JPH06311899A - 核酸分析法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 試料中の標的ポリヌクレオチドの存在を検出
する方法に関する。 【構成】方法は以下の工程を含む：検出用プローブを用
いた標的ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション工
程であって、検出用プローブは３’末端に付加されたア
ルカリフォスファターゼのような検出可能な基をもつ第
１のオリゴヌクレオチドからなり；捕捉プローブを用い
た標的ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション工程
であって、捕捉プローブは５’末端に付加されたビオチ
ンのような捕捉できる基をもつ第２のオリゴヌクレオチ
ドからなり；そして、検出用プローブおよび捕捉プロー
ブが標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズしたことを
検出する工程。プローブ、プローブセット、および本発
明を実行するのに有用なキットも開示される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はサンドイッチ分析におけ
るオリゴヌクレオチドプローブによる遺伝物質の検出に
関する。

【０００２】

【従来の技術】サンプル中の標的ポリヌクレオチドの存
在を検知するためのある既知の戦略はサンドイッチ分析
と呼ばれる。サンドイッチ分析は関心のある標的ポリヌ
クレオチドの塩基配列に相補的で独立した検出用および
捕捉用オリゴヌクレオチドを使用する。標的ポリヌクレ
オチドが存在すると、検出用および捕捉用オリゴヌクレ
オチドは各々相補的な塩基配列にハイブリダイズする。
一般的には、検出用オリゴヌクレオチドは、ある特定の
シグナルを与える基質と接触して検出可能なシグナルを
生じることができるような成分（ｍｏｉｅｔｙ）につな
げられる。捕捉用オリゴヌクレオチドは直接あるいは固
定用成分を通して固体支持体に固定される。固体支持体
から過剰なサンプルおよび他の試薬を除去した後に、捕
捉−標的−検出複合体はシグナルを生じる基質にさらさ
れる。シグナルを生じる基質により生じたシグナルの強
度は、サンプル中に存在する標的ポリヌクレオチドの濃
度を示す。

【０００３】シグナルを与える成分が使われるとき、一
般的にはそれはポリヌクレオチドの内部（放射性標識が
ヌクレオチドの化学的“ニック”を通して検出用プロー
ブに加えられる場合のように）または検出用の５’末端
につけられる。サンドイッチ分析の感度に影響するよく
ある問題は、分析中の非特異的シグナルの存在である。
非特異的シグナルの発生は、溶液中などのハイブリダイ
ズしなかった検出用プローブが残っていることによる可
能性がある。非特異的シグナルは間違った陽性の結果の
数を増大することにより、分析の結果を歪めることがあ
る；これは試験の感度を下げ、それにより、本分析によ
りサンプル中の低濃度の標的ヌクレオチドを正確に検出
することが不可能になる。

【０００４】Ｃ．ブラケル（Ｂｒａｋｅｌ）ら，欧州特
許第０３３０２２１号に、少なくとも一つのビオチンが
その各々の末端に付いたオリゴヌクレオチドおよびそれ
らを利用した分析システムが記載されている。

【０００５】Ｊ．タダ（Ｔａｄａ）ら，Ｍｏｌｅｃ．ａ
ｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ ６，４８９
（１９９２）に、５’末端がビオチンで標識されている
増幅プライマーを利用した分析法が記載されている。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】前述の観点から、非特
異的なバックグラウンドのシグナルを減少させたサンド
イッチ分析の提供が、本発明の第一の目的である。

【０００７】本発明の第二の目的は、非特異的なバック
グラウンドのシグナルを減少させたサンドイッチ分析を
迅速に遂行するのに適したキットを提供することであ
る。

【０００８】本発明の第三の目的は、非特異的なバック
グラウンドのシグナルを減少させたサンドイッチ分析を
行うのに有効なプローブおよびプローブのセットを提供
することである。

【０００９】

【課題を解決するための手段】サンプル中の標的ポリヌ
クレオチドの存在を検出する方法を開示する。方法は以
下の工程を含む： （ａ）標的ポリヌクレオチドを検出用プローブとハイブ
リダイズさせるが、その際、該検出用プローブは標的ポ
リヌクレオチドの第一セグメントとハイブリダイズする
第一オリゴヌクレオチド、及び第一オリゴヌクレオチド
の３’末端に付加された検出可能基を含む； （ｂ）標的ポリヌクレオチドを捕捉用プローブとハイブ
リダイズさせるが、その際、該捕捉用プローブは標的ポ
リヌクレオチドの第二セグメントとハイブリダイズする
第二オリゴヌクレオチド及び第二オリゴヌクレオチドの
５’末端に付加された捕捉基を含み；そして （ｃ）検出用プローブおよび捕捉用プローブの標的ポリ
ヌクレオチドへのハイブリダイゼーションを検出する。

【００１０】上述の特定の態様は、さらに検出工程に先
行して捕捉用プローブを固相支持体に付加させる工程を
含む。例えば、捕捉基が特定の結合対の第一のものであ
れば、固相支持体はそれに結合する特定の結合対の第二
のものを持つことができ、そして付着工程は特定の結合
対の第一のものおよび第二のものを互いに結合させるこ
とによってなされうる。次に、検出工程はハイブリダイ
ゼーション複合体を通して検出可能基の固相支持体への
結合を検出することによって行われうる。

【００１１】本発明の上述および他の目的ならびに側面
は、本明細書中の図面および以下に詳しく記載される。

【００１２】ヌクレオチド配列は本明細書においては、
左から右に向かって５’から３’方向に一本鎖によって
のみ示される。

【００１３】比較の目的で、従来のサンドイッチ分析技
術において形成されるハイブリダイゼーション複合体が
図１に概略的に表現される。図１の下の線は、オリゴヌ
クレオチド１２の５’末端に検出可能基１１を含む検出
用プローブ１０である。中央の線は標的ポリヌクレオチ
ド１３である。上の線は、オリゴヌクレオチド１６の
３’末端に捕捉基１５を含む捕捉用プローブ１４であ
る。検出用プローブ１０および捕捉用プローブ１４を標
的ポリヌクレオチドと結び付ける短い垂直な線は相補的
な塩基対間のハイブリダイゼーションの際に形成される
水素結合を表す。

【００１４】本発明のサンドイッチ分析において形成さ
れるハイブリダイゼーション複合体は、図２に概略的に
表現される。この図面は図１と似ている。しかし、重要
なことは、図２において上の線が検出用プローブ２０で
あり、オリゴヌクレオチド２２の３’末端に検知可能基
２１がある。中央の線は標的ポリヌクレオチド２３であ
る。図２の下の線はオリゴヌクレオチド２６の５’末端
に捕捉基２５を持つ捕捉用プローブ２４である。本方法
の側面は以下に詳細に論じられる。

【００１５】標的ポリヌクレオチドは実質的に、検出を
望むいかなるポリヌクレオチドでもよい。例えば、標的
はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、
およびそれらの類似体および分子複合体を含んでもよ
い。標的は天然にあるポリヌクレオチド、または組換技
術およびポリメラーゼ連鎖反応法のような他の手法によ
り生成されたポリヌクレオチドを含んでもよい。関心の
あるポリヌクレオチドは実質的に、サンプル中に存在す
るあらゆるポリ核酸またはその大半または一部の部分を
含むこともできる。また、サンプルはポリ核酸のみを含
む必要はなく、他の生体物質を含んでいてもよいし一般
的に含むであろう。例えば、本分析は培養液の細胞の全
部または分画したもの、ウイルス、細菌、菌類、藻類、
酵母、および他の微生物の中の特定のポリヌクレオチド
の存在を検出するのに使うことができる。共通して、こ
れらの源は血液、尿、ふん、唾液、膿汁、精液、血清、
または生物の他の組織からとられたサンプルの中に見い
だされる；このように、組織サンプル中のこれらの源の
一つに特異的なポリヌクレオチドの存在を検知する本分
析を使用することにより、サンプル中に源そのものが存
在することを示唆できる。Ｂ−溶血性ステロコッカス、
ヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）インフルエン
ザ、肺炎双球菌、マイコプラズマ肺炎菌、マイコバクテ
リア、サルモネラ、赤痢菌、ヤルシニアエンテロコリテ
ィカ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃ
ａ）、大腸菌、クロストリジウムディフィサイル（ｄｉ
ｆｆｉｃｉｌｅ）、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏ
ｂａｃｔｅｒ）、ナイセリアゴノロア（Ｎｅｉｓｓｅｒ
ｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、トレポネマパリダン
（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ）、クラミジ
アトラコマチィス、クロストリジウムペルフリンゲンス
（ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）のような細菌は本発明で検
出可能である。本分析に適したウイルスの例にはインフ
ルエンザＡ、インフルエンザＢ、パラインフルエンザ、
レスピラトリーシンシチアルウイルス（ｒｅｓｐｉｒａ
ｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ）、アデノ
ウイルス、ライノウイルス（ｒｈｉｎｏｖｉｒｉ）、ロ
タウイルス、パルボウイルス、エンテロウイルス、およ
び単純ヘルペスウイルスが含まれる。

【００１６】標的ポリヌクレオチドはハイブリダイゼー
ションのためには一本鎖の形状であるべきであるが、検
出用プローブと一本鎖のハイブリダイズをする前に二本
鎖を変成して一本鎖にしさえすればハイブリダイゼーシ
ョン溶液中での形状が二本鎖であってもよい。標的およ
び検出用プローブのハイブリダイゼーションに適したい
かなる変成技術、標的の固体支持体への付着、またはシ
グナルを与える成分の検出は、本分析において使用する
のに好都合である。

【００１７】標的ポリヌクレオチドは鎖置換増幅または
ポリメラーゼ連鎖反応のような何らかの適した技術によ
り生成された増幅物でよい。例えばＧ．テランスウォー
カー（Ｔｅｒｒａｎｃｅ Ｗａｌｋｅｒ）ら、Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０，１６９１ー１６９
６（１９９２）；Ｋ．マリス（Ｍｕｌｌｉｓ）ら、米国
特許第４，６８３，２０２号参照。このように、標的ポ
リヌクレオチドは天然のものまたは合成したもののいず
れでもよい。

【００１８】標的ポリヌクレオチドは、２つの異なるオ
リゴヌクレオチドプローブと、オーバーラップするにし
てもしないにしても、一斉に結合するのに十分な長さだ
け必要である。一般的には標的ポリヌクレオチドは少な
くとも２０残基の長さである。標的ポリヌクレオチドは
ゲノムＤＮＡと同じくらいの長さでもよいが、一般的に
は標的ポリヌクレオチドは３，０００残基よりは長くな
い。上述したポリヌクレオチドの第一及び第二セグメン
トは、特定のプローブがハイブリダイズしうるポリヌク
レオチドの重要な領域に関係する；第一セグメントはポ
リヌクレオチド中で第二セグメントに対して３’または
５’のいずれに位置してもよい。

【００１９】上述したように検出用プローブは、標的ポ
リヌクレオチドの第一セグメントにハイブリダイズする
第一オリゴヌクレオチド、及び第一オリゴヌクレオチド
の３’末端に付加された検知可能基を含む。第一オリゴ
ヌクレオチドの長さは標的ポリヌクレオチドの第一セグ
メントに結合できさえすれば重要ではない。第一オリゴ
ヌクレオチドは一般的には５、６、７、または８塩基の
長さで２５、３０、および４０またはそれ以上の塩基長
程度までである。第一オリゴヌクレオチドはＤＮＡまた
はＲＮＡを含み、合成または天然に生じたものでよい。
一般にＪ．グッドチャイルド（Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ）、
Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １，
１６５−１８７（１９９０）を参照。適当な検出可能基
のいずれも使用してよく、その例としては、酵素標識
（例えばアルカリホスファターゼ、ホースラディッシュ
ペルオキシダーゼのようなペルオキシダーゼ、酸性ホス
ファターゼ、βーＤ−ガラクトシダーゼ、グルコースオ
キシダーゼ、ルシフェラーゼ）、化学蛍光標識（例えば
ルミノール、ルシゲニン、Ｌ．アーノルド（Ａｒｎｏｌ
ｄ）ら、ＰＣＴ出願 ＷＯ ８９／０２８９６に記載さ
れたようなアクリジニウムエステルのようなアクリジニ
ウム化合物）、生物蛍光標識（例えばエクオリンおよび
ルシフェラーゼのような光タンパク質）、蛍光標識（例
えばフルオレセイン）、および電子密度標識（例えばフ
ェリチン、金）が含まれるがそれらだけに限定されな
い。一般的には、検出可能基はタンパク質である。検出
可能基は何らかの適切な技術で第一オリゴヌクレオチド
に付着されうる。例えば、Ｓ．ゴーシュ（Ｇｈｏｓ
ｈ）、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
１，７１−７６（１９９０）を参照。

【００２０】好適には、シャップ（Ｓｃｈａｐｐ）の米
国特許第４，９５９，１８２号に記載されているように
（本明細書中に引用されたすべての米国特許参考文献に
よる開示は参考事項として本明細書中に取り入れる）、
使用される検知可能基はアルカリホスファターゼであ
り、好ましい基質はダイオキセタン化合物およびフルオ
レサインのような蛍光化合物のくみあわせであり、反応
はアルカリホスファターゼによるダイオキセタンの活性
化を促す条件下で行われ、ダイオキセタンから蛍光化合
物に電子エネルギーが転位される。好適なダイオキセタ
ンおよび蛍光基質系はＬｕｍｉｇｅｎ Ｉｎｃ．，デト
ロイト，ミシガン州，ＵＳＡによるＬＵＭＩＰＨＯＳ
（商標名）５３０として商業的に入手可能である。

【００２１】捕捉用プローブも、上述したように、標的
ポリヌクレオチドの第二セグメントとハイブリダイズす
る第二オリゴヌクレオチド、及び第二オリゴヌクレオチ
ドの５’末端に付加された捕捉基を含む。第二オリゴヌ
クレオチドの長さも、標的ポリヌクレオチドの第二セグ
メントに結合できさえすれば重要ではない。第二オリゴ
ヌクレオチドは第一オリゴヌクレオチドのように、通常
は、５、６、７または８塩基の長さで２５、３０および
４０またはそれ以上の塩基長程度までである。第一オリ
ゴヌクレオチドのように、第二オリゴヌクレオチドは、
ＤＮＡまたはＲＮＡを含み、合成または天然に生じたも
のでよい。好適な捕捉基のいずれも使用できるが、例と
しては、ビオチンおよびアビジン、抗原および抗体、抗
体および抗体結合蛋白質（例えばプロテインＡ，プロテ
インＧ，プロテインＶ）が含まれるが、それらに限定さ
れない。通常、捕捉基は特異的結合対の一方である。

【００２２】固相支持体は、付加された捕捉用プローブ
−標的−検出用プローブがハイブリダイズした複合体
を、結合していないサンプル、検出用プローブおよび捕
捉用プローブから分離させるいかなる媒介でもよい。固
相支持体はガラス、ポリスチレン、ポリエチレン、デキ
ストラン、ニトロセルロース、ナイロン、およびポリプ
ロピレンを含むいずれの好適な材料の混合物でもよい。
固相支持体は例えばビーズ、試験管、マイクロウェル、
メンブレン等を含む好適な形状のいずれかを取ることが
できる。

【００２３】好適には、固相支持体は捕捉用プローブを
結合するための手段を含む（即ち、それに付加された捕
捉用プローブの捕捉基に直接にまたは間接的に結合でき
る基を備えている）。いかなる適切な技術も使われう
る。オリゴヌクレオチドプローブの捕捉基としてビオチ
ンが使われる好適な態様において、ウシ血清アルブミン
（ＢＳＡ）のような蛋白質およびビオチンを含む複合体
はこの蛋白質により固相支持体に固定され、ストレプト
アビジンはビオチンに結合され、ストレプトアビジンの
結合部位はオリゴヌクレオチドプローブのビオチン捕捉
基に結合しないままでいる。

【００２４】オリゴヌクレオチドプローブの標的ポリヌ
クレオチドへのハイブリダイゼーションには、アデニン
（Ａ）およびその類似体とチミン（Ｔ）およびその類似
体またはウラシル（Ｕ）およびその類似体、並びにグア
ニン（Ｇ）およびその類似体とシトシン（Ｃ）およびそ
の類似体のワトソンークリックの塩基対に従ったヌクレ
オチド鎖の相補的なヌクレオチド鎖への非共有結合が包
含される。ハイブリダイゼーションはある鎖の塩基が他
の鎖の正しい相補的な塩基と１００％結合して起きう
る；ハイブリダイゼーションはある鎖の塩基の９５、８
５または７５％またはそれ以下しか他の鎖の塩基と相補
的でない場合にも起きうる。本発明のように２つの異な
るプローブが１つの標的ポリヌクレオチドにハイブリダ
イズする場合、２つのプローブは、すぐ隣合っているか
または介在セグメントにより離されているセグメントに
ハイブリダイズする。いくつかのケースでは、プローブ
そのものが部分的にオーバーラップしていても、各々の
プローブが標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする
限り重要ではない。ハイブリダイゼーションが起きるよ
うな条件はよく知られている。

【００２５】通常、ハイブリダイゼーションは既知の技
術にしたがって、通常は水溶液である適切なハイブリダ
イゼーション溶液の中で行われうる。通常、ハイブリダ
イゼーション液は、５０％ホルムアミド、塩化ナトリウ
ムークエン酸ナトリウム混合物、および数％のＤＮＡ
（しばしば仔ウシ胸腺またはサケ精子）を含む。標的、
検出用プローブ、および捕捉用プローブが加えられ、必
要ならば変成され、そしてハイブリダイゼーションおよ
び固相支持体へ付加される。過剰な反応液やサンプルは
検出のために、ハイブリダイズした複合体から分離され
る。当業者は、検出用プローブの標的へのハイブリダイ
ゼーション、捕捉用プローブの標的へのハイブリダイゼ
ーション、および捕捉用プローブの固相支持体への付加
の工程がどのような順に行われてもよいということが分
かるであろう；すなわち各々のハイブリダイゼーション
工程は分析の精密さに影響を与えずに、他のものに先行
することは可能であり、そして捕捉用プローブが標的に
ハイブリダイズする前またはハイブリダイズした後でも
よいが、捕捉用プローブを固相支持体に一番初めに付加
することは可能である。好ましい態様においては、捕捉
用プローブおよび検出用プローブが標的サンプルに同時
に加えられてハイブリダイゼーションをさせ；この反応
液が捕捉用プローブの付加部分を通してこの複合体が付
着するように固相支持体に加えられる。

【００２６】分析の検出工程は、ハイブリダイゼーショ
ン工程に関連して、検出可能基が検出可能なシグナルを
放出するのを誘導するのに適した既知の技術により行わ
れる。一般に、これは検出可能基が作用できる基質に接
触すること、およびそれから検出可能基により変えられ
た基質の量を検出することを含む。例えば、ハイブリダ
イゼーション水溶液の中でハイブリダイゼーションを行
い、そして溶液に接触させている状態で捕捉用プローブ
を固相持体に付着させた後に、溶液を固相支持体から分
離し、そして測定されるハイブリダイゼーション複合体
を通して固相支持体への検出可能基の付着程度を測定す
ることができる（即ち、固相支持体に接触して検出可能
なシグナルを生じることが可能な基質を用いることによ
る）。

【００２７】本発明に従った特定の標的ポリヌクレオチ
ドを検出するためのキットは検出用プローブおよび／ま
たは捕捉用プローブを含み、場合によっては上述したよ
うな固相支持体を含む。キットの内容物は一般的には共
通の包の中に一緒に含まれ、本発明の方法を遂行するた
めの指示が書かれた紙またはそのような指示が印刷され
た紙もまた含まれうる。キットは、検出可能なシグナル
を放出できる検出用プローブの検出基の基質も含んえよ
い。

【００２８】本発明は以下の限定されない実施例におい
てさらに詳細に説明される。

【００２９】

【実施例】

実施例１５’にビオチンが結合した捕捉用オリゴデオキシヌクレ
オチドプローブの調製 オリゴデオキシヌクレオチド捕捉用プローブは以下に述
べるように合成された。まず第一に捕捉用オリゴマー
が、ＤＮＡ合成機（Ｍｏｄｅｌ ３８０Ｂ，Ａｐｐｌｉ
ｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，フォスターシティー，カリ
フォルニア州）、および５’末端に３つのビオチン分子
（ＢＢＢ）がついたオリゴマーを生じるＢｉｏｔｉｎ
ＯＮ（商標名）反応液（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ，パロアル
ト、カリフォルニア州）を用いて調製された。プローブ
は逆相高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ，Ｂｒｏ
ｗｎｌｅｅ Ｌａｂ Ａｑｕａｐｏｒｅ ＲＰ ３００
カラム−２２０×４．６ｍｍ，Ｃ８カラム７粒子（ｐａ
ｒｔｉｃｌｅ）、孔の大きさ３００Ａ）により２５４ｎ
ｍの紫外線（ＵＶ）検知機を用いて流速１ｍｌ／分で、
１時間にわたって緩衝液Ｂの濃度を１４％から４４％に
勾配をかけて（緩衝液Ｂ：０．１Ｍ酢酸トリエチルアミ
ン、ｐＨ７、および５０％アセトニトリル；緩衝液Ａ：
０．１Ｍ酢酸トリエチルアミン、ｐＨ７）精製した。

【００３０】実施例２３’アルカリホスファターゼ検出用オリゴデオキシヌク
レオチドプローブの調製 オリゴヌクレオチド検出用プローブは、ＤＮＡ合成機
（Ｍｏｄｅｌ ３８０Ｂ、Ａｐｐｌｉｄ Ｂｉｏｓｙｓ
ｔｅｍｓ，フォスターシティー、カリフォルニア州）、
および３’アミノ修飾カラム（Ｇｌｅｎｎ Ｒｅｓｅａ
ｒｃｈ，スターリング、バージニア州）を用いて合成さ
れた。本方法により、後にマレイミド誘導体のアルカリ
ホスファターゼ検出用酵素と結合するのに必要な３’末
端のアミンがついたオリゴデオキシヌクレオチドが生じ
た。

【００３１】仔ウシの腸のアルカリホスファターゼ（Ａ
Ｐ，酵素免疫分析用、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎ
ｈｅｉｍ，インディアナポリス、インディアナ州）は５
０ｍＭリン酸カルシウムｐＨ７．５に対して４℃で一晩
透析され、そして続いて遠心分離して凝集物を取り除い
た。アルカリホスファターゼ（４ｍｌ，１０ｍｇ／ｍ
ｌ）はＮ，Ｎ’ージメチルホルムアミド（ＤＭＦ，Ａｌ
ｄｒｉｃｈ，ミルウォーキー、ウィスコンシン州）に溶
かしたスクシニミジルー４−（ｐ−マレイミドフェニ
ル）ブチレート（ＳＭＰＢ，Ｐｉｅｒｃｅより得られ
た，ロックフォード、メリーランド州、５０ｍＭ）の４
０μＬ溶液と化合させ、暗所で室温で３０分反応させ
た。アルカリホスファターゼ誘導体は、予め５０ｍＭリ
ン酸カルシウムｐＨ７．５（脱気してＮ₂で浄化した）
で平衡化したＮＡＰ−２５カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ，ピスカタウェイ，ニュージャージー州）を用いて精
製した。ＮＡＰ−２５カラムの画分の吸光を２６０およ
び２８０ｎｍにて測定し、ボイドボリュームピークがプ
ールされた。アルカリホスファターゼ誘導体の濃度は、
吸光係数０．７５ｍＬ／μｍｏｌｅ ｃｍ^-1を用いて２
８０ｎｍの吸光により測定した。典型的には、アルカリ
フォスファターゼのＳＭＰＢ誘導体の約１７０ｎｍｏｌ
ｅが得られ、氷上に保存した（２時間以内）。

【００３２】３’アミノ−オリゴデオキシヌクレオチド
（５０８．２μＭを９８．４μＬ、５０ｎｍｏｌｅｓ）
を１３．４μＬの１Ｍリン酸カルシウム（ｐＨ７．２）
に希釈し、ＤＭＦ中に溶かされた２７μｌのｎ−スクシ
ニミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピネート
（５０ｍＭ，ＳＰＤＰ，Ｐｉｅｒｃｅ，ロックフォー
ド、イリノイ州）溶液と混合した。この混合物を暗所で
１時間室温にてインキュベートした。５０ｍＭリン酸カ
ルシウム（ｐＨ７．５）中のジチオスレイトール（ＤＤ
Ｔ，１Ｍ）溶液をＳＰＤＰ−オリゴデオキシヌクレオチ
ド結合物（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）／ＤＭＦ溶液（最終濃
度０．１Ｍ ＤＤＴ）に加え、１５分室温でインキュベ
ートさせた。ＤＤＴによるオリゴデオキシヌクレオチド
ＳＰＤＰ誘導体の還元によりアルカリフォスファターゼ
ＳＭＰＢ誘導体と反応する遊離のチオール基を生じる。
過剰のＤＤＴおよび２−チオピリドンを、５０ｍＭリン
酸カルシウム（ｐＨ７．５）を用いたＮＡＰ−２５カラ
ムによる溶出により、オリゴデオキシヌクレオチド誘導
体から分離した。

【００３３】精製から１０分以内に、還元されたオリゴ
デオキシヌクレオチドをアルカリフォスファターゼＳＭ
ＰＢ誘導体と混合した。還元したオリゴマーとアルカリ
フォスファターゼＳＭＰＢ誘導体を素早く混合すること
により、チオール基のついたオリゴマーが再び酸化され
るのを防ぐことができる。得られた混合溶液は室温で２
−４時間、それから一晩４℃でインキュベートし、その
後５０ｍＭリン酸カルシウム（ｐＨ７．５）中の５０ｍ
Ｍ ２ーメルカプトエタノールをもとの体積の１／１０
０容加えることにより反応を停止させた。粗結合物は、
Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ ３０（商標名）遠心濃縮機（Ａ
ｍｉｃｏｎ，ダンバーズ，マサチューセッツ州）を用い
ておよそ２ｍｌに濃縮した。この物質を、ＤＥＡＥ−５
ＰＷカラム（７．５ｍｍ×７．５ｃｍ）を用いたＨＰＬ
Ｃにより、緩衝液Ｂ（緩衝液Ｂ：２０ｍＭトリス、１Ｍ
ＮａＣｌ、ｐＨ７．５、緩衝液Ａ：２０ｍＭトリス
、ｐＨ７．５）を０から６６％の濃度勾配をかけて流
速１ｍｌ／分でさらに精製した。吸光は２５４ｎｍで計
測した。Ａ₂₆₀／Ａ₂₈₀が１．０−１．１に等しい画分は
上記結合物に相当し、プールされた。それから結合した
オリゴデオキシヌクレオチドの蛋白質濃度を測定した
（ＢＣＡ蛋白質分析キット、Ｐｉｅｒｃｅ，ロックフォ
ード、イリノイ州）。

【００３４】精製されたアルカリホスファターゼ検出用
オリゴデオキシヌクレオチドプローブは、２０ｍＭトリ
ス、１ＭＮａＣｌ，０．０５％アジ化ナトリウム、５０
μｇ／ｍｌの超音波処理したサケ精子ＤＮＡ，ｐＨ７．
５中に２μＭになるように溶解され、その後４℃で保存
された。

【００３５】実施例３ ５’検出用プローブ酵素活性 アルカリフォスフェイト（ＡＰ）検出用オリゴヌクレオ
チドプローブの活性は以下のようにして決定された。結
合物を５０ｍＭ トリスーＨＣｌ、１００ｍＭＮａＣ
ｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ ｐＨ
７．５中で５μｇ／ｍｌに希釈した。基質、４−ニトロ
フェニルフォスフェイト（ｐＮＰＰ、５ｍＭ）を１Ｍジ
エタノールアミン、１ｍＭ ＭｇＣｌ₂、ｐＨ９．８中
に溶解した。結合物（５μｌ）を２５℃で、２ｍｌの基
質溶液に希釈し、ヒュウレットパッカード８４５２分光
光度計を用いて４０５ｎｍの吸光度の変化を観察した。
反応速度は４０５ｎｍでのｐ−ニトロフェノールの吸光
係数（１８５００Ｍ^-1ｃｍ^-1）を用いて反応速度表の線
形領域より計算した。アルカリフォスファターゼ検出用
オリゴヌクレオチドプローブの比活性は、８５０−１３
００μｍｏｌｅ／分／ｍｇと測定された。

【００３６】比較実施例Ａ ３’ービオチニル化捕捉オリゴヌクレオチドの調製 ＤＮＡ合成機（モデル３８０Ｂ、アプライドバイオシス
テムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、カ
ルフォルニア州フォスターシティー）を用いて３’ービ
オチニル化捕捉オリゴヌクレオチドを合成した。３’ビ
オチンーＯＮＣＰＧ（コントロールドポアーグラス、ク
ローンテック（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）、カルフォルニア
州パロアルト）をオリゴヌクレオチドの３’末端にビオ
チン成分（ｍｏｉｅｔｙ）を付けるのに用いた。そし
て、さらに２つのビオチンを、ビオチン−ＯＮフォスフ
ォラミダイト試薬（同様にクローンテック製）を用いて
３’末端に付加した。そして、オリゴヌクレオチドを標
準フォスフォラミダイト試薬を用いて調製し、固相より
切り離し、粗製３’−ビオチニル化オリゴヌクレオチド
を得た。２５４ｎｍでＵＶ吸光度を観察し、１時間以上
１４から４４％の緩衝液Ｂの濃度勾配をかけ（緩衝液
Ｂ：０．１Ｍ酢酸トリエチルアミン ｐＨ７、５０％ア
セトニトリル；緩衝液Ａ：０．１Ｍ酢酸トリエチルアミ
ン、ｐＨ７）、１ｍｌ／分の流速で逆相高圧液体クロマ
トグラフィー（ＨＰＬＣ）（ブラウンリーラボアクアポ
アー（Ｂｒｏｗｎｌｅｅ ｌａｂ Ａｑｕａｐｏｒｅ）
ＲＰ３００カラムー２２０×４．６ｎｍ、Ｃ８カラム７
粒子、３００Ａ穴計）によって、精製を行った。

【００３７】比較実施例Ｂ ５’−アルカリフォスファターゼ検出用オリゴヌクレオ
チドの精製 ５’−アルカリフォスファターゼ検出用オリゴヌクレオ
チドを、ＤＮＡ合成機（モデル３８０Ｂ、アプライドバ
イオシステムズ、カルフォルニア州フォスターシティ
ー）を用いて、５’−アミノーオリゴデオキシヌクレオ
チド調製物より合成した。上述したようにアルカリフォ
スファターゼと後に結合させるため、オリゴデオキシヌ
クレオチドの５’末端にアミノ基を付加するのに、試薬
アミノリンクII（アプライドバイオシステムズ、カル
フォルニア州フォスターシティー）を用いた。粗製結合
物を２０ｍＭトリスｐＨ７．５中で透析し、セントリプ
レップ３０（アミコン（Ａｍｉｃｏｎ）、マサチュウセ
ッツ州ダンバーズ）を用いて約２ｍｌまで濃縮した。そ
して、ＤＥＡＥ−５ＰＷカラム（７．５ｍｍ×７．５ｃ
ｍ）を用い、０から６６％の緩衝液Ｂ（緩衝液Ｂ：２０
ｍＭトリス、１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５、緩衝液Ａ：
２０ｍＭトリスｐＨ７．５）の勾配をかけ、１ｍｌ／分
の流速でＨＰＬＣにより濃縮結合物を精製した。２５４
ｎｍの吸光度を観察した。画分を集め、結合物の活性を
測定し、結合物を上述したように保存した。

【００３８】実施例４ 被膜マイクロタイタープレートの精製 ビオチニル化牛血清アルブミン（ｂｉｏｔｉｎ＊ＢＳ
Ａ）（ピアス（Ｐｉｅｒｃｅ）、イリノイ州ロックフォ
ード）を０．３ＭグリシンｐＨ９．６（ＢＲＬ、マリー
ランド州ベテスダ、オウトクレーブした水を用いて調製
した）中に５μｇ／ｍｌに希釈し、ｍｉｃｒｏＬＩＴＥ
１（商標名）プレート（ダイナテック（Ｄｙｎａｔｅｃ
ｈ）、ヴァージニア州チャンチリー）の各ウエルにピペ
ットで移し（２００μｌ／ウエル）、４℃で１晩保温し
た。プレートをＦＴＡヘマグルチネイション緩衝液、ｐ
Ｈ７．２（ベクトンディッキンソンマイクロバイオロジ
ーシステムズ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｍ
ｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ）マリーラン
ド州コッキースビル、オウトクレーブした水を用いて調
製した）を用いて２回洗った。ヘマグルチネイション緩
衝液中のストレプトアビジン（５０μｇ／ｍｌ）をビオ
チン＊ＢＳＡ−被膜マイクロタイターウエルに加えた
（１００μｌ／ウエル）。プレートに蓋をして、３７℃
で１時間保温した。倒置することにより結合していない
ストレプトアヴィジンを除き、ブロッキング緩衝液（ヘ
マグルチネイション緩衝液ｐＨ７．２、０．０５％重量
／体積（ｗ／ｖ）牛血清アルブミン、シグマケミカルＣ
ｏ．（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）、ミゾ
ーリ州セントルイス）を加えた（３００μｌ／ウエ
ル）。プレートに蓋をして保温し（３０分、３７℃）、
倒置することによりブロッキング緩衝液を除いた。プレ
ートをヘマグルチネイション緩衝液（３７５μｌ／ウエ
ル）で２回洗い、２％ｗ／ｖトレハロース入りヘマグル
チネイション緩衝液（３７５μｌ／ウエル）（フルカ
（Ｆｌｕｋａ）、ニューヨーク州ロンコンコーマ）を用
いて１回洗った。プレートを２５℃で０．５Ｔｏｒｒ以
下の真空条件下で約４時間乾燥し、乾燥剤と共にマイラ
ー袋に入れて閉じ、使用前に室温で一晩保存した。その
後プレートを２−８℃に保存した。

【００３９】実施例５ マイクロタイタープレート分析法 この分析は、Ｍ．ａｖｉｕｍ／ｉｎｒａｃｅｌｌｕｌａ
ｒｅ ゲノミックＤＮＡから作製したＳＤＡ産物に似せ
て設計された合成標的ＤＮＡを用いる。ゲノム中の標的
配列は、Ｄ．ワース（Ｗｉｒｔｈ）ら、Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ ａｎｄＣｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ ４、８
７−１０５（１９９０）に記載されているｐＭＡＶ２９
配列より決定した。ビオチニル化（ＢＢＢ）捕捉プロー
ブは標的ＤＮＡおよびマイクロタイタープレート上のス
トレプトアビジンに結合する。アルカリフォスファター
ゼ（ＡＰ）と結合した第二の検出用プローブは標的ＤＮ
Ａに結合する。アルカリフォスファターゼは比色定量、
蛍光測定又は化学ルミネッセンスによる検出する機会を
提供する。この分析は、プローブに、ビオチンまたはア
ルカリフォスファターゼをオリゴマーの５’または３’
末端において結合させることの有意性を評価する。

【００４０】分析では以下のプローブおよび合成Ｍ．ａ
ｖｉｕｍ／ｉｎｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ 標的ＤＮＡの
検出用標的を用いた。

【００４１】（１）ＢＢＢ−ＧＧＧＡＡＣＣＧＧＴＧＡ
ＣＴＣ（配列番号：１）（Ｂはビオチンを表す）； （２）ＣＡＡＡＡＡＣＣＴＴＧＣＧＧＣ−Ｐ（配列番
号：２）（Ｐはアルカリフォスファターゼを表す）； （３）Ｐ−ＧＧＧＡＡＣＣＧＧＴＧＡＣＴＣ（配列番
号：３）（Ｐはアルカリフォスファターゼを表す）； （４）ＣＡＡＡＡＡＣＣＴＴＧＣＧＧＣ−ＢＢＢ（配列
番号：４）（Ｂはビオチンを表す）；および （５）ＧＡＣＣＣＧＡＣＴＴＧＴＡＡＧＡＧＣＣＧＣＡ
ＡＧＧＴＴＴＴＴＧＧＡＧＴＣＡＣＣＧＧＴＴＣＣＣＡ
ＣＴＣＧＣＡＧＣＣＴＧＣＧＴＣＴＴＴＴ（配列番号：
５） 配列番号：１及び配列番号：２は本発明の１対のプロー
ブを表している。配列番号：３及び配列番号：４は従来
技術の１対のプローブを表している。配列番号：５は合
成標的ＤＮＡを表す。

【００４２】合成標的ＤＮＡ（配列番号：５）を、溶液
が以下の濃度になるように、滅菌しシリコン加工したチ
ューブ中の０．１ｍｇ／ｍｌの分断したサケ精子ＤＮＡ
（シグマ）中に希釈した：標的ＤＮＡ／５０μｌ体積
１６００、４００、１００、２５、６．２５、０ａｔｔ
ｏｍｏｌｅｓ。希釈した合成標的ＤＮＡを９５度で３分
間加熱しＤＮＡを変成した。チューブを室温で５分間冷
却し、５０μｌの変成したＤＮＡを各ウエルに加えた。
各レベルの標的ＤＮＡを３回分析した。その直後に、５
０μｌ／ウエルのハイブリダイゼーション混合物（１Ｍ
リン酸ナトリウム、０．２％ＢＳＡ、４０ｎＭ 捕捉
プローブ、１０ｎＭ 検出用プローブ）を加えた。プレ
ートに蓋をして３７℃で４５分間保温した。配列番号：
１及び配列番号：２のプローブを１組のウエルで対にし
て用い、配列番号：３及び配列番号：４のプローブを別
の組のウエルで対にして用いた。３つの強度の洗浄（３
００μｌ／ウエル）（１０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ
７、０．１％ｗ／ｖ牛血清アルブミン、０．０５％ノニ
デットＰ−４０（シグマ））を室温で行った。各洗浄液
はマイクロタイターウエル中に１分間置き取り除いた。
ルミフォス（商標名）５３０（１００μｌ／ウエル、ル
ミゲン Ｉｎｃ．（Ｌｕｍｉｇｅｎ Ｉｎｃ．）、ミシ
ガン州デトロイト）基質を加え、プレートに蓋をして３
７℃で３０分間保温した。３７℃で、２秒／ウエル積分
時を用いて発光をマイクロタイタープレート発光計測器
（ラボシステムズ（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ）、ノースキ
ャロライナ州リサーチトライアングルパーク）で測定し
た。結果は以下の表１に示す。配列番号：１／配列番
号：２プローブセット（５’−ビオチン成分及び３’−
アルカリフォスファターゼ成分を利用している）を用い
て分析されたウエルのバックグランドシグナルは、配列
番号：３／配列番号：４プローブセットを用いて分析さ
れたウエルと比較して３倍も減少していることが結果よ
り示された。プローブ試薬は同一のＤＮＡ配列をもつの
で、バックグランドの減少は末端の結合の違いに帰する
ことができる。

【００４３】

【表１】 平均相対ライトユニット（シグナル） プローブ Ａｔｔｏｍｏｌｅｓ／テスト ＣＶ％セット ０ 6.25 25 100 400 1600 レンジ¹ 配列番号１ および２ 8.03 10.88 20.13 49.3 180.5 645.4 3.3-10.1％ 配列番号３ および４ 24.85 30.97 39.32 56.14 164.33 510.5 1.7-27.4％¹ ＣＶ％、各標準値（３回）について計算した 実施例６ さまざまなプローブ配列を用いた分析法 実施例４及び５で上述した方法を用いて、少し変えた配
列をもつプローブを、Ｍ．ａｖｉｕｍ／ｉｎｔｒａｃｅ
ｌｌｕｌａｒｅ合成標的ＤＮＡを検出するのに用いた。
再び、プローブセットは３’又は５’ビオチン又はアル
カリフォスファターゼの結合の有意性を比較した。この
実施例で用いたプローブは以下のものである。

【００４４】（６）ＢＢＢ−ＡＡＣＣＧＧＴＧＡＣＴＣ
ＣＡ（配列番号：６）（Ｂはビオチンを表す）； （７）ＡＡＡＡＣＣＴＴＧＣＧＧＣ−Ｐ（配列番号：
７）（Ｐはアルカリフォスファターゼを表す）； （８）ＡＡＡＡＣＣＴＴＧＣＧＧＣ−ＢＢＢ（配列番
号：８）（Ｂはビオチンを表す）；及び （９）Ｐ−ＡＡＣＣＧＧＴＧＡＣＴＣＣＡ（配列番号：
９）（Ｐはアルカリフォスファターゼを表す） 配列番号：６及び配列番号：７は本発明の１対のプロー
ブを表す。配列番号：８及び配列番号：９は従来技術の
１対のプローブを表す。配列番号：５も標的ＤＮＡであ
った。分析で集められたデータを以下の表２に表す。

【００４５】

【表２】 平均相対比ライトユニット（シグナル） プローブ Ａｔｔｏｍｏｌｅｓ／テスト ＣＶ％セット ０ 6.25 25 100 400 1600 レンジ¹ 配列番号６ および７ 9.02 15.96 37.83 125.97 477.7 1791 3.1-5.4％ 配列番号８ および９ 267.7 286.33 320.33 433.4 730.03 1936.33 0.35-5.9％ 配列番号：８及び配列番号：９（３’−ビオチン、５’
−アルカリフォスファターゼ）からなるプローブセット
は、配列番号：６及び配列番号：７（５’ビオチン、
３’アルカリフォスファターゼ）からなるプローブセッ
トと比較して、３０倍も高いバックグランド及び１６倍
も低い検出感度をもつということを結果が再び示してい
る。

【００４６】実施例８ Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ標的ＤＮＡの分析 前述の実施例と同様に、この実験では合成標的ＤＮＡを
用いた。しかし、標的は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ
ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ゲノミックＤＮＡより作製
した鎖置換増幅（Ｓｔｒａｎｄ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅ
ｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＳＤＡ；Ｇ．
Ｔ．ウォーカー（Ｗａｌｋｅｒ）ら（１９９２）ＰＮＡ
Ｓ ８９，３９２−３９６：Ｇ．Ｔ．ウォーカーら（１
９９２）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２０，
１６９１−１６９６）産物に似せて設計された。ゲノム
中の標的領域はゲノミックＤＮＡより得たＩＳ６１１０
配列より得られた。ゲノム中の標的領域は、シアリー
（Ｔｈｉｅｒｒｙ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１８：１８８（１９９０）に記載さ
れたＩＳ６１１０配列より得られた。上述した分析法
を、合成Ｍ．ｔｂ標的ＤＮＡの検出を評価するのに、以
下のプローブで、以下の標的に対して利用した。

【００４７】（１０）ＴＡＴＣＣＡＣＣＡＴＡＣＧＧＡ
−ＢＢＢ（配列番号：１０）（Ｂはビオチンを表す）； （１１）Ｐ−ＣＧＡＣＣＴＧＡＡＡＧＡＣＧＴ（配列番
号：１１）（Ｐはアルカリフォスファターゼを表す）； （１２）ＢＢＢ−ＣＣＴＧＡＡＡＧＡＣＧＴＴＡＴ（配
列番号：１２）（Ｂはビオチンを表す）； （１３）ＣＣＡＣＣＡＴＡＣＧＧＡＴＡＧ−Ｐ（配列番
号：１３）（Ｐはアルカリフォスファターゼを表す）；
及び （１４）ＧＡＣＡＣＴＧＡＧＡＴＣＣＣＣＴＡＴＣＣＧ
ＴＡＴＧＧＴＧＧＡＴＡＡＣＧＴＣＴＴＴＣＡＧＧＴＣ
ＧＡＧＴＡＣＧＣＣＧＴＣＴＴＴＴＴ（配列番号：１
４） 配列番号：１０及び配列番号：１１は従来技術の１対の
プローブを表す。配列番号：１２及び配列番号：１３は
本発明の１対のプローブを表す。配列番号：１４は標的
ＤＮＡを表す。合成標的ＤＮＡを２０００、１０００、
５００、２５０、１２５、６２．５、３１．２５、及び
０ａｔｔｏｍｏｌｅｓ／５０μｌ体積に希釈し、各プロ
ーブセットを本質的には上述したのと同じ方法で標的の
分析に用いた。表３は分析で集められたデータを示す。

【００４８】

【表３】 平均相対ライトユニット（シグナル） プローブ Ａｔｔｏｍｏｌｅｓ／テスト ＣＶ％セット ０ 31.25 62.5 125 250 500 1000 2000 レンジ¹ 配列番号 10および11 19.87 25.1 36.9 56.4 104 202 420 856 2.8-13.39 配列番号 12および13 4.94 24.13 44.5 89.6 170.7 331.7 721.6 1498 1.78-9.98 また、５’ビオチン及び３’アルカリフォスファターゼ
を結合したプローブセット（配列番号：１２及び配列番
号：１３）では、バックグランドのレベルが顕著に減少
しており、生じた特異的シグナルの量が増大していた。

【００４９】前述の実施例は本発明の例示であり、それ
に限定して解釈されるべきものではない。本発明は、特
許請求の範囲の均等物により定義される。

【００５０】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：１５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｍＲＮＡ ｔｏ ｃＤＮＡ 配列 GGGAACCGGT GACTC 15 配列番号：２ 配列の長さ：１５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｍＲＮＡ ｔｏ ｃＤＮＡ 配列 CAAAAACCTT GCGGC 15 配列番号：３ 配列の長さ：１５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｍＲＮＡ ｔｏ ｃＤＮＡ 配列 GGGAACCGGT GACTC 15 配列番号：４ 配列の長さ：１５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｍＲＮＡ ｔｏ ｃＤＮＡ 配列 CAAAAACCTT GCGGC 15 配列番号：５ 配列の長さ：６６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｍＲＮＡ ｔｏ ｃＤＮＡ 配列 GACCCGACTT GTAAGAGCCG CAAGGTTTTT GGAGTCACCG GTTCCCACTC GCAGCCTGCG 60 TCTTTT 66 配列番号：６ 配列の長さ：１４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｍＲＮＡ ｔｏ ｃＤＮＡ 配列 AACCGGTGAC TCCA 14 配列番号：７ 配列の長さ：１３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｍＲＮＡ ｔｏ ｃＤＮＡ 配列 AAAACCTTGC GGC 13 配列番号：８ 配列の長さ：１３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｍＲＮＡ ｔｏ ｃＤＮＡ 配列 AAAACCTTGC GGC 15 配列番号：９ 配列の長さ：１４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｍＲＮＡ ｔｏ ｃＤＮＡ 配列 AACCGGTGAC TCCA 14 配列番号：１０ 配列の長さ：１５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｍＲＮＡ ｔｏ ｃＤＮＡ 配列 TATCCACCAT ACGGA 15 配列番号：１１ 配列の長さ：１５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｍＲＮＡ ｔｏ ｃＤＮＡ 配列 CGACCTGAAA GACGT 15 配列番号：１２ 配列の長さ：１５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｍＲＮＡ ｔｏ ｃＤＮＡ 配列 CCTGAAAGAC GTTAT 15 配列番号：１３ 配列の長さ：１５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｍＲＮＡ ｔｏ ｃＤＮＡ 配列 CCACCATACG GATAG 15 配列番号：１４ 配列の長さ：６３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｍＲＮＡ ｔｏ ｃＤＮＡ 配列 GACACTGAGA TCCCCTATCC GTATGGTGGA TAACGTCTTT CAGGTCGAGT ACGCCGTCTT 60 TTT 63

【００５１】

【図面の簡単な説明】

【００５２】

【図１】図１は従来技術の標的ポリヌクレオチド、検出
用プローブ、および捕捉プローブのサンドイッチハイブ
リダイゼーション複合体の概略図である。

【００５３】

【図２】図２は本発明の標的ポリヌクレオチド、検出用
プローブ、および捕捉プローブのサンドイッチハイブリ
ダイゼーション複合体の概略図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 グレン・ピー・ボンク アメリカ合衆国ノース・カロライナ州 27526，フクアイ−バリナ，ピニー−グロ ーブ・ウィルボン・ロード 2717 (72)発明者 スチュワート・ラッセル・ジャーゲンセン アメリカ合衆国ノース・カロライナ州 27615，ローリー，バレー・ラン・ドライ ブ 7504 (72)発明者 ロナルド・ジー・マイアティック アメリカ合衆国ノース・カロライナ州 27113，ダーラム，ウッドクロフト・パー クウェイ 500 18エイ

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 （ａ）標的ポリヌクレオチドの第１セグ
   メントにハイブリダイズする第１オリゴヌクレオチドお
   よび上記第１オリゴヌクレオチドの３’末端に付加され
   た検出可能な基からなる検出用プローブを標的ヌクレオ
   チドとハイブリダイズさせ； （ｂ）上記標的ポリヌクレオチドの第２セグメントにハ
   イブリダイズする第２オリゴヌクレオチドおよび上記第
   ２オリゴヌクレオチドの５’末端に付加された捕捉基か
   らなる捕捉プローブを上記標的ヌクレオチドにハイブリ
   ダイズさせ；そして、 （ｃ）上記検出用プローブおよび上記捕捉プローブの上
   記標的ポリヌクレオチドへのハイブリダイゼーションを
   検出する；工程からなる、サンプル中の標的ポリヌクレ
   オチドの存在を検出する方法。
2. 【請求項２】 上記検出可能な基が酵素標識、化学発光
   標識ル、生物発光標識、蛍光標識、および電子密集標識
   からなるグループから選択される、請求項１記載の方
   法。
3. 【請求項３】 上記捕捉基が特異的結合対のメンバーで
   ある、請求項１記載の方法。
4. 【請求項４】 上記捕捉基がビオチンおよびアビジンか
   らなるグループから選択される、請求項１記載の方法。
5. 【請求項５】 上記捕捉プローブを固相体支持体へ付加
   する工程をさらに含む、請求項１記載の方法。
6. 【請求項６】 （ａ）標的ポリヌクレオチドの第１セグ
   メントにハイブリダイズする第１オリゴヌクレオチドお
   よび上記第１オリゴヌクレオチドの３’末端に付加され
   た検出可能な基からなる検出用プローブ； （ｂ）上記標的ポリヌクレオチドの第２セグメントにハ
   イブリダイズする第２オリゴヌクレオチドおよび上記第
   ２オリゴヌクレオチドの５’末端に付加された捕捉基か
   らなる捕捉プローブ；および、 （ｃ）上記捕捉基を結合するための手段；からなる、サ
   ンプル中の標的ポリヌクレオチドの存在を検出するのに
   有用なキット。
7. 【請求項７】 （ａ）標的ポリヌクレオチドの第１セグ
   メントにハイブリダイズする第１オリゴヌクレオチドお
   よび上記第１オリゴヌクレオチドの３’末端に付加され
   た検出可能な基からなる検出用プローブであって、上記
   検出可能な基が酵素標識、化学発光標識、生物発光標
   識、蛍光標識、および電子密集標識からなるグループか
   ら選択され；および （ｂ）上記標的ポリヌクレオチドの第２セグメントにハ
   イブリダイズする第２オリゴヌクレオチドおよび上記第
   ２オリゴヌクレオチドの５’末端に付加された捕捉基か
   らなる捕捉プローブ；からなる、サンプル中の標的ポリ
   ヌクレオチドの存在を検出するのに有用なプローブセッ
   ト。
8. 【請求項８】 上記検出可能な基が、アルカリフォスフ
   ァターゼ、ホースラディシュペルオキシダーゼ、ルシフ
   ェラーゼ、およびアクリジニウム化合物からなるグルー
   プより選択される、請求項７記載のプローブセット。
9. 【請求項９】 上記捕捉基が特異的結合対のメンバーで
   ある、請求項７記載のプローブセット。
10. 【請求項１０】 上記捕捉基がビオチンおよびアビジン
    からなるグループから選択される、請求項７記載のプロ
    ーブセット。