JP2000513921A - 核酸の配列特異的検出 - Google Patents

核酸の配列特異的検出

Info

Publication number
JP2000513921A
JP2000513921A JP08526599A JP52659996A JP2000513921A JP 2000513921 A JP2000513921 A JP 2000513921A JP 08526599 A JP08526599 A JP 08526599A JP 52659996 A JP52659996 A JP 52659996A JP 2000513921 A JP2000513921 A JP 2000513921A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
nucleic acid
sequence
detected
analog
binding
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
JP08526599A
Other languages
English (en)
Inventor
クライベル,イェルク
オルム,ヘンリック
レステル,アン−ウレルプ
ガイゲル,アルベルト
Original Assignee
ベーリンガー マンハイム ゲーエムベーハー
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from DE19548590A external-priority patent/DE19548590A1/de
Application filed by ベーリンガー マンハイム ゲーエムベーハー filed Critical ベーリンガー マンハイム ゲーエムベーハー
Publication of JP2000513921A publication Critical patent/JP2000513921A/ja
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813Hybridisation assays
    • C12Q1/6827Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813Hybridisation assays
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813Hybridisation assays
    • C12Q1/6834Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C12Q1/6837Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

(57)【要約】 本発明は、核酸の点変異およびポリモルフィズムの検出方法ならびにアレイ(arrays)を用いる単純な方法による未知の核酸のシーケンス方法に関する。該方法によれば、核酸類似体を配列識別剤として用いる。本発明の方法は、複雑な場合でも操作方法を容易にする。

Description

【発明の詳細な説明】 核酸の配列特異的検出 本発明の主題は、固体担体表面上の前もって決定した部位に結合した、異なる 塩基配列を有する2以上の核酸類似体を保持する固体担体である。また、本発明 は、この性質の担体を用いる核酸の検出方法も提供する。 この10年間に、試料分析は、迅速な発展を受けている。通常の化学試薬との 反応により、被検体がまず最初に検出され、後に酵素を用いて検出されたが、特 に、医学的診断において、被検体の免疫学的特性を利用する試験が最近標準とな ってきた。これは、特に、感染性疾患の分野で事実である。しかしながら、免疫 学的手法は、基本的には、抗原または抗体等の免疫学的活性化合物が役割を果た す被検体のみしか検出できない。これらの手法は、ウイルスまたは細菌により生 じる多くの感染に対して可能な適応を約束する結果となった。しかしながら、蛋 白質のパターンに変化として発現しないか不充分な含有量しか発現しない遺伝病 または前傾向は、免疫学的手法を用いて検出することは、困難または不可能であ る。したがって、最近、多くの場合で、核酸が検出対象となった。ある種の核酸 の存在により、感染病原体の存在または生物の遺伝的状態を推論することができ る。少数で存在する核酸の増幅方法が利用できるようになった近年、特に、特異 的核酸配列の存在に基づく検出手法が容易になった。大量の配列情報および完全 に異なる機能を有する2つのヌクレオチド配列が、たびたびたった1個の塩基単 位が異なるのみであるという事実により、ヌクレオチド配列の特異的検出は、核 酸配列の検出に基づく試薬および分析方法に対する相当な挑戦的姿勢をいまだと っている。また、ヌクレオチド配列は公知でないことが多いが、むしろ、核酸検 出方法それ自体で初めて検出されるものである。 臨床的に関連した点変異を検出することができるHLA遺伝子のヌクレオチド 配列の検出方法が、欧州特許EP−B−0 237 362号明細書に記載され ている。この方法において、膜に結合して識別対象の2つの核酸のうちの1つと 正確に相補的なヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドが、試料と接触さ せる。ある一定の条件が維持されている間、正確に相補的な核酸のみが、固相に 結合したオリゴヌクレオチドと結合して、検出可能である。 ポリdTによりナイロン膜の別々の前もって決定された部位に結合した多数の オリゴヌクレオチドを使用して、核酸の増幅された領域の公知の対立遺伝子変異 体のすべてを同時に検出するための方法が、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86,6 230-6234(1989)に記載されている。 ハイブリダイゼーション条件下、前もって決定した公知の配列を有するオリゴ ヌクレオチドを未知の核酸試料と接触させることにより、核酸配列を理論的に決 定できる方法が、米国特許第5,202,231号明細書に記載されている。こ のことは、核酸配列のすべての可能な置換が、固相の既知の部位で固定されてい ることを必要とする。決定対象の配列を含む核酸がハイブリダイズする部位を決 定することにより、核酸にどの配列が存在するかを理論的に決定することがきる 。 「オリゴヌクレオチド アレイ(arrays)」を用いる遺伝的ポリモルフィズムの 分析分野での先行技術は、Nucleic Acids Research 22,5456-5465(1994)および Clin.Chem.41/5,700-6(1995)に記載されている。 先行技術に伴う主要な問題は、シーケンスまたは検出対象の核酸を含む選択し た配列特異的オリゴヌクレオチドの融解温度が異なるという事実である。この状 況を改善するために、オリゴヌクレオチドの長さおよびその塩基組成を選択し、 該オリゴヌクレオチド内のミスマッチの位置およびハイブリダイゼーション複合 体の塩濃度を最適化するという複雑な方法を行わなければならない。しかしなが ら、多くの場合、互いに密接に関連した配列を同時に区別することは、実際上不 可能である。ハイブリダイゼーションの温度は、別の厳密なパラメーターである 。1〜2℃程度の少ない変化で、強度を変えたり間違いのない結果を生じること ができる。点変異の存在に基づく間違った分析結果が、診断に対して重大な係わ り合いを有する。 したがって、本発明の目的は、核酸の配列特異的検出のための択一的方法を提 供することおよびこの方法のための好適な材料を提供することにあった。 この目的は、固体担体の表面上の前もって決定された部位に結合した、異なる 塩基配列を有する2以上の核酸類似体を有する固体担体を提供することにより達 成された。本発明の別の目的は、この固体担体を用いる核酸の配列特異的検出方 法である。 本発明において「固体担体」とは、表面上で特異的領域が区別できるほど広い 表面を有するものをいう。この表面は、平らであることが好ましく、5mm2よ りも大きく、10mm2〜約100cm2であることが好ましい。担体の材料は、 液体状または気体状でなく、試料液体または核酸を表面に固定するために用いら れる反応調製物に全く溶解しないか、不完全に溶解することが好ましい。かかる 材料の例は、ガラス、プラスチック(例えば、ポリスチレン、ポリアミド、ポリ エチレン、ポリプロピレン等)、金等である。材料はそれ自体、必ずしも完全に 固体である必要はないが、むしろ、支持材料の付加により固体をなすことが可能 である。 固体担体の外見の形は、この固体担体上の核酸の存在を検出するために用いら れる方法に、基本的に依存する。例えば、チップ等の基本的に平坦な型を選ぶこ とが適当であることがわかった。 したがって、特に好適な固体担体は、例えば、1〜5mmの厚さで、1〜5c m2の表面積を有するポリスチレンチップである。大きさが4x2.5cm2であ るポリアミド膜が、本発明とともに用いるために特によく適することがわかった 。異なる塩基配列を有する2以上の核酸類似体を、この担体の表面の異なる部位 に結合させる。これらの部位または領域は、互いに重なり合わないことが好まし い。それらは、核酸類似体が結合していない表面領域により互いに離れている ことが好ましい。核酸類似体が結合する部位を、以下、「結合領域」という。結 合領域は、異なる形を有することができる。これらの形は、基本的には、固体担 体の製造方法または結合領域で核酸類似体を決定するために用いる方法により決 定される。結合領域の最小の大きさは、基本的には、事象−領域の核酸類似体へ の核酸の結合−を検出する器具により決定される。大きさが約1μmである領域 への結合を検出できる器具が、既に利用可能である。結合領域の大きさの上限値 は、費用効率および操作の斟酌により決定される。 結合領域の大きさも、基本的には、核酸類似体の表面への適用のために用いら れる方法により決定される。かかる方法は、後述する。 固体担体上の結合領域数は、固体担体の予定された使用に依存する。最も単純 な場合、ちょうど2個の結合領域が、ある種の点変異を検出するために必要であ る。この場合、結合領域は、点変異が検出される位置で塩基を有する核酸類似体 を含む。この塩基は、正常の配列の位置の塩基と相補的である。一方、他の結合 領域は、対応する位置に、変異した配列の塩基と相補的な塩基を有する核酸類似 体を含む。別の場合、表面に結合した2個の全く異なる核酸類似体を有する固体 担体を用いて、互いにわずかに関連するのみの2個の核酸または核酸配列を同時 に検出できる。 「核酸類似体」とは、塩基対形成により核酸を検出できる非天然性分子をいう 。したがって、それらは、検出対象の核酸の塩基配列と完全に相補的な特異的塩 基配列を含む。したがって、塩基配列は、2個の天然ヌクレオ塩基からなること が好ましい。しかしながら、塩基対形成の特異性が失われない限り、ヌクレオ塩 基に対する修飾も可能である。 それらの核酸類似体は、核酸と結合したときに、塩基対形成の原理によって、 核酸の塩基配列と水素結合を形成する塩基配列を有する核酸と相補的であるとみ なす。この配列は、少なくとも8塩基長が好ましく、8〜25塩基長がより好ま しい。 さらに、核酸類似体は、少なくともバックボーンという用語において、それら が構造上核酸とは異なるという事実により定義される。核酸または核酸類似体に おける「バックボーン」とは、それぞれ塩基を含む基本的には同一のユニットか らなる構造をいう。天然の核酸において、バックボーンは、糖リン酸バックボー ンである。核酸類似体においては、このバックボーンは、例えば、糖またはリン 酸基部分が非環式成分等の他の化学単位で完全にまたは部分的に置換されたもの 等、構造的に修飾される。基本的には、同一のユニットも、バックボーンで互い に置換することができる。 本発明で用いるために好適な核酸類似体の選択を容易にするために、核酸類似 体のいくつかの特性を以下に記載する。核酸類似体が同一の塩基配列を有するオ リゴヌクレオチドよりも配列相補的核酸に対して高い親和性を有することは、核 酸類似体にとって有利である。また、同じ長さの対応するオリゴヌクレオチドよ りも少ない電荷を保持するか、または反対の電荷で電荷を埋め合わせることがで きる核酸類似体が好ましい。基本的には、非荷電核酸類似体が特に好ましい。特 に好ましい核酸類似体は、その相補的核酸との親和性がハイブリダイゼーション 複合体の塩含有量に基本的に依存しないものである。 特に好適な核酸類似体は、国際公開第92/20702号パンフレットおよび 国際公開第92/20703号パンフレット(ペプチド核酸、PNA、例えば、 Nature 365,566-568(1993)およびNucl.Acids Res.21,5332-5(1993))に記載 の核酸類似体である。これらの特許出願は、核酸類似体の構造の説明に参照され る。好ましい核酸類似体は、バックボーンの窒素原子と結合した各塩基でバック ボーンにそって結合した多くの塩基を含むポリアミドバックボーンを有する化合 物である。しかしながら、核酸類似体は、欧州特許出願公開第0 672 67 7号明細書に記載のような化合物も含有してもよい。追加の核酸類似体は、Recu eil 91,1069-1080(1971)、Methods in Molecular Biology 29,355-389(1993) 、Tetrahedron 31,73-75(1975)、J.Org.Chem.52,4202-4206(1987)、Nucl .Acids Res.17,6129-6141(1989)、Unusual Properties of New Polymers(Spr inger Verlag 1983)、1-16、Specialty Polymers(Springer Verlag 1981)、1-51 、国際公開第92/20823号パンフレット、国際公開第94/06815号 パンフレット、国際公開第86/05518号パンフレットおよび国際公開第8 6/05519号パンフレットに記載されている。追加の核酸類似体は、Proc. Natl.Acad.Sci.USA 91,7864-7868(1994)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92 ,6097-6101(1995)およびJ.Am.Chem.Soc.117,6140-6141(1995)に記載され ている。記載された核酸類似体は、8〜30塩基長であるが、10〜25塩基長 が特に有利である。核酸類似体と称されたものは、直接または間接、固体担体の 表面に結合する。結合の型は、どの反応基が固体担体上に結合するために利用で きるか、および相補的核酸に結合する核酸類似体の能力を限定することなく、ど の反応基が核酸類似体との結合のために利用できるかに基本的に依存する。結合 の型も、意向が核酸類似体を同時に異なる部位へ結合させるかどうか、またはそ れらの上に構築させるかどうかに依存する。また、より強力な結合力を有する材 料の層で固体担体の表面を被覆すること、または化学反応により表面を活性化す ることがふさわしい。固体担体の表面上の反応基は、通常、−OH、NH2およ びSH群から選ばれる。核酸類似体の反応基は、−OH、−NH2、−SH、− COOH、−SO3Hおよび-PO32群から選ばれることが好ましい。 特に好ましい態様において、特に、15原子を越え、200原子未満の長さの リンカーにより表面および核酸類似体の反応基が互いに共有結合している。「リ ンカー」とは、基本的に、固体担体の表面で立体的に利用可能な、核酸類似体を 除去する機能を有する分子の一部をいう。溶解を容易にする水素原子(例えば、 アルキレンユニット中の)および多くのヘテロ原子(例えば、−O−または−N H−または−NR−)を有するリンカーが、通常選ばれる。リンカーは、1以上 のエチレンオキシユニットおよび/またはペプチド基を含むことが好ましい。特 に好ましい態様において、リンカーは、独国特許出願公開第3924705号明 細書に記載の1以上のユニットを含む。以下、Ado(8−アミノ−3,6−ジ オキサオクタン酸)と称する実施例に記載のユニットが、特に好ましい。PNA と固体担体間により長いリンカーを用いることにより、PNA表面に対する核酸 の結合依存性を、やや低減させることができる。 部位に結合した核酸類似体は、異なるが公知の配列を有する2以上の類似体の 混合物であってもよい。このことにより、多数決定のために必要な部位の数を低 減することができる。 担体の表面は、荷電されていないことが好ましく、親水性であることが好まし い。本発明は、核酸を検出する際に、基本的に荷電されていない表面の使用が有 利であることを示した。 本発明により提供される異なる部位で核酸類似体を負荷した固体担体は、種々 の方法で製造することができる。1つの態様において、異なる核酸類似体をそれ ぞれ含む適当な量の溶液を、例えば、ピペットを介して固体担体の表面の異なる 部位に適用する。液体試料は、固体担体の表面で互いに混合してはならない。こ のことは、例えば、適用部位を互いに離して位置させることにより、または種々 の部位間の液体の広がりを停止させる疎水性バリアーを用いることによりなされ る。核酸類似体または固体担体の表面のいずれかが、反応のために活性化される ことが好ましい。この活性化は、例えば、前記基の1つが反応種の創作により活 性化されていることで達成される。カルボキシル基の場合、これは、さらに活性 化させることなくヒドロキシル基で迅速にエステル結合にする活性化エステル( 例えば、N−ヒドロキシスクシンイミドエステル等)である。好適に活性化され たポリアミド膜は、例えば、共有結合の形成で核酸類似体のアミノ基と反応可能 なトリアジン基を保持する。活性化は、国際公開第95/15983号パンフレ ットのスクエア酸誘導体またはグルタルアルデヒド(英国特許第2197720 号明細書)の二官能試薬でも行なうことができる。 また、類似体の結合は、ヌクレオチド類似体の配列の一部に相補的なヌクレオ チド配列を有する担体表面を被覆することによっても認識することができる。結 合領域への異なる核酸類似体の結合は、同時にまたは連続して行なうことができ る。 結合を行なうための充分な時間が経過した後、用いたいかなる結合試薬ととも に、結合しないかまたは不十分に結合したいかなる核酸類似体も洗浄して除去す ることが有利である。このことは、未結合核酸類似体が他の領域に結合した核酸 類似体と結合できない条件下で行うことが好ましい。 基本的には、モノマーユニットにより表面の異なる部位に核酸類似体を構築す ることも可能である。国際公開第92/10092号パンフレットまたは国際公 開第90/15070号パンフレットに記載の技術を、この目的のために用いる ことができる。適当なモノマーは、例えば、国際公開第92/20702号パン フレットに記載されている。 本発明の別の主題は、本発明により提供される固体担体を用いる核酸の配列特 異的検出方法である。 検出可能な核酸は、天然または人工の核酸である。したがって、「核酸」とは 、核酸類似体をもいう。しかしながら、検出対象の核酸は、例えば、ウイルス、 細菌、多細胞生物、プラスミドまたはある種の疾患に対する前傾向もしくは傾向 または自発的遺伝子の変異等の遺伝的条件等の核酸を含む生物に特有な、特にR NAまたはDNAである。この場合、RNAおよびDNAは、基本的にはゲノム 起源またはそれから派生する起源のものである。本発明の状況においては、核酸 の重要なクラスは、核酸増幅の成果である。これらの成果を、以下、「増幅物」 または「アンプリコン」とも称する。核酸は、未精製型で、精製型でまたはプロ セッシング型で存在することができる。精製は、アフィニティ分離工程等の調製 工程で細胞成分から核酸を分離することにより、行なうこともできる。核酸は、 酵素的に伸長、具体的には増幅または転写することもできる。 核酸の配列特異的検出のために本発明により提供される担体は、検出対象の核 酸の塩基配列と相補的な塩基配列を有し、ある部位に結合した核酸類似体を保持 する。核酸の存在を特異的に示すことができるように、この塩基配列を意図的に 選択する。通常の場合、このことは、混合物ができる限り少なく同一の全配列を 有する追加の核酸を含み、好ましくは、全く該核酸を含まないことを意味する。 しかしながら、本発明により提供される担体は、核酸群を特異的に検出するため に用いることもできることを言及しなければならない。例えば、細菌のファミリ ー等のある種の分類学上の群のいかなるメンバーをもその核酸により検出するこ とは、本発明の方法の課題となり得る。この場合、核酸類似体の塩基配列を、保 存領域中にあるがこの分類学上の群のメンバーのみに存在するように、意図的に 選択することができる。 同一の塩基配列と相補的でない塩基配列を有する追加の核酸類似体を、表面の 異なる部位に結合させることが好ましい。それは、その塩基配列がより短いかも しくはより長くてもよく、または1以上の塩基により第1の核酸類似体とは異な る核酸類似体であってもよい。塩基配列の相違は、解決する課題による。該相違 は、例えば、点変異またはより小さい欠失および挿入を含んでもよい。嚢胞性線 維症等の多くの遺伝病において、核酸類似体の配列は、個々の位置(点変異)お よび多くの位置(例えば、Δ508等での欠失)の観点から異なる。 検出対象の変異は、該類似体の塩基配列の中間に近接して位置することが好ま しい。 該類似体の配列を、長さが同一(重複)であるけれどもハイブリダイゼーショ ンの位置が互いに1塩基異なるように、意図的に選択することもできる。ハイブ リダイゼーションの領域が検出対象の核酸上で互いに隣接するように、該配列を 意図的に選択することもできる。 これらの核酸の配列と相補的な配列を有する核酸類似体を選択することにより 、同一または異なった核酸において、多くの変異を検出することもできる。 2つの対立遺伝子のうちのどちらが複合体に存在するかを決定することが目的 である、特に容易な場合において、2つの核酸類似体が固体担体の表面の異なる 部位に結合し、その塩基配列は、対立遺伝子も異なる位置が正確に異なる。した がって、1つの対立遺伝子のある配列と相補的な核酸類似体を選択するが、他の 核酸類似体は、他方の対立遺伝子の配列と相補的である。核酸類似体の長さとハ イブリダイゼーションの部位は、同一である。 例えば、嚢胞性線維症等に対するすべての対立遺伝子を、通常検出する。野生 型は、2つの健常な対立遺伝子を含む。ヘテロ接合体は、1つの変異および1つ の野生型配列を含有し、ホモ接合体変異は、2つの変異核酸を含む。この場合、 変異が存在するかを決定することだけではなく、それがヘテロ接合体であるかホ モ接合体であるかを決定する意向である。本発明によれば、両対立遺伝子を同時 に定量的に検出することが可能であり、したがって、前記3つの場合を識別する ことが可能である。 多くの場合、特に腫瘍学および感染パラメーターの決定において、変異した細 胞/粒子は、通常、非変異/正常細胞のバックグランドに存在している。これら の場合、選択的検出を確実に行なうことができないか、または当該技術分野の状 況により提供される方法を全く使用できない。例えば、便の試料由来のDNAか らのras変異の分析は、約100個の正常配列の存在下で、変異配列を確実に 検出することが要求される(Science 256,102-105(1992))。感染病の分野におい て、1人の感染患者において異なるHIV集団を決定することが所望される。し かしなから、これらのHIV集団の多くの変異体の量は、すべてのHIV配列に 対して2%未満である。したがって、本発明により提供される方法は、1つの核 酸が決定対象の核酸よりもずっと大量に存在しても、互いに非常に類似した核酸 混合物を調べることを特に完全に可能ならしめる。 結合した核酸類似体の長さは、同一であることが好ましい。適当な長さは、1 0〜100塩基、好ましくは10〜50塩基であることがわかった。10〜25 塩基長である核酸類似体を用いて、特に良好な結果が得られる。 本発明により提供される方法を行なうために、核酸を含む試料を、核酸類似体 と結合した担体表面上の部位と接触させる。このことは、例えば、固体担体を試 料液内にもってくることにより、または試料液を1以上に分けて固体担体上に注 ぐことにより行なうことができる。担体と接触させる前に、試料液中の核酸を変 性(一本鎖)させることができる。しかし、本発明の主要な有利性は、例えば、 PNAを用いることにより予備的な変性工程を排除できるという事実である。P NAは、決定対象の二本鎖核酸から鎖を押し出す。唯一の重要な要求は、決定対 象の核酸の1つの配列に相補的な核酸類似体により、検出対象の核酸が該表面の 適当な部位に特異的に結合する条件下で、固体担体と接触させることである。も ちろん、これらの条件は、核酸類似体の別々の型に対して異なってよいが、試験 を行なうことにより一定の核酸類似体に対して容易に決定される。通常の場合、 これらの条件は、オリゴヌクレオチドで負荷した担体に対して公知の条件に基づ く。しかし、核酸類似体を国際公開第92/20702号パンフレットに記載の ように使用したならば、対応するオリゴヌクレオチドに対するハイブリダイゼー ション条件とはかなり異なる条件を選択することができる。しかし、対応するオ リゴヌクレオチドを用いる場合よりもずっと少量の塩を用いることが適当である ことがわかった。例えば、100mM未満の塩の存在、より好ましくは50mM 未満の塩の存在および最も好ましくは10mM未満の塩の存在が推薦される。こ れらの条件下では、同一の配列を有するオリゴヌクレオチドを用いて類似の配列 を有する核酸を十分識別することはできないであろう。 表面上の適当な部位に核酸を十分結合させることを達成するために必要な限り 、試料を該表面と接触させておく。この期間は、通常、数分間である。 次の工程で、核酸が表面に結合したかどうか、もしそうならばどの部位に結合 したかを決定する。このことを、この部位に結合した核酸類似体に相補的な塩基 配列を含む核酸の存在の指標とみなす。様々な方法を用いて結合を決定すること ができる。 表面の特異的部位での変化を直接決定できる装置が、すでに利用できる。これ らの型の装置を用いる方法にとって、核酸を含む試料を適用した後表面からそれ を除去することは、必ずしも必要でない。しかしながら、通常、表面から該液体 を除去し、洗浄溶液を用いて表面に依然として付着しているいかなる残存試薬を も除去することが好ましい。この工程は、結合決定に干渉することができる試料 成分も洗い出すという有利性を提供する。 好ましい態様において、試料を表面に接触させる前に行なう工程で決定対象の 核酸に挿入した標識により、核酸類似体と検出対象の核酸との結合を決定する。 標識は、例えば、蛍光基等の検出可能な基であってもよい。この決定は、任意に 、顕微鏡を用いて、またはこの目的のために提供される測定セルで行なうことが できる。結合が起こった部位は、ある種の配列を有する核酸の存在の指標である けれども、前もって決定した部位での標識の量を、決定対象の核酸の量の指標と して用いることができる。 特に好ましい態様において、決定対象の核酸は、欧州特許EP−B−0 20 2 362号明細書に記載のポリメラーゼ鎖反応または欧州特許出願公開第03 29 822号明細書に記載のNASBA等の核酸増幅方法の産物である。核酸 類似体と結合する核酸配列が、増幅方法により増幅されることが重要である。増 幅方法が原配列を良好に保持すればするほど、すなわち、増幅中に配列に組み込 まれるエラーが少なければ少ないほど、その増幅方法が適する。ポリメラーゼ鎖 反応が特に適することがわかった。増幅プライマーを、特に、検出対象の核酸配 列がハイブリダイゼーション部位間の領域に位置するように選択する。 増幅中に、検出反応に必要な標識を増幅物に挿入することが有利であることも わかった。例えば、このことは、標識プライマーまたは標識モノヌクレオシド三 リン酸を用いることにより行なうことができる。 起こった結合は、例えば、インターカーレート剤を用いることにより、標識を 挿入することなく直接検出することができる。これらの剤は、配列特異的様式で 結合した核酸類似体と核酸との複合体を含む塩基を含有する二本鎖化合物上で、 選択的に沈殿する特徴を有する。複合体の存在は、蛍光試薬等のインターカーレ ート剤の特殊な性質を用いて検出することができる。臭化エチジウムが特に好適 な剤である。 標識を挿入することなくハイブリッドを検出する別の方法は、例えば、欧州特 許出願公開第0 618 441号明細書に記載のように、表面プラスモン共鳴 に基づく。 結合を決定する別の可能な方法によれば、表面を、検出のために標識された抗 体溶液と接触させる。この抗体は、核酸類似体および決定対象の核酸からなる複 合体に対するものである。この性質の抗体は、例えば、国際公開第95/174 30号パンフレットに記載されている。 ハイブリッドの検出は、用いる標識の型による。例えば、スキャナー、CCD カメラまたは顕微鏡を用いて検出できる。 本発明は、多くの有利性を提供する。特に、二次構造内に位置する核酸領域の 配列の相違を検出可能にする。従来の方法に比べて決定対象の結合核酸のより大 きな絶対量を用いることができるので、本発明を用いて、検出の感度を増幅させ ることも可能である。特に、オリゴヌクレオチドを用いる方法と比べて、シグナ ル対ノイズ比を増加させることも可能である。最初の試みにおいて、1:100 0未満のシグナル対ノイズ比が得られた。 本発明は、少なくとも2つの分野で使用することができる。第1の場合、固体 担体を用いて公知の変異およびポリモルフィズムを検出する。この場合、検出対 象の変異およびポリモルフィズムの数は、表面上に要する様々な核酸類似体の数 または部位の指標である。核酸類似体の配列は、変異およびポリモルフィズム付 近の核酸の配列と特異的に対等である。該配列は、類似の配列を有する核酸類似 体による異なる塩基が、該配列の中間またはその近くに位置するような方法で選 択されることが好ましい。 本発明により提供される担体は、下記分野で用いることができる: 感染性疾患、異なる被検体/パラメーターの同時決定および例えば多剤耐性研究 等のための細菌またはウイルスにおける遺伝子の状態の研究において。 腫瘍学(癌抑制遺伝子および癌遺伝子における変異検出ならびに変異細胞およ び正常細胞間の相関の決定)。 遺伝性疾患の研究(嚢胞性線維症、鎌状赤血球性貧血等)。 組織および骨髄のタイピング(MHC複合体)(Clin.Chem.41/4,553-5(19 95)を参照)。 第2の可能な適用において、いわゆる「ハイブリダイゼーションによるシーケ ンス」法を用いて、短い核酸断片の配列を決定することができる。この方法にお いて、選択した配列の長さの順列が存在するの同数の異なる核酸類似体を固定す る。十分なレベルの感度を達成するために、Nが各核酸類似体の塩基数と等しい 4N個の部位が必要である。Nが5〜12であることが好ましい。非常に短いD NA断片をシーケンスするためには、相当するより少ない部位を必要とする。「 ハイブリダイゼーションによるシーケンス」法を用いて未知の核酸をシーケンス する方法は、国際公開第92/10588号パンフレットに記載されている。 本発明の有利な点は、ハイブリダイゼーションの特異性が、試料の条件にほと んど依存しないという事実である。このことは、表面の異なる領域への核酸の同 時結合を容易にする。 驚くべきことに、PNA等の核酸類似体が表面の配列を識別する優れた能力を 有することが示された。この識別は、類似の溶解した化合物の融解温度から予想 されるよりも良好であった。 驚くべきことに、本発明により提供される担体は、多くの連続した核酸の決定 に用いるためにも好適である。決定を行なう後に、液体と接触している担体を熱 処理に供する。核酸類似体と核酸との結合が溶解する温度を選択する。次いで、 別の決定を行なうために、担体を利用できる。本発明により提供される方法を用 いて、少なくとも100倍の範囲の濃度で、試料中に互いに近接して位置する非 常に類似の核酸の相対量を最初に決定することが可能である。例えば、シーケン ス法を用いて変異体を定量的に決定することが可能であった。しかし、この方法 を用いて利用できる識別の最大値は、1:10であった。 本発明により提供される方法を用いて、変性工程なしに固体担体の固定された 核酸類似体に二本鎖DNAを結合することも可能である。このことは、固定され たDNAを用いては不可能であることが比較研究により示された。ハイブリッド の中心には存在しないミスマッチも、高い選択度で識別することができることも 示された。 PNA分子の配列を、図1aに示す。それらを、本発明の方法を説明する例と して用いる。PNAを、国際公開第92/20702号パンフレットに記載のよ うに調製した。 図1bは、図1a由来のPNA配列と相同な、DNA/ODNハイブリダイゼ ーション実験に用いたDNA分子の配列を示す。 図1cは、5’−DIG End Labelling Kit(Boehringer Mannheim)を用いて5’−リン酸末端をジゴキシゲニンで標識し、ポリヌクレオ チドキナーゼおよび32P−γ−ATP5’を用いてリン酸化した、用いた相補的 オリゴヌクレオチド(ODN)の配列を示す。 図1dは、ハイブイッドを形成するオリゴヌクレオチド(ODN)とPNAと の可能な組み合わせを示す。同一の組み合わせを、DNAプローブ(DNA、図 1bを参照)とオリゴヌクレオチド(ODN、図1cを参照)との間のハイブリ ダイゼーションに適用する。 図2は、本発明の方法の選択性を示す実施例4由来のハイブリダイゼーション の結果を示す。条件は:200nlのスポット体積(100;10;1;0.1 μM PNA、開裂当たり1つの濃度)、45℃でのインキュベーションであっ た。 図3は、実施例6由来のハイブリダイゼーションの結果を示す。それらは、固 定したPNAプローブによりPCRアンプリコンを検出することを証明する。条 件は:200nlのスポット体積(100;10;1;0.1μM PNA、開 裂当たり1つの濃度)、45℃でのインキュベーションであった。図3の符号は 、以下を意味する: I 対照実験、ODN1a(1pMol、1nM)、列1(PNA1)、列2( PNA2)、列3(PNA3) II ss増幅物(118bp、1倍のDIG標識) 94℃で5分間の熱変性 (1mlのハイブリダイゼーション緩衝液で希釈した50μl PCR調製 物) 列1(PNA1)、列2(PNA2)、列3(PNA3) III ds増幅物(118bp、1倍のDIG標識) (1mlのハイブリダイゼーション緩衝液で直接希釈した50μl PCR 調製物) 列1(PNA1)、列2(PNA2)、列3(PNA3)。 図4は、PNAアレイにより分析混合物の定性的定量的分析の結果を示す。条 件は:200nlのスポット体積(100μM PNA、列当たり1つのPNA 、開裂当たり1つの分析混合物)であった。 図5は、ハイブリダイゼーションにおけるリンカーの長さの効果を示す。条件 は:1μlのスポット体積(100;40;20;10;5;1μM PNA、 開裂当たり1つの濃度、列1では(Ado)3−PNA、列2では(Ado)6− PNA、列3では(Ado)9−PNA)であった。図5の符号は、以下を意味 する: A.5mM リン酸ナトリウム、0.1%SDS,pH7.0でのプレハイブリ ダイゼーション/ハイブリダイゼーション B.10mM リン酸ナトリウム、0.1%SDS,pH7.0でのプレハイブ リダイゼーション/ハイブリダイゼーション C.25mM リン酸ナトリウム、0.1%SDS,pH7.0でのプレハイブ リダイゼーション/ハイブリダイゼーション。 図6a〜6cは、PNAで誘導化した膜が、再生後何回も使用できることを示 唆する。条件は:1μlのスポット体積(100;40;20;10;5;1μ M PNA、開裂当たり1つの濃度)であった。 図6の符号は、以下を意味する: 6a:1回目のハイブリダイゼーション後のシグナル強度 6b:再生手法後のシグナル強度 膜1:再生なし(対照) 膜2:0.1M水酸化ナトリウム溶液、RT、1時間、2x10分 再蒸留水 RTを用いる再生 膜3:1M水酸化ナトリウム溶液、RT、1時間、2x10分 再蒸留水 RT を用いる再生 膜4:蒸留水、70℃1時間、2x10分 再蒸留水 RTを用いる再生 膜5:0.1M水酸化ナトリウム溶液、70℃ 1時間、2x10分 再蒸留水 RTを用いる再生 6c:再ハイブリダイゼーション後のシグナル強度。 下記実施例により、本発明をさらに詳細に説明する。 実施例一般: 用いた核酸類似体は、国際公開第92/20702号パンフレットに記載のよ に製造した。他に指示しなければ、化合物および試薬は、Boehringer Mannheim GmbHの製品であった。実施例1 : ナイロン膜の共有結合誘導化 0.5M 炭酸ナトリウム pH9.0中、所望の濃度でPNAを含む200 nlの溶液を、ピペットを用いてImmunodyne ABC膜(Pall)に適用する。スポット が乾燥した後、未だに存在するかもしれない表面の機能的反応基を不活化させる ために、0.1M水酸化ナトリウム溶液を用いて膜を洗浄する。膜を水で2回洗 浄し、次いで乾燥させる。実施例2 : ルミネセンスを用いるハイブリダイゼーション事象の検出 100μM、10μM、1μM、および0.1μM PNA溶液を用いて、実 施例1に記載のように膜を誘導化する。次いで、50mlのハイブリダイゼーシ ョン容器中、10mlのハイブリダイゼーション緩衝液(10mMリン酸ナトリ ウム、pH7.2、0.1%SDS(ドデシル硫酸ナトリウム))を用いて、4 5℃のハイブリダイゼーションオーブンで、膜をプレハイブリダイズする。30 分後、DIG標識オリゴヌクレオチドを1μMの濃度で含む10μlの溶液を添 加し、もう60分間複合体をハイブリダイズさせる。次いで、1回当たり25m 1の洗浄緩衝液(5mMリン酸ナトリウム、pH7.2、0.05%SDS)を 用いて、45℃、10分間で2回、膜を洗浄する。ジゴキシゲニン検出のための プロトコール(DIG Detection Kit,Boehringer Mannheim GmbH,BRD)に従って 、検出反応を行なう。抗−DIG−APコンジュゲートを、1:10000の希 釈で用いる。アルカリホスファターゼの基質として、CDP−StarTMを1: 10000の希釈で用いる。実施例3 : 蛍光を用いるハイブリダイゼーション事象の検出 100μM、10μMおよび1μM PNA溶液を用いて、実施例1に記載の ように膜を誘導化する。50mlのスクリュー蓋の容器中、10mlのハイブリ ダイゼーション緩衝液(実施例2参照)を用いて、45℃のオーブンで膜をプレ ハイブリダイズする。30分後、蛍光標識オリゴヌクレオチドを1μMの濃度で 含む10μlの溶液を添加し、もう60分間調製物をハイブリダイズさせる。次 いで、1回当たり25mlの洗浄緩衝液(実施例2参照)を用いて、45℃、1 0分間で2回、膜を洗浄する。膜を乾燥させ、次いで、蛍光強度を測定する。実施例4 : 方法の選択性 実施例1に記載のように、100μM〜0.1μMの濃度範囲のPNA溶液を 用いて、塩基配列が1つまたは2つの位置でそれぞれ異なる3つの(Ado)6 −PNA分子(図1a、配列番号1、2、3を参照)で、3つの膜片を誘導化す る。50mlのスクリュー蓋の容器中、10mlのハイブリダイゼーション緩衝 液で30分間、該膜片をプレハイブリダイズする。次の工程で、3つのDIG標 識オリゴヌクレオチド(図1b、配列番号4、5、6)のうちの1つを添加する 。60分間ハイブリダイズした後、各回25mlの洗浄緩衝液で10分間2回、 膜を洗浄する。実施例2に記載のように、ハイブリダイゼーション事象を検出す る。 含まれるPNA分子とオリゴヌクレオチドとのすべての可能な二本鎖ハイブリ ッドを、図1dに示す。図2は、ほとんどすべての場合において、検出されるオ リゴヌクレオチドのみが、固定した核酸類似体(PNA1、PNA2、PNA3 )と正確に相補的なものであるということを示す。シグナル対ノイズ比(S/N )も、図から推定できる。それらを定量的に評価し、表1に結果を示す。 表1 実施例5: 定量 実施例1に記載のように、100μMの濃度で、異なる塩基配列を有する3つ の(Ado)6−PNA分子(図1a、配列番号1、2、3)を用いて、膜片を 誘導化する。次いで、20mlのハイブリダイゼーション容器中、10mlのハ イブリダイゼーション緩衝液(実施例2を参照)を用いて、45℃でそれらをプ レハイブリダイズする。30分後、緩衝液を交換する。実施例1〜7を通して、 添加する緩衝液は、DIG標識成分−オリゴヌクレオチド1、2および3、配列 番号4、5、6の被検体の濃度により異なる。該片を、45℃で60分間ハイブ リダイズし、次いで、10mlの洗浄緩衝液で10分間2回洗浄する。実施例2 に記載の手法を用いて、検出を行なう。ルミネセンスシグナルを、ルミネセンス イメージャーを用いて記録し、次いで、評価する(図4)。 見出されたシグナル強度を用いて、被検体複合体組成物に関して定性的または 半定量的発見を達成することができる。シグナル強度を更正した後、絶対的に定 量的な発見を達成することができる。実施例6 : PCRアンプリコンの検出 A.好適な被検体(増幅物)を得ること その配列がPNAプローブ、PNA1に相補的な二本鎖DNA断片をpUC1 9プラスミドに連結する。該プラスミドを大腸菌に形質転換し、クローニングし 、次いでシーケンスする。次のハイブリダイゼーション実験には、プラスミド配 列の一部分を増幅し、増幅反応中にDIG標識する。50μlの全体積中で増幅 を行なう。増幅複合体は、1μl プラスミド(1ng/μl)、1μl プラ イマーF1(10μM)、1μl DIGプライマーR1(10μM)、5μl 10xPCR緩衝液(100mM Tris/HCl、15mM MgCl2 、500mM KCl、pH8.3)、2μl dNTP溶液(蒸留水中、10 mM dATP、10mM dCTP、10mM dGTP、10mM dTT P、pH7.0)、0.5μl Taqポリメラーゼ(5ユニット/μl)およ び38.5μl水からなる。 プライマーF1:5’−GTA AAA CGA CGG CCA GT−3’ (配列番号12) プライマーR1:5’−DIG−AAC AGC TAT GAC CAT G A−3’(配列番号13) 各反応混合物を、96℃で3分間温める。次の工程で、3段階のPCRサイク ル(96℃、45秒、48℃、30秒、72℃、1分)を30回行なう。最終サ イクルで、72℃、5分間、伸長工程を増やす。 B.ハイブリダイゼーション反応 実施例1に記載のように、100μM〜0.1μMの濃度範囲のPNA溶液を 用いて、塩基配列が1つまたは2つの位置でそれぞれ異なる3つの(Ado)6 −PNA配列(図1a、配列番号:1、2、3を参照)で、膜を誘導化する。2 0mlのハイブリダイゼーション容器中、5mlのハイブリダイゼーション緩衝 液を用いて45℃で該膜を前処理する。30分後緩衝液を交換し、被検体溶液を 添加する。被検体溶液を作るために、1mlのハイブリダイゼーション緩衝液で 、増幅複合体を直接(dsアンプリコン)、および5分間の熱変性後(ssアン プリコン)希釈する。45℃で1時間、2時間30分および4時間ハイブリダイ ゼーション後、各回5mlの洗浄緩衝液を用いて、10分間2回、膜を洗浄する 。実施例2に記載のように、ハイブリダイゼーション事象を検出する(図3)。 図3に、9個の区画を示す。各列間の相違は、インキュベーションの時間(4 時間、2.5時間および1時間)である。各カラム間の相違は、検出対象の核酸 の型である。3つの重複する列のスポットをカラムIの3つの区画それぞれに適 用する。列間の相違は、PNAの配列であるが、各区画のカラム間の相違は、濃 度である。オリゴヌクレオチドを検出する核酸として用いた場合に対して、特異 性および定量能力をカラムIに示す。 図は、インキュベーション時間の影響を示す。たった1時間のハイブリダイゼ ーション後、ODN1aと増幅物に対する優れた配列識別性が得られることが明 らかである。図3におけるカラムIIとIIIとの相違は、前もって一本鎖にした増 幅物を、検出対象の核酸として1つの場合で用いることである。カラムIIIにおい て、前もって一本鎖にしなかった増幅物を、検出対象の核酸として用いる。二本 鎖核酸を固体担体に適用する前に変性させることは必ずしも必要でないことが、 シグナルにより明らかに示される。このことにより、作業工程数が減少(加熱工 程、一本鎖の分離、洗浄工程)し、したがって、コンタミネーションの危険が減 少する。したがって、低塩条件と組み合わせたPNAプローブは、DNAプロー ブよりも明らかな有利性を提供する。実施例7 : PNA/DNAハイブリダイゼーションの比較 実施例1に記載のように、50μMの溶液を用いて、塩基配列が1つまたは2 つの位置で異なる(図1aおよび1b参照)、それぞれ3つの(Ado)6−P NA配列(配列番号:1、2、3)およびそれぞれ3つのDNA分子(配列番号 :8、10、11)で、膜片を誘導化する。実施例1とは異なり、スポット体積 は、200nlの代わりに400nlである。20mlのハイブリダイゼーショ ン容器中、5mlの低塩緩衝液(実施例2を参照)または高塩緩衝液(6xSS C;0.9M NaCl、90mM クエン酸ナトリウム、0.1%SDS、p H7.0)のいずれかを用いて、37℃または45℃いずれかで30分間、該膜 片をプレハイブリダイズする。次の工程で、3つのDIG標識オリゴヌクレオチ ド(図1c、配列番号:4、5、6)の1つを添加する。60分間のハイブリダ イゼーション工程後、37℃または45℃で、各回5mlの洗浄緩衝液を用いて 10分間2回、該片を洗浄する。低塩実験には、実施例2由来の洗浄緩衝液を用 いる。高塩実験には、0.02%SDSを有する1xSSC緩衝液、pH7.0 を用いる。実施例2に記載のように、ハイブリダイゼーションの結果を検出する 。定量的に評価を行ない、表2に示す。 DNAおよびPNA両プローブは、一重および二重ミスマッチ配列の相補的一 本鎖標的配列を完全に識別することが可能である。PNAプローブは、ある種の 型のミスマッチに対して、特にミスマッチが配列の中間に存在しないが、むしろ 末端にシフトしている場合に、DNAプローブよりも明らかな有利性を示す。こ のことは、同一の配列を有するPNAプローブよりもDNAプローブによりずっ と強力に寛容される分散したG/Tミスマッチ(プローブ1/ODN3)の例に おいて、特に明解になる。 表2*スポット強度がバックグランドシグナルの標準偏差よりも小さいので、より正 確な値は決定できない。実施例8 : 膜およびPNAプローブ間のリンカーの長さの影響 実施例1に記載のように、100μM〜1μMの濃度範囲でPNA溶液を用い て、リンカーの長さ(Ado3、Ado6またはAdo9)により異なるPNA分 子(図1a、配列番号7、1、9を参照)で、膜片を誘導化する。実施例1とは 異なり、スポット体積は、200nlの代わりに1μlである。10mlのハイ ブリダイゼーション緩衝液(5、10または25mMリン酸ナトリウム、0.1 %SDS、pH7.0)を含むハイブリダイゼーション容器中、35℃で30分 間、該膜片をプレハイブリダイズする。次の工程で、10pMolの32P標識オ リゴヌクレオチド(図1c;ODN1b、配列番号4を参照)を添加し、50℃ で60分間、調製物をハイブリダイズする。50mlの洗浄緩衝液(5mMリン 酸ナトリウム、0.1%SDS、pH7.0)を用いて、50℃で10分間2回 、該片を洗浄する。オートラジオグラフィーを用いて、ハイブリダイゼーショ ン事象を検出する(図5)。図は、より長いリンカーがハイブリダイゼーション を大きく改良することを示す。実施例9 : PNA膜の再利用 実施例1に記載のように、100μM〜1μMの濃度範囲でPNA溶液を用い て、(Ado)6−PNA分子(図1a;PNA1b、配列番号1を参照)で、 膜を誘導化する。5つの同一の濃度の連続で、PNAを適用する。実施例8に記 載のように、スポット体積は1μlである。10mlのハイブリダイゼーション 緩衝液(10mMリン酸ナトリウム、0.1%SDS、pH7.0)を含むハイ ブリダイゼーション容器中、35℃で30分間、該膜をプレハイブリダイズする 。次の工程で、10pMolの32P標識オリゴヌクレオチド(図1c;ODN1 b、配列番号4)を添加し、50℃で60分間、調製物をハイブリダイズする。 50mlの洗浄緩衝液(5mMリン酸ナトリウム、0.1%SDS、pH7.0 )を用いて、50℃で10分間2回、該膜を洗浄する。オートラジオグラフィー を用いて、ハイブリダイゼーション事象を検出する(図6a)。オートラジオグ ラフィーを行なった後、該膜を5つの同一片に切断する。これらの膜片を、実験 休止中、それぞれ別々に取り扱う。膜1は、インキュベートせずに対照膜として 供する。膜2は、50mlの0.1M水酸化ナトリウム溶液を用いて室温で60 分間インキュベートする。膜3は、50mlの1M水酸化ナトリウム溶液を用い て同様に60分間インキュベートする。膜4は、50mlの蒸留水を用いて70 ℃で60分間インキュベートする。膜5は、50mlの0.1N水酸化ナトリウ ム溶液を用いて70℃で60分間インキュベートする。次いで、蒸留水を用いて 10分間2回、すべての膜を洗浄する。この操作が終了後、もう1度オートラジ オグラフィーを行なう(図6b)。次いで、これらの膜片を、記載したように、 2回目のハイブリダイゼーション反応に用いて、オートラジオグラフィーを用い て、ハイブリダイゼーション事象を検出する(図6c)。 図6bに示すように、異なる処理方法により非常に異なる結果を得る。70℃ で再蒸留水での処理(膜4)は、膜をほとんど完全に再生させる。予期せぬ発見 は、核酸の変性に通常用いられる条件を使用した場合、再生の成功がより不成功 になるという事実であった。室温で1M水酸化ナトリウム溶液との膜3のインキ ュベーションそれ自体が、事実上再生効果を生じない。1Mから0.1Mへ水酸 化ナトリウム溶液の濃度を下げることは、室温(膜2)および70℃(膜5)で の再生度を高める。しかし、これらの条件は、再蒸留水を用いた場合(膜4)の ように、どれも再生度を少しでも良好にするという結果を生じない。これらの条 件が膜結合PNA/DNA二本鎖の効率的な変性に対する重要なパラメーターで あることが、実施例により示される。 再生方法に関わらず、すべての膜は、シグナル対ノイズ比をかなり悪化させる ことなく、ハイブリダイゼーションに再利用できる(図6c)。再生または再ハ イブリダイズするPNA膜の能力の顕著な効果を失うことなく、6回までの再ハ イブリダイゼーションを行なうことができる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号 19548590.4 (32)優先日 平成7年12月23日(1995.12.23) (33)優先権主張国 ドイツ(DE) (81)指定国 EP(AT,BE,CH,DE, DK,ES,FI,FR,GB,GR,IE,IT,L U,MC,NL,PT,SE),AU,CA,CN,H U,JP,KR,MX,NO,NZ,RU,US (72)発明者 レステル,アン−ウレルプ デンマーク国 ナルム デーカー−2850 スカイテダル 20 (72)発明者 ガイゲル,アルベルト ドイツ連邦共和国 ペンツベルク デー− 82377 ビルケンシュトラーセ 25

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 1.固体担体表面上の異なる部位に結合した、異なる塩基配列を有する2以上の 核酸類似体を保持してなる固体担体。 2.核酸類似体が、共有結合していることを特徴とする請求項1記載の担体。 3.核酸類似体が、15原子を越え、200原子未満の長さのリンカーにより結 合していることを特徴とする請求項1または2記載の担体。 4.固体担体が、荷電していないおよび/または親水性である表面を有している ことを特徴とする前記請求項いずれか記載の担体。 5.以下の工程による核酸の配列特異的検出方法、 −核酸を含む試料を、請求項1〜4いずれか記載の担体の表面上の部位と接触さ せ、少なくとも1つの核酸類似体が、検出対象の核酸の1つの塩基配列と相補的 な塩基配列を有し、少なくとも1つの他の核酸類似体が、検出対象の核酸の1つ の塩基配列と相補的でない塩基配列を有し、検出対象の核酸が核酸類似体に結合 する条件下で該手法を行なう工程、 −検出対象の核酸の存在の指標として、前もって決定した部位で起こった結合を 決定する工程。 6.検出対象の核酸が核酸類似体と結合する条件が、100mM未満の塩の存在 下であることを特徴とする請求項5記載の方法。 7.検出対象の核酸が、核酸増幅反応の結果物であることを特徴とする請求項5 または6記載の方法。 8.核酸が、検出可能に標識されていることを特徴とする請求項5〜7いずれか 記載の方法。 9.結合が、インターカーレート剤により検出されることを特徴とする請求項5 〜7いずれか記載の方法。 10.起こった結合が、検出できるような方法で標識されている結合産物に対す る抗体を用いて検出されることを特徴とする請求項5〜7いずれか記載の方法。 11.核酸を含む試料を請求項1記載の担体と接触させ、変異核酸および/また は非変異核酸の結合が、異なる部位で決定されることを特徴とする、非変異核酸 の大過剰の存在下での核酸変異体の選択的検出方法。 12.核酸を含む試料を請求項1記載の固体担体と接触させ、結合した変異核酸 および非変異核酸を比較することにより変異核酸の量の指標を誘導することによ る、変異核酸および正常核酸の相対量の決定方法。 13.核酸の定量的決定のための請求項1記載の固体担体の使用。
JP08526599A 1995-03-04 1996-03-04 核酸の配列特異的検出 Ceased JP2000513921A (ja)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP95103122 1995-03-04
EP95118843 1995-11-30
DE95103122.8 1995-12-23
DE95118843.2 1995-12-23
DE19548590.4 1995-12-23
DE19548590A DE19548590A1 (de) 1995-12-23 1995-12-23 Sequenzspezifischer Nachweis von Nukleinsäuren
PCT/EP1996/000893 WO1996027680A1 (de) 1995-03-04 1996-03-04 Sequenzspezifischer nachweis von nukleinsäuren

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2003048630A Division JP2004000154A (ja) 1995-03-04 2003-02-26 核酸の配列特異的検出

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2000513921A true JP2000513921A (ja) 2000-10-24

Family

ID=27215779

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP08526599A Ceased JP2000513921A (ja) 1995-03-04 1996-03-04 核酸の配列特異的検出
JP2003048630A Pending JP2004000154A (ja) 1995-03-04 2003-02-26 核酸の配列特異的検出

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2003048630A Pending JP2004000154A (ja) 1995-03-04 2003-02-26 核酸の配列特異的検出

Country Status (5)

Country Link
EP (1) EP0813610A1 (ja)
JP (2) JP2000513921A (ja)
AU (1) AU5002996A (ja)
CA (1) CA2214430A1 (ja)
WO (1) WO1996027680A1 (ja)

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7375198B2 (en) 1993-10-26 2008-05-20 Affymetrix, Inc. Modified nucleic acid probes
US6156501A (en) * 1993-10-26 2000-12-05 Affymetrix, Inc. Arrays of modified nucleic acid probes and methods of use
US6458530B1 (en) 1996-04-04 2002-10-01 Affymetrix Inc. Selecting tag nucleic acids
AU4174397A (en) 1996-08-30 1998-03-19 Life Technologies, Inc. Methods for identification and isolation of specific nucleotide sequences in cdna and genomic dna
US6306588B1 (en) 1997-02-07 2001-10-23 Invitrogen Corporation Polymerases for analyzing or typing polymorphic nucleic acid fragments and uses thereof
CA2298017A1 (en) * 1997-07-22 1999-02-04 Rapigene Inc. Multiple functionalities within an array element and uses thereof
CN1264319A (zh) 1997-07-22 2000-08-23 拉普吉恩公司 用于将溶液排列到固体支持物上的装置和方法
AU5017200A (en) 1999-05-14 2000-12-05 Iris Biotechnologies, Inc. Reversible immobilization of ligands onto metal surfaces, their preparation and use in biochemical applications
AU6203700A (en) * 1999-06-30 2001-01-31 Iris Biotechnologies, Inc. Hybridization of target dna with immobilized nucleic acid analogs
EP1111069A1 (en) * 1999-12-22 2001-06-27 BioChip Technologies GmbH Modified nucleic acids and their use
US6316608B1 (en) * 2000-03-20 2001-11-13 Incyte Genomics, Inc. Combined polynucleotide sequence as discrete assay endpoints
DE10152925A1 (de) * 2001-10-26 2003-05-08 Febit Ag Asymmetrische Sonden
WO2003080857A2 (en) * 2002-03-21 2003-10-02 Boston Probes,Inc. Pna oligomers, oligomers sets, methods and kits pertaining to the detection of bacillus anthracis
JP4524392B2 (ja) * 2006-04-25 2010-08-18 国立大学法人 千葉大学 プローブポリヌクレオチド固定化担体の再生方法

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8810400D0 (en) * 1988-05-03 1988-06-08 Southern E Analysing polynucleotide sequences
GB8811608D0 (en) * 1988-05-17 1988-06-22 Animal Health Inst Detecting disease susceptibility
JP2897959B2 (ja) * 1988-05-20 1999-05-31 エフ.ホフマン―ラ ロシュ アクチェンゲゼルシャフト 固定化された配列特異的プローブ
US5641625A (en) * 1992-05-22 1997-06-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Cleaving double-stranded DNA with peptide nucleic acids
GB9211979D0 (en) * 1992-06-05 1992-07-15 Buchard Ole Uses of nucleic acid analogues

Also Published As

Publication number Publication date
WO1996027680A1 (de) 1996-09-12
JP2004000154A (ja) 2004-01-08
EP0813610A1 (de) 1997-12-29
AU5002996A (en) 1996-09-23
CA2214430A1 (en) 1996-09-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP3937136B2 (ja) 塩基多型の検出方法
JP4222635B2 (ja) 2段階ハイブリダイゼーションおよびポリヌクレオチドの捕捉
JP4216333B2 (ja) オリゴヌクレオチドの化学結合による核酸検出及び増幅
AU697642B2 (en) High throughput screening method for sequences or genetic alterations in nucleic acids
US20040106108A1 (en) Solid support assay systems and methods utilizing non-standard bases
WO1996015271A1 (en) Multiplex ligations-dependent amplification
WO1989011548A1 (en) Immobilized sequence-specific probes
WO1996003529A9 (en) High throughput screening method for sequences or genetic alterations in nucleic acids
US7125972B2 (en) Solid carriers with peptide nucleic acid probes and methods for regeneration
CA2308368C (en) Specific and sensitive nucleic acid detection method
JP2000513921A (ja) 核酸の配列特異的検出
US7919611B2 (en) Nucleotide primer set and nucleotide probe for detecting genotype of N-acetyltransferase-2 (NAT2)
EP0387452B1 (en) Method of preparing nucleotide probes using a hybridizable complementary element
US6410235B1 (en) DNA detection by means of a strand reassociation complex
JP5854838B2 (ja) 対立遺伝子増幅バイアス
WO2003089894A2 (en) Isothermal amplification in nucleic acid analysis
EP0622464A2 (en) Nucleic acid assay procedure
JP2012161319A (ja) β2アドレナリン多型の検出
JP2002017399A (ja) 塩基多型を検出する方法
JP2000513202A (ja) 核酸の塩基配列決定または遺伝的置換の大量スクリーニング法
JP2001269197A (ja) 固定化オリゴヌクレオチドプローブ
JP2005245272A (ja) アルコール脱水素酵素遺伝子多型の簡易検出方法および検出用試薬
JP4560285B2 (ja) 核酸沈澱剤を利用した核酸増幅産物のハイブリダイゼーションアッセイ
JPH0698797A (ja) 核酸検出法
AU773108B2 (en) Method of isolation primer extension products with modular oligonucleotides

Legal Events

Date Code Title Description
A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20051220

A313 Final decision of rejection without a dissenting response from the applicant

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A313

Effective date: 20060508

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20060613