JP2000509278A

JP2000509278A - 試験サンプル中の複数の核酸配列を検出するための方法および試薬

Info

Publication number: JP2000509278A
Application number: JP9539079A
Authority: JP
Inventors: グラナドス，エドワード・エヌ; ボウマ，スタンレイ・アール; カリーノ，ジヨン・ジエイ; ソロモン，ナタリー・エイ
Original assignee: アボツト・ラボラトリーズ
Priority date: 1996-04-26
Filing date: 1997-04-25
Publication date: 2000-07-25
Also published as: CA2250706C; US5955268A; CA2250706A1; WO1997041256A3; EP0954603A2; WO1997041256A2

Abstract

(57)【要約】本発明は、試験サンプル中の複数の標的核酸配列を検出する方法を提供する。また、試験サンプル中の複数の標的配列を検出するのに有用なハイブリダイゼーションプラットフォームも提供する。該ハイブリダイゼーションプラットフォームは、一定のパターンの捕捉プローブが固定化されている固体支持物質を含んでなる。

Description

【発明の詳細な説明】試験サンプル中の複数の核酸配列を検出するための方法および試薬技術分野本発明は、核酸配列の検出、特に、試験サンプル中の複数の核酸配列の検出に関する。発明の背景ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）の出現以来、この核酸増幅反応のいくつかの変法が案出されている。さらに、いくつかの独特な核酸増幅反応が導入されている。例えば、リガーゼチェイン反応（LCR）は、核酸配列を増幅するための有効な手段である。例えば、個々の病原体に特有の核酸配列（標的配列と称されることがある）を増幅し、ついで該増幅核酸配列を検出することにより、試験サンプル中の病原体を検出するためには、PCRおよびLCRのいずれを使用することも可能である。増幅された核酸配列は、不均一系イムノアッセイで用いるのと同様の技術を用いて検出することができる。増幅反応の更なる開発に対する課題には、試験サンプル中の複数の標的配列の検出が含まれる。複数の標的配列を検出することにより、試験サンプル中に存在しうる複数の病原体の存在を確認したり、あるいは、複数の標的配列を検出することにより、試験サンプル中に存在する標的配列を定量することができる。残念ながら、複数の標的配列の検出方法は、その目的が何であるかにかかわらず、増幅された配列に結合することが可能なシグナル生成基の検出方法によって、ある程度制限されてしまう。特に、複数の標的配列を検出するためには、それらの配列を互いに識別しなければならない。そのような識別は、それらの配列を異なるシグナル生成部分と結合させることにより行なうことができるが、これらの部分からのシグナルを検出する場合に問題が生じる。例えば、複数の蛍光部分を使用する場合、それらの複数の部分のそれぞれは、１つの配列を他の配列から識別するのに使用しうる別々の吸収および発光波長を有することがある。しかしながら、この検出方法は、複数の波長で発蛍光団を励起し検出する複雑な検出系を必要とする。さらに、検出すべき異なる蛍光部分の数が増えるにつれて、それらの部分を検出するのに使用する光学系の複雑性も増す。残念ながら、光学系の複雑性が増せば経費が法外なものとなるため、そのような系は、検出可能な異なる配列の数によって制限されてしまう。また、複数の標的配列を検出するために、複数の酵素シグナル生成部分を使用することが提案されているが、そのような検出方法は、その酵素が生成したシグナルを産生させ抑制するために複雑な試薬系を使用する。そのため、複数の核酸配列を検出するための現在優勢な方法は、分子量に基づいて核酸配列を識別するゲル電気泳動である。しかしながら、ゲル電気泳動は、著しく手間がかかり、したがって時間のかかる、自動化または標準化に向かない検出方法である。したがって、複数の標的配列を実用的に検出しうる核酸検出系が必要とされている。発明の概要本発明は、試験サンプル中の複数の標的配列を検出する方法であって、a）ハイブリダイゼーションプラットフォーム（hybridization platform）を該試験サンプルと接触させ、b）該試験サンプル中に存在しうる少なくとも１つの標的配列を該ハイブリダイゼーションプラットフォームにハイブリダイズさせ、それにより、該標的配列がハイブリダイズする部位でシグナルの変化を得、c)該ハイブリダイゼーション部位でのシグナルの変化を、該試験サンプル中の該標的配列の存在の指標として検出する工程を含んでなる方法を提供する。該ハイブリダイゼーションプラットフォームは、一定のパターンで支持物質に固定化された少なくとも２つの捕捉プローブを含む。それらの捕捉プローブは別々の配列を有し、該捕捉プローブのそれぞれは、標的依存的にシグナルの変化を与えるシグナル生成系の少なくとも１つの部材で標識されている。該シグナル生成系は、その全体として、PORSCHA染料、少なくとも１つのインターカレート染料、またはクエンチャーまたはレポーター基を含むことが可能である。また、本発明は、固体支持物質に固定化された少なくとも２つの捕捉プローブを含んでなるハイブリダイゼーションプラットフォームを提供する。それらの捕捉プローブは、別々の配列を有し、例えば前記のような、標的依存的にシグナルの変化を与えうるシグナル生成系の少なくとも１つの部材で標識されている。さらに、該捕捉プローブは、一定のパターンで固体支持物質に固定化されている。図面の簡単な説明図１は、一定のパターンの捕捉プローブを有するハイブリダイゼーションプラットフォームの概要図である。図2a〜2dは、捕捉プローブが標的依存的に分解する本発明の実施態様を例示する。図3a〜3cは、本発明に従い使用しうる捕捉プローブの概要図である。図4a〜4cは、標的依存的にレポーター基によりシグナルが生成する本発明の実施態様を図式的に示す。発明の詳細な説明本発明は、試験サンプル中に存在しうる複数の標的配列を検出するための実用的な方法および試薬を提供するものであり、これらは、（i）少なくとも２つの捕捉プローブが標的配列の存在下および不存在下で異なるシグナルを生成する能力、および（ii）それらの捕捉プローブ間の空間的分離を利用することによるものである。個々の捕捉プローブがその標的配列の存在下および不存在下で生成する異なるシグナルまたはシグナルの変化としては、例えば、標的配列の不存在下でのシグナルの完全な欠如、および標的配列の存在下で検出可能なシグナルが挙げられる。あるいは、標的配列の不存在下で生成したシグナルの波長または強度が、標的配列の存在下で変化することも可能である。複数の捕捉プローブからのシグナルの変化は、該プローブの空間的分離に基づき互いに識別することができる。その結果、本発明は、異なるシグナルを識別しうる複雑な検出系を不要にする共通の吸収および発光スペクトルを有する複数のレポーター基を使用して、複数の標的配列を検出することができる（これは、そのようなレポーター基および検出系の使用が可能である場合にも言えることである）。さらに、本発明で提供する試薬および方法は、均一系類似の態様で複数の標的配列を検出することを可能にするものであり、このため、試薬の過度の取り扱いが不要となり、したがって汚染を最小限に抑制する環境が得られる。本発明によれば、試験サンプルをハイブリダイゼーションプラットフォームと接触させて標的配列を該ハイブリダイゼーションプラットフォームに固定化することにより、複数の標的配列を検出することができる。本発明で用いる「試験サンプル」は、標的配列を含有する疑いのある任意のものを意味する。試験サンプルは、任意の生物学的起源、例えば生理的流体、例えば血液、唾液、眼レンズ液、脳脊髄液、汗、尿、乳、腹水液、粘液、滑液、腹膜液、羊水、細胞など、または発酵ブロス、細胞培養、化学反応混合物などに由来することが可能である。また、法科学的物質（例えば、衣類）は標的配列を含有することがあるため、そのような物質も試験サンプルなる語の定義に含まれる。該試験サンプルは、（i）そのような起源から得たままの状態で直接、あるいは（ii）該サンプルの特性を修飾するための前処理の後で使用することができる。したがって、例えば、血液からの血漿の調製、固体物質からの液体の調製、粘性流体の希釈、液体の濾過、液体の蒸留、液体の濃縮、阻害成分の不活性化、試薬の添加などにより、試験サンプルを使用前に前処理することができる。また、二本鎖核酸配列を消化し、制限酵素処理し、あるいは一本鎖にするために、試験サンプルを前処理することができる。さらに、試験サンプルが含有しうる標的配列を蓄積させ、精製し、増幅し、あるいは濃縮するために、試験サンプルを前処理することができる。当該技術分野でよく知られている増幅反応を用いて、標的配列を増幅することができる。本発明で用いる「標的配列」は、増幅される核酸配列、検出される核酸配列、または増幅され検出される核酸配列を意味する。本発明で用いる「ハイブリダイゼーションプラットフォーム」は、一定のパターンの捕捉プローブが固定化されている固体支持物質を意味する。「固体支持物質」は、不溶性であるか又は後の反応で不溶性にしうる任意の物質を意味する。該固体支持体は、捕捉プローブを誘引し固定化するその固有の能力に関して選択することができ、あるいは該固体支持体は、捕捉プローブを誘引し固定化する能力を有する追加的な受容体を保有することができる。その追加的な受容体は、捕捉プローブとは反対に荷電した荷電物質を含むことが可能であり、あるいは該受容体分子は、固体支持物質上に固定化（結合）される特異的結合部材であって、特異的な結合反応により捕捉プローブを固定化する能力を有する任意の特異的結合部材であることが可能である。該受容体分子は、アッセイの実施前またはアッセイの実施中に、固体支持物質に対する捕捉プローブの間接的な結合を可能にする。したがって、固体支持物質は、例えば、ラテックス、プラスチック、誘導体化プラスチック、磁性もしくは非磁性金属、ガラスまたはケイ素の表面、あるいは試験管、マイクロタイターウェル、シート、ビーズ、微粒子、チップ（小片）および当業者に公知の他の構造体の表面であることが可能である。そのような物質は、フィルム、シート、プレートなどの適当な形状で使用することができ、あるいは、そのような物質を、紙、ガラス、プラスチックフィルム、布などの適当な不活性担体上にコーティングしたり、結合させたり、あるいは積層することができる。本発明では、微粒子、ビーズおよび同様の固体支持構造体を使用することができるが、ある捕捉プローブに関連したシグナルを、例えば別の微粒子に結合した別の捕捉プローブに関連したシグナルから識別することができるように、これらの支持物質構造体を異なる捕捉プローブでコーティングする場合には、これらの支持物質構造体の分離が必要となる。そのような分離技術は当該技術分野でよく知られており、それらには、サイズに基づいて粒子状物質を分離する流体流動分別(fluid flow fractionation)技術を含めることが可能である。したがって、粒子状固体支持物質を使用する場合には、異なる捕捉プローブでコーティングされる異なるサイズを有する粒子を使用することができる。しかしながら、好ましくは、例えばガラス小片などの平面状の支持物質を使用する。なぜなら、そのような表面には、一定のパターンのオリゴヌクレオチドを容易に固定化することができるからである。「捕捉プローブ」なる語は、選択した標的配列と相補的なオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドを包含する。捕捉プローブは、例えば、核酸、リボ核酸および核酸類似体、例えば、国際特許出願WO 92/20702に開示されているペプチド核酸（PNA）または米国特許第5,185,444号、第5,034,506号および第5,142,047 号に記載されているモルホリノ類似体を含む（これらに限定されるものではない）非荷電核酸類似体を含むことが可能である。さらに、以下の記載に基づき明らかとなるように、捕捉プローブはまた、これらの核酸物質の組合わせを含むことが可能である。捕捉プローブを「シグナル生成系」（本発明ではこれは、標的の存在下および不存在下で識別的（differential）シグナルを生成する標識を意味する）で標識する。したがって、シグナルは「標的依存的」（これは、捕捉プローブとその標的配列とのハイブリダイゼーションに際して検出可能な変化を受ける或るシグナルが、標的配列の不存在下で放出されることを意味する）に生成する。レポーター基により生成するシグナルが標的配列の不存在下ではクエンチ基により抑制されるようにプローブをシグナル生成基（本実施態様では「レポーター基」と可変的に称される）とクエンチ基とで標識することにより、捕捉プローブがシグナルを標的依存的に放出するように捕捉プローブを標識することが可能である。そのようなレポーター／クエンチャーの対は、米国特許第5,487,972号および米国特許第5,210,015号に既に記載されており、それらには、例えば、ローダミン、クマリン、フルオレセインなどの発蛍光団、および Yellow）、7−ヒドロキシークマリンおよび6−カルボキシ−フルオレセインを含めることが可能である。シグナルを標的依存的に生成しうる捕捉プローブのもう１つの例には、PORSCHA染料またはインターカレート染料で標識されたプローブが含まれる。PORSCHA染料は、米国特許第5,332,659号に記載されており、１つの PORSCHA染料が別の染料に接近することに基づいて蛍光の変化を示す。インターカレート染料は、PCT出願第WO95/01341号、D.Figeysら,Journal of Chromatogra phy A，699，pp.205-216(1994)およびM．Ogurら，Bio Techniques 16（6）pp.10 32-1033(1994)に記載されており、一本鎖核酸配列と結合したそのような染料により放出される蛍光強度と比べて、二本鎖核酸配列と結合している場合に蛍光強度の増加を示す。前記の考察に基づけば、シグナル生成系は、成分部分または「シグナル生成系の部材」に分解されうる、と当業者に認識されるであろう。例えば、クエンチ基は、レポーター／クエンチ基シグナル生成系の１つの部材である。あるいは、例えば、単一のPORSHA染料は、PORSHA染料シグナル生成系の１つの部材である。本発明に従い使用しうる標識された捕捉プローブおよびプライマー配列は、適当な任意の方法により調製することができる。例えば、オリゴヌクレオチドの化学合成は、米国特許第4,458,066号、米国特許第4,415,732号および米国特許第4, 948,882号に既に記載されている。固体支持物質に固定化された捕捉プローブの「一定のパターン」は、該支持物質上の或る特定の部位に固定化された捕捉プローブの配列（順序）が既知であることを意味する。該パターンは、例えば図１に示す平面状の支持物質上に配置された少なくとも２つの異なるオリゴヌクレオチドと同程度に単純であることが可能であり、図１において、スポット10および20は、既知配列を有する捕捉プローブが支持物質30上に固定化されている捕捉領域を表す。また、より複雑なパターン（例えば、支持物質上に固定化された異なる捕捉プローブを有する少なくとも２つの部位を有する支持物質）を用いることができ、それらは米国特許第5,405,783号、米国特許第5,412,087号、Southern E.M.ら，Nucleic Acids Research，Vol.22，No.8，pp.1368-1373(19 94)およびMaskos U.ら，Nucleic Acids Research，Vol.21，No.20，pp.4663-466 9(1993)に記載されている。いずれの場合にも、該パターンは一定であり、したがって、支持物質上の或る特定部位の捕捉プローブの配列は既知である。よく知られている方法（例えば、吸着、共有結合、特異的結合部材の相互作用、または金チオラート相互作用）のいずれかを用いて、捕捉プローブを支持物質に結合させることができる。また、米国特許第5,405,783号および米国特許第5,4 12,087号に記載されているとおり、捕捉プローブを支持物質に直接的に合成することができる。試験サンプルをハイブリダイゼーションプラットフォームと接触させた後、捕捉プローブは、それらのそれぞれの標的配列が存在すれば該標的配列にハイブリダイズし、それにより、該標的配列を該ハイブリダイゼーションプラットフォームに固定化する。標的配列とのハイブリダイゼーションに際して、捕捉プローブと結合したシグナル生成基は、シグナルの検出可能な変化を与える。その変化は、一般には、該プローブと結合したシグナル生成系に依存し、そのような変化は、捕捉プローブに対する標的配列のハイブリダイゼーションに際して検出可能かもしれない。あるいは、該捕捉プローブと標的配列とのハイブリダイゼーションは、シグナルの検出可能な変化につながる事象のカスケードを誘発することが可能である。例えば、捕捉プローブをインターカレート染料で標識する場合、該染料から放出される蛍光シグナルの強度は、捕捉プローブとその相補的標的配列とのハイブリダイゼーションの際に増加する。ハイブリダイゼーションの前には、捕捉プローブは或る強度のシグナルを有し、捕捉プローブを標的配列とハイブリダイズさせると、そのシグナルは、異なる強度を有する。強度のこの変化は、標的配列が捕捉プローブとハイブリダイズし、したがってそれが試験サンプル中に存在することを示す指標として検出することができる。あるいは、捕捉プローブをPORSCHA染料で標識する場合には、別のPORSCHA染料で標識された相補的標的配列が、ハイブリダイゼーションの際に捕捉プローブ上のPORSCHA染料の空間的特性を変化させることとなる。PORSCHA 染料に結合した特異的結合部材を含む結合体と標的配列とを接触させることによる捕捉プローブと標的配列とのハイブリダイゼーションの前または後に、標的配列をPORSCHA染料で標識することができる。特異的結合部材はよく知られており、それらには、例えば、抗体および抗原、ハプテンおよび抗体、ビオチンおよびアビジン、相補的核酸配列などを含めることが可能である。あるいは、PORSCHA 染料で標識された増幅プライマーを使用して、標的配列を増幅することができる。標的配列をPORSCHA染料で標識するためには、これらの方法のいずれを用いることも可能である。PORSCHAで標識された標的配列とPORSCHAで標識された捕捉プローブとのハイブリダイゼーションの際に、ハイブリダイゼーションプラットフォーム上の標的配列の存在、したがって試験サンプル中の標的配列の存在の指標として、シグナルの変化を検出することができる。前記のとおり、標的配列の存在は、シグナルの検出可能な変化につながる一連の事象を引き起こしうる。そのような一連の事象には、標的依存的な捕捉プローブの分解が含まれることが可能である。捕捉プローブの分解を記載するために本発明で用いる「標的依存的な分解」などの表現は、標的の不存在下では該プローブは分解されないが、捕捉プローブが標的配列とハイブリダイズすると該プローブが分解されることを意味する。例えば、標的依存的に分解されてシグナルの検出可能な変化を与えうる捕捉プローブは、DNAの配列が5'および3'の両末端に結合しているRNA配列を含むことが可能である。一方のDNA配列がレポーター基で標識され、他方のDNA配列がクエンチング基で標識されるように、そのような捕捉プローブを標識することができる。該レポーター基で標識されたDNA鎖が支持物質に最も接近して固定化され、該クエンチング基が該RNA配列により該レポーター基から分離されるように、該捕捉プローブを支持物質に固定化することができる。したがって、該プローブは、標的の不存在下では、クエンチング基によりクエンチされるシグナルを与えるレポーター基で標識された一本鎖核酸配列である。しかしながら、相補的標的配列が捕捉プローブに結合している場合には、該プローブは、標的依存的に分解されることが可能である。特に、該標的の存在は、クエンチング基がレポーター基から分離されるように分解されうる基質を与える。その結果、試験サンプル中の標的配列の存在を示す、該プローブの部位で検出しうるシグナルの検出可能な変化が生じる。標識されたDNA/RNA/DNA捕捉プローブを標的依存的に分解するためには、いくつかの方法を用いることができる。特に、標的配列がそのような捕捉プローブにハイブリダイズしている場合には、該二本鎖配列を、RNアーゼＨ様活性(すなわち、DNA/RNA二重らせん中のRNAを消化し、該標的にハイブリダイズした捕捉プローブの外側DNA部分を残すRNアーゼＨ様活性)を有する酵素と接触させることができる。DNA部分しか残存しなくなるため、捕捉プローブのDNA部分と標的配列との間のハイブリダイゼーション強度が減少する。その結果、標的がDNA部分から自発的に解離することが可能となり、あるいはストリンジェンシー（例えば、温度）が増加すれば、該プローブの残存部分が標的から解離し、それによりクエンチング基がレポーター基から分離することとなる。このようにして、試験サンプル中の標的配列の存在の指標として検出しうるシグナルの検出可能な変化が得られる。このような標的依存的な分解を、図2a〜2dに示す。図2aは、ハイブリダイゼーションプラットフォーム60を形成するために支持物質50に固定化された捕捉プローブ40を示す。図2aに示すとおり、捕捉プローブ40は、RNA配列70（ジグザグの線で示されている）と、RNA配列70の3'および5'末端に結合したDNA配列80および90とを含む。また、図2aには、レポーター基100およびクエンチング基110が示されている。図2bは、標的配列 120が捕捉プローブ40にハイブリダイズした後のハイブリダイゼーションプラットフォームを示す。ついでハイブリダイゼーションプラットフォーム60および固定化された標的配列120を、捕捉プローブ40のRNA配列を分解するRNアーゼＨと接触させることができ、この場合には、図2cに示すとおり、標的配列に結合したDN A配列80および90が残される。図2dは、固体支持体に結合したままのレポーター基100からのクエンチング基110の分離(これは、捕捉プローブの部位のレポーター基からのシグナルの検出を可能にする)を示す。 DNA/RNA/DNA捕捉プローブを分解するための手段としてRNアーゼＨを例示しているが、いくつかの他の酵素およびプローブの設計により、同じ効果を得ることが可能であろう。例えば、RNAではなく非塩基（abasic）部位を含有するが同様のタイプの捕捉プローブを使用し、エンドヌクレアーゼIV活性を有する酵素を用いて、捕捉プローブの非塩基部分を分解し、レポーター基からクエンチング基を遊離させ、シグナルの検出可能な変化を得ることが可能であろう。あるいは、該プローブと標的配列とのハイブリダイゼーションの後で該プローブを3' から5'の方向に分解し、それによりレポーター基からクエンチャー基を遊離させ、シグナルの検出可能な変化を与えるエキソヌクレアーゼIII活性を有する酵素を、DNA捕捉プローブと共に使用することが可能であろう。さらなる別法として、該プローブは、DNA/RNA/DNA構造体または専らDNAを含むことが可能であり、標的配列とのハイブリダイゼーションの際に制限部位が得られるように選択することができる。したがって、ハイブリダイゼーションの際に制限酵素を使用して、二本鎖捕捉プローブー標的配列複合体を切断し、それによりレポーター基からクエンチング基を分離するすることが可能であろう。BamH IまたはII、PST I、Eco r I、HincII、Taq Iなどの制限酵素、およびそれらが作用する制限部位は当該技術分野でよく知られており、それらは、本発明で使用しうる酵素の具体例である。あるいは、シグナルの検出可能な変化が可能となるように、増幅反応／プライマー伸長に基づく分解により、DNA捕捉プローブを標的依存的に分解することができる。この実施態様では、捕捉プローブを分解し、それによりレポーター基からクエンチング基を分離するために、標的配列と共に増幅プライマーを使用する。この実施態様では、捕捉プローブおよび増幅プライマーが互いに隣接するように、該プライマーおよびプローブの両方が標的配列にハイブリダイズする。標的配列上のプライマーとプローブとの関係を記載するために本発明で用いる「隣接」なる語は、該プライマーおよびプローブが、標的配列の同一鎖の異なる部分に対して相補的であり、したがって、該標的配列にハイブリダイズする際に重複しないことを意味するものとする。さらに、該プローブ配列がプライマー伸長の経路に位置するように、該プローブは該プライマー配列の3'末端に隣接するであろう。プライマー伸長に必要な試薬（例えば、ポリメラーゼ活性とヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼ活性とを有する酵素）とヌクレオチド三リン酸の供給との存在下、プライマーの伸長は、該プライマーを伸長させる酵素のヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼ活性により該プローブの分解を引き起こすこととなる。ポリメラーゼ活性とヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼ活性とを有する酵素は良く知られており、それらには、例えば、大腸菌（E.coli）DNAポリメラーゼＩまたはTaqポリメラーゼが含まれる。したがって、該プライマーが伸長するにつれて、該プローブが分解され、それによりレポーター基からクエンチング基が分離され、シグナルの検出可能な変化が可能となる。また、標的配列の不存在下では、該プローブは該標的にハイブリダイズせず、該プライマーは標的の伸長を開始せず、該プローブは分解されない。前記のとおり、本発明の利点は、支持物質に結合したレポーター基が互いに空間的に分離しているため、共通の吸収および発光スペタトルで複数の標的配列の検出が可能なことにある。したがって、ヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼ活性を用いて標的依存的にプローブが分解される或る実施態様に関しては、レポーター基と支持物質との連結はもとのままに維持される。レポーター基と支持物質との連結を維持するためには、いくつかの方法を用いることができる。捕捉プローブの分解を停止するために、いくつかの捕捉プローブの設計を用いることができ、図3a〜3cと共にそれを説明することにする。例えば、該プローブは、レポーター基の3'方向に、ヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼ活性に対する感受性がない核酸類似体を含むことが可能である。図3aに示すとおり、捕捉プローブ130（支持物質135に固定化された状態で示されている）は、クエンチング基140、およびクエンチング基140と支持物質135との間のレポーター基150を含む。クエンチング基140とレポーター基150との間には、線（ジグザグの線）で示されている１以上のヌクレオチド類似体160が存在する。あるいは、捕捉プローブの5'末端が、標的配列にハイブリダイズする際に増幅プライマーの3'末端に隣接するように、捕捉プローブが標的配列にハイブリダイズすることが可能である。この立体配置を図3bに示す。図3bでは、捕捉プローブ 170（支持物質175に固定化された状態で示されている）は、プローブ170の3'末端のクエンチング基180、およびクエンチング基180と支持物質175との間に固定化されたレポーター基190を含む。この実施態様では、該プローブを該支持物質に結合させるために連結基を使用し、該レポーター基を該リンカーに結合させるのが好ましい。図3bに示すとおり、捕捉プローブ170を支持物質175に結合させるために連結基185を使用する。また、図3bに示すとおり、レポーター基180を連結基185に結合させる。さらに、図3bは、捕捉プローブ170にハイブリダイズした標的配列186と、プライマーの3'末端が捕捉プローブの5'末端に隣接するように標的配列186にハイブリダイズしたプライマー187とを示す。プライマー187の伸長の際に、プローブ170 が分解されて、クエンチング基180を遊離する。しかしながら、支持物質175とレポーター基190との結合は未分解のままに維持される。さらなる別法として、該プローブが分枝状となることが可能であり、この場合、クエンチング基は、標的配列と相補的であり固体支持体に直接結合しない分枝に結合させ、レポーター基は、固体支持体に直接結合しており典型的には該標的に相補的でない分枝に結合させる。このプローブの立体配置を図3cに示す。図3c において、捕捉プローブ200は交差部材210を含み、交差部材210上にクエンチング基220が固定化されている。交差部材210は、レポーター基240を有する垂直部材230（レポーター基240は垂直部材230上に固定化されている）に結合している。捕捉プローブ200は、垂直部材230を介して支持物質205に結合している。垂直部材230は、一般には、標的配列に相補的ではないが、交差部材210は標的配列に相補的であり、標的配列に相補的なプライマーの伸長の際に、交差部材210は分解されるが、垂直部材230は分解されない。そのため、クエンチング基220は捕捉プローブ200から遊離し、レポーター基240はその一定の位置に維持される。その結果、この部位でシグナルを検出して、サンプル中の標的配列の存在を示すことができる。そのような分枝状プローブは、Clontech,Palo Alto,CAから商業的に入手可能な不斉分枝状ホスホルアミジットを用いて合成することができる。あるいは、ポリオキシエチレンスペーサーなどの非ヌクレオチドスペーサーを用いて、標的配列と相補的な分枝を固体支持体に連結することができる。さらなる別法として、レポーター基を含む捕捉プローブの部分を、エキソヌクレアーゼ酵素活性による分解に感受性でない非ヌクレオチド化学連結基で支持物質に固定化することができる。さらに、クエンチャーとレポーター基との間の配列を、支持物質からレポーター基が分解されないように十分に長くすることが可能である。好ましくは、レポーター基とクエンチング基との間のそのような介在配列は約25ヌクレオチド長以上、好ましくは、約30ヌクレオチド長以上である。捕捉プローブが標的依存的に分解される実施態様では、クエンチング基で標識された捕捉プローブの部分は分解に感受性であり、分解の際にクエンチング基がレポーター基から遊離される。しかしながら、レポーター基で標識された捕捉プローブまたは結合基の部分は、支持物質に永久的に固定化されている。支持物質とレポーター基との結合を記載するために本発明で用いる「永久的に固定化」なる語は、レポーター基からのシグナルを検出する前に、レポーター基が支持物質から分解されたり又は解離したりしないことを意味する。したがって、捕捉プローブが分解され、クエンチング基がレポーター基から分離された場合であっても、レポーター基は依然として支持物質にその一定の位置にて固定化されている。したがって、捕捉プローブの部位でシグナルを検出して、試験サンプル中の標的配列の存在を示すことができる。試験サンプルの前処理として又は捕捉プローブを標的依存的に分解するために用いることができる増幅反応は良く知られており、それらには、米国特許第4,68 3,195号および第4,683,202号に記載されているポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、EP- A-320308に記載されているリガーゼチェイン反応（LCR）、欧州特許出願EP-A-43 9182に記載されているキャップ（gap）LCR（GLCR）、または国際特許出願第WO 93/20227号に記載されている多重（multiplex）LCRを含めることが可能である。また、Fahy，Eら，PCR Methods and Applications，1 :25-33(1991)に記載されている「3SR」（Self-Sustained Sequence Replication ）およびWalker，G.Tら，PNAS 89:392-396(1992)に記載されている「SDA」（Str and Displacement Amplification）ならびに米国特許第5,487,972号および第5,2 10,015号に開示されている増幅反応を本発明に従い用いることも可能である。ハイブリダイゼーションプラットフォーム上の種々の位置で種々のシグナル生成基が放出するシグナルを複数の波長で検出することは可能であるが、種々のシグナルを単一の波長で検出することが好ましい。なぜなら、そのような場合には、複数の標的配列を検出するために、より実用的な検出系を用いることができるからである。シグナルを検出するための方法は、主に、使用したシグナル生成基が放出するシグナルに基づき当業者により選択される。いずれの場合も、ハイブリダイゼーションプラットフォーム上の種々の捕捉部位からシグナルを集めることになり、捕捉プローブが一定のパターンで配置されているため、シグナルの位置に基づき試験サンプル中の複数の標的配列の存在を確認することができる。本発明で提供する標的配列の検出方法では、標的配列を含有する疑いのある試験サンプルを、ハイブリダイゼーション支持体と接触させる。前記のとおり、試験サンプルの前処理は行なっても行なわなくてもよいが、いずれの場合も、典型的には約80℃〜約105℃の温度にまで数秒間から数分間試験サンプルを加熱することにより、標的配列を変性させる。標的配列が存在すれば、それは、冷却されると固体支持物質上の一定の領域で捕捉プローブにハイブリダイズしうる。捕捉プローブに対する標的のハイブリダイゼーションは、シグナルを誘発するか又はシグナルを生成する事象を誘発する。したがって、種々の一定の捕捉領域のシグナルが「標的依存的」に生成されると言える。１つの実施態様では、試験サンプルを前処理して、それに含有されているいずれかの配列を増幅することができる。いずれかの増幅された標的配列がPORSCHA 染料で標識されるように、使用する増幅プライマーをPORSCHA染料で標識することができる。標識された標的配列が存在すれば、それをついで、少なくとも２つの捕捉プローブ（それらのそれぞれは、異なる標的配列に相補的であり、支持物質に一定の部位にて固定化されている）を含むハイブリダイゼーションプラットフォームと接触させる。また、捕捉プローブもPORSCHA染料で標識する。捕捉プローブに対する標的配列のハイブリダイゼーションの際に、捕捉プローブに結合したPORSCHA染料のスペクトル特性が変化し、この変化を、試験サンプル中の標的配列の存在の指標として検出することができる。ある特定の捕捉プローブの標的配列が存在しなければ、捕捉ブローブに結合したPORSCHA染料のスペクトル特性は同じままに維持されるため、その特定の標的配列が存在しないことが示される。もう１つの実施態様では、試験サンプルを前処理して、それに含有されているいずれかの標的配列を増幅することができる。ついで、いずれかの増幅された標的配列を、種々の標的配列に相補的な或るパターンの捕捉プローブを含むハイブリダイゼーション支持体と接触させることができる。さらに、捕捉プローブは、インターカレート染料を含むことが可能である。あるいは、増幅反応を介して標的配列をインターカレート染料で標識することができ、該プローブがインターカレート染料を含有しないことも可能である。標的配列とのハイブリダイゼーションの際に、捕捉プローブ上または標的配列上の染料は、該二本鎖間にインターカレートし、蛍光の増加を示す。したがって、個々の捕捉プローブの標的配列の存在下、シグナルの検出可能な変化が、その捕捉プローブの部位で検出されることとなる。したがって、いずれか又はすべての捕捉プローブ部位におけるシグナルの変化を検出して、試験サンプル中のいずれか又はすべての標的配列の存在を示すことができる。さらにもう１つの実施態様では、試験サンプルに含有されるいずれかの標的配列を増幅するために、試験サンプルを前処理し、ハイブリダイゼーションプラットフォームと接触させることかできる。該プラットフォームは、支持物質に固定化された一定のパターンの捕捉プローブを含むことが可能であり、該プローブは、支持物質に固定化された末端を有する核酸または核酸の組合わせを含むことが可能である。レポーター染料が、支持物質に固定化された該プローブの末端、したがって支持物質とクエンチング基との間に最も接近するように、該プローブをクエンチングおよびレポーター基で標識することができる。ハイブリダイゼーションプラットフォームを試験サンプルと接触させた後、それに含有されるいずれかの標的配列が、種々の捕捉プローブにハイブリダイズすることとなる。ついで捕捉支持体およびそれに固定化されたいすれかの標的配列を、例えば制限酵素またはRNアーゼＨと接触させることにより該プローブを分解し、それによりクエンチング基を支持物質から遊離させることができる。クエンチング基の遊離の際に、試験サンプル中の標的配列の存在の指標として、レポーター基からのシグナルを検出することができる。したがって、一定の捕捉プローブ部位でのシグナルの検出を、試験サンプル中の標的配列を示す指標として用いることができる。本発明のさらにもう１つの実施態様は、試験サンプルとそれに含有されるいずれかの標的配列とを、ハイブリダイゼーションプラットフォームと接触させる方法を含む。さらに、増幅反応を行なうための試薬とハイブリダイゼーションプラットフォームとを接触させることができる。ハイブリダイゼーションプラットフォームは、支持物質に固定化された少なくとも２つの捕捉プローブを含むことが可能であり、レポーター基が支持物質とクエンチング基との間に存在するように、捕捉プローブをレポーターおよびクエンチング基で標識することができる。しかしながら、クエンチング基とレポーター基の間には、例えば、エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素の分解過程を停止するための手段が存在する。そのようなハイブリダイゼーション支持体を、試験サンプルおよび増幅試薬と接触させた後、標的配列が存在すればそれが捕捉プローブにハイブリダイズし、増幅プライマーが標的配列にハイブリダイズする。標的配列にハイブリダイズした増幅プライマーにより、プライマーの伸長が捕捉プローブの方向に生じ、それにより、分解を停止する手段が存在する位置まで、プローブの分解が生じることが可能である。したがって、プライマーの伸長により、クエンチング基はレポーター基から遊離されるが、レポーター基は支持物質から除去されない。そのため、標的配列の不存在下では、その標的配列に特異的な捕捉プローブが位置する部位からシグナルは検出されないであろう。一方、ある特定の標的配列の存在下では、その相補的捕捉プローブが固定化されていた部位から、シグナルの検出が可能であろう。このように、ハイブリダイゼーションプラットフォーム上の或る特定の部位で検出されたシグナルは、試験サンプル中のその相補的標的配列の存在を示す。したがって、複数の一定の捕捉プローブ部位でのシグナルの検出は、試験サンプル中の標的配列の存在を示す。図4a〜cは、ハイブリダイゼーションプラットフォーム上の１つの部位における前記の実施態様を図式的に示している。図4aは、図3aに記載のハイブリダイゼーションプラットフォームにハイブリダイズした標的配列250 を示し、捕捉プローブ130は、支持物質135に固定化されており、レポーター基15 0、クエンチング基140および核酸類似体160を含む。図4bは、例えば、ポリメラーゼおよびエキソヌクレアーゼ活性を有する酵素、増幅プライマーおよびヌクレオチド三リン酸の供給を含む増幅試薬を加えた後の4aのハイブリダイゼーションプラットフォームを示す。図4b中の矢印で示されるとおり、プライマーの伸長は、捕捉プローブ130の方向に開始し進行する。図4cは、核酸類似体160が位置する地点までプライマーの伸長が進行した後のハイブリダイゼーションプラットフォームを示す。その結果、クエンチング基140は捕捉プローブから遊離し、プライマーの伸長は停止している。したがって、レポーター基150からのシグナルを、試験サンプル中の標的配列250の存在の指標として検出することができる。本発明の実施態様を均一的に実施するのが可能となるようにハイブリダイゼーションプラットフォームを設計するのが有利である。この場合には、種々の実施態様を実施するためのすべての試薬を、同時にハイブリダイゼーション支持体と接触させることができ、また、ハイブリダイゼーションプラットフォームを含有する容器を密封することができるため、汚染に関連した問題を回避することができる。以下の実施例は、本発明をさらに例示するものであり、本発明を限定するものではない。実施例以下の実施例は、DNAオリゴマープライマーと、固相に結合したオリゴヌクレオチド捕捉プローブとを使用して、HIV由来のDNA（配列番号9）および／またはヒトβ−アクチン遺伝子のエキソン３（配列番号10）を検出するための本発明の使用を示す。これらのプライマーおよびプローブを、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７および配列番号８として表す。配列番号１、２、３および７はHIVに特異的である。配列番号４、５、６および８はアクチンに特異的である。HIV特異的プライマーは配列番号１および配列番号２である。HIV特異的捕捉プローブは配列番号３および配列番号７である。アクチン特異的プライマーは配列番号４および配列番号５であり、アクチン特異的捕捉プローブは配列番号６および配列番号８である。実施例１．プライマーおよびプローブの調製 A．プライマーセット HIVまたはアクチンのいずれかの標的配列のコピーとハイブリダイズしその伸長を開始させる標的特異的プライマーを設計する。これらのプライマーは、HIV に関しては配列番号１および配列番号２であり、アクチンに関しては配列番号４および配列番号５である。標準的なオリゴヌクレオチド合成法を用いて、プライマー配列を合成する。 PORSCHA固相プローブと共に使用する場合のために、オリゴ合成で使用する第２取込みヌクレオチドとしてピレンヌクレオシドホスホルアミジット（Kidwell ，米国特許第5,332,659号）、ついで配列番号１および４に示す残存ヌクレオチドを使用することにより、HIV用の配列番号１およびアクチン用の配列番号４を3 '末端においてピレンで標識する。 B．3' 固相固定化のための伸長分解性固相プローブ HIV（配列番号３）標的またはアクチン標的（配列番号６）にハイブリダイズし、隣接プライマーのTmより少なくとも5℃高いTmを有するように、捕捉プローブを設計する。標準的なオリゴヌクレオチド合成法を用いて、該プローブ配列を合成する。該プローブの3'残基は、3'チオールカップラー（Genosys Biotechnologies，Inc.，The Woodlands ，TX）、およびそれに続くC12ポリエチレンオキシドリンカースペーサーホスホルアミジット（Clontech Laboratories，Inc.，Palo Alto，CA）である。フルオレセイン−ONホスホルアミジット（Clontech Laboratories，Inc.，Palo Alto， CA）を使用して、フルオレセインレポーター基を隣に、ついでHIVプローブには配列番号３を、アクチンプローブには配列番号６を付加する。アミノ官能性を5' 末端に付加し、合成に使用した固相から該オリゴを遊離させる。ついでアミノ反応性クエンチャーTAMRA-NHS（6−カルボキシ−テトラメチル−ローダミンn−ヒドロキシスクシンイミド、Perkin-Elmer，Applied Biosystems Division，Foste rcity，CA）の活性エステルを、末端アミノ基との反応により該プローブの5'末端上に取込ませる。ついで該オリゴの3'ジスルフィド残基を介して、プローブを固相に結合させる。該固相は、チタンの薄層（500Å）、ついで5200Åの金の層でスパッタリングされた0.005''カプトンよりなる。5×10¹²分子/μｌの濃度の25mM Tris（pH8）中のプローブを、各プローブの既知の分離位置にて0.2μｌの容量中の金（１×10¹²分子/スポット）に適用し、乾燥させる。 C．5' 固相固定化のための伸長分解性固相プローブ HIV（配列番号３）標的またはアクチン標的（配列番号６）にハイブリダイズし、隣接プライマーのTmより少なくとも5℃高いTmを有するように、捕捉プローブを設計する。標準的なオリゴヌクレオチド合成法を用いて、該プローブ配列を合成する。該プローブの3'残基は、リンカーアームヌクレオチド（LAN）ホスホルアミジット（Glen Research，Sterling，VA）（6炭素のリンカーアームが塩基に結合しているヌクレオチド）である。該（LANホスホルアミジットの後、HIVプローブには配列番号３が、アクチンプローブには配列番号６が続く。フルオレセイン−ONホスホルアミジット（Clontech Laboratories，Inc.，Palo Alto，CA）を使用して、フルオレセインレポーター基を隣に、ついでC12ポリエチレンオキシドリンカースペーサーホスホルアミジット（Clontech Laboratories，Inc.，P alo Alto，CA）を付加する。該プローブの5'残基は、5'チオールカップラー（Ge nosys Biotechnologies，Inc.，The Woodlands，TX)である。合成に使用した固相から該オリゴを遊離させ、3'末端をリン酸で保護する。ついで、LANを含有するオリゴヌクレオチドに、TAMRA-NHS（6 −カルボキシ−テトラメチル−ローダミンn−ヒドロキシスクシンイミド）エステル（Perkin-Elmer，App1ied Biosystems Division，Foster City，CA）を結合させる。ついで該オリゴの5'ジスルフィド残基を介して、プローブを固相に結合させる。該固相は、チタンの薄層（500Å）、ついで5200Åの金の層でスパッタリングされた0.005''カプトンよりなる。5×10¹²分子/μｌの濃度の25mM Tris（pH8）中のプローブを、各プローブの既知の分離位置にて0.2μｌの容量中の金（1×10¹² 分子/スポット）に適用し、乾燥させる。 D．DNA/RNA/DNA 固相プローブ HIVまたはアクチン標的配列にハイブリダイズするように、HIVには配列番号３を、アクチンには配列番号６を使用する。標準的なオリゴヌクレオチド合成法を用いて、該プローブ配列を合成する。該プローブの3'残基は、3'チオールカップラー（Genosys Biotechnologies，Inc.，The Woodlands，TX）、およびそれに続くC12ポリエチレンオキシドリンカースペーサーホスホルアミジット(Clontech L aboratories，Inc.，Palo Alto, CA)である。フルオレセイン−ONホスホルアミジット(Clontech Laboratories，I nc.，Palo Alto，CA)を使用して、フルオレセインレポーター基を隣に、ついでH IVプローブには配列番号３またはアクチンプローブには配列番号６の13個のデオキシリボヌクレオチドホスホルアミジットを付加する。ついで、それぞれの特異的配列を代表する４個のリボヌクレオチドホスホルアミジットを、ついでHIVプローブでは配列番号３の、アクチンプローブでは配列番号６の残りのデオキシリボヌクレオチドホスホルアミジットを挿入する。アミノ官能性を5'末端に付加し、合成に使用した固相から該オリゴを遊離させる。ついでアミノ反応性クエンチャーTAMRA-NHS(6−カルボキシーテトラメチル−ローダミンn−ヒドロキシスクシンイミド、Perkin-Elmer，Applied Biosystems Division，Foster City，CA)の活性エステルを、末端アミノ基との反応により該プローブの5'末端上に取込ませる。ついで該オリゴの3'ジスルフィド残基を介して、プローブを固相に結合させる。該固相は、チタンの薄層（500Å）、ついで5200Åの金の層でスパッタリングされた0.005''カプトンよりなる。5×10¹²分子/μｌの濃度の25mM Tris（pH8）中のプローブを、各プローブの既知の分離位置にて0.2μｌの容量中の金(１×10¹²分子/スポット）に適用し、乾燥させる。 E．インターカレート染料固相プローブ HIVには配列番号３を、アクチンには配列番号６を使用して、HIVまたはアクチン標的配列用の捕捉プローブを合成する。標準的なH−ホスホナートオリゴヌクレオチド合成法（試薬はApplied Biosystems Inc.，Foster City，CAから入手可能）を用いて、該プローブ配列を合成する。該プローブの3'残基は、3'ジスルフィドホスホルアミジット（Clontech Laboratories，Inc.，Palo Alto，CA）、およびそれに続くC12ポリエチレンオキシドリンカースペーサーホスホルアミジット（Clontech Laboratories，Inc.，Palo Alto,CA）である。該スペーサーの後に、HIVプローブには配列番号３が、アクチンプローブには配列番号６が続く。合成中、フェナントリジン−トリアミンの存在下、H−ホスホナートを５個ごとに酸化して、このインターカレート染料を該ホスホナート残基に連結する。合成に使用した固相から該オリゴを遊離させる。ついで該オリゴの3'ジスルフィド残基を介して、プローブを固相に結合させる。該固相は、チタンの薄層（500Å）、ついで 5200Åの金の層でスパッタリングされた0.005''カプトンよりなる。5×10¹²分子 /μｌの濃度の25mM Tris（pH8）中のプローブを、各プローブの既知の分離位置にて0.2μｌの容量中の金（1×10¹²分子/スポット）に適用し、乾燥させる。 F．PORSCHA 固相プローブ HIVには配列番号７を、アクチンには配列番号８を使用して、HIVまたはアクチン標的配列とハイブリダイズする捕捉プローブを合成する。標準的なオリゴヌクレオチド合成法を用いて、該プローブ配列を合成する。該プローブの3'残基は、オリゴ合成で使用する最初に取込まれるヌクレオチドであるピレンヌクレオシドホスホルアミジット（Kidwell，米国特許第5,332,659号）であり、それに続いて、HIVプローブには配列番号７、アクチンプローブには配列番号８が存在する。該特異的配列の後には、C12ポリエチレンオキシドリンカースペーサーホスホルアミジット（Clontech Laboratories，Inc.，Palo Alto，CA）が続く。該プローブの5'残基は、5'チオールカップラー（Genosys Biotechnologies，Inc.，The W oodlands，TX）である。ついで、合成に使用した固相から該オリゴを遊離させる。ついで該オリゴの5'ジスルフィド残基を介して、プローブを固相に結合させる。該固相は、チタンの薄層（500Å）、ついで5200Åの金の層でスパッタリングされた0.005''カプトンよりなる。5×10¹²分子/μｌの濃度の2 5mM Tris（pH8）中のプローブを、各プローブの既知の分離位置にて0.2μｌの容量中の金（1×10¹²分子/スポット）に適用し、乾燥させる。実施例２伸長分解性3'固相プローブを使用する多重増幅および検出既知量のHIV由来のDNA（β−アクチン遺伝子DNAを欠くクローン化DNA）および／またはヒトβ−アクチン遺伝子のエキソン３を含有する混合物を、実施例1.A. に記載のプライマーおよび実施例1.B.に記載の固相プローブを使用して以下のとおりにPCR増幅し、検出する。それらのプライマーは、それそれ0.5μＭの濃度で使用する。Taqポリメラーゼは、2.5単位/反応の濃度で使用する。500mM KCl、10 0mM Tris-HCl、15mM MgCl₂、0.01％(w/v)ゼラチン（pH8.3）よりなる10×PCR緩衝液を最終濃度1×で使用して、PCRを行なう。MgCl₂の最終濃度は1.5mMであり、それぞれ200nMのdNTPおよび50μｇ/ml BSAを0.2mlの合計反応容量中で使用する。 190μｌの前記PCR混合物および10μｌの標的DNAを、実施例 1.Bに記載の金固相に結合したHIVおよびアクチン捕捉プローブを含有するチューブに加える。95℃で１分、ついで95℃で60秒／60℃で80秒の50サイクルの温度プロフィールを有するパーキンエルマー480サーマルサイクラー（Perkin-Elmer 48 0 Thermal Cycler）中で、該反応混合物を増幅する。95℃で５分、ついで15℃で 30分が、これに続く。 PCRの後、表面蛍光リーダーを使用して、488nmで励起した後、518nmのレポーター蛍光および582nmのクエンチャー基の蛍光の増加をモニターすることにより、該金固相上の各スポットの反応性を測定する。蛍光の増加を、陰性対照（標的 DNAを含有しないもの）の蛍光と比較する。レポーター蛍光（R）を、クエンチャー蛍光（Q）で割り算して、該金固相上にプローブを含有する各スポットに関するRQ比を得る。サンプルのRQ比と陰性対照のRQ比との差（ΔRQとして公知である）は、特異的産物の増幅および検出を表す（Livakら，PCR Methods and Applica tions 4:357-362，1995）。 HIVだけを含有するサンプルは、HIVプローブが結合しているスポットでは反応性（518nmの蛍光の増加およびΔRQの増加）を示すが、アクチンプローブが該金固相に結合しているスポットでは反応性を示さない。アクチンDNAだけを含有するサンプルは、アクチンプローブが結合しているスポットでは反応性を示すが、HIVプローブが該金固相に結合しているスポットでは反応性を示さない。HIVおよびアクチンの両方を含有するサンプルは、両方のプローブが結合している場合に反応性を示し、HIVもアクチンも含有しないサンプルは、該固相に結合したプローブでの反応性を示さない。実施例３伸長分解性５'固相プローブを使用する多重増幅および検出既知量のHIV由来のDNAおよび／またはヒトβ−アクチン遺伝子のエキソン３を含有する混合物を、前記実施例２に記載の方法により、実施例1.A.に記載のプライマーおよび実施例1.C.に記載の固相プローブを使用してPCR増幅し、検出する。反応性および結果は、実施例２に記載のものと同じである。実施例４ DNA/RNA/DNA 固相プローブを使用する多重検出既知量のHIV由来のDNAおよび／またはヒトβ−アクチン遺伝子のエキソン３を含有する混合物を、実施例1.D.に記載の固相プローブを使用して検出する。10μ ｌの標的DNAを、実施例 1.D.に記載の金固相に結合したHIVおよびアクチンDNA/RNA/DNAプローブ、17μｌの10×RNアーゼＨ緩衝液、1〜10単位のRNアーゼＨならびに分子生物学等級の水（170μｌの容量に調整）を含有するチューブに加える。チューブを、65℃で10 分間、ついで37℃で30分間インキュベートする。表面蛍光リーダーを使用して、488nmで励起した後、518nmのレポーター蛍光および582nmのクエンチャー基の蛍光の増加をモニターすることにより、標的を検出した後で該金固相上の各スポットの反応性を測定する。蛍光の増加を、陰性対照（標的DNAを含有しないもの）の蛍光と比較する。レポーター蛍光（R）を、クエンチャー蛍光（Q）で割り算して、該金固相上にプローブを含有する各スポットに関するRQ比を得る。サンプルのRQ比と陰性対照のRQ比との差（ΔRQとして公知である）は、特異的標的の検出を表す（Livakら，PCR Methods and Applicati ons 4:357-362，1995）。結果は、実施例２に記載のものと同じである。実施例５インターカレート染料固相プローブを使用する多重増幅および検出既知量のHIV由来のDNA（β−アクチン遺伝子DNAを欠くクローン化DNA）および／またはヒトβ−アクチン遺伝子のエキソン３を含有する混合物を、実施例1.A. に記載のプライマーおよび実施例1.E.に記載の固相プローブを使用して以下のとおりにPCR増幅し、検出する。それらのプライマーは、それぞれ0.5μＭの濃度で使用する。Stoeffel断片(Perkin-Elmer,Roche Molecular Systems，Inc.，Branc hburg，NJ)を、2.5単位の濃度で使用する。500mM KCl、100mM Tris-HCl、15mM M gCl²、0.01％(w/v)ゼラチン（pH8.3）よりなる10×PCR緩衝液を最終濃度1×で使用して、PCRを行なう。MgCl₂の最終濃度は1.5mMであり、それぞれ200nMのdNTPおよび50μｇ/ml BSAを0.2mlの合計反応容量中で使用する。 190μｌの前記PCR混合物および10μｌの標的DNAを、実施例1.F.に記載の金固相に結合したHIVおよびアクチンプローブを含有するチューブに加える。95℃で１分、ついで95℃で60秒／60℃で80秒の50サイクルの温度プロフィールを有するパーキンエルマー480サーマルサイクラー(Perkin-Elmer 480 Thermal Cycler)中で、該反応混合物を増幅する。95℃で５分、ついで15℃で30分が、これに続く。 PCRの後、表面蛍光リーダーを使用して、360nmで励起した後、590nmの蛍光発光の増加をモニターすることにより、該金固相上の各スポットの反応性を測定する。590nmの蛍光の発光は、プローブと増幅された標的との間の特異的ハイブリダイゼーションにより形成した二本鎖オリゴヌクレオチド中へのインターカレートの際の該染料の蛍光特性の変化によるものである。 HIVだけを含有するサンプルは、HIVプローブが結合しているスポットでは反応性（陰性対照に対する590nmの蛍光の増加）を示すが、アクチンプローブが該金固相に結合しているスポットでは反応性を示さない。アクチンDNAだけを含有するサンプルは、アクチンプローブが結合しているスポットでは反応性を示すが、 HIVプローブが該金固相に結合しているスポットでは反応性を示さない。HIVおよびアクチンの両方を含有するサンプルは、両方のプローブが結合している場合に反応性を示し、HIVもアクチンも含有しないサンプルは、該固相に結合したプローブでの反応性を示さない。実施例６ PORSCHA 固相プローブを使用する多重増幅および検出既知量のHIV由来のDNA（β−アクチン遺伝子DNAを欠くクローン化DNA）および／またはヒトβ−アクチン遺伝子のエキソン３を含有する混合物を、実施例1.A.に記載の配列番号１および配列番号４のPORSCHAピレン標識プライマーならびに配列番号２および配列番号５の非標識プライマーと、実施例1.F.に記載の固相プローブとを使用して、前記実施例５に記載の方法によりPC R増幅し、検出する。 PCRの後、特異的ハイブリダイゼーションにより接近した該プライマーおよびプローブ上のピレン環のpi系の重なりから生じる、343nmで励起した後の480nmの発光の増加をモニターするために表面蛍光リーダーを使用して、該金固相上の反応性を測定する。また、378nmおよび396nmでの発光もモニターする。これらの発光は、プライマーとプローブとが離れすぎていて相互作用できない場合のそれらのピレンが発する光に相当する。378nmおよび396nmでの発光に対する480nmでの発光の比は、特異的産物の増幅および検出を表す。 HIVだけを含有するサンプルは、HIVプローブが結合しているスポットでは反応性(480nmの発光の増加および480:378，396nmの比の増加)を示すが、アクチンプローブが該金固相に結合しているスポットでは反応性を示さない。アクチンDNA だけを含有するサンプルは、アクチンプローブが結合しているスポットでは反応性を示すが、HIVプローブが該金固相に結合しているスポットでは反応性を示さない。HIV およびアクチンの両方を含有するサンプルは、両方のプローブが結合している場合に反応性を示し、HIVもアクチンも含有しないサンプルは、該固相に結合したプローブでの反応性を示さない。本発明は特定の実施態様に関して詳細に記載されているが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、そのような実施態様に種々の変更および修飾を加えうることは、当業者には明らかであろう。さらに、本明細書中に引用したすべての参照文献および特許（米国特許または米国以外の特許を含む）を、参考として本明細書に組入れることとする。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者カリーノ，ジヨン・ジエイアメリカ合衆国、イリノイ・60031、ガーニー、プレズント・メドウ・コート・215 (72)発明者ソロモン，ナタリー・エイアメリカ合衆国、イリノイ・60089、バツフアロー・グローブ、ソーンデイル・ドライブ・467

Claims

【特許請求の範囲】１．試験サンプル中の複数の標的配列を検出する方法であって、 a)ハイブリダイゼーションプラットフォームを該試験サンプルと接触させ（この場合、（i）該ハイブリダイゼーションプラットフォームは、一定のパターンで支持物質に固定化された少なくとも２つの捕捉プローブを含み、（ii）前記の少なくとも２つの捕捉プローブは、別々の配列を有し、（iii）該捕捉プローブのそれぞれは、標的依存的にシグナルの変化を与えるシグナル生成系の少なくとも１つの部材で標識されている）、 b)少なくとも１つの標的配列を該ハイブリダイゼーションプラットフォームにハイブリダイズさせて、該標的配列がハイブリダイズする部位でシグナルの変化を得、 c)該部位でのシグナルの変化を、該試験サンプル中の該標的配列の存在の指標として検出する工程を含んでなる方法。２．該捕捉プローブがインターカレート染料で標識されており、該ハイブリダイゼーションプラットフォームに対する該標的配列のハイブリダイゼーションの際のシグナルの前記変化を検出する、請求項１に記載の方法。３．該プローブがPORSCHA染料で標識されており、該方法が、前記の少なくとも１つの標的配列を該ハイブリダイゼーションプラットフォームにハイブリダイズさせる前または後で、かつ、シグナルの前記変化を検出する前に、該標的配列をPORSCHA染料で標識する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。４．該シグナル生成基が該支持物質に永久的に固定化されるように、該捕捉プローブがクエンチング基とレポーター基とで標識されており、該方法が、該標的を該プラットフォームにハイブリダイズさせた後で、かつ、シグナルの前記変化を検出する前に、該捕捉プローブを標的依存的に分解することをさらに含む、請求項１に記載の方法。５．該捕捉プローブの分解が、RNアーゼＨ活性、制限活性、エンドヌクレアーゼIV活性、エンドヌクレアーゼ活性およびエンドヌクレアーゼIII活性よりなる群から選ばれる活性を有する酵素と該プローブとを接触させることを含む、請求項４に記載の方法。６．該捕捉プローブの分解が、前記のハイブリダイズした標的配列を、増幅反応を行なうための試薬と接触させることを含む、請求項４に記載の方法。７．増幅反応を行なうための前記試薬が、 a)ヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼ活性とポリメラーゼ活性とを有する酵素、および b)ヌクレオチド三リン酸を含む、請求項６に記載の方法。８．該捕捉プローブが、該捕捉プローブの分解を停止するための手段をさらに含む、請求項７に記載の方法。９．固体支持物質に固定化された少なくとも２つの捕捉プローブを含んでなるハイブリダイゼーションプラットフォームであって、 a)該捕捉プローブが、別々の配列を有し、 b)該捕捉プローブのそれぞれが、標的依存的にシグナルの変化を与えるシグナル生成系の少なくとも１つの部材で標識されており、 c)該捕捉プローブが、一定のパターンで該固体支持物質に固定化されていることを特徴とするハイブリダイゼーションプラットフォーム。 10．該シグナル生成基が該固体支持物質に永久的に固定化されるように、該捕捉プローブがレポーター基とクエンチング基とで標識されている、請求項９に記載のハイブリダイゼーションプラットフォーム。 11．該捕捉プローブが、該レポーター基と該固相との間の捕捉プローブの分解を停止するための手段を含む、請求項10に記載のハイブリダイゼーションプラットフォーム。