EP0813610A1 - Sequenzspezifischer nachweis von nukleinsäuren - Google Patents

Sequenzspezifischer nachweis von nukleinsäuren

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EP0813610A1
EP0813610A1 EP96906732A EP96906732A EP0813610A1 EP 0813610 A1 EP0813610 A1 EP 0813610A1 EP 96906732 A EP96906732 A EP 96906732A EP 96906732 A EP96906732 A EP 96906732A EP 0813610 A1 EP0813610 A1 EP 0813610A1
Authority
EP
European Patent Office
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nucleic acid
sequence
detected
nucleic acids
information
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP96906732A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Jörg KLEIBER
Henrik ÖRUM
Ane-Ullerup Lester
Albert Geiger
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Roche Diagnostics GmbH
Original Assignee
Roche Diagnostics GmbH
Boehringer Mannheim GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from DE19548590A external-priority patent/DE19548590A1/de
Application filed by Roche Diagnostics GmbH, Boehringer Mannheim GmbH filed Critical Roche Diagnostics GmbH
Priority to EP96906732A priority Critical patent/EP0813610A1/de
Publication of EP0813610A1 publication Critical patent/EP0813610A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips

Definitions

  • the invention relates to a solid support, to the surface of which two or more nucleic acid analogs of different base sequences are bound at predetermined locations, and to methods for the detection of nucleic acids using such a support.
  • nucleic acids can then be used to infer the presence of an infectious agent or the genetic condition of an organism.
  • Detections based on the presence of special nucleotide sequences have been made easier in particular by the fact that methods for amplifying nucleic acids, which are only present in small numbers, are now available.
  • the specific detection of nucleotide sequences still poses a great challenge to reagents and methods of carrying out analyzes based on the detection from Nuklein- acid sequences are based.
  • the nucleotide sequences to be detected are not known as such, but should only be determined by the nucleic acid detection.
  • EP-B-0-237 362 describes a method for the detection of nucleotide sequences of the HLA gene, with which a clinically relevant point mutation can be found.
  • an oligonucleotide which is bound to a membrane and which has a nucleotide sequence which is exactly complementary to one of the two nucleic acids to be distinguished is brought into contact with the sample. If certain conditions are met, only the exactly complementary nucleic acid binds to the solid-phase bound oligonucleotide and can be detected.
  • US Pat. No. 5,202,231 describes a method in which the sequence of a nucleic acid can theoretically be determined by bringing oligonucleotides with a predetermined and known sequence into contact with the sample of the unknown nucleic acid under hybridization conditions. All possible permutations of the nucleotide sequence must be immobilized at known locations on a solid phase. By determining at which locations the nucleic acid hybridizes with the sequence to be determined, it can theoretically be determined which sequences are present in the nucleic acid.
  • the main problem of the prior art is that the melting temperatures of the selected sequence-specific oligonucleotides differ with the nucleic acid to be sequenced or detected. This has to be optimized by elaborate selection of the length of the oligonucleotides, their base composition and optimization of the position of the mismatches within the oligonucleotide and the salt concentration of the hybridization mixture. In many cases, it is still practically impossible to be closely related Differentiate sequences from each other simultaneously.
  • the hybridization temperature is also critical. Even variations of 1 to 2 ° C can lead to modifications in the intensity or to false negative results. Faulty analysis results are very serious, especially in the diagnosis based on the presence of point mutations.
  • the object of the present invention was therefore to provide an alternative method for the sequence-specific detection of nucleic acids and materials suitable therefor.
  • the invention is achieved by a solid support, on the surface of which two or more nucleic acid analogs of different base sequences are bound at predetermined, different locations.
  • the invention also relates to a method for the sequence-specific detection of a nucleic acid using this solid support.
  • a solid support is understood to mean an object which has a surface which is so extensive that individual areas can be distinguished on it. This surface is preferably flat and larger than 5 mm 2 , preferably between 10 mm 2 and approximately 100 cm 2 .
  • the material of the carrier is not liquid and not gaseous and preferably does not dissolve or does not completely dissolve in sample liquids or reaction mixtures which are used for the immobilization of nucleic acids on the surface. Examples of such materials include glass, plastics (e.g. polystyrene, polyamide, polyethylene, polypropylene), gold or the like. However, the material does not necessarily have to be completely solid itself, but can be made firm, for example, by attachment to support materials.
  • the external shape of the solid support depends essentially on the manner in which the presence of nucleic acids on this solid support is to be detected. It has proven useful, for example, to choose an essentially planar shape, e.g. B. a tile.
  • Particularly suitable solid supports are, for. B. polystyrene plates with a thickness of about 1 to 5 mm, an area of about 1 to 5 cm 2 . Membranes made of polyamide with a size of 4 x 2.5 cm 2 have proven to be particularly suitable.
  • Two or more nucleic acid analogs of different base sequences are bound at different points on the surface of this support. These locations or areas preferably do not overlap together. They are preferably separated from one another by surface areas to which no nucleic acid analogs are bound. The locations at which the nucleic acid analogs are bound are referred to below as binding regions.
  • the binding regions can have different shapes, which are also essentially determined by the type of preparation of the solid support or by the method by which the nucleic acid analogs are bound in the binding regions.
  • the minimum size of the binding regions is essentially determined by the device with which the event of the binding of a nucleic acid to nucleic acid analogues of a region is detected. Devices already exist that can detect binding in areas of approximately 1 ⁇ m. An upper limit on the size of the binding areas results from economic reasons and the desire to be able to handle the solid support in a sensible manner.
  • the size of the binding areas results in particular from the methods by which the nucleic acid analogs are applied to the surface. Such procedures will be described later.
  • binding areas on the solid support depends on the intended use of the solid support. In the simplest case, only two binding areas are required for the detection of a specific point mutation.
  • One binding region contains nucleic acid analogs which contain a base at the position at which the point mutation is to be detected, which base is complementary to the base in the position of the normal sequence, while the other binding region contains a nucleic acid analogue which corresponds to the base sequence the position contains a base that is complementary to the base of the mutated sequence.
  • a solid support to the surface of which two nucleic acid analogs that are completely different from one another in the sequence are bound, can simultaneously detect two nucleic acids or nucleic acid sequences that are not very closely related to one another.
  • Non-naturally occurring molecules that can recognize nucleic acids via base pairings are understood as nucleic acids analog. They therefore contain a specific base sequence that is completely complementary to a base sequence of a nucleic acid to be detected.
  • the base sequence is therefore preferably composed essentially of the naturally occurring nucleobases. If the specificity of the base pairing is not lost, modifications to the nucleobases are also permitted.
  • Complementary to a nucleic acid are in particular nucleic acid analogs which have a base sequence which, in the state bound to the nucleic acid, forms water bridges to a base sequence of the nucleic acid according to the principle of base pairing. This sequence is preferably at least 8 bases long and particularly preferably between 8 and 25 bases long.
  • nucleic acid analogs are further defined by the fact that they differ structurally from nucleic acids, at least in the backbone.
  • a basic structure in nucleic acids or in a nucleic acid analog is understood to be a structure of essentially identical units, each of which contains a base bound. In the naturally occurring nucleic acids, the basic structure is a sugar phosphate basic structure. In nucleic acid analogs, this backbone is structurally modified, for example by completely or partially replacing the sugar or phosphate portion with other chemical units, e.g. B. non-cyclic components. In the basic structure, essentially identical units can also alternate.
  • nucleic acid analogs Some properties of nucleic acid analogs are given below, which are intended to facilitate the selection of nucleic acid analogs suitable for the present invention. It is an advantageous property of nucleic acid analogs if they have a higher affinity for sequence-complementary nucleic acids than an oligonucleotide with an identical base sequence. Furthermore, nucleic acid analogs are preferred which carry fewer charges than a corresponding oligonucleotide of the same length or which are able to compensate charges with opposite charges. Essentially uncharged nucleic acid analogs are particularly preferred. Particularly preferred nucleic acid analogs are those whose affinity for complementary nucleic acids essentially does not depend on the salt content of the hybridization mixture.
  • nucleic acid analogs are the compounds described in WO 92/20702 and WO 92/20703 (peptides nucleic acid, PNA, e.g. Nature 365, 566-568 (1993) and Nucl. Acids Res. 21, 5332-5 (1993)).
  • PNA peptides nucleic acid
  • PNA peptides nucleic acid
  • PNA nucleic acid
  • Preferred nucleic acid analogs are compounds which have a polyamide backbone which contains a multiplicity of bases bonded along the backbone, each base being bound to a nitrogen atom of the backbone.
  • nucleic acid analogs are also said to fall into compounds as described in EP-A-0 672 677.
  • nucleic acid analogs are described in Recueil 91, 1069-1080 (1971), Methods in Molecular Biology 29, 355-389 (1993), Tetrahedron 31, 73-75 (1975), J. Org. Chem. 52, 4202-4206 ( 1987), Nucl. Acids Res. 17, 6129-6141 (1989), Unusual Properties of New Polymers (Springer Verlag 1983), 1-16, Specialty polymers (Springer Verlag 1981), 1-51, WO 92/20823, WO 94/06815, WO 86/05518 and WO 86/05519. Further nucleic acid analogs are described in Proc. Natl. Acad. Be. USA 91: 7864-7868 (1994), Proc. Natl.
  • the nucleic acid analogs mentioned have a length of 8 to 30 bases, a length of 10 to 25 bases is particularly advantageous.
  • the nucleic acid analogs mentioned are bound directly or indirectly to the surface of the solid support. The type of binding essentially depends on which reactive groups on the solid support are available for binding and which reactive groups on the nucleic acid analog are available for binding without inhibiting the ability of the nucleic acid analog to bind to a complementary nucleic acid, and whether the nucleic acid analogs are to be simultaneously bound to different sites or to be built up at these sites.
  • Reactive groups on the surface of a solid support are usually selected from the group -OH, -NH 2 and SH.
  • Reactive groups of nucleic acid analogs are preferably selected from the group -OH, -NH 2 , -SH, -COOH, -SO 3 H and -PO 3 H 2 .
  • the reactive groups of the surface and the nucleic acid analog are particularly preferably covalently bonded to one another, in particular by means of a linker of more than 15 atoms and less than 200 atoms in length.
  • a linker is understood to mean a part of a molecule which essentially has the function of removing the nucleic acid analogs in a sterically accessible manner on the surface of the solid support.
  • the linker is usually selected so that it contains, in addition to carbon atoms (eg in alkylene units), a plurality of hetero atoms (eg -O- or -NH- or -NR-) which facilitate solvation.
  • the linker preferably contains one or more ethyleneoxy units and / or peptide groups.
  • the linker particularly preferably contains one or more units as described in DE-A 3924705. Particular preference is given to the units described by way of example, hereinafter referred to as ado (8-amino-3,6-dioxa-octanoic acid) be designated.
  • ado (8-amino-3,6-dioxa-octanoic acid) be designated.
  • the nucleic acid analog that is bound at one site can also be a mixture of two or more analogs of different but known sequences. This can reduce the number of digits required for a multiple determination.
  • the surface of the carrier is preferably not charged and is preferably hydrophilic. It has been shown as a result of the invention that the use of essentially uncharged surfaces is advantageous for the detection of nucleic acids.
  • a solid support loaded with nucleic acid analogs at different locations in the sense of the invention can be produced in different ways.
  • suitable amounts of solutions, each containing different nucleic acid analogs are applied to the surface of the solid support at different points, e.g. B. pipetted.
  • the amounts of liquid added should not mix here. This can be achieved, for example, by the fact that the feed points are far apart or the spreading of the liquid is stopped by a hydrophobic barrier between the different points.
  • Either the nucleic acid analogs or the surface of the solid support are preferably activated for the reaction.
  • Such activation can be carried out, for example, in that one of the abovementioned groups, by generating a reactive species, in the case of a carboxyl group, for example an activated ester (for example an N-hydroxysuccinimide ester), which rapidly binds an ester to a hydroxyl group without further activation is activated.
  • Suitable activated polyamide membranes carry, for example, triazm groups which can react with amino groups of nucleic acid analogs to form a covalent bond.
  • the activation can also take place via bifunctional reagents, squaric acid derivatives according to WO 95/15983 or by means of glutaraldehyde (GB 2197720).
  • the binding of the analogs can also be achieved by coating the support surface with nucleotide sequences that are complementary to part of the sequence the nucleotide analogs.
  • the different nucleic acid analogs can be bound to the binding regions simultaneously or in succession.
  • nucleic acid analogs successively from monomer units at the different locations on the surface.
  • the technology described in WO 92/10092 or WO 90/15070 can be used for this purpose.
  • Corresponding monomers are z. B. described in WO 92/20702.
  • the invention also relates to a method for the sequence-specific detection of a nucleic acid with the aid of the solid support according to the invention.
  • Detectable nucleic acids are natural or artificial nucleic acids. Nucleic acids are accordingly also understood to mean nucleic acid analogs. In particular, however, the nucleic acid to be detected is RNA or DNA, which is suitable for a nucleic acid-containing organism, e.g. B. a virus, a bacterium, a multi-cell, a plasmid or a genetic state, e.g. B. a predisposition or predisposition to a certain disease or spontaneous mutation in a gene are characteristic. These are essentially RNA and DNA, both genomic and derived from them. An important class of nucleic acids in the sense of the invention are the results of a nucleic acid amplification.
  • the nucleic acids can either be in their raw form or in a purified or processed form.
  • a purification can be present, for example, in that the nucleic acids are separated from cell components in a prepared step, for example by an affinity separation step.
  • the nucleic acids can be enzymatically extended, specifically amplified or transcribed.
  • the carrier according to the invention has a nucleic acid analog bound to one site which has a base sequence which is complementary to a base sequence of the nucleic acid to be detected.
  • This base sequence is chosen so that it allows a statement to be made about the specific presence of the nucleic acid. As a rule, this means that as little as possible, but preferably no further nucleic acid of the same total sequence is present in the mixture.
  • it must be established that it is also possible with the aid of the carrier according to the invention to specifically detect groups of nucleic acids.
  • the base sequence of the nucleic acid analog can be chosen so that it lies in a conserved area, but this sequence only occurs in members of this taxonomic group.
  • nucleic acid analog is preferably bound at a different location on the surface, which has a base sequence that is not complementary to the same base sequence. It can be a nucleic acid analogue whose base sequence can be shorter or longer or which differs in its base sequence from the first nucleic acid analogue in one or more bases.
  • the difference in the base sequence depends on the task to be solved. The differences may include e.g. B. point mutations, minor deletions and insertions. With some inherited diseases, e.g. B. cystic fibrosis, the sequences of the nucleic acid analogs differ in individual positions (point mutations) and several positions (deletions, see at ⁇ 508).
  • the mutation to be detected is preferably positioned near the center of the base sequence of the analog.
  • sequences of the analogs can also be chosen such that their hybridization positions differ by one base each (overlapping) while the length remains the same.
  • the sequences can also be chosen so that the hybridization areas are adjacent to the nucleic acid to be detected.
  • nucleic acids analogous the sequence of which is complementary to sequences on these nucleic acids.
  • two nucleic acid analogs are bound at different locations on the surface of the solid support, the base sequence of which differ exactly in position which also differentiate the alleles.
  • a nucleic acid analogue complementary to a certain sequence of the one alley and the other nucleic acid analogue complementary to the sequence of the other alien are chosen.
  • the length and hybridization site of the nucleic acid analogs are the same.
  • cystic fibrosis for example, detection of all alleles is usually carried out.
  • the wild-type contains two healthy alleles, heterozygotes contain a mutated and a wild-type sequence and homozygous mutants contain two mutant nucleic acids. In this case, it should not only be determined whether there are mutants, but whether it is a heterozygous or homozygous case. According to the present invention, it is possible to quantitatively detect both alleles simultaneously and thus differentiate between the three cases mentioned.
  • mutated cells / particles are often present in the background of non-mutated / normal cells.
  • the selective detection is not certain or not possible with methods of the prior art.
  • the analysis of ras mutations from DNA from stool requires the reliable detection of a mutated sequence in the presence of approximately 100 normal sequences (Science 256, 102-105, (1992)).
  • some of these mutants are less than 2% of all HIV sequences. It is therefore particularly possible with the method according to the invention to investigate mixtures of nucleic acids which are very similar to one another, even if one of the nucleic acids is in a very large excess compared to the nucleic acid to be determined.
  • the lengths of the bound nucleic acid analogs are preferably the same.
  • the selection of a length of between 10 and 100, preferably 10 and 50, bases has proven to be expedient. Particularly good results can be achieved if nucleic acid analogs with a length of between 10 and 25 bases are used.
  • the nucleic acid-containing sample is brought into contact with the sites on the surface of the support which have bound the nucleic acid analogs. This can be done, for example, by introducing the solid support into the sample liquid or pouring the sample liquid onto the solid support in one or more portions.
  • the nucleic acids of the sample liquid can be in a denatured (single-stranded) state before being brought into contact with the support.
  • a great advantage of the invention is, however, that, for. B. by using PNAs, denaturation before contacting can be avoided.
  • the PNAs displace a strand of possibly double-stranded nucleic acid to be determined. It is only essential that the contacting takes place under conditions in which the nucleic acid to be detected specifically binds to the relevant location on the surface via the nucleic acid analogs which are complementary to a sequence of the nucleic acid to be detected. Although these conditions can be different for different types of nucleic acid analogs, they can be obtained in a simple manner by testing for given nucleic acid analogs. As a rule, these conditions will be based on the conditions known for carriers loaded with oligonucleotides.
  • nucleic acid analogs according to WO 92/20702 are used, however, conditions can be selected which are significantly different from the hybridization conditions of corresponding oligonucleotides.
  • the presence of less than 100 mM, particularly preferably less than 50 mM and very particularly preferably less than 10 mM salts should be emphasized. Under these conditions, sufficient differentiation between sequence-like nucleic acids could not be achieved with oligonucleotides of the same sequence.
  • the sample is kept in contact with the surface for as long as is necessary for sufficient binding of the nucleic acid to the relevant point on the surface. This period is usually in the range of a few minutes.
  • nucleic acid It is then determined whether and at what point a nucleic acid has bound to the surface. This is regarded as a sign of the presence of a nucleic acid which is an analogue of the nucleic acid bound at this point contains complementary base sequence.
  • the determination of the binding that has taken place can be done in different ways.
  • the nucleic acid to be detected can be bound to the nucleic acid analog in an advantageous manner by detecting a mark made in the nucleic acid to be detected in a step prior to contacting the surface.
  • This can be, for example, a detectable group, e.g. B. act a fluorescent residue.
  • This determination can be made optically using a microscope or in a measuring cell provided for this purpose. While the location of the binding that took place is an indication of the presence of a nucleic acid with a certain sequence, the amount of label at a predetermined location can be used as a sign of the amount of the presence of the nucleic acid to be detected.
  • the nucleic acids to be detected are particularly preferably results of a nucleic acid amplification reaction such as the polymerase chain reaction according to EP-B-0 202 362 or NASBA according to EP-A-0 329 822. It is essential for the amplification that the nucleic acid sequence, the is intended for binding to the nucleic acid analogs, is amplified by the amplification process. The more true to the sequence the amplification takes place, ie the fewer errors are built into the sequence during the amplification, the more suitable the amplification method is.
  • the polymerase chain reaction has proven to be particularly suitable.
  • the primers for the amplification are chosen such that the nucleic acid sequence to be detected lies in the area between the primer hybridization sites.
  • a direct detection of the binding that has taken place without incorporation of a label is possible, for example, by using an intercalating agent.
  • intercalating agents have the property of being selectively incorporated into double-stranded base-containing compounds, including the complex of the nucleic acid analogs and the sequence-specifically bound nucleic acid.
  • the intercalating agents e.g. B. a fluorescence
  • a particularly suitable agent is ethidium bromide.
  • the surface is coated with a solution of a detectably labeled antibody against the complex of nucleic acid analogs. and the nucleic acid to be detected.
  • a detectably labeled antibody against the complex of nucleic acid analogs. and the nucleic acid to be detected are described, for example, in WO 95/17430.
  • the detection of the hybrid depends on the type of marking. It can be, for example, a scanner, a CCD camera or a microscope.
  • the solid support is used to detect known mutations and polymorphisms.
  • the number of mutations and polymorphisms to be determined is one Measure of the required number of different nucleic acid analogs or sites on the surface.
  • the sequence of the nucleic acid analogs is specially matched to the sequence of the nucleic acids around the mutations and polymorphisms.
  • the sequences are preferably chosen so that the base, in which sequence-like nucleic acid analogs differ, lies in or near the center of the sequence.
  • Oncology detection of mutations in tumor suppressor and oncogenes and determination of the ratio of mutated to normal cells.
  • hereditary diseases cystic fibrosis, sickle cell anemia, etc.
  • a sequence of short nucleic acid fragments can be determined using the so-called sequencing by hybridization method.
  • sequencing by hybridization method for this purpose, as many different nucleic acid analogs are immobilized as there are per mutations from the selected length of the sequence.
  • 4 N sites are required if N is the number of bases in each nucleic acid analog.
  • N is preferably between 5 and 12.
  • Correspondingly fewer sites are required for the sequencing of very short DNA fragments.
  • the method for sequencing unknown nucleic acids by sequencing by hybridization is described in WO 92/10588.
  • An advantage of the present invention is that the specificity of the hybridization is largely independent of the conditions in the sample. This facilitates the simultaneous binding of nucleic acids to different areas of the surface.
  • nucleic acid analogs such as PNA
  • PNA nucleic acid analogs
  • the carriers according to the invention are even suitable for determining nucleic acids several times in succession.
  • the carrier is subjected to a heat treatment in contact with a liquid.
  • the temperature chosen is one at which the binding of the nucleic acid analog to the optionally bound nucleic acid is released.
  • the carrier is then available for a new determination.
  • FIG. 1b shows the sequences of the DNA molecules which are homologous to the PNA sequences from FIG. la and were used for the DNA / ODN hybridization experiments.
  • ODN complementary oligonucleotides
  • FIG. 2 shows the hybridization results from Example 4, which are intended to illustrate the selectivity of the method.
  • the conditions were: 200 nl spot volume (100; 10; 1; 0, 1 ⁇ M PNA, one concentration per column), incubation at 45 ° C.
  • FIG. 3 shows the hybridization results from Example 6, which demonstrates the detection of PCR amplicons by immobilized PNA probes.
  • the conditions were: 200 nl spot volume (100; 10; 1; 0.1 ⁇ M PNA, one concentration per column) incubation at 45 ° C. Also mean:
  • ODN la (lpMol, InM), line 1 (PNA1), line 2 (PNA2) line 3 (PNA3)
  • FIG. 4 shows the results of the qualitative and quantitative analysis of analyte mixtures by PNA arrays.
  • the conditions were: 200 nl spot volume (100 ⁇ M PNA, one of the PNA per line, one analyte mixture per column).
  • FIG. 5 shows the influence of linker length on hybridization.
  • the conditions were: 1 ⁇ l spot volume (100; 40; 20; 10; 5; 1 ⁇ M PNA, one concentration per column, (Ado) 3 - PNA in row 1, (Ado) ⁇ -PNA in row 2, (Ado) o-PNA in row 3).
  • 1 ⁇ l spot volume 100; 40; 20; 10; 5; 1 ⁇ M PNA, one concentration per column, (Ado) 3 - PNA in row 1, (Ado) ⁇ -PNA in row 2, (Ado) o-PNA in row 3).
  • Ado 1 ⁇ l spot volume
  • FIG. 6a-6c demonstrate the possibility of using PNA-derivatized membranes several times after regeneration.
  • the conditions were: 1 ⁇ l spot volume (100; 40; 20; 10; 5, 1 ⁇ M PNA, one concentration per column).
  • 1 ⁇ M PNA one concentration per column.
  • FIG. 6 mean:
  • Membrane 2 regeneration with 0. IM sodium hydroxide solution, RT In, 2x 10min. bidest.
  • Water RT membrane 3 regeneration with IM sodium hydroxide solution, RT lh, 2x 10min. bidest.
  • Water RT membrane 4 regeneration with dist. Water, 70 ° C lh, 2x 10min. bidest.
  • Water RT membrane 5 regeneration with 0. IM sodium hydroxide solution, 70 ° C lh, 2x 10min. bidest. Water RT
  • nucleic acid analogs used were prepared in accordance with WO 92/20702. Unless otherwise specified, chemicals and reagents were from Boehnnger Mannheim GmbH.
  • the membrane is derivatized using 100 ⁇ M, 10 ⁇ M 1 ⁇ M and 0.1 ⁇ M PNA solutions as described in Example 1. It is then prehybridized in a 50 ml hybridization vessel with 10 ml hybridization buffer (10 mM sodium phosphate pH 7.2, 0.1% SDS (sodium dodecyl sulfate)) in the hybridization oven at 45 ° C. After 30 min. 10 ⁇ l of a solution which contains DIG-labeled oligonucleotide in a concentration of 1 ⁇ M are added, and the mixture is stirred for a further 60 min. hybridizes. Then 2 x 10 min.
  • 10 ml hybridization buffer 10 mM sodium phosphate pH 7.2, 0.1% SDS (sodium dodecyl sulfate)
  • the membrane is derivatized using 100 ⁇ M, 10 ⁇ M and 1 ⁇ M PNA solution as described in example 1.
  • the membrane is prehybridized in a 50 ml screw vessel with 10 ml hybridization buffer (cf. Example 2) in the oven at 45 ° C. After 30 min. 10 ⁇ l of a solution which contains a fluorescence-labeled oligonucleotide in a concentration of 1 ⁇ M are added, and there are a further 60 min. hybridizes.
  • the membrane is then 2 x 10 min. washed with 25 ml wash buffer (see Example 2) at 45 ° C. The fluorescence intensities are measured after the membrane has dried.
  • Three membrane strips are each with three (AdoVPNA molecules that differ in their base sequence at one or two positions (see FIG. La, SEQ.ID.NOS. 1, 2, 3)) using PNA solutions in the Concentration range between 100 ⁇ M and 0.1 ⁇ M derivatized analogously to example 1.
  • the membrane strips are prehybridized in 50 ml screw-top containers with 10 ml hybridization buffer for 30 min. Then one of the three DIG-labeled oligonucleotides (FIG. 1b, SEQ.ID.NOS 4, 5, 6) After 60 minutes of hybridization, 2 ⁇ 10 minutes are washed with 25 ml of washing buffer each, and the hybridization events are demonstrated as described in Example 2.
  • Hybrid PNA / ODN
  • Hybrid S / N signal (hybrid) / signal (match)
  • Membrane strips are derivatized with three (AdoVPNA molecules, which differ in their base sequence (FIG. La, SEQ.ID.NOS. 1, 2, 3), in a concentration of 100 ⁇ M analogously to Example 1. They are then in 20 ml Hybridization tubes with 10 ml hybridization buffer (cf. Example 2) prehybridized at 45 ° C. The buffer is changed after 30 min .. In experiments 1 to 7, the added buffer differs in the analyte concentrations of the DIG-labeled components oligonucleotide 1, 2 and 3, SEQ.ID.NOS. 4, 5, 6.
  • Example 2 After 60 minutes of hybridization at 45 ° C., 2 ⁇ 10 minutes are washed with 10 ml of washing buffer and the detection of a hybridization event is carried out as in Example 2. The luminescence signal is also monitored recorded by a luminescence imager and then evaluated (FIG. 4).
  • the signal intensities found enable both a qualitative and semi-quantitative statement about the composition of the analyte mixture. Absolute quantitative statements are possible after calibration of the signal intensities.
  • a double-stranded DNA fragment is ligated into a pUC19 plasmid, the sequence of which is complementary to the PNA probe PNA1.
  • the plasmid is transformed into E. coli, cloned and then sequenced.
  • a section of the plasmid sequence is amplified and DIG- marked during the amplification reaction. The amplification is carried out in a total volume of 50 ⁇ l.
  • the amplification mixture consists of 1 ⁇ l plasmid (1 ng / ⁇ l), 1 ⁇ l primer Fl (10 ⁇ M), 1 ⁇ l DIG primer R1 (10 ⁇ M), 5 ⁇ l 10 ⁇ PCR buffer (100 mM Tris / HCl, 15 mM MgCl 2, 500 mM KC1, pH 8.3), 2 ⁇ l dNTP solution (10 mM dATP, 10 mM dCTP, 10 mM dGTP, 10 mM dTTP in distilled water pH 7.0), 0.5 ⁇ l Taq polymerase (5 unit / ⁇ l) and 38.5 ⁇ l water .
  • Primer Fl 5'-GTA AAA CGA CGG CCA GT-3 '(SEQ.ID.NO. 12)
  • Each reaction batch is 3 min. heated to 96 ° C and then 30 rounds of a 3-step PCR cycle are carried out (45 sec. 96 ° C, 30 sec. 48 ° C, 1 min. 72 ° C). In the last cycle, the elongation step is extended by 5 minutes at 72 ° C.
  • the membranes are each with three (AdoVPNA sequences, which differ in their base sequence at one or two positions (see FIG. La, SEQ.ID.NOS. 1, 2, 3), using PNA solutions in Concentration range between 100 ⁇ M and 0.1 ⁇ M derivatized analogously to Example 1.
  • the membrane is pretreated in a 20 ml hybridization vessel with 5 ml hybridization buffer at 45 ° C.
  • the buffer is changed and the analyte solution is added of the analyte solution, the amplification mixture is diluted directly (ds Amplicon) or after 5 min heat denaturation (ss Amplicon) in 1 ml hybridization buffer, after 1 h, 2 h 30 min or 4 h hybridization at 45 ° C, 2 x 10 min. washed with 5 ml of washing buffer each Hybridization events are detected as described in Example 2 (FIG. 3).
  • FIG. 3 9 fields can be seen.
  • the rows differ in the length of the incubation period (4 h, 2 l ⁇ h and 1 h).
  • the columns differ in the type of nucleic acid to be detected.
  • In each of the 3 fields of column I there are 3 rows of spots on top of each other.
  • the rows differ in the sequence of the PNAs, while the columns of each field differ in concentration. Both the specificity and the quantifiability in the case of oligonucleotides as the detecting nucleic acid are shown in column I.
  • the influence of the incubation time can be seen in the figure. It is clear that an excellent sequence discrimination for ODN la and the amplificates is achieved even with one hour's hybridization.
  • Membrane strips are each with three (Ado) 6 -PNA sequences (SEQ.ID.NOS. 1, 2, 3) and three DNA molecules (SEQ.ID.NOS. 8, 10, 11), which differ in their base sequence differentiate at one or two positions (see FIG. la and lb), derivatized using 50 ⁇ M solutions analogous to Example 1.
  • the spot volume is 400 nl instead of 200 nl.
  • the membrane strips are placed in 20 ml hybridization vessels with either 5 ml of low salt buffer (see example 2) or high salt buffer (6 x SSC: 0.9 M NaCl, 90 mM sodium citrate, 0.1% SDS, pH 7.0) at 37 ° C or alternatively 45 ° C 30 min. pre-hybridized.
  • Both the DNA and the PNA probes are able to distinguish completely complementary single-stranded target sequences from single and double mismatched sequences.
  • ODN1 PNA 45'C low salt 100.0% 1.2% 1.5% DNA 37 * C, high salt 100.0% 1.2% 6.4%
  • Membrane strips are made with PNA molecules (see FIG. La, SEQ.ID.NOS. 7, 1, 9), which differ in the length of the linker (Ado 3 , Ado 6 and Ado 9 ), using PNA - Derivatized solutions in the concentration range between 100 uM and 1 uM analogous to Example 1.
  • the spot volume is 1 ⁇ l instead of 200 nl.
  • the membrane strips are in hybridization vessels with 10 ml hybridization buffer (5, 10 or 25 mM sodium phosphate, 0.1% SDS, pH 7.0) for 30 min. Prehybridized at 35 ° C. Then 10 pmol 3 P-labeled oligonucleotide (see FIG.
  • a membrane is derivatized with (Ado) 6 -PNA molecules (see FIG. La: PNA lb, SEQ.ID.NO. 1) using PNA solutions in the concentration range between 100 ⁇ M and 1 ⁇ M analogously to Example 1.
  • the PNA is applied in five identical concentration series.
  • the spot volume is 1 ⁇ l.
  • the membrane is in a hybridization vessel with 10 ml hybridization buffer (10 mM sodium phosphate, 0.1% SDS, pH 7.0) for 30 min. Prehybridized at 35 ° C. Then 10 pmol 3 P-labeled oligonucleotide (see FIG. 1c: ODN 1b, SEQ.ID.NO. 4) are added and 60 min. hybridized at 50 ° C.
  • the membrane is 2 x 10 min. washed with 50 ml washing buffer (5 mM sodium phosphate, 0.1% SDS, pH 7.0) at 50 ° C. Hybridization events are detected by autoradiography. (FIG. 6a). After autoradiography, the membrane is cut into five identical strips. These membrane strips are treated differently in the course of the further experiment.
  • Membrane 1 is not incubated and serves as a control membrane, membrane 2 becomes 60 min. incubated at room temperature with 50 ml of 0.1 M sodium hydroxide solution, membrane 3 for the same period with 50 ml of 1 M sodium hydroxide solution, membrane 4 becomes 60 min. at 70 ° C with 50 ml dist. Incubated water and membrane 5 is 60 min.
  • FIG. 6b shows very different results are obtained through the different treatment methods.
  • Treatment with bidest water at 70 ° C (membrane 4) causes the membrane to regenerate almost completely.
  • the success of the regeneration is worse if conditions are used that i.a. are common for denaturing nucleic acids.
  • Incubation of membrane 3 with 1 M sodium hydroxide solution at room temperature thus has hardly any regeneration effect.
  • Lowering the sodium hydroxide concentration from 1 M to 0.1 M increases the degree of regeneration both at room temperature (membrane 2) and 70 ° C (membrane 5).
  • none of these conditions leads to an approximately good degree of regeneration, as is the case with bidest. Water is the case (membrane 4).
  • the example shows that these conditions are important parameters for the efficient denaturation of membrane-bound PNA / DNA double strands.

Abstract

Ein Verfahren zum Nachweis von Punktmutationen und Polymorphismen in Nukleinsäuren bzw. zur Sequenzierung unbekannter Nukleinsäuren durch ein einfaches Verfahren unter Verwendung von Arrays benutzt Nukleinsäureanaloge als Sequenz-Diskriminatoren. Dieses Verfahren erleichtert die Arbeitsweise auch in komplexen Problemfällen.

Description

SequenzspeziΩscher Nachweis von Nukleinsäuren
Gegenstand der Erfindung ist ein fester Träger, an dessen Oberfläche an vorbestimmten Stellen zwei oder mehr Nukleinsaureanaloge unterschiedlicher Basensequenz gebunden sind, und Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren unter Verwendung eines solches Trägers.
Die Analytik von Proben hat in den letzten Jahrzehnten eine schnelle Entwicklung durchge¬ macht. Während in den Anfangsjahren Analyten insbesondere durch ihre Reaktion mit kon¬ ventionellen chemischen Reagenzien und später mit Enzymen nachgewiesen wurden, haben sich Tests, die immunologische Eigenschaften des Analyten benutzen, in jüngerer Zeit be¬ sonders bei der medizinischen Diagnostik als Standard durchgesetzt. Dies gilt insbesondere auf dem Gebiet der Infektionskrankheiten. Mit immunologischen Verfahren sind jedoch im wesentlichen nur solche Analyte nachzuweisen, bei denen immunologisch aktive Verbin¬ dungen, wie Antigene oder Antikörper, eine Rolle spielen. Bei vielen Infektionen durch Viren und Bakterien haben sich daher aussichtsreiche Anwendungsmöglichkeiten ergeben. Durch immunologische Verfahren sind genetische Erkrankungen oder Prädispositionen, die sich nicht oder nicht ausreichend in einer Änderung von Proteinmustern auswirken, jedoch nur schwer oder gar nicht nachweisbar. In vielen Fällen wurden daher in jüngster Zeit Nukleinsäuren zum Gegenstand des Nachweises gemacht. Aus der Anwesenheit bestimmter Nukleinsäuren läßt sich dann auf die Anwesenheit eines infektiösen Agens oder den genetischen Zustand eines Organismus zurückschließen. Nachweise, die auf der Anwesenheit spezieller Nukleotidsequenzen beruhen, wurden insbesondere dadurch er¬ leichtert, daß mittlerweile Verfahren zur Amplif-kation von Nukleinsäuren, die nur in ge¬ ringer Anzahl vorliegen, zur Verfügung stehen. Der spezifische Nachweis von Nukleotid¬ sequenzen stellt jedoch wegen der großen Menge an Sequenzinformation und der oft nur in einer einzigen Baseneinheit unterschiedlichen Sequenz zweier in ihrer Funktion völlig unterschiedlicher Nukleotidsequenzen immer noch eine große Herausforderung an Reagenzien und Arten der Durchführung von Analysen, die auf dem Nachweis von Nuklein- säuresequenzen beruhen. Oftmals sind auch die nachzuweisenden Nukleotidsequenzen als solche nicht bekannt, sondern sollen durch den Nukleinsäurenachweis erst ermittelt werden.
In EP-B-0-237 362 ist ein Verfahren zum Nachweis von Nukleotidsequenzen des HLA- Gens beschrieben, mit dem eine klinisch relevante Punktmutation ausfindig gemacht werden kann. Bei diesem Verfahren wird ein Oligonukleotid, welches an eine Membran gebunden ist und das eine Nukleotidsequenz aufweist, die exakt komplementär zu einer der beiden zu unterscheidenden Nukleinsäuren ist, mit der Probe in Kontakt gebracht. Unter Einhaltung bestimmter Bedingungen bindet nur die exakt komplementäre Nukleinsäure an das fest- phasengebundene Oligonukleotid und kann nachgewiesen werden.
In Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86, 6230-6234 (1989) ist ein Verfahren beschrieben, bei dem eine Vielzahl von Oligonukleotiden, die über Poly-dT an vorbestimmten unterschiedlichen Stellen einer Nylonmembran gebunden sind, zum simultanen Nachweis aller bekannten allelischen Varianten eines amplifizierten Bereiches einer Nukleinsäure verwendet werden.
In US-A 5,202,231 ist ein Verfahren beschrieben, bei dem theoretisch die Sequenz einer Nukleinsäure dadurch bestimmt werden kann, daß Oligonukleotide mit einer vorbestimmten und bekannten Sequenz mit der Probe der unbekannten Nukleinsäure unter Hybridisierungs- bedingungen in Kontakt gebracht wird. Alle möglichen Permutationen der Nukleotidsequenz müssen hierzu an bekannten Orten einer Festphase immobilisiert sein. Durch Feststellen, an welchen Orten die Nukleinsäure mit zu bestimmender Sequenz hybri¬ disiert, kann theoretisch festgestellt werden, welche Sequenzen in der Nukleinsäure vorhan¬ den sind.
In Nucleic Acids Research 22, 5456-5465 (1994) und Clin. Chem. 41/5, 700-6 (1995) ist der Stand der Technik der Entwicklung auf dem Gebiet der Analyse genetischer Polymorphismen mit sogenannten Oligonukleotid-Arrays beschrieben.
Das Hauptproblem des Standes der Technik ist, daß die Schmelztemperaturen der gewähl¬ ten sequenzspezifischen Oligonukleotide mit der zu sequenzierenden oder nachzuweisenden Nukleinsäure unterschiedlich sind. Dies muß durch aufwendige Wahl der Länge der Oligo¬ nukleotide, deren Basenzusammensetzung und Optimierung der Position der Mismatche innerhalb des Oligonukleotids sowie der Salzkonzentration des Hybridisierungsgemisches optimiert werden. In vielen Fällen ist es dennoch praktisch unmöglich, nahe verwandte Sequenzen simultan voneinander zu unterscheiden. Kritisch ist auch die Hybridisierungs- temperatur. Bereits Variationen von 1 bis 2 °C können zu Modifikationen in der Intensität oder zu falsch-negativen Befunden führen. Fehlerhafte Analyseergebnisse sind gerade bei der Diagnose basierend auf der Anwesenheit von Punktmutationen sehr schwerwiegend.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es daher, ein alternatives Verfahren zum sequenz¬ spezifischen Nachweis von Nukleinsäuren und dafür geeignete Materialien zur Verfügung zu stellen.
Die Erfindung wird gelöst durch einen festen Träger, an dessen Oberfläche an vorbestimm¬ ten, unterschiedlichen Stellen zwei oder mehr Nukleinsaureanaloge unterschiedlicher Basen¬ sequenz gebunden sind. Ebenfalls Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zum sequenz¬ spezifischen Nachweis einer Nukleinsäure unter Verwendung dieses festen Trägers.
Unter einem festen Träger wird im Sinne der Erfindung ein Gegenstand verstanden, der eine so weit ausgedehnte Oberfläche hat, daß auf ihr einzelne Bereiche unterschieden werden können. Diese Oberfläche ist bevorzugt flach und größer als 5 mm2, bevorzugt zwischen 10 mm2 und ca. 100 cm2. Das Material des Trägers ist nicht flüssig und nicht gasförmig und löst sich bevorzugt nicht bzw. nicht vollständig in Probenflüssigkeiten bzw. Reaktionsge¬ mischen, die für die Immobilisierung von Nukleinsäuren an der Oberfläche verwendet wer¬ den, auf. Beispiele für solche Materialien sind beispielsweise Glas, Kunststoffe (z. B. Polystyrol, Polyamid, Polyethylen, Polypropylen), Gold o.a.. Das Material muß jedoch nicht unbedingt selbst vollständig fest sein, sondern kann beispielsweise durch Befestigung an Stützmaterialien fest gemacht werden.
Die äußere Form des festen Trägers richtet sich im wesentlichen nach der Art, mit der die Anwesenheit von Nukleinsäuren an diesem festen Träger detektiert werden soll. Es hat sich beispielsweise als zweckmäßig erwiesen, eine im wesentlichen planare Form zu wählen, z. B. ein Plättchen.
Besonders geeignete feste Träger sind daher z. B. Polystyrolplättchen einer Dicke von ca. 1 bis 5 mm, einer Fläche von ca. 1 bis 5 cm2. Als besonders geeignet haben sich Membranen aus Polyamid mit einer Größe von 4 x 2,5 cm2 erwiesen. An unterschiedlichen Stellen der Oberfläche dieses Trägers sind zwei oder mehr Nukleinsaureanaloge unterschiedlicher Basensequenz gebunden. Diese Stellen oder Bereiche überlappen bevorzugt nicht miteinander. Bevorzugt sind sie voneinander durch Oberflächenbereiche getrennt, an denen keine Nukleinsaureanaloge gebunden sind. Die Stellen, an denen die Nukleinsaureanaloge gebunden sind, werden im folgenden als Bindebereiche bezeichnet. Die Bindebereiche können unterschiedliche Formen haben, die im wesentlichen auch durch die Art der Herstellung des festen Trägers bzw. durch das Verfahren, mit dem die Nukleinsaureanaloge in den Bindebereichen gebunden sind, bestimmt werden. Die minimale Größe der Bindebereiche wird im wesentlichen bestimmt durch das Gerät, mit welchem das Ereignis der Bindung einer Nukleinsäure an Nukleinsaureanaloge eines Bereiches nachgewiesen wird. Es gibt derzeit schon Geräte, die Bindung an Bereichen von ca. 1 μm detektieren können. Eine Obergrenze der Größe der Bindebereiche ergibt sich aus Wirtschaft¬ lichkeitsgründen und dem Wunsch, den festen Träger sinnvoll handhaben zu können.
Die Größe der Bindebereiche ergibt sich insbesondere auch durch die Verfahren, mit denen die Nukleinsaureanaloge auf die Oberfläche aufgetragen werden. Solche Verfahren werden später geschildert.
Die Anzahl der Bindebereiche auf dem festen Träger hängt von der beabsichtigten Verwen¬ dung des festen Trägers ab. Für den Nachweis einer bestimmten Punktmutation sind im ein¬ fachsten Fall nur zwei Bindebereiche erforderlich. Dabei enthält ein Bindebereich Nuklein¬ saureanaloge, die an der Position, an der die Punktmutation nachgewiesen werden soll, eine Base enthalten, die komplementär zu der Base in der Position der Normalsequenz ist, während der andere Bindebereich ein Nukleinsäureanaloges enthält, das an der entsprechen¬ den Position eine Base enthält, die komplementär zu der Base der mutierten Sequenz ist. Andererseits können mit einem festen Träger, an dessen Oberfläche zwei in der Sequenz gänzlich voneinander verschiedene Nukleinsaureanaloge gebunden sind, zwei miteinander wenig verwandte Nukleinsäuren oder Nukleinsäuresequenzen simultan nachgewiesen wer¬ den.
Als Nukleins ureanaloge werden nicht-natürlich vorkommende Moleküle verstanden, die Nukleinsäuren über Basenpaarungen erkennen können. Sie enthalten daher eine spezifische Basensequenz, die zu einer Basensequenz einer nachzuweisenden Nuklein-»äure vollständig komplementär ist. Die Basensequenz setzt sich daher bevorzugt im wesentlichen aus den na¬ türlich vorkommenden Nukleobasen zusammen. Wenn die Spezifität der Basenpaarung nicht verlorengeht, sind jedoch auch Modifikationen an den Nukleobasen erlaubt. Als komplementär zu einer Nukleinsäure werden insbesondere Nukleinsaureanaloge bezeichnet, die eine Basensequenz aufweisen, die in an die Nukleinsäure gebundenem Zustand WasserstoSbrücken zu einer Basensequenz der Nukleinsäure nach dem Prinzip der Basenpaarung ausbildet . Diese Sequenz ist bevorzugt mindestens 8 Basen lang und besonders bevorzugt zwischen 8 und 25 Basen lang.
Die Nukleinsaureanaloge sind weiter dadurch definiert, daß sie sich von Nukleinsäuren strukturell zumindest im Grundgerüst (Backbone) unterscheiden. Als Grundgerüst in Nukleinsäuren oder in einem Nukleinsäureanalogen wird eine Struktur von im wesentlichen identischen Einheiten verstanden, von denen jede eine Base gebunden enthält. In den natürlich vorkommenden Nukleinsäuren ist das Grundgerüst ein Zuckerphosphat-Grundge¬ rüst. In Nukleinsäureanalogen ist dieses Grundgerüst strukturell modifiziert, beispielsweise durch vollständigen oder teilweisen Ersatz des Zucker- oder Phosphatanteils durch andere chemische Einheiten, z. B. nicht-zyklischer Bauteile. Im Grundgerüst können sich im wesentlichen identische Einheiten auch abwechseln.
Im Folgenden werden einige Eigenschaften von Nukleinsäureanalogen angegeben, die die Auswahl von für die vorliegende Erfindung geeigneten Nukleinsäureanalogen erleichtern soll. Eine vorteilhafte Eigenschaft von Nukleinsäureanalogen ist es, wenn sie eine höhere Affinität zu sequenzkomplementären Nukleinsäuren haben als ein Oligonukleotid mit identischer Basensequenz. Ferner sind solche Nukleinsaureanaloge bevorzugt, die weniger Ladungen als ein korrespondierendes, gleich langes Oligonukleotid tragen bzw. Ladungen durch entgegengesetzte Ladungen zu kompensieren vermögen. Besonders bevorzugt sind im wesentlichen ungeladene Nukleinsaureanaloge. Besonders bevorzugte Nukleinsaure¬ analoge sind solche, deren Affinität zu komplementären Nukleinsäuren im wesentlichen nicht vom Salzgehalt der Hybridisierungsmischung abhängt.
Besonders geeignete Nukleinsaureanaloge sind die in WO 92/20702 und WO 92/20703 be¬ schriebenen Verbindungen (Peptide Nucleic Acid, PNA, z. B. Nature 365, 566-568 (1993) und Nucl. Acids Res. 21, 5332-5 (1993)). Für die Beschreibung der Struktur der Nukleinsaureanaloge wird hiermit auf die genannten Patentanmeldungen verwiesen. Bevorzugte Nukleinsaureanaloge sind Verbindungen, die ein Polyamid-Grundgerüst aufweisen, das eine Vielzahl von Basen entlang dem Grundgerüst gebunden enthält, wobei jede Base an ein Stickstoffatom des Grundgerüstes gebunden ist. Unter Nukleinsäureanalogen sollen jedoch auch Verbindungen fallen, wie sie in der EP-A-0 672 677 beschrieben sind. Weitere Nukleinsaureanaloge sind beschrieben in Recueil 91, 1069-1080 (1971), Methods in Molecular Biology 29, 355-389 (1993), Tetrahedron 31, 73-75 (1975), J. Org. Chem. 52, 4202-4206 (1987), Nucl. Acids Res. 17, 6129-6141 (1989), Unusual Properties of New Polymers (Springer Verlag 1983), 1-16, Specialtiy polymers (Springer Verlag 1981), 1-51, WO 92/20823, WO 94/06815, WO 86/05518 und WO 86/05519. Weitere Nukleinsaureanaloge sind beschrieben in Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91, 7864-7868 (1994), Proc. Natl. Acad. Sei. USA 92, 6097-6101 (1995) und J. Am. Chem. Soc. 117, 6140-6141 (1995). Die genannten Nukleinsaureanaloge haben eine Länge von 8 bis 30 Basen, besonders vorteilhaft ist eine Länge von 10 bis 25 Basen. Die genannten Nukleinsaureanaloge sind direkt oder indirekt an die Oberfläche des festen Trägers gebunden. Die Art der Bindung hängt im wesentlichen davon ab, welche reaktiven Gruppen auf dem festen Träger zur Bindung zur Verfügung stehen und welche reaktiven Gruppen an dem Nukleinsäureanalogen für eine Bindung zur Verfügung stehen, ohne die Bindefähigkeit des Nukleinsäureanalogen an eine komplementäre Nukleinsäure zu unterbinden, und ob die Nukleinsäureanalogen simultan an unterschiedliche Stellen gebunden oder an diesen aufgebaut werden sollen. Darüber hinaus kann es zweckmäßig sein, die Oberfläche des festen Trägers mit einer Schicht eines besser bindefähigen Materials zu überziehen oder die Oberfläche durch eine chemische Reaktion zu aktivieren. Reaktive Gruppen an der Oberfläche eines festen Trägers sind üblicherweise ausgewählt aus der Gruppe -OH, -NH2 und SH. Reaktive Gruppen von Nukleinsäureanalogen sind bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe -OH, -NH2, -SH, -COOH, -SO3H und -PO3H2.
Besonders bevorzugt sind die reaktiven Gruppen der Oberfläche und des Nukleinsäure¬ analogen kovalent miteinander verbunden, insbesondere durch einen Linker von mehr als 15 Atomen und weniger als 200 Atomen Länge. Unter einem Linker wird ein Molekülteil verstanden, der im wesentlichen die Funktion hat, die Nukleinsäureanalogen sterisch zu¬ gänglich an der Oberfläche des festen Trägers zu entfernen. Üblicherweise wird der Linker so gewählt, daß er neben Kohlenstoffatomen (z. B. in Alkyleneinheiten) mehrere Hetero- atome (z. B. -O- oder -NH- oder -NR-) enthält, die die Solvatisierung erleichtern. Bevor¬ zugt enthält der Linker eine oder mehrere Ethylenoxy-Einheiten oder/und Peptidgruppen. Besonders bevorzugt enthält der Linker eine oder mehrere Einheiten, wie sie in der DE-A 3924705 beschrieben sind. Besonders bevorzugt sind die dort beispielhaft beschriebe¬ nen Einheiten, die im Folgenden mit der Bezeichnung Ado (8-Amino-3,6-dioxa-octansäure) bezeichnet werden. Eine geringe Abhängigkeit der Bindung von Nukleinsäuren an die PNA- Oberfläche kann durch längere Linker zwischen PNA und dem festen Träger reduziert werden.
Bei dem Nukleinsäureanalogen, das an einer Stelle gebunden ist, kann es sich auch um ein Gemisch von zwei oder mehr Analogen unterschiedlicher, aber bekannter Sequenzen handeln. Damit kann die Anzahl von erforderlichen Stellen für eine multiple Bestimmung reduziert werden.
Die Oberfläche des Trägers ist bevorzugt nicht geladen und bevorzugt hydrophil. Es hat sich nämlich als Ergebnis der Erfindung herausgestellt, daß die Verwendung im wesent¬ lichen ungeladener Oberflächen für den Nachweis von Nukleinsäuren vorteilhaft ist.
Ein mit Nukleinsäureanalogen an unterschiedlichen Stellen beladener fester Träger im Sinne der Erfindung kann auf unterschiedliche Weise hergestellt werden. In einer ersten Ausfuh¬ rungsform werden geeignete Mengen von Lösungen, die jeweils unterschiedliche Nuklein¬ saureanaloge enthalten, auf die Oberfläche des festen Trägers an unterschiedlichen Stellen aufgegeben, z. B. aufpipettiert. Die aufgegebenen Flüssigkeitsmengen sollen sich hierbei nicht vermischen. Dies kann beispielsweise dadurch erreicht werden, daß die Aufgabestellen weit voneinander entfernt liegen oder die Ausbreitung der Flüssigkeit durch eine hydro¬ phobe Sperre zwischen den unterschiedlichen Stellen gestoppt wird. Bevorzugt sind ent¬ weder die Nukleinsäureanalogen oder die Oberfläche des festen Trägers für die Reaktion aktiviert. Eine solche Aktivierung kann beispielsweise dadurch vorgenommen werden, daß eine der oben genannten Gruppen durch Erzeugung einer reaktiven Spezies, im Falle einer Carboxylgruppe beispielsweise eines aktivierten Esters (z. B. eines N- Hydroxysuccinimidesters), der mit einer Hydroxylgruppe ohne weitere Aktivierung schnell eine Esterbindung eingeht, aktiviert wird. Geeignet aktivierte Polyamidmembranen tragen beispielsweise Triazm-Gruppen, die mit Aminogruppen von Nukleinsäureanalogen unter Bildung einer kovalenten Bindung reagieren können. Die Aktivierung kann auch über bi- funktionelle Reagenzien, Quadratsäurederivate nach WO 95/15983 oder mittels Glutaraldehyd (GB 2197720) geschehen.
Die Bindung der Analogen kann jedoch auch realisiert werden, indem die Trägeroberfläche mit Nukleotidsequenzen beschichtet wird, die komplementär sind zu einem Teil der Sequenz der Nukleotidanalogen. Die Bindung der unterschiedlichen Nukleinsäureanalogen kann an den Bindebereichen simultan oder auch aufeinanderfolgend vorgenommen werden.
Nach für die Bindung ausreichender Zeit hat es sich als vorteilhaft erwiesen, eventuell nicht oder nur ungenügend gebundene Nukleinsaureanaloge sowie eventuell verwendete Binde¬ reagenzien durch Abwaschen zu entfernen. Dies geschieht bevorzugt unter Bedingungen, bei denen nicht-gebundene Nukleinsaureanaloge nicht mit an anderen Bereichen gebundenen Nukleinsäureanalogen Bindungen eingehen können.
Prinzipiell ist es jedoch auch möglich, die Nukleinsaureanaloge an den unterschiedlichen Stellen der Oberfläche nacheinander aus Monomereinheiten aufzubauen. Hierzu kann die in WO 92/10092 oder WO 90/15070 beschriebene Technologie eingesetzt werden. Entspre¬ chende Monomeren sind z. B. in WO 92/20702 beschrieben.
Ebenfalls Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zum sequenzspezifischen Nachweis einer Nukleinsäure mit Hilfe des erfindungsgemäßen festen Trägers.
Nachweisbare Nukleinsäuren sind natürliche oder künstliche Nukleinsäuren. Unter Nuklein¬ säuren werden demnach auch Nukleinsaureanaloge verstanden. Insbesondere handelt es sich bei der nachzuweisenden Nukleinsäure jedoch um RNS oder DNS, die für einen nuklein- säurehaltigen Organismus, z. B. ein Virus, ein Bakterium, einen Mehrzeller, ein Plasmid oder einen genetischen Zustand, z. B. eine Prädisposition oder Veranlagung für eine be¬ stimmte Krankheit oder Spontanmutation in einem Gen charakteristisch sind. Hierbei han¬ delt es sich im wesentlichen um RNS und DNS, sowohl genomischen als auch davon abge¬ leiteten Ursprungs. Eine wichtige Klasse von Nukleinsäuren im Sinne der Erfindung sind die Resultate einer Nukleinsäure- Amplifikation. Diese werden im folgenden auch als Ampli- fikate oder Amplikons bezeichnet. Die Nukleinsäuren können entweder in ihrer Rohform oder in aufgereinigter oder bearbeiteter Form vorliegen. Eine Aufreinigung kann bei¬ spielsweise dadurch vorliegen, daß die Nukleinsäuren in einem vorbereiteten Schritt von Zellbestandteilen abgetrennt werden, beispielsweise durch einen Affinitätstrennschritt. Außerdem können die Nukleinsäuren enzymatisch verlängert, spezifisch a plifiziert oder transkribiert sein.
Der erfindungsgemäße Träger hat zum sequenzspezifischen Nachweis der Nukleinsäure an einer Stelle ein Nukleinsäureanaloges gebunden, welches eine Basensequenz aufweist, die komplementär zu einer Basensequenz der nachzuweisenden Nukleinsäure ist. Diese Basen¬ sequenz wird so gewählt, daß sie eine Aussage über das spezifische Vorliegen der Nuklein¬ säure zuläßt. Dies bedeutet im Regelfall, daß möglichst wenig, bevorzugt jedoch keine weitere Nukleinsäure der gleichen Totalsequenz in der Mischung vorliegen. Es muß jedoch festgestellt werden, daß es mit Hilfe des erfindungsgemäßen Trägers auch möglich ist, Gruppen von Nukleinsäuren spezifisch nachzuweisen. Beispielsweise kann es Aufgabe des Verfahrens sein, irgend welche Mitglieder einer bestimmten taxonomischen Gruppe, z. B. einer Bakterienfamilie, über ihre Nukleinsäuren nachzuweisen. In diesem Fall kann die Basensequenz des Nukleinsäureanalogen so gewählt werden, daß sie in einem konservierten Bereich liegt, diese Sequenz jedoch nur in Mitgliedern dieser taxonomischen Gruppe vorkommt.
An einer hiervon unterschiedlichen Stelle auf der Oberfläche ist bevorzugt ein weiteres Nu- kleinsäureanaloges gebunden, das eine Basensequenz aufweist, die nicht zu der selben Ba¬ sensequenz komplementär ist. Es kann sich um ein Nukleinsäureanaloges handeln, dessen Basensequenz kürzer oder länger sein kann oder welches sich in seiner Basensequenz von dem ersten Nukleinsäureanalogen in einer oder mehreren Basen unterscheidet. Worin der Unterschied in der Basensequenz besteht, hängt von der zu lösenden Aufgabe ab. Bei den Unterschieden kann es sich z. B. um Punktmutationen, kleinere Deletionen und Insertionen handeln. Bei manchen Erbkrankheiten, z. B. Cystischer Fibröse, unterscheiden sich die Sequenzen der Nukleinsäureanalogen in einzelnen Positionen (Punktmutationen) und mehreren Positionen (Deletionen, siehe bei Δ 508).
Die nachzuweisende Mutation ist bevorzugt nahe der Mitte der Basensequenz des Analogen positioniert.
Die Sequenzen der Analogen können auch so gewählt werden, daß sich bei gleichbleibender Länge ihre Hybridisierungspositionen um jeweils eine Base unterscheiden (überlappend). Die Sequenzen können auch so gewählt sein, daß die Bereiche der Hybridisierung benach¬ bart auf der nachzuweisenden Nukleinsäure liegen.
Es können auch mehrere Mutationen in derselben oder verschiedenen Nukleinsäuren nach¬ gewiesen werden, indem Nukleins ureanaloge gewählt werden, deren Sequenz komplemen¬ tär ist zu Sequenzen auf diesen Nukleinsäuren. In einem besonders einfach gelagerten Fall, bei dem festgestellt werden soll, welches von zwei Allelen in einer Mischung vorhanden ist, werden an unterschiedlichen Stellen der Oberfläche des festen Trägers zwei Nukleinsaureanaloge gebunden, die sich in ihrer Basen¬ sequenz genau in der Position unterscheiden, in der sich auch die Allele unterscheiden. So¬ mit wird ein Nukleinsäureanaloges komplementär zu einer bestimmten Sequenz des einen Alleis und das andere Nukleinsaureanaloge komplementär zu der Sequenz des anderen Alieis gewählt. Länge und Hybridisierungsstelle der Nukleinsaureanaloge sind gleich.
Bei Cystischer Fibröse beispielsweise wird üblicherweise ein Nachweis aller Allele durchge¬ führt. Der Wild-Typ enthält zwei gesunde Allele, Heterozygote enthalten eine mutierte und eine Wild-Typ-Sequenz und homozygote Mutanten enthalten zwei mutante Nukleinsäuren. In diesem Fall soll nicht nur festgestellt werden, ob Mutanten vorliegen, sondern ob es sich um einen heterozygoten oder den homozygoten Fall handelt. Gemäß der vorliegenden Erfindung ist es möglich, beide Allele gleichzeitig quantitativ nachzuweisen und somit zwischen den genannten 3 Fällen zu differenzieren.
In manchen Fällen, insbesondere in der Onkologie und bei der Bestimmung von Infektions¬ parametern, liegen mutierte Zellen/Partikel oft in einem Hintergrund von nicht-mutier- ten/normalen Zellen vor. Der selektive Nachweis ist in solchen Fällen mit Verfahren des Standes der Technik nicht sicher oder gar nicht möglich. So erfordert die Analyse von ras- Mutationen aus DNA aus Stuhl den sicheren Nachweis einer mutierten Sequenz in Gegen¬ wart von ca. 100 normalen Sequenzen (Science 256, 102-105, (1992)). Auf dem Gebiet der Infektionsparameter wäre es wünschenswert, unterschiedliche HIV-Populationen in einem infizierten Patienten zu bestimmen. Von diesen liegen manche Mutanten jedoch in einer Menge von weniger als 2 % verglichen mit allen HIV-Sequenzen vor. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es daher besonders gut möglich, Gemische von zueinander sehr ähnlichen Nukleinsäuren zu untersuchen, selbst wenn eine der Nukleinsäuren in sehr großem Überschuß gegenüber der zu bestimmenden Nukleinsäure vorliegt.
Bevorzugt sind die Längen der gebundenen Nukleinsäureanalogen gleich. Als zweckmäßig hat sich die Auswahl einer Länge von zwischen 10 und 100, bevorzugt 10 und 50, Basen erwiesen. Für den Fall der Verwendung von Nukleinsäureanalogen einer Länge zwischen 10 und 25 Basen lassen sich besonders gute Ergebnisse erzielen. Zur Durchfuhrung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die nukleinsäurehaltige Probe mit den Stellen auf der Oberfläche des Trägers in Kontakt gebracht, welche die Nuklein¬ säureanalogen gebunden haben. Dies kann beispielsweise durch Einbringen des festen Trägers in die Probenflüssigkeit oder Aufgießen der Probenflüssigkeit auf den festen Träger in einer oder mehreren Portionen geschehen. Die Nukleinsäuren der Probenflüssigkeit können vor dem Inkontaktbringen mit dem Träger in denaturiertem (einzelsträngigem) Zu¬ stand vorliegen. Ein großer Vorteil der Erfindung ist jedoch, daß, z. B. durch Verwendung von PNAs, eine Denaturierung vor Inkontaktbringen unterlassen werden kann. Die PNAs verdrängen einen Strang aus eventuell doppelsträngiger zu bestimmender Nukleinsäure. Wesentlich ist nur, daß das Inkontaktbringen unter Bedingungen geschieht, bei denen die nachzuweisende Nukleinsäure über das zu einer Sequenz der nachzuweisenden Nuklein¬ säure komplementäre Nukleinsaureanaloge an die betreffende Stelle der Oberfläche spezi¬ fisch bindet. Diese Bedingungen können zwar für unterschiedliche Arten von Nukleinsäu¬ reanalogen unterschiedlich sein, sie sind jedoch bei gegebenen Nukleinsäureanalogen auf einfache Weise durch Austesten erhältlich. Im Regelfall werden sich diese Bedingungen an den Bedingungen orientieren, wie sie für mit Oligonukleotiden geladene Träger bekannt sind. Für den Fall der Verwendung von Nukleinsäureanalogen gemäß WO 92/20702 können jedoch Bedingungen gewählt werden, die deutlich unterschiedlich von den Hybridisierungs- bedingungen entsprechender Oligonukleotide sind. Insbesondere hat es sich als zweckmäßig erwiesen, deutlich weniger Salze einzusetzen als bei der Verwendung entsprechender Oligonukleotide. Beispielsweise ist die Anwesenheit von weniger als 100 mM, besonders bevorzugt weniger als 50 mM und ganz besonders bevorzugt von weniger als 10 mM Salzen hervorzuheben. Unter diesen Bedingungen könnte mit Oligonukleotiden gleicher Sequenz keine ausreichende Unterscheidung zwischen sequenzähnlichen Nukleinsäuren er¬ reicht werden.
Die Probe wird solange in Kontakt mit der Oberfläche gehalten, wie für eine ausreichende Bindung der Nukleinsäure an die betreffende Stelle der Oberfläche erforderlich ist. Dieser Zeitraum liegt üblicherweise im Bereich weniger Minuten.
Anschließend wird bestimmt, ob und an welcher Stelle eine Bindung einer Nukleinsäure an die Oberfläche stattgefunden hat. Dies wird als ein Zeichen der Anwesenheit einer Nuklein¬ säure gewertet, die eine zu dem an dieser Stelle gebundenen Nukleinsäureanalogen komplementäre Basensequenz enthält. Die Bestimmung der stattgefundenen Bindung kann auf unterschiedliche Weise geschehen.
Zwar gibt es mittlerweile schon Geräte, mit denen Veränderungen von Oberflächen an ganz bestimmten Stellen direkt festgestellt werden können. Für Verfahren, die solche Geräte be¬ nutzen, ist es nicht einmal erforderlich, die auf die Oberfläche aufgegebene nukleinsäure- haltige Probe wieder von der Oberfläche zu entfernen. Im Regelfall wird jedoch bevorzugt die nach Inkontaktbringen auf der Oberfläche befindliche Flüssigkeit von der Oberfläche entfernt und eventuell noch anhaftende Reagenzrückstände durch eine Waschlösung ent¬ fernt. Dies hat auch den Vorteil, daß Probenbestandteile, die mit der Bestimmung der Bindung interferieren könnten, abgewaschen werden.
Die Bindung der nachzuweisenden Nukleinsäure an das Nukleinsaureanaloge kann in vor¬ teilhafter Weise dadurch geschehen, daß ein in die nachzuweisende Nukleinsäure in einem vor dem Inkontaktbringen mit der Oberfläche liegenden Schritt eingebrachte Markierung nachgewiesen wird. Hierbei kann es sich beispielsweise um eine nachweisbare Gruppe, z. B. einen fluoreszierenden Rest, handeln. Diese Bestimmung kann sowohl optisch mit Hilfe eines Mikroskopes, als auch in einer dafür vorgesehenen Meßzelle vorgenommen werden. Während der Ort der stattgefundenen Bindung ein Hinweis auf das Vorhandensein einer Nukleinsäure mit einer bestimmten Sequenz ist, kann die Menge an Markierung an einer vorbestimmten Stelle als ein Zeichen für die Menge der Anwesenheit der nachzuweisenden Nukleinsäure ausgenutzt werden.
Besonders bevorzugt sind die nachzuweisenden Nukleinsäuren Resultate einer Nuklein¬ säure- Amplifikationsreaktion wie der Polymerasen-Kettenreaktion nach EP-B-0 202 362 oder NASBA nach EP-A-0 329 822. Wesentlich für die Amplifikation ist, daß die Nuklein- säuresequenz, die zur Bindung mit dem Nukleinsäureanalogen vorgesehen ist, durch das Amplifikationsverfahren vermehrt wird. Je sequenztreuer die Amplifikation geschieht, d. h. je weniger Fehler während der Amplifikation in die Sequenz eingebaut werden, desto ge¬ eigneter ist das Amplifikationsverfahren. Als besonders geeignet hat sich die Polymerase- Kettenreaktion erwiesen. Die Primer zur Amplifikation werden so gewählt, daß die nach¬ zuweisende Nukleinsäuresequenz in dem Bereich zwischen den Primerhybridisationsstellen liegt. Darüber hinaus hat es sich als vorteilhaft erwiesen, die für die Nachweisreaktion erforder¬ liche Markierung während der Amplifikation in die Amplifikate einzubauen. Dies kann bei¬ spielsweise geschehen durch Einsatz markierter Primer oder markierter Mononukleosidtri- phosphate.
Ein direkter Nachweis der stattgefundenen Bindung ohne Einbau einer Markierung ist bei¬ spielsweise möglich durch Einsatz eines interkalierenden Agens. Diese Agenzien haben die Eigenschaft, sich selektiv an doppelsträngigen basenhaltigen Verbindungen, darunter auch dem Komplex aus dem Nukleinsäureanalogen und der sequenzspezifisch gebundenen Nukleinsäure, einzulagern. Anhand spezifischer Eigenschaften der interkalierenden Agenzien, z. B. einer Fluoreszenz, kann das Auftreten der Komplexe nachgewiesen werden. Ein besonders geeignetes Agens ist Ethidiumbromid.
Eine weitere Möglichkeit, die Hybride ohne Einbau eines Labels zu erfassen, ist mit Hilfe der Oberflächenplasmonenresonanz gegeben, z. B. nach EP-A-0 618 441.
In einer anderen Möglichkeit der Bestimmung der stattgefundenen Bindung wird die Ober¬ fläche mit einer Lösung eines nachweisbar markierten Antikörpers gegen den Komplex aus Nukleinsäureanalogen. und nachzuweisender Nukleinsäure in Kontakt gebracht. Solche Antikörper sind beispielsweise beschrieben in WO 95/17430.
Der Nachweis der Hybride richtet sich nach der Art der Markierung. Es kann sich bei¬ spielsweise um einen Scanner, eine CCD-Kamera oder ein Mikroskop handeln.
Mit der vorliegenden Erfindung können vielerlei Vorteile realisiert werden. Insbesondere ist es möglich, auch Sequenzunterschiede in Nukleinsäurebereichen zu erfassen, die innerhalb von Sekundärstrukturen liegen. Erfindungsgemäß ist es auch möglich, die Sensitivität des Nachweises zu steigern, da mit ihm die absolute Menge an gebundener nachzuweisender Nukleinsäure höher sein kann als bei herkömmlichen Verfahren. Insbesondere ist es auch möglich, die Signal-ZRauschverhältnis gegenüber Verfahren unter Verwendung von Oligo¬ nukleotiden zu erhöhen. Im ersten Versuch war ein Signal-/Rauschverhältnis von weniger als 1 : 1000 erhältlich.
Anwendungsmöglichkeiten der Erfindung liegen auf mindestens zwei Gebieten. Im ersten Fall wird der feste Träger zum Nachweis von bekannten Mutationen und Polymorphismen benutzt. Hierfür ist die Anzahl an zu bestimmenden Mutationen und Polymorphismen ein Maß für die erforderliche Anzahl unterschiedlicher Nukleinsaureanaloge bzw. Stellen auf der Oberfläche. Die Sequenz der Nukleinsäureanalogen ist speziell auf die Sequenz der Nukleinsäuren um die Mutationen und Polymorphismen abgestimmt. Die Sequenzen werden bevorzugt so gewählt, daß die Base, in der sich sequenzähnliche Nukleinsaureanaloge unterscheiden, in oder nahe der Mitte der Sequenz liegt.
Die erfindungsgemäßen Träger können auf folgenden Gebieten eingesetzt werden:
Infektionskrankheiten, simultane Bestimmung unterschiedlicher Analyten Parameter, aber auch Unterschung des Zustandes eines Genes in einem Bakterium oder Virus , z. B. Multidrug-Resistance .
Onkologie (Nachweis von Mutationen in Tumorsuppressor- und Onkogenen und Be¬ stimmung des Verhältnisses mutierter zu normaler Zellen.
Untersuchung von Erbkrankheiten (Cystische Fibröse, Sichelzellanämie, etc.).
Typisierung von Geweben und Knochenmark (MHC -Komplex) (siehe Clin. Chem. 41/4, 553-5 (1995)).
In einer zweiten Anwendungsmöglichkeit kann eine Sequenz kurzer Nukleinsäurefragmente nach dem Verfahren der sogenannten Sequencing by Hybridization bestimmt werden. Hierzu werden so viele unterschiedliche Nukleinsaureanaloge immobilisiert, wie sich Per¬ mutationen aus der gewählten Länge der Sequenz ergeben. Um eine ausreichende Spezifität zu erlangen, sind hierzu 4N Stellen erforderlich, wenn N die Anzahl von Basen in jedem Nukleinsäureanalogen ist. Bevorzugt liegt N zwischen 5 und 12. Für die Sequenzierung von sehr kurzen DNA-Fragmenten sind entsprechend weniger Stellen erforderlich. Das Ver¬ fahren zur Sequenzierung unbekannter Nukleinsäuren durch Sequencing by Hybridization ist in WO 92/10588 beschrieben.
Ein Vorteil der vorliegenden Erfindung ist, daß die Spezifität der Hybridisierung weitgehend unabhängig von den Bedingungen in der Probe ist. Dies erleichtert die simultane Bindung von Nukleinsäuren an unterschiedliche Bereiche der Oberfläche.
Überraschenderweise hat sich herausgestellt, daß Nukleinsaureanaloge, wie PNA, an der Festphase eine hervorragende Fähigkeit zur Diskriminierung zwischen Sequenzen auf- weisen. Diese Diskriminierung war besser als aus den Schmelztemperaturen analoger ge¬ löster Verbindungen zu erwarten war.
Die erfindungsgemäßen Träger sind erstaunlicherweise sogar zur mehrfach hintereinander durchgeführten Bestimmung von Nukleinsäuren geeignet. Nach Durchführung einer Be¬ stimmung wird der Träger in Kontakt mit einer Flüssigkeit einer Hitzebehandlung unter¬ zogen. Als Temperatur wird eine solche gewählt, bei der die Bindung des Nukleinsäure¬ analogen an die gegebenenfalls gebundene Nukleinsäure gelöst wird. Danach steht der Träger für eine erneute Bestimmung zur Verfügung. Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Ver¬ fahrens ist zum ersten Mal eine Bestimmung relativer Mengen von nebeneinander in einer Probe vorhandenen sehr ähnlichen Nukleinsäuren in einem Konzentrationsbereich von mindestens zwei logs möglich. Eine quantitative Bestimmung von Mutanten war bislang z. B. über Sequenzierungsverfahren möglich. Die hierbei erhältliche Diskriminierung lag jedoch bei maximal 1 : 10.
Ferner ist es mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens möglich, doppelsträngige DNA ohne Denaturierung an die immobilisierten Nukleinsäureanalogen des festen Trägers zu binden. Vergleichende Studien haben gezeigt, daß dies mit immobilisierter DNA nicht möglich ist. Es hat sich außerdem gezeigt, das mismatches, die nicht im Zentrum des Hybrids liegen, ebenfalls mit hoher Selektivität diskriminiert werden können.
In FIG. la sind die Sequenzen der PNA-Molekülen gezeigt, mit deren Hilfe das Verfahren beispielhaft erläutert wird. Die PNAs wurden nach WO 92/20702 hergestellt.
In FIG. lb sind die Sequenzen der DNA-Moleküle gezeigt, die homolog zu den PNA Sequenzen aus FIG. la sind und für die DNA/ODN-Hybridisierungsexperimente verwendet wurden.
In FIG. lc sind die Sequenzen der verwendeten komplementären Oligonukleotide (ODN) angegeben, die am 5'-Phosphat-Ende mit Hilfe des 5'-DIG-Endlabeling Kits (Boehringer Mannheim) mit Digoxigenin markiert bzw. mit Polynukleotidkinase und 3 P-γ-ATP 5 - phosphoryliert wurden.
In FIG. ld sind die denkbaren Kombinationen von Oligonukleotid (ODN) und PNA zur Bildung von Hybriden gezeigt. Identische Kombinationen gelten für Hybridisierungen zwischen DNA-Sonden (DNA, vgl. FIG. lb) und Oligonukleotiden (ODN, vgl. FIG. lc). In FIG. 2 sind die Hybridisierungsergebnisse aus Beispiel 4 gezeigt, das die Selektivität der Methode verdeutlichen sollen. Die Bedingungen waren: 200 nl Spotvolumen (100; 10; 1; 0, 1 μM PNA, je eine Konzentration pro Spalte), Inkubation bei 45 °C.
In FIG. 3 sind die Hybridisierungsergebnisse aus Beispiel 6 gezeigt, das den Nachweis von PCR-Amplikons durch immobilisierte PNA-Sonden belegt. Die Bedingungen waren: 200 nl Spotvolumen (100; 10; 1; 0,1 μM PNA, je eine Konzentration pro Spalte) Inkubation bei 45 °C. Außerdem bedeuten:
I Kontrollexperiment, ODN la (lpMol, InM), Zeile 1 (PNA1), Zeile 2 (PNA2) Zeile 3 (PNA3)
II ss Amplifikat ( 118bp, einfach DIG-markiert) 5 min. Hitzedenaturierung bei 94°C
(50μl PCR- Ansatz verdünnt in 1ml Hybridisierungspuffer) Zeile 1 (PNA1), Zeile 2 (PNA2) ZeUe 3 (PNA3)
III ds Amplifikat ( 118bp, einfach DIG-markiert)
(50μl PCR- Ansatz direkt verdünnt in 1ml Hybridisierungspuffer Zeile 1 (PNA1), Zeile 2 (PNA2) Zeile 3 (PNA3)
In FIG. 4 sind die Ergebnisse der qualitativen und quantitativen Analyse von Analytgemischen durch PNA-Arrays gezeigt. Die Bedingungen waren: 200 nl Spotvolumen (lOOμM PNA, je eine der PNA pro Zeile, je ein Analytgemisch pro Spalte).
FIG. 5 zeigt den Einfluß der Linkerlänge auf die Hybridisierung. Die Bedingungen waren: lμl Spotvolumen (100; 40; 20; 10; 5; 1 μM PNA, je eine Konzentration pro Spalte, (Ado)3- PNA in Reihe 1, (Ado)β-PNA in Reihe 2, (Ado)o-PNA in Reihe 3). In FIG. 5 bedeuten:
A. Vorhybridisierung / Hybridisierung in 5mM Natriumphosphat, 0.1% SDS, pH 7.0
B. Vorhybridisierung / Hybridisierung in lOmM Natriumphosphat, 0.1% SDS, pH 7.0
C. Vorhybridisierung / Hybridisierung in 25mM Natriumphosphat, 0.1% SDS, pH 7.0
Die FIG. 6a - 6c beweisen die Möglichkeit, PNA-derivatisierte Membranen nach der Regenerierung mehrfach zu verwenden. Die Bedingungen waren: lμl Spotvolumen (100; 40; 20; 10; 5, 1 μM PNA, je eine Konzentration pro Spalte). In FIG. 6 bedeuten:
6a: Signalintensitäten nach der ersten Hybridisierung
6b: Signalintensitäten nach der Regenerierungsprozedur
Membran 1 : keine Regenerierung (Kontrolle)
Membran 2: Regenerierung mit 0. IM Natronlauge, RT In, 2x 10min. bidest. Wasser RT Membran 3: Regenerierung mit IM Natronlauge, RT lh, 2x 10min. bidest. Wasser RT Membran 4: Regenerierung mit dest. Wasser, 70°C lh, 2x 10min. bidest. Wasser RT Membran 5: Regenerierung mit 0. IM Natronlauge, 70°C lh , 2x 10min. bidest. Wasser RT
6c: Signalintensitäten nach der Rehybridisierung
Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter erläutert:
Beispiele
Allgemeines:
Die benutzten Nukleinsäureanalogen wurden gemäß WO 92/20702 hergestellt. Chemikalien und Reagenzien waren, soweit nicht gesondert angegeben, von der Boehnnger Mannheim GmbH.
Beispiel 1:
Kovalente Derivatisierung von Nylonmembranen
200 nl einer Lösung, welche PNA in der gewünschten Konzentration in 0.5 M Natrium- carbonat pH 9.0 enthält, werden auf eine Immunodyne ABC Membran (Pall) mit einer Pipette aufgetragen. Nach dem Trocknen der Spots werden noch vorhandene reaktive funktionelle Oberflächengruppen durch Waschen der Membran mit 0.1 M Natronlauge deaktiviert. Es wird mit Wasser nachgewaschen und danach die Membran getrocknet.
Beispiel 2:
Nachweis eines Hybridisierungsereignisses durch Lumineszenz
Die Membran wird unter Verwendung von 100 μM, 10 μM 1 μM und 0.1 μM PNA- Lösungen wie unter Beispiel 1 beschrieben derivatisiert. Anschließend wird sie in einem 50 ml Hybridisierungsgefäß mit 10 ml Hybridisierungspuffer (10 mM Natriumphosphat pH 7.2, 0.1% SDS (Natriumdodecylsulfat)) im Hybridisierungsofen bei 45°C prähybridisiert. Nach 30 min. werden 10 μl einer Lösung, die DIG-markiertes Oligonukleotid in 1 μM Konzentration enthält, zugegeben und es wird weitere 60 min. hybridisiert. Danach wird 2 x 10 min. mit je 25 ml Waschpuffer (5 mM Natriumphosphat pH 7.2, 0.05% SDS) bei 45°C gewaschen. Die Nachweisreaktion wird gemäß dem Protokoll für die Digoxigenin Detektion (DIG-Detection-Kit, Boehringer Mannheim GmbH, BRD) durchgeführt. Dabei wird Anti-DIG-AP-Konjugat in einer Verdünnung von 1:10000 verwendet. Als Substrat für die Alkalische Phosphatase wird CDP-Star™ in einer Verdünnung von 1:10000 eingesetzt.
Beispiel 3 :
Nachweis eines Hybridisierungsereignisses durch Fluoresenz
Die Membran wird unter Verwendung 100 μM, 10 μM und 1 μM PNA-Lösung wie unter Beispiel 1 beschrieben derivatisiert. Die Membran wird in einem 50 ml Schraubgefäß mit 10 ml Hybridisierungspuffer (vgl. Beispiel 2) im Ofen bei 45°C prähybridisiert. Nach 30 min. werden 10 μl einer Lösung, die ein fluoreszenzmarkiertes Oligonukleotid in einer Konzentration von 1 μM enthält, zugegeben und es werden weitere 60 min. hybridisiert. Im Anschluß wird die Membran 2 x 10 min. mit je 25 ml Waschpuffer (vgl. Beispiel 2) bei 45°C gewaschen. Die Fluoreszenzintensitäten werden nach dem Trocknen der Membran ge¬ messen.
Beispiel 4:
Selektivität der Methode
Drei Membranstreifen werden mit jeweils drei (AdoVPNA-Molekülen, die sich in ihrer Basenabfolge an einer bzw. zwei Positionen unterscheiden (vgl. FIG. la, SEQ.ID.NOS. 1, 2, 3), unter Verwendung von PNA-Lösungen im Konzentrationsbereich zwischen 100 μM und 0,1 μM analog Beispiel 1 derivatisiert. Die Membranstreifen werden in 50 ml Schraubgefäßen mit 10 ml Hybridisierungspuffer 30 min. prähybridisiert. Anschließend wird jeweils eines der drei DIG-markierten Oligonukleotide (FIG. lb, SEQ.ID.NOS. 4, 5, 6) zugegeben. Nach 60 min. Hybridisierungsdauer wird 2 x 10 min. mit je 25 ml Waschpuffer gewaschen. Die Hybridisierungsereignisse werden, wie in Beispiel 2 beschrieben, nach¬ gewiesen.
In FIG. ld sind alle möglichen doppelsträngigen Hybride zwischen den beteiligten PNA- Molekülen und den Oligonukleotiden dargestellt. Aus FIG. 2 ist ersichtlich, daß praktisch immer nur das Oligonukleotid nachgewiesen wird, welches zu dem immobilisierten Nukleinsäureanalogen (PNA 1, PNA 2, PNA 3) exakt komplementär ist. Aus der Abbildung können außerdem die Signal-Rausch- Verhältnisse (S/N) abgeschätzt werden. Sie wurden quantitativ ausgewertet, die Ergebnisse sind in Tabelle 1 wiedergegeben.
Tabelle 1
Hybrid (PNA/ODN) S/N Signal (Hybrid)/Signal (Match)
1/1 655,2 100,0%
2/1 20,7 3,2 %
3/1 10,3 1,6%
1/2 23,1 2,6 %
2/2 871,8 100,0%
3/2 6,4 0,7 %
1/3 109,4 22,7 %
2/3 12,3 2,5 %
3/3 481,1 100,0 %
Beispiel 5:
Quantifizierung
Membranstreifen werden mit drei (AdoVPNA-Molekülen, die sich in ihrer Basenabfolge (FIG. la, SEQ.ID.NOS. 1, 2, 3) unterscheiden, in einer Konzentration von 100 μM analog Beispiel 1 derivatisiert. Anschließend werden sie in 20 ml Hybridisierungsgefäßen mit 10 ml Hybridisierungspuffer (vgl. Beispiel 2) bei 45°C prähybridisiert. Nach 30 min. wird der Puffer gewechselt. In den Experimenten 1 bis 7 unterscheidet sich der hinzugegebene Puffer in den Analytkonzentrationen der DIG-markierten Komponenten Oligonukleotid 1, 2 und 3, SEQ.ID.NOS. 4, 5, 6. Nach 60 min. Hybridisierungdauer bei 45°C wird 2 x 10 min. mit 10 ml Waschpuffer gewaschen und der Nachweis eines Hybridisierungsereignisses wird wie in Beispiel 2 geführt. Das Lumineszenzsignal wird mit einem Lumineszenz-Imager aufgezeichnet und anschließend ausgewertet (FIG. 4).
Die gefundenen Signalintensitäten ermöglichen sowohl eine qualitative als auch semiquantitative Aussage über die Zusammensetzung des Analytgemisches. Absolute quantitative Aussagen sind nach einer Eichung der Signalintensitäten möglich.
Beispiel 6:
Nachweis von PCR-Amplikons
A. Gewinnung eines geeigneten Analyten (Amplifikat)
In ein pUC19-Plasmid wird ein doppelsträngiges DNA-Fragment ligiert, dessen Sequenz komplementär zur PNA-Sonde PNA1 ist. Das Plasmid wird in E.coli transformiert, kloniert und anschließend sequenziert. Für die nachfolgenden Hybridisierungsexperimente wird ein Abschnitt der Plasmidsequenz amplifiziert und während der Amplifikationsreaktion DIG- markiert. Die Amplifikation wird in einem Gesamtvolumen von 50 μl durchgeführt. Der Amplifikationsansatz besteht aus 1 μl Plasmid (1 ng/μl), 1 μl Primer Fl (10 μM), 1 μl DIG- Primer Rl (10 μM), 5 μl 10 x PCR Puffer (100 mM Tris/HCl, 15 mM MgCl2, 500 mM KC1, pH 8.3), 2 μl dNTP-Lösung (10 mM dATP, 10 mM dCTP, 10 mM dGTP, 10 mM dTTP in dest. Wasser pH 7.0), 0.5 μl Taq-Polymerase (5 Unit/μl) und 38.5 μl Wasser.
Primer Fl : 5'-GTA AAA CGA CGG CCA GT-3' (SEQ.ID.NO. 12)
Primer Rl : 5'-DIG-AAC AGC TAT GAC CAT GA-3' (SEQ.ID.NO. 13)
Jeder Reaktionsansatz wird 3 min. auf 96°C erhitzt und anschließend werden 30 Runden eines 3-Stufen PCR-Zyklus durchgeführt (45 sec. 96°C, 30 sec. 48°C, 1 min. 72°C). Im letzten Zyklus wird der Elongationsschritt um 5 min bei 72°C verlängert.
B. Hybridisierungsreaktion
Die Membranen werden mit jeweils drei ( AdoVPNA-Sequenzen, die sich in ihrer Basenabfolge an einer bzw. zwei Positionen unterscheiden (vgl. FIG. la, SEQ.ID.NOS. 1, 2, 3), unter Verwendung von PNA-Lösungen im Konzentrationsbereich zwischen 100 μM und 0, 1 μM analog Beispiel 1 derivatisiert. Die Vorbehandlung der Membran erfolgt in einem 20 ml Hybridisierungsgefäß mit 5 ml Hybridisierungspuffer bei 45°C. Nach 30 min. wird der Puffer gewechselt und die Analytlösung wird zugegeben. Für die Herstellung der Analytlösung wird der Amplifikationsansatz direkt (ds Amplicon) bzw. nach 5 min Hitzedenaturierung (ss Amplicon) in 1 ml Hybridisierungspuffer verdünnt. Nach 1 h, 2 h 30 min. bzw. 4 h Hybridisierung bei 45°C wird 2 x 10 min. mit je 5 ml Waschpuffer gewaschen. Hybridisierungsereignisse werden, wie in Beispiel 2 beschrieben, nachgewiesen (FIG. 3).
In FIG. 3 sind 9 Felder zu sehen. Die Reihen unterscheiden sich in der Länge der Inkubationszeit (4 h, 2 lΛ h und 1 h). Die Spalten unterscheiden sich in der Art der nachzuweisenden Nukleinsäure. In jedem der 3 Felder von Spalte I sind 3 übereinanderliegende Reihen von Spots aufgebracht. Die Reihen unterscheiden sich in der Sequenz der PNAs, während die Spalten jeden Feldes sich in der Konzentration unterscheiden. Sowohl die Spezifität als auch die Quantifizierbarkeit für den Fall von Oligonukleotiden als nachweisende Nukleinsäure gehen aus Spalte I hervor. In der Abbildung ist der Einfluß der Inkubationszeit zu erkennen. Es wird klar, daß schon bei einstündiger Hybridisierung eine hervorragende Sequenz-Diskriminierung für ODN la und den Amplifikaten erreicht wird. Die Spalten II und in in FIG. 3 unterscheiden sich dadurch, daß im einen Fall ein zuvor einzelsträngig gemachtes Amplifikat und in Spalte m ein nicht zuvor einzelsträngig gemachtes Amplifikat als nachzuweisende Nukleinsäure eingesetzt werden. Aus den Signalen ist erkennbar, daß es nicht erforderlich ist, doppel- strängige Nukleinsäuren vor Aufbringung auf den festen Träger zu denaturieren. Dies führt zu einer Einsparung von Arbeitsschritten (Hitzeschritt, Einzelstrangseparation, Wasch¬ schritt) und verringert dadurch die Kontaminationsgefahr, so daß PNA-Sonden in Verbindung mit Niedrigsalzbedingungen deutliche Vorteile gegenüber DNA-Sonden zeigen.
Beispiel 7
Vergleich PNA / DNA Hybridisierung
Membranstreifen werden mit jeweils drei (Ado)6-PNA-Sequenzen (SEQ.ID.NOS. 1, 2, 3) sowie drei DNA-Molekülen (SEQ.ID.NOS. 8, 10, 11), die sich in ihrer Basenabfolge an einer bzw. zwei Positionen unterscheiden (vgl. FIG. la und lb), unter Verwendung von 50 μM Lösungen analog Beispiel 1 derivatisiert. In Abänderung zu Beispiel 1 beträgt das Spotvolumen 400 nl statt 200 nl. Die Membranstreifen werden in 20 ml Hybridisierungsgefäßen wahlweise mit 5 ml Niedrigsalzpuffer (vgl. Beispiel 2) oder Hochsalzpuffer (6 x SSC: 0.9 M NaCl, 90 mM Natriumeitrat, 0.1 % SDS, pH 7.0) bei 37°C bzw. alternativ 45°C 30 min. prähybridisiert. Anschließend wird jeweils eines der drei Dig- markierten Oligonukleotide (FIG. lc, SEQ.ID.NOS. 4, 5, 6) zugegeben. Nach 60 min. Hybridisierungsdauer wird 2 x 10 min mit je 5 ml Waschpuffer bei 37°C bzw. 45°C gewaschen. Für die Niedrigsalzexperimente wird der Waschpuffer aus Beispiel 2 verwendet und für die Hochsalzexperimente ein 1 x SSC-Puffer mit 0.02 % SDS, pH 7.0. Die Hybridisierungsereignisse werden wie in Beispiel 2 nachgewiesen. Die Auswertung erfolgte quantitativ und ist in Tabelle 2 dargestellt.
Sowohl die DNA- als auch die PNA-Sonden sind in der Lage, vollständig komplementäre einzelsträngige Zielsequenzen von einzel- und doppelt fehlpaarenden Sequenzen zu unterscheiden. Deutliche Vorteile der PNA-Sonden gegenüber der DNA-Sonden ergeben sich für bestimmte Arten der Fehlpaarung, besonders wenn diese nicht in der Mitte der Sequenz liegt, sondern terminal verschoben ist. Besonders deutlich wird dies am Beispiel einer dezentralen G/T-Fehlpaamng (Sonde 1 / ODN 3), die von der DNA-Sonde stärker toleriert wird als von der sequenzidentischen PNA-Sonde.
TabeUe 2
PNAhzv» DNA11 PNA bzw.- DNA 2ς,
ODN1 PNA 45'C, low salt 100,0% 1,2% 1,5% DNA 37*C, high salt 100,0% 1,2% 6,4%
ODN 2 PNA 45PC, low salt 1,1% 100,0% 2,9% DNA 37'C, high salt <2% * 100,0% <2%*
ODN 3 PNA 45*C. low salt 26,0% 1,5% 100,0% DNA 37βC, high salt 66.5% <2% * 100,0%
* genauer Wert nicht bestimmbar, da Spotintensitat kleiner als Standardabweichung des Untergrundsignals
Beispiel 8
Einfluß der Länge des Linkers zwischen Membran und PNA-Sonden
Membranstreifen werden mit PNA-Molekülen (vgl. FIG. la, SEQ.ID.NOS. 7, 1, 9), die sich in der Länge des Linkers (Ado3, Ado6 bzw. Ado9) unterscheiden, unter Verwendung von PNA-Lösungen im Konzentrationsbereich zwischen 100 μM und 1 μM analog Beispiel 1 derivatisiert. In Abänderung zu Beispiel 1 beträgt das Spotvolumen 1 μl statt 200 nl. Die Membranstreifen werden in Hybridsierungsgefäßen mit 10 ml Hybridisierungspuffer (5, 10 bzw. 25 mM Natriumphosphat, 0.1 % SDS, pH 7.0) 30 min. bei 35°C prähybridisiert. Anschließend werden 10 pMol 3 P-markiertes Oligonukleotid (vgl. FIG. lc: ODN lb, SEQ.ID.NO. 4) zugegeben und 60 min. bei 50°C hybridisiert. Die Membranen werden 2 x 10 min. mit 50 ml Waschpuffer (5 mM Natriumphosphat, 0.1 % SDS, pH 7.0) bei 50°C gewaschen. Der Nachweis von Hybridisierungsereignissen erfolgt durch Autoradiographie (FIG. 5) Der Abbildung kann entnommen werden, daß mit einem längeren Linker die Hybridisierung deutlich verbessert werden kann.
Beispiel 9
Wiederverwendung von PNA-Membranen
Eine Membran wird mit (Ado)6-PNA-Molekülen (vgl. FIG. la: PNA lb, SEQ.ID.NO. 1) unter Verwendung von PNA-Lösungen im Konzentrationsbereich zwischen 100 μM und 1 μM analog Beispiel 1 derivatisiert. Die PNA wird dabei in fünf identischen Konzentrationsreihen aufgetragen. Wie in Beispiel 8 beträgt das Spotvolumen 1 μl. Die Membran wird in einem Hybridsierungsgefäß mit 10 ml Hybridisierungspuffer (10 mM Natriumphosphat, 0.1 % SDS, pH 7.0) 30 min. bei 35°C prähybridisiert. Anschließend werden 10 pMol 3 P-markiertes Oligonukleotid (vgl. FIG. lc: ODN lb, SEQ.ID.NO. 4) zugegeben und 60 min. bei 50°C hybridisiert. Die Membran wird 2 x 10 min. mit 50 ml Waschpuffer (5 mM Natriumphosphat, 0.1 % SDS, pH 7.0) bei 50°C gewaschen. Der Nachweis von Hybridisierungsereignissen erfolgt durch Autoradiographie. (FIG. 6a). Nach der Autoradiographie wird die Membran in fünf identische Streifen geschnitten. Diese Membranstreifen werden im Verlauf des weiteren Experimentes unterschiedlich behandelt. Membran 1 wird nicht inkubiert und dient als Kontrollmembran, Membran 2 wird 60 min. bei Raumtemperatur mit 50 ml 0.1 M Natronlauge inkubiert, Membran 3 für denselben Zeitraum mit 50 ml 1 M Natronlauge, Membran 4 wird 60 min. bei 70°C mit 50 ml dest. Wasser inkubiert und Membran 5 wird 60 min. bei 70°C mit 50ml 0.1 N Natronlauge inkubiert. Anschließend werden alle Membranen 2 x 10 min. mit dest. Wasser bei Raumtemperatur gewaschen. Nach dieser Prozedur wird erneut eine Autoradiographie durchgeführt (FIG. 6b). Abschließend werden diese Membranstreifen ein weiteres Mal in einer Hybridisierungsreaktion wie beschrieben eingesetzt und die Hybridisierungsereignisse werden durch Autoradiographie nachgewiesen (FIG. 6c).
Wie FIG. 6b zeigt, erhält man durch die unterschiedlichen Behandlungsmethoden sehr verschiedene Resultate. Eine Behandlung mit bidest Wasser bei 70°C (Membran 4) bewirkt eine nahezu vollständige Regenerierung der Membran. Unerwarteterweise ist der Erfolg der Regenerierung schlechter, wenn Bedingungen verwendet werden, die i.a. für die Denaturierung von Nukleinsäuren üblich sind. So ergibt die Inkubation der Membran 3 mit 1 M Natronlauge bei Raumtemperatur kaum einen Regenerierungseffekt. Eine Erniedrigung der Natronlaugenkonzentration von 1 M auf 0.1 M erhöht den Grad der Regenerierung sowohl bei Raumtemperatur (Membran 2) als auch 70°C (Membran 5). Keine dieser Bedingungen führt jedoch zu einem annähernd guten Regenerierungsgrad, wie dies mit bidest. Wasser der Fall ist (Membran 4). Das Beispiel zeigt, daß diese Bedingungen wichtige Parameter für die effiziente Denaturierung von membrangebundenen PNA/DNA- Doppelsträngen sind.
Unabhängig von der Regenerierungsmethode können alle Membranen zur erneuten Hybridisierung verwendet werden (FIG. 6c), ohne daß eine erhebliche Verschlechterung des Signal/Rausch- Verhältnisses beobachtet wird. Bis zu 6 Rehybridisierungen konnten ohne merklichen Einfluß auf die Regenerierbarkeit oder die Rehybridisierungsfähigkeit der PNA- Membranen durchgeführt werden. Sequenzproto oll
(1) ALLGEMEINE ANGABEN:
(i) ANMELDER:
(A) NAME: Boehringer Mannheim GmbH
(B) STRASSE: Sandhoferstr.116
(C) ORT: Mannheim
(E) LAND: DE
(F) POSTLEITZAHL: 68298
(G) TELEFON: 0621 759 4348 (H) TELEFAX: 0621 759 4457
(ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG: Sequenzspezifischer Nachweis von
Nukleinsäuren
(in) ANZAHL DER SEQUENZEN: 13
(iv) COMPUTER-LESBARE FASSUNG:
(A) DATENTRÄGER: Floppy disk
(B) COMPUTER: IBM PC compatible
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: Patentin Release #1.0, Version #1.30 (EPA)
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 1 :
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 16 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ü) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN (ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modified-site
(B) LAGE:1
(D) SONSTIGE ANGABEN:/product= "OTHER"
/note= "Xaa is
N-(( 1 -thyminyl)acetyl)-N-(2-amino(N'-hexa(8-amino-3 ,6-dioxa-octano- 1 -yl))- ethyl)-beta-alanine "
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modified-site
(B) LAGE:2
(D) SONSTIGE ANGABEN:/product= "OTHER" /note= "Xaa is N-(( 1 -guaninyl)acetyl)-N-(2-aminoethyl)-beta-alanine"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modified-site
(B) LAGE:3
(D) SONSTIGE ANGABEN:/product= "OTHER" /note= "Xaa is N-(( 1 -thyminyl)acetyl)-N-(2-aminoethyl)-beta-alanine"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modified-site
(B) LAGE:4
(D) SONSTIGE ANGABEN:/product= "OTHER" /note= "Xaa is N-(( 1 -adeninyl)acetyl)-N-(2-aminoethyl)-beta- alanine"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modified-site
(B) LAGE:5
(D) SONSTIGE ANGABEN:/product= "OTHER" /note= "Xaa is N-(( 1 -cytosyl)acetyl)-N-(2-aminoethyl)-beta-alanine"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modified-site
(B) LAGE:6
(D) SONSTIGE ANGABEN:/product= "OTHER" /note= "Xaa is N-(( 1 -guaninyl)acetyl)-N-(2-aminoethyl)-beta-alanine"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modified-site
(B) LAGE:7
(D) SONSTIGE ANGABEN:/product= "OTHER" /note= "Xaa is N-(( 1 -thyminyl)acetyl)-N-(2-aminoethyl)-beta-alanineM
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modified-site
(B) LAGE:8
(D) SONSTIGE ANGABEN:/product= "OTHER" /note= "Xaa is N-(( 1 -cytosyl)acetyl)-N-(2-aminoethyl)-beta-alanine"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modified-site
(B) LAGE:9
(D) SONSTIGE ANGABEN:/product= "OTHER" /note= "Xaa is N-(( 1 -adeninyl)acetyl)-N-(2-aminoethyl)-beta-alanine"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modified-site
(B) LAGE: 10
(D) SONSTIGE ANGABEN:/product= "OTHER" /note= "Xaa is - 32 -
N-(( 1 -cytosyl)acetyl)-N-(2-aminoethyl)-beta-alanine"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME SCHLÜSSEL: Modified-site
(B) LAGE: 11..12
(D) SONSTIGE ANGABEN:/product= "OTHER" /note= "Xaa is N-(( 1 -adeninyl)acetyl)-N-(2-aminoethyl)-beta-alanine"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modified-site
(B) LAGE: 13
(D) SONSTIGE ANGABEN:/product= "OTHER" /note= "Xaa is N-(( 1 -cytosyl)acetyl)-N-(2-aminoethyl)-beta-alanine"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modified-site
(B) LAGE: 14
(D) SONSTIGE ANGABEN:/product= "OTHER" /note= "Xaa is N-(( 1 -thyminyl)acetyl)-N-(2-aminoethyl)-beta-alanine''
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modified-site
(B) LAGE: 15
(D) SONSΗGE ANGABEN:/product= "OTHER" /note= "Xaa is N-( 1 -adeninyl)acetyl)-N-(2-aminoethyl)-beta-alanine "
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1 :
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly 1 5 10 15 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 2:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 16 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(iü) HYPOTHETISCH: NEIN
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modified-site
(B) LAGE: 1
(D) SONSTIGE ANGABEN:/product= "OTHER"
/note= "Xaa is
N-(( 1 -thyminyl)acetyl)-N-(2--uτϋno(N-hexa(8-amino-3 , 6-dioxa-octano- 1 -yl))- ethyl)-beta-alanine"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modified-site
(B) LAGE:2
(D) SONSTIGE ANGABEN:/product= "OTHER" /note= "Xaa is N-(( 1 -guaninyl)acetyl)-N-(2-aminoethyl)-beta-alanine"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME SCHLÜSSEL: Modified-site
(B) LAGE:3
(D) SONSTIGE ANGABEN:/product= "OTHER" /note= "Xaa is N-(( 1 -thyminyl)acetyl)-N-(2-aminoethyl)-beta-alanine"
(ix) MERKMAL: (A) NAME/SCHLÜSSEL: Modified-site
(B) LAGE:4
(D) SONSTIGE ANGABEN:/product= "OTHER" /note= "Xaa is N-(( 1 -adeninyl)acetyl)-N-(2-aminoethyl)-beta-alanine"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modified-site
(B) LAGE:5
(D) SONSΗGE ANGABEN:/product= "OTHER" /note= "Xaa is N-(( 1 -cytosyl)acetyl)-N-(2-aminoethyl)-beta-alanine"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modified-site
(B) LAGE:6
(D) SONSTIGE ANGABEN:/product= "OTHER" /note= "Xaa is N-(( 1 -guaninyl)acetyl)-N-(2-aminoethyl)-beta-alanine"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME SCHLÜSSEL: Modified-site
(B) LAGE:7
(D) SONSTIGE ANGABEN:/product= "OTHER" /note= "Xaa is N-(( 1 -thyminyl)acetyl)-N-(2-aminoethyl)-beta-alanine"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modified-site
(B) LAGE:8
(D) SONSTIGE ANGABEN:/product= "OTHER" /note= "Xaa is N-(( 1 -guaninyl)acetyl)-N-(2-aminoethyl)-beta-alanine" (ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modified-site
(B) LAGE:9
(D) SONSTIGE ANGABEN:/product= "OTHER" /note= "Xaa is N-(( 1 -adeninyl)acetyl)-N-(2--uτ-inoethyl)-beta-alanine"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modified-site
(B) LAGE: 10
(D) SONSTIGE ANGABEN:/product= "OTHER" /note= "Xaa is N-(( 1 -cytosyl)acetyl)-N-(2-aminoethyl)-beta-alanine"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modified-site
(B) LAGE: 11..12
(D) SONSTIGE ANGABEN:/product= "OTHER" /note= "Xaa is N-(( 1 -adeninyl)acetyl)-N-(2-aminoethyl)-beta-alanine"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modified-site
(B) LAGE: 13
(D) SONSTIGE ANGABEN:/product= "OTHER" /note= "Xaa is N-(( 1 -cytosyl)acetyl)-N-(2-aminoethyl)-beta-alanine"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modified-site
(B) LAGE: 14
(D) SONSTIGE ANGABEN:/product= "OTHER" /note= "Xaa is N-(( 1 -thyminyl)acetyl)-N-(2-aminoethyl)-beta-alanine" (ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modified-site
(B) LAGE: 15
(D) SONSTIGE ANGABEN:/product= "OTHER" /note= "Xaa is N-( 1 -adeninyl)acetyl)-N-(2-aminoethyl)-beta-alanine "
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2:
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly 1 5 10 15
(2)ANGABENZUSEQIDNO:3:
(i)SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 16 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ü) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modified-site
(B) LAGE:1
(D) SONSTIGE ANGABEN:/product^ "OTHER"
/note= "Xaa is
N-(( 1 -thyminyl)acetyl)-N-(2-amino(N'-hexa(8-amino-3 ,6-dioxa-octano- 1 -yl))- ethyl)-beta-alanine "
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modified-site
(B) LAGE:2 (D) SONSTIGE ANGABEN:/product= "OTHER" /note= "Xaa is N-(( 1 -guaninyl)acetyl)-N-(2-aminoethyl)-beta-alanine"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modified-site
(B) LAGE:3
(D) SONSΗGE ANGABEN:/product= "OTHER" /note= "Xaa is N-(( 1 -thyminyl)acetyl)-N-(2-aminoethyl)-beta-alanine "
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modified-site
(B) LAGE:4
(D) SONSΗGE ANGABEN:/product= "OTHER" /note= "Xaa is N-(( 1 -adeninyl)acetyl)-N-(2-aminoethyl)-beta-alanine"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modified-site
(B) LAGE:5
(D) SONSTIGE ANGABEN:/product= "OTHER" /note= "Xaa is N-(( 1 -cytosyl)acetyl)-N-(2-aminoethyl)-beta-alanine"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modified-site
(B) LAGE:6
(D) SONSΗGE ANGABEN:/product= "OTHER" /note= "Xaa is N-(( 1 -adeninyl)acetyl)-N-(2-aminoethyl)-beta-ala.nine''
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modified-site
(B) LAGE:7 (D) SONSTIGE ANGABEN:/product= "OTHER" /note= "Xaa is N-(( 1 -thyminyl)acetyl)-N-(2-aminoethyl)-beta-alanine"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modified-site
(B) LAGE:8
(D) SONSTIGE ANGABEN:/product= "OTHER" /note= "Xaa is N-(( 1 -cytosyl)acetyl)-N-(2-aminoethyl)-beta-alanine"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modified-site
(B) LAGE:9
(D) SONSTIGE ANGABEN:/product= "OTHER" /note= "Xaa is N-(( 1 -adeninyl)acetyl)-N-(2-aminoethyl)-beta-alanine"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modified-site
(B) LAGE: 10
(D) SONSTIGE ANGABEN:/product= "OTHER" /note= "Xaa is N-(( 1 -cytosyl)acetyl)-N-(2-aminoethyl)-beta-alanine"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modified-site
(B) LAGE: 11..12
(D) SONSTIGE ANGABEN:/product= "OTHER" /note= "Xaa is N-(( 1 -adeninyl)acetyl)-N-(2-aminoethyl)-beta-alanine"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modified-site
(B) LAGE: 13 (D) SONSTIGE ANGABEN:/product= "OTHER" /note= "Xaa is N-(( 1 -cytosyl)acetyl)-N-(2-aminoethyl)-beta-alanine"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modified-site
(B) LAGE: 14
(D) SONSTIGE ANGABEN:/product= "OTHER" /note= "Xaa is N-(( 1 -thyminyl)acetyl)-N-(2-aminoethyl)-beta-alanine"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modified-site
(B) LAGE: 15
(D) SONSTIGE ANGABEN:/product= "OTHER" /note= "Xaa is N-( 1 -adeninyl)acetyl)-N-(2-aminoethyl)-beta-alanine "
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 3:
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly
1 5 10 15
(2)ANGABENZUSEQIDNO:4:
(i)SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 15 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Sonstige Nucleinsäure
(A) BESCHREIBUNG: /desc = "Oligodesoxyribonukleotid"
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN (ix) MERKMAL:
(A) NAME/ SCHLÜSSEL: misc_feature
(B) LAGE: 15
(D) SONSTIGE ANGABEN:/note= "markiert am 5'-Phosρhat mit Digoxigenin über Aminolinker (Boehringer Mannheim GmbH, BRD) oder 32-P"
(xi)SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQIDNO:4:
TAGTTGTGACGTACA 15
(2)ANGABENZUSEQIDNO: 5:
(i)SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 15 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Sonstige Nucleinsäure
(A) BESCHREIBUNG: /desc = "Oligodesoxyribonukleotid"
(üi) HYPOTHETISCH: NEIN
(ix) MERKMAL:
(A) NAME SCHLÜSSEL: misc_feature
(B) LAGE: 15
(D) SONSΗGE ANGABEN:/note= "markiert am 5'-Phosphat mit Digoxigenin über Aminolinker (Boehringer Mannheim GmbH, BRD)"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 5:
TAGTTGTCAC GTACA 15 (2)ANGABENZUSEQIDNO:6:
(i)SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 15 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS. Sonstige Nueleinsäure
(A) BESCHREIBUNG: /desc = "Oligodesoxyribonukleotid"
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/ SCHLÜSSEL: misc eature
(B) LAGE: 15
(D) SONSTIGE ANGABEN:/note= "markiert am 5'-Phosphat mit Digoxigenin über Aminolinker (Boehringer Mannheim GmbH, BRD)"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 6:
TAGTTGTGAT GTACA 15
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 7:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 15 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ü) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN (iv) ANTISENSE: JA
(ix) MERKMAL:
(A) NAME SCHLÜSSEL: Modified-site
(B) LAGE:1
(D) SONSTIGE ANGABEN:/product= "OTHER"
/note= "Xaa is
N-(( 1 -thyminyl)acetyl)-N-(2-amino(N'-tri( 8-amino-3 , 6-dioxa-octano- 1 -y 1))- ethyl)-beta-alanine"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modified-site
(B) LAGE:2
(D) SONSTIGE ANGABEN:/product= "OTHER" /note= "Xaa is N-(( 1 -guaninyl)acetyl)-N-(2-aminoethyl)-beta-alanine"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modified-site
(B) LAGE:3
(D) SONSTIGE ANGABEN:/product= "OTHER" /note= "Xaa is N-(( 1 -thyminyl)acetyl)-N-(2-aminoethyl)-beta-alanine"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modified-site
(B) LAGE:4
(D) SONSTIGE ANGABEN:/product= "OTHER" /note= "Xaa is N-((l-adeninyl)acetyl)-N-(2-aminoethyl)-beta-alanine"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modified-site
(B) LAGE:5
(D) SONSTIGE ANGABEN:/product= "OTHER" /note= "Xaa is
N-(( 1 -cytosyl)acetyl)-N-(2-aminoethyl)-beta-alanine"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME SCHLÜSSEL: Modified-site
(B) LAGE:6
(D) SONSΗGE ANGABEN:/product= "OTHER" /note= "Xaa is N-(( 1 -guaninyl)acetyl)-N-(2-aminoethyl)-beta-alanine"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modified-site
(B) LAGE:7
(D) SONSTIGE ANGABEN:/product= "OTHER" /note= "Xaa is N-(( 1 -thyminyl)acetyl)-N-(2-aminoethyl)-beta-alanine"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modified-site
(B) LAGE:8
(D) SONSTIGE ANGABEN:/product= "OTHER" /note= "Xaa is N-(( 1 -cytosyl)acetyl)-N-(2-aminoethyl)-beta-alanine"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME SCHLÜSSEL: Modified-site
(B) LAGE:9
(D) SONSTIGE ANGABEN:/product= "OTHER" /note= "Xaa is N-(( 1 -adeninyl)acetyl)-N-(2-aminoethyl)-beta-alanine"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modified-site
(B) LAGE.10
(D) SONSTIGE ANGABEN:/product= "OTHER" /note= "Xaa is
N-(( 1 -cytosyl)acetyl)-N-(2-aminoethyl)-beta-alanine"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modified-site
(B) LAGE: 11..12
(D) SONSTIGE ANGABEN:/product= "OTHER" /note= "Xaa is N-(( 1 -adeninyl)acetyl)-N-(2-aminoethyl)-beta-alanine"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modified-site
(B) LAGE: 13
(D) SONSΗGE ANGABEN:/product= "OTHER" /note= "Xaa is N-(( 1 -cytosyl)acetyl)-N-(2-aminoethyl)-beta-alanine"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME SCHLÜSSEL: Modified-site
(B) LAGE: 14
(D) SONSTIGE ANGABEN:/product= "OTHER" /note= "Xaa is N-(( 1 -thyminyl)acetyl)-N-(2-aminoethyl)-beta-alanine''
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modified-site
(B) LAGE: 15
(D) SONSTIGE ANGABEN:/product= "OTHER" /note= "Xaa is N-( 1 -adeninyl)acetyl)-N-(2-aminoethyl)-beta-alanine "
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 7:
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly
1 5 10 15 (2)ANGABENZUSEQIDNO: 8:
(i)SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 30 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Sonstige Nueleinsäure
(A) BESCHREIBUNG: /desc = "Oligodesoxyribonukleotid"
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 8:
TTTTTTTTTT TTTTTTGTAC GTCACAACTA 30
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 9:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 16 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ü) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(ix) MERKMAL:
(A) NAME SCHLÜSSEL: Modified-site (B) LAGE:1
(D) SONSΗGE ANGABEN:/product= "OTHER" /note= "Xaa is N-(( 1 -thyminyl)acetyl)-N-(2-amino(N'-nona(8-amino-3 ,6-dioxa-octano- 1 -yl))- ethyl)-beta-alanine"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modified-site
(B) LAGE:2
(D) SONSTIGE ANGABEN:/product= "OTHER" /note= "Xaa is N-(( 1 -guaninyl)acetyl)-N-(2-aminoethyl)-beta-alanine"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modified-site
(B) LAGE:3
(D) SONSTIGE ANGABEN:/product= "OTHER" /note= "Xaa is N-(( 1 -thyminyl)acetyl)-N-(2-aminoethyl)-beta-alanine"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modified-site
(B) LAGE:4
(D) SONSTIGE ANGABEN:/product= "OTHER" /note= "Xaa is N-(( 1 -adeninyl)acetyl)-N-(2-aminoethyl)-beta-alanine"
(ix) MERKMAL.
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modified-site
(B) LAGE: 5
(D) SONSTIGE ANGABEN:/product= "OTHER" /note= "Xaa is N-(( 1 -cytosyl)acetyl)-N-(2-aminoethyl)-beta-alanine"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modified-site
(B) LAGE:6
(D) SONSTIGE ANGABEN:/product= "OTHER" /note= "Xaa is
N-(( 1 -guaninyl)acetyl)-N-(2-aminoethyl)-beta-alanine"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME SCHLÜSSEL: Modified-site
(B) LAGE:7
(D) SONSTIGE ANGABEN:/product= "OTHER" /note= "Xaa is N-(( 1 -thyminyl)acetyl)-N-(2-aminoethyl)-beta-alanine"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME SCHLÜSSEL: Modified-site
(B) LAGE:8
(D) SONSTIGE ANGABEN:/product= "OTHER" /note= "Xaa is N-(( 1 -cytosyl)acetyl)-N-(2-aminoethyl)-beta-alanine"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME SCHLÜSSEL: Modified-site
(B) LAGE:9
(D) SONSTIGE ANGABEN:/product= "OTHER" /note= "Xaa is N-(( 1 -adeninyl)acetyl)-N-(2-aminoethyl)-beta-alanine"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modified-site
(B) LAGE: 10
(D) SONSTIGE ANGABEN:/product= "OTHER" /note= "Xaa is N-(( 1 -cytosyl)acetyl)-N-(2-aminoethyl)-beta-alanine"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modified-site
(B) LAGE: 11 .12
(D) SONSTIGE ANGABEN:/product= "OTHER" /note= "Xaa is
N-(( 1 -adeninyl)acetyl)-N-(2-aminoethyl)-beta-alanine"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modified-site
(B) LAGE: 13
(D) SONSTIGE ANGABEN:/product= "OTHER" /note= "Xaa is N-(( 1 -cytosyl)acetyl)-N-(2-aminoethyl)-beta-alanine"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modified-site
(B) LAGE: 14
(D) SONSTIGE ANGABEN:/product= "OTHER" /note= "Xaa is N-(( 1 -thyminyl)acetyl)-N-(2-aminoethyl)-beta-alanine "
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modified-site
(B) LAGE: 15
(D) SONSTIGE ANGABEN:/product= "OTHER" /note= "Xaa is N-( l-adeninyl)acetyl)-N-(2-aminoethyl)-beta-alanine "
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 9:
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly
1 5 10 15
(2)ANGABENZUSEQIDNO: 10:
(i)SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 30 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang (D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Sonstige Nueleinsäure
(A) BESCHREIBUNG: /desc = "Oligodeoxyribonikleotid"
(iü) HYPOTHETISCH: NEIN
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 10:
TTTTTTTTTT TTTTTTGTAC GTGACAACTA 30
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 11 :
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 30 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Sonstige Nueleinsäure
(A) BESCHREIBUNG: /desc = "Oligodeoxyribonukleotid"
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 11 :
TTTTTTTTTT TTTTTTGTAC ATCACAACTA 30
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 12:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 17 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear (ii) ART DES MOLEKÜLS: Sonstige Nueleinsäure
(A) BESCHREIBUNG: /desc = "Oligodeoxyribonukleotid"
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 12:
GTAAAACGAC GGCCAGT 17
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 13:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 17 Basenpaare
(B) ART. Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKδLS: Sonstige Nueleinsäure
(A) BESCHREIBUNG: /desc = "Oligodeoxyribonukleotid"
(üi) HYPOTHETISCH: NEIN
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/ SCHLÜSSEL: misc_feature
(B) LAGE:1
CD) SONSTIGE ANGABEN :/note= "A am 5'-Terminus ist mit Aminomodifier
(Boehringer Mannheim GmbH) an Digoxigenin gebunden"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 13:
AACAGCTATG ACCATGA 17

Claims

Patentansprüche
1. Fester Träger, an dessen Oberfläche an unterschiedlichen Stellen zwei oder mehr Nu¬ kleinsaureanaloge unterschiedlicher Basensequenz gebunden sind.
2. Träger gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäureanalogen kovalent gebunden sind.
3. Träger gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäureanalogen über einen Linker von mehr als 15 Atomen und weniger als 200 Atomen Länge gebunden sind.
4. Träger gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der feste Träger eine nicht geladene und/oder hydrophile Oberfläche hat.
5. Verfahren zum sequenzspezifischen Nachweis einer Nukleinsäure durch
- Inkontaktbringen einer nukleinsäurehaltigen Probe mit den Stellen auf der Ober¬ fläche eines Trägers gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei mindestens ein Nukleinsäureanaloges eine Basensequenz aufweist, die komplementär zu einer Basensequenz der nachzuweisenden Nukleinsäure ist und wobei mindestens ein weiteres Nukleinsäureanaloges eine Basensequenz aufweist, die nicht zu einer Basensequenz der nachzuweisenden Nukleinsäure komplementär ist, unter Bedin¬ gungen bei denen die nachzuweisende Nukleinsäure an das Nukleinsaureanaloge bindet;
- Bestimmung der stattgefundenen Bindung an der vorbestimmten Stelle als ein Zeichen der Anwesenheit der nachzuweisenden Nukleinsäure.
6. Verfahren gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Bedingungen, bei denen die nachzuweisende Nukleinsäure an das Nukleinsaureanaloge bindet, die An¬ wesenheit von weniger als 100 mM Salzen bedeuten.
7. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß die nachzuweisende Nukleinsäure Resultat einer Nukleinsäure- Amplifikationsreaktion ist.
8. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Nu¬ kleinsäure nachweisbar markiert ist.
9. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die statt¬ gefundene Bindung mit Hilfe eines interkalierenden Agens nachgewiesen wird.
10. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die statt¬ gefundene Bindung mit Hilfe eines nachweisbar markierten Antikörpers gegen das Bindungsprodukt nachgewiesen wird.
11. Verfahren zum selektiven Nachweis von Mutanten von Nukleinsäuren in Gegenwart eines großen Überschusses von nicht-mutanten Nukleinsäuren, dadurch gekenn¬ zeichnet, daß die nukleinsäurehaltige Probe mit einem Träger gemäß Anspruch 1 in Kontakt gebracht wird und die Bindung der mutanten Nukleinsäuren oder/und der nicht-mutanten Nukleinsäuren an unterschiedliche Stellen bestimmt wird.
12. Verfahren zur Bestimmung der relativen Menge einer mutanten und einer normalen Nukleinsäure durch Inkontaktbringen einer nukleinsäurehaltigen Probe mit einem festen Träger gemäß Anspruch 1 und Ableitung einer Information für die Menge an mutanten Nukleinsäuren durch Vergleich der gebundenen mutanten Nukleinsäure und nicht-mutanten Nukleinsäure.
13. Verwendung eines festen Trägers gemäß Anspruch 1 zur quantitativen Bestimmung von Nukleinsäuren.
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