ES2320572T3 - Procedimiento de marcado y de purificacion de acidos nucleicos de interes presentes en una muestra biologica a tratar en un recipiente de reaccion. - Google Patents
Procedimiento de marcado y de purificacion de acidos nucleicos de interes presentes en una muestra biologica a tratar en un recipiente de reaccion. Download PDFInfo
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Abstract
Procedimiento de marcado y de purificación de ácidos nucleicos de interés presentes en una muestra biológica a tratar, que consiste en: disponer de un único recipiente de reacción, introducir en el recipiente de reacción: en la que: - la muestra biológica, - al menos un reactivo de marcado de ácidos nucleicos, siendo dicho reactivo de marcado estable a la temperatura y de fórmula (0): ** ver fórmula** - R 1 representa H o un grupo alquilo, arilo o arilo sustituido, - R 2 representa un marcador detectable o al menos dos marcadores detectables unidos entre sí por al menos una estructura multimérica, - L es un brazo de unión que comprende una cadena lineal de al menos dos enlaces covalentes y n es un número entero igual a 0 ó 1, - R 3 y R 4 representan independientemente uno de otro: H, NO2, Cl, Br, F, I, R 2 -(L)n-Y-X-, OR, SR, NR2, R, NHCOR, CONHR, COOR con R = alquilo o arilo, - A es un brazo de unión que comprende al menos un doble enlace covalente que permite la conjugación de la función diazo con el anillo aromático y u es un número entero comprendido entre 0 y 2, preferentemente de 0 ó 1, y - -Y-X- representa -CONH-, -NHCO-, CH 2O-, CH 2S-. - al menos un soporte sólido que permite la adsorción de dichos ácidos nucleicos, - cualquier ingrediente necesario para el marcado de los ácidos nucleicos y/o para la inmovilización de dichos ácidos nucleicos en el soporte, - incubar el contenido del recipiente de reacción, y - aislar los ácidos nucleicos marcados de este modo.
Description
Procedimiento de marcado y de purificación de
ácidos nucleicos de interés presentes en una muestra biológica a
tratar en un único recipiente de reacción.
La presente invención se refiere a un
procedimiento de marcado de ácidos nucleicos en presencia de al
menos un soporte sólido.
Es estado de la técnica muestra que existen
muchos métodos para marcar nucleótidos, oligonucleótidos o ácidos
nucleicos.
Un primer método consiste en fijar el marcador
en la base, sea ésta natural o modificada. Un segundo método
propone fijar el marcador en el azúcar, sea éste aquí también
natural o modificado. Un tercer método tiene por objeto la fijación
del marcador en el fosfato.
El marcado en la base se ha utilizado
particularmente en el enfoque de marcado de los ácidos nucleicos
mediante incorporación de nucleótidos directamente marcados.
El marcado en el azúcar se utiliza a menudo en
el caso de sondas nucleicas preparadas mediante síntesis
química.
El marcado en el fosfato también se ha utilizado
para introducir brazos funcionarizados y marcadores durante la
síntesis química de los oligonucleótidos.
De hecho, el experto en la materia, que debe
realizar un marcado de un nucleótido o de un análogo de nucleótido
o de un ácido nucleico, es propenso a realizar esta fijación en la
base o en el azúcar que le ofrecen mayor comodidad y más
alternativas. Esto es, además, lo que se aprecia a partir del
estudio de muchos documentos, tales como
EP-A-0.329.198,
EP-A-0.302.175,
EP-A-0.097.373,
EP-A-0.063.879,
US-A-5.449.767,
US-A-5.328.824,
WO-A-93/16094,
DE-A-3.910.151,
EP-A-0.567.841 para la base o
EP-A-0.286.898 para el azúcar.
La fijación del marcador en el fosfato es una
técnica más compleja que la técnica que consiste en funcionalizar a
la base o al azúcar y se ha utilizado mucho menos, particularmente
por causa de la reducida reactividad del fosfato (véase por ejemplo
Jencks W.P. et al., J. Amer. Chem Soc., 82,
1778-1785, 1960). Del mismo modo, en la revista de
O'Donnel y Mc Laughlin ("Reporter groups for the analysis of
nucleic acid structure", p. 216-243, en
"Bioorganic Chemistry: Nucleic Acids", Ed Hecht S. M., Oxford
University Press, 1996) que se refiere a los métodos de
introducción de sondas en los fragmentos de oligonucleótidos, la
alquilación eficaz del fosfodiéster internucleotídico se considera
imposible.
La solicitud de patente
WO-A-99/65926 describe un
procedimiento de marcado de un ácido ribonucleico (ARN) de síntesis
o natural que consiste en fragmentar el ARN y en marcarlo a nivel
del fosfato terminal. Ese documento describe cierto número de
funciones que pueden utilizarse para el marcado junto con la
fragmentación, como las funciones hidroxilo, amina, hidrazina,
alcoxiamina, halogenuro de alquilo, halogenuro de alquilo de tipo
bencílico y en particular el derivado
5-(bromometil)fluoresceína. Estas funciones permiten marcar
los ácidos nucleicos, pero es preciso asociar una etapa de
fragmentación para tener un marcado eficaz, ya que este marcado se
produce en el fosfato liberado durante la fragmentación. Además, es
preciso añadir un exceso importante de reactivo de marcado con
respecto al ARN para obtener un marcado eficaz, lo que induce
problemas de ruido de fondo generados por el exceso de marcador.
Finalmente, este método no funciona eficazmente en ADN de doble
cadena.
Han aparecido nuevos reactivos aún más eficaces
desde el punto de vista del rendimiento de marcado. Estos son
específicos a nivel de la posición de marcado y en particular no
afectan a las propiedades de hibridación de las bases implicadas en
la formación de la doble hélice, por medio de los puentes de
hidrógeno, que son utilizables al tiempo para ADN y ARN y
finalmente que permiten marcar de forma indiferente nucleótidos,
oligonucleótidos, ácidos nucleicos naturales o preparados mediante
amplificación enzimática.
La Solicitante ya ha propuesto dichos nuevos
marcadores que responden a las condiciones mencionadas anteriormente
y que utilizan la función diazometilo como función reactiva para el
marcado. Éste es por ejemplo el caso en:
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
\vskip1.000000\baselineskip
El contenido de esos documentos mencionados
anteriormente se incorpora en este documento como referencia.
El estado de la técnica también describe la
utilización de soporte sólido particularmente de sílice, y más
particularmente en forma de polvo, de gel o de partículas
magnéticas, para purificar ácidos nucleicos antes o después del
marcado, en un proceso que conduce a una detección por hibridación
específica (que se refiere a chips de ADN, pero también a las
placas de ELISA o formas de ensayos rápidos). La purificación antes
del marcado permite mejorar considerablemente el rendimiento de
marcado, la purificación después del marcado permite mejorar de
forma determinante el rendimiento de hibridación y la proporción
señal/ruido, necesaria para una buena sensibilidad del ensayo.
Éste el caso de la patente
EP-B-0.389.063 que propone un
procedimiento de aislamiento de los ácidos nucleicos que contienen
un material biológico complejo de partida, consistiendo el
procedimiento por lo tanto en mezclar el material de depósito con
una sustancia caotrópica y una fase sólida, permitiendo la fase
sólida la fijación de ácidos nucleicos que posteriormente pueden
limpiarse o eluirse del resto de complejos creados de este modo.
El contenido de esta patente también se
incorpora en este documento como referencia.
De hecho, estas dos técnicas se emplean de forma
independiente, realizándose las etapas de purificación y de marcado
en diferentes consumibles, con modos operatorios también diferentes.
La presencia de dos etapas impone por lo tanto transferencias de
líquidos, potencialmente factores de contaminación, de pérdida de
material y de forma general, moderadamente automatizable.
Por otro lado, el procedimiento que combina el
marcado y la purificación en sílice presenta muchas ventajas que
hasta ahora eran desconocidas para el experto en la materia.
Primera ventaja, el procedimiento de acuerdo con
la invención en un medio de reacción que permite a la vez la
reacción de marcado y la captura, mediante adsorción por ejemplo, de
los ácidos nucleicos en perlas magnéticas de sílice no conlleva
ninguna disminución de la eficacia del marcado, marcado que por lo
tanto, no resulta afectado por la presencia de la sílice
magnética.
Segunda ventaja, el procedimiento es
comparativamente mucho más rápido de aplicar que un procedimiento en
dos etapas diferenciadas de marcado y purificación.
Tercera ventaja de la invención, ésta permite
concentrar los ácidos nucleicos marcados en un volumen muy reducido,
del orden de 0,1 a 10 \mul, estado los ácidos nucleicos fijados
en las perlas y pudiendo eluirse mediante un simple tampón de
hibridación convencional sin recurrir a un tampón de elución. Por lo
tanto, es posible suprimir completamente esta etapa de dilución y
mejorar la sensibilidad del procedimiento, concentrándose más los
ácidos nucleicos durante la hibridación.
Además, el proceso puede automatizarse
fácilmente, lo que constituye una cuarta ventaja, debido a la
flexibilidad de la utilización de perlas magnéticas y de la
relativa sencillez del procedimiento (calentamiento, lavado,
elución). La utilización de perlas magnéticas permite
particularmente hacer variar la capacidad de captura de los
sistemas muy fácilmente, mediante simple modificación de la cantidad
de perlas utilizadas. El procedimiento también puede utilizarse en
un sistema que utiliza un flujo continuo, permitiendo simplificar
las etapas de lavado. No hay entonces que realizar pipeteo de
líquido.
Una quinta ventaja de este procedimiento se basa
en el hecho de que permite la transferencia de los ácidos nucleicos
en forma sólida, es decir adsorbidos a las perlas de sílice
magnéticas, lo que le hace fácilmente utilizable en
microcomponentes, tecnología que actualmente está en pleno
desarrollo.
Finalmente una sexta ventaja, entre otras, que
también está vinculada a la automatización del procedimiento
(cuarta ventaja descrita) consiste en un procedimiento que puede
estar completamente integrado en un único tubo, de la purificación
del ácido nucleico a la hibridación en chip, pasando por el marcado
si, por supuesto, nos encontramos en el marco de un procedimiento
que no necesita etapa de amplificación. Esto conlleva la reducción
de los riesgos de contaminación y la disminución del número de
consumibles empleados.
La presente invención se refiere esencialmente a
un procedimiento de marcado y de purificación de ácidos nucleicos
de interés presentes en una muestra biológica a tratar, que consiste
en:
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
\vskip1.000000\baselineskip
De acuerdo con una primera realización de la
invención, el procedimiento de marcado y de purificación anterior
se caracteriza porque los ácidos nucleicos tratados pueden estar
constituidos por ADN y/o ARN, de cadena sencilla y/o de cadena
doble, sintéticos y/o naturales.
De acuerdo con una segunda realización de la
invención, el procedimiento de marcado y de purificación anterior
se caracteriza porque el reactivo de marcado puede permitir:
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
\vskip1.000000\baselineskip
Siempre de acuerdo con esta segunda realización
de la invención, el marcado del extremo 3' o 5' de un fragmento de
ácido nucleico puede realizarse mediante fijación, en el fosfato en
posición 2', en posición 3' o en posición
2'-3'-monofosfato cíclico, con
respecto a la ribosa, de una función reactiva portada por un
marcador.
También de acuerdo con esta segunda realización
de la invención, la fragmentación y/o el marcado del extremo 3' o
5' de un fragmento de ácido nucleico puede realizarse mediante
fijación, en el fosfato en posición 2', en posición 3' o en
posición 2'-3'-monofosfato cíclico,
con respecto a la ribosa, de una función nucleófila, electrófila o
halogenuro portada por un marcador.
De acuerdo con las variantes de realización de
esta segunda realización de la invención, la fragmentación de los
ácidos nucleicos puede realizarse por vía:
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
\vskip1.000000\baselineskip
Sea cual sea la realización, el marcado del
extremo 3' o 5' de un fragmento de ARN puede realizarse mediante
fijación, en el fosfato unido a la posición 2', a la posición 3' o a
la posición 2'-3'-monofosfato
cíclico de la ribosa, de una molécula R-X, donde R
está constituido por el marcador y X es el agente de unión entre el
marcador y el ARN, tal como un grupo hidroxilo, amina, hidrazina,
alcoxilamina, halogenuro de alquilo, fenil-metil
halogenuro, yodoacetamida o maleimida.
Sea cual sea la realización, el marcado en el
grupo fosfato puede realizarse por medio de
5-(bromometil)-fluoresceína.
De acuerdo con una realización particular, el
procedimiento de marcado y de purificación, de acuerdo con la
invención, se caracteriza porque el reactivo de marcado puede
ponerse en contacto con los ácidos nucleicos en solución homogénea,
en un tampón prácticamente acuoso, siendo dicho reactivo de marcado
estable a la temperatura y de fórmula (0):
en la
que:
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
\vskip1.000000\baselineskip
De acuerdo con esta realización particular, el
reactivo de marcado puede ser de fórmula (1):
en la
que:
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
\vskip1.000000\baselineskip
De acuerdo con las dos características
anteriores, el reactivo puede ser de fórmula (2):
en la
que:
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
\newpage
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
\vskip1.000000\baselineskip
De acuerdo con una primera variante de las dos
realizaciones anteriores, el reactivo puede ser de fórmula (3):
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la
que:
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
\vskip1.000000\baselineskip
De acuerdo con una variante de las dos
realizaciones anteriores, el reactivo puede ser de fórmula (4):
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la
que:
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
\newpage
De acuerdo con otra variante de la primera de
estas dos realizaciones anteriores, el reactivo puede ser de
fórmula (21):
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la que:
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
\vskip1.000000\baselineskip
De acuerdo con otra variante más de la primera
de estas dos realizaciones anteriores, el reactivo puede ser de
fórmula (22):
\vskip1.000000\baselineskip
en la
que:
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
\newpage
Siempre de acuerdo con otra variante de la
primera de estas dos realizaciones anteriores, el reactivo puede
ser de fórmula (23):
en la
que:
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
\vskip1.000000\baselineskip
De acuerdo con todas las variantes de estas dos
realizaciones anteriores, el reactivo, R^{3} y R^{4} pueden
representar independientemente uno de otro: H, NO_{2}, OCH_{3},
-CO-NH-(CH_{2})_{3}-(O-CH_{2}-CH_{2})_{3}-CH_{2}-NH-R^{2},
-CO-NH-(CH_{2})_{3}-(O-CH_{2}-CH_{2})_{4}-CH_{2}-NH-R^{2}.
De acuerdo con otra variante de estas
realizaciones anteriores, el reactivo puede ser de fórmula (7):
en la
que:
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
\vskip1.000000\baselineskip
De acuerdo con otra variante más de estas
realizaciones anteriores, el reactivo puede ser de fórmula (24):
en la
que:
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
\vskip1.000000\baselineskip
Sea cual sea la variante de estas realizaciones
anteriores, la estructura R^{2}-(L)_{n}- del reactivo
puede ser de fórmula (5):
en la
que:
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
\vskip1.000000\baselineskip
Sea cual sea la variante de estas realizaciones
anteriores, el reactivo puede ser de fórmula (6):
en la
que
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
\newpage
Sea cual sea la variante de estas realizaciones
anteriores, el reactivo puede ser de fórmula (25):
en la
que:
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
\vskip1.000000\baselineskip
Sea cual sea la variante de estas realizaciones
anteriores, el reactivo puede ser de fórmula (14):
en la
que:
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
\vskip1.000000\baselineskip
Sea cual sea la variante de estas realizaciones
anteriores, el reactivo puede ser de fórmula (26):
en la
que:
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
\vskip1.000000\baselineskip
Sea cual sea la variante de estas realizaciones
anteriores, el reactivo puede ser de fórmula (15):
\vskip1.000000\baselineskip
en la
que:
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
\vskip1.000000\baselineskip
Sea cual sea la variante de estas realizaciones
anteriores, el reactivo puede ser de fórmula (27):
\vskip1.000000\baselineskip
en la
que:
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
\vskip1.000000\baselineskip
De acuerdo con el conjunto de variantes de estas
realizaciones anteriores, el constituyente L del reactivo puede
comprender un resto
-(O-CH_{2}-CH_{2})-, repetido de
1 a 20 veces, preferentemente de 1 a 10 veces y aún más
preferentemente de 2 a 5 veces.
\newpage
De acuerdo con las dos primeras realizaciones,
el reactivo de marcado puede permitir el marcado y la fragmentación
de un ácido nucleico de cadena sencilla o doble, de acuerdo con las
siguientes etapas:
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
en la
que:
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
acoplándose dicho reactivo de
manera covalente y mayoritaria en al menos un fosfato de dicho
fragmento.
\vskip1.000000\baselineskip
De acuerdo con la realización anterior, el
reactivo de marcado puede seleccionarse entre los compuestos de
fórmula (20):
\vskip1.000000\baselineskip
en la
que:
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
\vskip1.000000\baselineskip
en la
que:
- \sqbullet
-
\vtcortauna
- \sqbullet
-
\vtcortauna
\newpage
De acuerdo con una variante de realización, el
grupo Z puede estar constituido por:
De acuerdo con otra variante de realización, la
fragmentación y el marcado pueden realizarse en dos etapas.
De acuerdo con otra variante de realización, la
fragmentación y el marcado pueden realizarse en una etapa.
De acuerdo con otra variante de realización, el
marcado puede realizarse en solución homogénea prácticamente
acuosa.
De acuerdo con otra variante de realización, la
fragmentación puede realizarse por vía enzimática, física o
química.
De acuerdo con las dos primeras realizaciones,
el reactivo de marcado puede ponerse en contacto en solución
homogénea, en un tampón prácticamente acuoso, siendo dicho reactivo
de marcado estable a la temperatura y de fórmula (8):
en la
que:
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
\newpage
- \bullet
-
\vtcortauna
\vskip1.000000\baselineskip
De acuerdo con una variante de la realización
anterior, el reactivo puede ser de fórmula (9):
en la
que:
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
\vskip1.000000\baselineskip
De acuerdo con las dos realizaciones anteriores,
en la fórmula del reactivo, p puede ser inferior o igual a m.
De acuerdo con las tres realizaciones
anteriores, el reactivo puede ser de fórmula (10):
en la
que:
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
\vskip1.000000\baselineskip
De acuerdo con las cuatro realizaciones
anteriores, el reactivo puede ser de fórmula (11):
en la
que:
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
\vskip1.000000\baselineskip
De acuerdo con una realización, el reactivo
R^{2} puede estar constituido por un resto de
D-Biotina de fórmula (12):
De acuerdo con las seis realizaciones
anteriores, el reactivo R^{1} está constituido por: CH_{3}, y
R^{3} y R^{4} representan cada uno: H.
De acuerdo con las siete realizaciones
anteriores, la estructura -(L)_{n}- del reactivo puede
estar constituida por:
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
\vskip1.000000\baselineskip
De acuerdo con las dos primeras realizaciones,
el reactivo de marcado estable a la temperatura puede ponerse en
contacto en solución homogénea, en un tampón acuoso, y es de fórmula
(13):
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
en la que:
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
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De acuerdo con la realización anterior, el
reactivo puede ser de fórmula (16):
en la
que:
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De acuerdo con las diez realizaciones
anteriores, el constituyente L del reactivo puede comprender un
resto -(O-CH_{2}-CH_{2}),
repetido de 1 a 20 veces, preferentemente de 1 a 10 veces y aún más
preferentemente de 2 a 5 veces, estando -Z- representado entonces
por -NH-, -NHCO- o -CONH-.
Sea cual sea la realización, el soporte sólido
puede estar constituido por partículas de sílice.
Sea cual sea la realización, el soporte sólido
puede estar constituido por partículas magnéticas recubiertas de
sílice.
De acuerdo con las dos realizaciones anteriores,
las partículas de sílice que constituyen el soporte sólido pueden
tener tamaños de partícula comprendidos entre 0,1 y 500 \mum y
preferentemente entre 1 y 200 \mum.
Sea cual sea la realización, uno de los
ingredientes suplementarios que permiten el marcado puede estar
constituido por un alcohol, preferentemente isopropanol.
De acuerdo con la realización anterior, el
isopropanol puede constituir el 70% v/v de la mezcla final.
Sea cual sea la realización, uno de los
ingredientes suplementarios que permiten la liberación celular y por
lo tanto la adsorción de los ácidos nucleicos en el soporte sólido
puede estar constituido por un agente caotrópico.
De acuerdo con la realización anterior, el
agente caotrópico empleado puede ser una sal de guanidio, yoduro
sódico, yoduro potásico, (iso)tiocianato sódico, urea o
mezclas de estos derivados.
De acuerdo con la realización anterior, la sal
de guanidio empleada puede ser (iso)tiocianato de
guanidio.
Sea cual sea la realización, pueden separarse
los complejos de fase sólida-ácido nucleico de los líquidos
mediante sedimentación y rechazo del sobrenadante y a continuación
lavado de los complejos con un tampón de lavado que contiene una
sustancia caotrópica.
De acuerdo con la realización anterior, los
complejos de fase sólida-ácido nucleico, lavados con el tampón de
lavado, también pueden lavarse a continuación con ayuda de uno o más
disolventes orgánicos y a continuación someterse a secado.
De acuerdo con la realización anterior, el ácido
nucleico presente en los complejos de fase sólida-ácido nucleico,
estando los complejos lavados y secados, puede eluirse por medio de
un tampón de elución.
Sea cual sea la realización, los complejos de
fase sólida-ácido nucleico obtenidos de este modo pueden ponerse en
contacto con una mezcla en la que están presentes los componentes
para amplificar el ácido nucleico, fijado a dicha fase sólida o
eluido de ésta.
Sea cual sea la realización, la etapa de
incubación puede consistir en mantener la muestra tratada durante
de 5 a 45 minutos, preferentemente durante de 15 a 35 minutos y aún
más preferentemente durante 25 minutos a una temperatura
comprendida entre 45 y 85ºC, preferentemente entre 55 y 75ºC y aún
más preferentemente a 65ºC.
De acuerdo con la realización anterior, después
de la etapa de incubación, la muestra puede llevarse a temperatura
ambiente durante al menos varios minutos, preferentemente 5
minutos.
Por "estructura multimérica", se entiende
un polímero formado por unidades repetidas de sintones químicos o
biológicos. Se menciona un ejemplo en el ejemplo 34.2 de la
descripción de la solicitud de patente
WO-A-02/090319. Se invita al
experto en la materia a remitirse a ese documento si encuentra las
informaciones desarrolladas a continuación insuficientes para su
completa comprensión de este tema. Se conocen muchas variantes de
dichas estructura utilizables en la presente invención, como por
ejemplo:
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\vskip1.000000\baselineskip
Si fuera necesario, el experto en la materia
también puede remitirse a esos documentos para una perfecta
comprensión de este tema.
Por "marcador detectable", se entiende al
menos un marcador capaz de generar directamente una señal
detectable. Por ejemplo la presencia de biotina se considera un
marcado directo, ya que es detectable, incluso aunque es posible
asociarla posteriormente con estreptavidina marcada. A continuación
se proporciona una lista no limitante de estos marcadores:
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Preferentemente, el marcador no es un marcador
radiactivo para evitar problemas de seguridad vinculados a los
marcadores.
En una realización particular de la presente
invención, el marcador es detectable electroquímicamente y en
particular el marcador es un derivado de un complejo de hierro, como
un ferroceno.
La expresión "ácido nucleico" significa una
cadena de al menos dos desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos que
comprende opcionalmente al menos un nucleótido modificado, por
ejemplo al menos un nucleótido que comprende una base modificada,
tal como inosina,
metil-5-desoxicitidina,
dimetilamino-5-desoxiuridina,
desoxiuridina, diamino-2,6-purina,
bromo-5-desoxiuridina o cualquier
otra base modificada que permite la hibridación. Este
polinucleótido también puede modificarse a nivel de la unión
internucleotídica como por ejemplo fosforotioatos,
H-fosfonatos, alquil-fosfonatos, a
nivel del esqueleto como por ejemplo
alfa-oligonucleótidos (FR 2 607 507) o PNA (M.
Egholm et al., J. Am. Chem. Soc., 114,
1895-1897 o 2' O-alquil ribosa y LNA
(BW, Sun et al., Biochemistry, 4160-4169,
43, 2004). El ácido nucleico puede ser natural o sintético, un
oligonucleótido, un polinucleótido, un fragmento de ácido nucleico,
un ARN ribosómico, un ARN mensajero, un ARN de transferencia, un
ácido nucleico obtenido mediante una técnica de amplificación
enzimática tal como:
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Se habla entonces de amplicones para designar a
los ácidos nucleicos generados mediante una técnica de amplificación
enzimática.
Cada una de estas modificaciones puede
combinarse siempre que al menos un fosfato esté presente en el ácido
nucleico.
Por "polipéptido", se entiende una cadena
de al menos dos aminoácidos,
Por "aminoácidos", se entiende:
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Por "etapa de purificación", se entiende
particularmente la separación entre los ácidos nucleicos de los
microorganismos y los constituyentes celulares liberados en la
etapa de lisis que precede a la purificación de los ácidos
nucleicos. Estas etapas de lisis se conocen bien, como ejemplo
indicativo, pueden utilizarse métodos de lisis tales como los
descritos en las solicitudes de patente:
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El experto en la materia podrá utilizar otros
métodos de lisis bien conocidos tales como choques térmicos u
osmóticos o tratamientos con agentes caotrópicos, tales como sales
de guanidio (patente
US-A-5.234.809).
Esta etapa permite generalmente concentrar los
ácidos nucleicos. Como ejemplo, pueden utilizarse partículas
magnéticas (véase a este respecto las patentes
US-A-4.672.040 y
US-A-5.750.338) y de este modo
purificar los ácidos nucleicos, que se han fijado a estas
partículas magnéticas, mediante una etapa de lavado. Esta etapa de
purificación de los ácidos nucleicos es particularmente interesante
si se desea amplificar posteriormente dichos ácidos nucleicos. Una
realización particularmente interesante de estas partículas
magnéticas se describe en las solicitudes de patente
WO-A-97/45202 y
WO-A-99/35500.
La expresión "soporte sólido" tal como se
utiliza en este documento, incluye todos los materiales en los que
puede fijarse un ácido nucleico. Pueden utilizarse materiales de
síntesis o materiales naturales, opcionalmente modificados
químicamente, como soporte sólido, particularmente polisacáridos,
tales como materiales a base de celulosa, por ejemplo papel,
derivados de celulosa tales como acetato de celulosa y nitrocelulosa
o dextrano; polímeros, copolímeros, particularmente a base de
monómeros de tipo estireno, fibras naturales tales como algodón y
fibras sintéticas tales como nylon; materiales minerales tales como
sílice, cuarzo, vidrios, cerámica; látex; partículas magnéticas;
derivados metálicos, geles, etc. El soporte sólido puede estar en
forma de placa de microtitulación, de membrana, de partícula o de
placa prácticamente plana de vidrio o silicio o derivados.
Los ejemplos adjuntos representan realizaciones
particulares y no pueden considerarse como limitantes del alcance
de la presente invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Este experimento se realiza en un modelo llamado
"Myco 16S".
Este nombre designa a los amplicones generados
por PCR a partir de una secuencia de 180 bases de un fragmento del
gen que codifica el ARN ribosómico 16S de Mycobacterium
tuberculosis.
Las condiciones para el cultivo, la extracción
de las micobacterias así como los cebadores de amplificación se dan
en la publicación de Alain Troesch: "Mycobacterium species
identification and rifampin resistance testing with
high-density DNA probe arrays" publicado en J.
Clin. Microbiol. 1999, 37, páginas 49 a 55.
\newpage
La PCR se realiza utilizando como matriz de
partida preparaciones de ADN genómico (10^{3} copias por PCR) con
el kit FastStart High Fidelity PCR System (Roche Diagnostic
Corporation, Basilea, Suiza, Referencia: 03 553 426 001) con 0,2 mM
de cada desoxirribonucleótido, 03 \muM de cebadores y 0,4 \mul
de enzima.
Los parámetros del ciclo de PCR son los
siguientes: 95ºC durante 4 minutos y después 35 ciclos de acuerdo
con el siguiente protocolo: 95ºC durante 30 segundos y después 55ºC
durante 30 segundos y finalmente 72ºC durante 30 segundos. Después
se conserva a 4ºC hasta la detención del sistema.
Los amplicones obtenidos de la PCR descrita
anteriormente se designan en lo sucesivo mediante la expresión
"PCR 16S".
El marcado en fase homogénea se utilizará como
técnica de referencia con respecto a la invención, se le denominará
"control".
Un volumen de 50 \mul de PCR 16S diluido al
1/5 en el tampón de amplificación proporcionado en el kit, se
mezcla con 75 \mul de
meta-Biotin-fenilmetildiazometano, en lo
sucesivo denominado "m-BioPMDAM", (a 50 mM de
Di-Metilsulfóxido, en lo sucesivo designado
"DMSO") y 102,5 \mul de H_{2}O y después se incuban
durante 25 minutos a 95ºC. A continuación se añaden 22,5 \mul de
HCl a 0,1 M en el medio de reacción y después se incuba de nuevo a
95ºC durante 5 minutos.
A continuación se purifica el medio de reacción
con el kit QIAQuick (QIAgen GmbH, Hilden, Alemania. Referencia: 28
306) utilizando el protocolo del fabricante y después se hibrida en
chip de ADN (Affymetrix, Santa Clara, CA). El chip de ADN utilizado
está diseñado para el análisis de la región 213-415
de la secuencia M20940 (Referencia del GenBAnk) del ADN 16S de
Mycobacterium tuberculosis. Este chip de ADN se describe, con
el protocolo de hibridación correspondiente, en el artículo de A.
Troesch et al.: "Mycobacterium species identification and
rifampin resistance testing with high-density DNA
probe arrays" publicado en J. Clin. Microbiol. 1999, 37, páginas
49 a 55.
Paralelamente, la PCR se trata siguiendo el
protocolo descrito a continuación.
Un volumen de 10 \mul de PCR (para utilizar la
misma cantidad de PCR que para el control descrito en el párrafo B)
se mezcla con 25 \mul de m-BioPMDAM (50 mM en DMSO), 5
\mul de HCl 0,2 M, 140 \mul de isopropanol (% final = 70% v/v)
y 20 \mul de perlas de sílice magnéticas MagPrep (Merck KGaA,
Darmstadt, Alemania. Referencia: 1.01193.0001).
Esta mezcla se incuba durante 25 minutos a 65ºC
y después 5 minutos a temperatura ambiente. A continuación se lava
el sedimento magnético tres veces con 250 \mul de isopropanol al
70% (en H_{2}O al 30% v/v) y después los ácidos nucleicos
adsorbidos en la sílice se eluyen en una mezcla de 100 \mul de
tampón EB (Elution Buffer, QIAgen. Referencia: 19086), a la que se
añaden 400 \mul de tampón de hibridación (6x SSPE (NaCl 0,9 M,
NaH_{2}PO_{4} 60 mM, EDTA 6 mM, pH 7,4), Triton x 100 al 0,05%
(v/v). Este tampón se prepara siguiendo el protocolo descrito en la
publicación de A Troesch et al., descrita en el párrafo
anterior, para reproducir las condiciones utilizadas para el
control.
Los resultados en términos de porcentaje de
homología, de intensidad de la señal (I) y de ruido de fondo (B) se
agrupan en la tabla 1 siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
En conclusión, los resultados obtenidos con un
procedimiento de reacción de acuerdo con la invención son
comparables a los obtenidos con un procedimiento más
"convencional" en dos etapas separadas de purificación y
marcado. Además, el procedimiento de reacción es mucho más corto,
aproximadamente un 50% menos de tiempo, en el caso del marcado y
escisión en fase sólida (es decir 15 minutos en lugar de media
hora).
Se observa también que los valores de
intensidades medidas son prácticamente similares. Esto indica que el
rendimiento de purificación es similar siguiendo los dos métodos de
purificación (QIAquick o perlas magnéticas).
Un volumen de 50 \mul de PCR 16S diluido a
1/10 en tampón de amplificación (se realiza esta dilución para
poner a prueba la sensibilidad del ensayo, reduciendo la
concentración de amplicones) se mezcla con 39,5 \mul de
N,N'-Bis(13-biotinoilamino-4,7,10-trioxatridecil)-5-(diazometil)isoftalamida
(en lo sucesivo denominado "bisBioPDAM") 190 mM en DMSO, 110,5
\mul de DMSO y 15 \mul de H_{2}O y después se incuban durante
25 minutos a 95ºC. A continuación se añaden 35 \mul de HCl 0,1 M
en el medio de reacción y después se incuba de nuevo a 95ºC durante
5 minutos.
El medio de reacción se purifica a continuación
con el kit QIAquick utilizando el protocolo del fabricante y
después se hibrida en chip de ADN (Affymetrix, Santa Clara, CA) de
la misma manera que en el ejemplo 1.
Paralelamente, la misma PCR diluida a 1/10 se
trata siguiendo otro protocolo. El volumen de 50 \mul de PCR se
mezcla con 39,5 \mul de bisBioPDAM 190 mM en DMSO, 5 \mul de HCl
0,4 M, 175 \mul de isopropanol (% final = 70% v/v), 6,5 \mul de
DMSO y un sedimento de 20 \mul de perlas de sílice magnéticas
MagPrep.
Esta mezcla se incuba durante 15 minutos a 80ºC
y después 5 minutos a temperatura ambiente. El sedimento magnético
se lava a continuación tres veces con 250 \mul de isopropanol al
70% (en H_{2}O al 30% v/v) y después los ácidos nucleicos
adsorbidos en la sílice se eluyen en una mezcla de 100 \mul de
tampón de elución EB (véase anteriormente), a los que se añaden 400
\mul de tampón de hibridación. La hibridación se realiza de la
misma manera que en el ejemplo 1.
Los resultados en términos de porcentaje de
homología, de intensidad de la señal (I) y de ruido de fondo (B) se
agrupan en la tabla 2 siguiente:
En conclusión, los resultados obtenidos con un
procedimiento de reacción de acuerdo con la invención son mejores
que los obtenidos con un procedimiento más "convencional" en
dos etapas separadas de purificación y marcado cuando se utiliza
bisBioPDAM, en una PCR diluida.
Esta molécula, más soluble que el
m-BioPDAM, que tiene dos grupos de biotina, permite por otro
lado mejorar la sensibilidad del ensayo utilizando el marcado en
soporte sólido. Esto es visible en la mejora de los valores de
intensidad (I) y de proporción de señal con respecto a ruido (I/B)
que mejoran con respecto al procedimiento "convencional".
\newpage
La utilización del procedimiento de reacción y
de bisBioPDAM permite por lo tanto obtener un ensayo muy robusto
(gran valor de intensidad, poca sensibilidad a las variaciones entre
ensayos) para un menor número de copias.
\vskip1.000000\baselineskip
La expresión "PCR VHB" designa en lo
sucesivo en el texto el producto de amplificación por PCR de un
fragmento de 3200 pares de bases del genoma del virus de la
hepatitis B, que se genera de la siguiente manera:
Aproximadamente 10^{3} copias de ADN de virus
de la hepatitis B (VHB), contenidos en un volumen de 15 \mul de
sobrenadante de un cultivo celular, se amplifican por PCR utilizando
el kit Expand High Fidelity (Roche Diagnostic Corporation, Basilea,
Suiza. Referencia: 1732 641).
Como información, el medio de reacción final
utilizado en el kit contiene 1,5 mM de MgCl_{2}, 200 \muM de
cada dNTP y 2,6 Unidades de una mezcla de ADN polimerasas Taq
y Pow; 0,3 \muM de cebadores P1 y P2 cuyas secuencias
son:
- P1: 5'-CCGGAAAGCTTGAGCTCTTCTTTTTCACCTCTGCTAATCA-3'
- P2: 5'-CCGGAAAGCTTGAGCTCTTCAAAAAGTTGCATGGTGCTGG-3',
se añaden a la mezcla, para
permitir la amplificación del fragmento de 3200 nucleótidos
esperado.
\vskip1.000000\baselineskip
Una descripción de esta PCR se presenta en el
artículo de Gunther S. et al., "A novel method for
efficient amplification of whole hepatitis B virus genome permits
rapid functionnal analysis and reveals deletion mutants in
immunosuppressed patients", Journal of Virology, septiembre de
1995, páginas 5437 a 5444.
Este PCR VHB se utiliza para disponer de una PCR
que actúa sobre secuencias de ácidos nucleicos mucho más largas que
con el modelo myco (3200 bases en lugar de 180 para myco 16S) para
estudiar el rendimiento de captura de las perlas magnéticas en dos
modelos muy diferentes.
\vskip1.000000\baselineskip
Un producto de amplificación por PCR de una
parte del gen 16S de Mycoplasma tuberculosis, amplificado de
la misma manera que se ha descrito en el ejemplo 1, y paralelamente
un producto de PCR VHB se tratan de la siguiente manera:
Un volumen de 10 \mul de PCR se mezcla con 25
\mul de m-BioPMDAM (50 mM en DMSO), 5 \mul de H_{2}O,
140 \mul de isopropanol (% final = 70% v/v) y 20 \mul de perlas
de sílice magnética MagPrep.
Esta mezcla se incuba durante 25 minutos a 65ºC
y después 5 minutos a temperatura ambiente. El sedimento magnético
se lava a continuación tres veces con 250 \mul de isopropanol al
70% (en H_{2}O al 30% v/v) y después los ácidos nucleicos
adsorbidos en la sílice se eluyen en 50 \mul de tampón EB.
Paralelamente las mismas soluciones de PCR se
marcan siguiendo el mismo protocolo (isopropanol sustituido por
H_{2}O) y después se purifican siguiendo el protocolo QIAquick y
se eluyen en un volumen final de 50 \mul.
Los productos de purificación así como las PCR
iniciales se analizan en un aparato BioAnalyser 2100 (Agilent, Palo
Alto, CA, Estados Unidos, Referencia: G2940CA) utilizando el
protocolo del fabricante, para cuantificarlos.
\newpage
Los valores obtenidos se reproducen en la tabla
3 reproducida a continuación:
\vskip1.000000\baselineskip
Para concluir, estos resultados añadidos a los
obtenidos en chip, muestran que la liberación de ácidos nucleicos
en el medio de reacción es reducida. En el marco del kit QIAgen, la
parte esencial de la captura se realiza en fragmentos de pequeño
tamaño, lo que permite su utilización con los productos de escisión
hibridados, necesitando la hibridación en chip de ADN en algunos
casos una escisión de los productos de PCR (véase por ejemplo Zhang
et al., "Reproducible and inexpensive probe preparation for
oligonucleotide arrays", publicado en Nucleic Acid Res. 2001,
29, e66. Los resultados presentados en este ejemplo permiten mostrar
que el protocolo utilizado con las perlas magnéticas permite
capturar una gama más amplia de tamaño de fragmentos. Esto permite
una mayor flexibilidad de la tecnología, ya que es posible, a
partir del producto de PCR de tamaños muy variados, obtener,
mediante modulación de la escisión, fragmentos de ADN marcados de
tamaño adaptado a la aplicación prevista, sin coacción técnica
notable.
\vskip1.000000\baselineskip
El ADN genómico, que en lo sucesivo se
denominará "ADNg", se extrae a partir de un cultivo líquido de
Staphylococcus aureus de 18 horas en medio Tripticasa de
soja (bioMérieux, Marcy, Francia. Referencia: 41 146).
El ADNg se purifica con columna de intercambio
iónico "Genomic Tips 500" (QIAgen. Referencia: 10262) siguiendo
el protocolo del fabricante y se cuantifica mediante medición de la
adsorbancia a 260 nm.
Un volumen de 10 \mul de ADNg que contiene
aproximadamente 10^{9} copias de genomas bacterianos se mezcla
con 25 \mul de m-BioPMDAM (50 mM en DMSO), 5 \mul de
acetato sódico pH = 3, 40 \mul de isopropanol (% final = 70% v/v)
y 20 \mul de perlas de sílice magnéticas MagPrep (Merck).
Esta mezcla se incuba durante 25 minutos a 65ºC
y después 5 minutos a temperatura ambiente. El sedimento magnético
se lava a continuación tres veces con 250 \mul de isopropanol al
70% (en H_{2}O al 30% v/v) y después los ácidos nucleicos
adsorbidos en la sílice se eluyen en una mezcla de 100 \mul de
tampón EB al que se añaden 400 \mul de tampón de hibridación
(Cloruro de Tetrametilamonio, 3 M; Tris, pH 7,8, 10 mM;
Tween-20 al 0,01%; Albúmina de Suero Bovino
Acetilada, 500 \mug/ml; ADN de Esperma de Arenque, 100 \mug/ml.
Este tampón se prepara siguiendo el protocolo proporcionado por
Affymetrix en su manual del usuario: CustomSeq resequencing Array
protocol Versión 2.0).
La mezcla se hibrida en un chip Affymetrix
diseñado para el análisis del gen 16S cuyas características y
protocolo operatorio se describen en el artículo de G. Vernet et
al., "Species differentiation and antibiotic susceptibility
testing with DNA microarrays", publicado en J. Appl. Microbiol.,
2004, 96, páginas 59 a 68 y C. Jay et al., "16S rRNA
gene-based identification of Staphylococcus species
using high density DNA probe array", 10^{th} International
Symposium on staphylococci and Staphylococcal infections Tsukuba, de
octubre de 2002.
\newpage
Los resultados en términos de porcentaje de
homología, de intensidad de la señal (I) y de ruido de fondo (B) se
agrupan en la tabla 4 siguiente:
En conclusión, este resultado es muy
satisfactorio. El porcentaje de homología del 93% permite
identificar de manera ideal la especie bacteriana analizada y
diferenciarla de las demás especies que pueden identificarse en el
chip.
Sabiendo que es posible purificar el ADNg en las
mismas perlas magnéticas que las utilizadas para la purificación
del ADN marcado, puede realizarse el conjunto del protocolo (de la
colonia bacteriana al ADN listo para hibridar) en un único y mismo
tubo, tratado manualmente o en un autómata.
Pueden obtenerse resultados idénticos desde el
punto de vista de la invención, utilizando otras técnicas de
amplificación como NASBA o TMA que generan directamente amplicones
de ARN.
Claims (60)
1. Procedimiento de marcado y de purificación de
ácidos nucleicos de interés presentes en una muestra biológica a
tratar, que consiste en:
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
en la
que:
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
2. Procedimiento de marcado y de purificación de
acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque los
ácidos nucleicos tratados están constituidos por ADN y/o ARN, de
cadena sencilla y/o de cadena doble, sintéticos y/o naturales.
3. Procedimiento de marcado y de purificación de
acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2,
caracterizado porque la introducción del reactivo de marcado
permite:
- -
-
\vtcortauna
\newpage
- -
-
\vtcortauna
4. Procedimiento de marcado y de purificación de
acuerdo con la reivindicación 3, caracterizado porque el
marcado del extremo 3' o 5' de un fragmento de ácido nucleico se
realiza mediante fijación, en el fosfato en posición 2', en
posición 3' o en posición
2'-3'-monofosfato cíclico, con
respecto a la ribosa, de una función reactiva portada por un
marcador.
5. Procedimiento de marcado y de purificación de
acuerdo con la reivindicación 3, caracterizado porque la
fragmentación y/o el marcado del extremo 3' o 5' de un fragmento de
ácido nucleico se realiza mediante fijación, en el fosfato en
posición 2', en posición 3' o en posición
2'-3'-monofosfato cíclico, con
respecto a la ribosa, de una función nucleófila, electrófila o
halogenuro portada por un marcador.
6. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera
de las reivindicaciones 3 a 5, caracterizado porque la
fragmentación de los ácidos nucleicos se realiza por vía:
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
7. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera
de las reivindicaciones 3 a 6, caracterizado porque el
marcado del extremo 3' o 5' de un fragmento de ARN se realiza
mediante fijación, en el fosfato unido a la posición 2', a la
posición 3' o a la posición
2'-3'-monofosfato cíclico de la
ribosa, de una molécula R-X, donde R está
constituido por el marcador y X es el agente de unión entre el
marcador y el ARN, tal como un grupo hidroxilo, amina, hidrazina,
alcoxilamina, halogenuro de alquilo, fenil-metil
halogenuro, yodoacetamida y maleimida.
8. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera
de las reivindicaciones 3 a 7, caracterizado porque el
marcado en el grupo fosfato se realiza por medio de
5-(bromometil)-fluoresceína.
9. Procedimiento de marcado y de purificación de
acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2,
caracterizado porque el reactivo de marcado se pone en
contacto con los ácidos nucleicos en solución homogénea, en un
tampón prácticamente acuoso, siendo dicho reactivo de marcado
estable a la temperatura y de fórmula (0).
10. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 9, en el que el reactivo de marcado utilizado es de
fórmula (1):
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la
que:
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
\newpage
11. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera
de las reivindicaciones 9 ó 10, en el que el reactivo es de fórmula
(2):
en la
que:
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
12. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera
de las reivindicaciones 9 ó 10, en el que el reactivo es de fórmula
(3):
en la
que:
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
13. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera
de las reivindicaciones 9 ó 10, en el que el reactivo es de fórmula
(4):
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
en la que:
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
14. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 9, en el que el reactivo es de fórmula (21):
\vskip1.000000\baselineskip
en la
que:
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
15. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 9, en el que el reactivo es de fórmula (22):
en la
que:
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
16. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 9, en el que el reactivo es de fórmula (23):
\vskip1.000000\baselineskip
en la
que:
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
17. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera
de las reivindicaciones 9 a 16, caracterizado porque, en el
que el reactivo de marcado utilizado comprende R^{3} y R^{4} que
representan independientemente uno de otro: H, NO_{2}, OCH_{3},
-CO-NH-(CH_{2})_{3}-(O-CH_{2}-CH_{2})_{3}-CH_{2}-NH-R^{2},
-CO-NH-(CH_{2})_{3}-(O-CH_{2}-CH_{2})_{4}-CH_{2}-NH-R^{2}.
18. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera
de las reivindicaciones 9 a 11, en el que el reactivo es de fórmula
(7):
\vskip1.000000\baselineskip
en la
que:
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
\newpage
19. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera
de las reivindicaciones 9 ó 14, en el que el reactivo es de fórmula
(24):
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la
que:
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
20. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera
de las reivindicaciones 9 a 19, en el que la estructura
R^{2}-(L)_{n}- del reactivo es de fórmula (5):
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la
que:
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
21. Procedimiento de marcado y de purificación
de ácidos nucleicos de interés presentes en una muestra biológica a
tratar, que consiste en:
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
\newpage
- -
-
\vtcortauna
en la
que:
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
22. Procedimiento de marcado y de purificación
de ácidos nucleicos de interés presentes en una muestra biológica a
tratar, que consiste en:
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
en la
que:
- \bullet
-
\vtcortauna
\newpage
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
23. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera
de las reivindicaciones 9 a 11, en el que el reactivo es de fórmula
(14):
en la
que:
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
24. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera
de las reivindicaciones 9 ó 14, en el que el reactivo es de fórmula
(26):
\vskip1.000000\baselineskip
en la
que:
- \bullet
-
\vtcortauna
\newpage
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
25. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera
de las reivindicaciones 9 a 11, en el que el reactivo es de fórmula
(15):
en la
que:
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
26. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera
de las reivindicaciones 9 ó 14, en el que el reactivo es de fórmula
(27):
en la
que:
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
27. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera
de las reivindicaciones 9 a 26, caracterizado porque el
constituyente L del reactivo comprende un resto
-(O-CH_{2}-CH_{2})-, repetido de
1 a 20 veces, preferentemente de 1 a 10 veces y aún más
preferentemente de 2 a 5 veces.
28. Procedimiento de marcado y de purificación
de ácidos nucleicos de interés presentes en una muestra biológica a
tratar, que consiste en:
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
\newpage
- -
-
\vtcortauna
- \circ
-
\vtcortauna
- \circ
-
\vtcortauna
en la
que:
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
acoplándose dicho reactivo de manera covalente y
mayoritaria en al menos un fosfato de dicho fragmento,
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
29. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 28, caracterizado porque el reactivo de
marcado se selecciona entre los compuestos de fórmula (20):
\vskip1.000000\baselineskip
en la
que:
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
en la que:
- \sqbullet
-
\vtcortauna
- \sqbullet
-
\vtcortauna
30. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 28, caracterizado porque Z es:
31. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera
de las reivindicaciones 28 a 30, caracterizado porque la
fragmentación y el marcado se realizan en dos etapas.
32. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera
de las reivindicaciones 28 a 30, caracterizado porque la
fragmentación y el marcado se realizan en una etapa.
33. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera
de las reivindicaciones 28 a 32, caracterizado porque el
marcado se realiza en solución homogénea prácticamente acuosa.
34. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera
de las reivindicaciones 28 a 33, caracterizado porque la
fragmentación se realiza por vía enzimática, física o química.
35. Procedimiento de marcado y de purificación
de ácidos nucleicos de interés presentes en una muestra biológica a
tratar, que consiste en:
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
en la
que
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
\newpage
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
36. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 35, en el que el reactivo es de fórmula (9):
en la
que:
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
37. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera
de las reivindicaciones 35 ó 36, caracterizado porque en la
fórmula del reactivo, p es inferior o igual a m.
38. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera
de las reivindicaciones 35 a 37, en el que el reactivo es de
fórmula (10):
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la
que:
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
39. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera
de las reivindicaciones 35 a 38, en el que el reactivo es de
fórmula (11):
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la
que:
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
\newpage
40. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera
de las reivindicaciones 35 a 39, caracterizado porque, en el
reactivo, R^{2} está constituido por un resto de
D-Biotina de fórmula (12):
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
41. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera
de las reivindicaciones 35 a 40, caracterizado porque, en el
reactivo, R^{1} está constituido por: CH_{3}, y R^{3} y
R^{4} representan cada uno H.
42. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera
de las reivindicaciones 35 a 41, en el cual la estructura
-(L)_{n}- del reactivo está constituida por:
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
43. Procedimiento de marcado y de purificación
de ácidos nucleicos de interés presentes en una muestra biológica a
tratar, que consiste en:
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
en la
que:
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
\newpage
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
44. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 43, en el que el reactivo es de fórmula (16):
en la
que:
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
45. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera
de las reivindicaciones 35 a 44, caracterizado porque el
constituyente L del reactivo comprende un resto
-(O-CH_{2}-CH_{2}), repetido de
1 a 20 veces, preferentemente de 1 a 10 veces y aún más
preferentemente de 2 a 5 veces, estando -Z- representado entonces
por -NH-, -NHCO- o -CONH-.
46. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 45, caracterizado porque el
soporte sólido está constituido por partículas de sílice.
47. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 46, caracterizado porque el
soporte sólido está constituido por partículas magnéticas
recubiertas de sílice.
48. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera
de las reivindicaciones 46 ó 47, caracterizado porque las
partículas de sílice que constituyen el soporte sólido tienen
tamaños de partícula comprendidos entre 0,1 y 500 \mum y
preferentemente entre 1 y 200 \mum.
49. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 48, caracterizado porque uno de
los ingredientes suplementarios que permiten el marcado está
constituido por un alcohol preferentemente isopropanol.
50. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 49, caracterizado porque el isopropanol
constituye el 70% v/v de la mezcla final.
51. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 50, caracterizado porque uno de
los ingredientes suplementarios que permiten la liberación celular y
por lo tanto la adsorción de los ácidos nucleicos en el soporte
sólido está constituido por un agente caotrópico.
52. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 51, caracterizado porque el agente caotrópico
empleado es una sal de guanidio, yoduro sódico, yoduro potásico,
(iso)tiocianato sódico, urea o mezclas de estos
derivados.
53. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 52, caracterizado porque la sal de guanidio es
(iso)tiocianato de guanidio.
54. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 53, caracterizado porque se
separan los complejos de fase sólida-ácido nucleico de los líquidos
por sedimentación y rechazo del sobrenadante y a continuación
lavado de los complejos con un tampón de lavado que contiene una
sustancia caotrópica.
55. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 54, caracterizado porque los complejos de fase
sólida-ácido nucleico, lavados con el tampón de lavado, se vuelven
a lavar a continuación con ayuda de uno o más disolventes orgánicos
y a continuación se someten a un secado.
56. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 55, caracterizado porque el ácido nucleico
presente en los complejos de fase sólida-ácido nucleico, estando
los complejos lavados y secados, se eluye por medio de un tampón de
elución.
57. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 53, caracterizado porque los
complejos de fase sólida-ácido nucleico obtenidos de este modo se
ponen en contacto con una mezcla en la que están presentes los
componentes para amplificar el ácido nucleico, fijado a dicha fase
sólida o eluído de ésta.
58. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 57, caracterizado porque la etapa
de incubación consiste en mantener la muestra tratada durante de 5
a 45 minutos, preferentemente durante de 15 a 35 minutos y aún más
preferentemente durante 25 minutos a una temperatura comprendida
entre 45 y 85ºC, preferentemente entre 55 y 75ºC y aún más
preferentemente a 65ºC.
59. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 58, caracterizado porque después de la etapa
de incubación, la muestra se lleva a temperatura ambiente durante
al menos varios minutos, preferentemente 5 minutos.
60. Procedimiento de marcado y de purificación,
de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 21, 22, 28,
35 ó 43, caracterizado porque los ácidos nucleicos tratados
están constituidos por ADN y/o ARN de cadena sencilla y/o de cadena
doble, sintéticos y/o naturales.
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