DE69434066T2

DE69434066T2 - Verfahren zur immobilisierung von nukleinsäuremolekülen

Info

Publication number: DE69434066T2
Application number: DE69434066T
Authority: DE
Inventors: Theo Nikiforov; R. Michael KNAPP
Original assignee: Beckman Coulter Inc
Current assignee: Beckman Coulter Inc
Priority date: 1993-12-06
Filing date: 1994-12-06
Publication date: 2006-03-09
Anticipated expiration: 2014-12-07
Also published as: US5610287A; EP0684952A1; AU682741B2; WO1995015970A1; EP0684952A4; ATE279427T1; CA2155634A1; EP0684952B1; DE69434066D1; AU1303295A

Description

Die Erfindung betrifft ein einfaches Verfahren zum Immobilisieren synthetischer Nucleinsäuremoleküle auf einem Träger. Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung solcher immobilisierter Moleküle in Nucleinsäure-Hybridisierungstests, bei der Nucleinsäuresequenzierung und bei der Analyse genomischer Polymorphismen.
Die Analyse der Struktur, der Organisation und der Sequenz von Nucleinsäuremolekülen ist von entscheidender Bedeutung bei der Vorhersage, Diagnose und Behandlung von Erkrankungen des Menschen und von Tieren, in der Forensik, in der Epidemiologie und im Gesundheitswesen, sowie bei der Ermittlung der Faktoren, welche die Genexpression und -entwicklung steuern. Bei diesen Analysearten sind häufig Verfahren zur Immobilisierung von Nucleinsäuren wichtig. Drei besonders wichtige Bereiche umfassen Hybridisierungstests, die Nucleinsäuresequenzierung und die Analyse genomischer Polymorphismen.
I. Nucleinsäurehybridisierung
Das Vermögen eines Nucleinsäure-"Sonden"-Moleküls, an ein komplementäres Nucleinsäure-"Ziel"-Molekül zu hybridisieren (d. h. eine Basenpaarung hervorzurufen) bildet die Grundlage für viele verschiedene diagnostische und therapeutische Verfahren.
Hybridisierungstests werden in der Molekularbiologie und der Medizin sehr häufig verwendet. Verfahren zur Durchführung solcher Hybridisierungsreaktionen sind z. B. von Sambrook et al., (in: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989)), B. D. Haymes et al. (in: Nucleic Acid Hybridisation, A Practical Approach, IRL Press, Washington, DC (1985)) und G. H. Keller und M. M. Manak (in: DNA Probes, zweite Auflage, Stockton Press, New York, NY (1993)) beschrieben worden, wobei diese Literatur unter Bezugnahme in diese Beschreibung einbezogen wird.
Viele Hybridisierungstests erfordern die Immobilisierung einer Komponente. Nagata et al. haben ein Verfahren zur Quantifizierung von DNA beschrieben, welches das Binden unbekannter Mengen klonierter DNA an Mikrotiter-Wells in Gegenwart von 0,1 M MgCl₂ umfasst (Nagata et al., FEBS Letters 183, 379–382, 1985). Eine komplementäre biotinylierte Sonde wurde dann an die DNA in jedem Well hybridisiert und die gebundene Sonde wurde kolorimetrisch gemessen. P. Dahlen et al. haben eine Sandwich-Hybridisierung in Mikrotiter-Wells unter Verwendung einer geklonten Einfang-DNA, die an den Wells adsorbiert war, diskutiert (P. Dahlen et al., Mol. Cell. Probes 1, 159–168, 1987). Es wurde auch ein Test zur Erfassung von HIV-1-DNA unter Verwendung einer PCR-Amplifizierung und einer Einfang-Hybridisierung in Mikrotiter-Wells diskutiert (G. H. Keller et al., J. Clin. Microbiol. 29, 638–641, 1991). Keller et al. haben auch die Verwendung eines solchen Tests zum Nachweisen von Hepatitis B-DNA diskutiert (G. H. Keller et al., J. Clin. Microbiol. 28, 1411–1416, 1990). Das NaCl-vermittelte Binden von Oligomeren an Polystyrol-Wells wurde von Cros et al. (FR-Patent 2,663,040) und kürzlich von Nikiforov et al. diskutiert (PCR Methods Applic. 3, 285–291, 1994). Das durch ein kationisches Detergenz vermittelte Binden von Oligomeren an Polystyrol-Wells wurde kürzlich von Nikiforov et al., Nucleic Acids Res. 22, 4167–4175 beschrieben.
II. Analyse von Einzelnucleotid-DNA-Polymorphismen
Viele genetische Erkrankungen und Merkmale (d. h. Hämophilie, Sichelzellenanämie, cystische Fibrose, usw.) spiegeln die Folgen von Mutationen wieder, die in den Genomen einiger Mitglieder einer Art durch Mutation oder Evolution aufgetreten sind (J. F. Gusella, Ann. Rev. Biochem. 55, 831–854 (1986)). In manchen Fällen sind solche Polymorphismen mit einem genetischen Ort verbunden, der für die Erkrankung oder das Merkmal verantwortlich ist. In anderen Fällen sind die Polymorphismen die bestimmende Charakteristik des Zustands.
Solche Einzelnucleotid-Polymorphismen unterscheiden sich signifikant von den Polymorphismen des variablen Nucleotidtyps ("VNTRs"), die sich aus spontanen Tandemwiederholungen von Di- oder Trinucleotid-Wiederholungsmotiven von Nucleotiden ergeben (J. L. Weber, US-Patent 5,075,217; J. A. L. Armour et al., FEBS Lett. 307, 113–115 (1992); L. Jones et al., Eur. J. Haematol. 39, 144–147 (1987); G. T. Horn et al., PCT-Anmeldung WO 91/14003; A. J. Jeffreys, US-Patent 5,175,082; A. J. Jeffreys et al., Amer. J. Hum. Genet. 39, 11–24 (1986); A. J. Jeffreys et al., Nature 316, 76–79 (1985); I. C. Gray et al., Proc. R. Acad. Soc. Lond. 243, 241–253 (1991); S. S. Moore et al., Genomics 10, 654–660 (1991); A. J. Jeffreys et al., Anim. Genet. 18, 1–15 (1987); J. Hillel et al., Anim. Genet. 20, 145–155 (1989); J. Hillel et al., Genet. 124, 783–789 (1990)) und von den Restriktionsfragmentlängen-Polymorphismen ("RFLP's"), die Variationen umfassen, welche die Längen der Fragmente verändern, die durch eine Spaltung mit Restriktionsendonuklease erzeugt werden (J. Glassberg, GB-Patentanmeldung 2135774; M. H. Skolnick et al., Cytogen. Cell Genet. 32, 58–67 (1982); D. Botstein et al., Ann. J. Hum. Genet. 32, 314–331 (1980); S. G. Fischer et al. (PCT-Anmeldung WO 90/13668); M. Uhlen (PCT-Anmeldung WO 90/11369)).
Da Einzelnucleotid-Polymorphismen Variationsstellen bilden, die von Regionen mit einer unveränderten Sequenz umgeben sind, erfordert deren Analyse nicht mehr als die Bestimmung der Identität des einzelnen Nucleotids, das an der Variationsstelle vorliegt. Es ist nicht erforderlich, für jeden Patienten eine vollständige Gensequenz zu bestimmen. Es wurden mehrere Verfahren entwickelt, um die Analyse solcher Einzelnucleotid-Polymorphismen zu erleichtern.
Beispielsweise diskutiert C. R. Mundy (US-Patent 4,656,127) ein Verfahren zur Bestimmung der Identität des Nucleotids, das an einer bestimmten polymorphen Stelle vorliegt, bei dem ein spezifisches, Exonuclease-beständiges Nucleotidderivat eingesetzt wird. Ein Primer, der zu der allelischen Sequenz unmittelbar 3' zu der polymorphen Stelle komplementär ist, wird an ein Zielmolekül hybridisieren gelassen, das von einem speziellen Tier oder Menschen erhalten worden ist. Wenn die polymorphe Stelle auf dem Zielmolekül ein Nucleotid enthält, das zu dem speziellen vorliegenden Exonuclease-beständigen Nucleotidderivat komplementär ist, dann wird dieses Derivat am Ende des hybridisierten Primers eingebaut. Ein solcher Einbau macht den Primer gegen Exonuclease beständig und ermöglicht daher dessen Nachweis bzw. Erfassung. Da die Identität des Exonuclease-beständigen Derivats der Probe bekannt ist, legt das Ergebnis, dass der Primer gegen Exonucleasen beständig geworden ist, nahe, dass das in der polymorphen Stelle des Zielmoleküls vorliegende Nucleotid zu dem Nucleotid des in der Reaktion verwendeten Nucleotidderivats komplementär ist. Das Mundy-Verfahren hat den Vorteil, dass es nicht die Bestimmung großer Mengen irrelevanter Sequenzdaten erfordert. Es hat die Nachteile, dass die amplifizierten Zielsequenzen zerstört werden und dass unmodifizierte Primer bezüglich der Geschwindigkeit des Polymeraseeinbaus des spezifischen verwendeten Exonuclease-beständigen Nucleotids extrem empfindlich sind.
D. Cohen et al. (FR-Patent 2,650,840; PCT-Anmeldung WO 91/02087) diskutieren ein Verfahren auf Lösungsbasis zur Bestimmung der Identität des Nucleotids einer polymorphen Stelle. Wie in dem Mundy-Verfahren des US-Patents 4,656,127 wird ein Primer eingesetzt, der zu allelischen Sequenzen unmittelbar 3' zu einer polymorphen Stelle komplementär ist. Das Verfahren bestimmt die Identität des Nucleotids dieser Stelle unter Verwendung markierter Didesoxynucleotid-Derivate, die, wenn sie zu dem Nucleotid der polymorphen Stelle komplementär sind, in die Endgruppe des Primers eingebaut werden.
Ein alternatives Verfahren, das als genetische Bit-Analyse oder GBA^TM bekannt ist, wurde von P. Goelet et al. beschrieben (PCT-Anmeldung WO 92/15712). Das Verfahren von P. Goelet et al. nutzt Gemische markierter Terminatoren und eines Primers, der zu der Sequenz 3' zu einer polymorphen Stelle komplementär ist. Der eingebaute markierte Terminator wird folglich durch das Nucleotid, das in der polymorphen Stelle des zu bewertenden Zielmoleküls vorliegt, und komplementär zu diesem ist, bestimmt. Im Gegensatz zu dem Verfahren von Cohen et al. (FR-Patent 2,650,840; PCT-Anmeldung WO 91/02087) ist das Verfahren von P. Goelet et al. vorzugsweise ein Test in einer heterogenen Phase, in welcher der Primer oder das Zielmolekül an einer festen Phase immobilisiert ist. Das Verfahren von Goelet et al. ist deshalb einfacher durchzuführen und genauer als das Verfahren, das von Cohen diskutiert worden ist.
Ein alternativer Ansatz, der "Oligonucleotid-Ligationstest" ("OLA") (U. Landegren et al., Science 241, 1077–1080 (1988)), wurde ebenfalls so beschrieben, dass er Einzelnucleotid-Polymorphismen nachweisen bzw. erfassen kann. Das OLA-Protokoll nutzt zwei Oligonucleotide, die so gestaltet sind, dass sie an aneinanderstoßende Sequenzen eines Einzelstrangs eines Ziels hybridisieren können. Eines der Oligonucleotide ist biotinyliert und das andere ist nachweisbar markiert. Wenn in einem Zielmolekül die genau komplementäre Sequenz gefunden wird, werden die Oligonucleotide derart hybridisieren, dass deren Endgruppen aneinander stoßen, und ein Ligationssubstrat erzeugen. Die Ligation ermöglicht dann, dass das markierte Oligonucleotid unter Verwendung von Avidin oder eines anderen Biotinliganden gewonnen werden kann. D. A. Nickerson et al. haben einen Nucleinsäure-Nachweistest beschrieben, der die Merkmale von PCR und OLA kombiniert (D. A. Nickerson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 87, 8923–8927 (1990). Bei diesem Verfahren wird die PCR eingesetzt, um die exponentielle Amplifizierung einer Ziel-DNA zu erreichen, die dann unter Verwendung von OLA nachgewiesen wird. Zusätzlich dazu, dass solche Kombinationen mehrere und separate Verarbeitungsschritte erfordern, besteht ein Problem bei solchen Kombinationen darin, dass sie nach wie vor alle Probleme aufweisen, die mit PCR und OLA zusammenhängen.
Kürzlich wurden mehrere Primer-geführte Nucleotideinbauverfahren zum Testen polymorpher Stellen in DNA beschrieben (J. S. Komher et al., Nucl. Acids Res. 17, 7779–7784 (1989); B. P. Sokolov, Nucl. Acids Res. 18, 3671 (1990); A.-C. Syvänen et al., Genomics 8, 684–692 (1990); M. N. Kuppuswamy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88, 1143–1147 (1991); T. R. Prezant et al., Hum. Mutat. 1, 159–164 (1992); L. Ugozzoli et al., GATA 9, 107–112 (1992); P. Nyrén et al., Anal. Biochem. 208, 171–175 (1993)). Diese Verfahren unterscheiden sich von GBA^TM im Allgemeinen darin, dass sie alle auf dem Einbau markierter Desoxynucleotide zur Unterscheidung zwischen Basen an einer polymorphen Stelle beruhen. Da in einem solchen Format das Signal zu der. Anzahl der eingebauten Desoxynucleotide proportional ist, können Polymorphismen, die in Durchläufen mit dem gleichen Nucleotid auftreten, zu Signalen führen, die zur Länge des Durchlaufs proportional sind (A.-C. Syvänen et al., Amer. J. Hum. Genet. 52, 46–59 (1993)). Ein solcher Bereich ortsspezifischer Signale könnte verglichen mit einer einfachen ternären (2 : 0, 1 : 1 oder 0 : 2) Klasse von Signalen, die von dem GBA^TM-Verfahren erzeugt werden, insbesondere für Heterozygoten, komplexer zu interpretieren sein. Darüber hinaus kann bei einigen Stellen der Einbau eines falschen Desoxynucleotids selbst in der Gegenwart des richtigen Didesoxynucleotids stattfinden (J. S. Komher et al., Nucl. Acids Res. 17, 7779–7784 (1989)). Solche Desoxynucleotid-Fehleinbauereignisse können aufgrund der Km der DNA-Polymerase für das fehlgepaarte Desoxysubstrat stattfinden, die in manchen Fällen mit der relativ schlechten Km selbst eines korrekt gepaarten Didesoxysubstrats vergleichbar sind (A. Kornberg et al., in: DNA Replication, zweite Auflage (1992), W. H. Freeman and Company, New York; S. Tabor et al, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86, 4076–4080 (1989)). Dieser Effekt würde zu dem Hintergrundrauschen beim Abfragen der polymorphen Stelle beitragen.
III. Oligonucleotid-Immobilisierung auf Kunststoff und Glas
Mehrere der vorstehend beschriebenen Verfahren umfassen Vorgänge, bei denen einer oder mehrere der Nucleinsäurereaktanten an einem Träger immobilisiert wird bzw. werden. Gegenwärtig werden 96-Well-Polystyrolplatten in Festphasenimmuntests verbreitet verwendet, und mehrere PCR-Produktnachweisverfahren, bei denen Platten als Träger eingesetzt werden, sind beschrieben worden. Das spezifischste dieser Verfahren erfordert die Immobilisierung einer geeigneten Oligonucleotidsonde in den Mikrotiter-Wells, worauf das PCR-Produkt durch Hybridisierung eingefangen und ein geeignetes Hapten kolorimetrisch nachgewiesen wird. Es wäre vorteilhaft, wenn ein verbessertes Immobilisierungsverfahren zur Verfügung stehen würde, das zum Binden von Oligonucleotiden an Polystyrol derart verwendet werden könnte, dass deren Vermögen, zum Hybridisieren, Sequenzieren oder für eine Polymorphieanalyse verwendet zu werden, beibehalten wird, und das schnell, bequem einzusetzen und billig ist. Die vorliegende Erfindung stellt ein solches Verfahren bereit.
Der Mechanismus, mit dem Makromoleküle nicht-kovalent an Polystyrol- und Glasoberflächen binden, ist nicht genau bekannt. Trotzdem haben sich diese Adsorptionsphänomene bei der Entwicklung und Herstellung von Immuntests und anderer Arten diagnostischer Tests, bei denen eine Komponente immobilisiert werden muss, als wichtig erwiesen.
Polystyrol ist ein sehr hydrophobes Material, da es gewöhnlich keine hydrophilen Gruppen enthält. Mikrotiterplattenhersteller haben Verfahren zum Einführen solcher Gruppen (Hydroxyl-, Carboxyl-, Carbonylgruppen und andere Gruppen) auf der Oberfläche von Mikrowells entwickelt, um die Hydrophilie der Oberfläche zu erhöhen. Theoretisch ermöglicht dies, dass Makromoleküle durch eine Kombination aus hydrophoben und hydrophilen Wechselwirkungen binden (Baier et al., Science 162, 1360–1368 (1968); Baier et al., J. Biomed. Mater. Res. 18, 335–355 (1984); Good et al., in L. H. Lee (Hrsg.) Fundamentals of Adhesion, Plenum, New York, Kapitel 4 (1989)) (1). In der Praxis binden einige Proteine effizienter an das behandelte hydrophile Styrol als an das unbehandelte Material. Eine kovalente Bindung an Polystyrol, insbesondere an Mikrotiter-Wells, hat sich als schwierig erwiesen, so dass die passive Adsorption das am gebräuchlichsten verwendete Verfahren zum Binden von Makromolekülen an solche Wells bleibt. Der Begriff "Polystyrol" kann auch verwendet werden, um Styrol-enthaltende Copolymere wie z. B. Styrol/Divinylbenzol, Styrol/Butadien, Styrol/Vinylbenzylchlorid und andere Copolymere zu beschreiben.
Während Polystyrol ein organisches hydrophobes Substrat ist, stellt Glas eine anorganische hydrophobe Oberfläche mit hydrophilen Inseln bereit. Das in Immuntests gebräuchlichste Glasformat ist der Mikroskop-Objektträger. Gläser in Laborqualität sind vorwiegend aus SiO₂ zusammengesetzt, können jedoch auch B₂O₃, Na₂O, Al₂O₃ sowie andere Oxide enthalten (2).
Die vorliegende Erfindung stellt ein verbessertes Immobilisierungsverfahren bereit, das die schnelle und billige Immobilisierung von Nucleinsäuremolekülen an einem Träger ermöglicht. Die Erfindung ist extrem einfach und ermöglicht eine Immobilisierung von Oligonucleotiden durch eine Inkubation mit einem Salz oder einem kationischen Detergenz. Die immobilisierten Moleküle können zur Hybridisierung, Sequenzierung oder für eine Polymorphismus-Analyse verwendet werden.
Die Erfindung stellt ein Verfahren zum Immobilisieren eines synthetischen Nucleinsäuremoleküls auf einem Träger, der ein hydrophiler Polystyrolträger, der eine Gruppe umfasst, die aus -OH, -C=O und -COOH ausgewählt ist, oder ein Glasträger ist, bereit, wobei das Verfahren umfasst:

(a) Inkubieren des Trägers mit einer Lösung, die das Nucleinsäuremolekül und
(1) ein kationisches Detergenz, das aus 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-1,3-carbodiimid-hydrochlorid, das in einer Konzentration von etwa 30 mM bis etwa 100 mM bereitgestellt ist, und Octyldimethylamin-hydrochlorid, das in einer Konzentration von etwa 50 mM bis etwa 150 mM bereitgestellt ist, ausgewählt ist, oder
(2) NaCl, das in einer Konzentration von etwa 50 mM bis etwa 250 mM bereitgestellt ist, umfasst, um dadurch die Nucleinsäure nicht-kovalent an dem Träger zu immobilisieren, wobei dann,
(i) wenn das kationische Detergenz 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-1,3-carbodiimid-hydrochlorid ist, der Träger aus Glas und hydrophilem Polystyrol ausgewählt ist,
(ii) wenn das kationische Detergenz Octyldimethylamin-hydrochlorid ist, der Träger hydrophiles Polystyrol ist,
(iii) wenn die Lösung NaCl enthält, der Träger hydrophiles Polystyrol ist, und
(b) anschließend Waschen des Trägers mit einer wässrigen Lösung.

Demgemäß betrifft die vorliegende Erfindung auch einen hydrophilen Polystyrol- oder Glasträger, auf dem unter Verwendung eines erfindungsgemäßen Verfahrens ein Nucleinsäuremolekül immobilisiert worden ist.
In einer Ausführungsform ist die wässrige Lösung im Schritt (b) eine wässrige Lösung eines nicht-ionischen Detergenzes.
Die Erfindung betrifft insbesondere die Ausführungsformen des vorstehenden Verfahrens, bei dem im Schritt (a) das kationische Detergenz das wasserlösliche 1-Ethyl-3-(3'-dimethylaminopropyl)-3,3-carbodiimid-hydrochlorid (EDC) ist, das in einer Konzentration von etwa 30 mM bis etwa mM bereitgestellt wird, oder bei dem das kationische Detergenz Octyldimethylamin ist, das in einer Konzentration von etwa 50 mM bis etwa 150 mM bereitgestellt wird.
Die Erfindung betrifft ferner die Ausführungsformen der vorstehenden Verfahren, bei denen im Schritt (b) die wässrige Lösung das nicht-ionische Detergenz Tween^TM enthält, das vorzugsweise in einer Lösung bereitgestellt wird, die zusätzlich gepufferte Kochsalzlösung enthält.
Die Erfindung betrifft zusätzlich die Ausführungsformen der vorstehenden Verfahren, bei denen das Nucleinsäuremolekül eine Länge von mindestens 12 Nucleotidresten und bis zu 100 Reste und ein 3'- und ein 5'-Ende aufweist, und bei dem solche Moleküle an dem Träger durch nicht-kovalente Wechselwirkungen am 3'-Ende, an einem internen Bereich oder am 5'-Ende des Oligonucleotids immobilisiert werden.
Die Erfindung betrifft ferner die Ausführungsformen der vorstehenden Verfahren, bei denen die Oligonucleotide in einem spezifischen Muster oder Gitter mittels Mikroabscheidungsver fahren wie z. B. Tintenstrahldrucken auf den Träger aufgebracht werden. Eine weitere Ausführungsform umfasst die Immobilisierung von Oligonucleotiden an Polystyrolstiften, die in einer Matrix angeordnet sind, die zu einer Standard-96-Well-Platte passt.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren bereit, welches das nicht-kovalente Immobilisieren eines synthetischen Nucleinsäuremoleküls, das ein spezifisches Polynucleotid ist, auf einem Träger, der ein hydrophiler Polystyrolträger, der eine Gruppe umfasst, die aus -OH, -C=O und -COOH ausgewählt ist, oder ein Glasträger ist, durch die Durchführung der Schritte (a) und (b) eines der Ansprüche 1 bis 16 und zusätzlich

(ai) das Einfangen mindestens eines Strangs eines spezifischen Polynucleotidanalyten aus der Lösung durch Hybridisieren an das immobilisierte Polynucleotid, und
(bi) das Nachweisen der Gegenwart des eingefangenen Analyten, oder
(aii) das Amplifizieren einer spezifischen Region eines spezifischen Genoms unter Verwendung einer Polymerasekettenreaktion, wobei die Region des Genoms eine Sequenz aufweist, die zu dem immobilisierten Polynucleotid komplementär ist,
(bii) das Einfangen mindestens eines Strangs des Amplifizierungsprodukts aus der Lösung durch Hybridisieren an das immobilisierte Polynucleotid, und
(cii) das Nachweisen der Gegenwart des eingefangenen Amplifizierungsprodukts, oder
(aiii) das Inkubieren einer Nucleinsäureprobe eines Zielorganismus, der einen Einzelnucleotidpolymorphismus aufweist, in Gegenwart des immobilisierten Polynucleotidprimers und mindestens eines Didesoxynucleotidderivats unter Bedingungen, die ausreichend sind, um eine Polymerase-vermittelte, Templatabhängige Verlängerung des Primers zuzulassen, wobei die Verlängerung den Einbau eines einzelnen Didesoxynucleotids in das 3'-Ende des Primers verursacht, wobei das einzelne Didesoxynucleotid zu dem einzelnen Nucleotid der polymorphen Stelle des Polymorphismus komplementär ist,
(biii) Zulassen der Templat-abhängigen Verlängerung des Primermoleküls und des Einbaus des einzelnen Didesoxynucleotids, und
(ciii) Bestimmen der Identität des in die polymorphe Stelle eingebauten Didesoxynucleotids umfasst, wobei das identifizierte Nucleotid zu dem Nucleotid der polymorphen Stelle komplementär ist.

Die 1 veranschaulicht das Binden eines generischen Makromoleküls an eine hydrophile Polystyroloberfläche.
Die 2 veranschaulicht das Binden eines generischen Makromoleküls an eine typische Glasoberfläche.
Die 3 ist ein Diagramm eines GBA^TM genetischen Bit-Analyseprotokolls.
Die 4 veranschaulicht den Effekt der TMAC-Konzentration auf das Binden eines Oligonucleotids an Polystyrol.
Die 5 veranschaulicht den Effekt der CTAB-Konzentration auf das Binden eines Oligonucleotids an Polystyrol.
I. Immobilisierung von Nucleinsäuremolekülen
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Immobilisierung eines synthetischen Nucleinsäuremoleküls auf einem Träger. Kürzlich wurden verschiedene Verfahren vorgeschlagen, die zum Immobilisieren eines Oligonucleotids an einem Träger geeignet sind. K. Holmstrom et al. nutzen beispielsweise die Affinität von Biotin für Avidin und Streptavidin und immobilisieren biotinylierte Nucleinsäuremoleküle an einem Avidin/Streptavidin-beschichteten Träger (K. Holmstrom et al., Anal. Biochem. 209, 278–283 (1993)). Ein anderes neueres Verfahren erfordert das Vorbeschichten der Polystyrol- oder Glasfestphasen mit poly-L-Lys oder poly-L-Lys, Phe und anschließender kovalenter Bindung entweder von Amino- oder Sulfhydryl-modifizierter Oligonucleotide unter Verwendung bifunktioneller Vernetzungsmittel. Beide Verfahren haben den Nachteil, dass sie die Verwendung modifizierter Oligonucleotide als auch eine Vorbehandlung der festen Phase erfordern (J. A. Running et al., BioTechniques 8, 276–277 (1990); C. R. Newton et al., Nucl. Acids Res. 21, 1155–1162 (1993)).
S. Kawai et al. beschreiben ein alternatives Verfahren, bei dem kurze Oligonucleotidsonden unter Bildung von Multimeren zusammenligiert worden sind und diese wurden in einen Phagemidvektor ligiert (S. Kawai et al., Anal. Biochem. 209, 63–69 (1993)). Die Oligonucleotide wurden auf Polystyrolplatten immobilisiert und durch UV-Bestrahlung bei 254 nm fixiert. Ein Verfahren zur direkten kovalenten Bindung kurzer 5'-phosphorylierter Primer an chemisch modifizierte Polystyrolplatten ("Covalink"-Platten, Nunc) wurde ebenfalls von S. R. Rasmussen et al. vorgeschlagen (Anal. Biochem. 198, 138–142 (1991)). Die kovalente Bindung zwischen dem modifizierten Oligonucleotid und der Festphasenoberfläche wird durch die Kon densation mit einem wasserlöslichen Carbodiimid eingeführt. Von diesem Verfahren wird gesagt, dass es eine vorwiegende 5'-Bindung der Oligonucleotide über ihre 5'-Phosphate sicherstellt. Es erfordert jedoch die Verwendung speziell hergestellter, teurer Platten.
Die erfindungsgemäßen Verfahren weichen dahingehend von diesen Verfahren ab, dass sie weder die Gegenwart speziell modifizierter Nucleotide in dem zu immobilisierenden Molekül, noch die Verwendung teurer modifizierter Träger erfordern. Unter Verwendung der erfindungsgemäßen Verfahren kann jegliches Nucleinsäuremolekül (RNA oder DNA) an solchen Trägern immobilisiert werden. Die Nucleinsäuremoleküle können Idealerweise 12 bis 100 Nucleotide lang sein und sie können an dem Träger an ihrem 3'-Ende, ihrem 5'-Ende oder an einem internen (d. h. nicht-endständigen) Bereich immobilisiert werden.
Ein Nucleinsäuremolekül gilt an einem Träger als "immobilisiert", wenn es mit einer ausreichenden Stärke entweder an dem Träger adsorbiert oder daran gebunden ist, so dass es durch Waschen mit Wasser oder einem wässrigen Puffer nicht durch Waschen von dem Träger entfernt werden kann. Zur Verwendung der vorliegenden Erfindung ist die Kenntnis des genauen chemischen Mechanismus, durch den eine solche Immobilisierung stattfindet, nicht erforderlich.
Obwohl gemäß den Verfahren der vorliegenden Erfindung viele verschiedene Glas- oder Kunststoffträger verwendet werden können, ist Polystyrol der bevorzugte Träger. Der Träger kann als Kügelchen, Eintauchstab, Reagenzglas, usw., gestaltet werden. Die herkömmlichen 96-Well-Polystyrol-Mikrotiterplatten, die in diagnostischen Laboratorien und in der Gewebekultur verwendet werden, sind jedoch ein besonders bevorzugter Träger. Es können beliebige käufliche Polystyrolplatten direkt zur Immobilisierung verwendet werden, mit der Maßgabe, dass sie auf der Kunststoffoberfläche hydrophile Gruppen aufweisen. Beispiele für geeignete Platten umfassen die Immulon 4^TM-Platten (Dynatech) und die Maxisorp^TM-Platten (Nunc). Verfahren zur Synthese von Polystyrol sind bekannt. Solche Verfahren sind z. B. in Abhandlungen über Kunststoffe und Polymere beschrieben, wie z. B. J. A. Byrdson, Plastics Material, 5. Auflage, Butterworth Heinemann, London (1991), das in die vorliegende Beschreibung unter Bezugnahme einbezogen wird.
Es sollte beachtet werden, dass in dem erfindungsgemäßen Verfahren unmodifizierte Oligonucleotide auf der Oberfläche einer hydrophilen Polystyrolplatte einfach durch Inkubieren in der Gegenwart eines von zwei verschiedenen Gruppen von Reagenzien, die entweder als Salze oder als kationische Detergenzien charakterisiert werden können, effizient immobilisiert werden können. Eine hydrophile Polystyrolplatte ist als Polystyrolplatte definiert, die vom Hersteller oder Anwender behandelt worden ist, um die Anzahl hydrophiler Gruppen (d. h. -OH, -C=O, -COOH) auf der Oberfläche des Kunststoffs zu erhöhen. Beim Fehlen eines Salzes oder eines kationischen Detergenzes findet keine Immobilisierung statt, d. h. wenn das Oligonucleotid in einer salzfreien Wasserlösung oder einer Wasserlösung ohne kationisches Detergenz vorliegt.
Die erste Gruppe besteht aus Chemikalien wie NaCl und (CH₃)₄NCl, die am besten wirken, wenn sie in relativ hohen Konzentrationen von im Allgemeinen mehr als 50 mM und am besten bei 250 bis 500 mM eingesetzt werden. Selbst so hohe Konzentrationen wie 1 M können ohne feststellbare nachteilige Effekte auf die Immobilisierung eingesetzt werden. Die zweite Gruppe von Immobilisierungsreagenzien besteht aus Chemikalien, die durch die Gegenwart von zwei Strukturmerkmalen gekennzeichnet sind: Einen positiv geladenen "Kopf' und einen relativ hydrophoben "Schwanz". Dabei handelt es sich um die typischen Merkmale kationischer Detergenzien. Beispiele für diese Gruppe umfassen Octyldimethylamin-hydrochlorid und 1-Ethyl-3-(3'-dimethylaminopropyl)-1,3-carbodiimid-hydrochlorid (EDC). Diese Verbindungen können für die Oligonucleotid-Immobilisierung bei sehr niedrigen Konzentrationen eingesetzt werden, jedoch hemmen sie die Immobilisierung, wenn sie bei höheren Konzentrationen eingesetzt werden. Die Hemmkonzentration unterscheidet sich zwischen den Reagenzien dieser Gruppe. Für EDC beträgt sie etwa 500 mM. Folglich scheint die Immobilisierung gehemmt zu werden, sobald Micellen gebildet werden. Verbindungen mit einer ähnlichen Struktur, jedoch mit einem negativ geladenen "Kopf" (oder nicht-ionische Detergenzien) sind als Oligonucleotid-Immobilisierungsreagenzien vollkommen inaktiv. Ein typisches Beispiel dafür ist das anionische Detergenz SDS (Natriumdodecylsulfat), bei dem gefunden wurde, dass es über einen sehr breiten Bereich unterschiedlicher Konzentrationen (0,025 mM bis 100 mM) inaktiv ist.
Es ist vernünftig, anzunehmen, dass die beiden Reagenzgruppen, die vorstehend erläutert worden sind, die Immobilisierung von Oligonucleotiden an Polystyrolplatten durch unterschiedliche Mechanismen fördern. In der Gegenwart von NaCl und anderen Salzen werden die hydrophoben Wechselwirkungen zwischen dem Oligonucleotidmolekül und den hydrophoben Regionen an der Polystyroloberfläche in einem Maß verstärkt, das die Immobilisierung des Oligonucleotidmoleküls ermöglicht wird. Die Gegenwart eines Salzes (erhöhte Ionenstärke der Lösung) vermindert die elektrostatische Abstoßung zwischen den Phosphaten des Oligonucleotid-Grundgerüsts und der negativ geladenen Gruppen an der Polystyroloberfläche. Diese Verminderung sollte die hydrophobe Bindung der Oligonucleotidmoleküle verstärken.
Der Mechanismus der Bindung in der Gegenwart kationischer Detergenzien ist möglicherweise davon ziemlich verschieden. Dabei liegt zu Beginn in der Lösung zwischen den negativ geladenen Oligonucleotiden und den positiv geladenen Detergenz-artigen Molekülen eine Assoziation vor. Die Anzahl der Detergenzmoleküle, die mit jedem Oligonucleotidmolekül assoziieren, wird von der Länge des Oligonucleotids abhängen, sollte in dem Fall eines 25mer-Oligonucleotids jedoch signifikant höher als 1 sein. Diese Assoziation von Oligonucleotiden mit Detergenzien, die einen hydrophoben Schwanz enthalten, wird das Oligonucleotid signifikant hydrophob machen und zu dessen Immobilisierung an der Plattenoberfläche durch hydrophobe Wechselwirkungen führen. Als Folge davon scheinen diese Moleküle als Linker zwischen den hydrophoben Bereichen der Platte und dem geladenen Phosphat-Grundgerüst des Oligonucleotids zu wirken.
Wenn die Konzentration der Detergenzmoleküle höher ist als deren CMC, werden Mizellen gebildet. Obwohl Oligonucleotide nach wie vor mit den Detergenzmolekülen in Wechselwirkung treten können, werden sie in die Mizellen eingeschlossen, und da die Mizellen einen hydrophoben Kern aufweisen, der vollständig von einer polaren Oberfläche umgeben ist, werden keine hydrophoben Wechselwirkungen mit der Oberfläche stattfinden, und daher wird die Oligonucleotid-Immobilisierung vermindert oder verhindert. Die verschiedenen Hemmkonzentrationen, die für die verschiedenen Reagenzien festgestellt werden, geben die stark unterschiedlichen Konzentrationen wieder, bei denen diese Reagenzien Mizellen bilden. EDC und Octyldimethylamin-hydrochlorid, die sehr schlechte Detergenzien sind, bilden nur bei relativ hohen Konzentrationen Mizellen und hemmen dann die Immobilisierung.
Ein Beispiel eines geeigneten Salzes ist Natriumchlorid (NaCl). Wenn NaCl verwendet werden soll, können Konzentrationen von etwa 50 mM bis etwa 250 mM eingesetzt werden. Eine Konzentration von mindestens 50 mM ist bevorzugt, um eine optimale Immobilisierung zu erreichen (die hydrophoben Wechselwirkungen sind bei höheren Salzkonzentrationen stärker). Beispiele für geeignete kationische Detergenzien sind 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid-hydrochlorid, pH etwa 6,8 ("EDC") und tertiäre Alkylamine, wie z. B. Octyldimethylamin·HCl. EDC kann bei Konzentrationen (in Wasser) von etwa 30 mM bis etwa 100 mM eingesetzt werden. J. M. Varga et al. haben gezeigt, dass verschiedene kleine Biomoleküle an Polystyrolplatten durch Inkubieren mit 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid-hydrochlorid ("EDC") immobilisiert werden können (J. M. Varga et al, FASEB 4, 2671–2677 (1990)). Es wurden jedoch keine Beispiele für eine Oligonucleotid-Immobilisierung angegeben und es wird allgemein angenommen, dass kurze, einsträngige Oligonucleotidmoleküle nur sehr ineffizient an Polystyrolträgern immobilisiert werden. Lacy et al. (J. Immunol. Methods 116, 87–98 (1989)) haben die Bindung von Kalbsthy mus-DNA an Polystyrol in der Gegenwart einer hohen Salzkonzentration und eines hohen pH-Werts beschrieben, jedoch Beweise dafür erbracht, dass ein synthetisches Oligonucleotid nicht bindet.
Ein bevorzugtes tertiäres Alkylamin ist Octyldimethylamin, das in Konzentrationen von etwa 50 mM bis etwa 150 mM verwendet werden kann. Octyldimethylamin weist eine Struktur auf, die der Struktur von EDC sehr ähnlich ist, jedoch enthält Octyldimethylamin nicht die funktionelle reaktive Diimidgruppe von EDC. Dies zeigt, dass EDC nicht die kovalente Bindung an Polystyrol vermittelt, sondern als Detergenz wirkt (hydrophiles/hydrophobes Molekül).
Die Immobilisierung wird durch Inkubieren, vorzugsweise bei Raumtemperatur für 3 bis 24 Stunden erreicht. Nach einer solchen Inkubierung werden die Platten vorzugsweise mit einer Lösung von 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, gewaschen, die 150 mM NaCl und 0,05 Vol.-% Tween 20 (TNTw) enthält. Der letztgenannte Bestandteil hat die wichtige Aufgabe, alle freien Oligonucleotid-Bindungsstellen zu blockieren, die noch auf der Polystyroloberfläche vorliegen, so dass während eines beliebigen nachfolgenden Hybridisierungsschritts keine unspezifische Bindung von Oligonucleotiden stattfinden kann. Das vorstehend genannte Verfahren konnte mindestens 500 fmol Oligonucleotid pro Well immobilisieren (was einer Oberfläche von etwa 1 cm² entspricht). Die Oligonucleotide werden an der Oberfläche der Platte mit einer ausreichenden Stabilität immobilisiert und können nur durch längere Inkubationen mit 0,5 M NaOH-Lösungen bei erhöhten Temperaturen entfernt werden. Kein Oligonucleotid wird durch Waschen der Platte mit Wasser, TNTw (Tween 20), PBS, 1,5 M NaCl oder einem ähnlichen wässrigen Puffer entfernt.
Diese Verfahren und Reagenzien können unmodifizierte und modifizierte (z. B. biotinylierte) Oligonucleotide effektiv immobilisieren. Es wird angenommen, dass es sich bei der durch diese Reagenzien vermittelten Immobilisierung nicht um eine kovalente Bindung zwischen der Nucleinsäure und den reaktiven Gruppen des Trägers handelt. Ohne Beschränkung des Schutzbereichs der vorliegenden Erfindung wird angenommen, dass die Immobilisierung nicht-kovalent ist und eine Kombination aus hydrophoben Wechselwirkungen, ionischen Wechselwirkungen und Wasserstoffbrückenbindungs-Wechselwirkungen mit der Polystyroloberfläche des Trägers wiedergibt.
Unabhängig vom genauen Mechanismus der Immobilisierung können die Reagenzien der vorliegenden Erfindung eine Bindung von Oligonucleotiden an einen Träger vermitteln, die eine ausreichende Stabilität aufweist, so dass sie einem Waschen widersteht, und eine einstündige Behandlung mit 0,1 N NaOH übersteht. Darüber hinaus können die immobilisierten Oligonucleotide effizient an Hybridisierungsreaktionen teilnehmen. Obwohl auch kürzere Oligonucleotide immobilisiert werden können, wurde gefunden, dass eine Länge von mindestens 12 Basen erforderlich ist, um an komplementäre DNA-Moleküle effizient zu hybridisieren. Diese Beobachtung legt nahe, dass das Verfahren der Immobilisierung des Oligonucleotids an dem Träger kurze Teile der immobilisierten Moleküle für eine Hybridisierung unzugänglich macht.
Erfindungsgemäß wird das Immobilisierungsreagenz in der Gegenwart des Oligonucleotids, das immobilisiert werden soll, und des Trägers inkubiert. Geeignete Inkubationen können sich bezüglich der Dauer unterscheiden und werden vorzugsweise über Nacht durchgeführt. Die Inkubation kann bei Raumtemperatur durchgeführt werden.
Die Nucleinsäuremoleküle, die auf dem Träger immobilisiert werden sollen, können chemisch synthetisiert oder von einer natürlichen Quelle gewonnen werden. Alternativ können solche Moleküle über ein in vitro-Amplifizierungsprotokoll erzeugt werden, wie z. B. eine PCR. Kurze Oligonucleotide werden mehr bevorzugt mittels chemischer Synthese erhalten.
II. Verwendung immobilisierter Oligonucleotide in der genetischen Analyse
Die erfindungsgemäßen Verfahren sind besonders zur Erzeugung immobilisierter Oligonucleotide für eine Festphasenhybridisierung, für Festphasen-Didesoxysequenzierstudien und zur Analyse von DNA-Polymorphismen geeignet.
A. Hybridisierungsnachweis von PCR-Produkten
Folglich können die Verfahren beispielsweise zum Nachweis spezifischer PCR-Produkte durch Hybridisierung verwendet werden, wenn die Einfangsonde auf der Festphase immobilisiert wird (Ranki et al., Gene 21, 77–85, 1983; Keller et al., J. Clin. Microbiol. 29, 638–641, 1991; Urdea et al., Gene 61, 253–264, 1987). Ein bevorzugtes Verfahren würde darin bestehen, vor der Hybridisierung ein einzelsträngiges PCR-Produkt herzustellen. Eine Probe, von der vermutet wird, dass sie das Zielmolekül enthält, oder ein Amplifizierungsprodukt davon, würde dann dem Well zugesetzt und an das gebundene Oligonucleotid hybridisieren gelassen werden.
Die erfindungsgemäßen Verfahren erfordern nicht, dass die Ziel-Nucleinsäure nur einen seiner beiden natürlichen Stränge enthält. Folglich können die erfindungsgemäßen Verfahren entweder mit doppelsträngiger DNA oder einzelsträngiger DNA durchgeführt werden, die z. B. durch eine Alkalibehandlung nativer DNA erhalten worden ist. Die Gegenwart des nicht verwendeten Strangs (nicht-Templatstrang) beeinflusst die Reaktion nicht.
Gegebenenfalls können jedoch verschiedene Verfahren eingesetzt werden, um einen der beiden natürlichen Stränge des Ziel-DNA-Moleküls aus der Reaktion zu entfernen. Einzelsträngige DNA-Moleküle können unter Verwendung der Einzelstrang-DNA-Bakteriophage M13 erzeugt werden (J. Messing et al., Meth. Enzymol. 101, 20 (1983); vgl. auch J. Sambrook et al., (in: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989)).
Verschiedene alternative Verfahren können verwendet werden, um einzelsträngige DNA-Moleküle zu erzeugen. U. Gyllensten et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 85, 7652–7656 (1988) und M. Mihovilovic et al. (BioTechniques 7, 14 (1989)) beschreiben ein Verfahren, das als "asymmetrische PCR" bezeichnet wird, bei dem das Standard-"PCR"-Verfahren unter Verwendung von Primern durchgeführt wird, die in unterschiedlichen molaren Konzentrationen vorliegen. R. G. Higuchi et al. (Nucleic Acids Res. 17, 5865 (1985)) geben ein Beispiel für ein zusätzliches Verfahren zur Erzeugung einzelsträngiger Amplifizierungsprodukte. Das Verfahren umfasst die Phosphorylierung des 5'-Endes eines Strangs eines doppelsträngigen Amplifizierungsprodukts und dann das bevorzugte Abbauenlassen des phosphorylierten Strangs durch eine 5' → 3'-Exonuclease (wie z. B. Exonuclease).
Andere Verfahren haben auch die Nuclease-beständigen Eigenschaften von Phosphorothioatderivaten genutzt, um einzelsträngige DNA-Moleküle zu erzeugen (Benkovic et al., US-Patent 4,521,509; 4. June 1985); J. R. Sayers et al. (Nucl. Acids Res. 16, 791–802 (1988); F. Eckstein et al., Biochemistry 15, 1685–1691 (1976); J. Ott et al., Biochemistry 26, 8237–8241 (1987)).
Insbesondere werden solche einzelsträngigen Moleküle unter Verwendung von Verfahren erzeugt, bei denen Nuclease-beständige Nucleotid-Derivate eingesetzt werden und solche Derivate durch chemische Synthese oder enzymatische Mittel in Primermoleküle oder deren Verlängerungsprodukte anstelle von natürlich vorkommenden Nucleotiden eingebaut werden.
Geeignete Nucleotidderivate umfassen Derivate, in denen eines oder zwei der nicht-verbrückenden Sauerstoffatome des Phosphatrests eines Nucleotids durch eine Schwefelenthaltende Gruppe (insbesondere ein Phosphorothioat), eine Alkylgruppe (insbesondere eine Methyl- oder Ethylalkylgruppe), eine Stickstoff-enthaltende Gruppe (insbesondere ein Amin) und/oder eine Selen-enthaltende Gruppe, usw., ersetzt worden ist. Phosphorothioat-Desoxyribonucleotid- oder -ribonucleotid-Derivate sind die am meisten bevorzugten Nucleotid-Derivate. Verfahren zur Herstellung und Verwendung solcher Phosphorothioat-Derivate sind von T. Nikiforov (US-Patentanmeldung 08/155,746) beschrieben worden.
B. Festphasen-DNA-Sequenzierung
Die erfindungsgemäßen Verfahren können auch bei der Durchführung einer Festphasensequenzierung verwendet werden, wie sie von K. R. Khrapko et al. (DNA Seq. 1, 375–388, 1991) und R. Drmanac und R. Crkvenjakov (Int. J. Genome Res. 1, 1–1, 1992) beschrieben worden ist.
C. GBA^TM Genetische Bit-Analyse
Die erfindungsgemäßen Verfahren können auch zur Immobilisierung der Oligonucleotide verwendet werden, die in der GBA^TM Genetischen Bit-Analyse verwendet werden (P. Goelet et al., PCT-Anmeldung 92/15712). Oligonucleotide, die eine definierte Sequenz aufweisen, die zu einem Bereich komplementär ist, der unmittelbar proximal oder distal zu dem variablen Nucleotid eines Polymorphismus liegt, würden gemäß den vorstehend beschriebenen Verfahren somit in einen Polystyrol-Mikrotiter-Well eingebracht und mit einem Salz inkubiert werden.
Der immobilisierte Primer wird dann in der Gegenwart eines DNA-Moleküls (vorzugsweise eines genomischen DNA-Moleküls) mit einem Einzelnucleotid-Polymorphismus, dessen unmittelbar 3'-distale Sequenz zu der Sequenz des immobilisierten Primers komplementär ist, inkubiert. Vorzugsweise findet eine solche Inkubation in vollständiger Abwesenheit von dNTP (d. h. dATP, dCTP, dGTP oder dTTP), sondern nur in der Gegenwart eines oder mehrerer kettenabbrechender Nucleotidtriphosphatderivate (wie z. B. eines Didesoxyderivates) und unter Bedingungen statt, die ausreichend sind, so dass der Einbau eines solchen Derivats am 3'-Ende des Primers möglich ist. Es sollte beachtet werden, dass dann, wenn die polymorphe Stelle derart ist, dass nur zwei oder drei Allele vorliegen (so dass nur zwei oder drei Spezies von ddNTPs in das Primer-Verlängerungsprodukt eingebaut werden könnten), die Gegenwart von nicht verwendbaren oder nicht verwendbarer Nucleotidtriphosphat(e) in der Reaktion unerheblich ist. Als Folge der Inkubation und nur der Verwendung kettenabbrechender Nucleotidderivate wird dem 3'-Ende des Primers ein einzelnes Didesoxynucleotid hinzugefügt. Die Identität dieses hinzugefügten Nucleotids wird durch das Nucleotid der polymorphen Stelle des Polymorphismus bestimmt und ist zu diesem komplementär.
In dieser Ausführungsform wird das Nucleotid der polymorphen Stelle folglich durch Testen, welcher Satz markierter Nucleotide am 3'-Ende des gebundenen Oligonucleotids durch eine Primer-abhängige Polymerase eingebaut worden ist, bestimmt. Insbesondere werden dann, wenn mehrere Didesoxynucleotidderivate gleichzeitig eingesetzt werden, verschiedene Marker verwendet, um die differenzierende Bestimmung der Identität des eingebauten Didesoxynucleotidderivats zu ermöglichen.
D. Ligase-vermittelte GBA^TM
Die Verfahren und Reagenzien der vorliegenden Erfindung können auch zusammen mit einem Polymerase/Ligase-vermittelten Polymorphie-Abfragetest verwendet werden. Dieser Test, der als Ligase-vermittelte GBA^TM genetische Bit-Analyse bezeichnet wird, ist eine spezifischere Version des GBA^TM genetischen Bit-Analysetests. Die zusätzliche Spezifität ergibt sich aus dem Hinzufügen eines zweiten Hybridisierungsschritts und eines Ligationsschritts.
In diesem Test werden zwei Oligonucleotide eingesetzt. Das erste Oligonucleotid ist ein Primer, der zu der unmittelbar 3'-distalen Invarianten Sequenz des Polymorphismus komplementär ist. Das 3'-Ende des Oligonucleotids ist an die Platte gebunden. Ein zweites Linker-Oligonucleotid ist zu der 5'-proximalen Sequenz des analysierten Polymorphismus komplementär, kann jedoch nicht an das erste Oligonucleotid hybridisieren. Dieses Oligonucleotid ist an dessen 3'- und 5'-Ende phosphoryliert.
Diese Oligonucleotide werden in der Gegenwart von DNA, die den zu analysierenden Einzelnucleotid-Polymorphismus enthält, und mindestens einem 2'-Desoxynucleotid-5'-triphosphat inkubiert. Die Inkubationsreaktion umfasst ferner eine DNA-Polymerase und eine DNA-Ligase. Die gebundenen und löslichen Oligonucleotide können somit an den gleichen Strang des analysierten Zielmoleküls hybridisieren. Die Sequenzgegebenheiten führen dazu, dass die beiden Oligonucleotide an die proximale und die distale Sequenz des Einzelnucleotid-Polymorphismus (SNP) hybridisieren, welche das variable Nucleotid des Polymorphismus flankieren, und an der exakten Variabilitätsposition durch ein einzelnes Nucleotid getrennt sind.
Die Gegenwart einer Polymerase und des 2'-Desoxynucleotid-5'-triphosphats, das zu dem in der variablen Stelle des Polymorphismus komplementär ist, ermöglicht es dem verlängerten Primer, an das gebundene Oligonucleotid ligiert zu werden, wodurch der Primer immobilisiert wird. Die Identität der polymorphen Stelle, die dem einzelnen Nucleotid gegenüber lag, kann dann mit einem beliebigen Mittel bestimmt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das 2'-Desoxynucleotid-5'-triphosphat der Reaktion markiert und dessen Nachweis zeigt folglich die Identität des komplementären Nucleotids der polymorphen Stelle. Mehrere verschiedene 2'-Desoxynucleotid-5'-triphosphate können vorliegen, die jeweils unterschiedlich markiert sind. Alternativ können getrennte Reaktionen jeweils mit einem anderen 2'-Desoxynucleotid-5'-triphosphat durchgeführt werden. In einer alternativen Unterausführungsform sind die 2'-Desoxynucleotid-5'-triphosphate unmarkiert und das lösliche Oligonucleotid ist markiert. In dieser Ausführungsform ist der Primer, der verlängert wird, an dem Polystyrol immobilisiert. Es werden getrennte Reaktionen jeweils unter Verwendung eines anderen unmarkierten 2'-Desoxynucleotid-5'-triphosphats durchgeführt.
Nachdem die Erfindung allgemein beschrieben worden ist, kann die Erfindung leichter unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele der Isolierung und Analyse von Pferde-Polymorphismen verstanden werden, die lediglich beispielhaft angegeben werden und nicht beschränkend aufzufassen sind.
Beispiel 1
Demonstration der unterschiedlichen Bindungsmechanismen für Salze und kationische Detergenzien
Ein Hinweis darauf, dass Salze und kationische Detergenzien verschiedene Mechanismen der Immobilisierung vermitteln, ergab sich aus dem folgenden Experiment, bei dem drei verschiedene Oligonucleotidmoleküle und ein biotinyliertes Polyphosphat unter Verwendung von drei verschiedenen Reagenzien auf Polystyrolplatten immobilisiert worden sind: 20 mM EDC, 0,03 mM CTAB und 500 mM NaCl. Die verwendeten biotinylierten Oligonucleotide waren #1129, Biotin-T₅ und Biotin T₂₅. Das #1129-Oligonucleotid hat die folgende Sequenz:
Das biotinylierte Polyphosphat hatte die Struktur Biotin-(C₃)₂₅, wobei C₃ CH₂CH₂CH₂OPO₃ ist. Dieses Polyphosphat weist die Phosphodiesterbindungen eines regulären Oligonucleotids auf, jedoch keine Desoxyribosereste und keine heterocyclischen Basen. Die Ergebnisse dieses Experimentes sind in der Tabelle 1 zusammengefasst. Die Ergebnisse sind als mOD₄₅₀/min angegeben.
Tabelle 1 Effekte von Salzen und Detergenzien auf die Oligonucleotidbindung
Die Tabelle 1 zeigt, dass das Polyphosphat Biotin-(C₃)₂₅ durch 500 mM NaCl nicht effizient auf der Polystyrolplatte immobilisiert werden konnte, während alle drei getesteten Reagenzien bei der Immobilisierung der drei biotinylierten Oligonucleotide wirksam waren. Die Ineffizienz von NaCl bei der Immobilisierung von Biotin-(C₃)₂₅ könnte durch die intrinsisch niedrigere Hydrophobie dieses Moleküls verglichen mit einem typischen Oligonucleotid erklärt werden. Diese verminderte Hydrophobie ist auf den Mangel an Desoxyriboseresten und der heterocyclischen Basen zurückzuführen. Folglich ist die Gegenwart von NaCl zur Förderung des hydrophoben Bindens dieses Moleküls an die Plattenoberfläche nicht ausreichend. Andererseits bildet Biotin-(C₃)₂₅ mit EDC oder CTAB durch elektrostatische Wechselwirkungen in Lösung Komplexe. Diese Komplexe erhöhen die Hydrophobie dieses Polyphosphats signifikant und fördern dessen Immobilisierung an dem Polystyrol.
Beispiel 2
Konzentrationsabhängigkeit der Bindung mit Salzen oder kationischen Detergenzien
Immobilisierung von Oligonucleotiden an Polystyrolplatten. Verwendung von CTAB und (CH₃)₄NCl als Beispiele für zwei Reagenzien, die durch unterschiedliche Mechanismen wirken. Das Oligonucleotid #1112 wurde auf Immulon^TM4-Platten (Dynatech, VA) immobilisiert. Die Nucleotidsequenz von #1112 ist:
Die Immobilisierung wurde unter Verwendung von 10 pmol des Oligonucleotids in 50 μl Immobilisierungslösung pro Well der Mikrotiterplatte durchgeführt. Die Immobilisierungsreagenzien wurden in den folgenden Konzentrationen eingesetzt:
CTAB: 0,5, 0,25, 0,12, 0,06 und 0,03 mM
(CH₃)₄NCl: 300, 150, 30, 0,3 und 0,03 mM
Als Negativkontrollen wurden die Oligonucleotide einigen der Wells ohne Immobilisierungsreagenzien (d. h. als wässrige Lösungen) zugesetzt.
Um die Immobilisierung dieser Oligonucleotide zu bewerten, wurden die Platten nach einer Inkubation über Nacht dreimal mit TNTw gewaschen und ein biotinyliertes Oligonucleotid (#1676), das zu dem Oligonucleotid #1112 komplementär war, wurde bei verschiedenen Konzentrationen (31, 62, 125 und 250 fmol pro Well) zugesetzt. Das biotinylierte Oligonucleotid #1676 hatte die folgende Sequenz:
Die Gegenwart von Biotin wurde dann durch einen Enzym-verknüpften Test nachgewiesen. Die erhaltenen Ergebnisse (als mOD₄₅₀/min ausgedrückt) sind in den 4 und 5 graphisch dargestellt. Für CTAB wurden die besten Ergebnisse bei der niedrigsten getesteten Konzentration (0,03 mM) erhalten, während bei 0,5 mM nahezu keine Immobilisierung nachgewiesen wurde. Für (CH₃)₄NCl sind die Ergebnisse genau umgekehrt: Die besten Ergebnisse wurden erhalten, wenn das Reagenz bei relativ hohen Konzentrationen (300, 150 und 30 mM) eingesetzt wurde, wobei die Signale bei 0,3 und 0,03 mM dramatisch abnahmen. Dieses Beispiel veranschaulicht, dass sich (CH₃)₄NCl wie ein Salz (maximales Binden bei hoher Konzentration) verhält, und zwar möglicherweise aufgrund der geringen Hydrophobie seiner kurzen Methylarme. CTAB zeigte andererseits das typische Verhalten eines kationischen Detergenzes (maximale Bindung bei niedriger Konzentration), und zwar aufgrund seines Vermögens, als Brückenmolekül zwischen dem hydrophoben Kunststoff und den geladenen Phosphaten des Oligonucleotids zu wirken.
Beispiel 3
Bevorzugtes Verfahren zur Immobilisierung von Oligonucleotiden an 96-Well-Polystyrolplatten unter Verwendung von EDC
100 μl einer wässrigen 10 μM-Lösung des zu immobilisierenden Oligonucleotids wurden mit 4,4 ml destilliertem Wasser gemischt. Dieser Lösung wurden 500 μl einer 38 mg/ml-Lösung von EDC in Wasser zugesetzt. 50 μl-Aliquots der resultierenden Oligonucleotidlösung wurden jedem Well einer Polystyrolmikrotiterplatte zugesetzt und über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Dann wurden die Platten dreimal mit einer Lösung gewaschen, die 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl und 0,05% (v/v) Tween^TM20 enthielt (diese Lösung wird nachstehend mit TNTw abgekürzt).
Beispiel 4
Bevorzugtes Verfahren zur Immobilisierung von Oligonucleotiden an 96-Well-Polystyrolplatten unter Verwendung von NaCl
Wie vorstehend wurden 100 μl einer wässrigen 10 μM-Lösung des zu immobilisierenden Oligonucleotids mit 4,4 ml destilliertem Wasser gemischt. Dieser Lösung wurden 500 μl einer 5 M-NaCl-Lösung in Wasser (Endkonzentration von NaCl: 500 mM) zugesetzt. Die Inkubations- und Waschschritte entsprechen denjenigen für die EDC-Immobilisierung.
Beispiel 5
Stabilität der immobilisierten Oligonucleotide und Effizienz der Immobilisierung von Oligonucleotiden an Polystyrolplatten unter Verwendung verschiedener Immobilisierungsbedingungen
Die Immobilisierung des Oligonucleotids #1129 wurde untersucht. Nach einer Inkubation über Nacht wurde die Platte mit TNTw gewaschen. Dann wurden einige der Wells 1 Stunde bei Raumtemperatur mit einer 0,1 N-NaOH-Lösung behandelt und dann wurden die Platten bezüglich der Gegenwart von Biotin getestet. In einem Parallelexperiment wurde das unmarkierte Oligonucleotid #308
das zu dem Oligonucleotid #1129 komplementär ist, unter dem gleichen Satz von Bedingungen gebunden. Dann wurde eine Hybridisierung an das Oligonucleotid #1129 mit und ohne vorhergehende NaOH-Behandlung der Platte durchgeführt. Die Ergebnisse (in mOD₄₅₀/min angegeben) sind in der Tabelle 2 zusammengefasst.
Tabelle 2
Die Ergebnisse dieses Experiments zeigten, dass die Immobilisierung der Oligonucleotide die Gegenwart eines Salzes erforderte. Die Immobilisierung war in salzfreien wässrigen Lösungen sehr ineffizient. Auch in der Gegenwart von Tween^TM20 fand keine Immobilisierung statt. Dies war möglicherweise auf eine „Inaktivierung" der Plattenoberfläche durch die bevorzugte Adsorption dieses Detergenzmoleküls zurückzuführen. Entsprechend konnte keine Immobilisierung erreicht werden, wenn die Platte vor dem Bindungsschritt mit einer Lösung gewaschen wurde, die Tween^TM20 enthielt, und zwar selbst dann nicht, wenn die Bindungslösung das Detergenz nicht enthielt. Die Verwendung von 250 mM NaCl in dem Bindungsschritt führte zu etwas stärkeren Signalen in dem anschließenden Hybridisierungstest.
Eine Anzahl verschiedener käuflicher 96-Well-Platten wurde bezüglich der Eignung für eine Oligonucleotid-Immobilisierung getestet. Im Allgemeinen führten Platten, die eine hydrophilere Oberfläche aufwiesen, zu guten Ergebnissen, wohingegen sich Platten mit einer hydrophoben Oberfläche als ungeeignet erwiesen. Beispiele für geeignete Platten umfassen Immulon 4^TM-(Dynatech), Maxisorp^TM-(Nunc) und Immunoware^TM-Platten (Pierce). Keine Bindung konnte an Immulon 1^TM-(Dynatech) und Polysorp^TM-Platten (Nunc) erreicht werden. Alle nachstehenden Experimente wurden mit Immulon 4-Platten durchgeführt.
Beispiel 6
Beweise gegen eine kovalente Bindung in Gegenwart von EDC
EDC (1-Ethyl-3-(3-dimethylaminoethyl)carbodiimid·HCl) ist ein bekanntes Vernetzungsmittel. Beispielsweise wird es verbreitet in der Peptidsynthese verwendet, um die Bildung von Peptidbindungen zu erreichen. Daher war es wichtig, experimentelle Beweise für oder gegen die Bildung von kovalenten Bindungen zwischen den Oligonucleotiden und jeglichen funktionellen Gruppen zu erbringen, die auf der Oberfläche der Polystyrolplatten vorliegen können.
In diesem Experiment wurden zwei verschiedene Arten von Polystyrolplatten verwendet. Die erste Art waren Immulon 4-Platten^TM, die von Dynatech (Chantilly, VA) erhalten wurden, und die zweite Art waren Carboxylat-modifizierte Platten von Costar (Cambridge, MA). Die letztgenannte Plattenart wurde speziell für die kovalente Bindung von Biomolekülen, vorwiegend von Peptiden und Proteinen, gestaltet, die durch eine einfache passive Absorption nicht gut binden. Aufgrund der Gegenwart der Carboxylatgruppen auf der Oberfläche der Costar-Platten kann die kovalente Bindung unter Verwendung von Reagenzien wie z. B. des wasserlöslichen Carbodiimids EDC durchgeführt werden. In dem folgenden Experiment wurden zwei Oligonucleotide verwendet, #680, und dessen 5'-Amino-modifizierte Version, #680 „Amino". Die beiden Oligonucleotide hatten die gleiche Sequenz:
wobei X eine primäre Aminogruppe im Fall des Oligonucleotids #680 „Amino" angibt. Diese beiden Oligonucleotide wurden unter Verwendung von EDC an Costar- und Immulon 4^TM-Platten gemäß Beispiel 3 gebunden. Zwei verschiedene EDC-Lösungen in Wasser wurden verwendet. Die erste Lösung war eine frisch hergestellte Lösung, während die zweite Lösung eine wässrige Lösung mit der gleichen Konzentration war, die 15 Tage bei Raumtemperatur aufbewahrt worden ist. Die funktionelle Carbodiimidgruppe von EDC ist feuchtigkeitsempfindlich und wird beim Kontakt mit Wasser relativ schnell zu dem entsprechenden N,N'-disubstituierten Harnstoffanalogon hydrolysiert. Dieses Hydrolyseprodukt von EDC kann nicht als Kondensationsmittel wirken. Folglich wurde diese EDC-Lösung in dem Bindungsexperiment verwendet, um zu zeigen, ob die funktionelle Carbodiimidgruppe dieser Verbindung eine Rolle bei der Oligonucleotid-Immobilisierung spielt.
Nach der Immobilisierung der beiden Oligonucleotide wurden die Platten mit TNTw gewaschen. Dann wurden 20 μl-Aliquots von Lösungen der jeweiligen folgenden synthetischen Oligonucleotide den Wells der beiden Platten zugesetzt und an die immobilisierten Oligonucleotide #1209 und 1210 (SEQ ID NO: 7 bzw. SEQ ID NO: 8) hybridisieren gelassen:
Jedes 20 μl-Aliquot enthielt 250 fmol des entsprechenden Oligonucleotids in 1,5 M NaCl, 10 mM EDTA. Die Hybridisierung wurde 30 min bei Raumtemperatur durchgeführt, worauf die Platten erneut mit TNTw gewaschen wurden.
Als nächstes wurde eine enzymatische Verlängerungsreaktion gemäß Beispiel 11A (siehe weiter unten) durchgeführt. Es wurde erwartet, dass die Verwendung der synthetischen Oligonucleotide #1209 und #1210 als Template in der Verlängerung zur Verlängerung des 3'-Endes der immobilisierten Primer durch ein Biotin-markiertes ddCTP im Fall des Oligonucleotids #1209 und ein Biotin-markiertes ddNTP im Fall des Oligonucleotids #1210 führt. Der Nachweis des eingebauten ddNTP wurde so durchgeführt, wie es nachstehend beschrieben ist (vgl. Beispiel 11A). Die in dem kolorimetrischen Test erhaltenen Ergebnisse sind in der Tabelle 3 zusammengefasst, welche die Rolle des wasserlöslichen Carbodiimids EDC in der Oligonucleotid-Immobilisierung an zwei verschiedene Polystyrolplatten zeigt. Die Oligonucleotide #680 und #680 „Amino" wurden an Carboxylat-modifizierte Platten (Costar) und Immulon 4^TM-Platten (Dynatech) immobilisiert. Die immobilisierten Oligonucleotide wurden an die synthetischen Template #1209 und #1210 hybridisiert und einer Templat-gerichteten enzymatischen Verlängerung an ihren 3'-Enden unterworfen (GBA^TM), wobei Biotin-markierte ddNTP's verwendet wurden. Die Ergebnisse sind als mOD₄₅₀/min angegeben.
Tabelle 3 Nachweis des Einbaus von ddNTP
Die wichtigsten Ergebnisse dieses Experiments können folgendermaßen zusammengefasst werden:

1. Oligonucleotide können an Carboxylat-modifizierten Costar-Platten unter Verwendung von frischem Carbodiimid als Kondensationsreagenz immobilisiert werden. Sowohl Oligonucleotide, die eine primäre Aminfunktion am 5'-Ende aufweisen, als auch Oligonucleotide ohne diese Funktion können immobilisiert werden. Es ist sehr wahrscheinlich, dass die Bindung zumindest teilweise über die exocyclischen Aminogruppen der heterocyclischen Basen stattfindet. Die immobilisierten Oligonucleotide können in DNA-Tests auf Hybridisierungsbasis eingesetzt werden. Die Immobilisierung findet nur in der Gegenwart von frischem EDC statt. Wenn das verwendete EDC hydrolysiert worden ist, findet keine Bindung statt.
2. Unter entsprechenden Bedingungen können Oligonucleotide erfolgreich an Immulon^TM4-Platten immobilisiert und in Tests auf Hybridisierungsbasis verwendet werden. Im Gegensatz zu den Costar-Platten führt jedoch sowohl eine frisch hergestellte als auch eine hydrolysierte EDC-Lösung zu nahezu identischen Ergebnissen. Das EDC wirkt in diesem Fall somit nicht als kovalentes Bindungsreagenz.

Beispiel 7
Nachweis von PCR-Produkten in Polystyrolplatten
Oligonucleotide, die auf Polystyrolplatten (oder Mikroskop-Glasobjektträgern, siehe weiter unten) immobilisiert worden sind, können in einem neuen, nicht-radioaktiven Festphasentest von Polymerasekettenreaktionsprodukten (PCR-Produkten) als Sonden verwendet werden. Das Verfahren kann voll automatisiert werden und es kann ein sehr hoher Durchsatz erreicht werden. Das Verfahren umfasst vier Einzelschritte:

1. DNA-Amplifizierung mittels PCR unter Verwendung eines regulären und eines markierten, Phosphorothioat-modifizierten Primers;
2. Umwandlung des doppelsträngigen PCR-Produkts in die einzelsträngige Form;
3. Hybridisierung des einzelsträngigen PCR-Produkts an die Oligonucleotidsonde, die an der Festphase immobilisiert worden ist;
4. Kolorimetrischer Nachweis des PCR-Produkts in einem Test des ELISA-Typs.

Diese einzelnen Schritte werden in dem folgenden Beispiel detaillierter beschrieben. In diesem Beispiel wurden 96-Well-Polystyrol-ELISA-Platten (Immulon^TM4 von Dynatech, Chantilly, VA) verwendet.
Die folgende PCR-Amplifizierung veranschaulicht die Anwendung der vorliegenden Erfindung auf die PCR-Amplifizierung. In allen PCR-Amplifizierungsreaktionen war genomische Pferde-DNA die DNA-Quelle. Die PCR-Reaktionen wurden in einem Gesamtvolumen von 50 μl durchgeführt. Die Endkonzentration der PCR-Primer betrug 0,5 μM. Nach einem anfänglichen zweiminütigen Denaturierungsschritt bei 95°C wurden 35 Zyklen durchgeführt, die jeweils aus einer Denaturierung (1 min bei 95°C), Hybridisierung (2 min bei 60°C) und Verlängerung (3 min bei 72°C) bestanden. Taq-DNA-Polymerase wurde von Perkin-Eimer erhalten und in einer Konzentration von 0,025 μ/μl verwendet. Die Endzusammensetzung des PCR-Puffers war: 1,5 mM MgCl₂, 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8,3 und 200 μg/ml BSA. Die Sequenzen der verwendeten PCR-Primer sind nachstehend angegeben. Die Längen der PCR-Produkte sind ebenfalls angegeben. Phosphorothioatbindungen befinden sich zwischen den unterstrichenen und hervorgehobenen Nucleotiden. Es sollte beachtet werden, dass der 5'-terminale Biotinrest auch über eine Phosphorothioatbindung gebunden ist.
A: 93 bp PCR-Amplifizierungsprodukt PCR-Primer:
Einfangsonde
B: 201 bp PCR-Amplifizierungsprodukt PCR-Primer:
Einfangsonde
C: 547 bp PCR-Amplifizierungsprodukt PCR-Primer
Einfangsonde
Aliquots der PCR-Reaktionen wurden nach der Amplifizierung entnommen und mittels Polyacrylamid-Gelelektrophorese analysiert.
Beispiel 8
Herstellung einzelsträngiger PCR-Produkte
Um einen der Stränge des doppelsträngigen PCR-Produkts vor einer Exonucleasehydrolyse zu schützen, wurden während der Synthese vier Phosphorothioatbindungen am 5'-Ende jedes PCR-Primerpaars eingeführt. Zur Erzeugung einzelsträngiger PCR-Produkte nach der PCR-Amplifizierung wurde T7-Gen 6-Exonuclease in einer Endkonzentration von 2 Einheiten/μl der PCR-Reaktion zugesetzt. Es wurde 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die T7-Gen 6-Exonuclease wurde von USB erhalten und in einem Puffer verdünnt, der vom Hersteller empfohlen wird. Nach der Exonucleasebehandlung wurden Aliquots der Reaktionsgemische entnommen und mittels Polyacrylamid-Gelelektrophorese analysiert.
Beispiel 9
Hybridisierung einzelsträngiger PCR-Fragmente an Oligonucleotide, die in ELISA-Platten immobilisiert worden sind
Nach der Exonucleasebehandlung wurde ein gleiches Volumen 3 M NaCl, 20 mM EDTA dem Reaktionsgemisch zugesetzt und 20 μl-Aliquots der resultierenden Lösung wurden in einzelne Wells überführt, die das geeignete immobilisierte Oligonucleotidmolekül enthielten. Die Sequenzen der immobilisierten Einfangsonden sind vorstehend angegeben. Diese Einfangsonden wurden unter Verwendung von 500 mM NaCl immobilisiert. Die Hybridisierung wurde 30 min bei Raumtemperatur durchgeführt, worauf mit TNTw gewaschen wurde.
Beispiel 10
Kolorimetrischer Nachweis
Nach der Hybridisierung wurde die Platte mit einer 1 : 1200-Verdünnung eines Anti-Biotin-Meerrettichperoxidase-Konjugats (Vector Laboratories, Burlingame, CA) in 1% BSA in TNTw 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platte wurde dann sechsmal mit TNTw und einer Lösung von 1 mg/ml o-Phenylendiamin (OPD) in 0,1 M Citratpuffer, pH 4,5, der 0,012% H₂O₂ enthielt, gewaschen. Die Platte wurde sofort in ein Plattenlesegerät (V_max, Molecular Devices) eingesetzt und die Entwicklung der Farbe wurde 2 min bei 450 nm verfolgt. Die Tabelle 4 zeigt die Ergebnisse (als mOD₄₅₀/min) ausgedrückt der Mikrotiterplatten-Hybridisierungstests der PCR-Reaktionen A, B und C. Die Produkte der PCR-Reaktionen A, B und C wurden durch Behandeln mit 2 u/μl T7-Gen 6-Exonuclease einsträngig gemacht und Aliquots, die 5 μl der ursprünglichen PCR-Reaktion entsprachen, wurden den Wells einer Mikrotiterplatte zugesetzt, welche die geeigneten Einfang-Oligonucleotide zur Hybridisierung enthielten. Die Einfangoligonucleotide wurden unter Verwendung von 500 mM NaCl an der Platte immobilisiert. Die Ergebnisse des kolorimetrischen Tests sind in mOD₄₅₀/min angegeben. Alle Experimente wurden zweifach durchgeführt. Die Ergebnisse sind als Durchschnitte gezeigt (NT = nicht getestet).
Tabelle 4 Analyse von Plattenhybridisierungstests unter Verwendung immobilisierter Einfangoligonucleotide
Beispiel 11
Anwendung des Festphasen-Immobilisierungsverfahrens auf die nicht-radioaktive Typisierung von Einzelbasen-Nucleinsäurepolymorphismen
Die GBA^TM genetische Bit-Analyse ist ein Festphasenverfahren zur Typisierung von Einzelnucleotidpolymorphismen. Das Verfahren ist in der 3 veranschaulicht. Unter Verwendung des in der vorliegenden Patentanmeldung beschriebenen Verfahrens können Oligonucleotidprimer an Festphasen wie z. B. Polystyrol oder Glas immobilisiert, an PCR-abgeleitete einzelsträngige Template hybridisiert und einer enzymatischen Verlängerung an ihren 3'- Enden durch ein einzelnes markiertes ddNTP unterworfen werden. Die Art des eingebauten ddNTP wird von dem Nucleotid bestimmt, das sich in dem gegenüberliegenden Strang (dem polymorphen Nucleotid) befindet. Dieser Test kann zweckmäßig sowohl in Polystyrol-ELISA-Platten als auch auf Glasobjektträgern durchgeführt werden.
Nachstehend werden drei Beispiele (A, B und C) für eine GBA^TM genetische Bit-Analyse auf Polystyrolplatten angegeben. Im Beispiel 11A werden GBA^TM genetische Bit-Analyse-Primer mit dem erfindungsgemäßen Verfahren an Polystyrolplatten gebunden und zur Typisierung eines diallelischen Polymorphismus in genomischer Pferde-DNA verwendet. Das zweite und das dritte Beispiel vergleichen die GBA^TM-Analyseergebnisse, die unter Verwendung von zwei verschiedenen Oligonucleotid-Immobilisierungsansätzen erhalten worden sind. Im Beispiel 11A wurden die Oligonucleotidprimer (die GBA^TM-Primer) unter Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens an Polystyrolplatten immobilisiert, während die Immobilisierung im Beispiel 11C mit einer Modifizierung eines bereits beschriebenen Verfahrens (J. A. Running et al., Biotechniques 8, 276–277, 1990) durchgeführt wurde. Von dem letztgenannten Verfahren ist bekannt, dass es eine kovalente Bindung der Oligonucleotide über ihre 5'-Enden an die poly-(Lys, Phe)-beschichtete Platte bewirkt. Wie es aus dem Beispiel 11B und dem Beispiel 11C ersichtlich ist, ist das erfindungsgemäße Verfahren zur Oligonucleotid-Immobilisierung signifikant einfacher durchzuführen als das Verfahren von Running und Urdea, und trotzdem sind die bei der GBA^TM-Analyse erhaltenen Ergebnisse (ausgedrückt als Signal-Rausch-Verhältnisse der einzelnen Basen) signifikant besser, wenn die Immobilisierung mit dem erfindungsgemäßen Verfahren durchgeführt worden ist.
Beispiel 11A
Typisierung von DNA-Einzelbasenpolymorphismen mittels GBA^TM-Analyse: Verwendung von PCR-abgeleiteten Templaten und Primern, die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren an Polystyrol immobilisiert worden sind
Die PCR-Primer (#1833 bzw. #1834), die zur Amplifizierung eines 112 bp-Bereichs aus genomischer Pferde-DNA verwendet wurden, die einen Einzelbasenpolymorphismus enthält, hatten die folgenden Sequenzen:
Es sollte beachtet werden, dass der PCR-Primer #1834 vier Phosphorothioatbindungen an seinem 5'-Ende enthält. Diese schützen dieses Ende des doppelsträngigen PCR-Produkts vor der exonucleolytischen Wirkung der T7-Gen 6-Exonuclease und ermöglichen die Herstellung eines einzelsträngigen PCR-Produkts.
Die PCR-Amplifizierung wurde gemäß Beispiel 7 durchgeführt. Es wurde genomische DNA verwendet, die von vier verschiedenen Pferden isoliert worden ist. Das doppelsträngige PCR-Produkt wurde gemäß Beispiel 8 in die einzelsträngige Form umgewandelt und gemäß Beispiel 9 an den GBA^TM-Primer #814 hybridisiert. Der GBA^TM-Primer hatte die folgende Sequenz:
Die Immobilisierung dieses GBA^TM-Primers an einer Polystyrolplatte wurde mit NaCl gemäß Beispiel 4 durchgeführt.
Nach der Hybridisierung des PCR-abgeleiteten einzelsträngigen DNA-Fragments an den immobilisierten GBA^TM-Primer wurde dessen 3'-Ende enzymatisch in Gegenwart des großen Fragments von DNA-Polymerase I von E. coli (Klenow-Polymerase) um ein markiertes ddNTP verlängert. Das verwendete Verlängerungsgemisch enthielt die folgenden Komponenten: 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl₂, 25 mM NaCl, 10 mM MnCl₂, 15 mM Natriumisocitrat, jeweils 1,5 μM von drei unmarkierten 2',3'-Didesoxynucleosid-5'-triphosphaten und 1,5 μM eines Biotin-markierten 2',3'-Didesoxynucleosid-5'-triphosphats und 0,15 Einheiten der Klenow-Polymerase. Die Gegenwart von Biotin wurde dann mit einem kolorimetrischen Nachweis gemäß Beispiel 10 festgestellt. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 5 gezeigt. Diese Ergebnisse zeigen, dass für diesen Polymorphismus die Pferde 1 und 3 Heterozygoten sind, das Pferd 2 ein G-Homozygot und das Pferd 4 ein A-Homozygot ist.
Tabelle 5 Ergebnisse des GBA^TM-Analyseexperiments
Beispiel 11B
GBA^TM-Analyse auf Polystyrolplatten unter Verwendung von Primern, die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren immobilisiert worden sind: Vergleich von zwei verschiedenen Verfahren für die Oligonucleotid-Immobilisierung
Der folgende GBA^TM-Primer (#670) wurde gemäß Beispiel 1 auf Polystyrolplatten immobilisiert. Die Sequenz dieses Primers ist
Dann wurde dieser immobilisierte GBA^TM-Primer an die folgenden zwei synthetischen Oligonucleotide (#1241 und #1242) hybridisiert. Die jeweiligen Sequenzen dieser Oligonucleotide sind:
Nach der Hybridisierung wurde der immobilisierte GBA^TM-Primer gemäß Beispiel 9A an seinem 3'-Ende enzymatisch verlängert. Der kolorimetrische Nachweis wurde gemäß Beispiel 8 durchgeführt. Die für die einzelnen Basen in dem kolorimetrischen Test erhaltenen Signale sind in der Tabelle 6 gezeigt.
Tabelle 6 Ergebnisse des GBA^TM-Experiments (mOD/min)
Beispiel 11C
GBA^TM-Analyse auf Polystyrolplatten unter Verwendung von Primern, die mit einer Modifizierung des Verfahrens von Running et al. immobilisiert worden sind: Vergleich von zwei verschiedenen Verfahren für die Oligonucleotid-Immobilisierung
Das Oligonucleotid #1592 wurde als GBA^TM-Primer verwendet. Dieses Oligonucleotid hat die gleiche Sequenz wie #670 (vgl. Beispiel 9B), ist jedoch an seinem 5'-Ende mit einer Thiophosphatgruppe modifiziert. Diese Thiophosphatgruppe wird als reaktiver Henkel in der anschließenden kovalenten Immobilisierung an die poly-(Lys, Phe)-beschichtete Platte verwen det. Um diese Thiophosphatgruppe einzuführen, wurde ein 5'-Phosphat-on-phosphoramidit (von Glen Research erhalten) an das 5'-Ende des Oligonucleotids während dessen Synthese gekoppelt. Die Oxidation während der Kopplung dieses Phosphoramidits wurde durch eine Schwefelung ersetzt, wodurch das gewünschte 5'-Thiophosphat erzeugt wurde. Das für die Schwefelung verwendete Reagenz war Tetraethylthiuramdisulfid (TETD), das von Applied Biosystems erhalten worden ist. Unmittelbar vor der Immobilisierung an den Polystyrolplatten wurde dieses modifizierte Oligonucleotid mit einer Lösung von 4-Nitrophenylbromacetat, einem heterobifunktionellen Vernetzungsmittel, in einem Gemisch von DMSO und einem Phosphatpuffer, pH 7,2, umgesetzt. Der Verlauf der Modifizierungsreaktion wurde mittels HPLC verfolgt und nach dessen Ende wurde das Reaktionsgemisch durch eine NAP5-Gelfiltrationssäule (Pharmacia) geschickt, um das überschüssige Vernetzungsmittel zu entfernen. Dieses aktivierte Oligonucleotid wurde dann sofort in dem Immobilisierungsschritt verwendet, da die reaktive Estergruppe an dessen 5'-Ende beim Lagern hydrolysiert.
Die für die Immobilisierung verwendeten Polystyrolplatten wurden durch eine passive Adsorption von poly-(Lys, Phe) in bekannter Weise beschichtet (J. A. Running und M. S. Urdea, Biotechniques 8, 276–277, 1990). Nach dem Waschen wurden Aliquots, die 50 pmol des aktivierten modifizierten Oligonucleotids #1592 in Phosphatpuffer, pH 7,2, enthielten, in jeden Well überführt und über Nacht inkubiert. Die Platten wurden dann mit TNTw, 0,1 N NaOH und erneut mit TNTw gewaschen, bevor die Hybridisierung an die Oligonucleotide #1241 und #1242 durchgeführt wurde. Alle nachfolgenden Schritte (Hybridisierung, Verlängerung und kolorimetrische Erfassung) wurden in der vorstehend beschriebenen Weise durchgeführt. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 7 gezeigt.
Tabelle 7 Ergebnisse des GBA^TM-Analyseexperiments (mOD/min)
Beispiel 12
Immobilisierung von Oligonucleotiden an Glasobjektträgern und Hybridisierungstest auf Objektträgern
In diesem Experiment wurde das Oligonucleotid #308 verwendet. Die Sequenz dieses Oligonucleotids ist:
Zur Bindung des Oligonucleotids an die Glasobjektträger wurde die folgende Lösung hergestellt: 1,1 ml H₂O, 25 μl einer 10 μM-Lösung des Oligonucleotids #308 in Wasser und 125 μl einer 38 mg/ml-Lösung von EDC in Wasser. Als Kontrolle wurde ein weiteres Gemisch hergestellt, das kein EDC enthielt: 1,225 μl H₂O und 25 μl der 10 μM-Oligonucleotidlösung. 20 μl-Aliquots dieser Lösungen (die 4 pmol des Oligonucleotids enthielten) wurden in die einzelnen "Wells" eines Glasobjektträgers (von Cel-Line erhalten) eingebracht. Der Durchmesser jedes "Wells" auf den Objektträgern betrug 4 mm. Die einzelnen "Wells" sind durch eine dünne hydrophobe Teflonbeschichtung voneinander getrennt. Die Inkubierung wurde über Nacht bei Raumtemperatur und 100% relativer Feuchtigkeit durchgeführt, um ein Verdampfen zu verhindern. Nach dieser Inkubation wurden die Objektträger dreimal durch Eintauchen in eine Lösung von 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl und 0,05% Tween 20 (TNTw) gewaschen. Die Objektträger wurden dann vor dem Hybridisierungsschritt lufttrocknen gelassen.
Zur Hybridisierung wurden zwei 5'-biotinylierte Oligonucleotide verwendet: #1129, das eine zu #308 komplemientäre Sequenz aufweist, und #431, das zu #308 nicht komplementär ist. Die jeweiligen Sequenzen dieser beiden Oligonukleotide sind ("B" steht für Biotin):
Diese beiden Oligonucleotide wurden getrennten "Wells" auf dem Objektträger zugesetzt. 20 μl-Aliquots von Lösungen dieser Oligonucleotide in 1,5 M NaCl, 10 mM EDTA wurden den getrennten "Wells" des Objektträgers zugesetzt und die Hybridisierung wurde 30 min bei Raumtemperatur und 100% relativer Feuchtigkeit durchgeführt.
Nach der Hybridisierung wurden die Objektträger erneut in der gleichen Weise, wie es vorstehend beschrieben worden ist, in TNTw gewaschen. Nach dem Trocknen wurden 20 μl-Aliquots einer 1 : 1000-Verdünnung eines Meerrettichperoxidase-(HRP-)konjugierten anti-Biotins in 1% BSA in TNTw jedem "Well" zugesetzt und 30 min in der vorstehend beschriebenen Weise inkubiert. Dann wurden die Objektträger in der vorstehend beschriebenen Weise sechsmal mit TNTw gewaschen und luftgetrocknet. Dann wurde eine kolorimetrische Reaktion durchgeführt, um die Gegenwart von Biotin festzustellen. Es wurde eine HRP-Substratfertiglösung (von Pierce) verwendet. 20 μl-Aliquots dieser Substratlösung wurden jedem "Well" zugesetzt und die Farbentwicklung wurde visuell verfolgt.
Bei diesem Experiment wurde in Wells, bei denen das biotinylierte Oligonucleotid #1129 an das Oligonucleotid #308 hybridisiert hatte, und bei denen das letztgenannte Oligonucleotid in Gegenwart von EDC an den Objektträger gebunden worden ist, eine intensive blaue Farbe beobachtet. Keine Farbentwicklung wurde beobachtet, wenn das Oligonucleotid #308 in Abwesenheit von EDC immobilisiert worden ist. Es wurde ebenfalls keine Farbentwicklung festgestellt, wenn das Oligonucleotid #431 an das Oligonucleotid #308 hybridisiert worden ist, und zwar ungeachtet der Art und Weise der Bindung des letztgenannten Oligonucleotids.
Alternativ wurde, um quantitativere Ergebnisse zu erhalten, nach einer Inkubation mit dem kolorimetrischen Substrat für einen geeigneten Zeitraum die Substratlösung aus den "Wells" entfernt, in die Wells einer Standard-96 Well-Platte überführt, mit 100 μl H₂O und 50 μl 3 M H₂SO₄ gemischt und die Extinktion der Lösung wurde in einem 96-Well-Plattenlesegerät bei 450 nm aufgezeichnet. Die Ergebnisse dieses Experiments sind in der Tabelle 8 gezeigt.
Tabelle 8 Ergebnisse des GBA^TM-Experiments (mOD/min)
Beispiel 13
GBA^TM-Analyse auf Mikroskop-Objektträgern
Nachstehend ist ein Beispiel für GBA^TM auf Glasobjektträgern angegeben. Die verwendeten Glasobjektträger wurden von Cel-Line Associates, Inc., Newfield, N. J. erhalten. Der in diesem Experiment verwendete GBA^TM-Primer war das Oligonucleotid #670 (vgl. das Beispiel 11B). Die Immobilisierung dieses Primers wurde unter Verwendung von EDC gemäß der vorstehenden Beschreibung durchgeführt. In dem Hybridisierungsschritt wurden 100 fmol der synthetischen Template #1241 und #1242 pro "Well" des Objektträgers zugesetzt. Der Hybridisierungspuffer enthielt 1,5 M NaCl und 10 mM EDTA. Nach der Hybridisierung wurden die Objektträger in TNTw gewaschen und dann wurde die Primerverlängerung durchgeführt. Die Zusammensetzung der Verlängerungslösung entsprach derjenigen von Beispiel 11A. 20 μl dieser Lösung wurden pro "Well" zugesetzt und die Reaktion wurde 5 min bei Raumtemperatur ablaufen gelassen. Nach dem Waschen mit TNTw wurde die Gegenwart eines biotinylierten ddNTP gemäß Beispiel 12 getestet. Die erhaltenen Endpunktmesswerte sind in der Tabelle 9 gezeigt.
Tabelle 9 Ergebnisse des GBA^TM-Experiments (A₄₅₀)
Die vorstehenden Experimente zeigen, dass relativ kurze, unmodifizierte Oligonucleotide auf der Oberfläche eines hydrophilen Polystyrols oder Glases einfach durch Inkubieren in einer Lösung, die ein anorganisches Salz wie z. B. NaCl, oder ein kationisches Detergenz wie z. B. Octyldimethylamin-hydrochlorid, enthält, effizient immobilisiert werden können. Die Einfachheit dieser Erfindung sollte die Abscheidung von Polynucleotiden auf Glas- oder Polystyrolsubstraten in verschiedenartiger Weise ermöglichen. Eine musterspezifische Abscheidung sollte unter Verwendung von Siebdruck- und Tintenstrahldrucktechnologien sowie einer Photolithographie möglich sein, um Bereiche des Substrats zu maskieren, so dass ein Binden von Oligonucleotiden verhindert wird. Die Mikroabscheidung von Oligonucleotiden unter Verwendung der vorstehend genannten Technologien könnte miniaturisierte Tests mit einer starken Erhöhung der Anzahl von Analyten, die gleichzeitig nachgewiesen werden könnten, und mit einer entsprechenden Abnahme der Kosten für Arbeit und Reagenzien ermöglichen.
Während die Erfindung im Zusammenhang mit spezifischen Ausführungsformen beschrieben worden ist, sollte beachtet werden, dass die Erfindung weiter modifiziert werden kann, und diese Anmeldung soll jegliche Variationen, Anwendungen oder Anpassungen der Erfindung, die allgemein den Prinzipien der Erfindung folgen, umfassen, einschließlich solcher Abweichungen von der vorliegenden Beschreibung, die der üblichen Praxis innerhalb des Fachgebiets entsprechen, dem die Erfindung angehört, und die auf die vorstehend beschriebenen und in den beigefügten Ansprüchen dargelegten wesentlichen Merkmale angewandt werden können.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Ein Verfahren zum nicht-kovalenten Immobilisieren eines synthetischen Nucleinsäuremoleküls auf einem Träger, der ein hydrophiler Polystyrolträger, der eine Gruppe umfasst, die aus -OH, -C=O und -COOH ausgewählt ist, oder ein Glasträger ist, wobei das Verfahren umfasst: (a) Inkubieren des Trägers mit einer Lösung, die das Nucleinsäuremolekül und (1) ein kationisches Detergenz, das aus 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-1,3-carbodiimid-hydrochlorid, das in einer Konzentration von etwa 30 mM bis etwa 100 mM bereitgestellt ist, und Octyldimethylamin-hydrochlorid, das in einer Konzentration von etwa 50 mM bis etwa 150 mM bereitgestellt ist, ausgewählt ist, oder (2) NaCl, das in einer Konzentration von etwa 50 mM bis etwa 250 mM bereitgestellt ist, umfasst, um dadurch die Nucleinsäure nicht-kovalent an dem Träger zu immobilisieren, wobei dann, (i) wenn das kationische Detergenz 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-1,3-carbodiimid-hydrochlorid ist, der Träger aus Glas und hydrophilem Polystyrol ausgewählt ist, (ii) wenn das kationische Detergenz Octyldimethylamin-hydrochlorid ist, der Träger hydrophiles Polystyrol ist, (iii) wenn die Lösung NaCl enthält, der Träger hydrophiles Polystyrol ist, und (b) anschließend Waschen des Trägers mit einer wässrigen Lösung.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das kationische Detergenz 1-Ethyl-3-(3'-dimethylaminopropyl)-1,3-carbodiimid-hydrochlorid ist.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das kationische Detergenz Octyldimethylamin ist.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Lösung NaCl umfasst.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei dem der Träger ein hydrophiles Polystyrol ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, bei dem der Träger ein Glasträger ist.
Verfahren nach Anspruch 5, bei dem der hydrophile Polystyrolträger eine 96-Well-Mikrotiterplatte ist.
Verfahren nach Anspruch 5, bei dem der hydrophile Polystyrolträger eine 96-Stift-Matrix ist, die so gestaltet ist, dass sie in eine 96-Well-Mikrotiterplatte passt.
Verfahren nach Anspruch 5, bei dem der hydrophile Polystyrolträger ein Kügelchen, eine Affinitätssäule, eine Membran oder eine Filteranordnung ist.
Verfahren nach Anspruch 6, bei dem der Glasträger in Form eines Mikroskop-Objektträgers vorliegt.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei dem die Inkubation bei einem pH-Wert von 6 bis 8 stattfindet.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei dem die wässrige Lösung im Schritt (b) ein nicht-ionisches Detergenz enthält.
Verfahren nach Anspruch 12, bei dem das nicht-ionische Detergenz Polyoxyethylen(20)sorbitan ist.
Verfahren nach Anspruch 13, bei dem das Polyoxyethylen(20)sorbitan gegebenenfalls in einer Lösung bereitgestellt ist, die zusätzlich gepufferte Kochsalzlösung enthält.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei dem das Nucleinsäuremolekül ein synthetisches Oligonucleotid mit einer minimalen Länge von mindestens 12 Nucleotidresten und einer maximalen Länge von 100 Resten ist.
Verfahren nach Anspruch 15, bei dem das Oligonucleotid chemisch modifiziert ist.
Ein Verfahren, welches das nicht-kovalente Immobilisieren eines synthetischen Nucleinsäuremoleküls, das ein spezifisches Polynucleotid ist, auf einem Träger, der ein hydrophi ler Polystyrolträger, der eine Gruppe umfasst, die aus -OH, -C=O und -COOH ausgewählt ist, oder ein Glasträger ist, durch die Durchführung der Schritte (a) und (b) eines der Ansprüche 1 bis 16 und zusätzlich (ai) das Einfangen mindestens eines Strangs eines spezifischen Polynucleotidanalyten aus der Lösung durch Hybridisieren an das immobilisierte Polynucleotid, und (bi) das Nachweisen der Gegenwart des eingefangenen Analyten, oder (aii) das Amplifizieren einer spezifischen Region eines spezifischen Genoms unter Verwendung einer Polymerasekettenreaktion, wobei die amplifizierte Region des Genoms eine Sequenz aufweist, die zu dem immobilisierten Polynucleotid komplementär ist, (bii) das Einfangen mindestens eines Strangs des Amplifizierungsprodukts aus der Lösung durch Hybridisieren an das immobilisierte Polynucleotid, und (cii) das Nachweisen der Gegenwart des eingefangenen Amplifizierungsprodukts, oder (aiii) das Inkubieren einer Nucleinsäureprobe eines Zielorganismus, der einen Einzelnucleotidpolymorphismus aufweist, in Gegenwart des immobilisierten Polynucleotidprimers und mindestens eines Didesoxynucleotidderivats unter Bedingungen, die ausreichend sind, um eine Polymerase-vermittelte, Templatabhängige Verlängerung des Primers zuzulassen, wobei die Verlängerung den Einbau eines einzelnen Didesoxynucleotids in das 3'-Ende des Primers verursacht, wobei das einzelne Didesoxynucleotid zu dem einzelnen Nucleotid der polymorphen Stelle des Polymorphismus komplementär ist, (biii) Zulassen der Templat-abhängigen Verlängerung des Primermoleküls und des Einbaus des einzelnen Didesoxynucleotids, und (ciii) Bestimmen der Identität des in die polymorphe Stelle eingebauten Didesoxynucleotids umfasst, wobei das identifizierte Nucleotid zu dem Nucleotid der polymorphen Stelle komplementär ist.