JP2006055166A - 偽陽性結果を低下させる方法 - Google Patents
偽陽性結果を低下させる方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2006055166A JP2006055166A JP2005236516A JP2005236516A JP2006055166A JP 2006055166 A JP2006055166 A JP 2006055166A JP 2005236516 A JP2005236516 A JP 2005236516A JP 2005236516 A JP2005236516 A JP 2005236516A JP 2006055166 A JP2006055166 A JP 2006055166A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- nucleic acid
- solid phase
- binding
- sample
- reagent
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Abstract
【解決手段】試料中の生物学的分子を検出するために必要な試薬中に潜在的に存在する生物学的分子の検出は回避する、試料中の生物学的分子の検出方法であって、
a)生物学的分子を潜在的に含む試料を提供する工程、
b)固相の表面にカップリングされた結合部を提供する工程、
c)生物学的分子を検出するために必要な試薬を提供する工程、
d)試料へ試薬を添加する工程、
e)試料中の生物学的分子を検出する工程、
を含み、工程c)において、又は工程d)において、又は工程c)及びd)において、試薬中に潜在的に存在する生物学的分子が固相の表面にカップリングされた結合部へ結合する条件下で試薬が結合部と物理的に接触している、方法。
【選択図】なし
Description
本発明は、液体をある種の分子から汚染除去するための方法および化合物を提供する。特に、本発明は、試薬を該分子を含まないように維持する方法および化合物に指向される。さらに詳しくは、本発明は、試料中の標的分子の核酸増幅反応を確実とし、偽陽性結果を回避する方法および化合物に指向される。
核酸分析に基づく診断または研究用の微生物学的テストは、依然として重要性を増している。一方において、核酸はしばしば非常に低い濃度で存在し、他方において、核酸は、例えば細胞の溶解の後に、多くの他の固体および溶解した物質の存在下に見出されるので、核酸は、特に、特異的分析物の検出を行う生物特異的アッセイにおいては単離しまたは測定するのが困難である。従って、大部分の場合には、その微生物学的テストは、検出すべき特徴的なDNA分子の少なくとも1つの増幅工程を含む。2つのオリゴヌクレオチドプライマーの選択的結合を含むよく知られたアッセイは、特許文献1に記載されているポリメラーゼ連鎖反応(PCR)である。この方法は、数サイクルにおいて、デオキシヌクレオチド三リン酸の存在下で熱安定性ポリメラーゼによる特異的核酸領域の検出可能なレベルまでの選択的増幅を可能とする。他の可能な増幅反応はリガーゼ連鎖反応(LCR,非特許文献1および非特許文献2); ポリメラーゼリガーゼ連鎖反応(非特許文献3); Gap-LCR(特許文献2); 修復連鎖反応(特許文献3)、3SR(非特許文献4; 非特許文献5; 特許文献4)、およびNASBA(特許文献5)である。さらに、ストランド置換増幅(SDA)、転写媒介増幅(TMA)、およびQβ−増幅がある(レビューについては、例えば、非特許文献6; 非特許文献7参照)。
より一般的には、カチオン性表面を用いて荷電DNA分子を結合させることができ、それにより、例えば、特許文献9は核酸単離用のポリカチオン性支持体を記載しており、特許文献10は荷電膜を記載し、または特許文献11はpH依存性イオン交換マトリックスを記載する。特許文献12は、DNAの可逆的結合のための、固体支持体上の切替え可能な電荷を持つポリマーを開示する。カチオン性表面と同様に、ポリカチオン体もまたある種のDNA−結合親和性を有する非特許文献15は、増大するカチオン性電荷を持つDNAへの結合用の、溶液中におけるポリアミンの親和性の増加を報告している。非特許文献16は、二本鎖および一本鎖核酸の間のカチオン性化合物の選択性を記載する。
[1] 試料中の生物学的分子を検出するために必要な試薬中に潜在的に存在する生物学的分子の検出は回避する、試料中の生物学的分子の検出方法であって、
a)生物学的分子を潜在的に含む試料を提供する工程、
b)固相の表面にカップリングされた結合部を提供する工程、
c)生物学的分子を検出するために必要な試薬を提供する工程、
d)試料へ試薬を添加する工程、
e)試料中の生物学的分子を検出する工程、
を含み、工程c)において、又は工程d)において、又は工程c)及びd)において、試薬中に潜在的に存在する生物学的分子が固相の表面にカップリングされた結合部へ結合する条件下で試薬が結合部と物理的に接触している、方法、
[2] 固相の表面が、容器の内側表面又はピペット先端の内側表面である前記[1]記載の方法、
[3] 固相の表面が、ビーズの表面又は多孔性材料の表面である前記[1]記載の方法、
[4] 結合部の結合親和性が、少なくとも102のファクターで、好ましくは少なくとも103のファクターで、試薬中における生物学的分子の含有量の減少を実現する前記[1]〜[3]いずれか記載の方法、
[5] 結合部が、二本鎖核酸分子を結合することができる部分である前記[1]〜[4]いずれか記載の方法、
[6] 結合部が、生物学的区画を結合することができる部分である前記[1]〜[4]いずれか記載の方法、
[7] 結合部が、二本鎖核酸分子及び生物学的区画を結合することができる部分である前記[1]〜[4]いずれか記載の方法、
[8] a)標的核酸分子を潜在的に含む試料を提供する工程、
b)固相の表面にカップリングされた核酸結合部を提供する工程、
c)標的核酸分子を増幅するために必要な試薬を提供する工程、
d)試料へ試薬を添加する工程、
e)試料中の標的核酸分子を増幅する工程、
を含む、標的核酸分子の増幅方法であって、工程c)において、又は工程d)において、又は工程c)及びd)において、試薬中に潜在的に存在する核酸分子が固相の表面にカップリングされた核酸結合部へ結合する条件下で試薬が核酸結合部と物理的に接触している、方法、
[9] 固相の表面が、容器の内側表面又はピペット先端の内側表面である前記[8]記載の方法、
[10] 固相の表面が、ビーズの表面又は多孔性材料の表面である前記[8]記載の方法、
[11] 核酸結合部が、二本鎖核酸結合部である前記[8]〜[10]いずれか記載の方法、
[12] 二本鎖核酸結合部が、ポリカチオン体、副溝バインダー、インターカレーター、又は抗二本鎖核酸抗体である前記[11]記載の方法、
[13] ビオチン化二本鎖核酸結合部が、固相のストレプトアビジン被覆表面に結合される前記[11]〜[12]記載の方法、
[14] 標的核酸分子の増幅が、試料の微生物学的感染についての試験における核酸増幅である前記[8]〜[13]いずれか記載の方法、
[15] 固相材料であって、二本鎖核酸結合部が該固相材料の表面にカップリングされ、容器、ビーズ、又はピペット先端である固相材料、
[16] 二本鎖核酸結合部が、ポリカチオン体、副溝バインダー、インターカレーター、又は抗二本鎖核酸抗体である前記[15]記載の固相材料、
[17] 固相材料であって、ポリカチオン体、又はインターカレーターが二本鎖核酸結合部として該固相材料の表面にカップリングされた固相材料、
[18] 固相材料であって、生物学的区間を結合することができる結合部が、該固相材料の表面にカップリングされ、容器、又はピペット先端である固相材料、
[19] 結合部が、副溝バインダー、抗体、色素、両親媒性体、又はポリカチオン体である前記[18]記載の固相材料、
[20] 固相材料であって、色素、両親媒性体、ポリカチオン体、又は副溝バインダーが、生物学的区画のための結合部として該固相材料の表面にカップリングされた固相材料、
[21] 固相材料であって、二本鎖核酸分子及び生物学的区画を結合することができる結合部が、該固相材料の表面にカップリングされた固相材料、
[22] ビーズ、多孔性材料、容器、又はピペット先端である前記[21]記載の固相材料、
[23] 2種以上の結合部が該固相材料の表面にカップリングされた、前記[21]又は[22]記載の固相材料、
[24] 2種以上の結合部が、副溝バインダー、インターカレーター、抗体、色素、両親媒性体、およびポリカチオン体からなる群より選択される前記[23]記載の固相材料、
[25] 試料中の標的核酸分子を増幅するために必要な試薬中に潜在的に存在する核酸分子の増幅は回避する、試料中における標的核酸増幅のための前記[15]〜[24]いずれか記載の固相材料の使用、
[26] 標的核酸増幅が、試料の微生物学的感染についての試験の一部である前記[25]記載の使用、ならびに
[27] 標的核酸増幅を行うために必要な試薬及び前記[15]〜[24]いずれか記載の固相材料を含むキット。
固体支持体の表面への、溶液からの例えば核酸のような生物学的分子の結合のための多くの代替法が、当業者に知られているが、これらの代替法はいずれも特殊な適用のための汚染除去方法として適用することはできない。
試料中の生物学的分子を検出するために必要な試薬中に潜在的に存在する生物学的分子の検出は回避する、試料中の生物学的分子の検出方法であって、
a)生物学的分子を潜在的に含む試料を提供する工程、
b)固相の表面にカップリングされた結合部を提供する工程、
c)生物学的分子を検出するために必要な試薬を提供する工程、
d)試料へ試薬を添加する工程、
e)試料中の生物学的分子を検出する工程、
を含み、工程c)において、又は工程d)において、又は工程c)及びd)において、試薬中に潜在的に存在する生物学的分子が固相の表面にカップリングされた結合部へ結合する条件下で試薬が結合部と物理的に接触している、方法である。
a)標的核酸分子を潜在的に含む試料を提供する工程、
b)固相の表面にカップリングされた核酸結合部を提供する工程、
c)標的核酸分子を増幅するために必要な試薬を提供する工程、
d)試料へ試薬を添加する工程、
e)試料中の標的核酸分子を増幅する工程、
を含む、標的核酸分子の増幅方法であって、工程c)において、又は工程d)において、又は工程c)及びd)において、試薬中に潜在的に存在する核酸分子が固相の表面にカップリングされた核酸結合部へ結合する条件下で試薬が核酸結合部と物理的に接触している、方法に関する。
試料に最初に存在するこれらの非標的分子は、本発明によって避けることができない。もし標的分子および非標的分子が核酸分子であれば、そららは、各々、標的核酸分子および非−標的核酸分子と呼ばれる。非−標的核酸分子は、標的核酸分子とは異なる配列を持つ分子である。
本発明の1つの主題は、
試料中の生物学的分子を検出するために必要な試薬中に潜在的に存在する生物学的分子の検出は回避する、試料中の生物学的分子の検出方法であって、
a)生物学的分子を潜在的に含む試料を提供する工程、
b)固相の表面にカップリングされた結合部を提供する工程、
c)生物学的分子を検出するために必要な試薬を提供する工程、
d)試料へ試薬を添加する工程、
e)試料中の生物学的分子を検出する工程、
を含み、工程c)において、又は工程d)において、又は工程c)及びd)において、試薬中に潜在的に存在する生物学的分子が固相の表面にカップリングされた結合部へ結合する条件下で試薬が結合部と物理的に接触している、方法である。
a)固相の表面にカップリングされた結合部を提供する工程、
b)生物学的分子を検出するのに必要な試薬を提供する工程、
c)標的分子を潜在的に含む試料に該試薬を添加する工程、
d)該試料中の生物学的分子を検出する工程;
を含み、ここに、工程b)においてまたは、工程c)において、または工程b)およびc)において、試薬中に潜在的に存在する該生物学的分子が固相の該表面にカップリングされた該結合部に結合する条件下で、該試薬が、該結合部と物理的に接触している、試料中の生物学的分子を検出するのに必要な試薬中に潜在的に存在する生物学的分子の検出は回避する、試料中の生物学的分子を検出する方法である。
本発明のこの態様においては、該標的分子を検出するのに必要な試薬を、試料への添加に先立ってその表面にカップリングされた結合部を有する容器中に供し、維持しおよび/または混合する。もし試薬を1つの容器からもう1つの容器に移す場合、あるいはもし試薬を最終的に試料に添加する場合、本発明の1つの態様においては、その表面にカップリングされた結合部を有するピペット先端を用いる。本発明による結合部で機能性化された固相は、好ましくは、例えば、試験管またはピペット先端のようなプラスチックデバイス、または例えば反応容器のようなガラスデバイスである。
f)該結合部に会合した生物学的分子を溶出させる工程、及び、
g)該溶出された生物学的分子を検出する工程:
を含む。
もし結合部が二本鎖核酸分子に結合すれば、それらは二本鎖核酸結合部と呼ばれる。二本鎖核酸結合部または「ds-NAバインダー」というフレーズは、本発明を通じて同等なものとして用いられる。
ポリカチオン体は、複数電荷を有する巨大分子である。ポリマーまたはペプチドの場合には、このポリカチオン体はある量のモノマーを含み、各モノマーは正電荷または負電荷を有するか、または中性である。従って、そのようなポリカチオン体は、全てのモノマー電荷の総和であるその正味の電荷によって特徴付けられる。その例はペプチドまたはポリアミド誘導体である。例えば、ジスタマイシンまたはメチル‐イミダゾール‐ポリアミド誘導体のような副溝バインダー(MGB)は、二本鎖核酸の副溝に結合する分子である。例えばアクチノマイシンDまたは臭化エチジウムのようなインターカレーターは、二本鎖核酸のスタックされた塩基対の間に結合する分子である。抗-ds DNA抗体は二本鎖DNAのみに選択的に結合し、一本鎖DNAには結合しないことが知られている。ds-NAバインダーのこれらの種類は当業者に知られており、さらなる情報は「先行技術背景」の章に含まれている。
適当なDNA検出方法は当業者に知られており、Sambrook et al.: Molecular Cloning, A Laboratory Manual (第2版, Cold Spring Harbour Laboratory Press Cold Spring Harbour, NY)またはAusubel et al.: Current Protocols in Molecular Biology (1987) J. Wiley and Sons, NY)などの標準的なテキストに記載されている。検出方法は、限定されるものではないが、二本鎖DNAにインターカレートし、しかる後その蛍光を変化させる臭化エチジウムのような特異的な色素の結合またはインターカレーティングを含むことができる。精製されたDNAは、所望により制限消化後に電気泳動方法によって分離し、しかる後可視化することもできる。特異的配列へのオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、引き続いてのハイブリッドの検出を利用するプローブ‐ベースのアッセイもある。また、当業者に知られたさらなる工程後にDNAを配列決定することもできる。他の方法は、特異的プローブが結合するシリコンチップに多様なDNA配列を適用し、相補的な配列が結合する場合にシグナルを生じる。
a)標的核酸分子を潜在的に含む試料を提供する工程、
b)固相の表面にカップリングされた核酸結合部を提供する工程、
c)標的核酸分子を増幅するために必要な試薬を提供する工程、
d)試料へ試薬を添加する工程、
e)試料中の標的核酸分子を増幅する工程、
を含む、標的核酸分子の増幅方法であって、工程c)において、又は工程d)において、又は工程c)及びd)において、試薬中に潜在的に存在する核酸分子が固相の表面にカップリングされた核酸結合部へ結合する条件下で試薬が核酸結合部と物理的に接触している、方法に関する。
a)標的核酸分子を潜在的に含む試料を提供する工程、
b)固相の表面にカップリングされた核酸結合部を提供する工程、
c)該標的核酸分子を増幅するのに必要な試薬を提供する工程、
d)該試薬を該試料に添加する工程、
e)該試料中の該標的核酸分子を増幅する工程;
を含み、ここに、工程c)において、または工程d)において、または工程c)およびd)において、該試薬中に潜在的に存在する該核酸分子が固相の該表面にカップリングされた該核酸結合部に結合する条件下で、該試薬が、該核酸結合部と物理的に接触している、試料中の該標的核酸分子を増幅するのに必要な該試薬中に潜在的に存在する核酸分子の増幅は回避する、標的核酸分子を増幅する方法に関する。
a)固相の表面にカップリングした核酸結合部を提供する工程、
b)該標的核酸分子を増幅するのに必要な試薬を提供する工程、
c)標的核酸分子を潜在的に含む試料に該試薬を添加する工程、
d)該試料中の該標的核酸分子を増幅する工程;
を含み、ここに工程b)において、または工程c)において、または工程b)および工程c)において、該試薬中に潜在的に存在する該核酸分子が固相の該表面にカップリングした該核酸結合部に結合する条件下で、該試薬が、該核酸結合部と物理的に接触している、試料中の標的核酸分子を増幅する方法に関する。
a)固相の表面にカップリングされた核酸結合部を提供する工程、
b)該標的核酸分子を増幅するのに必要な試薬を提供する工程、
c)標的核酸分子を潜在的に含む試料に該試薬を添加する工程、
d)該試料中の該標的核酸分子を増幅する工程;
を含み、ここに、工程b)において、または工程c)において、または工程b)および工程c)において、該試薬中に潜在的に存在する該核酸分子が固相の該表面にカップリングされた該核酸結合部に結合する条件下で、該試薬が、該核酸結合部に物理的に接触している、試料中の該標的核酸分子を増幅するのに必要な該試薬中に潜在的に存在する核酸分子の増幅は回避する、試料中の標的核酸分子を増幅する方法に関する。
f)該核酸結合部と会合した核酸分子を溶出させる工程;および
g)該溶出した核酸分子を検出する工程
を含む。
副溝バインダー(MGB)、ペプチドおよびインターカレーターの合成
材料
rinkアミド樹脂およびFmoc−Glu(ビオチニル−PEG)−OHはNovabiochem (Merck Biosciences AG, Laufelfingen,Switzerland)から購入した。4(Fmoc−アミノ)−1−メチルピロール−2−カルボン酸(Fmoc−Amp−OH)および4−(Fmoc−アミノ)−1−メチル−1H−イミダゾール−2−カルボン酸(Fmoc−Im−OH)はFlukaから購入し、Fmoc−Orn−OHおよびFmoc−Nva−OHはBachem(Bubendorf,Switzerland)から購入した。全ての他のアミノ酸はApplied Biosystems (Foster City, USA)から入手した。HBTUおよびHOBtはIris Biotech(Marktredwitz, Germany)からのものであった。ペプチド合成溶媒(DMF、NMP)はMerck AG(Darmstadt, Germany)から入手し、同様の全ての他の溶媒は商業的に入手可能な最高の生化学グレードのものであった。
全ての化合物は手動、あるいはFastMoc Chemistryを用いるApplied Biosystes Inc.433ペプチドシンセサイザーで組立てた。通常のカップリング反応は、特に断りのない限り、HOBt/HBTUおよびDIPEAで活性化されたFmocアミノ酸(1ミリモル)を用いて1時間で行った。Fmocの除去は、DMF中の20%ピペリジンで樹脂を2×5分処理することによって行った。三官能性アミノ酸の側鎖は以下のように保護した:Arg(Pmc)、Asn(Trt)、Asp(OtBu)、Gln(Trt)、Glu(OtBu)、Lys(Boc)、Ser(tBu)、Thr(tBu)、Trp(Boc)、Tyr(tBu)。
MGB 1
Bi−PEG−ジスタマイシン
H−Glu(ビオチニル−PEG)−Nva−Orn−Nva−Amp−Amp−Amp−Arg−NH2
0.25ミリモルのrinkアミド樹脂(0.43ミリモル/g)への最初のアルギニンへの慣用的なアンカリングおよび引き続いてのそのFmoc基の除去の後に、樹脂を順次NMP、イソプロパノールおよびNMPで洗浄した。DIPEA(DMF中2M)をFmoc−Amp−OH(2ミリモル)およびHOBt/HBTU(1:1;2ミリモル)の溶液に添加した。2分間の活性化の後、この混合物を樹脂に添加した。懸濁液を3時間震盪し、樹脂をDMFおよびイソプロパノールで徹底的に洗浄した。全ての3つのAmp−残基が配列に取り込まれるまで、この手順を3回反復した。Fmoc−基を前記したように切断し、二重カップリングを使用する通常のカップリング条件下でNva、Orn、NvaおよびGlu(ビオチニル−PEG)によってペプチド鎖を伸長させた。N−末端Fmoc−基を切断し、樹脂をDMFで洗浄した後、樹脂を、TFA、トリエチルシランおよびエタンジチオール(0.8/0.5/1.5)を含有する(100mgの樹脂当たり)2.8mlの混合物で切断した。樹脂を濾去し、溶出物に対して300mlの冷ジイソプロピルエーテルによってペプチドを沈殿させた。沈殿をエーテルで洗浄し、真空中で乾燥し、vydac polygosilでの分取用HPLC精製のために酢酸/水(1/5)に溶解させた。
LC−ESI−MS: m/z=1410.12[M+H]+; C64H104N20O14Sの計算値Mr=1409.59Da
Bi−PEG−ジスタマイシン(Argを含まず)
H−Glu(ビオチニル−PEG)−Nva−Orn−Nva‐Amp−Amp−Amp−NH2
この物質は、Fmoc−Arg(Pmc)を最初のアミノ酸として樹脂にカップリングしなかった以外はMGB 1につき記載したように手順に従って合成した。
LC−ESI−MS:m/z=1253,74[M+H]+; C58H92N16O13Sの計算値、Mr=1253,51Da。
Bi−PEG−イミダゾール−誘導体
H−Glu(ビオチニル−PEG)−Nva−Orn−Nva−Im−Im−Im−Arg−NH2
この物質は、Fmoc−Amp−OHを4−(Fmoc−アミノ)―1−メチル−1H −イミダゾール−2−カルボン酸(Fmoc−Im−OH)によって置き換える以外は、Bi−PEG−ジスタマイシンにつき記載した手順に従って合成した。
LC−ESI−MS: m/z=1412.86[M+H]+; C61H101N23O14Sの計算値、Mr=1411.9Da
Bi−PEG−イミダゾール−誘導体(短)
H−Glu(ビオチニル−PEG)−Im−Im−Im−Arg−NH2
この物質は、Fmoc−Glu(ビオチミル−PEG)−OHを直接Imにカップリングさせた以外はMGB 3につき記載した手順に従って合成した。
LC−ESI−MS: m/z=1100,5[M+H]+; C46H73N19O11Sの計算値、Mr=1100.20Da
合成は前記した一般的な手順に従って行った。樹脂からの切断はイミダゾールジスタマイシン化合物について記載したように達成し、物質は分取用HPLCによって精製した。
H−Glu(ビオチニル−PEG)−QGRVEVLYRGSWGTVA−NH2
LC−ESI−MS: m/z=1168.06[M+2H]2+; C104H168N30O29Sの計算値、Mr=2334.1Da
H−Glu(ビオチニル−PEG)−IGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ−NH2
LC−ESI−MS: m/z=1116.58[M+3H]3+; C154H269N43O37Sの計算値、Mr=3346.7Da
Bi−ZU−KKNKRNTNRRPQDVKFPGGGQIVGGVYLLPRRGPRLGVRA−NH2
LC−ESI−MS: m/z=696.6[M+7H]7+; Mr=4869.2Da
Bi−XUZU−KKNKRNTNRPPQDVKFPGGGQIVGGVYLLPRRGPRLGVRATRKTS−NH2
Mr=5639.8Da
Bi−XUZU−PWPLYGNEGLGWAGWLLSPRGSRPSWGPTDPRRRSR−NH2
Mr=4728.8Da
Bi−XUUUU−QPGPPSEKAWQPGWT−NH2
Mr=2303.6Da
BXUZU−GGGGDDLGANDELISFKDEGEQEEK(Amid)
Mr=3219.44g/mol
H−Glu(ビオチニル−PEG)−(Arg−Gly)5−NH2
LC−ESI−MS: m/z=411.39[M+4H]4+; C65H121N31O17Sの計算値、Mr=1640.9Da
H−Glu(ビオチニル−PEG)−(Arg−Gly)15−NH2
LC−ESI−MS: m/z=755.8[M+5H]5+; C145H271N81O37Sの計算値、Mr=3773.3Da
H−Glu(ビオチニル−PEG)−(Lys−Gly)5−NH2
LC−ESI−MS: m/z=501.51[M+3H]3+; C65H121N21O17Sの計算値、Mr=1501.4Da
H−Glu(ビオチニル−PEG)−(Lys−Gly)15−NH2
LC−ESI−MS: m/z=839.43[M+4H]4+; C145H271N51O37Sの計算値、Mr=3354.6Da
H−Glu(ビオチニル−PEG)−(Arg)20−NH2
LC−ESI−MS: m/z=617.61[M+6H]6+; C145H286N86O27Sの計算値、Mr=3699.5Da
アミノ酸およびペプチドの命名法はIUPAC−IBU生化学命名委員会(Europ.J.Biochem.138(1984)9−37)の提唱に従う。
ABI Applied Biosystems
Amp アミノメチルピロール−2−カルボン酸
Boc tert−ブチルオキシカルボニル
Da ダルトン
DIPEA ジイソプロピルエチルアミン
DMF ジメチルホルムアミド
ESI−MS 電子スプレイイオン化質量分析
Fmoc フルオレニル−9−メチルオキシカルボニル
HBTU 2(1H−ベンゾトリアゾール−1イル)−1,1,3,3−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート
HOBt 1−ヒドロキシベンゾトリアゾール
HPLC 高速液体クロマトグラフィー
Im アミノメチル−1H−イミダゾール−2−カルボン酸
MS 質量分析
NMP N−メチルピロリジン
OtBu O−tert−ブチル
PEG ポリエチレングリコール
Pmc 2,2,5,7,8−ペンチルメチルクロマン−6−スルフォニル
TFA トリフルオロ酢酸
Trt トリフェニルメチル(トリチル)
アクリフラビン−ビオチンコンジュゲート:2,7−ビス(アミノ)−9−(ビオチニルアミドエチルアミノ)アクリジン
数個のビオチニル化ds DNA−バインダー(実施例1)を、以下の手順に従って、ストレプトアビジン被覆Dynabeads(登録商標)M−280 (Dynal Biotech S.A., Prod. No.112.06, Oslo, Norway;ビオチンに対する結合能:650ピコモル/mg; これらの実施例を通じてSA−磁性ビーズ)に固定化した。
以下の手順に従って、副溝バインダーMGB1、MGB3およびペプチド3(実施例1)をストレプトアビジン被覆Dynabeads(登録商標)M−280(Dynal Prod.No.112.06, Oslo, Norway; ビオチンに対する結合能:650ピコモル/mg;これらの実施例を通じてSA−磁性ビーズ)に固定化した。
副溝バインダーMGB1、MGB 3 およびペプチド3(図1および図2)を、以下の手順に従って、ストレプトアビジン−被覆PCRチューブ(Roche Cat. No.1741772、Roche Diagnostics GmbH, Mannheim;ビオチンに対する結合能: 61.5ピコモル/200μlチューブ)に固定化した。
この実験では、数個の副溝バインダー/SA-磁性ビーズ複合体での細菌DNA(Staphylococcus epidermidis)からの汚染除去を行った。
数個のds DNA−バインダー分子の汚染除去効率をLight Cycler Control Kit DNA(Roche Cat.No.2158833, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim)、Light Cycler DNA Master Hybridization Probes(Roche Cat.No.2 015 102, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim)およびLightCycler 1.2 装置(Roche Cat.No 2 011 468; ソフトウエアバージョンLC 3.5)を用いて評価した。
3つのds−NA(MGB1、MGB3およびペプチド3)バインダーの汚染除去効率は、Parvovirus B19 Quantification Kit (Roche Cat.No.3 246 809, Roche Diagnostics GmbH, Germany)およびLightCycler 1.2装置(Roche Cat.No.2011468, Roche Diagnostics GmbH, Germany; ソフトウェアバージョンLC 3.5)を用いて評価した。
以下の実験を行って、二本鎖および一本鎖オリゴヌクレオチドに対する3つの異なるds−NAバインダー(MGB1、MGB3およびペプチド3)の選択性を時間依存的に評価した。
本実験においては、Bi−PEG−ジスタマイシン/SA−磁性ビーズ複合体での細菌DNA(LC敗血症キット、Id.nr.04493613, Roche Diagnostics GmbH, GermanyからのStreptoccocus pneumonia DNA)からの汚染除去を行い、引き続いて、結合したDNAをビーズから溶出させた。
本実験では、Bi−PEG−ジスタマイシン/SA−被覆チューブ中の細菌DNA(LC敗血症キット、Id.nr04493613, Roche Diagnostics GmbH, GermanyからのStreptoccocus pneumonia DNA)の汚染除去を行い、引き続いて、結合したDNAをチューブから溶出させた。
本実験において、複数の細菌バインダー/SA-磁性ビーズ複合体を用いた細菌(Staphylococcus epidermidis)からの汚染除去を行った。
Abramson, R.D.およびMyers, T.W. Current Opinion in Biotechnology 4 (1993) 41-47
Abravaya, K. ら、Nucleic Acid Ampl. Technol. Chapter 9 (1997) 125-133
Aslam & Dent: Bioconjugation (2000, Macmillian Reference, London, GB
Ausubel ら、Current Protocols in Molecular Biology (1987) J. Wiley and Sons, NY
Barany, F., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 (1991) 189-193
Barany, F., PCR Methods and Applic. 1 (1991) 5-16
Boger, D.L. ら、J. Am. Chem. Soc. 123 (2001) 5878-5891
Brana, M.F. ら、Curr. Pharm. Design 7 (2001) 1745-1780
Corless, C.E. ら、J. Clin. Microbiol. 38 (2000) 1747-1752
Demeunynck ら、(編): DNA and RNA binders (Vol. 1 & 2, 2003, Wiley-VCH, Weinheim
Di Pietro, S.M. ら、Biochemistry 42 (2003) 6218-6227
Dore, K. ら、JACS 126 (2004) 4240-4244
EP 0 281 390
EP 0 439 182
EP 0 476 014
EP 0 585 660
EP 0 792 376
Fish, E.L. ら、Biochemistry 27 (1988) 6026-6032
Fox, J.C. ら、J. Virol. Meth. 33 (1991) 375-3823
Guatelli, J.C. ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (1990) 1874-1878
Hilali, F. ら、Mol. Biotechnol. 7 (1997) 207-216
Hoheisel, J. D., TIBTECH 15 (1997) 465-469
IUPAC-IBU Commission on Biochemical Nomenclature, Europ. J. Biochem. 138 (1984) 9-37
Kessler (編): Nonradioactive labeling and detection of biomolecules, 1992, Springer Verlag, Heidelberg
Klaschik, S. ら、Mol. Biotechnol. 22 (2002) 231-242
Koepsel, R.R. および Russell, A.J., Biomacromolecules 4 (2003) 850-855
Kwoh, D.Y. ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 1173-1177
Li, M. ら、Bioorg. Med. Chem. Letters 12 (2003) 4351-4354
Mantero, G. ら、Clin. Chem. 37 (1991) 422-429
Pauluhn, J. ら、Ber. Bunsenges. Phys. Chem. 82 (1978) 1265-1278
Prince, A.M.およびAndrus, L., Biotechniques 12 (1992) 358-360
Record, M.T. ら、J. Mol. Biol. 107 (1976) 145-158
Sambrook, J. ら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd ed., Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, NY
Stewart, K.D. ら、J. Phys. Org. Chem. 5 (1992) 461-466
Stryer, Biochemistry, 4th edition (1995) W H Freeman & Co, NV, USA
Tijssen, P.: Practice and theory of enzyme immunoassays (1985, Elsevier, Amsterdam, Netherlands
US 4,683,195
US 5,002,867
US 5,130,238
US 5,143,854
US 5,202,231
US 5,210,015
US 5,487,972
US 5,545,522
US 5,716,785
US 5,804,375
US 5,891,636
US 6,022,963
US 6,103,476
US 6,156,501
US 6,174,670
US 6,291,170
US 2002/0006617
US 2001/0026921
US 2002/0095073
US 2003/0130499
Vogelstein, B.,およびGillespie, D., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76 (1979) 615-619
Whelen, A.C.およびPersing, D.H., Annu. Rev. Microbiol. 50 (1996) 349-373
WO 00/69872
WO 01/09370
WO 01/94573
WO 02/06117
WO 02/48164
WO 03/33698
WO 04/01418
WO 89/10977
WO 89/11548
WO 90/01069
WO 90/15070
WO 91/19003
WO 92/0880
WO 92/10092
WO 93/17126
WO 2002/060539
WO 2002/074993
WO 2002/82078
Wu, D.Y.およびWallace, R.B., Genomics 4 (1989) 560-569
Zimmer, G. ら、Prog. Biophys. Molec. Biol. 47 (1986) 37-112
Claims (23)
- 試料中の生物学的分子を検出するために必要な試薬中に潜在的に存在する生物学的分子の検出は回避する、試料中の生物学的分子の検出方法であって、
a)生物学的分子を潜在的に含む試料を提供する工程、
b)固相の表面にカップリングされた結合部を提供する工程、
c)生物学的分子を検出するために必要な試薬を提供する工程、
d)試料へ試薬を添加する工程、
e)試料中の生物学的分子を検出する工程、
を含み、工程c)において、又は工程d)において、又は工程c)及びd)において、試薬中に潜在的に存在する生物学的分子が固相の表面にカップリングされた結合部へ結合する条件下で試薬が結合部と物理的に接触している、方法。 - 固相の表面が、容器の内側表面又はピペット先端の内側表面である請求項1記載の方法。
- 固相の表面が、ビーズの表面又は多孔性材料の表面である請求項1記載の方法。
- 結合部の結合親和性が、少なくとも102のファクターで、試薬中における生物学的分子の含有量の減少を実現する請求項1〜3いずれか記載の方法。
- 結合部が、二本鎖核酸分子を結合することができる部分である請求項1〜4いずれか記載の方法。
- 結合部が、生物学的区画を結合することができる部分である請求項1〜4いずれか記載の方法。
- 結合部が、二本鎖核酸分子及び生物学的区画を結合することができる部分である請求項1〜4いずれか記載の方法。
- a)標的核酸分子を潜在的に含む試料を提供する工程、
b)固相の表面にカップリングされた核酸結合部を提供する工程、
c)標的核酸分子を増幅するために必要な試薬を提供する工程、
d)試料へ試薬を添加する工程、
e)試料中の標的核酸分子を増幅する工程、
を含む、標的核酸分子の増幅方法であって、工程c)において、又は工程d)において、又は工程c)及びd)において、試薬中に潜在的に存在する核酸分子が固相の表面にカップリングされた核酸結合部へ結合する条件下で試薬が核酸結合部と物理的に接触している、方法。 - 固相の表面が、容器の内側表面又はピペット先端の内側表面である請求項8記載の方法。
- 固相の表面が、ビーズの表面又は多孔性材料の表面である請求項8記載の方法。
- 核酸結合部が、二本鎖核酸結合部である請求項8〜10いずれか記載の方法。
- 標的核酸分子の増幅が、試料の微生物学的感染についての試験における核酸増幅である請求項8〜11いずれか記載の方法。
- 固相材料であって、二本鎖核酸結合部が該固相材料の表面にカップリングされ、容器、ビーズ、又はピペット先端である固相材料。
- 固相材料であって、ポリカチオン体、又はインターカレーターが二本鎖核酸結合部として該固相材料の表面にカップリングされた固相材料。
- 固相材料であって、生物学的区間を結合することができる結合部が、該固相材料の表面にカップリングされ、容器、又はピペット先端である固相材料。
- 結合部が、副溝バインダー、抗体、色素、両親媒性体、又はポリカチオン体である請求項15記載の固相材料。
- 固相材料であって、色素、両親媒性体、ポリカチオン体、又は副溝バインダーが、生物学的区画のための結合部として該固相材料の表面にカップリングされた固相材料。
- 固相材料であって、二本鎖核酸分子及び生物学的区画を結合することができる結合部が、該固相材料の表面にカップリングされた固相材料。
- ビーズ、多孔性材料、容器、又はピペット先端である請求項18記載の固相材料。
- 2種以上の結合部が該固相材料の表面にカップリングされた、請求項18又は19記載の固相材料。
- 試料中の標的核酸分子を増幅するために必要な試薬中に潜在的に存在する核酸分子の増幅は回避する、試料中における標的核酸増幅のための請求項13〜20いずれか記載の固相材料の使用。
- 標的核酸増幅が、試料の微生物学的感染についての試験の一部である請求項21記載の使用。
- 標的核酸増幅を行うために必要な試薬及び請求項13〜20いずれか記載の固相材料を含むキット。
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP04019636 | 2004-08-19 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2006055166A true JP2006055166A (ja) | 2006-03-02 |
Family
ID=34926218
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2005236516A Withdrawn JP2006055166A (ja) | 2004-08-19 | 2005-08-17 | 偽陽性結果を低下させる方法 |
Country Status (3)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP2006055166A (ja) |
CN (1) | CN1737165A (ja) |
CA (1) | CA2512599A1 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2007105786A1 (ja) * | 2006-03-16 | 2007-09-20 | National University Corporation Akita University | 核酸検出方法及び核酸検出キット |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN108085371B (zh) * | 2017-12-29 | 2021-11-02 | 武汉艾德士生物科技有限公司 | 判断pcr结果是否为假阳性的方法 |
CN113029905B (zh) * | 2021-03-13 | 2024-04-12 | 杭州市交通工程试验检测中心有限公司 | 一种土工布有效孔径测定仪 |
CN114685572B (zh) * | 2022-06-02 | 2022-08-30 | 上海百力格生物技术有限公司 | 用于mgb核酸探针合成的氧化剂组合物及探针的合成方法 |
-
2005
- 2005-08-17 CA CA002512599A patent/CA2512599A1/en not_active Abandoned
- 2005-08-17 JP JP2005236516A patent/JP2006055166A/ja not_active Withdrawn
- 2005-08-18 CN CNA2005100926909A patent/CN1737165A/zh active Pending
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2007105786A1 (ja) * | 2006-03-16 | 2007-09-20 | National University Corporation Akita University | 核酸検出方法及び核酸検出キット |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CA2512599A1 (en) | 2006-02-19 |
CN1737165A (zh) | 2006-02-22 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
KR101602305B1 (ko) | 게놈 획득 및 소실에 대한 다중 분석법 | |
JP4372341B2 (ja) | リニアービーコン(LinearBeacons)に関する方法、キットおよび組成物 | |
US6060246A (en) | Reagent and method for isolation and detection of selected nucleic acid sequences | |
EP3348640B1 (en) | Amplified nucleic acid detection method and detection device | |
ES2294287T5 (es) | Empleo de un material de sílice en una reacción de amplificación | |
ES2381279T3 (es) | Métodos y productos para la captura de ácido nucleico diana | |
EP2843058B1 (en) | Method for amplifying nucleic acid and method for detecting amplified nucleic acid | |
WO1995035390A1 (en) | Ligation-dependent amplification for the detection of infectious pathogens and abnormal genes | |
JP2002330783A (ja) | アレイ解析のための標的の濃縮と増幅 | |
CN102625838A (zh) | 用于生成rRNA除尽的样本或者用于从样本分离rRNA的方法、组合物和试剂盒 | |
JP2007506402A (ja) | Dnaチップに基づく遺伝子型決定 | |
JP2006055166A (ja) | 偽陽性結果を低下させる方法 | |
US6620586B2 (en) | Methods and compositions for analyzing nucleic acids | |
CN110923338A (zh) | 一种能检测多种细菌基因组dna的微阵列芯片及其制备方法 | |
JP2010515451A (ja) | 大腸菌検出用dnaチップ | |
TW201231672A (en) | Primer, probe, and method for multi-specimen analysis | |
EP0235727A2 (en) | Rapid dna test for microbes | |
JPH06311899A (ja) | 核酸分析法 | |
JPS62265999A (ja) | 核酸含有試料中の微生物の検出 | |
EP1627926A1 (en) | A method to reduce false positive results | |
CN110612354A (zh) | 用于分离靶核酸的组合物和方法 | |
EP3814496B1 (en) | Sample preparation method and system | |
ES2253279T3 (es) | Metodos y composiciones para la deteccion de especies del complejo de mycobacterium avium. | |
JP4651666B2 (ja) | 単一の反応槽において処理される生体試料中に存在する、標的の核酸の標識及び精製方法 | |
JP2010515452A (ja) | スタフィロコッカス・アウレウス検出用dnaチップ |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20081008 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20090107 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20090113 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20090209 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20090317 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20090612 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20090710 |
|
A911 | Transfer of reconsideration by examiner before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20090827 |
|
A912 | Removal of reconsideration by examiner before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A912 Effective date: 20091023 |
|
A761 | Written withdrawal of application |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A761 Effective date: 20110513 |