JP2000023698A

JP2000023698A - 鎖再会合複合体によるｄｎａの検出

Info

Publication number: JP2000023698A
Application number: JP11158297A
Authority: JP
Inventors: Kurt Dr Weindel; ヴァインデルクルト; Joachim Brandt; ブラントヨアヒム
Original assignee: Roche Diagnostics GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 1998-06-04
Filing date: 1999-06-04
Publication date: 2000-01-25
Also published as: CA2273471A1; DE19824900A1; ATE316151T1; EP0962536B1; US6790623B2; DE59914868D1; ES2256984T3; ATE408030T1; US6410235B1; US20030152937A1; EP0962536A1; EP1595960B1; DE59913055D1; DE19824900B4; EP1595960A1

Abstract

(57)【要約】（修正有）【課題】標識を取りこませながら生成させた増幅産物の
捕捉反応に基づくハイブリダイゼーション測定法を改良
する。【解決手段】下記工程：１つのプライマーは検出対象の
核酸の一方の鎖とハイブリダイズ可能であり、他方のプ
ライマーは該一方の鎖に相補的な鎖とハイブリダイズ可
能であり、そのうちの少なくとも１つは結合した検出可
能標識を含有するプライマーである２つのプライマーに
より核酸またはその一部を増幅させ、その毎に、反応混
合物中にこれらのプライマーの伸長産物を生成する工
程；前記伸長産物の一つに捕捉プローブを結合して、捕
捉プローブと少なくとも該伸長産物とを含むハイブリダ
イゼーション複合体を形成する工程；反応混合物の未結
合成分から該捕捉プローブに結合した伸長産物を分離す
る工程；該捕捉プローブに結合した検出可能標識を測定
する工程を含む核酸の選択的検出方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、標識プライマーを
用いて核酸を増幅させ、捕捉プローブを用いて増幅産物
を検出する核酸の検出方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】分子認識機構を利用して特定の分析対象
または分析対象特性の検出を可能にする生体特異的結合
測定法が、診断および生体分析の分野で不可欠になって
いる。そこで、近年、免疫測定法や受容体リガンド測定
法に加えて、ハイブリダイゼーション測定法が確立され
てきた。ハイブリダイゼーション測定法は、所望の特異
性を有するプローブにより特定の分析対象核酸( たとえ
ばＤＮＡ、ＲＮＡ) の分子認識を行うためのヌクレオ塩
基対合( Ａ：：Ｔ；Ｇ：：：Ｃ) の原理を利用してい
る。すなわち、たとえば１つの選ばれた配列中のヌクレ
オチド１８ないし２０個から成るオリゴヌクレオチドプ
ローブにより、ヒトゲノム全体を対象とする場合でも正
確な検出が可能になる。

【０００３】ハイブリダイゼーション測定法（＝プロー
ブ利用測定法）は、いわゆるＤＮＡチップ技術により、
有望かつ興味深い発展を遂げてきた。これらの測定法に
おいては、異なる配列を有するがゆえに特異性も異なる
少なくとも２つ、通常は数個ないし非常に多数のプロー
ブを、該プローブと核酸分析対象セグメントとの間、ま
たは異なる核酸分析対象の間で所定回数のハイブリダイ
ゼーション反応を同時に行うことができるように、試験
担体上の別々の領域に幾何学的パターンで結合させる。
適当な反応条件下、例えば、配列選択、緩衝剤環境、塩
含有率、およびとりわけインキュベーションおよび洗浄
温度が適当である条件下では、オリゴヌクレオチドプロ
ーブに含まれているすべてのヌクレオチドが、分析対象
分子中の対応するヌクレオチドに対して相補的であるこ
との結果として完全結合長をもたらすハイブリダイゼー
ション複合体のみを固相に結合させた状態に保つことが
可能である。そこで、これを完全塩基対合( パーフェク
トマッチ、ＰＭ) と呼ぶ。

【０００４】このような条件下で、ミスマッチ( ＭＭ)
を含むハイブリダイゼーション複合体を遊離させる。最
適条件下では、完全塩基対合を有する複合体とワンポイ
ントミスマッチ（単一塩基変化）を有する複合体を明確
に区別することすら可能である。これは、幾何学的パタ
ーンの捕捉プローブ（アレイ）を用いた場合に固相上で
同時的に起きるため、プローブアレイ試験と呼ばれる。

【０００５】捕捉プローブはいずれも、一定の長さ( ヌ
クレオチドビルディングブロック数) を有しうる、すな
わち、ＧＣ含有量に反比例するように、オリゴ長さをマ
ッチさせることができる。第１の場合、たとえば共通融
点Ｔｍがヌクレオ塩基配列と無関係になり、オリゴ長さ
だけに依存するようになる程度までＡＴ結合を強化する
緩衝剤によって、すべての完全対合ハイブリダイゼーシ
ョン複合体のＴｍを実現することができる。このような
添加剤の具体例としては、テトラメチルアンモニウムク
ロリド（ＴＭＡＣ）およびテトラエチルアンモニウムブ
ロミドが挙げられる。第２の場合、上記長さ適応によ
り、Ｔｍの平均化が起きる。捕捉プローブは、たとえば
デオキシリボシル- ホスホジエスエル鎖( ＝＞ＤＮＡ)
、リボシル- ホスホジエステル鎖（＝＞ＲＮＡ）な
ど、特異性介在ヌクレオ塩基を保持する化学的に異なる
バックボーンを有するものであってもよいが、たとえば
Ｎ- （２- アミノエチル）−グリシルまたはＮ- （２-
アミノエチル）グルタミル鎖( ＝＞ＰＮＡ、国際公開第
９２/ ２０７０２号パンフレット) などの非天然物質に
属するものであってもよい。

【０００６】プローブアレイ試験は、多くの分子生物学
的用途や診断用途において重要である。具体的には、マ
ルチパソジェン試験( 異なる病原体を遺伝子レベルで同
時に検出する) 、生物の( サブ) タイピング、遺伝的多
様性の分析( 多型、突然変異) 、遺伝子またはゲノムの
配列決定などが挙げられる。

【０００７】核酸は、通常まず単離した後、増幅させ、
ＤＮＡの場合は一本鎖に変換( 変性) させてからでない
と、プローブ利用アッセイやプローブアレイ試験に使用
することができない比較的複雑な分析対象である。この
プロセシング、および相補的ヌクレオ塩基は同一鎖内で
塩基対合する傾向があるということから、単離または増
幅の効率の変動に伴う反応溶液中の分析対象力価の変
動、変性効率の不足、ＤＮＡの一本鎖の再会合による一
本鎖とプローブのハイブリダイゼーションに競合するオ
リジナル二本鎖の形成、プローブハイブリダイゼーショ
ンに競合する内部ストランドハイブリダイゼーション
（たとえばヘアピンループやクロスフォーメーションな
どの２次構造の形成）などの典型的な問題が生じる。こ
のことは、パリンドローム指標、すなわちＤＮＡまたは
ＲＮＡ鎖の自己相補性の程度が上昇するとさらに顕著に
なる。

【０００８】とくに最後の２つの現象が、この試験法の
基礎を成す分析対象の配列領域の近寄りやすさを決める
ため、捕捉プローブのアレイ全体の総合的能力を制限す
る。

【０００９】いわゆるＰＣＲ法( ポリメラーゼ連鎖反
応、ＵＳ- Ａ- ４，６８３，２０２)を用いて、分析対
象核酸を増幅させるのが普通である。この方法において
は、たとえばジゴキシン誘導体など、検出可能基を増幅
中にすでに取りこませておくことが可能である( ＤＩＧ
標識、ＥＰ- Ｂ- ０３２４４７４) 。ヌクレオシド
三リン酸混合物中でｄＴＴＰの一部をＤＩＧ−ｄＵＴＰ
で置換することで、これを行うことができる。

【００１０】検出可能に標識されたアンプリコン鎖を固
定化可能捕捉プローブにハイブリダイズさせ、生じたハ
イブリッドを検出する方法が、ＤＥ- Ａ- ３８０７９９
４（ＵＳ- Ａ- ５，４７６，７６９）に記載されてい
る。

【００１１】検出対象の核酸を、該核酸の異なる領域に
対して相補的である捕捉プローブおよび検出プローブと
のハイブリダイゼーションによって検出するいわゆるサ
ンドイッチハイブリダイゼーション法が、ＥＰ- Ａ- ０
０７９１３９に記載されている。

【００１２】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、標識
を取りこませながら生成させた増幅産物の捕捉反応に基
づくハイブリダイゼーション測定法を改良すること、と
くに非常に近縁な配列を有する２つ以上の核酸同士の区
別を向上させた測定法を提供することである。

【００１３】

【課題を解決するための手段】即ち、本発明の要旨は、〔１〕下記工程： − １つのプライマーは検出対象の核酸の一方の鎖とハ
イブリダイズ可能であり、他方のプライマーは該一方の
鎖に相補的な鎖とハイブリダイズ可能であり、そのうち
の少なくとも１つは結合した検出可能標識を含有するプ
ライマーである２つのプライマーにより核酸またはその
一部を増幅させ、その毎に、反応混合物中にこれらのプ
ライマーの伸長産物を生成する工程、 − 前記伸長産物の一つに捕捉プローブを結合して、捕
捉プローブと少なくとも該伸長産物とを含むハイブリダ
イゼーション複合体を形成する工程、 − 反応混合物の未結合成分から該捕捉プローブに結合
した伸長産物を分離する工程、 − 該捕捉プローブに結合した検出可能標識を測定する
工程、ここで、該捕捉プローブは、標識プライマーの伸
長により生成した伸長産物ともハイブリダイズ可能な伸
長産物の鎖と結合できるように選択されたものである、
を含む核酸の選択的検出方法、〔２〕該２つのプライマーのうちの１つのみが検出可
能標識を含有する、すなわち、捕捉プローブとは直接ハ
イブリダイズできない逆平行相補的伸長産物を産生する
プライマーである前記〔１〕記載の方法、〔３〕該捕捉プローブが固相に結合している前記
〔１〕または〔２〕記載の方法、〔４〕形成されて固相に結合したハイブリダイゼーシ
ョン複合体が、プライマー標識に結合可能な成分を含
む、シグナルを与える検出試薬またはシグナルを産生す
る検出試薬により可視化されうるものである前記〔３〕
記載の方法、〔５〕検出試薬がシグナル伝達成分粒子またはシグナ
ル媒介成分粒子を含む前記〔４〕記載の方法、〔６〕伸長産物が最初に一本鎖型に変換され、次い
で、捕捉プローブと接触し、捕捉プローブが伸長産物の
鎖に結合可能な条件が設定される前記〔１〕記載の方
法、〔７〕捕捉プローブの伸長産物への結合のための反応
開始が伸長産物の鎖の再会合のための反応開始と本質的
に同一であるように、捕捉プローブとの接触および結合
条件の設定が本質的に同時に生じる前記〔１〕〜〔６〕
いずれか記載の方法、〔８〕伸長産物がアルカリ変性により一本鎖型に変換
され、結合条件の設定が中和を含む前記〔１〕〜〔７〕
いずれか記載の方法、

〔９〕下記工程： − １つのプライマーは１もしくは複数の核酸の一方の
鎖とハイブリダイズ可能であり、他方のプライマーは該
一方の鎖に相補的な鎖とハイブリダイズ可能であり、そ
のうちの少なくとも１つは結合した検出可能標識を含有
するプライマーである少なくとも１組の２つのプライマ
ーにより１もしくは複数の核酸またはその一部を増幅し
て、各配列に対してこれらのプライマーの伸長産物を生
成する工程、 − 配列が試料中に存在してハイブリダイゼーション複
合体を形成する場合、１つの伸長産物をそれ毎に該伸長
産物に選択的に結合可能な１つの捕捉プローブに結合す
る工程、 − 反応混合物の未結合成分から該捕捉プローブに結合
した伸長産物を分離する工程、 − 該捕捉プローブに結合した検出可能標識を測定する
工程、ここで、該捕捉プローブはそれぞれ、該捕捉プロ
ーブの配列に相補的な配列を含み、かつ、標識プライマ
ーの伸長により生成した伸長産物ともハイブリダイズ可
能な伸長産物の鎖と結合できるように選択されたもので
ある、を含む１もしくは複数の核酸における特異的配列
の試料からの選択的検出方法、〔１０〕該捕捉プローブが固相の空間的に離れた別々
の領域に結合する前記

〔９〕記載の方法、〔１１〕各組の１つのプライマーのみが検出可能な基
で標識されたプライマーである、前記

〔９〕または〔１
０〕記載の方法、〔１２〕前記プライマーが多数の特異的配列から伸長
産物を生成するために用いられるものである、前記〔１
１〕記載の方法、〔１３〕下記： − 核酸またはその一部の増幅用の結合した検出可能標
識を含む少なくとも１つのプライマー、 − 異なる配列を有する少なくとも２つの固定可能なま
たは固定された捕捉プローブ、ここで、該プライマー
は、捕捉プローブと同じ伸長産物鎖とハイブリダイズで
きるように選択されたものである、を別々の容器に含有
してなる核酸の検出用試薬キット、ならびに〔１４〕少なくとも１つの検出可能標識プライマー、
および異なる配列を有する少なくとも２つの固定された
または固定可能な捕捉プローブを含有してなる試薬キッ
トの使用方法であって、該少なくとも１つの検出可能標
識プライマーが、突然変異分析において捕捉プローブと
同じ各標的核酸の鎖とハイブリダイズできるように選択
されたものである使用方法、に関する。

【００１４】

【発明の実施の形態】本発明の主題は、検出対象の核酸
の１方の鎖とハイブリダイズ可能なプライマーと、該鎖
に対して相補的である鎖とハイブリダイズ可能なプライ
マーという２つのプライマーにおいて、少なくとも一方
のプライマーは結合した検出可能標識を含んでいる２つ
のプライマーを用いて、核酸またはその一部を増幅させ
るたびに反応混合物中でこれらのプライマーの伸長産物
を生成させ；これらの伸長産物の１つに捕捉プローブを
結合させて、該捕捉プローブと少なくともこの伸長産物
とを含むハイブリダイゼーション複合体を生成させ；捕
捉プローブに結合した伸長産物を反応混合物の未結合成
分から分離し；捕捉プローブに結合した検出可能標識を
測定する工程を含む核酸の選択的検出方法において、該
捕捉プローブとして標識プライマーの伸長によって生成
させた伸長産物ともハイブリダイズ可能な伸長産物の鎖
と結合しうるようなものを選ぶことを特徴とする方法で
ある。

【００１５】本発明の骨子は、未標識正方向プライマー
から出発するＰＣＲにおいて合成されるセンス鎖に対し
て相補的かつ逆平行であるように、固相結合捕捉プロー
ブを設計した場合に、最高の識別力( ＰＭとＭＭの区
別) が得られるが、検出反応は、特異性（識別力）を決
定するプローブハイブリダイゼーション複合体が間接的
に検出され、任意にＤＮＡ鎖再会合複合体を介して定量
されるように検出可能基で標識した逆方向プライマーか
ら出発するＰＣＲにおいて合成されるアンチセンス鎖に
基づくものであるという驚くべき発見に基づくものであ
る。逆に、捕捉プローブは、アンチセンス鎖に対して相
補的であってもよく、この場合、標識正方向プライマー
によって検出することができるセンス鎖との再会合によ
って検出を行う。

【００１６】これは単一ハイブリダイゼーションにも有
効であるが、同時に行われるハイブリダイゼーション測
定、すなわち（Ｄ）ＮＡプローブアレイ試験と組み合わ
せた場合に、とくに好適な効果が得られる。

【００１７】選択的試験とは、それ自体は標的配列を有
さないが、標的配列が存在する可能性のある多くの核酸
を含む試料中の非標的配列とはわずかに異なるだけの標
的配列を有する核酸を選択し、結合させる試験をいうも
のとする。結合は、プローブおよび検出対象の核酸のＡ
およびＴまたはＵならびにＧおよびＣなどの相補的塩基
の対合によって起きる。この目的のためには、とくに標
的配列が非標的配列と異なる塩基に関して、プローブの
配列は核酸の標的配列に対して高度に相補的であり、１
００％相補的であることが好ましい。プローブ配列は、
８ないし３６ヌクレオチド長であることが好ましく、１
６ないし２０ヌクレオチド長がとくに好ましい。プロー
ブのいわゆるバックボーンなどの非ヌクレオ塩基部分の
化学構造は、標的配列への選択的結合が可能である限
り、比較的自由に選ぶことができる。最近、上記( 好ま
しい) オリゴヌクレオチド( 天然バックボーンまたはバ
ックボーンとして働く付着基で修飾された糖リン酸バッ
クボーン) 以外にも、いわゆるペプチド核酸( 国際公開
第９２/ ２０７０２号パンフレットのＰＮＡ、バックボ
ーンの構造中に取り込ませた人工アミノ酸) も適当であ
ることが判明している。混合バックボーン単位を有する
分子も適している( 国際公開第９５/ １４７０６号パン
フレットまたはＥＰ- Ａ- ０６７２７００) 。

【００１８】反応複合体を配列特異的に固相上に固定化
する機能を有する捕捉プローブは、たとえば、それがや
はり標識プライマーの伸長によって生成した伸長産物と
ハイブリダイズ可能な伸長産物上の配列に対して相補的
である場合は、その伸長産物の鎖に結合しうる。そこ
で、この配列を標的配列とする。この検出対象の核酸の
配列は、公知のものであってもよいが、配列決定によっ
て決定してもよく、本発明により１または複数のプロー
ブに結合してから、配列を限定し決定してもよい。

【００１９】標的配列は、互いに対向するプライマーの
内部末端の間に存在するものを選ぶことが好ましい。標
的配列の配列は、とくに塩基配列に関して、検出対象で
ない核酸の配列と異なるものを選ぶ。この差異は、たと
えば突然変異( 単一または複数の塩基置換) 、欠失、挿
入または多型によるものであってよい。

【００２０】当該分野に熟練せる者であれば、たとえば
公知の配列データベースにおける配列検索と配列比較を
行うことで、適当な標的配列を見つけることができる。
複数の配列、配列差異、突然変異、多型などを検出する
本発明の好ましい態様の本質においては、標的配列は、
１つのプライマー対（逆方向プライマーと正方向プライ
マー）を用いて増幅させることができる領域内に存在す
ることが好ましいが、原理上、とくに他の標的配列に対
応する領域を含む増幅産物を生成する場合は、複数のプ
ライマーを用いることもできる。検出対象の核酸は、所
望の起源のものであれば、ＲＮＡであってもよいし、Ｄ
ＮＡであってもよい。ゲノムＤＮＡが好ましい。

【００２１】この場合、別の核酸または配列に対して相
補的である核酸または配列とは、該別の核酸または配列
の分断されていない連続塩基群とワトソン−クリック型
または/ およびフーグスティーン型塩基対合を形成しう
る分断されていない連続塩基群を含む核酸または配列を
いうものとする。

【００２２】この場合、別の核酸または配列に対して相
同的である核酸または配列とは、該別の核酸に対して相
補的である核酸または配列に対して相補的である核酸ま
たは配列をいうものとする。このプロセスにおいては、
分断されていない塩基配列を各ケースで比較する。

【００２３】すなわち、天然塩基以外にも、他の塩基へ
の結合能力の点で天然塩基と有意差がない人工塩基が存
在するということが当該分野に熟練せる者にとって自明
である。プローブとしてオリゴヌクレオチドを用いる場
合、これもハイブリダイゼーションという。最適なハイ
ブリダイゼーションが起きる条件は、当該分野に熟練せ
る者にとって公知である。たとえば、温度、プローブの
長さおよび塩含有率も、検出対象の核酸のＧＣ含有率に
よって決まる。

【００２４】本発明には、他の条件は同じであっても、
より高い検出選択性が得られるという利点がある。一
方、選択性を維持しながら、プロセスパラメーター（た
とえば洗浄温度）のストリンジェンシーを下げることが
できる。選択性とは、完全相補的ではない配列を有する
すべての核酸を識別しながら、完全相補的である塩基配
列を有する核酸に対して特異的なプローブハイブリダイ
ゼーションをいうものとする。

【００２５】本発明の範疇にある試料は、体液、培地も
しくは培養組織、またはそれらから調製した溶解物、抽
出物、または血清、血漿もしくはそれらの誘導物などの
単離物などである。

【００２６】増幅方法は、当該分野に熟練せる者にとっ
て基本的に公知である。具体例としては、ＮＡＳＢＡ
（ＥＰ- Ｂ- ０３２９８２２またはＵＳ- Ａ- ５，
１３０，２３８）、ＬＣＲ（ＥＰ- Ｂ- ０３２０２
０８）、およびＰＣＲ（国際公開第９０/ ０１０６９号
パンフレット）などの増幅方法が挙げられるが、本発明
の範疇においては、ＰＣＲ原理（ＥＰ- Ｂ- ０２００
３６２またはＵＳ- Ａ- ４，６８３，２０２）による
増幅が好ましい。この方法においては、検出対象の核酸
の鎖とハイブリダイゼーションしうるように選ばれた配
列を有する１つのプライマーを鋳型として用い、ポリメ
ラーゼ、およびその他のハイブリダイゼーションに必要
な緩衝剤、モノヌクレオシド三リン酸などの試薬を作用
させた後で、プライマーの３’末端の下流側に位置する
核酸セグメントであって、後で他方のプライマーとのハ
イブリダイゼーションおよびその伸長のための鋳型とし
て働きうる核酸セグメントを鋳型として用いて伸長産物
を生成させるように、そのプライマーともう１つのプラ
イマーとの少なくとも２つのプライマーを用いる。プラ
イマーが核酸またはその対向鎖に対してより選択的に結
合すればするほど、増幅はより選択的になる。下記反応
工程を何度も繰り返すことによって、標的配列（単数ま
たは複数）を含むプライマーの外側末端の間に位置する
核酸片の無数のコピーを作成することができる。すなわ
ち、プライマーを鋳型とハイブリダイゼーションさせ、
プライマーを伸張させ、伸長産物を鋳型から分離する工
程である。

【００２７】正方向プライマーとは、検出対象の核酸鎖
の配列とハイブリダイズ可能か、実際にハイブリダイズ
するプライマーをいうものとする。該鎖は、二本鎖の２
本の鎖の一方から選ぶことができるが、たとえばＲＮ
Ａ、好ましくはｍＲＮＡまたはｒＲＮＡなど、すでに一
本鎖核酸状態にあるものであってもよい。逆方向プライ
マーとは、正方向プライマーから生成させた伸長産物と
ハイブリダイズ可能か、実際にハイブリダイズするプラ
イマーをいうものとする。

【００２８】正方向プライマーは、検出対象の核酸のア
ンチセンス鎖とハイブリダイズ可能なプライマーが好ま
しく、逆方向プライマーは、センス鎖とハイブリダイズ
する。したがって、センス伸長産物( センス娘鎖) は、
正方向プライマーから生成される( 図１参照) 。

【００２９】プライマー結合部位を標的化する１つの配
列以外にも、プライマーは、好ましくは５’末端に位置
する標識に対してスペーサーとして働くオリゴＴ末端な
ど、検出対象の核酸と直接的にハイブリダイズできない
追加の配列を含んでいてもよい。このようにして、捕捉
プローブも修飾することができる。

【００３０】共通プライマーは、１２ないし３０個のヌ
クレオチド/ 塩基数の長さを有する。本発明において
は、分析対象核酸の存在( 定性試験) または量( 定量試
験) の指標となる次の検出工程に、両者ともに含まれ
る。

【００３１】本発明の範疇では、正方向および逆方向プ
ライマーの群から選ばれた少なくとも１つのプライマ
ー、好ましくは１つだけのプライマー、とくに好ましく
は１つだけの逆方向プライマーが、検出可能に標識され
ていることが好ましい。標識とは、検出可能な形で核酸
と性質が異なる化学基をいうものとする。このような性
質は、たとえば特定の波長における吸光度、蛍光、散
乱、反射、または他物質への結合能力であってよい。こ
れらを直接標識と間接標識に分けることもできる。直接
標識は、結合成分を追加しなくてもシグナル生成性に基
づき検出することができる。この群にはたとえば、発色
基質の酵素触媒変換をモニターすることによって検出す
ることができるアルカリホスファターゼやペルオキシダ
ーゼ（ＰＯＤ）などの酵素が含まれる。しかしながら、
たとえばアエクオリン（aequorin）の場合のように、測
定時に基質が複合体の付近にとどまる場合に限り、本発
明の範疇でこれらの条件を満たす基が好ましい。しかし
ながら、これらは、スペクトル性に基づき検出すること
ができるフルオレセインなどのシグナル生成基も含む。

【００３２】間接標識とは、それらに結合しうる成分で
あって、後で直接的または間接的に標識することができ
る成分を含む別の試薬への結合を必要とするものをい
う。これらの基としては、たとえばビオチンまたはジゴ
キシゲニンなどのハプテンが挙げられる。これらのもの
は、たとえばストレプトアビジンまたは抗体などの結合
パートナーを含む検出試薬との反応によって検出するこ
とができる。この目的のためには、これらものを、アエ
クオリンまたは蛍光物質などのシグナル生成基またはシ
グナル介在基で標識する。検出可能な染料を含むラテッ
クス製ビーズまたはマイクロスフィアーなどの粒状成分
がシグナル生成基としてとくに好ましい。本発明は、内
部鎖再会合が防止されない場合に、図５に示した立体配
座ゆえに標識( この場合、ジゴキシゲニンが標識であ
る) に結合することができない大きなサイズの粒子の場
合に、とくに好適な効果を示す。いうまでもなく、標識
は、プライマーのハイブリダイゼーションと伸長を極力
阻害しないようなやり方でプライマーに正しく付着させ
る。したがって、たとえばマーカー基による誘導体化を
行ったホスホロアミダイトを用いる化学合成時のオリゴ
ヌクレオチドの場合には、５’末端に標識を付着させる
ことが好ましいが、標識は、塩基に付着させてもよい(
国際公開第９３/ ０５０６０号パンフレット) 。ＰＮＡ
の場合、標識はアミノ末端に付着させることが好ましい
( 国際公開第９２/ ２０７０３号パンフレット) 。

【００３３】捕捉プローブとは、核酸に結合する単位で
あって、増幅によって生じる核酸鎖( 伸長産物) のうち
の１つに選択的に結合しうるとともに、固相に結合させ
ることができるか( 固定化可能) 、固相にすでに結合し
ている( 固定化済み) ものをいうものとする。したがっ
て、直接結合とは、水素架橋を介した２個の塩基の結合
をいうものとする。固相への結合は、共有結合であって
もよいし、非共有結合であってもよい。共有結合は、ホ
スホジエステル結合( ＥＰ−Ｂ−０３８６２２９) お
よびアミド結合( ＥＰ- Ｂ- ０５６２０２５または
ＵＳ- Ａ- ５，２４２，９７４) によるか、感光性残基
（たとえばジアゾ基）の活性化および反応基を含むプロ
ーブの溶液との接触（たとえばＰＣＴ/ ＥＰ９６/ ００
８９３）により、これを行うことができる。

【００３４】非共有結合としては、たとえば相互作用ペ
アである（ストレプト）アビジン−ビオチン、ハプテン
−抗体、ビタミン−受容体などに含まれているものなど
の生体特異的結合が挙げられる。捕捉プローブは、たと
えばアミノアルキルリンカーを用いて５’リン酸基を介
してビオチンで標識することが好ましく、固相はストレ
プトアビジンで被覆したものが好ましい。しかしなが
ら、捕捉プローブは、増幅で生じた反応混合物と接触さ
せる前に、共有結合によるか安定的生体特異的結合( た
とえば( ストレプト) アビジン−ビオチン) を介して固
相にすでに結合されていることが好ましい。本発明にお
いては、固相の組成は重要ではないが、増幅混合物に対
しては不溶でなければならない。たとえば、ビーズ状ま
たは多孔質フリース状または多少平坦な非多孔質試験担
体状など、金属成分含有または金属成分不含のプラスチ
ックでできた相がとくに好ましい具体例として挙げられ
る。捕捉プローブがすでに結合されているか、結合させ
ることができる部位を提供するとともに、検出対象の核
酸が存在する場合にはそれが結合しうるということが、
上記担体の重要な性質の１つである。別の捕捉プローブ
に対して１００％相補的である捕捉プローブを同時に用
いないことが好ましい。

【００３５】本発明の特定の態様は、異なる配列を有す
る複数の核酸のポテンシャル( マルチプル) 検出を目的
とするものである。この目的は、検出対象の各核酸また
は配列に対して選択的である捕捉プローブを用いること
によって行うことができる。捕捉プローブは異なる固相
に結合させてもよいが、同一固相上の異なる部位に結合
させることが特に好ましく、たとえば国際公開第９２/
１０５８８号パンフレットに記載されている核酸アレイ
タイプの測定技術によって識別することができる同一固
相上の特定の幾何学的部位に結合させることがさらに好
ましい。すなわち、判定を容易にする四角形、六角形、
または十字型マトリックスなどの一定の幾何学的パター
ンを選ぶことが可能である。これにより、標的配列のク
ラスター全体が試料に含まれているかどうかを調べるこ
とができる。本発明は、逆方向プライマーおよび正方向
プライマーの伸長産物ならびに捕捉プローブを含む結合
複合体( ハイブリッド) の生成を利用するものである。
以下、正方向プライマーの伸長によって生成させた伸長
産物を正方向伸長産物という。従来技術から知られた方
法では、上記ハイブリッドを測定可能に生成させるのに
必要な条件は満たされない。一般に、捕捉プローブがそ
の（増幅産物の）対向鎖とハイブリダイズして、( 再)
会合産物を生成することができる前に、増幅産物の鎖と
ハイブリダイズするのに十分な機会が与えられた場合
に、上記複合体の生成が促進される。そうでない場合
は、とくに検出対象の核酸が内部鎖ハイブリッドを形成
する傾向が強い場合は、捕捉プローブは所望の伸長産物
とハイブリダイゼーションすることができず、シグナル
強度が非常に低くなるために、検出が阻害されたり不可
能になったりする。

【００３６】この複合体の生成は、次のようにして行う
ことができる。適当量のハイブリダイゼーション溶液
と、二本鎖として存在する伸長産物が塩基変成によって
一本鎖に変換されている一定量の増幅反応混合物をそれ
ぞれ別々にまたは/ および連続的にピペット、好ましく
は同じピペットに採取し、互いを物理的に分離( ピペッ
ト中の混合が実質的に排除されるように) した後、固相
を入れた容器に注入する。

【００３７】好ましい態様においては、可能な限り２つ
の液が混合し合わないように、まずハイブリダイゼーシ
ョン溶液、次いで気泡、次いで反応混合物をピペットま
たはニードルに吸引する。次いで、２つの液を、捕捉プ
ローブを含む容器に、迅速に、すなわち５秒以内、好ま
しくは１秒以内に分配する。迅速混合は、とくに分配速
度によって達成され、所望により、液体をピペットから
反復的に出し入れすることによって行われる。したがっ
て、たとえば、はね返しを防止するためには、分配速度
を、反応容器の形状にマッチさせなければならない。迅
速混合により、伸長産物の１つの鎖と捕捉プローブとの
ハイブリダイゼーションを、鎖再会合または内部鎖ハイ
ブリダイゼーションと実質的に同時に起こさせることが
できる。ハイブリダイゼーションの開始時間ｔ₀を、ハ
イブリダイゼーションを可能にする反応条件の設定時間
と定義する。

【００３８】インキュベーション温度に関しては、捕捉
プローブがセンス鎖とハイブリダイズ可能なものを選ぶ
ことが好ましく、好ましくはこのハイブリッドの融点よ
り５℃以下であり、混合物の凝固点より２℃以上高い温
度である。

【００３９】プローブ( 単数または複数) は、４５ない
し１８０分間にわたり反応混合物とともにインキュベー
トすることが好ましい。続いて、非選択的に結合した標
識、すなわち過剰標識が、選択的に結合した画分の測定
を有意に妨害することがないように、固相に結合しなか
ったプライマー( とくに標識プライマー) の画分および
標識増幅産物の画分を固相から分離する。この操作は、
液体をピペットで除去することによって行うことがで
き、１または複数の洗浄工程を任意に加えることで、促
進することもできる。

【００４０】本発明の好ましい態様においては、増幅産
物とともに捕捉プローブをインキュベートするために、
比較的ストリンジェンシーの低いハイブリダイゼーショ
ン条件、すなわち選択的ハイブリダイゼーションはまだ
起きていないが、比較的大量の核酸が比較的非選択的に
結合するような条件を選ぶ。一方、引き続き行われる１
または複数の洗浄工程においては、比較的ストリンジェ
ンシーの高いハイブリダイゼーション条件を選ぶ。この
プロセスにおいては、捕捉プローブが標的配列に対して
比較的相補性が低いハイブリッドが再び遊離され、比較
的ストリンジェンシーが高い相補的ハイブリッドは結合
したままである。

【００４１】この目的のためには、洗浄緩衝液を次のよ
うにして選ぶことが好ましい。すなわち、２〜５ｍｏｌ
/ ｌのＴＭＡＣ、０．１〜５ｍｍｏｌ/ ｌのキレート剤
（たとえばＥＤＴＡ）、０．１〜５重量％の好ましくは
アニオン系の界面活性剤、および１〜１００ｍＭの有機
緩衝剤塩基を含むものが好ましい。

【００４２】本操作は、突然変異、とりわけたとえばｐ
５３など、抗生物質または多型に対する生物の抵抗性な
ど複雑なパターンを有する突然変異の検出にとくに適し
ている。本操作は、とくに選択性が高いこと、すなわち
非常に類似性の高い核酸配列同士をうまく区別または識
別することができるという特徴を有する。

【００４３】本発明の好ましい態様においては、たとえ
ば血清などの試料を、検出対象の核酸がハイブリダイゼ
ーションに利用できる形で存在する試薬を用いて処理す
る。これは、たとえばウイルスや細菌などの生物の細胞
壁を溶解する試薬を添加することによって行うことがで
きる。核酸は、所望により、たとえばガラス粒子などの
固相上に固定化させ、カオトロピック塩を添加すること
により、前精製することができる。このような前精製に
ついては、たとえばＥＰ- Ａ- ０３８９０６３また
はＵＳ- Ａ- ５，２３４，８０９に記載されている。次
いで、核酸を含む溶液を、検出可能基で標識された逆方
向プライマーと標識されていない正方向プライマーを用
いるＰＣＲによる核酸増幅に付す。プライマーの間に存
在する検出対象の核酸の領域が、標的配列を含む領域で
ある。増幅産物を含む溶液を、ハイブリダイゼーション
溶液と同時に、検出対象の核酸の未標識センス鎖上に存
在する１つの標的配列に対してそれぞれ相補的である異
なる配列を有する捕捉プローブを別々の領域に結合させ
たものを表面に有する平坦な反応容器に加える。一方、
捕捉プローブがアンチセンス鎖に対して逆平行で相補的
であるように設計されたものである場合、それに合わせ
て、標識済みの正方向プライマーを用いる。

【００４４】このプロセスにおいては、検出対象の核酸
がオリジナル試料中に存在していた場合に限り、捕捉プ
ローブと２つの鎖とから成る所望のハイブリッドが、本
発明に従い形成される。ハイブリッドの形成は、たとえ
ば( 蛍光) 顕微鏡を用いて、増幅産物中に取り込ませた
標識を介して、直接的に検出することができる。たとえ
ばハプテンによる間接的標識の場合、ハプテンに特異的
な標識抗体を加えることにより、該抗体と( 第２の) 標
識が( 第１の) 標識に結合する。続いて、( 第２の) 標
識を測定することができる。

【００４５】測定値は、特異的反応部位のアレイ内のど
の位置で標識が判定されるかを確定することによって判
定する。結合した捕捉プローブの( 既知) 配列に対して
相補的である配列が、試料中に存在する。測定シグナル
を陽性判定として可能などうかを決定するために、核酸
が存在していたと考えられる最低閾値を求めるのが普通
である。測定シグナルは配列や類似性によって異なる可
能性があるので、通常、測定感度は非常に高く、バック
グランドシグナルもシグナルとして検査される可能性が
ある。したがって、本発明による識別力の増加は、偽陽
性判定を防止する上できわめて重要である。これによ
り、標的配列の存在下および非存在下でのシグナル同士
の識別度をはるかに向上させることができる。

【００４６】上記マルチプル試験においては、特定の核
酸のさまざまなプライマー対や部分配列を用いて、たと
えばヒトゲノム上の多型など、ＨＢＶ、ＨＧＶ、ＨＣ
Ｖ、およびＨＩＶなどのウイルスをはじめとするさまざ
まな分析対象をまとめて検出することができるだけでな
く、新規の配列（従来公知でない配列）または正常配列
との違いの検出を目的として、ハイブリダイゼーション
（ＳＢＨ）法による配列決定により、その配列を決定す
ることもできる。１つのＳＢＨ法は、既報[ たとえばク
ラプコ（Khrapko ）ら、FEBS Letters 250, 118-122 (1
989)；クラプコ（Khrapko ）ら、J. DNA Sequencing an
d Mapping 1, 375-388 (1991)]に記載されている。この
方法においては、通常、１端側が最も類似性の高い配列
よりも短く、他端側が長くなるように配列が重複してい
るほぼ同長の捕捉プローブを用いる。方向は変わらない
が、１端側で長く、他端側で短くなっている追加配列に
ついては、同じことが当てはまる。こうしてできるシフ
トは、要件に応じてヌクレオチド１個ないし５個分であ
る。得られたハイブリダイゼーション情報を総合するこ
とによって、配列決定対象の核酸の配列を決定すること
ができる。

【００４７】対立遺伝子特異的または突然変異特異的捕
捉プローブを、突然変異分析に用いることができる。

【００４８】したがって、また本発明の主題は、検出核
酸の一方の鎖とハイブリダイズ可能なプライマーと、該
鎖に対して相補的である鎖とハイブリダイズ可能なプラ
イマーという２つのプライマーにおいて、少なくともそ
の１つは結合した検出可能標識を含んでいる２つのプラ
イマーを用いて、反応混合物中でこれらのプライマーの
伸長産物を生成させ；捕捉プローブを、これらの伸長産
物の１つに結合させて、該捕捉プローブと少なくともこ
の伸長産物とを含むハイブリダイゼーション複合体を生
成させ；捕捉プローブに結合した伸長産物を反応混合物
の未結合成分から分離し；捕捉プローブに結合した検出
可能標識を測定する工程を含む核酸の選択的検出方法に
おいて、標識プライマーの伸長によって生成させた伸長
産物ともハイブリダイズ可能な伸長産物の鎖と結合しう
る捕捉プローブを選ぶことを特徴とする方法である。

【００４９】本発明のさらなる主題は、プライマーが捕
捉プローブと同じ伸長産物の鎖とハイブリダイズ可能な
プライマーを選ぶことを特徴とする、別々の容器内に、
核酸またはその一部を増幅させるための結合した検出可
能標識を含む少なくとも１つのプライマーと、異なる配
列を有する少なくとも２つの捕捉プローブとを含有する
核酸の検出用試薬キットである。

【００５０】本発明のさらなる主題は、少なくとも１つ
の検出可能標識プライマー、および異なる配列を有する
少なくとも２つの捕捉プローブを含有する試薬キットの
使用方法であって、少なくとも１つの検出可能標識プラ
イマーは、突然変異分析において捕捉プローブと同じ各
標的核酸の鎖とハイブリダイズできるように選択された
ものである使用方法である。

【００５１】

【実施例】以下、実施例により本発明をさらに詳細に説
明する。

【００５２】実施例１ミコバクテリウム・ツベルクロシスの検出Ａ）試料の調製および増幅ミコバクテリウム・ツベルクロシス（野生型ＷＴおよび
変異体ＭＸ）のＲＮＡポリメラーゼのβサブユニット
（ｒｐｏβ）遺伝子を含む大腸菌でクローニングしたＤ
ＮＡプラスミド鎖を、細胞溶解後に単離し、小さいＱｕ
ｉａｇｅｎカラムにより精製した。リファンピシン耐性
に関連するｒｐｏβ遺伝子セグメントを、正方向プライ
マーまたは逆方向プライマーが任意に５’末端にＤＩＧ
標識を保有するＰＣＲにより増幅した。標準ホスホロア
ミダイト化学（カルサーズ(Caruthers, M. H.)、バロン
(Barone, A. D.) 、ビューケージ(Beaucage, S. L.) 、
ドッズ(Dodds, D. R.)、フィッシャー(Fisher, E. F.)
、マックブライド(McBride,L. J.) 、マチュッシ(Matt
eucci, M.) 、スタビンスキー(Stabinsky, Z.) 、タン
(Tang, J. Y.) 、デオキシリボヌクレオチドの化学合
成、Methods in Enzymology 154, 287-313 (1987))) に
従って、プライマーオリゴヌクレオチドを合成し、[ Ｎ
−トリフルオロアセタミド−（３−オキサ）ペンチル]
−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−メチル−ホスホロアミダイ
ト（ベーリンガーマンハイム社（ＢＭ）、注文番号１４
８０８６３）の取り込みにより、任意に５’末端を機能
化した後、アンモニア水溶液でのトリフルオロアセチル
保護基の塩基切断およびジゴキシゲニン−３−Ｏ−メチ
ルカルボニル−６−アミドカプロイル−ＮＨＳ−エステ
ル（ＢＭ社、注文番号１３３３０５４）との反応を行な
った。

【００５３】１００μｌのＰＣＲ反応溶液当たり１μｌ
の精製細胞抽出物を用いて、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ
ＧｅｎｅＡｍｐＰＣＲシステム９６００で実施され
るＰＣＲ温度プロフィールは、下記のようであった。開始９４℃３分；９５℃１５秒／６８℃３０秒／７２
℃３０秒を１０サイクル；９４℃１５秒／６８℃３０秒
／７２℃３０秒＋新しいサイクル毎に２０秒を追加を２
０サイクル；７０℃５分。平衡化４℃３０分以上。

【００５４】ＰＣＲ緩衝液：１０ｍＭＴｒｉｓ／ＨＣ
ｌ、１．５ｍＭＭｇＣｌ₂、５０ｍＭＫＣｌ、ｐＨ
８．３、プライマー（正方向および逆方向それぞれ、下
記参照のこと）、ＰＣＲコアキット（ＢＭ社、カタログ
番号１５７８５５３）によるポリメラーゼおよびｄＮＴ
Ｐｓ。

【００５５】ＰＣＲプライマー（Ｒ＝逆方向；Ｆ＝正方
向）：プライマー５５Ｆ：5'-TCG CCG CGA TCA AGG AGT-3'
（配列番号：１）プライマー５５Ｒ：5'-TGC ACG TCG CGG ACC TCC A-3'
（配列番号：２）プライマー５６Ｆ：5'-DIG-TCG CCG CGA TCA AGG AGT-
3' （配列番号：３）プライマー５６Ｒ：5'-DIG-TGC ACG TCG CGG ACC TCC A
-3' （配列番号：４）

【００５６】ＭＴＢｒｐｏ−βアンプリコン（センス
鎖；１５７ｎｔ）：5'-TCG CCG CGA TCA AGG AGT TCT T
CG GCA CCA GCC AGC TGA GCC AAT TCA TGGACC AGA ACA
ACC CGC TGT CGG GGT TGA CCC ACA AGC GCC GAC TGT CG
G CGC TGGGGC CCG GCG GTC TGT CAC GTG AGC GTG CCG G
GC TGG AGG TCC GCG ACG TGC A-3'（配列番号：５）

【００５７】野生型（ＷＴ）または変異体（ＭＸ）の増
幅したプラスミド鎖を、ゲル電気泳動および臭化エチジ
ウム染色によりチェックした後に分取して、使用するま
でディープフリーザーで保存した。

【００５８】Ｂ）増幅物の変性まず、５μｌのＤＩＧ標識増幅物と５μｌの強塩基性変
性溶液（５０ｍＭＮａＯＨ、２ｍＭＥＤＴＡ）とを
不活性の反応容器（エッペンドルフ社製等）中で混合
し、室温で１０分以上インキュベートする。

【００５９】Ｃ）使い捨て容器の製造また、センスアンプリコン鎖に逆平行に相補的な捕捉プ
ローブを、５’末端をビオチニル化した１８マーとして
標準ホスホロアミダイト化学により合成した。ビオチン
基を、反応性イミダゾリル窒素がジメトキシトリチルに
より保護されているビオチノイル−６−アミドヘキシル
−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−β−シアノエチル−ホスホ
ロアミダイト（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社ＡＢＩ、
Ｎｏ．４０１３９６）により合成中に直接取り込んだ。

【００６０】ｃ＝センス鎖に相補的；Ｓ＝リファンピシ
ン処理に感受性（＝野生型を検出するプローブ）；Ｒ＝
リファンピシン処理に耐性（＝種々の変異体を検出する
プローブ） cS1-18/2-BIO 5'-BIO-T₂₀-ATT GGC TCA GCT GGC TGG-3'
（表７、８）配列番号：６ cR1a-18-BIO 5'-BIO-T₂₀-TTG GCT CGG CTG GCT GGT-3'
（表７、８）配列番号：７ cS2-18-BIO 5'-BIO-T₂₀-GTT GTT CTG GTC CAT GAA-3'
（表７、８）配列番号：８ cR2-18-BIO 5'-BIO-T₂₀-GTT GTT CTG GAG CAT GAA-3'
（表７、８）配列番号：９ cS3-18-/1-BIO 5'-BIO-T₂₀-CAA CCC CGA CAG CGG GTT-
3' （表１〜６）配列番号：１０ cS3-18/2-BIO 5'-BIO-T₂₀-TCA ACC CCG ACA GCG GGT-3'
（表７、８）配列番号：１１ cS4-18-BIO 5'-BIO-T₂₀-TCG GCG CTT GTG GGT CAA-3'
配列番号：１２ cR4a-18-BIO 5'-BIO-T₂₀-TCG GCG CTT GTA GGT CAA-3'
配列番号：１３ cR4b-18-BIO 5'-BIO-T₂₀-TCG GCG CTT GTC GGT CAA-3'
配列番号：１４ cdS4-18-BIO 5'-BIO-T₂₀-TCG GCG CTT GCG GGT CAA-3'
（表７、８）配列番号：１５ cS5-18-BIO 5'-BIO-T₂₀-CCC CAG CGC CGA CAG TCG-3'
配列番号：１６ cR5-18-BIO 5'-BIO-T₂₀-CCC CAG CGC CAA CAG TCG-3'
（表７、８）配列番号：１７ MBD 5'-BIO-T₂₅-Y(DIG)-T-3' （表７、８）配列
番号：１８ BIO ＝ビオチノイル−６−アミドヘキシルホスホロアミ
ダイトのオンライン取り込みを介したモノビオチニル化 Y ＝３−トリフルオロアセタミド−１，２−プロパンジ
オール−ホスホロアミダイトのオンライン取り込み、そ
の後の塩基による脱ブロッキング、６−アミノカプロン
酸ＮＨＳエステルでの伸長およびＤＩＧ−３−Ｏ−カル
ボキシメチル−ＮＨＳエステル（塩基に安定）との反応
による標識（前記参照のこと）。 MBD ＝コンジュゲート／検出器機能のモニター用対照オ
リゴ

【００６１】０．７ｃｍ（丸型、直径）ｘ０．１５ｃｍ
（深さ）のマイクロウエルを有するカーボンブラック顔
料で染色したポリスリチレンの使い捨て容器（ＤＥ−１
９７０７２０４．６）を、サーモＢＳＡ−ビオチン／ス
トレプトアビジン層（ＰＣＴ／ＥＰ８９／００１９５）
で活性化した使い捨て容器として準備した。捕捉プロー
ブを機能化するビオチンを、ＥＰ−Ａ−０２６８２
３７に従ってインクジェット印刷法によりこれに固定し
た。印刷ヘッドの各ノズルを、種々の特異性を有する捕
捉プローブ溶液で満たして、試験担体上に幾何学的パタ
ーンで約１００μｍの直径を有する互いに孤立する小円
状の反応ゾーンを印刷した後乾燥させ、これにより異な
る捕捉プローブのアレイを生成させた（Ｃ２ａ固相）。

【００６２】インクジェット印刷溶液：５ｍＭＭｅｓ
／５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１％（ｗ／
ｖ）スクロース、０．５ｍｇ／ｍｌＢＳＡ−Ｒｅｓ
（透析したもの）、プローブ濃度１μＭ。

【００６３】Ｄ）プローブハイブリダイゼーション４０μｌのハイブリダイゼーション（＝中和）緩衝液お
よび１０μｌの変性ＰＣＲ増幅物を連続して吸引し、Ｈ
ａｍｉｌｔｏｎＭｉｃｒｏＬａｂディスペンサーを用
いて気泡により分離した後、迅速な混合が起こりすべて
のハイブリダイゼーション事象に関して同一のＴ₀とな
るように、１工程で加圧下で使い捨て容器内に分配し
た。該混合物を、室温で（表１〜６）または３７℃で
（表７、８）、振盪しながら（E. Buhler Swip、２５０
ｒｐｍ、直線）（表１〜６）または振盪なしで（表７、
８）９０分間インキュベートした。

【００６４】ハイブリダイゼーション緩衝液：１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、４ＭＴＭＡＣ（テトラメチルア
ンモニウムクロリド）、１ｍＭＥＤＴＡ、０．１％Ｔ
ｗｅｅｎ−２０[ 表７、８：ハイブリダイゼーション３
−１２] （ｗ／ｖ）、０．０１３％オキシピリオン、
０．０１％メチルイソチアゾロン、ｐＨ６．３。

【００６５】Ｅ）洗浄工程まず、洗浄溶液１での５９（６１）℃（手動ＤＮＡ洗浄
装置での設定標的温度）、または６０℃（半自動インキ
ュベーター／シェーカー／洗浄モジュールでの実際の温
度）で２０秒ｂ／ｆ分離（それぞれ流速１４．４および
１２ｍｌ／分）；その直後の低塩洗浄緩衝液での室温で
２０秒間の再洗浄（洗浄溶液２、流速１２ｍｌ／分）。

【００６６】洗浄溶液１（ハイブリダイゼーション後の
ストリンジェントな洗浄工程用）：１０ｍＭＴｒｉｓ
／ＨＣｌ、４ＭＴＭＡＣ、１ｍＭＥＤＴＡ、０．１
％Ｔｗｅｅｎ−２０[ 表７、８：ハイブリダイゼーショ
ン３−１２] （ｗ／ｖ）、０．０１３％オキシピリオ
ン、０．０１％メチルイソチアゾロン、ｐＨ８．０。

【００６７】洗浄溶液２（ハイブリダイゼーション後の
結合／遊離分離用再洗浄、およびコンジュゲート反応後
の結合／遊離分離用再洗浄のためのもの）：１５ｍＭ
ＮａＣｌ／１．５ｍＭクエン酸三ナトリウム／０．１
％ＳＤＳ溶液、ｐＨ７．０

【００６８】Ｆ）コンジュゲート結合３０μｌのコンジュゲート懸濁物（安定に懸濁した抗Ｄ
ＩＧ機能化フルオロビーズ、０．０１％固体）を、ウエ
ル内にピペットで入れ、混合物を室温で３０分間インキ
ュベートした（表５および６では３７℃、６０分間）。
最終ＤＩＧ用インキュベーション：振盪しながら（E. B
uhler Swip、２５０ｒｐｍ、直線、表１〜６）または振
盪なしで（表７、８）、抗ＤＩＧ免疫反応を行なう。そ
の後、低塩洗浄緩衝液（洗浄溶液２）で室温で８秒間、
１２ｍｌ／分の流速で洗浄した。

【００６９】コンジュゲート懸濁物：ＭＡＢ< ＤＩＧ >
（ＩｇＧ）−１１０ｎｍＣＯＯＨラテックスフルオロ
ビーズ懸濁物（ＢＭバイオケミカルズビーズ、カタログ
番号１７４２５８２から調製したもの、米国特許第５，
５１６，６３５号明細書に従って使用）の０．１重量％
固体を、コンジュゲート凍結乾燥物のボトルを２００μ
ｌの再蒸留水で溶解して調製する。毎日使用する分は、
コンジュゲート緩衝液で１：１０希釈で０．０１％固体
に希釈して調製する。

【００７０】コンジュゲート緩衝液：５０ｍＭＴｒｉ
ｓ／ＨＣｌ、ｐＨ８．５、１５０ｍＭＮａＣｌ、０．
５％ＲＰＬＡ−ＩＶ、１０μｇ／ｍｌＭ−ＩｇＧ−１
（ポリ−Ｆａｂ、ＢＭ、バイオケミカルズフォーザ
ダイアグノスティックインダストリー、カタログ番
号１３６８３８８）、１０μｇ／ｍｌＭ−ＩｇＧ−２
ａ（ポリ−Ｆａｂ、ＢＭ、バイオケミカルズフォー
ザダイアグノスティックインダストリー、カタログ
番号１８６６７２９）、０．０５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅ
ｎ−２０、０．０９５％ＮａＮ₃。

【００７１】Ｇ）結合した蛍光物質の測定および評価ライカ社（ハイデルベルグ、ＧＦＲ）製の顕微鏡／ＣＣ
Ｄカメラ装置を用いて、検出を行なった。表１〜６に測
定結果をまとめる。表１〜６の下線部を引いた箇所は、
厳密に相補的なプローブとのハイブリダイゼーション事
象を表す。表１〜６では、手動試験手法を用いて、Ｆア
ンプリコン（＝正方向プライマーを介して標識したセン
ス鎖）およびＲアンプリコン（＝逆方向プライマーを介
して標識したアンチセンス鎖）の比較評価で最初の５Ｘ
（５プローブ）アレイで得られた結果を示す。ハイブリ
ダイゼーション後のストリンジェントな洗浄工程での洗
浄温度、インキュベーション温度およびコンジュゲート
反応の時間を変えた。表１および２５Ｘアレイ特徴：洗浄緩衝液１での洗浄；５９℃（洗浄緩衝液の２
０秒添加）コンジュゲート３０分間振盪／室温

【００７２】

【表１】

【００７３】

【表２】

【００７４】表３および４５Ｘアレイ特徴：洗浄緩衝液１での洗浄；６１℃（洗浄緩衝液の２
０秒添加）３０分間振盪／室温

【００７５】

【表３】

【００７６】

【表４】

【００７７】表５および６５Ｘアレイ特徴：洗浄緩衝液１での洗浄；６１℃（洗浄緩衝液の２
０秒添加）６０分間振盪／３７℃

【００７８】

【表５】

【００７９】

【表６】

【００８０】表７および８は、延長した１２Ｘ（１２プ
ローブ）アレイでの結果を示す。その条件は：３７℃で
９０分間のハイブリダイゼーション、室温で３０分間の
コンジュゲート反応、６０℃で２０秒間のプローブ洗浄
工程を、半自動ＤＮＡインキュベーター／シェーカー／
洗浄モジュールで行なった。このとき、主として（より
小さい最初のアレイでのように）領域４および５を考慮
すべきであったので、新たに追加した領域１および２に
関しては最適ではなかった。該領域の位置を図３に示
す。

【００８１】表７および８１２Ｘアレイ

【００８２】

【表７】

【００８３】

【表８】

【００８４】驚くべきことに、すべての場合において、
Ｒアンプリコンの使用、即ち、鎖再会合複合体を介する
間接検出は、プローブ結合Ｆアンプリコンの直接検出で
達成されたよりも有意によい識別が可能である。

【００８５】この驚くべき効果は、一本鎖分析物ＤＮＡ
またはＲＮＡが内部鎖二次構造を形成する傾向が強く、
空間的な再配向過程が検出対象の基への近寄りやすさに
影響を及ぼすときに特に当てはまる。増幅されたｒｐｏ
β−遺伝子セグメントに関しては事実である（図４：ワ
シントン大学バイオメディカルコンピューティング研究
所のズーカー（Zuker)博士による２Ｄフォールディング
案を参照のこと）。図５において、内部鎖再会合の場合
（状態Ａ）または内部鎖再会合なしの場合（状態Ｂ）、
捕捉プローブが標識鎖と直接ハイブリダイズする場合
（本発明とは異なる）を示す試みがなされている。

【００８６】配列表フリーテキスト配列番号：３および４で表されるＤＮＡは、それぞれ１
位のヌクレオチドがジゴキシゲニンとリン酸エステルで
結合している。配列番号：６〜１８で表されるＤＮＡ
は、それぞれ１位のヌクレオチドのリン酸基がアミノリ
ンカーを介してビオチンと結合している。配列番号：１
８で表されるＤＮＡにおいて、２７位のy は、アミノリ
ンカー−ホスホロアミダイトその後の３−Ｏカルボキシ
メチルジゴキシゲニンとのエステル化物の取り込みを示
す。

【００８７】

【発明の効果】本発明により、標識を取りこませながら
生成させた増幅産物の捕捉反応に基づく改良された核酸
の選択的検出方法が提供され、とくに非常に近縁な配列
を有する２つ以上の核酸同士の区別が良好となる。ま
た、本発明のキットを用いることにより、前記選択的検
出方法を容易に行なうことができる。

【００８８】 SEQUENCE LISTING <110> Roche Diagnostics GmbH <120> DNA detection by means of a strand reassociation complex <130> RD-11-005 <150> DE 198 24 900.4 <151> 1998-06-04 <160> 18

【００８９】 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 1 tcgccgcgat caaggagt 18

【００９０】 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 2 tgcacgtcgc ggacctcca 19

【００９１】 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Mycobacterium tuberculosis <220> <221> misc＿signal <222> (1) <223> Phosphate ester with digoxigenin <400> 3 tcgccgcgat caaggagt 18

【００９２】 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Mycobacterium tuberculosis <220> <221> misc＿signal <222> (1) <223> Phosphate ester with digoxigenin <400> 4 tgcacgtcgc ggacctcca 19

【００９３】 <210> 5 <211> 157 <212> DNA <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 5 tcgccgcgat caaggagttc ttcggcacca gccagctgag ccaattcatg gaccagaaca 60 acccgctgtc ggggttgacc cacaagcgcc gactgtcggc gctggggccc ggcggtctgt 120 cacgtgagcg tgccgggctg gaggtccgcg acgtgca 157

【００９４】 <210> 6 <211> 38 <212> DNA <213> Mycobacterium tuberculosis <220> <221> misc＿signal <222> (1) <223> Phosphate linked to biotin via Aminolinker <400> 6 tttttttttt tttttttttt attggctcag ctggctgg 38

【００９５】 <210> 7 <211> 38 <212> DNA <213> Mycobacterium tuberculosis <220> <221> misc＿signal <222> (1) <223> Phosphate linked to biotin via Aminolinker <400> 7 tttttttttt tttttttttt ttggctcggc tggctggt 38

【００９６】 <210> 8 <211> 38 <212> DNA <213> Mycobacterium tuberculosis <220> <221> misc＿signal <222> (1) <223> Phosphate linked to biotin via Aminolinker <400> 8 tttttttttt tttttttttt gttgttctgg tccatgaa 38

【００９７】 <210> 9 <211> 38 <212> DNA <213> Mycobacterium tuberculosis <220> <221> misc＿signal <222> (1) <223> Phosphate linked to biotin via Aminolinker <400> 9 tttttttttt tttttttttt gttgttctgg agcatgaa 38

【００９８】 <210> 10 <211> 38 <212> DNA <213> Mycobacterium tuberculosis <220> <221> misc＿signal <222> (1) <223> Phosphate linked to biotin via Aminolinker <400> 10 tttttttttt tttttttttt caaccccgac agcgggtt 38

【００９９】 <210> 11 <211> 38 <212> DNA <213> Mycobacterium tuberculosis <220> <221> misc＿signal <222> (1) <223> Phosphate linked to biotin via Aminolinker <400> 11 tttttttttt tttttttttt tcaaccccga cagcgggt 38

【０１００】 <210> 12 <211> 38 <212> DNA <213> Mycobacterium tuberculosis <220> <221> misc＿signal <222> (1) <223> Phosphate linked to biotin via Aminolinker <400> 12 tttttttttt tttttttttt tcggcgcttg tgggtcaa 38

【０１０１】 <210> 13 <211> 38 <212> DNA <213> Mycobacterium tuberculosis <220> <221> misc＿signal <222> (1) <223> Phosphate linked to biotin via Aminolinker <400> 13 tttttttttt tttttttttt tcggcgcttg taggtcaa 38

【０１０２】 <210> 14 <211> 38 <212> DNA <213> Mycobacterium tuberculosis <220> <221> misc＿signal <222> (1) <223> Phosphate linked to biotin via Aminolinker <400> 14 tttttttttt tttttttttt tcggcgcttg tcggtcaa 38

【０１０３】 <210> 15 <211> 38 <212> DNA <213> Mycobacterium tuberculosis <220> <221> misc＿signal <222> (1) <223> Phosphate linked to biotin via Aminolinker <400> 15 tttttttttt tttttttttt tcggcgcttg cgggtcaa 38

【０１０４】 <210> 16 <211> 38 <212> DNA <213> Mycobacterium tuberculosis <220> <221> misc＿signal <222> (1) <223> Phosphate linked to biotin via Aminolinker <400> 16 tttttttttt tttttttttt ccccagcgcc gacagtcg 38

【０１０５】 <210> 17 <211> 38 <212> DNA <213> Mycobacterium tuberculosis <220> <221> misc＿signal <222> (1) <223> Phosphate linked to biotin via Aminolinker <400> 17 tttttttttt tttttttttt ccccagcgcc aacagtcg 38

【０１０６】 <210> 18 <211> 27 <212> DNA <213> Mycobacterium tuberculosis <220> <221> misc＿signal <222> (1) <223> Phosphate linked to biotin via Aminolinker <220> <221> misc＿signal <222> (27) <223> Y means incorporation of Aminolinker-phosphoramidite subsequently estered with 3-O carboxymethyl digoxigenin <400> 18 tttttttttt tttttttttt tttttyt 27

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、本発明によって規定される各増幅成分
の名称を示した模式図である。略号の意味は次のとおり
である。Ｐ１正方向プライマーＰ２逆方向プライマーＴ１センス娘鎖（センス伸長産物）Ｔ２アンチセンス娘鎖（アンチセンス伸長産物）Ｍ１アンチセンス鋳型鎖（鋳型）；検出対象の核酸の
鎖Ｍ２センス鋳型鎖（鋳型）；検出対象の核酸に対向す
る鎖

【図２】図２は、鎖Ｔ１（未標識）、Ｔ２（５’−末端
標識）、および固相結合プローブＰから成る固相に結合
した複合体を示す模式図である。四角記号は、検出可能
標識を示す。

【図３】図３は、セグメントに突然変異を有する領域の
位置を示す。

【図４】図４は、ｒｐｏβ- 遺伝子セグメントの折りた
たみ状態を示す。

【図５】図５は、理想的状態Ｂ（棒状ＤＮＡ) と実際の
状態Ａ（折りたたまれた状態）を比較したものである。
実際に、末端標識の近寄りやすさが大きく損なわれてい
ることが明白である。本発明の方法によって、この障害
を低減または防止することができる。

フロントページの続き (72)発明者ヨアヒムブラントドイツ連邦共和国パイッセンベルクデー−82380 ブエルガーマイスター−ライボルト−シュトラーセ 101

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】下記工程： − １つのプライマーは検出対象の核酸の一方の鎖とハ
イブリダイズ可能であり、他方のプライマーは該一方の
鎖に相補的な鎖とハイブリダイズ可能であり、そのうち
の少なくとも１つは結合した検出可能標識を含有するプ
ライマーである２つのプライマーにより核酸またはその
一部を増幅させ、その毎に、反応混合物中にこれらのプ
ライマーの伸長産物を生成する工程、 − 前記伸長産物の一つに捕捉プローブを結合して、捕
捉プローブと少なくとも該伸長産物とを含むハイブリダ
イゼーション複合体を形成する工程、 − 反応混合物の未結合成分から該捕捉プローブに結合
した伸長産物を分離する工程、 − 該捕捉プローブに結合した検出可能標識を測定する
工程、ここで、該捕捉プローブは、標識プライマーの伸
長により生成した伸長産物ともハイブリダイズ可能な伸
長産物の鎖と結合できるように選択されたものである、
を含む核酸の選択的検出方法。
【請求項２】該２つのプライマーのうちの１つのみが
検出可能標識を含有する、すなわち、捕捉プローブとは
直接ハイブリダイズできない逆平行相補的伸長産物を産
生するプライマーである請求項１記載の方法。
【請求項３】該捕捉プローブが固相に結合している請
求項１または２記載の方法。
【請求項４】形成されて固相に結合したハイブリダイ
ゼーション複合体が、プライマー標識に結合可能な成分
を含む、シグナルを与える検出試薬またはシグナルを産
生する検出試薬により可視化されうるものである請求項
３記載の方法。
【請求項５】検出試薬がシグナル伝達成分粒子または
シグナル媒介成分粒子を含む請求項４記載の方法。
【請求項６】伸長産物が最初に一本鎖型に変換され、
次いで、捕捉プローブと接触し、捕捉プローブが伸長産
物の鎖に結合可能な条件が設定される請求項１記載の方
法。
【請求項７】捕捉プローブの伸長産物への結合のため
の反応開始が伸長産物の鎖の再会合のための反応開始と
本質的に同一であるように、捕捉プローブとの接触およ
び結合条件の設定が本質的に同時に生じる請求項１〜６
いずれか記載の方法。
【請求項８】伸長産物がアルカリ変性により一本鎖型
に変換され、結合条件の設定が中和を含む請求項１〜７
いずれか記載の方法。
【請求項９】下記工程： − １つのプライマーは１もしくは複数の核酸の一方の
鎖とハイブリダイズ可能であり、他方のプライマーは該
一方の鎖に相補的な鎖とハイブリダイズ可能であり、そ
のうちの少なくとも１つは結合した検出可能標識を含有
するプライマーである少なくとも１組の２つのプライマ
ーにより１もしくは複数の核酸またはその一部を増幅し
て、各配列に対してこれらのプライマーの伸長産物を生
成する工程、 − 配列が試料中に存在してハイブリダイゼーション複
合体を形成する場合、１つの伸長産物をそれ毎に該伸長
産物に選択的に結合可能な１つの捕捉プローブに結合す
る工程、 − 反応混合物の未結合成分から該捕捉プローブに結合
した伸長産物を分離する工程、 − 該捕捉プローブに結合した検出可能標識を測定する
工程、ここで、該捕捉プローブはそれぞれ、該捕捉プロ
ーブの配列に相補的な配列を含み、かつ、標識プライマ
ーの伸長により生成した伸長産物ともハイブリダイズ可
能な伸長産物の鎖と結合できるように選択されたもので
ある、を含む１もしくは複数の核酸における特異的配列
の試料からの選択的検出方法。
【請求項１０】該捕捉プローブが固相の空間的に離れ
た別々の領域に結合する請求項９記載の方法。
【請求項１１】各組の１つのプライマーのみが検出可
能な基で標識されたプライマーである、請求項９または
１０記載の方法。
【請求項１２】前記プライマーが多数の特異的配列か
ら伸長産物を生成するために用いられるものである、請
求項１１記載の方法。
【請求項１３】下記： − 核酸またはその一部の増幅用の結合した検出可能標
識を含む少なくとも１つのプライマー、 − 異なる配列を有する少なくとも２つの固定可能なま
たは固定された捕捉プローブ、ここで、該プライマー
は、捕捉プローブと同じ伸長産物鎖とハイブリダイズで
きるように選択されたものである、を別々の容器に含有
してなる核酸の検出用試薬キット。
【請求項１４】少なくとも１つの検出可能標識プライ
マー、および異なる配列を有する少なくとも２つの固定
されたまたは固定可能な捕捉プローブを含有してなる試
薬キットの使用方法であって、該少なくとも１つの検出
可能標識プライマーが、突然変異分析において捕捉プロ
ーブと同じ各標的核酸の鎖とハイブリダイズできるよう
に選択されたものである使用方法。