ES2334471T3 - Procedimiento para marcar un acido ribonucleico, y fragmentos de adn marcados asi obtenidos. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para la fragmentación y marcaje uniforme con amplificación de señal de un ácido ribonucleico (ARN), comprendiendo dicho procedimiento: - fragmentar de manera no específica y químicamente el ARN con el fin de producir fragmentos que presentan un fosfato terminal en el extremo 3'', - fijar un primer ligando a dicho fosfato terminal, y - unir indirectamente un agente de marcaje a dicho primer ligando, en el que dicho primer ligando está unido a un primer antiligando, dicho primer antiligando está unido a un segundo ligando y el agente de marcaje es un segundo antiligando portador de por lo menos un marcador y puede reaccionar con dicho segundo antiligando.
Description
Procedimiento para marcar un ácido ribonucleico,
y fragmentos de ADN marcados así obtenidos.
La presente invención se refiere a un nuevo
procedimiento para el marcaje del ácido ribonucleico (ARN) con
amplificación de señal.
El estado de la técnica muestra que existe una
multiplicidad de procedimientos destinados al marcaje de los
nucleótidos, oligonucleótidos o ácidos nucleicos; se hará referencia
a los oligonucleótidos y ácidos nucleicos con el término
polinucleótidos. Los polinucleótidos se pueden marcar durante la
síntesis o mediante la incorporación de por lo menos un nucleótido
marcado.
Un primer procedimiento comprende la adición de
un marcador a la base, que puede ser una base natural o una base
modificada. Un segundo procedimiento propone añadir el marcador al
azúcar, ya sea esta última un azúcar natural o un azúcar
modificado. Un tercer procedimiento se refiere a añadir un marcador
al fosfato.
De hecho, un experto en la materia que deba
marcar un nucleótido o un análogo de nucleótido o un ácido nucleico,
tenderá a añadir el marcador a la base o al azúcar, lo que es más
conveniente y ofrece más opciones. Esto es, además, lo que se
concluye de estudiar gran número de documentos tales como
EP-A-0.329.198;
EP-A-0.302.176;
EP-A-0.097.373;
EP-A-0.063.879;
US-A-5.449.767;
US-A-5.328.824;
WO-A-93/16094;
DE-A-3.910.151 y
EP-A-0.567.841 en el caso de la
base o EP-A-0.286.898 en el caso del
azúcar.
El procedimiento que consiste en añadir el
marcador al fosfato es más complejo especialmente debido a que los
ácidos nucleicos son solubles en agua y la reactividad del fosfato
en este medio es inferior en comparación con ésta en disolventes
orgánicos.
Aún así, algunos documentos han propuesto
procedimientos para marcar el fosfato. Esto implica, por ejemplo,
al documento EP-A-0.280.058, que
describe el marcaje de un nucleótido mediante la unión del marcador
al fosfato, estando éste unido al azúcar en las posiciones 3' y/o
5', cuando se trata de un desoxirribonucleótido y en las posiciones
2', 3', y/o 5' cuando el nucleótido es un ribonucleótido. Este
documento describe asimismo un polinucleótido u oligonucleótido que
comprende por lo menos un nucleótido marcado tal como se describe
anteriormente; dicho nucleótido se incorpora en el polinucleótido u
oligonucleótido durante la síntesis.
Sin embargo, la estrategia de marcaje que se
propone en el documento EP-A-0 280
058 no permite que se marquen los ácidos nucleicos uniformemente.
La incorporación de los nucleótidos marcados en polinucleótidos no
se puede controlar; depende completamente de la composición de los
nucleótidos sintetizados. Así, algunos polinucleótidos pueden
comprender un gran número de nucleótidos marcados mientras que otros
pueden comprender ninguno en absoluto. En consecuencia, la
intensidad de la señal emitida por tales ácidos nucleicos no es
uniforme y por consiguiente será difícil interpretar los resultados
cuando se detectan ácidos nucleicos.
En este caso, el marcaje se incorpora
biológicamente sin control de las posiciones de los nucleótidos
marcados.
El documento
US-A-5.317.098 se refiere a ácidos
nucleicos marcados en sus extremos 5'. Esta unión utiliza imidazol
y un brazo conector. No existe una fragmentación asociada al
marcaje. Además, el fosfato se añade al ácido nucleico y por
consiguiente se utiliza una quinasa como procedimiento para
introducir el fosfato, lo que conduce a por lo menos una etapa
biológica adicional. Este documento describe el marcaje de
oligonucleótidos 15meros. Cuando se utilizan ácidos nucleicos
grandes en lugar de oligonucleótidos, este procedimiento conduce a
la presencia de un marcador solamente en los extremos 5' y la
actividad específica del ácido nucleico marcado es baja.
Además, cuando se realiza el marcaje en ácidos
nucleicos grandes sin una etapa de fragmentación, también referida
como etapa de escisión, la cinética de hibridación de estos ácidos
nucleicos a sus secuencias complementarias es lenta lo que conduce
a un rendimiento de hibridación bajo. Esto, por consiguiente,
conducirá a una pérdida de señal cuantitativa y cualitativa. El
impedimento estérico es un factor clave en esta reacción.
El impedimento estérico puede ser consecuencia
no solamente de la longitud del ácido nucleico sino también de la
existencia de estructuras secundarias. La fragmentación ayuda a
romper (o reducir) estas estructuras y de este modo a optimizar la
hibridación. El impedimento estérico tiene un papel particularmente
importante en el caso de la hibridación a superficies sólidas que
comprenden gran densidad de sondas capturadas, por ejemplo las
"matrices" de ADN desarrolladas por la compañía Affymetrix,
Inc. ["Accessing Genetic Information with
High-Density DNA arrays", M. Chee, et al.,
Science, 274:610-614 (1996).
"Light-generated oligonucleotide arrays for rapid
DNA sequence analysis", A. Caviani Pease et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 91: 5022-5026 (1994,
US nº 5.744.305, US nº 5.445.934). En esta metodología las
sondas capturadas generalmente son de un tamaño reducido, de
aproximadamente veinte nucleótidos.
En la materia se describe una multiplicidad de
procedimientos para la fragmentación de ácidos nucleicos.
En primer lugar, la fragmentación puede ser
enzimática, es decir, los ácidos nucleicos se pueden fragmentar
mediante nucleasas (ADNasas o ARNasas) (Methods in Enzymol., vol.
152, S. Berger y A. Kimmel, ed. Academia Press, 1987, Enzymatic
techniques and recombinant DNA technology, "Guide to molecular
cloning", p91-110, Molecular cloning, a
Laboratory Manual, J. Sambrook, E.F. Fritsch y T. Maniatis, Cold
Spring Harbor Laboratory Press, 2^{nd} Edition,
P5.30-5.95, 1989).
Dependiendo del enzima implicado, esta reacción
genera fragmentos pequeños o monómeros con un grupo hidroxilo o
monofosfato en los extremos 5' o 3'.
En segundo lugar, la fragmentación puede ser
química. Por ejemplo, en el caso de secuencias de ADN, la
depurinización o depirimidinilización utilizando agentes
alquilantes genera lugares sin bases que a continuación se
fragmentan en presencia de una base mediante un mecanismo referido
como "eliminación-\beta" (T. Lindahl et
al., Rate of chain breakage at apurinic sites in
double-stranded deoxyribonucleic acid.,
Biochemistry 11:3618-3623 (1972)). Los ADN
se pueden fragmentar mediante mecanismos de oxidación, alquilación o
adición de radicales libres, inter alia (M. Liuzzi et
al., Characterization and damage in
gamma-irradiated and
OsO_{4}-treated DNA using methoxiamine., Int.
J. Radiat. Biol., 54:709-722 (1988)). Los
cationes metálicos, que frecuentemente se combinan con moléculas
orgánicas utilizadas como catalizadores, por ejemplo los imidazoles,
se utilizan con el fin de fragmentar ARN. (R. Breslow y R. Xu,
Recognition and catalysis in nucleic acid chemistry, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 90:1201-1207 (1993); J. Hovinen
et al., Imidazole Tethered oligonucleotides: Synthesis and
RNA cleaving activity, J. Org. Chem.,
60:2205-2209 (1995)). Esta fragmentación se
realiza preferentemente en medio alcalino y genera fragmentos con
extremos 3' fosfato.
Sin embargo, el objetivo de estas
fragmentaciones no es el de facilitar o permitir el marcaje.
El documento
WO-A-88/04300 propone un
procedimiento de fragmentación y marcaje del ARN, que utiliza
moléculas de ARN que poseen propiedades enzimáticas, es decir,
ribozimas. La ruptura catalizada con estos ribozimas es secuencia
específica y la reacción produce fragmentos de ARN con grupos
hidroxilo (OH) en el extremo 5' y un monofosfato en el extremo 3'.
El marcaje, que es un marcaje exclusivamente radioactivo, se realiza
a continuación mediante la incorporación de un fosfato radiactivo
añadido, derivado de una molécula de GTP. Es una actividad
fosfotransferasa de esta categoría de ribozimas, es decir, una
actividad quinasa. La unión de fosfato radiactivo tiene lugar
solamente en el grupo hidroxilo del extremo 5' y no se utiliza
ningún fosfato resultante de la fragmentación para unir el marcador
a los fragmentos de ARN. Además, la fragmentación solamente se
realiza mediante las ribozimas, lo que implica la existencia de una
especificidad entre las ribozimas y los ácidos nucleicos diana que
se cortarán. El fosfato actúa entonces como marcador.
La presente invención permite la unión del
marcador al fosfato de un fragmento de ácido nucleico que se libera
durante la ruptura. No existe especificidad y por consiguiente, se
puede fragmentar al azar cualquier tipo de ácido nucleico.
Utilizando esta estrategia se obtiene homogeneidad en la intensidad
del marcaje, ya que el rendimiento del marcaje de cada uno de los
fragmentos generados es completamente independiente de su secuencia
y composición. Así, el procedimiento de la presente invención hace
posible la preparación, por ejemplo, de sondas para la detección.
Finalmente, el fosfato es solamente un brazo conector entre el ácido
nucleico y el marcador.
La técnica de amplificación de señal es bien
conocida en el ámbito de los ensayos inmunológicos o de las sondas
de ácidos nucleicos tal como se describe en los ejemplos de
WO95/08000 o en el artículo J. Histochem. Cytochem.
45:481-491 (1997), pero sin estar asociada a la
fragmentación durante el marcaje.
En la técnica anterior no se ha descrito ningún
proceso de fragmentación antes del marcaje con amplificación de
señal.
La presente invención, por consiguiente, propone
un procedimiento que supera las dificultades mencionadas
anteriormente. Así, este procedimiento hace posible obtener
fragmentos de ARN que están uniformemente marcados una vez se ha
completado la fragmentación. Además, la fragmentación hace posible
obtener fragmentos de un tamaño óptimo para una posible
hibridación. Con la mejora de la calidad de la hibridación, la
detección de los fragmentos marcados después de la hibridación será
más rápida y eficaz. Finalmente, la presente invención mejora la
sensibilidad mediante el incremento de la intensidad de la señal
generada y la proporción entre la señal y el fondo.
Con este fin, la presente invención se refiere a
un procedimiento destinado a marcar un ácido ribonucleico (ARN)
sintético o natural, caracterizado porque comprende:
- -
- fragmentar el ARN,
- -
- fijar un primer ligando al fosfato terminal que se encuentra en el extremo 3' y/o 5' de cada uno de los fragmentos de dicho ARN, habiendo sido cada uno de dichos fosfatos terminales liberado durante la fragmentación y,
- -
- unir el agente de marcaje a dicho primer ligando.
En la presente invención, el ARN (ácido
ribonucleico o ácido poliribonucleico) es ARN sintético o
natural.
Para los expertos en la materia resultarán
evidentes los procedimientos para la obtención de ARN sintético.
Estos procedimientos comprenden, por ejemplo, procedimientos de
amplificación (ver, por ejemplo, Kozal, M.J. et al.,
Nature Medicine 2(7):753-758 (1996)),
procedimientos de amplificación transcripcional u otros
procedimientos que generan productos de ARN que comprenden TMA
(amplificación mediada por la transcripción), NASBA (amplificación
de ácidos nucleicos basada en la secuencia), 3SR (Amplificación
autosostenida de secuencias), amplificación mediante Q\beta
replicasa, digestión enzimática de ARN natural y síntesis química de
poliribonucleótidos (ver, por ejemplo, patente US nº 5.554.516 y nº
5.766.849 y Clin. Microbiol. Rev.
5(4):370-386 (1992)). El ARN sintético
es un ARN que comprende además por lo menos un nucleótido modificado
o por lo menos un enlace internucleotídico modificado tal como
tiofosfato. Un ARN natural es un ARN que se obtiene mediante
extracción de una célula, por ejemplo un ARN mensajero (ARNm), un
ARN ribosomal (ARNr) o un ARN de transferencia (ARNt). El marcaje
es la unión de un marcador estable con el fin de generar una señal
detectable. La siguiente es una lista no limitativa de dichos
marcadores:
- \bullet
- enzimas que producen un señal detectable, por ejemplo, mediante colorimetría, fluorescencia, luminescencia, tales como peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina, \beta-galactosidasa y glucosa-6-fosfato deshidrogenasa,
- \bullet
- cromóforos tales como los compuestos fluorescentes y luminescentes,
- \bullet
- grupos con densidad electrónica que se pueden detectar por microscopía electrónica o por sus propiedades eléctricas tales como por conductividad, amperometría, voltametría e impedancia,
- \bullet
- grupos detectables, por ejemplo, los que presentan moléculas de tamaños suficientes para inducir modificaciones detectables en sus características físicas y/o químicas; esta detección se puede realizar mediante procedimientos ópticos tales como difracción, resonancia superficial de plasmón, cambio en la superficie y cambio en el ángulo de contacto, o procedimientos físicos tales como la espectroscopia de fuerza atómica y efecto túnel
- \bullet
- moléculas radioactivas tales como ^{32}P, ^{35}S o ^{125}I.
\vskip1.000000\baselineskip
El compuesto que comprende el marcador es el
agente de marcaje.
El término "fijar" se refiere a crear un
enlace covalente o no covalente. Un anticuerpo selectivo para un
fosfato o a un tiofosfato es un medio de crear un enlace no
covalente. De acuerdo con una forma de realización preferida, la
fijación covalente tal como se describe en los ejemplos.
En otro aspecto de la presente invención, la
fragmentación y la fijación se efectúan en una etapa.
En otro aspecto de la presente invención, la
fragmentación y la fijación se efectúan en dos etapas.
De acuerdo con la primera forma de realización,
la unión del agente de marcaje al primer ligando es covalente. Las
diferentes funciones reactivas que permiten la unión covalente son
bien conocidas por los expertos en la materia y algunos ejemplos de
conjugación se pueden encontrar, por ejemplo, en "Bioconjugate
techniques" Hermanson G.T., Academic Press, San Diego, 1996.
Según una segunda forma de realización, la unión
del agente de marcaje al primer ligando es no covalente.
La unión no covalente es una unión que implica,
por ejemplo, interacciones iónicas o electrostáticas, interacciones
de Van der Vaals, enlaces de hidrógeno o combinaciones de diferentes
interacciones.
En una forma de realización preferida, la unión
del agente de marcaje a dicho primer ligando se efectúa
indirectamente. El primer ligando fijado al fosfato terminal, se
une a un primer antiligando, dicho primer antiligando se une a un
segundo ligando y el agente de marcaje es un segundo antiligando
portador de por lo menos un marcador y que puede reaccionar con
dicho segundo ligando.
La combinación (antiligando/ligando) se refiere
a dos compuestos que pueden reaccionar de modo específico.
Las combinaciones de primer ligando/primer
antiligando y segundo ligando/segundo antiligando se seleccionan,
por ejemplo, de entre el grupo que consiste en
biotina/estreptavidina, hapteno/anticuerpo, antígeno/anticuerpo,
péptido/anticuerpo, azúcar/lectina y polinucleótido/polinucleótido
complementario.
Estas diferentes combinaciones y otras
combinaciones son conocidas y se describen por ejemplo en
"BioMerieux applications" WO 96/19729, WO 94/29723, WO
95/08000.
Los primer y segundo ligandos son iguales o
diferentes.
En una forma de realización preferida, el primer
ligando es un derivado de fluoresceína y el segundo ligando es un
derivado de la biotina.
En otra forma de realización preferida, el
primer ligando es un derivado de la biotina y el primer antiligando
es un derivado de la estreptavidina.
No existe limitación en el apilamiento de otras
entidades (ligando/antiligando) con el fin de incrementar la
amplificación. Por ejemplo, una entidad (segundo ligando/primer
antiligando) se une al primer ligando fijado al fosfato, a
continuación una entidad (tercer ligando/segundo antiligando) se une
al segundo ligando y el agente de marcaje es un tercer antiligando
portador de por lo menos un marcador y que puede reaccionar con el
tercer ligando.
La adición de diferentes entidades se puede
efectuar en por lo menos una etapa o cada entidad se puede añadir
sucesivamente después de la fijación del ligando al fosfato.
Según una forma de funcionamiento preferida, la
fijación del primer ligando al extremo 3' de cada fragmento del ARN
se efectúa a parte del fragmento que constituye el extremo 3' y/o 5'
del ARN inicial. Además o por el contrario, la unión del primer
ligando al extremo 5' de cada uno de los fragmentos de ARN se
efectúa aparte del fragmento que constituye el extremo 5' del ARN
inicial.
Independientemente de la forma de realización,
la fijación del primer ligando al extremo 3' o al extremo 5' de un
fragmento de ARN se efectúa haciendo reaccionar una función
reactiva, que es realizada por el primer ligando, con el fosfato
que se encuentra en la posición 2', en la posición 3' o en la
posición 2'-3' de un monofosfato cíclico, con
respecto a la ribosa.
La fragmentación y/o unión del primer ligando
con el extremo 3' o 5' de un fragmento de ARN se efectúa mediante
la unión de una función nucleófila, electrófila o de haluro que se
realiza mediante un ligando del fosfato en la posición 2', en la
posición 3' o en la posición 2'-3' de un monofosfato
cíclico, con respecto a la ribosa.
La fragmentación del ARN se efectúa
enzimáticamente, químicamente o físicamente.
La fragmentación enzimática del ARN se realiza
mediante nucleasas.
La fragmentación química del ARN se realiza
mediante cationes metálicos que pueden o no combinarse con un
catalizador químico.
En este caso los cationes metálicos son iones de
Mg^{++}, Mn^{++}, Cu^{++} , Co^{++} y/o Zn^{++} y el
catalizador químico comprende imidazol, un análogo sustituido, por
ejemplo N-metilimidazol o
una molécula química cualquiera con afinidad por el ARN y que es
portadora de un anillo de imidazol o un análogo sustituido.
La fragmentación física del ARN se realiza
mediante sonicación o radiación.
En todos los casos, la fijación del primer
ligando al extremo 3' o al extremo 5' del fragmento de ARN se
efectúa mediante la reacción de una molécula R-X,
en la que R comprende el ligando y X es la función reactiva, tal
como hidroxilo, amina, hidracina, alcoxilamina, haluro de alquilo,
haluro de fenilmetilo, iodoacetamida o maleimida, X reacciona con
fosfato que está unido a la posición 2', a la posición 3', o a la
posición 2'-3' del monofosfato cíclico de la
ribosa. En una forma de realización preferida, X es un haluro de
alquilo, un haluro de fenilmetilo, iodoacetamida o maleimida. Con
el fin de facilitar la unión del ligando, puede estar opcionalmente
presente un brazo conector entre el ligando y la función reactiva.
En una forma de realización preferida, R-X es
N-(biotinoil)-N'-(iodoacetil)etilendiamina,
(+)-biotinil-iodoacetamidil-3,6-dioxaoctandiamina,
N-iodoacetil-N-biotinilhexilendiamina,
5-(bromometil) fluoresceína.
La presente invención comprende también un
fragmento de ARN que se obtiene mediante el procedimiento anterior.
El fragmento de ARN posee en el extremo 3' o en el extremo 5' un
solo nucleótido que está marcado en el fosfato terminal que se
liberó durante la fragmentación.
Dicho fragmento de ARN comprende entre 10 y 150
nucleótidos, preferiblemente entre 30 y 70 nucleótidos y
preferiblemente entre 40 y 60 nucleótidos con el fin de facilitar
la hibridación del fragmento de ARN a una sonda o diana.
Según una forma de realización preferida, el
fragmento de ARN comprende por lo menos un nucleótido
tiofosfato.
Además, el nucleótido portador del ligando es un
nucleótido tiofosfato.
Según una forma de realización preferida el
fragmento de ARN comprende en el extremo 3' un fosfato o un
tiofosfato con una fluoresceína unida a un anticuerpo
antifluoresceína portador de por lo menos una biotina, dicho
anticuerpo unido a una estreptavidina marcada.
La invención se refiere a la utilización de un
fragmento de ARN, tal como se definió anteriormente, como sonda
para la detección de un ARN y/o un ADN o un fragmento de ARN y/o un
fragmento de ADN.
Finalmente, la invención se refiere a la
utilización de un fragmento de ARN, tal como se definió
anteriormente, como una diana marcada que es capaz de unirse a una
sonda de captura.
La figura 1 muestra un diagrama de la
fragmentación química de un ARN en presencia de cationes de
Mn^{++} e imidazol.
La figura 2 muestra un diagrama de un posible
mecanismo de fragmentación y marcaje de un ARN con un ligando
portador de una función nucleófila.
Las figuras y ejemplos representan formas de
realización particulares y no se pueden considerar limitativos del
alcance de la presente invención.
A partir de aislados, se rascaron con el extremo
de una espátula una o dos colonias de bacterias recientemente
crecidas (Mycobacterium tuberculosis
(ATCC-27294) en medio
Lowenstein-Jensen; 3 a 5 mm de diámetro,
aproxiamdamente 10^{8} bacterias) y se resuspendieron en 250
\mul de agua estéril en un tubo Eppendorf de 1,5 ml. Se liberaron
ácido nucleicos totales del material de cultivo mediante agitación
por vortex de la suspensión de bacterias en presencia de cuentas de
vidrio. Una alícuota de 5 \mul de homogeneizado se añadió
directamente a la PCR. La región hipervariable 16 S se amplificó
por PCR con cebadores del género Mycobacterium (posiciones
213 a 236 y 394 a 415 en la secuencia de referencia de M.
tuberculosis M20940 (GenBank): El tamaño del amplicón de M.
tuberculosis es 202 bp). Los cebadores comprenden también una
secuencia promotora del bacteriófago T3 o T7 en sus extremos
5':
\vskip1.000000\baselineskip
T3-M1,
5'-AATTAACCCTCACTAAAGGGAACACGTGGGTGATCTGCCCTGCA,
y
T7-M2,
5'-GTAATACGACTCACTATAGGGCTGTGGCCGGACACCCTCTCA.
\vskip1.000000\baselineskip
La PCR se realizó en un volumen de reacción de
100 \mul con 50 mM KCl, 10 mM Tris (pH 8,3), 1,5 mM MgCl_{2},
0,001% (peso/vol.) gelatina, 5% (vol./vol.) dimetil sulfóxido, 0,5
\muM (cada uno) cebador, 200 \muM (cada uno) desoxinucleotido
trifosfatos y 1,5 U de polimerasa Taq (AmpliTaq;
Perkin-Elmer, Norwalk, Conn.). La PCR se realizó en
un termociclador Perkin-Elmer 2400 con una etapa
inicial de desnaturalización a 94ºC durante 5 min. y condiciones de
ciclo de 94ºC durante 45 segundos, 60ºC durante 30 segundos y 72ºC
durante 30 segundos, para 35 ciclos y 72ºC durante 10 minutos para
el último ciclo. El producto de PCR se analizó mediante
electroforesis en gel de agarosa.
Los amplicones de PCR-unidos a
promotores se utilizaron con el fin de generar dianas de ARN de
cadena simple marcadas mediante transcripción in vitro. Cada
mezcla de reacción de 20 \mul contuvo aproximadamente 50 ng de
producto de PCR, 20 U de T3 o T7 de ARN polimerasa (Promega); 40 mM
Tris-acetato (pH 8,1); 100 mM Mg
(acetato)_{2}; 10 mM ditiotreitol; 1,25 mM ribonucleótido
trifosfatos (ATP, CTP, GTP y UTP). La reacción se realizó a 37ºC
durante 1 hora.
Se prepararon amplicones de ARN tal como se
describió en 1.1. A moléculas de ARN (1 \mul de mezcla de
reacción), se añadió 6 \mul de imidazol (0,1 M en agua pura), 6
\mul de MnCl_{2} (1 M en agua pura) y 2 \mul de
5-(bromometil)fluoresceína (5-BMF
proporcionada por Molecular Probes, Eugene, OR, USA, nº de
referencia: B1355; 100 mM en DMSO) y agua pura hasta un volumen
final de 100 \mul. se homogeneizó el medio de reacción y se
incubó a 65ºC durante 30 minutos.
El "chip" de ADN utilizado para el análisis
de los amplicones de Micobacteria es el mismo descrito por A.
Troesch et al en J. Clin. Microbiol.,
37(1):49-55 (1999). El análisis se
realizó en un instrumento GeneChip® (referencia: 900228,
Affymetrics, Santa Clara, CA) que comprende el escaneador
GeneArray®, el horno de hibridación Genechip®, GeneChip® Fluidics
Station y el software de análisis GeneChip®.
La primera etapa de hibridación se realizó sobre
matrices de ADN utilizando el protocolo descrito en el artículo
mencionado anteriormente.
A continuación las matrices se limpiaron y se
realizó una segunda etapa de tinción utilizando disolución de
tinción con 300 \mul de MES (referencia: Aldrich
16373-2, 2 M en agua pura), 2,4 \mul de albúmina
bobina acetilada, 6 \mul de IgG de cabra normal, 1,2 \mul de
anticuerpo antifluoresceína y agua pura hasta un volumen final de
600 \mul.
La fracción de IgG de conejo antifluoresceína,
conjugada a biotina-XX
(Ab-antiFbiot) fue de Molecular Probes (Eugene, OR,
referencia A-982).
La albúmina de suero bovino acetilada
(disolución de BSA acetilada) fue de GibcoBRL Life Technologies
(Rockville, MD. Ref 15561-020).
El grado de reactivo de IgG de cabra fue
proporcionado por Sigma Chemical (St. Louis, MO, referencia:
I-5256).
Después de 10 minutos de hibridación, la matriz
se enjuagó, se lavó con tampón de lavado con 6X
SSPE-Tween 0,01% y se realizó una tercera etapa de
hibridación, utilizando una segunda disolución de tinción definida
como: 300 \mul de MES (2 M en agua pura), 6 \mul de BSA
acetilada y 6 \mul de conjugado de Streptavidin,
R-Phycoerythrin, y agua pura hasta un volumen final
de 600 \mul.
El conjugado de Streptavidin,
R-Phycoerythrin (SRPhy), fue proporcionado por
Molecular Probes (Eugene, OR. Referencia:
S-866).
Después de 10 minutos de hibridación, la matriz
se enjuagó y se lavó utilizando el mismo tampón de lavado que se
definió en la segunda etapa.
Los resultados en términos de porcentajes de
referencia de bases (BC%), intensidades medias de señal para las
celdas de matrices de sondas (S expresado en Unidades Relativas de
Fluorescencia RFU), intensidades medias de fondo (B expresado en
RFU) y la proporción S/B se generaron mediante funciones disponibles
en el software de GeneChip® y se dan a conocer en la tabla
siguiente
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los datos representados demostraron que la
amplificación de señal utilizando tinción con anticuerpo mejora el
porcentaje de referencia de bases y el nivel de intensidad. La
proporción de la señal relativa al fondo también mejora.
\vskip1.000000\baselineskip
El oligonucleótido (ODN-ps)
(5'-CUG AAC GGU AGC AUC UUG AC-3')
con un grupo monofosfato en el extremo 3' fue preparado por
Eurogentec (Seraing Belgium) utilizando química de
fosforamidato.
Se preparó oligoribonucleótido
3'-monotiofosfato tal como se describió en 2.1.
A este oligonucleótido (5 \mul, 1 nmol), se le
añadieron 3 \mul de imidazol (0,1 M en agua pura), 3 \mul de
MnCl_{2} (1 M, en agua pura) y 2 \mul de uno de entre cuatro
marcadores (100 mM) y agua pura hasta un volumen final de 50
\mul. El medio de reacción se homogenizó y se incubó a 65ºC
durante 30 minutos.
\vskip1.000000\baselineskip
Se ensayaron diferentes marcadores:
Marcador a:
N-(biotinoil)-N'-(yodoacetil)etilendiamina
(100 nM en DMSO) (Molecular Probe, referencia:
B-1591).
Marcador b:
(+)-Biotinil-iodoacetamidil-3,6-dioxaoctandiamina
(100 mM en agua pura) (Pierce, Rockford, IL, referencia: 21334)
yodoacetil-PEO-biotina.
Marcador c:
N-yodoacetil-N-biotinilhexilendiamina
(100 mM en DMF) (Pierce, Rockford, IL, referencia: 21333).
Marcador d: 5-(bromometil)fluoresceína
(100 mM en DMSO) un control para la detección sin amplificación de
señal.
\vskip1.000000\baselineskip
A continuación se añadió 500 \mul de tampón de
hibridación (1,5 ml 20X SSPE + 250 \mul Triton 1% + 3,250 ml agua
pura (6X SSPE 0,05% Triton) y esta disolución se homogeneizó por
vortex.
El producto de la reacción se hibridó tal como
se describió en el Ejemplo 1.
Otra etapa de la hibridación se realizó en una
cuadrícula de ADN tal como se describe en el Ejemplo 1.4 para los 3
agentes de marcaje portadores de biotina. Para el marcador d,
el análisis se realizó directamente sin la etapa adicional de
tinción con anticuerpo.
Esta etapa de tinción se realizó utilizando una
disolución de tinción con 300 \mul de MES (2 M en agua pura), 60
\mul de BSA acetilada, 6 \mul de conjugado de Streptavidin,
R-Phycoerythrin (SRPhy) y agua pura hasta un
volumen final de 600 \mul. La disolución de albúmina de suero
bovino acetilada (BSA) fue proporcionada por GibcoBRL Life
Technologies (Rockville, MD, referencia: 15561-020).
El conjugado de Streptavidin, R-Phycoeritrin fue
proporcionado por Molecular Probes (Eugene, OR. Referencia
s-866).
Después de 10 minutos de hibridación, la matriz
se enjuagó y se lavó utilizando tampón de lavado 6X
SSPE-Tween 0,01%.
La detección y el análisis se realizaron en una
matriz de cuadrícula de ADN tal como se describió en el Ejemplo
1.
La matriz de cuadrícula de ADN se diseñó para el
análisis de la secuencia complementaria a ODN-ps
mediante una estrategia de 4-baldosas tal como se
describe en WO 9511995.
Los resultados en términos del porcentaje de
referencias de bases (BC%), nivel de intensidad (S), fondo (B) y
proporción S/B se proporcionan en la tabla siguiente a
continuación:
La amplificación de señal utilizando un derivado
de biotina y tinción con anticuerpo en lugar de marcar con
5-(bromometil)fluoresceína en el LDC es mejor en términos de
porcentaje de referencia de base y nivel de intensidad.
\vskip1.000000\baselineskip
Se aisló ARN total de Escherichia coli
MG1655 cultivada en caldo LB (Teknova). Las células se cultivaron
hasta la fase semilogaritmica a 37ºC y se cosecharon mediante
centrifugación. El ARN se aisló utilizando el equipo RNeasy
(Qiagen). El ARN aislado se cuantificó mediante la medición de la
absorbancia a 260 nm.
Se marcó el ARN con fluoresceína mediante la
combinación de los siguientes en un volumen final de 100 \mul: 8
\mug de ARN, 30 mM CHES (Aldrich, referencia:
22403-0), pH 9 a 9,5, 1 mM
5-(bromometil)fluoresceína (Molecular Probes, añadida a
partir de un reservorio de 50 mM en dimetilformamida), 30 mM cloruro
de manganeso. Los componentes se dispusieron en un tubo de PCR, se
calentaron a 65ºC durante 40 minutos y se enfriaron a 4ºC en un
instrumento GeneAmp PCR System 2400 (Perkin Elmer). Con el fin de
marcar el ARN con biotina se combinó lo siguiente en un volumen
final de 100 \mul: 10 \mug de ARN, 30 mM MOPS (Aldrich,
referencia: 16377-5), pH 7,5, 20 mM
PEO-iodoacetil-biotina (Pierce
Rockford, IL, ref: 21334), 10 mM cloruro de magnesio. Los
componentes se dispusieron en un tubo de PCR, se calentaron a 95ºC
durante 30 minutos, a continuación a 25ºC durante 30 minutos y se
enfriaron a 4ºC en un instrumento de PCR tal como el anterior. Los
fragmentos de ARN marcados se precipitaron mediante la adición de
25 \mug de glicógeno como vehículo. Se incluyeron controles de ARN
(2 femtomoles cada uno) al ARN de E. coli antes del marcaje.
Los contaminantes de ARN control se produjeron mediante
transcripción in vitro de un patrón de plásmido
linearizado.
Las hibridaciones se realizaron en una matriz de
sondas "cadena sentido" de E. coli (Affymetrix). La
matriz de sondas se basa en la secuencia de E. coli
K-12 ("The complete genome sequence of
Escherichia coli K-12", Blattner, F.,
et al., Science, 277:1453-1474 (1997).
La matriz contiene 15 pares de sondas para cada ARN o región
codificante de proteína designada por un b# (Blattner et al.,
ibid.). Para estas regiones, los conjuntos de sondas son
complementarios al ARN nativo (cadena sentido). La matriz contiene
también conjuntos de sondas de regiones intercaladas entre las
regiones b#. Éstas se designan como regiones intergénicas. En este
caso, el conjunto de sonda representa las dos orientaciones de la
regiones intergénicas. Además la matriz de sondas comprende
conjuntos de sondas a un número de secuencias control. Muchos de
estos controles pueden se pueden añadir a las muestras y sirven
como controles de hibridación positivos. La característica de celda
de la matriz es (23,5 x 23,5) \mum^{2} y el área de síntesis es
(12,8 x 12,8) mm^{2}.
La disolución de hibridación comprende 10 \mug
de fragmentos de ARN marcados con fluoresceína o 5 \mug de
fragmentos de ARN marcado con biotina en un volumen final de 200
\mul con 100 mM MES, pH 6,5 a 7,0, 1 M, EDTA Na 20 mM, 0,01%
(v/v) Tween 20, 0,5 nM oligonucleótidos control (marcados con
fluoresceína o biotina, correspondientes a la muestra de ARN), 0,1
mg/ml de ADN de esperma de arenque fragmentado y desnaturalizado y
0,5 mg/ml de BSA acetilada. La disolución de hibridación se inyectó
directamente en el cartucho de la matriz de sondas y se hibridó en
un horno de hibridación GeneChip® (Affymetrix, Santa Clara, CA) a
45ºC durante 16 horas. El lavado y la tinción se realizaron en el
la GeneChip® Fluidics Station (Affymetrix). La disolución de lavado
se definió como se expone a continuación: Tampón de Lavado Estricto,
100 mM MES, pH 6,5 a 7,0, 0,1 M Na^{+}, 0,01% (v/v) Tween 20;
Tampón de Lavado No-Estricto, 6X SSPE (de un stock
20X, BioWhittaker), 0,01% (v/v) Tween 20, 0,005% (v/v) Antifoam
0-30 (Sigma). Para las hibridaciones con ARN marcado
con fluoresceína, las matrices de sondas se colocaron en la
Fluidics Station y se lavaron con el Tampón de Lavado
No-Estricto (10 ciclos de 2 mezclados/ciclo a
25ºC), seguido del Tampón de Lavado Estricto (4 ciclos de 15
mezclados/ciclo a 50ºC) y se llenó con Tampón de Lavado
No-Estricto antes del escaneado. Las matrices de
sondas marcadas con fluoresceína se escanearon en el GeneArray®
Scanner (Hewlett Packard) utilizando los siguientes parámetros de
escaneado: 3 \mum de píxel, longitud de onda 530 nm. A
continuación del pasterizado, la señal de fluoresceína se amplificó
mediante el mezclado de la matriz con 600 \mul de 2 \mug/ml de
anticuerpo antifluoresceína conjugado a biotina
(Ab-antiFbiot), 0,1 mg/ml IgG de cabra normal, y 2
mg/ml BSA acetilada en 100 mM MES, pH 6,5 a 7,0, 1 M Na^{+},
0,05% (v/v) Tween 20 y 0,005% (v/v) Antifoam 0-30
durante 10 minutos a 25ºC. La unión del anticuerpo se siguió
mediante la tinción de la matriz con 600 \mul de 10 \mug/ml
Streptavidin, R-phycoerythrin (SRPhy) en 100 mM
MES, pH 6,5 a 7,0, 1 M Na^{+}, 0,05% (v/v) Tween 20, 0,005% (v/v)
Antifoam 0-30 y 5 mg/ml BSA acetilada durante 10
minutos a 25ºC. A continuación de la tinción con Streptavidin,
R-phycoerythrin, se lavó la matriz con Tampón de
Hibridación no Estricto (10 ciclos de 4 mezclas/ciclo a 30ºC). La
matriz se escaneó utilizando como parámetros de 3 \mum de píxel y
570 nm de longitud de onda. Par las hibridaciones con ARN marcado
con biotina las sondas de matrices se lavaron con Tampón de Lavado
No-Estrictos (10 ciclos de 2 mezclados/ciclo a
25ºC), seguido de Tampón de Lavado Estricto (4 ciclos de 15
mezclados/ciclo a 50ºC) tal como se describió anteriormente. A
continuación se tiño la matriz con Streptavidin,
R-phycoerythrin tal como se describió anteriormente
seguido de un lavado con Tampón de Lavado
No-Estricto (10 ciclos de 4 mezclados/ciclo a
25ºC). La señal en la matriz se amplificó mediante mezclado de la
matriz con 600 \mul de 3 \mug/ml anticuerpo antistreptavidina
(cabra), biotinilado (Vector Laboratorios), 0,1 mg/ml IgG de cabra
normal y 2 mg/ml BSA acetilada en 100 mM MES, pH 6,5 a 7,0, 1 M
Na^{+}, 0,05% (v/v) Tween 20 y 0,005% (v/v) Antifoam
0-30 durante 10 minutos a 25ºC. La matriz se tiñó
otra vez con Streptavidin, R-phycoerythrin tal como
se describió anteriormente seguido de un lavado con Tampón de
Lavado No-Estricto (15 ciclos de 4 mezclas/ciclo a
30ºC). Todas las etapas se manejaron en secuencia en la GeneChip®
Fluidics Station. A continuación se escaneó la matriz utilizando
como parámetros, pixelas de 3 \mum y longitud de onda 570 nm.
Los datos del escaneado se analizaron mediante
el software GenChip® (versión 3.1, Affymetrix). Los datos se
produjeron utilizando el conjunto de software Expression Annalysis
Algorithm con parámetros por defecto. Las referencias presentes se
seleccionaron de las secuencias codificantes (ARN estables y marcos
de lectura abiertos) en la matriz. Las medias de las diferencias se
definieron como las diferencias de intensidad entre las sondas
perfectamente complementarias y las sondas no complementarias,
promediadas entre los 16 pares de sondas utilizadas para definir
una secuencia codificante.
Los resultados de las hibridaciones se resumen
en las dos tablas siguientes.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La Tabla 1 resume los resultados obtenidos a
partir de las secuencias codificantes en la matriz. El valor de la
amplificación por anticuerpo en las dianas marcadas con fluoresceína
se aprecia claramente comparando el número de referencias presentes
y los valores medios de las diferencias. En este caso la señal
adicional generada por la amplificación con anticuerpo incrementa
el número de referencias presentes de 826 a 1199 e incrementa la
diferencia media de 6 a 180. La amplificación con anticuerpo del ARN
marcado con biotina produjo diferencias medias de señales similares
pero ligeramente inferiores a las obtenidas por amplificación de los
marcadores de fluoresceína. Se debe advertir que la cantidad de
muestra marcada con biotina fue la mitad de la muestra marcada con
fluoresceína.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La Tabla 2 resume los datos obtenidos con las
adiciones de ARN control. Con los aditivos marcadas con
fluoresceína, la señal de anticuerpo mejoró considerablemente la
media de los valores de las diferencias convirtiendo cualquiera de
las referencias ausentes o marginales en referencias presentes. Las
adiciones de ARN marcado con biotina produjeron señales superiores
en 10 de 12 de los conjuntos de sondas cuando se compararon a las
adiciones marcadas con fluoresceína después de la amplificación de
la amplificación de señal con anticuerpo.
Claims (18)
1. Procedimiento para la fragmentación y marcaje
uniforme con amplificación de señal de un ácido ribonucleico (ARN),
comprendiendo dicho procedimiento:
- -
- fragmentar de manera no específica y químicamente el ARN con el fin de producir fragmentos que presentan un fosfato terminal en el extremo 3',
- -
- fijar un primer ligando a dicho fosfato terminal, y
- -
- unir indirectamente un agente de marcaje a dicho primer ligando, en el que dicho primer ligando está unido a un primer antiligando, dicho primer antiligando está unido a un segundo ligando y el agente de marcaje es un segundo antiligando portador de por lo menos un marcador y puede reaccionar con dicho segundo antiligando.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que las combinaciones de primer ligando/antiligando y segundo
ligando/segundo antiligando se seleccionan de entre el grupo que
consiste en biotina/estreptavidina, hapteno/anticuerpo,
antígeno/anticuerpo, péptido/anticuerpo, azúcar/lectina y
polinucleótido/polinucleótido complementario.
3. Procedimiento según la reivindicación 2, en
el que los primer y segundo ligandos son el mismo.
4. Procedimiento según la reivindicación 2, en
el que los primer y segundo ligandos son diferentes.
5. Procedimiento según la reivindicación 4, en
el que el primer ligando es un derivado de la fluoresceína y el
segundo ligando es un derivado de la biotina.
6. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que el primer ligando es un derivado de la biotina y el agente
de marcaje o el primer antiligando es un derivado de la
estreptavidina.
7. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que la fragmentación y la fijación se efectúan en una etapa.
8. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que la fragmentación y la fijación se efectúan en dos etapas.
9. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, en el que la fijación del primer ligando al
extremo 3' de un fragmento de ARN se efectúa haciendo reaccionar una
función reactiva, que es portada por dicho primer ligando, al
fosfato que se encuentra en la posición 2', en la posición 3' o en
la posición 2'-3' del monofosfato cíclico, con
respecto a la ribosa.
10. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, en el que la fragmentación de dicho ARN y/o
la fijación del primer ligando al extremo 3' de un fragmento de ARN
se efectúa haciendo reaccionar una función nucleófila, electrófila
o haluro que es portada por dicho primer ligando al fosfato en la
posición 2', en la posición 3' o en la posición
2'-3' del monofosfato cíclico, con respecto a la
ribosa.
11. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que la fragmentación química del ARN se realiza mediante cationes
metálicos que pueden o no estar combinados con un catalizador
químico.
12. Procedimiento según la reivindicación 11, en
el que los cationes metálicos son iones Mg^{++}, Mn^{++},
Cu^{++}, Co^{++} y/o Zn^{++} y en el que el catalizador
químico consiste en imidazol, un análogo sustituido, por ejemplo
N-metilimidazol, o cualquier molécula química que
presenta una afinidad por el ARN y que sea portadora de un núcleo
imidazol o un análogo sustituido.
13. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 12, en el que la fijación del primer ligando al
extremo 3' de un fragmento de ARN se efectúa mediante la reacción
de una molécula R-X con el fosfato que está unido a
la posición 2', a la posición 3' o a la posición
2'-3' del monofosfato cíclico de la ribosa, en el
que R consiste en el primer ligando y X es la función reactiva,
seleccionada de entre el grupo que consiste en el hidroxilo, amina,
hidracina, alcoxilamina, haluro de alquilo, haluro de fenilmetilo,
yodoacetamida o maleimida.
14. Procedimiento según la reivindicación 13, en
el que R-X se selecciona de entre el grupo que
consiste en 5-(bromofluoresceína) y derivados de la yodoacetil
biotina.
15. Fragmento de ARN marcado que es obtenible
mediante el procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones
1 a 14, que comprende en el extremo 3' un fosfato o un tiofosfato,
un primer ligando, un primer antiligando, un segundo ligando y un
agente de marcaje que es un segundo antiligando portador de por lo
menos un marcador, en el que dicho primer ligando está unido a
dicho primer antiligando, dicho primer antiligando está unido a
dicho segundo ligando y dicho segundo ligando está unido a dicho
segundo antiligando y en el que dicho primer ligando es la
fluoresceína, dicho primer antiligando es un anticuerpo
antifluoresceína, dicho segundo ligando es la biotina y dicho
segundo antiligando es la estreptavidina marcada.
16. Fragmento de ARN según la reivindicación 15,
en el que comprende de 10 a 150 nucleótidos.
17. Utilización de un fragmento de ARN según la
reivindicación 15 ó 16 como una sonda para la detección de ARN y/o
ADN o un fragmento de ARN y/o un fragmento de ADN.
18. Utilización de un fragmento de ARN según la
reivindicación 15 ó 16 como una diana marcada que puede unirse a
una sonda de captura.
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