发明背景
现有技术显示，有很多方法用于标记核苷酸、寡核苷酸或核酸；寡核苷酸和核酸用术语多核苷酸表示。多核苷酸可在合成中被标记或通过掺入至少一个标记的核苷酸而被标记。
第一种方法包括将标记连到碱基上，无论后者是天然碱基或经修饰的碱基。第二种方法将标记连到糖上，也无论后者是天然糖或经修饰的糖。第三种方法涉及将标记连到磷酸上。
事实上，本领域技术人员都倾向于将标记连到碱基或糖上来标记核苷酸或核苷酸类似物或核酸，这会给他们带来更多的便利和更多的选择。而且，这是研究了大量文件得出的，如EP-A-0.329.198，EP-A-0.302.175，EP-A-0.097.373，EP-A-0.063.879，US-A-5,449,767，US-A-5,328,824，WO-A-93/16094，DE-A-3.910.151和EP-A-0.567.841涉及碱基，或EP-A-0.286.898涉及糖。各文件在此引作参考用于所有目的。
将标记连到磷酸的技术更为复杂，尤其是因为核酸是水溶性的，而磷酸在该介质中的反应性比在有机溶剂中低。
尽管这样，一些文件已经提出了标记磷酸的技术，如文件EP-A-0.280.058，在此引作参考用于所有目的，其描述了将标记连到磷酸来标记核苷酸的方法，当所述核苷酸是脱氧核糖核苷酸时，标记的磷酸连在糖的3’和/或5’位上；当所述核苷酸是核糖核苷酸时，标记的磷酸连在糖的2’，3’和/或5’位上。该文件也描述了包含至少一个如上所述的标记的核苷酸的多核苷酸或寡核苷酸；该核苷酸在合成过程中被掺入多核苷酸或寡核苷酸中。
然而，文件EP-A-0.280.058提出的标记方案不能均匀地标记核酸。标记的核苷酸掺入多核苷酸不受控制，它完全取决于合成的多核苷酸的组成。因此，一些多核苷酸可能含有大量标记的核苷酸，而其他的可能根本不含标记的核苷酸。其结果是这些核酸发射的信号强度不均匀，因此当检测核酸时难以解释结果。
在这种情况下，标记通过生物学方法掺入，标记的核苷酸的位置不受任何控制。
文件US-A-5,317,098在此引作参考用于所有目的，涉及在其5’端被标记的核酸。该连接使用咪唑和一个连接臂。没有与标记相关联的断裂。此外，磷酸被加至核酸，因此用激酶作为引入磷酸的手段，导致至少一个附加的生物学步骤。该文件描述了对15聚体的寡核苷酸的标记。当用大分子核酸而不是寡核苷酸时，该技术使得标记仅仅存在于5’端并且标记的核酸的特异性活性是低的。
另外，当对大分子核酸进行标记而不经过断裂阶段，也称为裂解阶段时，这些标记的核酸与其互补序列的杂交动力学是慢的，以至造成了低的杂交收率。这因此造成信号在数量和质量上的丢失。位阻在该反应中是关键因素。
位阻不仅仅由核酸的长度产生，也由二级结构的存在产生。断裂帮助打破(或减少)这些结构，并因此使得杂交最优化。位阻在与包含高密度捕获探针的固体表面的杂交中起着尤其重要的作用，如Affymetrix公司开发的DNA阵列(“用高密度DNA阵列存取遗传信息”，M.Chee等，科学(Science)，274，610-614，1996。“光生成的寡核苷酸阵列用于快速DNA序列分析”，A.Caviani Pease等，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，91，5022-5026，1994，US-5744 305，US-5 445 934)。各文件在此引作参考用于所有目的。在该技术中，捕获探针的大小通常减少，长度大约20个核苷酸。
现有技术中描述了许多断裂核酸的方法。
首先，断裂可以是酶促的，即核酸可被核酸酶(DNA酶或RNA酶)断裂(酶学方法(Methods in Enzymol.)，vol.152，S.Berger和A.Kimmel，ed.Academic Press，1987，酶技术和重组DNA技术(Enzymatic techniques和Recombinant DNA technology)，《分子克隆指南》，p91-110，分子克隆，实验室指南，J.Sambrook，E.F.Fritsch和T.Maniatis，冷泉港实验室出版社，第2版，p5.30-5.95，1989)。各文件在此引作参考用于所有目的。
取决于涉及的酶，该反应生成了在其5’或3’端有羟基或单磷酸基团的小片段或单体。
其次，断裂可以是化学的。例如，对于DNA序列，用烷化剂脱嘌呤或脱嘧啶作用生成脱碱基位点，然后在碱的存在下通过称为“β-消除”的机制将其断裂(T.Lindahl等，双链脱氧核糖核酸在无嘌呤位点的链断裂速率，生物化学(Biochemistry)，11，p3618-3623，1972)。DNA尤其可被氧化、烷化或自由基加成机制断裂(M.Liuzzi等，用甲氧胺对γ照射和OsO4处理的DNA的表征和损伤，国际放射生物学杂志(Int.J.Radiat.Biol.)，54，p709-722，1988).金属阳离子经常与用作化学催化剂的有机分子如咪唑组合，用于RNA的断裂(R.Breslow和R.Xu，核酸化学中的识别和催化，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，90，p1201-1207，1993.J.Hovinen等，咪唑栓系的寡核苷酸：合成和RNA裂解活性，有机化学杂志(J.Org.Chem.)，60，p2205-2209，1995)。该断裂优选在碱性介质中进行，产生有3’磷酸末端的片段。各文件在此引作参考用于所有目的。
然而，这些断裂的目的并不是易化或允许标记。
文件WO-A-88/04300提供了一种断裂和标记RNA的方法，其利用具有酶活特的RNA分子，即核酶。用这些核酶进行裂解催化是序列特异性的，反应生成5’端有羟基基团(OH)和3’端为单磷酸的RNA片段。然后通过掺入一个来源于GTP分子的附加的放射性磷酸来实现标记(只是放射性标记)。这是属于这些核酶的磷酸转移酶的活性，即激酶活性。所述放射性磷酸的结合只在5’端的羟基基团上实现，没有来自断裂的磷酸被用于将标记连到RNA片段上。此外，断裂只能通过核酶进行，意味着核酶与所要裂解的目标核酸之间存在特异性。然后，磷酸作为标记起作用。
我们的发明允许将标记连到在裂解过程中释放出的核酸片段的磷酸上，其中不存在特异性，因此任何类型的核酸能以随机方式断裂。用该方法能得到均匀的标记强度，因为每类生成片段的标记产率完全独立于其序列和组成。因此，我们的方法使得例如制备检测探针成为可能。最后，磷酸只是核酸和标记之间的连接臂。
信号放大技术在免疫测定领域，或例如在WO95/08000中描述的核酸探针，或发表在组织化学细胞化学杂志(J.Histochem.Cytochem.)45：481-491，1997的文章中(各文件在此引作参考用于所有目的)是熟知的，但是在标记过程中没有相关的断裂。
现有技术中未描述伴信号放大的标记之前的断裂过程。
所以本发明提供了一种克服先前所述缺点的方法。因此，该方法使一旦断裂完成得到均匀标记的RNA片段成为可能。另外，断裂使获得对可能的杂交具有最适大小的片段成为可能。随着杂交质量的提高，杂交后检测标记的片段将更快更有效。最后，发明通过增加产生的信号强度和信号/背景比提高了灵敏度。
发明概述
为此，本发明涉及一种标记合成的或天然的核糖核酸(RNA)的方法，特征在于其包括：
-断裂RNA，
-将第一配体固定于位于所述RNA各片段的3’端和/或5’端的末端磷酸，所述末端磷酸已经在断裂过程中被释放，和
-将标记剂结合到所述第一配体上。
发明详述
在本发明中，RNA(核糖核酸或多核糖核苷酸)是合成或天然RNA。
本领域技术人员熟知获得合成RNA的方法。这些方法包括：如扩增技术(参见，例如Kozal M.J.等，自然医学(NatureMedicine)，2(7)，753-758，1996，在此全文引作参考用于所有目的)，转录扩增技术或其他获得RNA产物的方法包括TMA(转录介导的扩增)，NASBA(基于核酸序列的扩增)，3SR(自动维持序列扩增)，Qβ复制酶扩增，用酶消化天然RNA和多核苷酸化学合成(参见，如美国专利5,554,516和5,766,849和临床微生物综述(Clin.Microbiol.Rev.)，5(4)，p370-386，1992.各文件在此全文引作参考用于所有目的)。合成RNA也是RNA，其包括至少一个经修饰的核苷酸或至少一个经修饰的核苷酸间键如硫代磷酸。天然RNA是从细胞中提取得到的RNA，如信使RNA(mRNA)、核糖体RNA(rRNA)或转运RNA(tRNA)。标记过程是连接一个能够产生可检测信号的标记。下面非限定列出这些标记：
●产生可检测信号的酶，如通过比色法、荧光和发光来检测，如辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶。
●发色团，如荧光和发光化合物和染料。
●具有能被电子显微镜或通过其电特性，如传导性、电流分析、电压测量和电阻等检测的电子密度的基团。
●可检测基团，如其分子大小足以诱导在其物理和/或化学特性上可检测的修饰；这种检测可通过光学方法(如衍射、表面胞质团共振，表面变异和接触变异角度)或物理方法(如原子力谱学和隧道效应)实现。
●放射性分子，如32P，35S或125I。
包含标记的化合物是标记剂。
术语“固定”意思是创建共价或非共价键。磷酸或硫代磷酸的选择性抗体是创建非共价键的方法。根据优选的操作模式，固定如实施例所述是共价的。
在本发明的一个方面，断裂和固定在一个步骤中实现。
在本发明的另一个方面，断裂和固定在两个步骤中实现。
根据第一个实施方案，标记剂与第一配体的结合是共价的。本领域技术人员熟知允许共价偶联的不同反应基团，一些轭合的实施例可在“生物轭合技术”《Bioconjugate techniques》Hermanson G.T.，Academic Press，San Diego，1996中找到，在此全文引作参考用于所有目的。
根据第二个实施方案，标记剂与第一配体的结合是非共价的。非共价结合是包括如离子或静电相互作用、范得瓦耳斯相互作用、氢键或不同相互作用组合的结合。
在优选的实施方案中，标记剂结合到所述第一配体是非直接进行的。固定到末端磷酸的第一配体结合到第一抗配体，所述第一抗配体结合到第二配体，而标记剂是带有至少一个标记的第二抗配体并能与所述第二配体反应。
(抗配体/配体)组合意思是能以特异性方式一起反应的两种化合物。
第一配体/第一抗配体和第二配体/第二抗配体组合选自如生物素/链霉抗生物素、半抗原/抗体、抗原/抗体、肽/抗体，糖/凝集素和多核苷酸/互补多核苷酸。
这些不同的组合和其他组合是已知的，例如在BioMerieux的申请WO 96/19729，WO 94/29723，WO 95/08000中记载，本文引作参考。
第一和第二配体是相同或不同的。
在优选操作模式中，第一配体是荧光素衍生物，第二配体是生物素衍生物。
在另一个优选操作模式中，第一配体是生物素衍生物，第一抗配体是链霉抗生物素衍生物。
对堆积其他实体(配体/抗配体)来增强信号放大设有限制。例如，一个(第二配体/第一抗配体)实体结合到固定至磷酸上的第一配体，然后一个(第三配体/第二抗配体)实体结合到第二配体，而标记剂是带有至少一个标记的第三抗配体并能与第三配体反应。
不同实体的加入可以在至少一个步骤中进行或可以在配体固定到磷酸后先后加入各实体。
根据优选的操作模式，将第一配体固定到RNA各片段的3’端，是远离构成起始RNA的3’和/或5’端的片段进行的。另外或可选择的，将第一配体固定到RNA各片段的5’端，是远离构成起始RNA的5’端的片段进行的。
无论哪个实施方案，将第一配体固定到RNA片段的3’端或5’端是通过将第一配体携带的反应基团与磷酸反应来实现的，所述磷酸相对于核糖位于2’位，3’位或环单磷酸2’-3’位。
断裂和/或将第一配体固定到RNA片段的3’端或5’端是通过配体携带的亲核、亲电子或卤素基团与磷酸结合来实现的，所述磷酸相对于核糖位于2’位，3’位或环单磷酸2’-3’位。
RNA断裂是通过酶促、化学或物理方法实现的。
RNA的酶促断裂通过核酸酶进行。
RNA的化学断裂通过金属阳离子进行，其中金属阳离子可以与或不与化学催化剂联合。
在这种情况下，金属阳离子是Mg++，Mn++，Cu++，Co++和/或Zn++离子，而化学催化剂包括咪唑，取代的类似物，如N-甲基咪唑，或任何对RNA有亲和力和带有咪唑环的化学分子或取代的类似物。
RNA的物理断裂通过超声或照射进行。
在所有情况下，第一配体固定到RNA片段的3’端或5’端是通过反应分子R-X实现的，其中R包括配体，X是反应基团，如羟基、胺、肼、烷氧基胺、烷基卤、苯甲基卤、碘乙酰胺或马来酰亚胺。X与连接于核糖的2’位，3’位或环单磷酸2’-3’位的磷酸反应。在优选的实施方案，X为烷基卤、苯甲基卤、碘乙酰胺或马来酰亚胺。为便于固定配体，连接臂任选存在于配体和反应基团之间。在优选的实施方案中，R-X是N-(生物素基)-N’-(碘乙酰基)乙二胺，(+)-生物素基-碘乙酰胺基-3，6-二氧杂辛烷二胺，N-碘乙酰基-N-生物素亚己基二胺，5-(溴甲基)荧光素。
本发明也包括通过上述方法得到的RNA片段。所述RNA片段在3’端或5’端具有单个核苷酸，所述核苷酸在断裂过程中释放出来的末端磷酸上被标记。
该RNA片段包括10-150个核苷酸，优选30-70个核苷酸并优选40-60个核苷酸以利于RNA片段与探针或目标的杂交。
根据优选实施方案，所述RNA片段包括至少一个硫代磷酸核苷酸。
另外，携带配体的核苷酸是硫代磷酸核苷酸。
根据优选实施方案，所述RNA片段在3’端包含磷酸或硫代磷酸，所述磷酸或硫代磷酸带有荧光素，荧光素结合至带有至少一个生物素的抗荧光素抗体，所述抗体结合到标记的链霉抗生物素。
本发明涉及如上所述的RNA片段，作为探针检测RNA和/或DNA或RNA片段和/或DNA片段的用途。
本发明最后涉及如上所述的RNA片段，作为能与捕获探针结合的标记的目标的用途。
附图简要说明：
图1显示在Mn++阳离子和咪唑存在下化学断裂RNA的图解。
图2显示用带有亲核基团的配体断裂和标记RNA的可能机制的图解。
附图和实施例代表特定的实施方案，不能视为限制本发明的范围。
实施例1：RNA扩增子在LDC(裂解过程中标记)中的信号放大。
1.1扩增子的制备：
从分离菌中，用刮匙末端刮取一个或两个新鲜生长的细菌菌落(结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)(ATCC-27294)，在Lowenstein-Jensen培养基上；3-5mm直径；约108个细菌)，并将其重悬于在1.5ml Eppendorf管中的250μl无菌水中。在玻璃珠存在下，通过涡旋细菌悬液从培养物中释放总核酸。将5μl裂解物直接加入PCR。用分枝杆菌属引物(在结核分枝杆菌参考序列M20940[GenBank]的213到236位和394到415位，结核分枝杆菌扩增子的大小是202bp)PCR扩增16S高变区。引物在其5’端还含有噬菌体T3或T7启动子序列：
T3-M1，5′-AATTAACCCTCACTAAAGGGAACACGTGGGTGATCTGCCCTGCA，
和T7-M2，5′-GTAATACGACTCACTATAGGGCTGTGGCCGGACACCCTCTCA.
PCR在100μl反应体积中进行，其中含有50mM KCl，10mM Tris(pH8.3)，1.5mM MgCl2，0.001％(重量/体积)明胶，5％(体积/体积)二甲基亚砜，0.5μM(每种)引物，200μM(每种)脱氧核苷三磷酸，和1.5U Taq聚合酶(AmpliTaq；Perkin-Elmer，Norwalk，Conn.)。PCR在Perkin Elmer 2400 thermal cycler中进行，最初变性步骤为94℃ 5分钟，循环条件为94℃ 45秒，60℃ 30秒和72℃ 30秒共35个循环和最后一个循环72℃ 10分钟。用琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物。
将启动子标记的PCR扩增子用于通过体外转录产生标记的单链RNA目标核酸。每20μl反应混合物含有约50ng PCR产物，20U T3或T7 RNA聚合酶(Promega)；40mM Tris乙酸(pH8.1)；100mM醋酸镁；10mM二硫苏糖醇；1.25mM核糖核苷三磷酸(ATP、CTP、GTP和UTP)，反应在37℃下进行1小时。
1.2扩增子裂解过程中的标记：
RNA扩增子如1.1所述制备。向RNA分子(1μl反应混合物)中，加入6μl咪唑(0.1M在纯水中)，6μlMnCl2(1M在纯水中)和2μl 5-(溴甲基)荧光素(5-BMF，由Molecular Probes，Eugene，OR，USA提供，编号B1 355；100mM在DMSO中)和纯水，至终体积为100μl。将反应介质均化，65℃温育30分钟。
1.3DNA阵列分析方案：
用于分析分枝杆菌扩增子的DNA芯片与A.Troesch等在临床微生物杂志(J.Clin.Microbiol.)，37(1)，p49-55，1999中描述的相同。在此全文引作参考用于所有目的。分析在GeneChip设备系统(参考号900228，Affymetrix，Santa Clara，CA)上进行，其包括GeneArray扫描仪，GeneChip杂交箱，GeneChip射流工作站(fluidics station)和GeneChip分析软件。
1.4抗体染色：
第一步杂交用上述引作参考的文章中描述的方法在DNA阵列上进行。
然后冲洗阵列，第二步染色用染色液进行，其中含300μl MES(参考Aldrich 16373-2，2M在纯水中)，2.4μl乙酰化的牛血清白蛋白，6μl正常山羊IgG，1.2μl抗荧光素抗体，和纯水，终体积为600μl。
抗荧光素-兔IgG级分-生物素XX偶联物(抗体-抗荧光素生物素)由Molecular Probes(Eugene，OR，参考号A-982)提供。
乙酰化的牛血清白蛋白(乙酰化BSA)溶液由GibcoBRL LifeTechnologies(Rockville，MD.编号15561-020)提供。
试剂级别的山羊IgG由Sigma Chemical(St.Louis，MO.编号I-5256)提供
杂交10分钟后，冲洗阵列，用含6×SSPE-Tween 0.01％的洗涤缓冲液洗涤。第三步杂交用第二种染色液进行，所述染色体定义为：300μl MES(2M在纯水中)，6μl乙酰化BSA和6μl链霉抗生物素-R-藻红素偶联物和纯水，终体积为600μl。
链霉抗生物素-R-藻红素偶联物(SRPhy)由Molecular Probes(Eugene，OR，编号S-866)提供。
杂交10分钟后，冲洗阵列，用和第二步中相同的洗涤缓冲液洗涤。
用GeneChip软件可用的功能生成的结果表示为核苷酸碱基信号百分比(BC％)、探针阵列单元的平均信号强度(S用相对荧光单位RFU表示)，平均背景强度(B用RFU表示)和S/B比值，见下表。
说明 BC％  S  B  S/B
用5-BMF直接标记 91.4  9095  4179  2.2
抗体染色 99.5  17884  2049  8.7
上述数据表明，用抗体染色的信号放大提高了碱基信号百分比和强度水平，信号对背景的比值也得到提高。
实施例2：合成的寡脱氧核糖核苷酸作为标记模型的抗体染色
2.1寡核苷3’-单硫代磷酸的制备。
通过Eurogentec(Seraing Belginm)用亚磷酰胺化学法制备在3’端带有单磷酸基团的寡核糖核苷酸(ODN-ps)(5’-CUG AAC GGU AGC AUCUUG AC-3’).
2.2寡核苷酸裂解过程中的标记
寡核糖核苷3’-单硫代磷酸如2.1所述制备。
向寡核苷酸(5μl，1nmol)中，加入3μl咪唑(0.1M在纯水中)，3μlMnCl2(1M在纯水中)和2μl四种标记之一(100mM)和纯水，至终体积为50μl。将反应介质均匀化，65℃温育30分钟。
测试不同的标记：
标记a：N-(生物素基)-N’-(碘乙酰基)乙二胺(100mM在DMSO中)(Molecular Probe编号B-1591)
标记b：(+)-生物素基-碘乙酰胺基-3，6-二氧杂辛烷二胺(100mM在纯水中)(Pierce Rockford，IL，编号21334)碘乙酰基-PEO-生物素。
标记c：N-碘乙酰基-N-生物素亚己基二胺(100mM在DMF中)(Pierce Rockford，IL，编号21333)。
标记d：5-(溴甲基)荧光素(100mM在DMSO中)，无信号放大的检测对照。
2.3杂交：
然后加入500μl杂交缓冲液(1.5ml 20×SSPE+250μl Triton 1％+3.250ml纯水(6×SSPE 0.05％triton)，将该溶液涡旋混匀。
将反应产物如实施例1所述进行杂交。
2.4抗体染色
对于3种带有生物素的标记剂，另一步杂交在DNA棋盘上如实施例1.4所述进行，对于标记d，不经抗体染色的附加步骤而是直接进行分析。
该染色步骤用染色液进行，其中包含300μl MES(2M在纯水中)，60μl乙酰化的BSA，6μl链霉抗生物素-R-藻红素偶联物(SRPhy)和纯水，终体积为600μl。乙酰化的牛血清白蛋白(BSA)溶液由GibcoBRLLife Technologies(Rockville，MD.编号15561-020)提供。链霉抗生物素-R-藻红素偶联物由Molecular Probes(Eugene，OR，编号S-866)提供。
杂交10分钟后，冲洗阵列，用洗涤缓冲液6×SSPE-Tween 0.01％洗涤。
如实施例1所述在DNA棋盘阵列上进行检测和分析。
该DNA-棋盘阵列设计为用如WO 9511995所述的4-tiling方法分析ODN-ps的互补序列。
分析
结果表示为碱基信号百分比(Bc％)、强度水平(S)、背景(B)和S/B比值，见下表。
所用标记  BC％  S  B  S/B
d  92.5  7049  2240  3.2
a  100  41961  1811  23.2
b  100  31301  1510  20.7
c  100  44457  2219  20.0
在LDC中用生物素衍生物和抗体染色取代用5-(溴甲基)荧光素直接标记，就碱基信号百分比和强度水平而言信号放大效果更好。
实施例3天然RNA在LDC(裂解过程中标记)中的信号放大。
3.1RNA分离
从生长在LB肉汤(Teknova)中的大肠杆菌菌株MG1655中分离总RNA。细胞在37℃下生长至对数中期，离心收集细胞。用RNeasy试剂盒(Qiagen)分离RNA。分离的RNA通过在260nm下测量吸光度以定量。
3.2 RNA断裂和标记
通过将以下成分在100μl终体积中混合用荧光素标记RNA：8μgRNA，30mM CHES(Aldrich，编号22403-0)pH9-9.5，1mM 5-(溴甲基)荧光素(Molecular Probes，用在二甲基甲酰胺中的50mM原液加入)，30mM氯化锰。将组分置于PCR管中，在GeneAmp PCRSystem2400设备(Perkin Elmer)中加热至65℃40分钟，然后冷却至4℃。为了用生物素标记RNA，将以下成分在100μl终体积中混合：10μg RNA，30mM MOPS(Aldrich，编号16377-5)pH7.5，20mM PEO-碘乙酰基-生物素(Pierce Rockford，IL，编号：21334)，10mM氯化镁。将组分置于PCR管中，在上述PCR设备中加热至95℃30分钟，然后25℃30分钟，再冷却至4℃。加入25μg载体糖原后沉淀标记的RNA片段。将对照RNA spikes(各2fmol)先于标记加到大肠杆菌RNA中。对照RNA spikes由体外转录线性化质粒模板来制备。
3.3探针阵列杂交和信号放大。
杂交在大肠杆菌有义探针阵列(Affymetrix)上进行。该探针阵列基于大肠杆菌K-12的序列(“大肠杆菌K-12完整的基因组序列”，Blattner，F.等，科学(Science)，277，1453-1474，1997，在此全文引作参考用于所有目的)。该阵列包含对每个用b#指定的RNA或蛋白编码区的15个探针对(Blattner等，同上文)。对于这些区域，探针组互补于天然RNA(有义链)。该阵列也包括对位于b#区域之间的区域的探针组。这些被称为基因间区。在这种情况下，探针组代表着基因间区的2个取向。另外，该探针阵列包含对一些对照序列的探针组。许多这些对照可以被夹杂在样本中，作为阳性杂交对照。阵列的单元特征大小为(23.5×23.5)μm2，合成面积为(12.8×12.8)mm2。
杂交液含有10μg荧光素标记的RNA片段或5μg生物素标记的RNA片段，在终体积为200μl含100mM MES，pH6.5-7.0，1M，Nat 20mMEDTA、0.01％(体积/体积)Tween20，0.5nM对照寡核苷酸(荧光素或生物素标记的，与RNA样本相匹配)、0.1mg/ml剪切和变性的鲱精子DNA和0.5mg/ml乙酰化BSA的体系中。将杂交液直接注射到探针阵列盒中，在GeneChip杂交箱(Affymetrix，Santa Clara，CA)里45℃杂交16小时。在GeneChip射流工作站(Affymetrix)进行洗涤和染色。洗涤液定义如下：严格的洗涤缓冲液，100mM MES，pH 6.5-7.0，0.1M Na+，0.01％(体积/体积)Tween20；非严格的洗涤缓冲液，6×SSPE(来自20×原液，BioWhittaker)，0.01％(体积/体积)Tween20，0.005％(体积/体积)Antifoam0-30(Sigma)。对于荧光素标记的RNA杂交，将探针阵列放置在射流工作站并用非严格洗涤缓冲液洗涤(25℃，每个循环2次混合共10个循环)，接着用严格洗涤缓冲液洗涤(50℃，每个循环15次混合共4个循环)，在扫描之前用非严格洗涤缓冲液填充。荧光素标记的探针阵列在GeneArray扫描仪(Hewlettpackard)上扫描，应用以下扫描参数：3μm象素，530nm波长。扫描后，通过以下方法将荧光素信号放大：将阵列与600μl2μg/ml抗荧光素抗体-生物素偶联物(抗体-抗荧光素生物素)，0.1mg/ml正常山羊IgG，和2mg/ml乙酰化BSA在100mM MES，pH6.5-7.0，1M Na+，0.05％(体积/体积)Tween20和0.005％(体积/体积)Antifoam0-30中在25℃混合10分钟。抗体结合之后，用600μl 10μg/ml链霉抗生物素-R-藻红素偶联物(SRPhy)在100mM MES，pH6.5-7.0，1M Na+，0.05％(体积/体积)Tween20，0.005％(体积/体积)Antifoam0-30和5mg/ml乙酰化BSA中在25℃将阵列染色10分钟。链霉抗生物素藻红素染色之后，用非严格杂交缓冲液洗涤阵列(30℃，每个循环4次混合共10个循环)。用3μm像素和570nm波长的参数扫描阵列。对于生物素标记的RNA杂交，用非严格洗涤缓冲液洗涤探针阵列(25℃，每个循环2次混合共10个循环)，接着如上所述用严格洗涤缓冲液洗涤(50℃，每个循环15次混合共4个循环)。然后如上所述用链霉抗生物素藻红素对阵列进行染色，接着用非严格洗涤缓冲液洗涤(25℃，每个循环4次混合共10个循环)。然后通过以下方法阵列上的信号被放大：将阵列与600μl3μg/ml生物素化的抗链霉抗生物素抗体(山羊)(Vector Laboratories)，0.1mg/ml正常山羊IgG，和2mg/ml乙酰化BSA在100mM MES，pH6.5-7.0，1M Na+，0.05％(体积/体积)Tween20和0.005％(体积/体积)Antifoam0-30中在25℃混合10分钟。将阵列如上所述再用链霉抗生物素藻红素染色，接着用非严格洗涤缓冲液洗涤(30℃，每个循环4次混合共1 5个循环)。所有的步骤都在GeneChip射流工作站上按次序进行。然后，用3μm像素和570nm波长的参数扫描阵列。
3.4数据分析
扫描数据用GeneChip软件(3.1版，AffyMetri X)分析。用设定在默认参数的Expression Analysis Algorithm生成数据。呈现的信号选自阵列上的编码序列(稳定RNA和可读框)。均差定义为完全配对探针和失配探针之间的强度差异对用以确定编码序列的16探针对的平均。
3.5结果
杂交结果总结于下面两个表中。
表1.大肠杆菌总RNA比较
    荧光素标记 生物素标记
    无放大     抗体放大
  呈现信号     826     1199     737
  ％呈现信号     19％     28％     17％
  总编码序列     4331     4331     4331
  平均均差     6     180     147
表1概括了从阵列上编码序列获得的结果。抗体放大对荧光素标记目标的价值通过比较呈现信号数目和平均均差值清楚可见。在这种情况下，抗体放大产生的附加信号将呈现信号数从826增加到1199，将平均均差从6提高到180。生物素标记的RNA的抗体放大产生的平均均差信号类似于但轻度低于那些来自荧光素标记的放大的平均均差信号。应当注意，生物素标记的样本是荧光素标记的样本量的1/2。
表2对照RNA spike的比较
   荧光素标记    生物素标记
   无放大   抗体放大
  探针组    Avg Diff1    Abs Call2   Avg Diff1    Abs Call2    Avg Diff1   Abs Call2
  DapX-5    11    P   192    P    1237   P
  DapX-M    0    A   111    P    507   P
  DapX-3    7    P   218    P    1554   P
  LysX-5    12    P   417    P    1795   P
  LysX-M    3    A   150    P    702   P
  LysX-3    3    P   154    P    384   P
  PheX-5    8    P   340    P    197   P
  PheX-M    6    P   162    P    297   P
  PheX-3    5    A   358    P    1474   P
  ThrX-5    10    P   234    P    123   P
  ThrX-M    9    P   144    P    196   P
  ThrX-3    6    M   233    P    337   P
1均差
2绝对信号
P＝呈现；A＝缺失；M＝边缘
表2概括了用RNA对照spike得到的数据。对于荧光素标记的spikes，抗体信号放大极大地提高了平均均差值，将任何缺失或边缘信号转化为呈现信号。在抗体信号放大后，与荧光素标记的spikes相比，生物素标记的RNA spikes在12个探针组中的10个产生了更高的信号。

Claims (26)

1.伴信号放大的标记核糖核酸(RNA)的方法，特征在于其包括：
-  断裂RNA；
-  将第一配体固定到位于所述RNA各片段的3’端和/或5’端的末端磷酸上，所述末端磷酸已在断裂过程中被释放，和
-  将标记剂结合到所述第一配体上。
2.根据权利要求1的方法，其中标记剂结合到所述第一配体是间接实现的。
3.根据权利要求2的方法，其中第一配体结合到第一抗配体，所述第一抗配体结合到第二配体，而标记剂是带有至少一个标记的第二抗配体并能与所述第二配体反应。
4.根据权利要求3的方法，其中第一配体/第一抗配体和第二配体/第二抗配体组合选自生物素/链霉抗生物素，半抗原/抗体，抗原/抗体，肽/抗体，糖/凝集素和多核苷酸/互补的多核苷酸。
5.根据权利要求4的方法，其中第一配体和第二配体是相同的。
6.根据权利要求4的方法，其中第一配体和第二配体是不同的。
7.根据权利要求6的方法，其中第一配体是荧光素衍生物，第二配体是生物素衍生物。
8.根据权利要求1-3中任一项的方法，其中第一配体是生物素衍生物而标记剂或第一抗配体是链霉抗生物素衍生物。
9.根据权利要求1或2的方法，其中断裂和固定在一个步骤中实现。
10.根据权利要求1或2的方法，其中断裂和固定在两个步骤中实现。
11.根据权利要求1的方法，其中标记剂与第一配体的结合是共价的。
12.根据权利要求1的方法，其中标记剂与第一配体的结合是非共价的。
13.根据权利要求1的方法，其中将第一配体固定到RNA片段的3’端或5’端是通过将所述第一配体携带的反应基团与相对于核糖位于2’位、3’位或环单磷酸的2’-3’位的磷酸反应来实现的。
14.根据权利要求1的方法，其中断裂和/或将第一配体固定到RNA片段的3’端或5’端是通过将所述第一配体携带的亲核、亲电子或卤素基团与相对于核糖位于2’位、3’位或环单磷酸的2’-3’位的磷酸反应来实现的。
15.根据权利要求1的方法，其中RNA断裂是用酶促、化学或物理方法实现的。
16.根据权利要求15的方法，其中RNA的酶促断裂是通过核酸酶进行的。
17.根据权利要求15的方法，其中RNA的化学断裂是通过可以与或可以不与化学催化剂组合的金属阳离子进行的。
18.根据权利要求1 7的方法，其中所述金属阳离子是Mg++，Mn++，Cu++，Co++和/或Zn++离子，化学催化剂包括咪唑，取代的咪唑，或任何对RNA有亲和力和带有咪唑核的化学分子或取代的咪唑。
19.根据权利要求18的方法，其中所述取代的咪唑为N-甲基咪唑。
20.根据权利要求15的方法，其中RNA的物理断裂是通过超声或照射方法进行的。
21.根据权利要求1的方法，其中第一配体固定到RNA片段的3’端或5’端是通过将分子R-X与连接于核糖的2’位，3’位或环单磷酸2’-3’位的磷酸反应来实现的，其中R包括第一配体，X是选自羟基、胺、肼、烷氧基胺、烷基卤、苯甲基卤、碘乙酰胺或马来酰亚胺的反应基团。
22.根据权利要求21的方法，其中R-X选自5-(溴荧光素)和碘乙酰基生物素衍生物。
23.通过根据权利要求1-22中任一项的方法可获得的标记的RNA片段，所述标记的RNA片段在其3’端包含一个磷酸或硫代磷酸、第一配体、第一抗配体、第二配体和标剂记，所述标记剂是携带至少一个标记的第二抗配体，其中所述第一配体结合至所述第一抗配体，所述第一抗配体结合至所述第二配体，而所述第二配体结合至所述第二抗配体，并且其中所述第一配体是荧光素，所述第一抗配体是抗荧光素抗体，所述第二配体是生物素，而所述第二抗配体是链霉抗生物素。
24.根据权利要求23的RNA片段，其中所述RNA片段包含10-150个核苷酸。
25.根据权利要求23或24的RNA片段作为探针用于检测RNA和/或DNA，或RNA片段和/或DNA片段的用途。
26.根据权利要求23或24的RNA片段作为能够结合捕获探针的标记的目标的用途。
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